KR20120091933A - 뇌졸중 치료 타겟으로서 프로네이나아제-3 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 뇌졸중 치료 타겟으로서 프로네이나아제-3에 관한 것으로 더욱 상세하게는 호중구에 다량으로 존재하는 단백분해 효소인 proteinase-3 (PR3)가 뇌졸중에서 뇌신경세포 손상 및 염증반응 개시에 중요한 역할을 수행한다는 것으로 뇌졸중 치료 타겟으로 사용될 수 있다.

Description

뇌졸중 치료 타겟으로서 프로네이나아제-3{Proteinase-3 as therapeutic target of Stroke}
본 발명은 뇌졸중 치료 타겟으로서 프로네이나아제-3에 관한 것으로 더욱 상세하게는 호중구에 다량으로 존재하는 단백분해 효소인 proteinase-3 (PR3)가 뇌졸중에서 뇌신경세포 손상 및 염증반응 개시에 중요한 역할을 수행한다는 것으로 뇌졸중 치료 타겟으로 사용될 수 있다.
허혈성 손상이 발생되면 뇌는 급성 염증과정과 만성 염증과정으로 반응하며 이는 주로 소교세포(microglia)의 활성화, 염증매개물질들의 생성, 호중구(neutrophil), T 세포, monocyte/macrophage등의 염증성 세포들이 침윤한다. 일차적으로 수시간 이내에 말초 혈액으로부터 leucocytes 가 두뇌 실질부위로 침입하게 되며 이때 일차적으로 침투하게 되는 것이 호중구 (neutrophil)이다 (Jin et al. J Leukoc Biol . 87(5):779-789, 2010). 이러한 말초 호중구는 수시간 이내에 두뇌 조직으로 유도되고 혈관손상의 유도로 인한 blood brain barrier (BBB) 파괴, 기타 염증 세포의 이차 침입 및 두뇌 조직의 염증 반응 개시에 중요한 역할을 수행하며 것으로 보고되었다 (Yilmaz and Granger, 2008; Kriz, 2006).
현재까지 호중구성 matrix metalloproteinase 등에 의한 혈관 손상 반응, NADPH oxidase 및 myeloperoxidase 활성화에 의한 ROS 생성 및 cytokine chemokine 생성 등이 염증 반응의 조절 및 세포손상 조절에 중요할 것으로 제시되고 있으나 (Gidday et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol . 289(2):H558-68, 2005; Rosell et al. Stroke . 39(4):1121-1126, 2008), 이들의 조절에 의한 뇌졸중 조절 가능성에 대한 확실한 증거는 없는 상황이다.
또한 상기 물질들의 약물 개발 타겟으로서의 특이성에 대해서도 많은 논란의 여지가 있다. 최근 CD47 넉아웃 마우스를 이용한 호중구의 infiltration 억제에 의해 뇌경색 부위의 감소와 뇌부종의 저하, BBB 손상 지표의 감소가 관찰되어 뇌졸중에서의 neutrophil 역할의 중요성에 관심이 집중되고 있다 (Jin et al. Exp Neurol. 217(1):165-170, 2009). 이러한 실험적 증거에도 불구하고 호중구 염증 반응의 조절에 중요한 역할을 담당할 것으로 사료되는 단백분해 효소에 관한 연구는 상대적으로 매우 미약하다 (Matayoshi et al. Brain Res. 1259:98-106, 2009; Shimakura et al. Brain Res. 858(1):55-60, 2000).
허혈성 혈관질환의 허혈과 재관류로 인한 세포 손상기전으로는 산소공급 차단에 의한 흥분성 세포손상, 활성 산소종의 증가, 세포사멸 신호전달경로 등이 있으며 급성기 및 만성기에서 이들의 작용기전이 다르므로 이들을 조절하기 위한 여러 전략들을 다각적으로 검토하여야 한다. 예를 들어 급성기 손상의 차단을 위해서는 이온채널 차단, 미토콘드리아 기능 조절, 활성산소종 차단, 세포사멸 기전 차단 등이 유용할 것으로 생각된다. 이와 반대로 만성기의 손상 차단을 위해서는 염증 세포의 유입 억제, 후발성 세포 사멸 억제, 싸이토카인 억제, 교세포 활성화 등 중추 염증 반응 제어 등의 다른 기전이 치료제 개발을 위하여 고려되어야 할 것으로 생각된다.
실제로 많은 연구자들이 진행하고 있는 연구에서는 1차(급성) 뇌손상 방지보다 2차(만성) 뇌손상 방지가 더욱 확실하고 장기간의 뇌손상 억제효과를 가짐이 밝혀지고 있다. 따라서 급성기의 손상 억제제는 일회성 효과만을 지니는 것에 비해 만성기 뇌손상 억제는 발병 후 손상 최소화 및 재활 전 과정에 걸쳐 효과를 발휘할 것으로 기대하고 있다.
