KR20120089800A - 신규 항체 및 치료 및 진단 방법에서 그것의 사용 - Google Patents

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Abstract

KTPAF50 단백질을 특이적으로 인식하는 다클론성 및 단클론성 항체 및 그것을 포함하는 조성물이 제공된다. 또한 암, 자가면역질환, 이식편거부반응, 신경퇴행성 질환 및 당뇨병과 같은 질환의 진단 및 치료에서, KTPAF50-특이적 항체의 사용이 제공된다.

Description

신규 항체 및 치료 및 진단 방법에서 그것의 사용{NOVEL ANTIBODIES AND THEIR USES IN THERAPEUTIC AND DIAGNOSTIC METHODS}
본 발명은 특히 자가면역 질환 및 암에 대한 신규 항체 및 치료 및 진단 방법 서 그것의 사용에 관한 것이다.
본 출원을 통해 언급된 모든 간행물은 본원에서 인용되는 모든 참고문헌을 포함하여, 본원에 참고로써 완전하게 포함된다.
조직-특이적 단백질 및 그것의 발현 수준은 질병의 경우에 치료를 위한 잠재적인 표적일 뿐만 아니라 유기체의 건강 상태에 대한 뛰어난 지표일 수 있다.
인간에 영향을 미치는 질병은 그것의 원인의 메커니즘에 따르는 범주로 분류된다. 예를 들어, 면역 성분 또는 병인을 가지는 질병은 전염성 질병, 급성 및 만성 염증 질병, 암, 이식 및 자가면역 질병을 포함한다.
용어 염증성 장 질환(IBD)은 아마도 그 자체의 장 조직에 대해 신체의 면역 반응의 결과로서, 장에 염증이 생기는(붉고 부어 있음) 장애의 그룹을 포함하고, 따라서 자가-면역 질환으로 생각된다.
IBD의 두 가지 주요 형태가 설명되었다: 궤양성 대장염(UC) 및 크론병(CD). 명칭이 시사하는 바와 같이, 궤양성 대장염은 결장(대장)으로 제한된다. 크론병은입으로부터 항문까지의 위장관의 임의의 부분을 포함할 수 있지만, 이것은 소장 및/또는 결장에 가장 흔하게 영향을 미친다.
심각한 염증이 있을 때, 질병은 활성 단계에 있는 것으로 고려되고, 사람은 질환의 돌발을 경험한다. 염증의 정도가 덜할 때(또는 없을 때), 사람은 보통 증상이 없고, 질병은 차도가 있는 것으로 생각된다.
염증성 장질환의 원인은 완전히 명확하지 않다. 알려지지 않은 인자/약제(또는 인자들의 조합)는 신체의 면역계가 조절 없이 계속 장관에서 염증성 반응을 만들도록 촉발한다. 염증성 반응의 결과로서, 장벽은 혈리 및 복통을 유발하는 손상이 생긴다.
유전적, 감염성, 면역적, 및 심리적 인자는 모두 IBD의 발생에 영향을 미치는 원인인 것으로 나타났다. IBD의 발생에 대해 유전적 체질(또는 아마도 감수성)이 있다. 그러나, 신체 면역계의 활성화를 위한 인자를 촉발하는 것은 지금까지 확인되었다. 신체예 면역계에서 변할 수 있는 인자는 감염성 약제(아직 확인되지 않음), 항원에 대한 면역 반응(예를 들어, 소 우유로부터의 단백질), 또는 자가면역 과정을 포함한다. 장은 면역 반응을 야기할 수 있는 것들에 항상 노출되지만, 더 최근의 가설은 정상 면역 반응을 벗어나는 유기체의 부전이 있다는 것이다.
IBD는 만성 질병이며, 질병이 심해지고 증상을 야기하는 기간 다음에, 증상이 사라지거나 또는 감소되고 양호한 건강상태로 되돌아오는 차도의 기간을 통해 피험자에 영향을 미친다.
증상은 경증 내지 중증의 범위에 있을 수 있고, 일반적으로 포함된 장관의 부분에 의존할 것이다. 그것들은 다음을 포함한다: 경련성 복통 및 통증; 혈리; 배변에 대한 심각한 응급; 열; 식욕 부진; 체중 감소; 빈혈증(실혈에 기인).
