CN102596218A - 新型杆菌肽抗生素 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含次甲基-异亮氨酸的新型杆菌肽化合物。

Description

新型杆菌肽抗生素
技术领域
本发明涉及具有抗生素活性的新型化合物。
背景技术
由枯草芽孢杆菌和藓样芽胞杆菌自然产生的一组紧密相关的肽抗生素类称为杆菌肽。杆菌肽通常具有抗多种革兰氏阳性菌并且少数革兰氏阴性菌种类的活性。
已经鉴别出数种杆菌肽，其中杆菌肽A具有首要的重要性并且具有高度活性(Biochemistry，vol.39 no 14，2000，page 4037-45 by Epperson andMing)。杆菌肽是通过非核糖体肽合成的硫模板机理合成的一种分支的环十二肽内酰胺抗生素(Wagner et al，J.Am Chem Soc.vol.128，2006，page 1051 3-10520以及Kleinkauf and von
Figure BDA0000158440680000011
Eur J Biochem，vol.192no.1，1990，page 1-15)。
杆菌肽A的一级结构是在L-Lys6的ε-氨基基团与L-ASn12的R-羧基基团之间环化的NH2-L-Ile1-L-噻唑啉2-L-Leu3-D-Glu4-L-lle5-L-Lys6-D-Orn7-L-Ile8-D-Phe9-L-His10-D-Asp11-L-Asn12-COOH(Wagner et al，J.Am ChemSoc.Vol 128 page 10513-10520，2006)。
Ming等人(Journal of Inorganic Biochemistry，vol.91，2002)将杆菌肽描述成具有下式的肽化合物：
Figure BDA0000158440680000012
其中
X是Ile或Val
以及
Y是Ile或Val。
值得注意的是，R1和R3是活性杆菌肽的N-端部分，而R4和R5是较低活性杆菌肽的氧化的N-端部分。然而，R2是一个无活性的立体异构体。
现有技术
Ikai等人提出杆菌肽的活性可能取决于疏水性：“MIC与提出的次要成分结构的比较表明缬氨酸的位置以下面的降序影响每个成分的活性：N-端，该七元肽环，以及该侧链肽部分。因为这个顺序与HPLC上次要组分的洗脱顺序相关联，因此该活性可能取决于对应组分的疏水性。”(参见Ikaiet al，Journal of Antibiotics，vol.48 no.3，1995 page 233-242)。
Wagner等人建议将新杂环结合到杆菌肽A中用来克服杆菌肽应用所存在的限制(Journal of the American Chemical Society，vol.128 no 32，2006，page 10513-10520)。
数种非核糖体合成的肽包括多种非常见氨基酸。例如环孢菌素A包括2(S)-氨基-3(R)-羟基-4(R)-甲基-6(E)-辛烯酸，它对于结合到环孢菌素的细胞内受体上是至关重要的，并且因此对于其免疫抑制活性是至关重要的(Offenzeller et al，Journal of Biological Chemistry，vol.268 no 35，1993)。
数种非常见氨基酸类似异亮氨酸的结构：
·2-氨基-5-甲基-5-己烯酸，一种新型甲硫氨酸类似物，是从链霉菌的发酵肉汤中分离的(Takeuchi et al，Journal of Antibiotics vol.32 no 11，page1118-1124，1979)。
·4-次甲基-正亮氨酸和2-氨基庚-6-烯酸是具有下式的化合物：C7H13NO2。
·4-甲基-正亮氨酸是可以结合到重组蛋白中的一种异亮氨酸衍生物。(Muramatsu et al，J Pharm Biomed Anal，vol 31.no.5，2003，page 979-987)。
·2-氨基-3-甲基-4-戊烯酸是可以结合到蛋白中的一种不饱和异亮氨酸类似物(Mock et al，Chembiochem vol.7 no.1，2006，page 83-87).
