KR20120097379A - 바시트라신 항생제 - Google Patents

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KR20120097379A
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마르틴 맨손
크리스틴 센스타드
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셀리아 파마슈티칼즈 에이피에스
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Abstract

본 발명은 메틸렌-이소류신을 함유하는 신규한 바시트라신 화합물에 관한 것이다.

Description

바시트라신 항생제{NEW BACITRACIN ANTIBIOTICS}
본 발명은 항생 활성을 지니는 신규한 화합물에 관한 것이다.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)에 의해 천연적으로 생산된 밀접하게 관련된 펩티드 항생제의 그룹을 바시트라신이라 부른다. 바시트라신은 일반적으로 다수의 그램 양성 및 소수의 그램 음성 박테리아 종에 대해 활성이다.
수 개의 바시트라신이 확인되었고 그 중 바시트라신 A가 일차적으로 중요하며 고도로 활성이다 (Biochemistry, vol. 39 no 14, 2000, page 4037-45 by Epperson and Ming). 바시트라신 A는 비-리보좀 펩티드 합성을 통해 합성된 분지된 시클릭 도데카펩티도락탐 항생제이다 (J. Am Chem Soc. vol. 128, 2006, page 10513-10520 by Wagner et al and Eur J Biochem, vol. 192 no. 1, 1990, page 1-15 by Kleinkauf and von Dohren).
바시트라신 A의 주요 구조는 L-Lys6의 ε-아미노기 및 L-Asn12의 R-카르복실기 사이에 있는 고리화된 NH2-L-Ile1-L-티아졸린2-L-Leu3-D-Glu4-L-Ile5-L-Lys6-D-Orn7-L-Ile8-D-Phe9-L-His10-D-Asp11-L-Asn12-COOH이다 (J. Am Chem Soc. vol 128 page 10513-10520, 2006 by Wagner et al).
Ming 등 (Journal of Inorganic Biochemistry, vol. 91 , 2002)은 하기 화학식을 지니는 펩티드 화합물로서 바시트라신을 기재하였다:
Figure pct00001
상기 식에서,
X는 Ile 또는 Val이고,
Y는 Ile 또는 Val이다.
그 중에서도 특히, R1 및 R3은 활성인 바시트라신의 N-말단 모이어티(moiety)인 반면, R4 및 R5는 덜 활성인 바시트라신의 산화된 N-말단 모이어티이다. 그러나, R2는 비활성 입체이성질체이다.
종래 기술
Ikai 등은 바시트라신의 활성이 소수성에 의존적일 수 있다고 제안하였다:
"MIC의 비교 및 소수 성분들의 제안된 구조는, 발린의 위치가 하기 감소 순서로 각각의 성분의 활성에 영향을 미침을 제안한다: N-말단, 7원 펩티드 고리, 및 측쇄 펩티드 모이어티. 이러한 순서가 HPLC 상에서 소수 성분들의 용리 순서와 관련되기 때문에, 활성은 개개 성분의 소수성에 의존적일 수 있다". 문헌(Journal of Antibiotics, vol. 48 no. 3, 1995 page 233-242 by Ikai et al) 참조.
Wagner 등은 바시트라신의 적용을 위해 현존하는 제한들을 극복하기 위해 신규한 헤테로사이클을 바시트라신 A내로 혼입시키는 것을 제안하였다 (Journal of the American Chemical Society, vol. 128 no 32, 2006, page 10513-10520).
비-리보좀에 의해 합성된 여러 개의 펩티드는 독특한 아미노산을 포함한다. 예를 들어 시클로스포린 A는 시클로필린의 경우 세포내 수용체와의 결합, 및 이에 따라 이의 면역억제 활성에 결정적인 2(S)-아미노-3(R)-히드록시-4(R)-메틸-6(E)-옥텐산을 포함한다 (Journal of Biological Chemistry, vol. 268 no 35, 1993 by Offenzeller et al).
여러 개의 드문 아미노산이 이소류신의 구조와 공통점이 있다:
? 신규한 메티오닌 유사체인 2-아미노-5-메틸-5-헥센산은 스트렙토마이세스의 발효 액체배지로부터 분리되었다 (Journal of Antibiotics vol. 32 no. 11, page 1118-1124, 1979 by Takeuchi et al).
? 4-메틸렌-노르류신 및 2-아미노헵트-6-엔산은 화학식: C7H13N02의 화합물이다.
? 4-메틸-노르류신은 재조합 단백질내로 혼입될 수 있는 이소류신 유도체이다 (J Pharm Biomed Anal, vol 31. no. 5, 2003, page 979-987 by Muramatsu et al).
? 2-아미노-3-메틸-4-펜텐산은 단백질내로 혼입될 수 있는 불포화 이소류신 유사체이다 (Chembiochem vol. 7 no. 1 , 2006, page 83-87 by Mock et al).
? 아마니타 솔리타리아(Amanita solitaria)의 불포화 노르류신. 화학적 및 약리학적 연구는 2-아미노-Hex-5-엔산을 기재한다 (Lloydia vol. 36 no.2, 1973, page 69-73 by Chilton et al).
? 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)에 의해 생산된 항대사산물인 베타-메틸노르류신 (J Antibiot, vol. 34 no. 10, 1981 page 1278-82 by Sugiura et al).
발명의 개요
일 양태에서, 본 발명은 신규한 바시트라신 화합물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 지금까지 알려지지 않은 아미노산 측쇄를 포함하는 신규한 바시트라신 화합물에 관한 것이다.
이론에 구속되지 않으며, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)에서, 본 발명자들은 이러한 측쇄가 바시트라신에 대한 화학적 변형 또는 지금까지 알려지지 않은 천연 아미노산의 혼입에 의해 비롯된다고 추측한다.
신규한 측쇄를 포함하는 α-아미노산 화합물의 체계명은 2-아미노-3-메틸-5-헥센산이고 이의 분자식은 C7H13NO2이다.
본 발명자들은 2-아미노-3-메틸-5-헥센산에 대해 5-메틸렌-이소류신이라는 명칭을 제안하고 이를 사용한다. 따라서, 5-메틸렌-이소류신 측쇄는 구조식 -CH(CH3)CH2CH=CH2를 지닌다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 5-메틸렌-이소류신 잔기를 포함하는 항박테리아 활성을 지니는 신규한 바시트라신 화합물에 관한 것이다. 이러한 바시트라신은 5-메틸렌-이소류신의 하나 이상의 측쇄를 포함한다. 5-메틸렌-이소류신의 측쇄는 하기와 같이 표시될 수 있었다:
Figure pct00002
본 발명은 5-메틸렌-이소류신의 하나 이상의 측쇄를 포함하는 항박테리아 활성을 지니는 바시트라신 화합물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 바시트라신은 위치 1 및/또는 5 및/또는 8에 하나 이상의 5-메틸렌-이소류신 잔기를 포함한다. 그러한 화합물은 하기 구조식을 지닌다:
Figure pct00003
상기 식에서,
R1, R2 및 R3 중 하나 이상은 -CH=CH2이고,
R1, R2 및 R3은 독립적으로 -H, -CH3, 또는 -CH=CH2이다.