염증성 잘질환의 장 합병증은 다음을 포함한다: 궤양으로부터 다량의 출혈; 장의 천공(파열); 협착 및 폐쇄(크론병이 있는 사람에서, 협착은 종종 염증성이고, 빈번하게 의학적 치료를 해결한다); 고정된 또는 섬유증의(흉터형성) 협착은 내시경적 또는 외과적 개입을 요구하여 폐쇄를 완화할 수 있다. 궤양성 대장염에서, 대장 구조는 악성(암성)이 되는 것으로 추측되어야 한다. 누관(비정상적 통로) 및 항문 주변 질병은 크론병이 있는 사람에서 더 흔하다. 독성거대결장(대장의 급성 비폐쇄성 확장)은 궤양성 대장염의 생명을 위협하는 합병증이고, 응급의 외과적 수술이 요구된다. 궤양성 대장염에서 대장암의 위험은 진단의 대략 8-10년 후 일반적 모집단의 위험 이상으로 유의하게 발생하기 시작한다. 크론병에서 암의 위험은 전체 대장이 포함된다면 궤양성 대장염에서 암의 위험과 동일 할 수 있다. 소장암의 위험은 크론병에서 증가되었다.
IBD의 장외 관련(Extraintestinal involvement)은 장 이외의 기관을 수반하는 합병증을 말한다. 이것은 IBD가 있는 사람들의 적은 비율에만 영향을 미친다. IBD가 있는 사람들은 관절염, 피부 질환, 눈의 염증, 간 및 신장 장애, 및 뼈 손실이 있을 수 있다.
IBD의 진단은 현재 검사와 시험의 조합을 통해 주로 행해지며, 분변검사, 대변잠혈검사, 완전 혈구 측정, 전해질 검사, LFT (알라닌 트랜스아미나아제, 아스파르테이트, 알칼린 포스파타아제, 알부민, 전체 단백질 및 빌리루빈 수준을 측정)을 포함한다.
영상의학 (예를 들어 복부 X-레이 또는 바륨 관장) 및 내시경 절차(예를 들어, 결장내시경술 및 S자결장경검사)가 또한 IBD의 진단을 위해 사용된다.
분명히, IBD에 대해 여전히 명확하지 않은 진단 방법이 있으며, IBD의 다르고 특이적인 진단에 도움을 줄 수 있는 분자 마커에 대한 필요가 있다.
암의 비-제한적 예는 부신피질 암; 악성 흑색종; 비-흑색종 피부 암; 피부 T세포 림프종; 카포시육종; 방광암; 대장암; 결장직장암; 직장암; 신경외배엽성 및 송과체 암; 소아 뇌줄기 신경아교종; 소아 소뇌 성상세포종; 소아 대뇌 성상세포종; 소아 수모세포종; 소아 시로 신경교종; 수막종; 혼합 신경교종; 희소돌기아교세포종; 성상 세포종, 뇌실막종; 뇌하수체 선종; 전이성 선암종; 청신경종; 척추주위 악성기형종; 유방암; 유관 상피내암종; 유선종양; 난소암; 유암종; 자궁경부암; 자궁암; 자궁내막암; 질암 여성외부 생식기암 임신성 융모성 암; 자궁관 암; 자궁육종; 백혈병; 림프종(호지킨병 및 비호지킨병); 신경모세포종; 망막모세포종; 연부조직육종; 윌름 종양; 판코니 빈혈; 랑게르한스세포조직구증식증; 신장의 악성 간상 종양; 간암; 신경모세포종; 망막모세포종; 융모막암종; 내분비암; 자궁내막암; 식도암; 유잉 육종; 안암; 위암; 위장암; 비뇨생식기 암; 신경교종; 부인과 암; 두경부암; 간세포암; 하인두 암; 섬세포암; 신장암; 후두암; 폐암; 림프종; 남성유방암; 흑색종; 중피종; 다발성 골수종; 비인두암; 비-흑색종 피부 암; 식도암; 골육종; 난소암; 췌장암; 뇌하수체암; 전립선암; 신세포암; 망막모세포종; 횡문근육종; 육종; 피부암; 편평세포암종; 위암; 고환암, 흉선암; 갑상선암; 이행세포암; 융모상피암; 자궁암; 급성림프성백혈병; 급성 골수성 백혈병; 선양낭포암; 항문암; 뼈암; 유관암; 지방육종; 신경모세포종; 신아세포종 및 골육종을 포함한다.
