KR20120099550A

KR20120099550A - 줄기세포 증식 촉진 기능을 갖는 피부 미백용 펩타이드 조성물

Info

Publication number: KR20120099550A
Application number: KR1020110009125A
Authority: KR
Inventors: 김국현; 김대현
Original assignee: (주)와이즈덤레버러토리
Priority date: 2011-01-28
Filing date: 2011-01-28
Publication date: 2012-09-11
Also published as: KR101244149B1

Abstract

본 발명은 피부 미백용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 피부 미백용
조성물은 인간 표피 성장 인자(Human Epidermal Growth Factor), 코퍼 트리펩타이드(Copper-Gly-His-Lys), 팔미토일 펜타펩타이드(팔미토일-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser), 아세틸 헥사펩타이드(Arg-Arg-Gln-Met-Glu-Glu-acetyl)를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

줄기세포 증식 촉진 기능을 갖는 피부 미백용 펩타이드 조성물{Peptide Composition for hyperpigmented skin}

본 발명은 피부 미백용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 피부 치밀도 증가 효과 및 피부 친화력이 우수하고 멜라닌 생성을 억제함으로써 색소 침착 억제 효과를 보여 주는 펩타이드 복합 성분 함유 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

기존 피부 미백제는 알부틴, 비타민 C, 비타민 c 유도체 등의 멜라닌 생합성 억제 효과 및 타이로시나아제 효소 활성 억제 효과만을 가진 소재들이었으나, 최근에는 줄기 세포 증식 촉진 작용을 통한 피부 진피층 밀도 증가에 따른 피부 미백 효과 및 멜라닌 색소 형성 세포 분화, 성장 조절 및 스트레스와 연관된 염증 반응 신호 전달 과정을 통해 유발될 수 있는 멜라닌 생합성 과정을 억제 시켜줌으로써 외부 스트레스에 의한 멜라닌 합성을 억제함과 동시에 유해 활성 산소, 피로, 수면 부족, 정신적 스트레스와 같은 내부 스트레스 의한 피부 색소 침착 개선을 시켜 주는 포괄적인 미백제 개발이 필요해지고 있다.

새로운 피부 미백 소재 개발 관련해서 스트레스와 멜라닌 합성에 관한 연구가 진행되고 있는데, 자외선, 환경 오염과 같은 외부 스트레스 혹은 수면부족이나 피로 및 정신적인 스트레스와 같은 내부 스트레스 요인에 의해 아세틸콜린과 칼시토닌 같은 신경전달 물질들이 염증반응을 촉진시키고 염증반응은 멜라닌 합성을 촉진하는 역할을 한다고 보고되고 있다.

전통적으로 강한 항산화 효과로 인해 가장 주목받고 있는 원료인 비타민C의 경우는 그 강력한 항산화 효과로 인해 안정성에 대한 해결이 매우 중요하게 대두되었다. 즉 비타민C의 안정화에 대한 수많은 연구가 진행되어 왔고, 다양한 안정화 비타민C가 제시되었으나 그 안정성과 항산화 효과의 상관관계는 매우 풀기 어려운 문제로서 여겨지고 있다. 따라서 강력한 실제 효과와 안정성을 겸비한 신원료에 대한 요구가 커지고 있는 것이 현실이다. 최근 이러한 연구의 한 성과로서 제시된 것이 펩타이드 원료들이다.

전세계적으로 보면 이미 수십년 전부터 다양한 펩타이드 및 단백질 등이 화장품 원료로써 사용되어 왔으나, 실제는 대두 펩타이드 효모 펩타이드 등 추출물 유래의 단백질 혹은 펩타이드 들의 사용이 주요 추세였다.

그러나 최근 들어 생명공학 기술의 발전에 따라 단일 펩타이드의 합성이 용이해지고 이에 따른 정확한 생체 내의 기전이 밝혀짐에 따라 중요한 고기능성 원료로서 주목을 받기 시작하고 있다. 이렇게 주목받고 있는 단일 펩타이드들로는 아세틸헥사펩타이드, 코퍼펩타이드, 팔미토일펜타펩타이드 그리고 상피세포성장인자(EGF) 등을 들 수 있다.