상기 구조식은 Rl, R2 및 R3이 모두 -CH3인 경우의 바시트라신을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
따라서, 바시트라신 A는 하기와 같이 표시될 것이다:
Figure pct00004
본 발명자들은 5-메틸렌-이소류신 잔기를 위치 5에 포함하는 본 발명에 따른 바시트라신에 대해 바시트라신 J1이라는 명칭을 제안하고 이를 이용한다. 이러한 명명법은 C18-컬럼으로부터의 용리 순서에 기반한다.
본 발명자들은 5-메틸렌-이소류신 잔기를 위치 8에 포함하는 본 발명에 따른 바시트라신에 대해 바시트라신 J2라는 명칭을 제안하고 이를 이용한다. 이러한 명명법은 C18-컬럼으로부터의 용리 순서에 기반한다.
본 발명자들은 5-메틸렌-이소류신 잔기를 위치 1에 포함하는 본 발명에 따른 바시트라신에 대해 바시트라신 J3이라는 명칭을 제안하고 이를 이용한다. 이러한 명명법은 C18-컬럼으로부터의 용리 순서에 기반한다.
본 발명자들은 5-메틸렌-이소류신 잔기를 위치 5 및 8에 포함하는 본 발명에 따른 바시트라신에 대해 바시트라신 K1이라는 명칭을 제안하고 이를 이용한다. 이러한 명명법은 C18-컬럼으로부터의 용리 순서에 기반한다.
본 발명자들은 5-메틸렌-이소류신 잔기를 위치 1 및 5에 포함하는 본 발명에 따른 바시트라신에 대해 바시트라신 K2라는 명칭을 제안하고 이를 이용한다. 이러한 명명법은 C18-컬럼으로부터의 용리 순서에 기반한다.
본 발명자들은 5-메틸렌-이소류신 잔기를 위치 1 및 8에 포함하는 본 발명에 따른 바시트라신에 대해 바시트라신 K3이라는 명칭을 제안하고 이를 이용한다. 이러한 명명법은 C18-컬럼으로부터의 용리 순서에 기반한다.
본 발명자들은 5-메틸렌-이소류신 잔기를 위치 1, 5 및 8에 포함하는 본 발명에 따른 바시트라신에 대해 바시트라신 L이라는 명칭을 제안하고 이를 이용한다. 이러한 명명법은 C18-컬럼으로부터의 용리 순서에 기반한다.
본 발명의 양태는 하기 발명의 설명 및/또는 첨부된 특허 청구범위에 개시된 특징들에 의해 수득될 수 있다.
발명의 상세한 설명
정의:
"바시트라신"은 하기 구조를 포함하는 펩티드 화합물이다 (위첨자로 넘버링된 아미노산 잔기를 지님):
Figure pct00005
상기 식에서, X는
Figure pct00006
이고,
여기서 R은 이소류신, 발린 또는 5-메틸렌-이소류신의 아미노산 잔기의 측쇄이고;
Y 및 Z는 독립적으로 이소류신, 발린 또는 5-메틸렌-이소류신의 아미노산 잔기이고;
Thz는 X에 2' 커플링되고 Leu의 α-탄소에 4' 커플링된 티아졸린 고리
Figure pct00007
이고;
Leu은 류신 아미노산 잔기이고
Glu는 글루타민 아미노산 잔기이며
Lys는 Y 및 Orn과 펩티드 결합을 형성하는 리신 아미노산 잔기인 한편, 이의 ε-아민은 펩티드 결합에 의해 아스파라긴의 α-카르복실기에 커플링되고
Orn은 오르니틴 아미노산 잔기이고
Phe은 페닐알라닌 아미노산 잔기이며
His는 히스티딘 아미노산 잔기이고
Asp는 아스파르트산 아미노산 잔기이며
Asn은 Asp와 펩티드 결합을 형성하는 아스파라긴 아미노산 잔기인 한편, 이의 α-카르복실기는 펩티드 결합에 의해 리신의 ε-아민에 커플링되되며;
본 출원에 이용시에, "바시트라신"은 생산 방법과 무관하게 상기 구조를 지니는 어떠한 화합물을 포함한다. 따라서, 용어 "바시트라신"은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)에 의해 천연적으로 생산된 항생제 화합물 뿐만 아니라 상기 주요 구조를 지니는 시험관내 생산된 화합물 (합성) 및 반합성 화합물도 포함한다. "바시트라신"은 또한 pH에 따라 변화되는 전하와 무관하게 상기 구조를 지니는 어떠한 화합물을 포함한다. "바시트라신"은 또한 입체화학과 무관하게 상기 주요 구조를 지니는 어떠한 화합물을 포함한다. "바시트라신"은 또한 상기 주요 구조를 지니는 화합물의 염 및 수화물을 포함한다.
"하나 이상의 5-메틸렌-이소류신 잔기를 포함하는 바시트라신"은 이소류신 또는 발린 잔기(들)가 위치 1 및/또는 5 및/또는 8에서 5-메틸렌-이소류신 잔기(들)로 치환되는 경우 생성될 구조를 포함하는 어떠한 바시트라신을 포함한다.
"5-메틸렌-이소류신 잔기를 포함하는 바시트라신"은 이소류신 또는 발린 잔기가 위치 1 또는 5 또는 8에서 5-메틸렌-이소류신 잔기로 치환되는 경우 생성될 구조를 나타내는 어떠한 바시트라신을 포함한다.
"하나 이상의 5-메틸렌-이소류신의 측쇄를 포함하는 바시트라신"은 "하나 이상의 5-메틸렌-이소류신 잔기를 포함하는 바시트라신"을 포함한다.
바시트라신의 N-말단 아미노기 및/또는 티아졸린 고리가 산화될 때, 항박테리아 활성의 실질적인 정도는 감소한다. 예를 들어, 낮은 활성 화합물인 바시트라신 F는 아미노-티아졸린 모이어티 대신 케토-티아졸 모이어티를 포함한다 (J. Org. Chem, vol. 22, 1957, page 1345- 1353 by Craig et al).
D-배치의 아미노산은 비-리보좀에 의해 합성된 박테리아 펩티드에 일반적이고 리보좀에 의해 합성된 단백질에 덜 일반적이다. 예를 들어 바시트라신에서, 위치 4, 7, 9 및 11의 아미노산 잔기는 일반적으로 D-배치이다 (Glu, Orn, Phe 및 Asp).
5-메틸렌-이소류신은 독립적으로 R 또는 S 배치일 수 있었던 두 개의 카이랄 탄소 원자를 포함한다.