따라서 만성 염증성 신경 손상을 유발하는 반응의 개시, 유지, 확장 및 소멸 기전을 이해하는 것이 뇌졸중 치료제 개발의 핵심 기초 연구 분야로 여겨지고 있다. 최근 보고된 연구논문들에 의하면 염증성 손상 반응의 개시 및 유지에 혈관으로부터의 염증성 세포 침입 및 활성화가 매우 중요한 역할을 수행할 가능성이 제시되고 있으며 이는 궁극적으로는 중추 내부에서의 염증반응 활성화로 이어질 것으로 여겨진다.
Proteinase-3 (이하, 'PR3'라 함)는 호중구 elastase, cathepsin G등과 같은 호중구-유래된 세린 단백분해효소로서 일차적인 기능은 염증부위에서 extracellular 단백질을 분해하는 것이지만, 너무 과도하게 많아지거나 오랫동안 유지되는 등의 부적절한 단백질분해능력을 갖게 되면 인체에 해로운 효과를 나타낸다. 이들은 구조적으로 유사하지만 PR3는 ANCA (anti-neutrophil cytoplasmic antibldies)라는 autoantibody의 타겟 항원으로 세포주기 (Csernok et al. Clin Exp Rheumatol 26(3 Suppl 49):S112-117, 2008), 분화 (Dublet et al. J Biol Chem 280(34):30242-30253, 2005), 세포사멸 (Yang et al. Am J Pathol 149(5):1617-1626, 1996) 등에 영향을 미치는 다기능성 세린 단백분해효소로서 최근에는 면역기능을 조절하는 것으로도 알려져 있다 (Sugawara S. Crit Rev Immunol. 2005;25(5):343-360, 2005). PR3는 soluble form도 있고 membrane-associated form도 있으며 Wegener's granulomatosis와 같은 전신 혈관질환에서 자가항원으로서도 작용하고 protease-activated receptor-2 (PAR-2)에 의해 dendritic cell에서 외부로부터의 자극에 대해 danger/alarm 신호로서 작용한다. 산성환경에서 활성화되고 정상조건에서는 불활성화상태로 있다. PR3는 최근에 innate immune response와 adaptive immune response에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 IL-32에 결합하여 활성화시킬수 있음이 시사되었다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 새로운 뇌졸증 치료 타겟을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 소교세포에 프로테이나아제(proteinase)-3를 처리한 후 배양하는 단계;
이러한 처리 단계 전, 동안 또는 후에, 상기 세포를 스크리닝하고자 하는 화합물과 접촉하는 단계;
상기 세포의 배양물을 신경세포에 처리하여 활성 산소 또는 세포 사멸을 측정하는 단계; 및
상기 스크리닝하고자 하는 화합물 중 화합물과 접촉에 의하여 신경세포의 활성산소 증가 또는 세포사멸을 억제 또는 방지하는 화합물은 선도 화합물로서 채택하고 활성산소 증가 또는 세포 사멸을 억제 또는 방지하지 않는 화합물은 거부하는 단계를 포함하는 뇌졸증 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 동정하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로테이나아제(proteinase)-3는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하나 상기 서열번호 1에 기재된 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 또는 전좌 등의 돌연변이를 유발하여 본 발명의 목적하고자 하는 효과를 나타내는 모든 돌연변이체도 본 발명의 단백질의 범위에 포함된다.
또 본 발명은 프로테이나아제(proteinase)-3를 유효성분으로 포함하는 뇌졸증 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 동정하기 위한 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 피험자로부터 분리된 샘플로부터 프로테이나아제-3 레벨을 측정하는 단계;
정상 대조군 샘플에서 프로테이나아제-3 레벨을 측정하는 단계; 및 피험자의 프로테이나아제-3 레벨과 정상 대조군의 프로테이나아제-3 레벨을 비교하여 정상 샘플에 비하여 프로테이나아제-3 레벨이 증가한 경우에 뇌졸증의 존재를 나타내는 것을 포함하는 피험자의 뇌졸증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 뇌졸증 마커를 측정하는 시험관내 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 뇌에 프로테이나아제(proteinase)-3를 주입하여 뇌졸증을 유발하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 호중구에 다량으로 존재하는 단백분해 효소인 proteinase-3 (PR3)가 뇌졸중에서 뇌신경세포 손상 및 염증반응 개시에 중요한 역할을 수행할 것이라는 것으로 뇌졸중 치료 타겟을 확립하고 바이오 신약 타겟발굴에 토대를 마련한 것이다.
본 발명자들은 proteinase-3 (PR3)가 뇌졸중의 동물모델과 염증성 모델에서 혈관 유래성 세포의 침윤과 함께 수 십배 증가됨을 확인하였고, 이러한 증가가 염증성 세포의 침입 및 활성화, 염증반응 개시 및 뇌신경세포 손상을 가져온다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 뇌신경계질환인 뇌졸중의 동물모델에서 호중구의 침윤에 의해 proteinase-3가 뇌에서 증가되고 염증성 세포의 활성화와 뇌신경세포 사멸을 유도함을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 300g의 SD 수컷 흰쥐를 이용해 중대뇌동맥 폐색(middle cerebral artery occlusion;이하, 'MCAo'라고도 함)을 시행하여 뇌졸중 모델을 만들고 뇌를 section하여 호중구 infiltration과 이로 인한 proteinase-3 (PR3)가 증가되는지를 면역조직염색법을 이용하여 확인하였다. 그 결과 선조체(striatum) 부분에서 대조군에 비해 호중구 마커인 elastase가 증가되어 있고 그 부분에서 PR3가 증가되어 있는 것을 확인 (도 1 참조) 함으로써 PR3가 MCAo 동물모델에서 증가됨을 확인하였다.