아세틸헥사펩타이드는 신경근육접합 부위의 신경 세포 내에 존재하는 SNAP25라고 하는 단백질의 N-말단의 12~17번 부위의 6개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이다. 때문에 이 아세틸헥사펩타이드는 SNAP25와 유사한 결합능력을 갖게 됨으로써 SNAP25가 VAMP와 STXN과 결합하여 SNARE복합체를 형성하는 것을 조절함으로써 신경전달물질인 카테콜아민의 분비를 조절하게 된다. 때문에 카테콜아민의 분비에 따라 움직임의 신호를 받게 되는 근육의 운동을 조절함으로써 주름 생성을 억제하게 된다.

코퍼펩타이드는 1980년대 부터 주목을 받고 연구가 진행되어온 펩타이드로 미국에서 창상 치료제와 모발이식 착상 보조제로 개발되어온 펩타이드이다. 이 펩타이드는 생체 내에 존재하는 면역 관련 단백질과 세포간극 ( ECM ) 구성 단백질들이 피부상처 이후 분해되면서 발생하는 트리펩타이드에 혈액내의 구리 이온이 결합되어 생성하는 것으로써 세포재생과 상처치유의 과정에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 펩타이드이다.

팔미토일 펜타펩타이드는 피부에 존재하는 콜라겐 단백질의 C말단에 존재하는 펩타이드 서열로서 콜라겐의 합성을 촉진함으로써 피부의 주름을 개선하는 것으로 알려진 펜타펩타이드에 피부 흡수를 용이하도록 팔미토일기를 결합시켜서 만든 펩타이드이다.

상피세포 성장인자는 인체 내에 존재하는 단백질로서 ECM 구성 단백질을 생성하는 섬유 아세포의 성장을 촉진하고 피부재생을 촉진함으로써 피부노화를 방지하고 주름을 개선하는 것으로 알려져 있는 펩타이드성 단백질이다.

피부 구조는 표피,진피, 기저층 등으로 나뉘며 정상적인 피부는 약 28일을 주기로 새로운 피부 세포층과 노화된 피부 세포층이 탈락되는 순환구조를 만들지만 피부 노화에 따라 이러한 순환 구조는 깨지게 되면서 피부 진피층을 이루고 있는 콜라겐 단백질 등의 손상으로 피부 기저증 등 피부층 밀도가 낮아지게 된다. 피부 기저층 등의 치밀도가 높아지게 되면 단위 피부 밀도당 멜라닌 색소 농도가 낮아지게 되어 피부톤이 밝아지는 효과를 기대할 수 있게 된다.

본 발명의 목적은 인간 표피 성장 인자, 코퍼 트리펩타이드(Copper-Gly-His-Lys), 팔미토일 펜타펩타이드(팔미토일-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser), 아세틸 헥사 펩타이드(Arg-Arg-Gln-Met-Glu-Glu-acetyl)로 구성된 복합 조성물을 유효 성분으로 자외선 등 외부 인자에 의한 멜라닌 과다 생성과 유해활성 산소, 염증 유발 신호 전달 등 내부 스트레스 인자에 의한 멜라닌 생성을 동시에 저해시켜주면서 피부 진피층 밀도 증가 효과에 따른 피부 미백용 조성물을 제공함에 있다.

줄기 세포 증식 촉진 작용과 신경 전달 물질 분비 조절 효능 및 피부 친화력과 멜라닌 생성 억제 효과가 우수한 펩타이드 및 단백질 복합 조성물을 신규로 발굴하여 피부 미백 화장료 조성물 및 피부 외용제 조성물로 개발하고자 한다.

줄기 세포 증식 촉진 및 신경 전달 물질 분비 조절 효능의 펩타이드 및 단백질 성분을 최상의 농도 배합비 선정을 통하여 자외선 및 염증 반응 등으로 유발되는 멜라닌 색소 과다 생성 억제 효과를 기대할 수 있다.