"아미노산 잔기"는 하기를 포함하는 펩티드의 유닛이다:
-NH-CHR-COOH (C-말단 잔기)
또는
NH2-CHR-CO- (N-말단 잔기)
또는
-NH-CHR-CO- (내부 잔기)
여기서 R은,
- 글리신의 H,
- 알라닌의 CH3,
- 세린의 OH,
- 시스테인의 CH2SH,
- 이소류신의 CH(CH3)CH2CH3,
- 류신의 CH2CH(CH3)2,
- 발린의 CH(CH3)2 등이다.
"아미노산 측쇄"는 "아미노산 잔기"의 R 기이다. 예를 들어, R 기는,
- 5-메틸렌-이소류신의 CH(CH3)CH2CH=CH2,
- 이소류신의 CH(CH3)CH2CH3,
- 류신의 CH2CH(CH3)2,
- 발린의 CH(CH3)2이다.
"항박테리아 활성"은,
? 박테리아의 성장, 대사 또는 재생을 억제하거나
? 박테리아의 사멸율을 증가시키거나
? 박테리아의 병원성을 감소시키는 임의의 활성이다.
효능은 시험관내 항박테리아 활성이다. 이것은 측정되고 IU/mg로서 표시될 수 있다.
바시트라신에서 아미노산 잔기의 "위치"는 위치 1에 이소류신, 발린 또는 5-메틸렌-이소류신이 있을 수 있는 N-말단으로부터 넘버링된다 (본 출원에서 바시트라신을 도시하는 모든 도면에서의 왼쪽 끝). 따라서, Lys은 위치 번호 6에 존재하고 Asn은 위치 번호 12에 존재한다.
바시트라신에서, "위치 1"은 특별한데, 그 이유는 이러한 아미노산 잔기가 티아졸린 고리내로 부분적으로 혼입되기 때문이다. 따라서, 바시트라신에서 위치 1에 있는 아미노산 잔기는 일반적인 N-말단 유닛인
Figure pct00008
을 포함하지 않으나, 대신 티아졸린 또는 이의 산화된 유도체에 커플링된
Figure pct00009
을 포함한다.
"조성물"은 두 개 초과의 상이한 화합물을 포함하는 임의의 혼합물이다. 예를 들어, 두 개의 활성 약학적 성분들의 혼합물, 또는 활성 약학적 성분과 하나 이상의 약학적 부형제의 혼합물이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "성분" 또는 "성분들"은 조성물에 있는 특수한 화합물을 지칭한다. 따라서, "소수 성분"은 조성물에서 비교적 소량으로 발견되는 화합물이다.
"약학적 조성물"은 생체내 사용하기에 적합한 임의의 조성물이다. 따라서 그러한 조성물은 피부, 피하, 정맥내, 비경구, 경구 등에 투여될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 5-메틸렌-이소류신 잔기의 측쇄를 포함하는 신규한 바시트라신 화합물에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 하나 이상의 5-메틸렌-이소류신 잔기를 포함하는 항박테리아 활성을 지니는 신규한 바시트라신 화합물에 관한 것이다.
심지어 더욱 구체적으로, 본 발명은 위치 1 또는 5 또는 8에 하나 이상의 5-메틸렌-이소류신 잔기(들)를 포함하는 개선된 항박테리아 활성을 지니는 신규한 바시트라신 화합물에 관한 것이다.
심지어 더욱 특히, 본 발명은 위치 1 또는 5 또는 8에 하나의 5-메틸렌-이소류신을 포함하는 항박테리아 활성을 지니는 신규한 바시트라신 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 위치 1 및 5에 두 개의 5-메틸렌-이소류신 잔기를 포함하는 항박테리아 활성을 지니는 신규한 바시트라신 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 위치 1 및 8에 두 개의 5-메틸렌-이소류신 잔기를 포함하는 항박테리아 활성을 지니는 신규한 바시트라신 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 위치 5 및 8에 두 개의 5-메틸렌-이소류신 잔기를 포함하는 항박테리아 활성을 지니는 신규한 바시트라신 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 위치 1 및 5 및 8에 세 개의 5-메틸렌-이소류신 잔기를 포함하는 항박테리아 활성을 지니는 신규한 바시트라신 화합물에 관한 것이다.
위치 1, 5 또는 8에 하나 이상의 5-메틸렌-이소류신 잔기를 포함하는 바시트라신은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 원치 않는 박테리아 성장을 억제하는데 사용될 수 있다. 따라서 이러한 화합물은 박테리아 감염된 동물 또는 인간에게 투여되는 경우 치료 효과를 지닐 수 있다.
5-메틸렌-이소류신 잔기가 위치 1, 5 또는 8에서 바시트라신에 혼입될 때, 생성된 아미노산 측쇄는 포화되지 않고 5개의 탄소 원자를 포함한다. 이소류신 및 발린 잔기의 측쇄는 각각 4개 또는 3개의 탄소 원자를 포함한다. C18-컬럼으로부터의 용리 순서는 바시트라신 A, 바시트라신 J1, 바시트라신 J2 및 바시트라신 J3의 순서이다 (도 1의 크로마토그램 참조). 따라서, 이소류신 측쇄를 5-메틸렌-이소류신 측쇄로 치환하는 것이 더욱 소수성인 바시트라신을 초래함이 타당하다.
Figure pct00010
본 발명의 바람직한 화합물은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)에 의해 천연적으로 생산된 바시트라신 J1-3; 예컨대 도 8a-8c에 도시된 바시트라신 J1, 바시트라신 J2 및 바시트라신 J3이다.
본 발명의 바람직한 화합물은 천연 발효 생성물인 바시트라신 A와 동일한 입체화학을 지니는 바시트라신 J1-3이다.
본 발명의 바람직한 화합물은 바시트라신 J1-3, 바시트라신 K1-3 또는 바시트라신 L이고 여기서 위치 4, 7, 9 및 11의 아미노산 잔기는 D-배치이다(Glu, Orn, Phe 및 Asp).
약어:
Mil = 5-메틸렌-이소류신
Thz = 티아졸린
Ala = 알라닌
Arg = 아르기닌
Asn= 아스파라긴
Asp = 아스파르트산
Cys = 시스테인
Gin = 글루타민
Glu = 글루타메이트
Phe = 페닐알라닌
Gly = 글리신
His = 히스티딘
Ile = 이소류신
Lys = 리신
Leu = 류신
Met = 메티오닌
Pro = 프롤린
Ser = 세린
Thr = 트레오닌
Trp = 트립토판
Tyr = 티로신
Val = 발린
LC-MS = 액체 크로마토그래피-질량 분석
NMR = 핵 자기 공명
V = 부피
M = 몰
본 출원에 기재된 바시트라신의 생산은 문헌[[J Org Chem, vol. 61 no. 12, 1996, page 3983-3986 by Lee et al]에 기재된 대로 고형상 합성에 의해 수행될 수 있다.