·角鳞白鹅膏菌的不饱和正亮氨酸。化学和药理学研究披露了一种2-氨基-己-5-烯酸(Chilton et al，Lloydia vol.36 no.2，1973，page 69-73)。
·β-甲基正亮氨酸，由粘质沙雷菌生产的一种抗代谢药(Sugiura et al，J Antibiot，vol.34 no.10，1981 page 1278-82)。
发明内容
一方面，本发明涉及新型杆菌肽化合物。更确切地它涉及包含一种迄今未知的氨基酸侧链的新型杆菌肽化合物。
在枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中，不受理论束缚，我们推测这个侧链是来自杆菌肽上的化学修饰或来自结合了一种迄今未知的天然氨基酸。
包括该新型侧链的α-氨基酸化合物的系统命名是2-氨基-3-甲基-5-己烯酸并且它的分子式是C7H13NO2。
对于2-氨基-3-甲基-5-己烯酸我们建议并且使用名称5-次甲基-异亮氨酸。因此，该5-次甲基-异亮氨酸侧链具有结构-CH(CH3)CH2CH＝CH2。
因此，本发明涉及包括至少一个5-次甲基-异亮氨酸残基的具有抗细菌活性的新型杆菌肽化合物。这类杆菌肽包括至少一个5-次甲基-异亮氨酸侧链。该5-次甲基-异亮氨酸的侧链可以表示为：
Figure BDA0000158440680000031
本发明涉及包括一个或多个5-次甲基-异亮氨酸侧链、具有抗细菌活性的杆菌肽化合物。
根据本发明的杆菌肽在位置1和/或5和/或8上包括至少一个5-次甲基-异亮氨酸残基。这类化合物具有如下结构：
Figure BDA0000158440680000041
其中
R1、R2和R3中至少一个是-CH＝CH2，
并且，其中
R1、R2和R3独立地是-H、CH3、或-CH＝CH2。
如果R1、R2和R3都是-CH3，上述结构应当解释为涵盖杆菌肽A。
因此，杆菌肽A可以表示为：
对于在位置5上包括一个5-次甲基异亮氨酸残基的本发明的杆菌肽，我们提出并且使用名称杆菌肽J1。该命名法是基于从C18柱上的洗脱顺序。
对于在位置8上包括一个5-次甲基异亮氨酸残基的本发明的杆菌肽，我们提出并且使用名称杆菌肽J2。该命名法是基于从C18柱上的洗脱顺序。
对于在位置1上包括一个5-次甲基异亮氨酸残基的本发明的杆菌肽，我们提出并且使用名称杆菌肽J3。该命名法是基于从C18柱上的洗脱顺序。
对于在位置5和8上包括5-次甲基异亮氨酸残基的本发明的杆菌肽，我们提出并且使用名称杆菌肽K1。该命名法是基于从C18柱上预期的洗脱顺序。
对于在位置1和5上包括5-次甲基异亮氨酸残基的本发明的杆菌肽，我们提出并且使用名称杆菌肽K2。该命名法是基于从C18柱上预期的洗脱顺序。
对于在位置1和8上包括5-次甲基异亮氨酸残基的本发明的杆菌肽，我们提出并且使用名称杆菌肽K3。该命名法是基于从C18柱上预期的洗脱顺序。
对于在位置1、5和8上包括5-次甲基异亮氨酸残基的本发明的杆菌肽，我们提出并且使用名称杆菌肽L。该命名法是基于从C18柱上预期的洗脱顺序。
本发明的这些方面可以通过在下面对本发明的说明和/或所附的权利要求中列出的特征而得到。
具体实施方式
定义：
“杆菌肽”是包括如下结构的肽化合物(氨基酸残基编号在上标中)：
其中X是
Figure BDA0000158440680000062
并且其中R是异亮氨酸、缬氨酸或5-次甲基异亮氨酸的氨基酸残基侧链；
并且其中
Y和Z独立地是异亮氨酸、缬氨酸或5-次甲基异亮氨酸的氨基酸残基；
并且其中
Thz是噻唑啉环
Figure BDA0000158440680000063
2’连接到X上并且4’连接到Leu中的α碳上；
并且，其中
Leu是亮氨酸的氨基酸残基
Glu是谷氨酰胺的氨基酸残基
Lys是与Y和Orn形成肽键并且其ε-胺通过肽键连接到天冬酰胺的α-羧基基团上的赖氨酸的氨基酸残基
Orn是鸟氨酸的氨基酸残基
Phe是苯丙氨酸的氨基酸残基
His是组氨酸的氨基酸残基
Asp是天冬氨酸的氨基酸残基
Asn是与Asp形成肽键同时其α-羧基基团通过肽键连接到赖氨酸的ε-胺上的天冬酰胺的氨基酸残基；
当用于本申请时，“杆菌肽”是指包括具有上述结构的任何化合物而不考虑生产方法。因此术语“杆菌肽”包括由地衣芽孢杆菌天然生产的抗生素化合物以及具有上述一级结构的体外生产的化合物(合成的)和半合成的化合物。杆菌肽还指包括具有上述结构的任何化合物而不考虑随pH改变的电荷。“杆菌肽”还指不考虑立体化学包括具有上述一级结构的任何化合物。“杆菌肽”还指包括具有上述一级结构的化合物的盐类和水合物类。
“包括至少一个5-次甲基异亮氨酸残基的杆菌肽”是指包括包含如果在位置1和/或5和/或8用5-次甲基异亮氨酸残基取代异亮氨酸或缬氨酸残基可以产生的结构的任何杆菌肽。
“包括一个次甲基异亮氨酸残基的杆菌肽”是指包括显示如果位置1或5或8处5-次甲基异亮氨酸残基取代异亮氨酸或缬氨酸残基可能产生的结构的任何杆菌肽。
“包括至少一个5-次甲基异亮氨酸侧链的杆菌肽”是指包括“包括至少一个5-次甲基异亮氨酸残基的杆菌肽”。
当将杆菌肽的N-端氨基基团和/或噻唑啉环氧化时，显著数量的抗细菌活性丧失。例如低活性化合物杆菌肽F，包括一个酮-噻唑部分代替氨基-噻唑啉部分(Craig et al，J.Org.Chem，vol.22，1957，page 1345-1353)。