본 발명에 따른 피부 미백 조성물은 자외선 등 외부 인자에 의해 유발되는 피부 멜라닌 과다 생성 억제 효과 뿐만 아니라 동시에 노화에 따른 유해 활성 산소 등에 의해 유발되는 멜라닌 과다 생성 억제 효과를 동시에 볼 수 있어서 보다 효과적인 피부 미백 효과를 줄 수가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 펩타이드 복합 조성물 0.1% 농도일때 멜라닌 생합성 억제 효과를 나타낸 그림이다.
도 2는 중간엽 줄기세포를 이용한 세포 증식 촉진 효과를 나타낸 그림이다.
도 3은 인체 미백 효능 평가를 나타낸 그림이다.
도 4는 피부색 측정값(Individual Typology Angle Value) 결과이다.
도 5는 피부 진피층 증가 효과에 대한 초음파 촬영 결과이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에 따른 인간 표피 성장 인자는 재조합 형태의 단백질로 단백질 크기가 6 kDa 정도로 SDS-PAGE 전기 영동 데이터에서 90% 이상의 순도 형태를 사용한다.

본 발명에 따른 코퍼트리펩타이드의 아미노산 서열은 글라이신을 아미노 말단기로 시작하여 히스티딘, 라이신 순서의 트리펩타이드가 코퍼 이온과 배위결합된 형태이다. 펩타이드 합성은 일반적인 방법을 따른다.

본 발명에 따른 팔미토일펜타펩타이드의 아미노산 서열은 라이신을 아미노 말단기로 시작하여 트레오닌, 트레오닌, 라이신, 세린 순서의 펜타펩타이드에 팔미토인산이 아미노산 말단에 공유결합된 형태이다. 펩타이드 합성은 일반적인 방법을 따른다.

본 발명에 따른 아세틸헥사펩타이드의 아미노산 서열은 아르기닌을 아미노 말단기로 시작하여 아르기닌-글루타민-메치오닌-글루타메이트-글루타메이트 순서의 헥사펩타이드에 아세틸 작용기가 카르복실기 말단에 공유결합된 형태이다. 펩타이드 합성은 일반적인 방법을 따른다.

본 발명에 따른 펩타이드 복합 조성물은 중량 %로 다음과 같은 비율로 PBS(phosphate buffer saline)에 혼합시켜 준다. 표피 성장 인자 : 코퍼트리펩타이드 : 팔미토일펜타펩타이드 : 아세틸헥사펩타이드 = 2 : 100 : 1 : 500

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나 이는 본 발명의 예시일 뿐 하기의 실시예에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아님은 자명하다.

{실시예 1 : 멜라닌 생성 억제 효과 측정.}

인체 멜라닌세포(melanocyte)를 이용하여 본 발명에 따른 펩타이드 복합 조성물 성분(표피성장인자:코퍼트리펩타이드:팔미토일펜타펩타이드:아세틸헥사펩타이드 = 2:100:1:500 중량 % 비율)과 알부틴 성분에 의한 멜라닌 생성 억제 효과를 비교 분석하였다.

구체적인 실시예로서, Human epidermal melanocyte 세포를 medium 254배지에서 5 % CO₂ _, 37℃ 하에서 배양하였다.

배양 후 배지를 제거하고 시료를 적당 농도로 희석헤서 배지에 처리한 후 이틀에 한 번 배지를 갈아주면서 5일간 배양하였다.

펩타이드 복합 조성물(SBRC)의 농도범위는 0.001%, 0.01%, 0.1%로 결정하였다.

배양이 끝난 후 배지를 제거하고 PBS(phosphated buffer saline)로 세척한 다음에, 트립신 처리하여 세포를 회수하였다.

회수된 세포는 hematocytometer를 이용하여 세포수를 측정한 다음, 세포수를 동수로 맞추어 2 mL 튜브에 나눠담은 뒤 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 pellet을 얻었다.

이 세포 pellet을 60℃에서 건조한 후, 10% DMSO가 함유된 1M 수산화나트륨액 100 ㎕를 넣어 60 ℃ 항온조에서 세포내 멜라닌을 얻었다. 생성된 멜라닌 함량은 490 nm 흡광도를 측정을 통해 구했다.

그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

멜라

멜라닌 생합성 억제 효과

시 료	사용 농도(%)	멜라닌 생성 억제율(%)
SBRC	0.001	23.7
SBRC	0.01	19.4
SBRC	0.1	21.7
알부틴	0.001	38.2

상기 표 1 및 그림 1에 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 펩타이드 복합 조성물이 알부틴 보다 우수한 멜라닌 생성 억제율을 보여 주었다.

(실시예 2 : 줄기세포 증식 촉진 효능 평가)

인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cell)는 다음과 같은 방법에 따라 준비를 한다.