WO 199747313호는 본 발명의 신규한 바시트라신을 생산하기 위해 이용될 수 있었던 바시트라신 펩티드의 합성을 기재한다.
대안적으로, 신규한 바시트라신은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)의 바시트라신 생산 균주로부터 생산될 수 있고 정제에 의해 수득될 수 있다.
도 1a는 YMC-Pack Pro C18-컬럼 (5 ㎛, 250 x 2.0 mm)을 이용하여 30℃에서 수득된 Axellia (BANN 21 1412)의 상업적 로트의 254 nm에서의 UV 크로마토그램을 도시한다. 이동상은 메탄올/아세토니트릴/0.1M 암모늄 아세테이트 pH 6.0/물 58:5:10:27, v/v/v/v로 구성된다. 동용매 조건은 0.2 ml/분의 유량으로 이용되었다. 주입 부피는 10 ㎕였다. 바시트라신 A 외에, 모두가 바시트라신 A보다 12 Da 많은 분자량을 지니는 바시트라신 J1, 바시트라신 J2 및 바시트라신 J3으로 지칭된 세 개의 소수 성분들이 표시된다.
도 1b는 도 1a에서와 같은 표시로 상응하는 MS TIC 크로마토그램을 도시한다.
도 2a는 바시트라신 A의 구조를 도시하며, 여기서 단편 이온 지정은 하기 생성물 이온 스펙트럼에서 특징적인 이온에 대해 수행된다.
도 2b는 바시트라신 A의 생성물 이온 (MS/MS) 스펙트럼을 도시하며, 이 때 m/z 712.0 ([M+2H]2+)에 있는 전구체 이온이 분리되고 단편화된다.
도 3a는 바시트라신 A의 시클릭 부분의 구조를 도시하며, 여기서 단편 이온 지정은 하기 두 번째-생성된 생성물 이온 스펙트럼에서 특징적인 이온에 대해 수행된다.
도 3b는 바시트라신 A의 두 번째-생성된 생성물 이온 (MS3) 스펙트럼을 도시하며, 여기서 보존적 전구체 이온은 m/z 712.0 ([M+2H]2+) 및 m/z 869.6 ([M+H]+)에 존재한다.
도 4a는 바시트라신 J1의 구조를 도시하며, 여기서 단편 이온 지정은 하기 생성물 이온 스펙트럼에서 특징적인 이온에 대해 수행된다.
도 4b는 바시트라신 J1의 생성물 이온 (MS/MS) 스펙트럼을 도시하며, 이 때 m/z 718.0 ([M+2H]2+)에 있는 전구체 이온이 분리되고 단편화된다.
도 5a는 바시트라신 J2의 구조를 도시하며, 여기서 단편 이온 지정은 하기 생성물 이온 스펙트럼에서 특징적인 이온에 대해 수행된다. 도 5b는 바시트라신 J2의 생성물 이온 (MS/MS) 스펙트럼을 도시하며, 이 때 m/z 718.0 ([M+2H]2+)에 있는 전구체 이온이 분리되고 단편화된다.
도 6a는 바시트라신 J2의 시클릭 부분의 구조를 도시하며, 여기서 단편 이온 지정은 하기 두 번째-생성된 생성물 이온 스펙트럼에서 특징적인 이온에 대해 수행된다.
도 6b는 바시트라신 J2의 두 번째-생성된 생성물 이온 (MS3) 스펙트럼을 도시하며, 여기서 보존적 전구체 이온은 m/z 718.0 ([M+2H]2+) 및 m/z 881.6 ([M+H]+)에 존재한다.
도 7a는 바시트라신 J3의 구조를 도시하며, 여기서 단편 이온 지정은 하기 생성물 이온 스펙트럼에서 특징적인 이온에 대해 수행된다. 도 7b는 바시트라신 J3의 생성물 이온 (MS/MS) 스펙트럼을 도시하며, 이 때 m/z 718.0 ([M+2H]2+)에 있는 전구체 이온이 분리되고 단편화된다.
도 8a는 위치 5에 5-메틸렌-이소류신 잔기를 지니는 바시트라신의 구조를 도시한다 (= 바시트라신 J1).
도 8b는 위치 8에 5-메틸렌-이소류신 잔기를 지니는 바시트라신의 구조를 도시한다 (= 바시트라신 J2).
도 8c는 위치 1에 5-메틸렌-이소류신 잔기를 지니는 바시트라신의 구조를 도시한다 (= 바시트라신 J3).
도 8d는 위치 5 및 8에 5-메틸렌-이소류신 잔기를 지니는 바시트라신의 구조를 도시한다 (= 바시트라신 K1).
도 8e는 위치 1 및 5에 5-메틸렌-이소류신 잔기를 지니는 바시트라신의 구조를 도시한다 (= 바시트라신 K2).
도 8f는 위치 1 및 8에 5-메틸렌-이소류신 잔기를 지니는 바시트라신의 구조를 도시한다 (= 바시트라신 K3).
도 8g는 위치 1, 5 및 8에 5-메틸렌-이소류신 잔기를 지니는 바시트라신의 구조를 도시한다 (= 바시트라신 L).
본 발명은 청구범위에 의해 규정되며 하기 예시적인 실시예에 의해 한정되지 않는다.
실험 1 : LC - MS n
사용된 샘플은 Axellia Pharmaceuticals로부터의 상업적 로트였다. 샘플을 물에 2 mg/ml의 농도로 용해시킨 다음 LC-MSn 분석에 앞서 0.45 ㎛ 필터 (VWR)를 통해 여과하였다.
Surveyor HPLC 시스템 (Thermo Fisher)은 4차 펌프, 탈가스기, 온도조절된 오토샘플러 (5℃로 설정), 온도조절된 컬럼 구획 (30℃로 설정) 및 다이오드-어레이 검출기 (254 nm로 설정)로 구성되었다. HPLC 조건은 문헌[Govaerts et al (Rapid Communications in Mass Spectrometry, vol. 17, no 12, page 1366-1379]에 기재된 것과 같았다. YMC-Pack Pro C18-컬럼 (5 ㎛, 250 x 2.0 mm)을 이용하였다. 이동상은 메탄올/아세토니트릴/0.1 M 암모늄 아세테이트 pH 6.0/물 58:5:10:27, v/v/v/v로 구성되었다. 0.1 M 아세트산을 첨가함에 의해 0.1 M 암모늄 아세테이트 용액을 pH 6.0으로 조정하였다. 동용매 조건을 0.2 ml/분의 유량으로 이용하였다. 주입 부피는 10 ㎕였다. ESI 인터페이스가 구비된 LXQ 선형 이온 트랩 질량 분광계 (Thermo Fisher)를 HPLC 시스템에 연결시켰다. 이중 양성자화된 분자 이온 ([M+2H]2+) 상에서 바시트라신 A의 튜닝을 수행하였다. ESI 파라메터를 다음과 같이 설정하였다: 시스 가스(sheath gas) 35 (임의 유닛), 보조 가스 10 (임의 유닛), 스프레이 전압 5.0 kV, 모세관 온도 320℃, 모세관 전압 9.0V, 튜브 렌즈 전압 95V. MS 파라메터를 다음과 같이 설정하였다: RF 렌즈 오프셋 -4.25 V, 렌즈 0 전압 -3.0 V, 다극 0 오프셋 -4.5 V, 렌즈 1 전압 -8.0 V, 게이트 렌즈 전압 -56 V, 다극 1 오프셋 -9.5 V, 다극 RF 진폭 400 V, 정면 렌즈 전압 -6.5 V. LC-MS/MS- 및 LC-MS3-분석을 절연 폭 3 및 충돌 에너지 16%로 수행하였다.