이후, PR3가 MCAo 시행한 동물의 뇌조직과 LPS (lipopolysachharide)와 같은 염증 물질을 주입한 뇌조직으로부터 PR3 단백질이 증가하는가를 웨스턴 블럿팅을 시행하여 확인하였다. 그 결과, LPS주입에 의해서는 cortex에서 5일, 7일에 PR3 발현이 현저히 증가됨이 확인되었고, MCAo 시행한 흰쥐의 뇌에서는 striatum 부분에서 PR3 발현이 15시간 이후 24시간까지 현저하게 증가되는 것을 확인(도 2 참조) 함으로써 PR3가 뇌졸중에 의한 신경세포사멸과 염증반응을 매개할 것이라는 것을 알 수 있었다.
본 발명자들은 MCAo 시행 후 시간에 따른 호중구 infiltraion과 PR3의 증가에 대해 확인하고자 MCAo 시행 후 6시간째와 24시간째의 뇌조직을 얻어 웨스턴 블럿팅을 시행하였다. 그 결과, MCAo 시행 후 6시간부터 elastase와 MPO (myelinperoxidase)와 같은 호중구 마커의 발현이 증가되고 PR3 또한 6시간부터 증가되어 24시간에 최고 증가됨이 확인된 바 (도 3 참조) MCAo에 의해 호중구 infiltration이 먼저 이루어지고 그로 인해 PR3 발현이 더 많이 증가됨을 확인할 수 있었다.
이 후, 흰쥐의 대뇌피질로부터 소교세포와 성상세포 등을 일차 배양하여 PR3에 의한 염증성 세포들의 활성화에 대해 조사하였다. 그 결과, 배양한 소교세포와 성상세포에 PR3의 농도별 처리에 의해 세포 내 reactive oxygen species (ROS, 활성산소)가 농도 의존적으로 증가됨이 확인되었다. 또한 PR3는 소교세포에서 iNOS (inducible nitric oxide synthase), MMP9 (matrix metalloprotease-9)과 같은 염증 매개물질들의 단백질 발현을 증가시켰고 IL-1β와 IL-6와 같은 염증성 사이토카인도 증가시킴을 확인(도 4 참조)함으로써 PR3는 뇌에서 염증세포를 활성화시키고 염증매개물질들을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명자들은 PR3에 의한 소교세포의 활성화에 의해서 신경세포의 사멸이 유도되는가를 확인하고자 소교세포에 PR3를 처리한 후 얻은 conditioned media를 일차배양 한 신경세포에 처리하여 세포 내 ROS증가를 DCFH2-DA를 처리하여 확인하였고, 신경세포사멸을 확인하고자 MTT 분석을 시행하였다. 또한 이러한 신경세포의 사멸이 apoptotic 세포 사멸의 형태인가를 확인하고자 에팝토시스의 마커로서 caspase-3의 절단을 확인하였다. 그 결과, 소교세포로부터 얻은 conditioned media는 신경세포에서 농도 의존적으로 ROS를 증가시켰고 신경세포의 사멸을 유도하였고, 절단된 caspase-3의 발현이 증가로 확인(도 5 참조)함으로써 PR3는 염증세포인 소교세포를 활성화시키고 이로써 신경세포의 사멸이 에팝토시스의 형태로서 유도됨을 알 수 있었다.
이 후, PR3를 뇌에 직접 microinjection 하여 striatum과 substantia nigra에서의 신경세포 사멸과 소교세포 활성을 TH(Tyrosine hydroxylase), OX-6와 CD11b 항체를 이용하여 염색해 보았다. 그 결과, PR3 injection한 동물로부터 뇌의 striatum과 substantia nigra에서는 CD11b와 OX6로 염색되는 활성화된 소교세포가 많아짐이 확인되었고 tyrosine hydroxylase 혹은 NeuN으로 염색되는 신경세포가 감소함에 따라 신경세포의 사멸이 증가되었음이 관찰되었다. 또한 hematoxylin/ eosin 염색을 통해서도 PR3 injection에 의해 세포사멸이 증가함이 관찰(도 6 참조)된 바 PR3는 뇌에서 소교세포를 활성화시키고 신경세포사멸을 증가시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통해, 본 발명자들은 MCAo 시행 후 호중구 infiltration이 유도되고 proteinase-3의 발현이 증가되며 이는 소교세포를 활성화시키고 염증성 매개물질들의 발현을 증가시킴으로써 신경세포의 사멸을 유도함을 증명하였다.
상기 결과를 바탕으로 본 발명은 proteinase-3가 뇌졸중과 같은 뇌질환의 타겟 물질이 될 수 있음을 제공한다.