D-构型氨基酸在非核糖体合成的细菌肽中是常见的，而在核糖体合成的蛋白质中是不常见的。例如，在杆菌肽中，位置4、7、9、和11中的氨基酸残基通常处于D-构型(Glu、Orn、Phe和Asp)。
5-次甲基异亮氨酸包括两个手性碳原子，它们可以独立地处于R或S构型。
“氨基酸残基”是肽中包括下面各项的单元：
-NH-CHR-COOH(C端残基)
或
NH2-CHR-CO-(N端残基)
或
-NH-CHR-CO-(内部残基)
其中R是
甘氨酸中的-H
丙氨酸中的CH3
丝氨酸中的-OH
半胱氨酸中的-CH2SH
异亮氨酸中的-CH(CH3)CH2CH3
亮氨酸中的-CH2CH(CH3)2
缬氨酸中的-CH(CH3)2
等等。
“氨基酸侧链”是“氨基酸残基”的R基团。例如，该R基团是
5-次甲基异亮氨酸中的-CH(CH3)CH2CH＝CH2
异亮氨酸中的-CH(CH3)CH2CH3
亮氨酸中的-CH2CH(CH3)2
缬氨酸中的-CH(CH3)2
“抗细菌活性”是任何活性，该活性
·抑制细菌的生长、代谢或繁殖，或
·提高细菌的死亡率，或
·降低细菌的致病性。
效力(potency)是体外抗细菌活性。它可以测量和表达为IU/mg。
杆菌肽中氨基酸残基的“位置”从N端编号，它可以是在位置1的异亮氨酸、缬氨酸或5-次甲基异亮氨酸(在本申请中在所有图中左端显示杆菌肽)。因此，Lys是处于6号位置并且Asn是处于12号位置。
在杆菌肽中，“位置1”是特异性的，因为这个氨基酸残基部分地结合到噻唑啉环中。因此杆菌肽中在位置1的氨基酸残基不包括通常的N端单元：
但是替代地包括：
连接到噻唑啉或其氧化的衍生物上的
Figure BDA0000158440680000092
“组合物”是包括大于两种不同化合物的任何混合物。例如，两种活性药物成分的混合物，或一种活性药物成分和一种或多种药物赋形剂的混合物。
本申请中使用的术语“一种组分”或“多种组分”是指组合物中一种特定的化合物。因此，“次要组分”是组合物中以较少数量发现的化合物。
“药用组合物”是适合体内使用的任何组合物。因此这样的组合物可以皮肤、皮下、静脉内、胃肠外、口服等方式给药。
本发明涉及包括至少一个5-次甲基异亮氨酸残基侧链的新型杆菌肽化合物。
更确切地，本发明涉及包括至少一个5-次甲基异亮氨酸残基的具有抗细菌活性的新型杆菌肽化合物。
甚至更确切地，它涉及包括在位置1或5或8上的至少一个5-次甲基异亮氨酸残基具有提高的抗细菌活性的新型杆菌肽化合物。
甚至更确切地，它涉及包括在位置1或5或8上的一个5-次甲基异亮氨酸残基、具有抗细菌活性的新型杆菌肽化合物。
本发明还涉及包括在位置1和5上的两个5-次甲基异亮氨酸残基具有抗细菌活性的新型杆菌肽化合物。
本发明还涉及包括在位置1和8上的两个5-次甲基异亮氨酸残基具有抗细菌活性的新型杆菌肽化合物。
本发明还涉及包括在位置5和8上的两个5-次甲基异亮氨酸残基具有抗细菌活性的新型杆菌肽化合物。
本发明还涉及包括在位置1和5和8上的三个5-次甲基异亮氨酸残基具有抗细菌活性的新型杆菌肽化合物。
包括在位置1、5或8上的至少一个5-次甲基异亮氨酸残基的杆菌肽可以用于体外和体内抑制不希望的细菌生长。因此，如果施用到患有细菌感染的动物或人身上，这些化合物可以具有治疗作用。
当5-次甲基异亮氨酸在位置1、5或8处结合到杆菌肽中时，得到的氨基酸侧链是不饱和的并且包括5个碳原子。异亮氨酸和缬氨酸残基的侧链对应地包括4或3个碳原子。从C18柱上的洗脱顺序是杆菌肽A、杆菌肽J1、杆菌肽J2和杆菌肽J3(参见图1中的色谱图)。因此用5-次甲基异亮氨酸侧链取代异亮氨酸侧链导致更疏水性的杆菌肽是适当的(合理的)。
Figure BDA0000158440680000101
本发明优选的化合物是由地衣芽孢杆菌自然生产的杆菌肽J1-3；例如如图8A-8C中可见的杆菌肽J1、杆菌肽J2和杆菌肽J3。
本发明优选的化合物是与天然发酵产物杆菌肽A具有相同立体化学的杆菌肽J1-3。
本发明优选的化合物是其中在位置4、7、9、和11的氨基酸残基处于D构型的的杆菌肽J1-3、杆菌肽K1-3或杆菌肽L(Glu、Orn、Phe和Asp)。
缩写：
Mil＝5-次甲基-异亮氨酸
Thz＝噻唑啉
Ala＝丙氨酸
Arg＝精氨酸
Asn＝天冬酰胺
Asp＝天冬氨酸
Cys＝半胱氨酸
Gln＝谷氨酰胺
Glu＝谷氨酸(glutamate)
Phe＝苯丙氨酸
Gly＝甘氨酸
His＝组氨酸
Ile＝异亮氨酸
Lys＝赖氨酸
Leu＝亮氨酸
Met＝甲硫氨酸
Pro＝脯氨酸
Ser＝丝氨酸
Thr＝苏氨酸
Trp＝色氨酸
Tyr＝酪氨酸
Val＝缬氨酸
LC-MS＝液相色谱-质谱法
NMR＝核磁共振
V＝体积
M＝摩尔
本申请中披露的杆菌肽的生产可以通过如Lee et al，J Org Chem，vol.61 no.12，1996，page 3983-3986所述的固相合成来完成。
WO 199747313说明了可以用于生产本发明新型杆菌肽的杆菌肽肽类的合成。
可替代地，可以从杆菌肽生产菌株地衣芽孢杆菌生产并且通过纯化来得到该新型杆菌肽
附图说明