결과
Axellia Pharmaceuticals로부터의 전형적인 로트 (BANN 211412)의 UV- 및 MS-크로마토그램을 도 1a-b에 도시한다. UV-크로마토그램은 LC-MS 부적합 Ph. Eur. HPLC 방법을 이용한 이러한 로트의 상응하는 크로마토그램과 매우 유사하다. 바시트라신 A 외에, 모두가 바시트라신 A보다 12 Da 많은 분자량을 지니는 바시트라신 J1, 바시트라신 J2 및 바시트라신 J3으로 지칭된 세 개의 소수 성분들이 도 1에 표시된다. 이러한 세 개의 성분의 구조적 설명은 본 출원에 기재될 것이고 이들의 구조는 그 표시에 대한 이론적 설명을 제공할 것이다.
바시트라신 A
이중 양성자화된 분자 이온 ([M+2H]2+, m/z 712.0)을 분리 및 단편화하고 초래된 생성물 이온 (MS/MS) 스펙트럼을 도 2b에 도시한다. 스펙트럼은 m/z 1337.7/669.82+ (Ile의 손실), m/z 1224.7/613.12+ (IleThz의 손실), m/z 1111.7 (IleThzLeu의 손실), m/z 982.6/492.22+ (IleThzLeuGlu의 손실) 및 m/z 869.6 (IleThzLeuGluIle의 손실)을 갖는 y" 이온의 풀셋을 함유한다. 이러한 단편 지정을 도 2a에 나타낸다. m/z 554.5 (IleThzLeuGluIle) 및 m/z 441.3 (IleThzLeuGlu)을 지니는 b 이온에 추가하여, 결합 쌍 절단에서 비롯된 단편 이온은 m/z 227.1 (ThzLeu), m/z 356.1 (ThzLeuGlu) 및 m/z 469.2 (ThzLeuGluIle)에서 관찰될 수 있다.
바시트라신 A의 시클릭 부분의 서열화는 MS3 실험 (712.0→869.6)에서 m/z 869.6에 있는 고리 부분 단편 이온을 추가로 분리하고 단편화함에 의해 수행되었다, 도 3b 참조. Orn 및 Ile 사이에서의 우선적인 고리 개환으로 도 3a에 도시된 두 개 시리즈의 단편 이온을 생성한다. 한 시리즈는 m/z 756.5 (Ile의 손실), m/z 609.4 (IlePhe의 손실), m/z 472.4 (IlePheHis의 손실) 및 m/z 357.4 (IlePheHisAsp의 손실)에서 생성물 이온을 포함한다. 다른 시리즈에서, m/z 755.6 (Orn의 손실), m/z 627.4 (OrnLys의 손실), m/z 513.4 (OrnLysAsn의 손실) 및 m/z 398.4 (OrnLysAsnAsp의 손실)에서 생성물 이온이 발견된다. 따라서 이러한 모든 단편 이온은 바시트라신 A의 널리 확립된 서열이 옳음을 증명하고 단편화 패턴 비교에 의한 알려지지 않은 바시트라신 유사체의 서열을 밝힐 가능성을 제시한다.
바시트라신 J1
바시트라신 A에 대한 것과 동일한 방법을 이용하여, 바시트라신 A와 +12 Da 차이의 원인이 되는 변형 위치를 결정할 수 있었다. 이중 양성자화된 분자 이온 ([M+2H]2+, m/z 718.0)을 분리 및 단편화하고 초래된 생성물 이온 (MS/MS) 스펙트럼을 도 4b에 도시한다. 스펙트럼은 m/z 1349.7/675.82+ (Ile의 손실), m/z 1236.7/619.12+ (IleThz의 손실), m/z 1123.7 (IleThzLeu의 손실), m/z 994.6/498.12+ (IleThzLeuGlu의 손실) 및 m/z 869.6 (IleThzLeuGluMil의 손실)을 지니는 y" 이온의 풀셋을 함유한다. 이러한 단편 지정은 도 4a에 도시된다. m/z 566.4 (IleThzLeuGluMil) 및 m/z 441.3 (IleThzLeuGlu)을 지니는 b 이온에 추가하여, 결합 쌍 절단에서 비롯된 단편 이온이 m/z 227.1 (ThzLeu), m/z 356.1 (ThzLeuGlu) 및 m/z 481.2 (ThzLeuGluMil)에서 보여질 수 있다.
LC-MS3 실험 (718.0→869.6)은 바시트라신 A의 시클릭 부분에 대한 상응하는 실험과 동일한 특징적인 단편 이온을 제공하였다. 따라서 이러한 모든 단편 이온은 이러한 성분의 위치 5에서 Ile보다 12 Da 더 무거운 잔기에 관해 일관되며, 반면 서열의 나머지는 바시트라신 A:s와 동일한 것으로 보인다.
바시트라신 J2
바시트라신 A에 대한 것과 동일한 방법을 이용하여, 바시트라신 A와 +12 Da 차이의 원인이 되는 변형 위치를 결정할 수 있었다. 이중 양성자화된 분자 이온 ([M+2H]2+, m/z 718.0)을 분리 및 단편화하고 초래된 생성물 이온 (MS/MS) 스펙트럼을 도 5b에 도시한다. 스펙트럼은 m/z 1349.7/675.82+ (Ile의 손실), m/z 1236.7/619.22+ (IleThz의 손실), m/z 1123.7 (IleThzLeu의 손실), m/z 994.6/498.12+ (IleThzLeuGlu의 손실) 및 m/z 881.6 (IleThzLeuGluIle의 손실)을 지니는 y" 이온의 풀셋을 함유한다. 이러한 단편 지정은 도 5a에 도시된다. m/z 554.4 (IleThzLeuGluIle) 및 m/z 441.3 (IleThzLeuGlu)을 지니는 b 이온에 추가하여, 결합 쌍 절단에서 비롯된 단편 이온이 m/z 227.1 (ThzLeu), m/z 356.1 (ThzLeuGlu) 및 m/z 469.2 (ThzLeuGluIle)에서 보여질 수 있다. 이러한 단편으로부터, 바시트라신 A로부터의 +12 Da 변형이 분자의 고리 부분에 존재함이 명백하다.