염증성 질병은 패혈증, 내독소혈증, 췌장염, 포도막염, 간염, 복막염, 각막염, SIRS 및 상처-유발 염증을 포함한다.
생식력과 관련된 질병은 남성 불임 및 여성 불임을 포함한다. 여성 불임은 다양한 문제에 의해 야기될 수 있다. 일부 더 흔한 장애는 하기에 열거한다:
- 결함있는 정자 생산: 남성 불임의 90%는 충분한 정자를 만들지 못함으로써 야기된다. 무정자증은 정자가 만들어지지 않을 때 일어나는 한편, 정자부족증은 정자가 거의 만들어지지 않을 때 진단된다;
- 정계정맥류;
- 기타 장애: 남성 불임을 야기할 수 있는 기타 장애는 고환의 비정상적 발달 또는 손상(내분비 장애 또는 염증에 의해 야기), 생식기부속선의 장애, 성교장애, 남성 생식관에서 낭종을 야기한 1950년대 및 1960년대에 사용된 합성 에스트로겐 디에틸스틸베스트롤(DES)에 노출, 불강하 고환, 및 드문 경우에 염색체 이상과 같은 유전적 장애를 포함한다.
여성 불임이 또한 다양한 문제에 의해 야기될 수 있다. 일부 더 흔한 장애는 다낭성난소질환, 골반염, 배란기능부전, 자궁근종, 자궁내막증 및 면역적 불임이다.
탄수화물 대사의 장애는 다양한 형태로 일어난다. 가장 흔한 장애는 후천적이다. 당뇨병성 케톤산증, 고장성 혼수, 및 저혈당증과 같은 탄수화물 대사의 후천적 또는 2차적 교란은 모두 중추신경계에 영향을 미친다. 말초신경 질병의 다양한 형태 및 변이체가 또한 당뇨병에서 보인다. 탄수화물 대사산물이 남아있는 장애는 대사의 희귀한 선천성 이상이다(즉, 유전적 결함).
탄수화물 대사의 후천적 장애는 미국 및 전세계적으로 꽤 흔하다. 저혈당증은 알코올 중독자와 인슐린으로 치료되는 당뇨병이 있는 환자 중에서, 신경질병, 특히 급성 정신황폐, 기억상실, 방향상실, 둔감, 및 혼수의 통상적인 원인이다.
탄수화물 대사의 유전적 장애는 드물다. 펜토오스뇨증으로 이상하게 불리는 피루브산탈수소효소 (PDH) 착물 및 양성 화학물질의 심각한 결함이 매우 적은 환자들(2-6명)에게서 보고되었다.
저혈당증, 당뇨병 케톤산증, 및 고장성 혼수는 잠재적으로 치명적이지만 잠재적으로 치료가능한 질환이다.
WO 2009/083968에서, 본 발명자들은 태반, 신장 (성인 및 태아), 췌장 및 정소에서 특이적으로 발현되는 것으로 나타난 반면, 조혈조직에서 이 단백질은 휴식 및 활성화된 CD8+ 세포, 휴식 및 활성화된 단핵 세포 및 휴식 및 활성화된 CD19+ 세포에서 검출된 KTPAF50로 표시된 단백질을 설명하였다.
놀랍게도, KTPAF50에서 특이적 항체의 발생시, 본 발명자들은 본 발명에서 KTPAF50의 발현이 특정 질병 상태, 특히 암 및 자가면역질환과 관련될 수 있다는 것을 나타낸다.
훨씬 더 예상외로, 본 발명자들은 KTPAF50-특이적 항체가 세포 성장과 사이토카인 발현의 잠재적 조절자라는 것을 보여준다.
따라서, 본 발명의 목적은 KTPAF50을 특이적으로 인식하는 항체뿐만 아니라 암, 자가면역질환, 이식편 거부반응, 신경퇴행성질환 및 당뇨병에서 그것의 사용을 제공하는 것이다.
본 명세서 및 하기의 실시예에 의해 나타낼 바와 같이, 본 발명의 진단 방법은 특정 종류의 암 및 자가면역 질환의 검출 및 모니터링에 특히 적합하다.