본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 호중구에 다량으로 존재하는 단백분해 효소인 proteinase-3 (PR3)가 뇌졸중에서 염증반응을 개시하고 뇌 신경세포 손상을 유도하는데 중요한 역할을 수행함을 확인한 것으로서 뇌졸중의 치료 타겟을 확립하고 바이오 신약을 개발하는데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 뇌졸중에 의한 호중구 침윤과 뇌 중 PR3 발현 증가에 관한 결과로서 면역염색한 그림이다.
도 1a는 뇌졸중의 동물모델 뇌의 선조체 부위에서 호중구(elastase)와 PR3의 발현을 관찰한 그림, 도 1b는 뇌졸중의 동물모델 뇌의 선조체 부위에서 호중구(elastase)와 PR3에 대한 항체로 염색 후 병합한 그림을 나타낸다.
도 2는 뇌졸중의 동물 모델과 염증 유도된 동물모델에서 뇌 중 PR3 발현 증가에 관한 결과로서 Western blotting을 시행한 결과를 나타낸 그림으로,
도 2a는 염증물질인 LPS (lipopolysaccharide)를 주입한 흰쥐로부터 시간별로 뇌의 각 부분의 단백질을 얻어 Western blotting을 시행한 결과를 나타내고, 도 2b는 MCAo 시행한 흰쥐로부터 시간별로 뇌의 각 부분의 단백질을 얻어 Western blotting을 시행한 결과를 나타낸다.
도 3은 뇌졸중의 동물 모델로부터 호중구 침윤과 뇌 중 PR3 발현 증가에 관한 결과로서 Western blotting을 시행한 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 PR3에 의한 소교세포 (microglia, 중추염증조절세포) 활성화에 관한 결과를 나타낸 그림으로, 도 4a는 배양한 microglia와 성상세포에서 PR3를 농도별로 처리한 후 세포내 ROS를 측정한 결과를 나타내고, 도 4b는 배양한 microglia 에서 PR3를 농도별로 처리한 후 변화되는 염증성 매개인자들의 변화를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 PR3에 의한 소교세포 (microglia, 중추염증조절세포) 활성화에 의한 신경세포 사멸결과(in vitro)를 나타낸 그림으로, 도 5a는 PR3에 의한 소교세포 (microglia, 중추염증조절세포) 활성화에 의한 신경세포 사멸을 MTT assay와 ROS 측정한 결과를 나타내고, 도 5b는 PR3에 의한 소교세포 (microglia, 중추염증조절세포) 활성화에 의해 신경세포에서 apoptosis의 증가를 보여준 그림이다.
도 6은 PR3에 의한 소교세포 (microglia) 활성화와 신경세포 사멸결과(in vivo)를 나타낸 그림으로, 도 6a는 PR3 microinjection 에 의한 신경세포 사멸과 microglia 활성을 면역염색하여 확인한 결과이고, 도 6b는 PR3 microinjection 에 의한 신경세포 사멸을 H&E 염색과 NeuN (신경세포 특이적인 표지자) 항체를 이용하여 면역염색한 결과이다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용은 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1: 뇌졸중에 의한 호중구 침윤과 뇌 중 PR3 발현 증가
300g의 SD 수컷 흰쥐를 이용해 중대뇌동맥 폐색(middle cerebral artery occlusion;이하, 'MCAo'라고도 함)을 시행하여 뇌를 절편화(section)하여 호중구 infiltration과 이로 인한 proteinase-3 (PR3)가 증가되는지를 하기의 방법으로 조사하였다.
<1-1> 뇌졸중의 동물모델로서 Middle cerebral artery occlusion ( MCAo ) 수술
10주된 300 g SD 수컷 흰쥐를 준비하여 Rompun/ketamine (1:2, 2 ml/kg, i.p.)으로 마취하였다. 오른쪽 common carotid artery 로부터 external carotid artery (ECA) 와 internal carotid artery (ICA)를 노출시켰다. ECA는 묶고 lingual 와 maxillary branches는 잘랐다. ICA 는 pterygopalatine branch를 따라 노출시켰고, 4-0 나일론 suture를 ECA stump를 따라 ICA로 삽입하여 middle cerebral artery를 블럭킹하였다. 1.5시간 허혈 후 나일론 suture를 빼고 24시간 재관류 후 실험에 사용하였다. 수술동안 동물은 37 ℃ ± 1℃를 유지하였다 (도 1).