MS3 실험 (718.0→881.6)에서 m/z 881.6에 있는 고리 부분 단편 이온을 추가로 분리하고 단편화함에 의해 바시트라신 J2의 시클릭 부분의 서열화를 수행하였다, 도 6b 참조. Orn 및 Ile 사이에서의 우선적인 고리 개환으로 도 6a에 도시된 두 개 시리즈의 단편 이온을 생성한다. 한 시리즈는 m/z 756.4 (Mil의 손실), m/z 609.5 (MilPhe의 손실), m/z 472.4 (MilPheHis의 손실) 및 m/z 357.4 (MilPheHisAsp의 손실)에서 생성물 이온을 포함한다. 다른 시리즈에서, m/z 767.4 (Orn의 손실), m/z 639.4 (OrnLys의 손실), m/z 525.4 (OrnLysAsn의 손실) 및 m/z 410.4 (OrnLysAsnAsp의 손실)에서 생성물 이온이 발견된다. 따라서 이러한 모든 단편 이온은 이러한 성분의 위치 8에서 Ile보다 12 Da 더 무거운 잔기에 관해 일관되며, 반면 서열의 나머지는 바시트라신 A와 동일한 것으로 보인다.
바시트라신 J3
바시트라신 A에 대한 것과 동일한 방법을 이용하여, 바시트라신 A와 +12 Da 차이의 원인이 되는 변형 위치를 결정할 수 있었다. 이중 양성자화된 분자 이온 ([M+2H]2+, m/z 718.0)을 분리 및 단편화하고 초래된 생성물 이온 (MS/MS) 스펙트럼을 도 7b에 도시한다. 스펙트럼은 m/z 1337.8/669.82+ (Mil의 손실), m/z 1224.8/613.22+ (MilThz의 손실), m/z 1111.7 (MilThzLeu의 손실), m/z 982.6/492.22+ (MilThzLeuGlu의 손실) 및 m/z 869.6 (MilThzLeuGluIle의 손실)을 지니는 y" 이온의 풀셋을 함유한다. 이러한 단편 지정은 도 7a에 도시된다. m/z 566.4 (MilThzLeuGluIle) 및 m/z 453.4 (MilThzLeuGlu)을 지니는 b 이온에 추가하여, 결합 쌍 절단에서 비롯된 단편 이온이 m/z 227.1 (ThzLeu), m/z 356.1 (ThzLeuGlu) 및 m/z 469.2 (ThzLeuGluIle)에서 보여질 수 있다.
LC-MS3 실험 (718.0→869.6)은 바시트라신 A의 시클릭 부분에 대한 상응하는 실험과 동일한 특징적인 단편 이온을 제공하였다. 따라서 이러한 모든 단편 이온은 이러한 성분의 위치 1에서 Ile보다 12 Da 더 무거운 잔기에 관해 일관되며, 반면 서열의 나머지는 바시트라신 A:s와 동일한 것으로 보인다.
실험 2: 성분 분리
세 개의 성분의 구조를 NMR 분석으로 밝히기 위해, 풍부화된 샘플이 제조되어야 한다. 전형적으로, 다른 성분들로부터의 방해 신호가 없는 "깨끗한" NMR 스펙트럼을 얻기 위해, 세 개의 성분들을 각각 약 90% 순도로 분리하여야 한다. 분리를 2 단계로 수행하였다. 첫 번째 단계에서, 세 개의 성분 전후로 용리되는 성분들을 제거하기 위해 LiChroprep RP-18-컬럼 (25-40 ㎛, 35 x 5 cm)을 이용하였다. 이동상은 메탄올/아세토니트릴/0.03 M 암모늄 포르메이트 pH 6.0 3.5:31.5:65, v/v/v로 구성되었다. 이러한 방식으로, 세 개의 성분에 대해 약 25%의 총 순도를 지니는 정제된 물질을 수득하였다. 두 번째 단계에서, YMC-Pack ODS-A-컬럼 (5 ㎛, 250 x 10 mm)을 이용하여 세 개의 성분들을 서로에게서 분리하였다. 이동상은 메탄올/아세토니트릴/0.025 M 암모늄 아세테이트 pH 6.0 58:5:37, v/v/v로 구성되었다. 이러한 2-단계 정제의 최종 결과는 4개의 샘플이었고 (샘플 B, B', C 및 C'로 표시됨), 여기서 샘플 B 및 B'는 유사하였고 주로 바시트라신 J1 및 바시트라신 A를 함유하였으며, 샘플 C 및 C'는 유사하였고 주로 바시트라신 J2 및 바시트라신 J3을 함유하였다 (표 1).
올바른 성분이 분리되었음을 증명하기 위해 모든 샘플에 대해 LC-MSn을 수행하였다. 샘플 B 및 C의 순도는 충분한 NMR 해명을 위해 일반적으로 필요한 것으로 여겨지는 것보다 훨씬 낮았다. 그러나, 샘플 B에서의 다른 주요 성분이 바시트라신 A였기 때문에, 추가 정제 없이 NMR 조사를 시도해 보기로 하였다. 풍부화된 함량의 바시트라신 A를 지니는 샘플에 대한 첫 번째 NMR 조사를 수행함에 의해 (샘플 A로 표시됨, 앞서 제조됨), 참조 화합물로서 소용되는 것에 추가하여, 바시트라신 A로부터의 신호를 샘플 B의 스펙트럼으로부터 생략할 수 있었을 것으로 기대되었다. 샘플 C가 바시트라신 J2 및 바시트라신 J3의 혼합물을 함유하였기 때문에, 예상된 높은 정도의 중첩 신호로 인해 충분한 구조적 해명이 기대될 수 없었다. 그러나, 이러한 성분들에서의 변형이 바시트라신 J1 (LC-MSn 시도로부터, 실험 1 참조)에서와 동일할 것으로 예상되었으므로, LC-MSn으로부터의 결과와 함께 NMR 실험이 충분한 구조적 증거를 제공할 것으로 여전히 기대되었다.
표 1. 샘플 A, B, B', C 및 C'에서 성분 바시트라신 A, 바시트라신 J1 , 바시트라신 J2 및 바시트라신 J3의 비율 (254 nm에서 면적 %)
Figure pct00011
실험 3: 정밀한 질량 측정
샘플 A, B' 및 C를 정밀한 질량 측정에 의해 분석하였다 (표 2 참조). 바시트라신 J1/바시트라신 A 사이의 분자량 차이는 11.9998이었다. 바시트라신 J2/바시트라신 A 및 바시트라신 J3/바시트라신 A 둘 모두의 분자량 차이는 각각 12.0000이었다. 이는, 성분 바시트라신 J1, 바시트라신 J2 및 바시트라신 J3이 바시트라신 A보다 하나 더 많은 탄소 원자 (정확한 질량 12.0000)로 구성된 기본 조성을 지닌다는 추가의 증거를 제공하였다.