본 발명의 이것 및 다른 사용 및 목적들은 설명이 진행됨에 따라서 명백할 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은 KTPAF50 단백질 또는 그것의 임의의 단편 또는 유도체를 특이적으로 인식하는 항체, 뿐만 아니라 그것을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 KTPAF50 단백질은 SEQ. ID. NO. 1 또는 SEQ. ID. NO. 2로써 표시된다.
본 발명은 또한 KTPAF50-유도된 펩티드를 특이적으로 인식하며, 상기 펩티드는 SEQ. ID. NO. 3, SEQ. ID. NO. 5, SEQ. ID. NO. 6 및 SEQ. ID. NO. 7중 임의의 하나로서 표시되는 항체 뿐만 아니라 그것을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본원에서 설명되는 항체 또는 그것을 포함하는 조성물은 진단 및/또는 치료 방법에서 사용을 위한 것이다.
특히, 상기 항체들 또는 그것을 포함하는 조성물은 암 및 자가면역 질환의 진단 또는 예후뿐만 아니라 암의 치료에서 사용을 위한 것이다.
다른 양태에서 본 발명은 항체-생성 셀라인 또는 하이브리도마 셀라인을 제공하며, 상기 셀라인은 KTPAF50 단백질 또는 그것으로부터 유도된 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 만든다. 이 셀라인에 의해 만들어지는 항체들은 또한 본 발명에 의해 제공된다.
추가 양태에서, 본 발명은 진단 또는 치료 조성물의 제조에서 KTPAF50 단백질 또는 그것으로부터 유도된 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체의 사용을 제공한다.
한 구체예에서, 본원에서 제공되는 진단 조성물은 암 및 자가면역 질환 중 임의의 하나의 진단을 위한 것이다.
본 발명에 의해 제공되는 치료 조성물은 암, 자가면역질환, 신경퇴행성 질환, 당뇨병 및 이식편 거부반응으로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환의 치료를 위한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 피험자에서 암 또는 자가면역 질환 중 임의의 하나의 진단을 위한 방법을 제공한다:
a) 샘플을 상기 피험자로부터 제공받는 단계;
b) 상기 샘플을 KTPAF50 단백질 또는 그것으로부터 유도된 펩티드를 특이적으로 인식하는 적어도 하나의 항체 또는 그것을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계;
c) 검출 수단을 통해 상기 적어도 하나의 항체와 그것의 특이적 항원 사이에서 착물의 형성을 검출하는 단계;
이것에 의한 착물의 검출은 상기 피험자가 암 또는 자가면역 질환을 겪고 있다는 것을 나타낸다.
상기 방법 중 한 구체예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플이다.
상기 방법의 다른 특정 구체예에서, 상기 암은 폐, 유방 및 난소암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
추가 구체예에서, 본 발명은 암의 치료를 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나의 항-KTPAF50 항체 또는 그것의 조합, 또는 그것을 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 세포 성장을 억제하는 방법 또는 사이토카인 발현을 억제하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나의 항-KTPAF50 항체 또는 그것의 조합, 또는 그것을 포함하는 조성물의 유효한 양을 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 한 특정 구체예에서, 상기 세포는 사이토카인을 발현시키는 세포이다.
본 발명의 항체에 의해 발현이 억제되는 특정 사이토카인은 TNF-α, IFN-γ 또는 IL-10이다.
추가 양태에서, 본 발명은 암 또는 자가면역 질환의 진단, 치료효능의 모니터링 또는 예후의 평가 중 임의의 하나를 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 하기 구성요소들을 포함한다:
a) 본 발명에 따르는 적어도 하나의 항체 또는 그것을 포함하는 조성물; 및
b) 샘플 내 항원의 존재하에서 검출을 수행하기 위한 설명서, 상기 항원은 본 발명의 상기 항체에 의해 특이적으로 인식된다.
상기 키트는 하기 구성요소 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다:
a) 시험되어야 하는 샘플을 수집하기 위한 적어도 하나의 수단;
b) 상기 항체에 의해 상기 항원의 상기 인식의 검출에 필요한 적어도 하나의 시약; 및
c) 적어도 하나의 대조군 샘플.
도 1: 항-KTPAF50 대 KTPAF50 항원의 특이성을 나타내는 교정곡선.
도 2: 건강한 개인(H)와 비교하여 폐암 환자(LC)로부터 획득한 인간 혈액 혈청 중에서 KTPAF50 농도를 나타내는 히스토그램.