<1-2> MCAo 시행 후 호중구 infiltration 과 PR3 발현 : 면역조직화학적 검색
MCAo시행 후 호중구 infiltration과 PR3 발현여부를 확인하고자 호중구 마커인 elastase 와 PR3 등에 대한 항체를 이용하여 면역 조직화학적으로 염색하여 발현 여부를 검색하였다. 흰쥐를 마취하고 심장 박동이 멈추기 전 perfusion을 실시하여, 멸균한 PBS로 뇌를 포함한 모든 조직에서 혈액이 남아있지 않도록 씻어주고 곧바로 4% Paraformaldehyde (PFA) in PBS를 넣어 몸이 굳어진 것을 확인하면 즉시 머리를 열어 뇌를 꺼냈다. 적출한 뇌를 4% PFA in PBS solution에 담가 4℃에서 2시간 동안 고정한 후, 멸균된 15% sucrose에 16시간 놓아두었다. 다음날 미리 70℃에 넣어 두었던 iso-pentane에 20초 정도 soaking 후 section하기 전까지 70℃에 보관하였다. 조직절편은 coronal 방향 (두께 40 μm)으로 microtome (microme, Walldorf, Germany)을 이용하여 실시하였다. 잘라진 조직절편은 poly L-lysine coated slide (ESCO, New Hampshire, U.S.A)에 올렸고 슬라이드에 올려진 뇌조직을 고정하기 위하여 4% PFA in PBS에 15분 동안 놓아둔 후, PBS-Triton X-100 (PBST)로 5분 정도 3번 반복하여 씻어주었다. 10% normal horse serum (Lfe Tech., Califonia, U.S.A.) in PBST로 2시간 동안 blocking을 하고 곧바로 1차 항체 (elastase, PR3)를 4℃에서 overnight으로 반응시켰다. 다음날 PBS-Triton X-100 (PBST)으로 10분 정도 3번 반복하여 씻어낸 후 형광이 붙어있는2차 항체를 1시간동안 붙였다. PBS-Triton X-100 (PBST)으로 10분 정도 3번 반복하여 씻어낸 후, 20 ul mounting solution을 떨어뜨린 뒤 cover-slip을 덮고 형광현미경으로 관찰하여 단백질의 발현양상을 확인하였다.
그 결과, MCAo 시행한 뇌의 선조체(striatum) 부분에서 대조군에 비해 호중구 마커인 elastase가 증가되어 있었고 그 부분에서 PR3가 증가되어 있음을 확인하였다 (도 1). 이러한 실험에 사용한 동물은 군당 최소한 5 마리였다.
<1-3> LPS 주입과 MCAo 시행한 흰쥐의 뇌조직에서의 PR3 발현 비교
MCAo 시행한 흰쥐와 stereotaxic surgery를 통한 microinjection에 의해 염증물질인 LPS (lipopolysaccharide)를 주입한 흰쥐로부터 시간별로 뇌의 각 부분의 단백질을 얻어 Western blotting을 시행하였다.
Stereotaxic surgery를 위해서 300 g의 SD 수컷 흰쥐를 준비하여 Rompun/ketamine (1:2, 2 ml/kg, i.p.) 으로 마취하였고, stereotaxic frame (Stoelting, Wood Dale, IL)에 마취된 쥐를 놓고 ear bar로 고정하였다. LPS (5 ug/5ul) 는 corpus callosum 으로 injection 하였고 (anterior (A),+0.7; lateral (L), +1.8; ventral (V), +3.2) PBS 대조군과 비교하였다.
MCAo 시행과 LPS injection에 의해 시간별로 얻어진 뇌로부터 얻은 단백질에서 PR3의 발현변화를 확인하고자 Western blotting을 시행하였다. Western blotting은 하기의 방법으로 시행하였다.
뇌의 각각의 조직으로부터 (cortex, striatum, hippocampus) 단백질을 추출하여 BCA 단백질 정량법을 이용하여 단백질 양을 정량하였다. 30 ug의 단백질을 얻어 샘플 버퍼를 넣고 이를 10 %의 SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 전기영동하였다. 전기영동한 단백질을 나이트로셀루로스 막에 전기적으로 transfer하였고, blot을 5 % 탈지 분유를 이용하여 불럭킹하였다. 일차항체로서 PR3를 가하고 4℃에서 오보나잇으로 반응시켰다. HRP (horse radish peroxidase)가 붙어있는 이차 항체를 1시간 동안 가하였다. PBS로 1분씩 세 번 세정하고 마지막 세정 후에 Enhanced chemilumnescence (ECL)법을 이용하여 LAS-3000기기를 이용하여 단백질 발현양을 확인하였고 Image J 프로그램으로 정량하였다.
그 결과, 염증성 물질인 LPS주입에 의해서는 주로 손상이 일어나는 cortex부위에서는 5일과 7일에 PR3 발현이 현저히 증가됨이 확인되었고, MCAo 시행한 흰쥐의 뇌에서는 주 손상이 일어나는 striatum 부분에서 PR3 발현이 15시간 이후 24시간까지 현저히 증가됨이 확인되었고 실험에 사용한 동물은 최소한 4 마리였다 (도 2).
<1-4> MCAo 에 의한 호중구 infiltration 과 PR3 발현
MCAo시행 후 6시간과 24시간째 뇌조직을 얻어 호중구 infiltration 여부를 확인하고자 호중구 마커인 elastase 와 MPO등에 대한 항체를 이용하여 단백질 발현양을 Western blotting을 통해 확인하였다. 뇌의 striatum으로부터 단백질을 추출하여 BCA 단백질 정량법을 이용하여 단백질 양을 정량하였다. 30 ug의 단백질을 얻어 샘플 버퍼를 넣고 이를 10 %의 SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 전기영동하였다. 전기영동한 단백질을 나이트로셀루로스 막에 전기적으로 transfer하였고, blot을 5 % 탈지분유를 이용하여 blocking하였다. 일차항체로서 elastase 와 MPO (myeloperoxidase)를 가하고 4℃에서 오버나잇으로 반응시켰다. HRP (horse radish peroxidase)가 붙어있는 이차 항체를 1시간 동안 가하였다. PBS로 10분씩 세번 세정하고 마지막 세정 후에 Enhanced chemilumnescence (ECL)법을 이용하여 LAS-3000기기를 이용하여 단백질 발현양을 확인하였고 Image J 프로그램으로 정량하였다.