중간엽 줄기세포 분리는 공여받은 골수를 밀도구배 원심분리를 통해 골수로부터 단핵구 세포를 분리하여 DMEM 배양액으로 계대배양을 통해 준비를 한다.

인간 중간엽 줄기세포 증식 효능 평가는 세포를 배양하면서 BrdU를 표지시켜 분열하는 세포의 양을 비교하는 방법으로 BrdU(bromodeoxyuridine) 시약을 이용한 항체면역 반응을(BrdU proliferation assay, CALBIOCHEM)이용해서 측정을 하였다. 세포를 3x10³/cm² 농도로 심고 이를 DMEM으로 배양한 대조군과 여기에 본 발명에 따른 펩타이드 복합 조성물(SBRC) 을 0.001%, 0.01%, 0.1% 각각 첨가하여 매 2일 마다 새로운 배양액으로 교체하면서 6일간 배양하였다.

중간엽 줄기세포 증식 촉진 효과

시 료	사용 농도(%)	대조군 대비 줄기세포 생존율(%)
SBRC	0.001	119
SBRC	0.01	130
SBRC	0.1	128

표2와 그림 2와 같이 본 발명에 따른 펩타이드 복합 조성물은 중간엽 줄기세포 증식 촉진 효과를 보여 주었다.

이하 본 발명에 따른 펩타이드 복합 조성물 함유 다음과 같은 제형예를 통해 인체 대상 효능 평가를 실시하였다. 인간 표피 성장 인자, 코퍼트리펩타이드,팔미토일펜타펩타이드, 아세틸헥사펩타이드를 포함하며 하기 조성으로 이루어진 영양 화장수, 영양크림, 에센스를 일반적인 제조방법에 따라 제조하였다.

영양 화장수

성분명	함량(중량 %)
정제수	92.06
부틸렌글라이콜	5
글리세린	1
글리세릴아크릴레이트/아크릴릭애씨드코폴리머	0.3
프로필렌글라이콜	1
페닐트리메치콘	0.2
잔탄검	0.1
디소듐이디티에이	0.05
비스피이지-18 메칠에텔디메칠실란	0.02
피이지-40 하이드로제네이티드카스터 오일	0.1
판테놀	0.1
표피성장인자	0.0002
코퍼트리펩타이드	0.01
아세틸헥사펩타이드	0.05
팔미토일펜타펩타이드	0.0001

영양 크림

성분명	함량(중량 %)
정제수	84.32
부틸렌글라이콜	10
글리세린	1
카프릴릭.카프릭트리글라이세라이드	0.2
프로필렌글라이콜	1
페닐트리메치콘	0.2
잔탄검	0.8
디소듐이디티에이	0.1
피이지-100 스테아레이트	0.7
폴리소르베이트 60	0.8
판테놀	0.1
쉐어버터	1
디메치콘	0.5
표피성장인자	0.0002
코퍼트리펩타이드	0.01
아세틸헥사펩타이드	0.05
팔미토일펜타펩타이드	0.0001

에센스

성분명	함량(중량 %)
정제수	90.23
스쿠알란	0.2
부틸렌글라이콜	5
레시친	1
글리세린	1
카보머	0.7
판테놀	0.1
잔탄검	0.7
콜레스테롤	0.3
카프릴릭/카프릭트리글라이세라이드	0.5
알란토인	0.2
표피성장인자	0.0002
코퍼트리펩타이드	0.01
아세틸헥사펩타이드	0.05
팔미토일펜타펩타이드	0.0001

{실시예 2 : 펩타이드 복합 조성물의 인체 피부에 대한 안전성 확인 실험.}

실시예 1에 따른 펩타이드 복합 조성물을 포함하는 피부 외용제를 제조하여 다음과 같이 인체 피부에 대한 안정성 확인 실험을 실시하였다.

피부 안정성 평가는 피험자 설문과 시험자 관찰에 의해 주관적 자극감과 객관적 자극을 평가하였다.

표 6 결과에 나온 것 처럼 본 시험 기간 동안 피험자에게서 아무런 피부반응도 관찰되지 않았다.