도 3A-3C: 암컷 Balb/C 비장세포 생육성에서 항-KTPAF50 단클론성 항체의 효과
도 3A: 레자주린으로 4 시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체에 의한 24 시간 처리 효과를 나타내는 히스토그램.
도 3B: 레자주린으로 24 시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체에 의한 24시간 처리 효과를 나타내는 히스토그램.
도 3C: 레자주린으로 24 시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체에 의한 48시간 처리 효과를 나타내는 히스토그램.
약어: 항-PRT3 1 = 항체 3E3G7; 항-PRT3 2 = 항체 5E11H3; Treat. = 처리; rel. cont. = 대조군 대비.
도 4A-4F: 암컷 또는 수컷 C57/블랙 비장세포 생육성에서 항-KTPAF50 단클론 항체의 효과
도 4A: 수컷 C57/블랙 마우스로부터 세포에서 레자주린으로 24 시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체에 의한 24시간 처리 효과를 나타내는 히스토그램.
도 4B: 암컷 C57/블랙 마우스로부터 세포에서 레자주린으로 24 시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체에 의한 24시간 처리 효과를 나타내는 히스토그램.
도 4C: 수컷 C57/블랙 마우스로부터 세포에서 레자주린으로 24 시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체에 의한 48시간 처리 효과를 나타내는 히스토그램.
도 4D: 암컷 C57/블랙 마우스로부터 세포에서 레자주린으로 24 시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체에 의한 48시간 처리 효과를 나타내는 히스토그램.
도 4E: 수컷 C57/블랙 마우스로부터 세포에서 레자주린으로 4.5시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체에 의한 72시간 처리 효과를 나타내는 히스토그램.
도 4F: 암컷 C57/블랙 마우스로부터 레자주린으로 4.5시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체에 의한 72시간 처리 효과를 나타내는 히스토그램.
약어: 항-PRT3 1 = 항체 5E11H3; 항-PRT3 2 = 항체 3E3G7; Treat. = 처리; rel. cont. = 대조군 대비.
도 5: C57/블랙 처리된 비장세포로부터 배지 내 KTPAF50 농도.
약어: f.= 암컷; m.= 수컷
도 6A-6C: 24-시간 항-KTPAF5 항체 처리 후 인간 단핵구의 생육성
도 6A: 레자주린으로 2-시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체로 24-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
도 6B: 레자주린으로 4-시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체로 24-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
도 6C: 레자주린으로 24-시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체로 24-시간 측정의 효과를 나타내는 히스토그램.
약어: 항-PRT3 1 = 항체 5E11H3; 항-PRT3 2 = 항체 3E3G7; rel.= 비례; cont.= 대조군; treat.= 처리.
도 7A-7B: 48-시간 항-KTPAF50 항체 처리 후 인간 단핵구의 생육성.
도 7A: 레자주린으로 2-시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체로 48-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
도 7B: 레자주린으로 4-시간 인큐베이션 후 측정된 항-KTPAF50 항체로 48-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
약어: 항-PRT3 1 = 항체 5E11H3; 항-PRT3 2 = 항체 3E3G7; rel.=비례; cont.= 대조군; treat.= 처리.
도 8A-8E: 인간 단핵구에서 TNF-α 발현에서 KTPAF50 항체의 효과.
도 8A: TNF-α 교정.
도 8B: TNF-α 발현에서 KTPAF50 항체로 24-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
도 8C: TNF-α 발현에서 KTPAF50 항체로 48-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
도 8D: TNF-α 발현에서 KTPAF50 항체로 120-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
도 8E: TNF-α 발현에서 KTPAF50 항체로 144-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
약어: 항-PRT3 1 = 5E11H3; 항-PRT3 2 = 3E3G7; cont. = 대조군.
도 9A-9E: 인간 단핵구에서 INF-γ 발현 상의 KTPAF50 항체 효과
도 9A: INF-γ 교정.
도 9B: INF-γ 발현에서 KTPAF50 항체로 24-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
도 9C: INF-γ 발현에서 KTPAF50 항체로 48-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
도 9D: INF-γ 발현에서 KTPAF50 항체로 120-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
도 9E: INF-γ 발현에서 KTPAF50 항체로 144-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
약어: 항-PRT3 1 = 5E11H3; 항-PRT3 2 = 3E3G7; EXP=발현; conc. = 농도.