图1A显示了30℃下使用YMC-Pack Pro C18-柱(5μm，250×2.0mm)得到的来自Axellia(BANN 21 1412)的商品套件的254nm处的一个UV色谱图。流动相由甲醇/乙腈/0.1M乙酸铵pH 6.0/水58∶5∶10∶27，v/v/v/v组成。在流速0.2ml/min下使用等度条件。注射体积是10μl。除了杆菌肽A之外，表示为杆菌肽J1、杆菌肽J2和杆菌肽J3的三种次要组分(都具有比杆菌肽A高12Da的分子量)被标记。
图1B显示了具有如图lA中标志的相应的MS TIC色谱图。
图2A显示了杆菌肽A的结构，其中针对下面产物离子谱中特征性离子进行离子碎片分配。
图2B显示了杆菌肽A的产物离子(MS/MS)谱，其中分离并且碎片化m/z 712.0([M+2H]2+)的前体离子。
图3A显示了杆菌肽A的环部分的结构，其中针对下面第二代产物离子谱中特征性离子进行碎片离子分配。
图3B显示了杆菌肽A的第二代产物离子(MS3)谱，其中顺序的(consecutive)前体离子是m/z 712.0([M+2H]2+)和m/z 869.6([M+H]+)。
图4A显示了杆菌肽J1的结构，其中针对下面产物离子谱中特征性离子进行碎片离子分配。
图4B显示杆菌肽J1的产物离子(MS/MS)谱，其中将处于m/z718.0([M+2H]2+)下的前体离子分离并且碎片化。
图5A显示了杆菌肽J2的结构，其中针对下面产物离子谱中特征性离子进行碎片离子分配。图5B显示了杆菌肽J2的产物离子(MS/MS)谱，其中将处于m/z718.0([M+2H]2+)下的前体离子分离并且碎片化。
图6A显示了杆菌肽J2环形部分的结构，其中针对下面第二代产物离子谱中特征性离子进行碎片离子分配。
图6B显示了杆菌肽J2的第二代产物离子(MS3)谱，其中顺序的前体离子是m/z 718.0([M+2H]2+)和m/z 881.6([M+H]+)。
图7A显示了杆菌肽J3的结构，其中针对下面产物离子谱中特征性离子进行碎片离子分配。图7B显示了杆菌肽J3的产物离子(MS/MS)谱，其中将处于m/z 718.0([M+2H]2+)下的前体离子分离并且碎片化。
图8A显示了在位置5具有5-次甲基-异亮氨酸残基的杆菌肽的结构(＝杆菌肽J1)。
图8B显示了在位置8具有5-次甲基-异亮氨酸残基的杆菌肽结构(＝杆菌肽J2)。
图8C显示了在位置1具有5-次甲基-异亮氨酸残基的杆菌肽的结构(＝杆菌肽J3)。
图8D显示了在位置5和8具有5-次甲基-异亮氨酸残基的杆菌肽的结构(＝杆菌肽K1)。
图8E显示了在位置1和5具有5-次甲基-异亮氨酸残基的杆菌肽的结构(＝杆菌肽K2)。
图8F显示了在位置1和8具有5-次甲基-异亮氨酸残基的杆菌肽的结构(＝杆菌肽K3)。
图8G显示了在位置1、5和8具有5-次甲基-异亮氨酸残基的杆菌肽的结构(＝杆菌肽L)。
本发明是由权利要求并且不是由下面说明性实施例定义的：
实施例
实验1：LC-MS n
所使用的样品是来自Axellia Pharmaceuticals的商品套件。将样品溶于水中至浓度2mg/ml并且然后在LC-MSn分析之前通过0.45μm过滤器(VWR)进行过滤。
Surveyor HPLC系统(Thermo Fisher)由一个四级泵、脱气器、恒温自动进样器(设定为5℃)、恒温柱箱(设定为30℃)、以及一个二极管阵列检测器(设定为254nm)组成。HPLC条件与Govaerts等人所描述的相同(Rapid Communications in Mass Spectrometry，vol.17，no 12，page1366-1379)。使用YMC-Pack Pro C18-柱(5μm，250×2.0mm)。流动相由甲醇/乙腈/0.1M乙酸铵pH 6.0/水58∶5∶10∶27，v/v/v/v组成。通过添加0.1M乙酸将0.1M乙酸铵溶液调节到pH 6.0。在0.2ml/min流速下使用等度条件(isocratic condition)。注射体积是10μl。将装备有ESI接口的LXQ线性离子阱质谱仪(Thermo Fisher)连接到该HPLC系统上。在杆菌肽A的双重质子化分子离子([M+2H]2+)上进行调制。ESI参数设置如下：鞘气35(任意单位)、辅助气体10(任意单位)、喷雾电压5.0kV、毛细管温度320℃、毛细管电压9.0V、管透镜电压95V。MS参数设置如下：RF透镜偏离-4.25V、透镜0电压-3.0V、多极0偏离-4.5V、透镜1电压-8.0V、门透镜电压-56V、多级1偏离-9.5V、多级RF振幅400V、前透镜电压-6.5V。用分离宽度3和碰撞能量16％进行LC-MS/MS-和LC-MS3-分析。
结果
来自Axellia Pharmaceuticals的典型套件(lot)(BANN 211412)的UV-和MS-色谱图示于图1A-B中。UV-色谱图非常类似于使用LC-MS不相容的Ph.Eur.HPLC方法该套件的相应色谱图。除了杆菌肽A之外，指示为杆菌肽J1、杆菌肽J2和杆菌肽J3的三种次要组分(都具有大于杆菌肽A 12Da的分子量)标记在图1中。在本申请中将对这三种组分的结构进行说明，并且它们的结构将给出它们指称(denotation)的基本原理。