그 결과, MCAo 시행 후 6시간부터 elastase와 MPO와 같은 호중구 마커의 발현이 증가되고 PR3 또한 6시간부터 증가되어 24시간에 최고 증가됨이 Western blot을 통해 확인되었고 (도 3) 이 실험은 최소한 3회 시행하였다.
실시예 2: PR3 에 의한 microglia 의 활성과 신경세포 사멸 ( in vitro )
PR3에 의한 소교세포의 활성화와 신경세포의 사멸에 대한 효과를 알아보고자, 흰쥐의 뇌로부터 대뇌피질을 얻어 신경세포와 소교세포를 배양한 후 PR3에 의한 소교세포 활성화와 신경세포사멸에 대한 실험을 진행하였다.
<2-1> PR3 에 의한 소교세포 활성화
흰쥐의 두뇌로부터 대뇌피질을 분리하여 소교세포와 성상세포를 배양하여 PR3에 대한 활성화 정도를 ROS 측정과 iNOS, mmp9, IL-1b, IL-6등의 염증성 매개물질들의 발현변화로 확인하였다. 자세하게는 흰쥐 두뇌의 일차 성상세포 및 미세아교세포 배양은 다음과 같이 시행하였다. 태어난 지 2일 된 흰쥐의 대뇌피질을 분리하였고 이를 0.1% 트립신을 이용하여 dissociation한 후 세포를 poly-D-lysine이 코팅된 T-75 플라스크에서 배양하였다. 10% FBS가 함유된 배지에서 배양하고 트립신을 이용하여 하베스트한 후 적절한 용기에 세포를 배양하여 7일 후에 연구에 적용하였다. 미세아교세포를 얻기 위해서는 confluent한 성상세포를 250 rpm으로 두 시간 진탕하여 세포를 수거하고 이를 poly-D-lysine이 코팅된 배양용기에서 배양한 후 다음날 실험에 적용하였다. 배양한 소교세포와 성상세포에 PR3를 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 ng/ml 의 농도별로 처리한 후 세포의 배지에 ROS 측정용 시약인 H2DCF -DA를 처리하여 glia 활성 정도를 측정하였고, 실험은 최소한 3회 반복하였다.
세포 내 ROS 측정방법은 다음과 같다. 전체 ROS의 양을 측정하기 위해 50 uM의 H2DCF-DA를 가하였고 20 분간 배양한 후 나타나는 형광의 강도를 ELISA 리더 (Molecular device, Spectramax Gemini EM) 를 이용하여 excitation 485nm emission 530 nm에서 측정하였다. H2DCF-DA는 형광을 나타내지 않는 시약으로서 세포로 들어가서 ROS를 만나면 diacetate 가 떨어져 나가고 DCF(dichlorofluorescence)로서 형광을 나타내는 시약이다.
그 결과, 소교세포와 성상세포 에서 세포내 ROS가 PR3의 농도 의존적으로 증가됨이 확인되었다 (도 4a).
PR3에 의한 소교세포의 활성화에 대한 확인으로 염증성 매개물질들의 변화에 대해 RT-PCR로 확인하였다. Reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) 방법은 다음과 같다. 배양된 소교세포에 PR3를 농도별로 처리한 후 24 시간 뒤에 전체 RNA를 Trizol을 이용하여 분리하였다. RNA로부터 superscript II 효소를 이용하여 cDNA를 합성하였고, MMP-9, iNOS, IL-6, IL-1β, GAPDH 등의 프라이머 세트(MMP-9 Forward 5'-TAA GCT ATT CAG TTA CTC CTA CTG GAA-3'(서열번호 2), Reverse 5'-CCT CTC TAG CAC ACA TGC ACT T-3'(서열번호 3); iNOS Forward 5'-GTG TTC CAC CAG GAG ATG TTG-3'(서열번호 4), Reverse 5'-CTC CTG CCC ACT GAG TTC GTC-3'(서열번호 5); IL-6 Forward: 5'- TTG TGC AAT GGC AAT TCT GA -3'(서열번호 6), Reverse: 5'-TGG AAG TTG GGG TAG GAA GG -3'(서열번호 7); IL-1베타 Forward: 5'-AAA ATG CCT CGT GCT GTC TG -3'(서열번호 8), Reverse 5'-CTA TGT CCC GAC CAT TGC TG -3'(서열번호 9); GAPDH Forward 5'-GTG AAG GTC GGT GTG AAC GGA TTT-3'(서열번호 10), Reverse 5'-CAC AGT CTT CTG AGT GGC AGT GAT-3'(서열번호 11))를 이용하여 polymerase를 이용하여 PCR 기계로 증폭하였다. 1%의 아가로스 젤에 전기 영동하여 증폭된 유전자를 분석하였고 정량하였고 실험은 최소한 3회 반복하였다.