도 10A-10E: 인간 단핵구에서 IL-10 발현 상의 KTPAF50 항체의 효과.
도 10A: IL-10 교정.
도 10B: IL-10 발현에서 KTPAF50 항체로 24-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
도 10C: IL-10 발현에서 KTPAF50 항체로 48-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
도 10D: IL-10 발현에서 KTPAF50 항체로 120-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
도 10E: IL-10 발현에서 KTPAF50 항체로 144-시간 처리의 효과를 나타내는 히스토그램.
약어: 항-PRT3 1 = 5E11H3; 항-PRT3 2 = 3E3G7; conc. = 농도.
도 11: 24-시간 및 144-시간 인큐베이션 후 인간 단핵구의 배지에서 KTPAF50 단백질의 존재.
약어: cont.= 대조군.
도 12A-12F: 광 현미경에 의해 시각화된 항-KTPAF50 처리 후 세포 형태의 변화.
도 12A: 대조군
도 12B: 100 ㎕의 항-KTPAF5 항체로 처리한 세포(α-PRT3 1).
도 12C: 100 ㎕의 항-KTPAF50 항체로 처리한 세포(α-PRT3 2).
도 12D: 100 ng/ml의 KTPAF50 단백질로 처리한 세포.
도 12E: 500 ng/ml의 KTPAF50 단백질로 처리한 세포.
도 12F: 1000 ng/ml의 KTPAF50 단백질로 처리한 세포.
이전의 보고에서, 본 발명자들은 발현 패턴과 생물학적 활성을 제공하는 KTPAF50(또한 본원에서 PRT3으로 언급됨)로 명명된 단백질을 설명하였다[WO 2009/083968]. 본 발명의 목적을 위해, WO 2009/083968의 내용은 참고로써 본원에 완전하게 포함된다.
가장 주목할 만하게는, WO 2009/083968는 KTPAF50 발현 패턴을 설명한다. 추가로, WO 2009/083968는 SEQ. ID. NO.1로서 본원에서 제공되는 단일 펩티드가 없는 KTPAF50 전장 단백질의 서열 뿐만 아니라 SEQ. ID. NO.2로서 본원에서 제공되는 단일 펩티드가 있는 KTPAF50 전장 단백질의 서열을 제공한다. 게다가, N-말단 펩티드, 36개 아미노산 길이는 또한 SEQ. ID. NO.4로서 본원에서 표현되는 WO 2009/083968에서 설명된다.
본 발명에서, 본 발명자들은 KTPAF50단백질 및/또는 KTPAF50-유도된 펩티드를 인식하고 결합하는 항체의 발생을 설명한다.
놀랍게도, 하기 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 상기 항체들은 WO 2009/083968에서 설명한 바와 같이 KTPAF50의 조직 발현과 직접 관련이 없는 특정 종류의 암, 특히 폐에서 상기 단백질의 확인에 특이적인 것으로 나타났다.
본 발명자들은 또한 KTPAF50-특이적 항체들인 세포 생육성의 강력한 조절자이고, 따라서 세포 성장을 조절하는데 중요한 도구로서 사용될 수 있다는 것을 증명한다.
예상치 못하게, KTPAF50-특이적 항체들은 전구염증사이토카인(pro inflammatory cytokines) 발현의 조절자로서 나타난다. 이 결과는 면역계의 항상성 균형에서 KTPAF50의 중심이 되는 역할을 제안하고, 잠재적 면역조절자로서 항체를 제공한다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 KTPAF50 단백질 또는 그것의 임의의 단편 또는 유도체를 특이적으로 인식하는 항체를 제공한다. 특이적으로, 상기 KTPAF50 단백질은 SEQ ID NO. 1 또는 SEQ. ID. NO. 2에 의해 표시된다. SEQ. ID. NO. 1은 50 aa 길이이고, 신호 펩티드가 없는 KTPAF50 단백질에 관한 것이다. SEQ. ID. NO. 2는 74 aa 길이이고, WO 2009/083968에서 앞서 설명한 바와 같은 단일 펩티드를 포함하는 전장 KTPAF50 단백질에 관한 것이다.