杆菌肽A
将双重质子化分子离子([M+2H]2+，m/z 712.0)分离并且碎片化并且得到的产物离子(MS/MS)谱示于图2B中。该谱图含有具有m/z1337.7/669.82+(缺失Ile)、m/z 1224.7/613.12+(缺失IleThz)、m/z 1111.7(缺失IleThzLeu)、m/z 982.6/492.22+(缺失IleThzLeuGlu)以及m/z 869.6(缺失IleThzLeuGluIle)的全套Y”离子。这些片段的分配见于图2A中。除了具有m/z 554.5(IleThzLeuGluIle)和m/z 441.3(IleThzLeuGlu)的b离子，从键切割配对得到的这些碎片离子可以见于m/z 227.1(ThzLeu)、m/z 356.1(ThzLeuGlu)以及m/z 469.2(ThzLeuGlulle)处。
在MS3(712.0→869.6)试验中通过将处于m/z 869.6的环形部分碎片离子进一步分离和碎片化，进行杆菌肽A环形部分的测序(参见图3B)。优选的Orn与Ile之间的环开口导致两个系列的碎片离子(示于图3A中)。一个系列包括处于m/z 756.5(缺失Ile)、m/z 609.4(缺失IlePhe)、m/z 472.4(缺失IlePheHis)以及m/z 357.4(缺失IlePheHisAsp)的产物离子。在另一个系列中，发现处于m/z 755.6(缺失Orn)、m/z 627.4(缺失OrnLys)、m/z 513.4(缺失OrnLysAsn)以及m/z 398.4(缺失OrnLysAsnAsp)的产物离子。因此所有这些碎片离子证实了良好建立的杆菌肽A的序列并且通过碎片模式比较提供了说明未知杆菌肽类似物序列的可能性。
杆菌肽J1
使用与杆菌肽A相同的方法，可以确定负责与杆菌肽A的+12Da差异的修饰的位置。将二重质子化分子离子([M+2H]2+，m/z 718.0)分离并且碎片化，并且将得到的产物离子(MS/MS)谱示于图4B中。该谱图包含具有m/z 1349.7/675.82+(缺失Ile)、m/z 1236.7/619.12+(缺失IleThz)、m/z 1123.7(缺失IleThzLeu)、m/z 994.6/498.12+(缺失IleThzLeuGlu)以及m/z 869.6(缺失IleThzLeuGluMil)的一个全套y”离子。这些碎片分配见于图4A中。除了具有m/z 566.4(IleThzLeuGluMil)和m/z 441.3(IleThzLeuGlu)的b离子，从键断裂配对得到的碎片离子可以见于m/z 227.1(ThzLeu)、m/z 356.1(ThzLeuGlu)以及m/z 481.2(ThzLeuGluMil)。
一个LC-MS3试验(718.0→869.6)给出与杆菌肽A的环形部分上对应试验相同的特征性碎片离子。因此所有这些碎片离子一致地具有在该组分中在位置5处大于Ile 12Da重量的一个残基，而该序列的剩余部分看起来与杆菌肽A:s完全相同。
杆菌肽J2
使用与杆菌肽A相同的方法，可以确定负责与杆菌肽A的+12Da差异的修饰位置。将双重质子化分子离子([M+2H]2+，m/z 718.0)分离并且碎片化并且将得到的产物离子(MS/MS)谱显示于图5B中。
该图谱包含具有m/z 1349.7/675.82+(缺失Ile)、m/z 1236.7/619.22+(缺失IleThz)、m/z 1123.7(缺失IleThzLeu)、m/z 994.6/498.12+(缺失IleThzLeuGlu)以及m/z 881.6(缺失IleThzLeuGlulle)的一个全套y”离子。这些碎片分配见于图5A中。除了具有m/z 554.4(IleThzLeuGlulle)和m/z 441.3(IleThzLeuGlu)的b离子，从键断裂的配对得到的碎片离子可以见于m/z227.1(ThzLeu)、m/z 356.1(ThzLeuGlu)以及m/z 469.2(ThzLeuGlulle)处。从这些碎片中，可以清楚的是来自杆菌肽A的该+12Da修饰定位在该分子的环形部分中。
在一个MS3试验(718.0→881.6)中通过将处于m/z 881.6的环形部分碎片离子进一步分离和碎片化进行杆菌肽J2环形部分的测序(参见图6B)。优选的Orn与Ile之间的环形开口导致两个系列的碎片离子(示于图6A中)。一个系列包括处于m/z 756.4(缺失Mil)、m/z 609.5(缺失MilPhe)、m/z 472.4(缺失MilPheHis)以及m/z 357.4(缺失MilPheHisAsp)的产物离子。在另一个系列中，发现处于m/z 767.4(缺失Orn)、m/z 639.4(缺失OrnLys)、m/z 525.4(缺失OrnLysAsn)以及m/z 410.4(缺失OrnLysAsnAsp)的产物离子。因此所有这些碎片离子都一致地具有在该组分中位置8处比Ile重12Da的一个残基，而该序列的剩余部分看起来与杆菌肽A完全相同。
杆菌肽J3