그 결과, IL-1β와 IL-6와 같은 염증성 사이토카인도 증가시킴을 확인하였다(도 4b).
<2-2> 일차배양한 신경세포에서 ROS 생성과 세포사멸에 대한 PR3 의 효과 ( in vitro )
소교세포에 PR3를 처리한 후 24 시간 뒤에 얻은 conditioned media를 일차배양 한 신경세포에 처리하여 ROS 생성과 세포사멸에 대한 효과를 조사하였다. 흰쥐 두뇌의 일차 신경세포 배양은 다음과 같은 방법으로 시행하였다. 임신 18일째 흰쥐의 복강으로부터 태자를 수거하였고 태자의 두뇌를 적출하여 대뇌피질 부위를 분리하였다. 이를 트립신으로 분해하여 single cell을 얻었고 B27이 함유된 Neuro Basal Medium(NBM)을 이용하여 세포를 배양하여 연구에 사용하였다. 신경세포의 독성을 측정하기 위해 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)시약을 이용하여 생성된 formazan을 측정하였고 세포 내 ROS 측정은 H2DCF-DA를 사용하였다.
그 결과, PR3가 처리된 소교세포로부터 얻은 conditioned media는 신경세포에서 농도 의존적으로 ROS를 증가시켰고 세포사멸을 유도함을 확인하였다 (도 5a).
이후 본 발명자들은 PR3에 의한 신경세포사멸의 형태를 알아보고자 에팝토시스의 마커인 caspase-3의 활성을 Western blotting을 이용해 확인하였고 그 방법은 다음과 같다. PR3가 처리된 소교세포로부터 얻은 conditioned media를 처리한 신경세포로부터 단백질을 추출하여 BCA 단백질 정량법을 이용하여 단백질 양을 정량하였다. 30 ug의 단백질을 얻어 샘플 버퍼를 넣고 이를 12 %의 SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 이용하여 전기영동하였다. 전기영동한 단백질을 나이트로세룰로스 막에 전기적으로 transfer하였고, blot을 5 % 탈지분유를 이용하여 blocking하였다. 일차항체로서 caspase-3 를 가하고 4℃에서 오버나잇으로 반응시켰다. HRP (horse radish peroxidase)가 붙어있는 이차 항체를 1시간 동안 가하였다. PBS로 10분씩 세번 세정하고 마지막 세정 후에 Enhanced chemilumnescence (ECL)법을 이용하여 LAS-3000기기를 이용하여 단백질 발현양을 확인하였고 Image J 프로그램으로 정량하였고, 실험은 최소한 3회 반복하였다.
그 결과, 에팝토시스의 마커인 caspase-3의 활성을 PR3가 증가시킴을 cleaved caspase-3의 발현의 증가로 확인할 수 있었다 (도 5b). 이를 통해 PR3는 소교세포를 활성화시키고 활성화된 소교세포는 여러가지 염증성매개 물질을 분비하여 신경세포의 사멸을 유도함을 알 수 있었고 이러나 세포사멸의 형태는 에팝토시스로서 나타남을 확인할 수 있었다.
실시예 3: PR3 microinjection 에 의한 신경세포 사멸 ( in vivo )
striatum으로 0.5ug PR3를 microinjection 한 후 5일째 뇌를 고정하여 striatum과 substantia nigra에서의 신경세포 사멸과 microglia 활성을 TH(Tyrosine hydroxylase), OX-6와 CD11b 항체를 이용하여 면역염색하였다.
Stereotaxic surgery를 위해서 300 g의 SD 수컷 흰쥐를 준비하여 Rompun/ketamine (1:2, 2 ml/kg, i.p.)으로 마취하였고, stereotaxic frame (Stoelting, Wood Dale, IL)에 마취된 쥐를 놓고 ear bar로 고정하였다. Proteinase-3 (1.5 ul; 0.5 ug)를 0.5 ul/minute 속도로 striatum (anterior (A), + 0.7; lateral (L), + 2.1; ventral (V), - 5.0)에 injection 하였고 PBS injection한 대조군과 비교하였다. 실시예 1-2의 방법으로 흰쥐 뇌조직의 striatum과 substantia nigra에서 일차항체로서 TH(Tyrosine hydroxylase), OX-6와 CD11b 항체를 이용하여 면역염색하였다. TH는 striatum과 substantia nigra의 dopaminergic neuron의 marker이고 OX-6/CD11b는 microglia 의 marker이다. 실험에 사용한 동물은 군당 최소한 3 마리였다.
그 결과, 대조군에 비해 PR3 주사한 동물로부터 뇌의 striatum과 substantia nigra에서는 CD11b와 OX6로 염색되는 활성화된 소교세포가 많아짐이 확인되었고 tyrosine hydroxylase 로 염색되는 신경세포가 감소함에 따라 신경세포의 사멸이 증가되었음이 관찰되었다 (도 6a).