본원에서 정의한 바와 같은, 본 발명의 항체는 보통 자연적으로 유도, 또는 자연적으로 생성된다. 따라서, 항체는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체이다. 대안으로, 본 발명의 항체는 예를 들어, 화학적 합성을 통해 합성으로 만들어지고, 또는 각각의 항체-생성 세포 또는 셀라인으로부터 특이적 mRNA의 분리를 통해 재조합적으로 만들어진다. 상기 특이적 mRNA는 이어서 재조합적으로 생성된 항체를 만들기 위해서 표준 분자 생물학 조작을 받을 것이다(cDNA를 얻고 발현 벡터에 상기 cDNA를 도입 등). 상기 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.
단백질에 대한 다클론성 항체의 생성은 당업자에게 잘 알려진 기법이고, 그 중에서도 Current Protocols in Immunology의 Chapter 2, John E. Coligan et al. (eds.), Wiley and Sons Inc에서 설명된다.
단클론성 항체는 혼성 세포의 성장에 좋은 조건 하에서 불멸화된 B 세포와 융합에 의해, 면역화된 동물들, 특히 래트 또는 마우스의 비장 또는 림프절로부터 취한 B 세포로부터 제조될 수 있다. 단클론성 항체를 만드는 기법은 상기 주목한 Current Protocols in Immunology의 Chapter 2와 같은 다수의 논문 및 교재에서 설명된다. 이 동물들의 비장 또는 림프절은 그것의 Chapter 2에서 설명되는 바와 같은 단클론성 항체의 생성을 위한 단백질-면역화된 동물의 비장 또는 림프절로서 동일 방법으로 사용될 수 있다. 단클론성 항체를 만드는데 사용된 기법은 Kohler and Milstein [Kohler and Milstein (1975) Nature 256; 495-497], 및 US 4,376,110에서 추가로 설명된다.
실시예 2는 본 발명자에 의해 만들어진 30 KTPAF50-특이적 단클론성 항체를 설명한다. 표 2는 각각의 항체의 항원 특이성을 나타내고, 표 3은 그것의 항원 친화도를 나타낸다.
용어 "항체"는 또한 무결함 분자뿐만 아니라, 예를 들어 scFv, Fv, Fab', Fab, 디아바디(diabody), 선형 항체, 항원에 결합할 수 있는 항체의 F(ab')2 항원 결합 단편과 같은 그것의 단편을 포함하는 것으로 의미된다[Wahl et al. (1983) J. Nucl. Med. 24, 316-325].
Fab 및 F(ab')2 및 항체들의 다른 단편은 무결함 항체 분자에 대해 본원에서 개시된 방법에 따르는 생물학적 샘플 중에서 본 발명의 항체의 생성을 위해서 뿐만 아니라 본원에 개시된 항체의 다른 사용을 위한 항원으로서 사용되는 단백질의 검출에 유용하다. 이러한 단편은 파파인(Fab 단편을 생성) 또는 펩신(F(ab')2 단편을 생성)과 같은 효소를 사용하여, 예를 들어 단백질 분해에 의해 만들어질 수 있다. 따라서, Fab 및 F(ab')2 및 본 발명에서 유용한 항체는 의도된 사용에 따라서 다양한 태그로 태깅될 수 있다. 이 태그는 검출을 용이하게 하기 위해 검출가능한 태그, 또는 종양세포를 사멸시키는 독성 태그, 또는 종양 세포를 사멸시키는 다른 세포 또는 물질을 유발할 수 있는 "유도성" 태그일 수 있다.
항체는 분자(항원)와 특이적으로 반응할 수 있다면, 분자를 "결합할 수 있는" 또는 "인식하는" 것으로 언급된다. 용어 "에피토프"는 항체에 의해 결합될 수 있으며, 또한 그 항체 또는 그 항체를 만드는 세포에 의해 인식될 수 있는 임의의 분자의 부분을 말한다. 에피토프 또는 "항원성 결정소"는 보통 아미노산 또는 당측쇄와 같이 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 구성되고, 특이적 3차원 구조 특성 뿐만 아니라 특이적 하전 특성을 가진다.
"항원"은 항체에 의해 인식 및 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 부분이다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 상기 언급한 특이적 반응은 매우 선택적이고 특이적인 방식으로 그것의 대응하는 항체와 반응할 것이고, 다른 항원에 의해 유발될 수 있는 다수의 다른 항체와는 반응하지 않을 것을 나타내는 것으로 의미된다.
본 발명에 의해 제공되는 항체들은 임의의 이소형, IgG, IgM, IgE, IgA 또는 IgD, 특히 다클론성 항체일 수 있다.