使用与杆菌肽A相同的方法，可以确定负责与杆菌肽A+12Da差异修饰的位置。将双重质子化分子离子([M+2H]2+，m/z 718.0)分离并且碎片化，并且将得到的产物离子(MS/MS)谱示于图7B中。该普通包含具有m/z 1337.8/669.82+(缺失Mil)、m/z 1224.8/613.22+(缺失(MilThz)、m/z 1111.7(缺失MilThzLeu)、m/z 982.6/492.22+(缺失MilThzLeuGlu)以及m/z 869.6(缺失MilThzLeuGluIle)的一个全套y”离子。这些碎片分配见于图7A中。除了具有m/z 566.4(MilThzLeuGlulle)和m/z 453.4(MilThzLeuGlu)的b离子，从键断裂配对得到的碎片离子可以见于m/z 227.1(ThzLeu)、m/z 356.1(ThzLeuGlu)以及m/z 469.2(ThzLeuGluIle)处。
一个LC-MS3试验(718.0→869.6)给出与杆菌肽A的环形部分上相应试验相同的特征性碎片离子。因此所有这些碎片离子一致地具有在该组分中位置1处比Ile重12Da的一个残基，而该序列的剩余部分看起来与杆菌肽A:s完全相同。
试验2：分离组分
为了用NMR光谱说明这三种组分的结构，必须制备浓缩样品。理想地，这三种组分的每一种可以分离至约90％纯度以便得到不含有来自其他组分干扰信号的“干净的”NMR谱图。以两个步骤进行分离。在第一步骤中，在三种组分洗脱之前和之后，使用一个LiChroprep RP-18-柱(25-40μm，35×5cm)来移开组分。流动相由甲醇/乙腈/0.03M甲酸铵pH 6.0 3.5∶31.5∶65，v/v/v组成。这样，得到针对这三种组分具有总纯度约25％的纯化物质。在第二步骤中，使用一个YMC-Pack ODS-A-柱(5μm，250×10mm)来将这三种组分彼此分离。流动相由甲醇/乙腈/0.025M乙酸铵pH 6.0 58∶5∶37，v/v/v组成。这个2-步纯化的最终结果是4个样品(表示为样品B、B’、C以及C’)，其中样品B和B’是类似的并且主要地包含杆菌肽J1和杆菌肽A，并且其中样品C和C’是类似的并且主要地包含杆菌肽J2和杆菌肽J3(表1)。
在所有样品上进行LC-MSn用来证实正确的组分已经被分离。样品B和C的纯度比通常认为全NMR解释所需要的低得多。然而，当样品B中其他主要组分是杆菌肽A时，可以决定进行NMR研究而无需进一步纯化。通过首先用浓缩含量的杆菌肽A(指示样品A，早期制备)在样品上进行NMR研究，可以希望的是除了用作参考化合物，可以将来自杆菌肽A的信号从样品B图谱上省略。当样品C包含杆菌肽J2和杆菌肽J3的混合物时，由于预期的高度重叠信号，不能期望全结构说明(structuralelucidation)。然而，当这些组分中的修饰预期与杆菌肽J1相同时(来自LC-MSn试验，参见试验1)，仍然希望的是NMR试验与来自LC-MSn的结果相结合可以给出足够的结构证据。
表1：样品A、B、B’、C以及C’中组分杆菌肽A、杆菌肽J1、杆菌肽J2和杆菌肽J3的比例(254nm处的面积％)。
Figure BDA0000158440680000171
试验3：准确质量确定
通过准确质量确定对样品A、B’和C进行分析(参见表2)。杆菌肽J1/杆菌肽A之间的分子量差异是11.9998。杆菌肽J2/杆菌肽A以及杆菌肽J3/杆菌肽A之间分子量差异对应地是12.0000。这给出组分杆菌肽J1、杆菌肽J2以及杆菌肽J3具有比杆菌肽A多一个碳原子构成的元素组成的进一步证据(确切质量12.0000)。
表2.在样品A、B’以及C上通过准确质量确定得到的确切质量
Figure BDA0000158440680000172
试验4：NMR
在303K下在处于95％磷酸盐缓冲液pH6.5/5％D2O中样品A、B和C的10mM溶液上对NMR谱进行记录。使用针对二维同核质子化学位移关联(DQF-COSY、TOCSY、NOESY)，异核1H-13C关联(HSQC、HMBC)以及异核1H-15N关联(HSQC)实验的标准脉冲序列在Bruker 600MHz能谱仪上得到实验结果。针对TOCSY实验使用20ms和60ms的混合时间，并且将100ms、200ms、400ms以及600ms的混合时间用于NOESY实验中。对于样品C，得到一个DEPT(135)实验。化学位移以p.p.m.形式报告，使用内部(内标)2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸(0.5mM)作为参考。
结论
样品A(杆菌肽A)
在1H检测模式中通过2D1H-1H化学位移关联实验(DQF-COSY和TOCSY)和异核1H-13C以及1H-15N化学位移关联(HSQC)进行氨基酸自旋系统的鉴别并且将数据汇总于表3中。这些化学位移数据与残基Ile、Thz、Leu、Glu、Ile、Lys、Om、Ile、Phe、His、Asp以及Asn存在是一致的(来自Kobayashi等人(1992)中1H化学位移数据的比较(参见表3)和BMRB数据库中发现的化学位移统计(参见表3)两者)。
从2D 1H-1H(NOESY，表4)和1H-13C(HMBC，表5)关联实验建立氨基酸残基的序列。双极偶合(通过间隔，NOESY)和长程标量偶合(HMBC)与良好建立的(well-established)杆菌肽A的序列一致。