표 2. 샘플 A, B' 및 C에 대한 정밀한 질량 측정에 의해 수득된 정확한 질량.
Figure pct00012
실험 4: NMR
NMR 스펙트럼을 95% 포스페이트 완충제 pH 6.5/303K의 5% D20에서 샘플 A, B 및 C의 10 mM 용액에 대해 기록하였다. Bruker 600 MHz 분광계 상에서 2차원 호모누클리어 양성자 화학적 시프트 상호관계 (DQF-COSY, TOCSY, NOESY), 헤테로누클리어 1H-13C 상호관계 (HSQC, HMBC) 및 헤테로누클리어 1H-15N 상호관계 (HSQC) 실험을 위한 표준 펄스 순서를 이용하여 실험을 행하였다. TOCSY 실험에 대해 20 ms 및 60 ms의 혼합 시간을 이용하였고, 100 ms, 200 ms, 400 ms 및 600 ms의 혼합 시간을 NOESY 실험에서 이용하였다. 샘플 C의 경우, DEPT(135) 실험을 행하였다. 참조로서 내부 2,2-디메틸-2-실라펜탄-5-설폰산 (0.5 mM)을 이용하여 화학적 시프트를 p.p.m.으로 기록하였다.
결과
샘플 A (바시트라신 A)
아미노산 스핀-시스템의 확인을 1H 검출 모드에서 2D 1H-1H 화학적 시프트 상호관계 실험 (DQF-COSY 및 TOCSY) 및 헤테로누클리어 1H-13C 및 1H-15N 화학적 시프트 상호관계 (HSQC)에 의해 수행하고 데이터를 표 3에 요약하였다. 화학적 시프트 데이터는 문헌[Kobayashi et al. (1992)]에 기재된 1H 화학적 시프트 데이터 (표 3 참조) 및 BMRB 데이터베이스에서 발견된 화학적 시프트 통계치 (표 3 참조) 둘 모두의 비교로부터 잔기 Ile, Thz, Leu, Glu, Ile, Lys, Orn, Ile, Phe, His, Asp 및 Asn의 존재에 관해 일치하였다.
아미노산 잔기의 서열을 2D 1H-1H (NOESY, 표 4) 및 1H-13C (HMBC, 표 5) 상호관계 실험으로부터 확립하였다. 2극성 커플링 (공간을 통하여, NOESY) 및 장거리 스칼라 커플링 (HMBC)은 바시트라신 A의 널리 확립된 서열대로였다:
Figure pct00013
표 3. 바시트라신 A (샘플 A에서) 및 바시트라신 J1 (샘플 B에서)에 대한 1 H, 13 C 및 15 N 화학적 시프트 . 데이터를 95% 포스페이트 완충제 pH 6.5/303K의 5% D20에서 기록하였다. 참조로서 내부 2,2-디메틸-2-실라펜탄-5-설폰산 (0.5 mM)을 이용하여 화학적 시프트를 p.p.m.으로 기록하였다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016

Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
a 단백질 및 핵산의 NMR 구조의 제시를 위한 IUPAC 권고에 따른 명명법.
b Kobayashi et al. (1992) FEBS Lett. 2, 105-09.
c BMRB 데이터베이스: 선택된 화학적 시프트에 대해 계산된 통계치.
http://www.bmrb.wisc.edu/ref_info/statsel.htm
표 4. 바시트라신 A (샘플 A에서) 및 바시트라신 J1 (샘플 B에서)에 대한 양성자 NOE 데이터. NOESY 실험으로부터 측정이 이루어졌다.
Figure pct00020
a 측쇄 아미드 양성자.
b 바시트라신 J1에서만 발생한 NOE 데이터.
표 5. 바시트라신 A (샘플 A에서) 및 바시트라신 J1 (샘플 B에서)의 카르보닐 탄소로부터 잔기간 및 잔기내 2 J H ,C -연결도. HMBC 실험으로부터 측정이 이루어졌다.
Figure pct00021
a 2-티아졸린 고리에서 축합된 카르보닐 탄소.
b 바시트라신 J1에서만 발생한 HMBC 데이터.
샘플 B (바시트라신 J1 )
아미노산 스핀-시스템의 확인을 1H 검출 모드에서 2D 1H-1H 화학적 시프트 상호관계 실험 (DQF-COSY 및 TOCSY) 및 헤테로누클리어 1H-13C 및 1H-15N 화학적 시프트 상호관계 (HSQC)에 의해 수행하고 데이터를 표 3에 요약하였다. 잔기 Ile, Thz, Leu, Glu, Lys, Orn, Ile, Phe, His, Asp 및 Asn에 대한 화학적 시프트 데이터는 바시트라신 A에 대한 상응하는 데이터와 거의 동일하였는데, 이는 동일한 잔기가 샘플 B의 주요 성분에서 변형되지 않은 채로 발견됨을 나타낸다. 주목할 만하게는, 바시트라신 A에서 Ile5에 상응하는 스핀-시스템은 샘플 A에서와 비교하여 이러한 샘플에서 현저히 약하였다 (샘플 B가 약 20%의 바시트라신 A를 함유하였음을 상기한다).
이러한 신호에 추가하여, δ 8.19 (백본 아미드 양성자), 5.72, 5.06, 4.11, 2.10, 1.98, 1.90 및 0.82에서 공명을 지닌 3 J H ,H-커플링된 스핀-시스템이 발견되었다. δ 5.72/138.2, δ 5.06/120.1, δ 4.11/60.8, δ 2.10/38.8, δ 1.90/38.8, δ 1.98/36.7 및 δ 0.82/17.9에서의 HSQC 크로스-피크는 6개 이상의 CHx-기를 나타내었다. δ 8.19/4.11, δ 4.11/1.98, δ 1.98/0.82에서의 COSY 크로스-피크 및 δ 8.19/60.8, δ 4.11/175.7, δ 4.11/36.7, δ 4.11/17.9, δ 0.82/60.8 및 δ 0.82/36.7에서의 HMBC 크로스-피크는 하기 엘리먼트 -NHCH(CO)CHCH3의 증거가 되는데, 이는 또한 예상된 NOE 상호관계에 의해 지지되었다.
δ 2.10/1.90에서의 COSY 크로스-피크 및 δ 4.11/38.8, δ 0.82/38.8, δ 1.90/36.7 및 δ 1.90/17.9에서의 HMBC 크로스-피크는 하기 엘리먼트 -NHCH(CO)CH(CH3)CH2의 증거가 되는데, 이는 또한 예상된 NOE 상호관계에 의해 지지되었다.