피부 안전성 평가

	항 목 (N=10)	2주 후	4주 후
주 과 적 인 자 극 감	가렵다	0	0
	바늘로 찌르듯이 아프다	0	0
	근질거린다	0	0
	화끈거린다	0	0
	따끔거린다	0	0
	뻣뻣하다	0	0
	당긴다	0	0
객 관 적 자 극	홍반	0	0
	부종	0	0
	인설	0	0
	뽀드락지,좁쌀 등	0	0
	기타	0	0
총 부작용자 수		0	0

(실시예 4 : 인체 피부 미백 효과 시험)

본 발명 실시예 1에 따른 원료 및 제품의 미백 효능에 대한 인체 적용 테스트는 멀티 파장을 이용한

commission internationale del'Eclairage(CIE) L*, a*, b* color system을 이용한다.

평균 연령 45.1세 건성 피부 5명, 중건성 피부 4명, 중성 피부 1명을 대상으로 제품 사용 전과 사용 2주, 4주 후 시점에서 spectrophotometer CM-2500d를 이용하여 색소 침착 부위의 피부 미백 개선 효과를 측정하였다.

표7과 그림 3, 그림 4 결과에 나온 것처럼 사용 전과 비교시 2주, 4주 후 시점에서 유의한 피부 미백 개선 효과가 나타났다.

피부색 측정값(Individual Typology Angle Value)

	0주	2주	4주
평균값	20.47	21.55	23.66

(실시예 3 : 진피층 두께 및 치밀도 측정)

진피층 두께 및 치밀도 측정을 위해 DermaScanC®(Cortex Denmark)를 이용하여 초음파 촬영을 실시하였다. 그 결과 표 8와 그림 5에 나온 것 처럼 사용 전과 비교시 진피층 두께와 치밀도가 증가함을 확인하였다.

진피층 두께 및 치밀도 변화

	시 점	평균값
두께	0주	1.32
	2주	1.32
	4주	1.36
치밀도	0주	6.00
	2주	6.46
	4주	7.17

Claims

재조합 인간 표피성장인자, 코퍼트리펩타이드, 팔미토일펜타펩타이드, 아세틸헥사펩타이드로 구성된 유효성분을 포함하는 피부 외용제 조성물
재조합 인간 표피성장인자, 코퍼트리펩타이드, 팔미토일펜타펩타이드, 아세틸헥사펩타이드로 구성된 유효성분을 포함하며, 피부 미백 개선인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물
제1항에 있어서 재조합 인간 표피 성장 인자, 코퍼트리펩타이드, 팔미토일펜타펩타이드, 아세틸헥사펩타이드는 2:100:1:500의 중량 비율임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물
제1항에 있어서 재조합 인간 표피 성장 인자, 코퍼트리펩타이드, 팔미토일펜타펩타이드, 아세틸헥사펩타이드로 구성된 유효 복합 성분은 외용제 총중량에 대하여 0.001~1%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물
제2항에 있어서 재조합 인간 표피 성장 인자, 코퍼트리펩타이드, 팔미토일펜타펩타이드, 아세틸헥사펩타이드는2:100:1:500의 중량 비율임을 특징으로 하는 화장료 조성물
제2항에 있어서 재조합 인간 표피 성장 인자, 코퍼트리펩타이드, 팔미토일펜타펩타이드, 아세틸헥사펩타이드로 구성된 유효 복합 성분은 화장료의 총중량에 대하여 0.001~1%의 양으로 함유됨을 특징으로 하는 화장료 조성물
1항과 2항에 있어서 코퍼트리펩타이드는 글라이신을 아미노 말단기로 시작하여 히스티딘, 라이신 순서의 트리펩타이드가 코퍼 이온과 배위결합된 형태.
1항과 2항에 있어서 팔미토일펜타펩타이드의 아미노산 서열은 라이신을 아미노 말단기로 시작하여 트레오닌, 트레오닌, 라이신, 세린 순서의 펜타펩타이드에 팔미토인산이 아미노산 말단에 공유결합된 형태
1항과 2항에 있어서 아세틸헥사펩타이드의 아미노산 서열은 아르기닌을 아미노 말단기로 시작하여 아르기닌-글루타민-메치오닌-글루타메이트-글루타메이트 순서의 헥사펩타이드에 아세틸 작용기가 카르복실기 말단에 공유결합된 형태
1항과 2항에 있어서 재조합 인간 표피 성장 인자는 대장균 혹은 효모에서 발현시킨 것을 특징으로 한다.