이후에 발명자들은 PR3 주사한 동물에서 신경세포의 사멸에 대해 신경세포의 마커인 NeuN을 이용하여 면역염색하였고, hematoxylin/eosin (H/E)염색을 통해 조사하였다. 이를 통해 대조군에 비해 PR3 주사한 동물에서의 striatum과 substantia nigra에서 NeuN으로 염색되는 신경세포 수가 감소함을 관찰하였고 또한, H/E염색을 통해 신경세포의 사멸이 PR3 주사에 의해 감소했음을 관찰하였다 (도 6b).
따라서, 뇌졸중과 같은 뇌신경질환에서 PR3는 호중구 infiltration에 의해서 증가되고 소교세포와 같은 염증성 세포를 활성화시켜 신경세포사멸을 유도함을 확인하였다.
<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Proteinase-3 as therapeutic target of Stroke <160> 11 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 256 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala His Arg Pro Pro Ser Pro Ala Leu Ala Ser Val Leu Leu Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ser Gly Ala Ala Arg Ala Ala Glu Ile Val Gly Gly His 20 25 30 Glu Ala Gln Pro His Ser Arg Pro Tyr Met Ala Ser Leu Gln Met Arg 35 40 45 Gly Asn Pro Gly Ser His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile His Pro Ser 50 55 60 Phe Val Leu Thr Ala Pro His Cys Leu Arg Asp Ile Pro Gln Arg Leu 65 70 75 80 Val Asn Val Val Leu Gly Ala His Asn Val Arg Thr Gln Glu Pro Thr 85 90 95 Gln Gln His Phe Ser Val Ala Gln Val Phe Leu Asn Asn Tyr Asp Ala 100 105 110 Glu Asn Lys Leu Asn Asp Ile Leu Leu Ile Gln Leu Ser Ser Pro Ala 115 120 125 Asn Leu Ser Ala Ser Val Thr Ser Val Gln Leu Pro Gln Gln Asp Gln 130 135 140 Pro Val Pro His Gly Thr Gln Cys Leu Ala Met Gly Trp Gly Arg Val 145 150 155 160 Gly Ala His Asp Pro Pro Ala Gln Val Leu Gln Glu Leu Asn Val Thr 165 170 175 Val Val Thr Phe Phe Cys Arg Pro His Asn Ile Cys Thr Phe Val Pro 180 185 190 Arg Arg Lys Ala Gly Ile Cys Phe Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile 195 200 205 Cys Asp Gly Ile Ile Gln Gly Ile Asp Ser Phe Val Ile Trp Gly Cys 210 215 220 Ala Thr Arg Leu Phe Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu Tyr Val 225 230 235 240 Asp Trp Ile Arg Ser Thr Leu Arg Arg Val Glu Ala Lys Gly Arg Pro 245 250 255 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 taagctattc agttactcct actggaa 27 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cctctctagc acacatgcac tt 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gtgttccacc aggagatgtt g 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ctcctgccca ctgagttcgt c 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttgtgcaatg gcaattctga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tggaagttgg ggtaggaagg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aaaatgcctc gtgctgtctg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ctatgtcccg accattgctg 20 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gtgaaggtcg gtgtgaacgg attt 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cacagtcttc tgagtggcag tgat 24

Claims (8)

  1. 소교세포에 프로테이나아제(proteinase)-3를 처리한 후 배양하는 단계;
    이러한 처리 단계 전, 동안 또는 후에, 상기 세포를 스크리닝하고자 하는 화합물과 접촉하는 단계;
    상기 세포의 배양물을 신경세포에 처리하여 활성 산소 또는 세포 사멸을 측정하는 단계; 및
    상기 스크리닝하고자 하는 화합물 중 화합물과 접촉에 의하여 신경세포의 활성산소 증가 또는 세포사멸을 억제 또는 방지하는 화합물은 선도 화합물로서 채택하고 활성산소 증가 또는 세포 사멸을 억제 또는 방지하지 않는 화합물은 거부하는 단계를 포함하는 뇌졸증 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 동정하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프로테이나아제(proteinase)-3는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌졸증 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 동정하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법.
  3. 프로테이나아제(proteinase)-3를 유효성분으로 포함하는 뇌졸증 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 동정하기 위한 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 프로테이나아제(proteinase)-3는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌졸증 치료 또는 예방에 유용한 화합물을 동정하기 위한 조성물.
  5. 피험자로부터 분리된 샘플로부터 프로테이나아제(proteinase)-3 레벨을 측정하는 단계;
    정상 대조군 샘플에서 프로테이나아제(proteinase)-3 레벨을 측정하는 단계;
    피험자의 프로테이나아제(proteinase)-3 레벨과 정상 대조군의 프로테이나아제(proteinase)-3 레벨을 비교하여 정상 샘플에 비하여 프로테이나아제(proteinase)-3 레벨이 증가한 경우에 뇌졸증의 존재를 나타내는 것을 포함하는 피험자의 뇌졸증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 뇌졸증 마커를 측정하는 시험관내 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 프로테이나아제(proteinase)-3는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 피험자의 뇌졸증 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 뇌졸증 마커를 측정하는 시험관 내 방법.
  7. 뇌에 프로테이나아제(proteinase)-3를 주입하여 뇌졸증을 유발하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 프로테이나아제(proteinase)-3는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 뇌졸증을 유발하는 방법.
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