δ 5.72/2.10, δ 5.72/1.90, δ 5.72/5.06에서의 COSY 크로스-피크 및 δ 5.72/38.8, δ 1.90/138.2, δ 5.06/38.8 및 δ 1.90/120.1에서의 HMBC 크로스-피크는 하기 신규한 엘리먼트 -NHCH(CO)CH(CH3)CH2CH=CH2의 증거가 되는데, 이는 또한 예상된 NOE 상호관계에 의해 지지되었다. Ile에 대한 이러한 독특한 아미노산-유사체에 대한 모든 화학적 시프트 데이터는 ChemDraw에 의해 생성된 예측 데이터와 유사하다 (데이터는 제시되지 않음).
아미노산 잔기의 서열은 2D 1H-1H (NOESY, 표 4) 및 1H-13C (HMBC, 표 5) 상호관계 실험으로부터 확립되었다. 아미노산 서열은 바시트라신 A에서와 동일한 것으로 나타났고, 여기서 독특한 Ile-유사체 (5-메틸렌-이소류신이라 부름)는 위치 5에서 Ile를 대신한다. 따라서 NMR 데이터는 LC-MSn 및 정밀 질량 측정의 결과에 일치하고, 이 때 모든 데이터는 샘플 A에서 하기 바시트라신 A-유사체의 존재를 나타낸다:
Figure pct00022
샘플 C (바시트라신 J2 및 바시트라신 J3 )
NMR 데이터는 샘플 B에 존재하는 동일한 드문 Ile-유사체의 두 개의 잔기의 존재를 입증한다 (표 6 참조). 샘플 A 및 B에 대해 획득한 2D 실험에 추가하여, DEPT(135) 실험을 또한 샘플 C에 대해 수행하였다 (표 6). 이러한 실험은 샘플 C에서 Ile에 대한 두 개의 독특하고 동일한 아미노산-유사체를 추가로 입증하였다. 이러한 Ile-유사체 중 하나는 N-말단에 위치하였고 (이의 가시적인 백본 아미드 양성자의 결여에 의해 표시된 대로), 상응하게 5-메틸렌-이소류신1로 표시되었다. 다른 Ile-유사체는 NOESY 및 HMBC 상호관계에 의해 입증된 바와 같이 위치 8에 위치하므로 5-메틸렌-이소류신8로 표시되었다. 따라서 NMR 데이터는 LC-MSn 및 정밀 질량 측정의 결과에 일치한다. 모든 데이터는 샘플 C에서 두 개의 바시트라신 A-유사체의 존재를 나타내며, 이 때 독특한 Ile-유사체는 하나의 바시트라신 A-유사체에서 위치 8에서 Ile를 대신하고, 독특한 Ile-유사체는 두 번째 바시트라신 A-유사체에서 위치 1에서 Ile를 대신한다:
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
표 6. 바시트라신 J2 및 바시트라신 J3 에 대한 (샘플 C에서) 1 H, 13 C 및 15 N 화학적 시프트 및 DEPT (135)-데이터. 데이터를 95% 포스페이트 완충제 pH 6.5/303K의 5% D20에서 기록하였다. 참조로서 내부 2,2-디메틸-2-실라펜탄-5-설폰산 (0.5 mM)을 이용하여 화학적 시프트를 p.p.m.으로 기록하였다.
Figure pct00026
a 단백질 및 핵산의 NMR 구조의 제시를 위한 IUPAC 권고에 따른 명명법.
실험 5: 효능
샘플 A, B' 및 C'의 항박테리아 활성 (표 1 참조)을 측정하였다. 종종 효능이라 지칭하는 특수한 항박테리아 활성 (본원에서 IU/mg로서 열거됨)을, 알려지지 않은 샘플의 항박테리아 활성을 알려진 (표준) 샘플과 비교함에 의해 측정하였다. 특히, 바시트라신 아연 표준을 용해시키고 0,07 M 포스페이트 완충제 pH 6.0 중에서 2.0, 1.0, 및 0.5 IU 바시트라신/ml로 희석하였다. 이러한 세 개의 표준 용액을 시험 유기체인 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus)로 접종된 아가 플레이트에 첨가하였다. 표준으로서, 알려지지 않은 샘플을 용해시키고, 희석하고, 동일한 플레이트에 첨가하였다. 32-37℃에서 16-24시간 후에, 억제 구역을 측정하고, 알려지지 않은 샘플을 표준과 비교하였다. 각각의 샘플의 결과 (IU/mg로서 기록됨)를 표 7에 나열한다.
표 7
분리된 샘플의 효능 (특수한 항박테리아 활성, IU/mg). 시험 유기체: 마이크로코쿠스 루테우스(Micrococcus luteus).
Figure pct00027
샘플 A는, 표 1에 나열된 대로, 93% (254 nm에서 HPLC로 측정됨)의 바시트라신 A (및 바시트라신 J1, J2 또는 J3 없음)를 함유하였다. 바시트라신 A의 특수한 항박테리아 활성은 그후 77.4 IU/mg로 계산될 수 있다. 이것은 앞서 보고된 것보다 낮은 것이다. 물 또는 염 함량, 및 소수 성분들의 있음직한 길항 효과가 가능한 설명일 수 있었다. 샘플 B' 및 C'가 여러 개의 바시트라신의 혼합물을 함유하기 때문에, 바시트라신 J1, J2 또는 J3의 정확한 구체적인 항미생물 활성 (IU/mg)을 기록하는 것은 불가능하다. 그러나, 이용가능한 데이터는, 바시트라신 J1, J2 및 J3의 효능이 바시트라신 A와 유사하거나 바시트라신 A 이상이었음을 강력하게 시사한다. 또한 샘플 B' 및 C'는 상승 효과 또는 길항 효과를 지니는 물, 염 및/또는 성분들을 함유할 수 있었다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식에 의해 표시되는 화합물, 또는 이의 염 또는 수화물:
    Figure pct00028

    상기 식에서,
    R1, R2 및 R3 중 하나 이상은 -CH=CH2이고,
    R1, R2 및 R3은 독립적으로 -H, -CH3 또는 -CH=CH2이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 R1, R2 및 R3 중 하나가 -CH3인 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 R1, R2 및 R3 중 두 개가 -CH3인 화합물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 R1이 -CH=CH2인 화합물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 R2가 -CH=CH2인 화합물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 R3이 -CH=CH2인 화합물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 R1 및 R2가 -CH=CH2인 화합물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 R2 및 R3이 -CH=CH2인 화합물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 R1 및 R3이 -CH=CH2인 화합물.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 R1, R2 및 R3이 -CH=CH2인 화합물.
  11. 제 1항의 화합물을 포함하는 조성물.
  12. 제 1항의 화합물을 포함하는 약학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 치료 효과를 지니는 약학적 조성물.
  14. 박테리아 감염을 치료하기 위한 약제의 제조에서 제 1항에 따른 화합물의 용도.
  15. 시험관내 바시트라신(Bacitracin) 합성 동안 이소류신 또는 발린을 5-메틸렌-이소류신으로 치환시킴에 의해 제 1항에 따른 화합물을 생성하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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