Figure BDA0000158440680000191
表3.针对杆菌肽A(样品A中)和杆菌肽J1(样品B中)的1H、13C和15N化学位移。在303K下在95％磷酸盐缓冲液pH 6.5/5％D2O中对数据进行记录。以p.p.m形式报告化学位移，使用内部2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸(0.5mM)作为参考。
Figure BDA0000158440680000192
Figure BDA0000158440680000201
Figure BDA0000158440680000211
Figure BDA0000158440680000221
Figure BDA0000158440680000231
Figure BDA0000158440680000241
a蛋白质和核酸的NMR结构表示根据IUPAC推荐的命名法。
b Kobayashi等人(1992)FEBS Lett.2，105-09。
c BMRB数据库：针对选定的化学位移的计算的统计学。
http://www.bmrb.wisc.edu/ref_info/statsel.htm
表4.针对杆菌肽A(样品A中)和杆菌肽J1(样品B中)的质子NOE数据。从NOESY实验中得到测量值。
Figure BDA0000158440680000251
a侧链酰胺质子
b仅针对杆菌肽J1发生的NOE数据
表5.来自杆菌肽A(样品A中)和杆菌肽J1(样品B中)羰基碳的残基间和残基内2JH，C-结合性。从HMBC实验得到测量值。
  羰基碳   残基内质子   残基间质子
  Ile1 a   HA   Thz2的HA
  Thz2   HA   Leu3的H
  Leu3   HA   Glu4的H
  Glu4   HA   Ile5的H
  Ile5   HA   Lys6的H
  Lys6   HA   Orn7的H
  Orn7   HA   Ile8的H
  Ile8   HA   Phe9的H
  Phe9   HA   His10的H
  His10   HA   Asp11的H
  Asp11   HA   Asn12的H
  Asn12   HA   Lys6的HZ
  Glu4 b   HA   Mil5的H
  Mil5 b   HA   Lys6的H
a 2-噻唑啉环中缩合的羰基碳
b仅对于杆菌肽J1出现的HMBC数据。
样品B(杆菌肽J1)
通过2D1H-1H化学位移关联实验(DQF-COSY和TOCSY)以及异核1H-13C和1H-15N化学位移关联(HSQC)(以1H检测模式)进行氨基酸自旋系统的鉴定，并且将数据汇总于表3中。针对残基Ile、Thz、Leu、Glu、Lys、Orn、Ile、Phe、His、Asp以及Asn的化学位移数据与杆菌肽A的对应数据几乎完全相同，这指示在样品B的主要组分中存在未改性的相同残基。值得注意的是，与样品A中的情况相比较在这个样品中杆菌肽A中相应于Ile5的自旋系统显著地较弱(回忆样品B包含约20％杆菌肽A)。
除了这些信号，发现3JH，H-偶合自旋系统在δ8.19(主链酰胺质子)、5.72、5.06、4.11、2.10、1.98、1.90和0.8处具有共振。HSQC交叉峰位于δ5.72/138.2、δ5.06/120.1、δ4.11/60.8、δ2.10/38.8、δ1.90/38.8、δ1.98/36.7以及δ0.82/17.9处，指示至少6个CHx-基团。COSY交叉峰在δ8.19/4.11、δ4.11/1.98、δ1.98/0.82处并且HMBC交叉峰位于δ8.19/60.8、δ4.11/175.7、δ4.11/36.7、δ4.11/17.9、δ0.82/60.8以及δ0.82/36.7处(证明下面元件-NHCH(CO)CHCH3)，它还由预期的NOE关联支持。
位于δ2.10/1.90处的COSY交叉峰和位于δ4.11/38.8、δ0.82/38.8、δ1.90/36.7以及δ1.90/17.9处HMBC交叉峰证明了下面元件-NHCH(CO)CH(CH3)CH2，它还由预期的NOE关联支持。
位于δ5.72/2.10、δ5.72/1.90、δ5.72/5.06处的COSY交叉峰和位于δ5.72/38.8、δ1.90/138.2、δ5.06/38.8以及δ1.90/120.1处的HMBC交叉峰证明了下面新元件-NHCH(CO)CH(CH3)CH2CH＝CH2，它也由预期的NOE关联支持。该非常见氨基酸(Ile类似物)所有的化学位移数据类似于ChemDraw产生的预测数据(数据未显示)。
从2D 1H-1H(NOESY，表4)和1H-13C(HMBC，表5)相关性实验建立氨基酸残基序列。发现氨基酸序列与杆菌肽A中相同，其中非常见Ile类似物(称为5-次甲基-异亮氨酸)替换位置5处的Ile。因此NMR数据与来自LC-MSn以及准确质量确定的结果一致，其中所有数据指示样品A中存在下面的杆菌肽A-类似物：
Figure BDA0000158440680000271
样品C(杆菌肽J2和杆菌肽J3)
NMR数据证明存在于样品B中的相同不常见Ile-类似物的两个残基的存在(参见表6)。除了针对样品A和B获得的2D实验，还在样品C上进行了一个DEPT(135)实验(表6)。这个实验进一步证实样品C中这两个不常见的和完全相同的氨基酸-与Ile的类似物的结构。这些Ile-类似物中的一个位于N端(如通过它缺失可见主链酰胺质子所指示的)，并且对应地指示为5-次甲基-异亮氨酸1。另一个Ile类似物位于位置8(如由NOESY和HMBC相关性证明的)，并且因此指示为5-次甲基-异亮氨酸8。因此NMR数据与来自LC-MSn以及准确的质量确定的结果一致。所有这些数据表明样品C中存在两个杆菌肽A-类似物，其中在一个杆菌肽A-类似物中不常见的Ile类似物替换位置8处的Ile，并且其中在第二杆菌肽A-类似物中该不常见的Ile类似物替换位置1处的Ile。
Figure BDA0000158440680000281
Figure BDA0000158440680000291
表6.杆菌肽J2和杆菌肽J3(样品C中)1H、13C和15N化学位移和DEPT(135)-数据。在303K下在95％磷酸盐缓冲液pH 6.5/5％D2O中对数据进行记录。以p.p.m.的形式记录化学位移，使用内部2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸(0.5mM)作为参考。
Figure BDA0000158440680000301
a 蛋白质和核酸的NMR结构的表示根据IUPAC推荐的命名法。
实验5：效价
对样品A、B’、和C(参见表1)的抗细菌活性进行测量。抗细菌比活性(在此以IU/mg形式列出)(通常称为效价)是通过将未知样品的抗细菌活性与已知(标准)样品相比较来测量的。具体地，将杆菌肽锌标准品溶解并且稀释至2.0、1.0、以及0.5IU杆菌肽/ml 0.07M磷酸盐缓冲液pH 6.0。将这三个标准溶液添加到琼脂平板上，与测试生物(藤黄微球菌)一起孵化。将未知样品溶解、稀释并且添加到与标准品相同的平板上。在32-37℃下16-24小时之后，对抑制区进行测量，并且将未知样品与标准品进行比较。每个样品的结果(以IU/mg形式报告)列于表7中。
表7.分离样品的效价(抗细菌比活性(specific antibacterial activity)，IU/mg)。测试生物：藤黄微球菌(Micrococcus luteus)。
  样品   效价(IU/mg)
  A   72
  B’   53
  C’   60
样品A包含(如表1中列出的)93％(在254nm下用HPLC测量)杆菌肽A(并且无杆菌肽J1、J2或J3)。然后可以对杆菌肽A的抗细菌比活性进行计算为77.4IU/mg。这低于之前的报告情况。可能的解释可以是水或盐含量，以及可能的次要组分拮抗作用。当样品B’和C’包含数种杆菌肽混合物时，不可能报告杆菌肽J1、J2或J3的确切的抗微生物比活性(IU/mg)。然而得到的数据强烈地表明杆菌肽J1、J2和J3的效价类似于或高于杆菌肽A。而且样品B’和C’可以包含水、盐和/或具有协同或拮抗作用的组分。

Claims (15)

1.一种通过下式表示的化合物：
其中
R1、R2和R3中至少一个是-CH＝CH2，并且
其中
R1、R2和R3独立地是-H、-CH3、或-CH＝CH2，以及
它们的盐类和水合物。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中R1、R2和R3中一个是-CH3。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中R1、R2和R3中两个是-CH3。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中R1是-CH＝CH2。
5.根据权利要求1所述的化合物，其中R2是-CH＝CH2。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中R3是-CH＝CH2。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中R1和R2是-CH＝CH2。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中R2和R3是-CH＝CH2。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中R1和R3是-CH＝CH2。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中R1和R2和R3是-CH＝CH2。
11.一种组合物，包括权利要求1所述的化合物。
12.一种药用组合物，包括权利要求1所述的化合物。
13.根据权利要求12所述的药用组合物，其具有治疗效果。
14.根据权利要求1所述的化合物在用于制备治疗细菌感染的药物中的应用。
15.在体外杆菌肽合成过程中通过用5-次甲基-异亮氨酸取代异亮氨酸或缬氨酸来生产根据权利要求1所述的化合物的方法。
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