다클론성 항체들은 또한 임의의 이소형일 수 있다.
본원에서 제공되고 표 2에 존재하는 항체는 보통 IgG 이소형이었다.
본 발명에서, 본 발명의 KTAPF50-특이적 항체들을 만드는데 사용될 항원들은 전장 단백질에 또는 KTAPF50 단백질로부터 유래된 펩티드에 대응한다.
용어 "펩티드"는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 펩티드는 유전적 유전자 조작 방법, 숙주 세포 내 발현을 통해, 또는 임의의 다른 적당한 방법에 의해 합성으로 얻을 수 있다. 달리 표시되지 않는다면, 펩티드는 일반적으로 천연적으로-발생하는 L-아미노산으로 구성된다.
펩티드 분자에 대해 용어 "생물학적 특성"은 제한되는 것은 아니지만, 본 명세서에서 설명되는 생물학적 활성을 포함하여 전체 KTPAF50 펩티드 또는 KTPAF50 펩티드에 의해 발휘될 수 있는 시험관 내 또는 생체내 효과 중 적어도 하나를 발휘하는 펩티드의 능력을 말한다. 예를 들어, 생물학적 특성은 암, 면역계 관련 질병, 바이러스 질병 및 염증-기반 질병을 치료하기 위한 능력을 포함한다.
항체에 대해서, "생물학적 특성" 또는 "생물학적 활성"은 보통 에피토프를 특이적으로 인식하고, 그 결과 그것에 결합하는 항체의 능력을 말한다. 에피토프는 전장 단백질의 부분일 수 있고 또는 단백질의 단편 또는 펩티드에 포매(embed) 될 수 있다. 실시예에서 증명되고 도면에서 도시되는 바와 같이, 도 1은 KTPAF50 단백질에 대한 항-KTPAF50 항체의 특이성을 나타내었다. 도 3에서 유사하게, 항-T101 항체의 특이성이 T101 단백질에 대해 나타났다.
용어 "비변형 분자와 비교하여 변형된 분자의 생물학적 특성에 유의하게 영향을 미치지 않는"은 변형된 분자가 비변형 분자의 생물학적 활성과 질적으로 유사한 생물학적 활성을 보유한다는 것을 나타내는 것으로 의미된다.
본 발명에 관해 변형된 펩티드에 대해, 이것은 SEQ. ID. NO. 1, SEQ. ID. NO. 2, SEQ. ID. NO. 3, SEQ. ID. NO. 5, SEQ. ID. NO. 6, SEQ. ID. NO. 7의 단백질의 생물학적 활성의 하나 이상을 보유한다는 것을 의미한다. 펩티드가 비변형 분자의 생물학적 활성과 질적으로 유사한 생물학적 활성을 보유하는지 여부를 결정하기 위해서, 하나 이상의 분석, 예를 들어 변형된 펩티드가 동시에 분석되는 대응하는 비변형 펩티드와 비교되는 시험관내, 생체내 또는 임상 실험(즉, 전체 KTPAF50 펩티드 또는 KTPAF50 펩티드의 실험); 또는 변형된 펩티드가 개별적으로 수행된 실험으로부터 알려진 바와 같은 비변형 펩티드의 생물학적 효과와 유사한 생물학적 효과를 가지는지 여부를 시험하기 위해서 분석한 실험이 수행될 수 있다. 이러한 실험은, 예를 들어 WO 2009/083968에서 설명한 방식으로 수행될 수 있다.
변형 펩티드는 KTPAF50 펩티드에 포함된 적어도 8, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 적어도 45개의 아미노산 잔기의 대응하는 서열과 동일성의 정도를 가지는 적어도 8, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 적어도 45개의 아미노산 잔기의 연속하는 서열을 포함하는 펩티드일 수 있으며, 동일성의 정도는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더 바람직하게는 적어도 90% 및 특히 적어도 95%이다.
또한 본 발명에 의해 KTPAF50로부터 유도된 변형된 펩티드, 예를 들어 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환에 의해 다른 아미노산으로 치환되는 변형된 펩티드를 인식할 수 있는 항체가 제공된다. 본원에서 사용되는 "보존적 치환"은 한 분류 내 아미노산이 동일 분류의 아미노산으로써 치환되는 것을 말하며, 분류는 통상적인 물리화학적 아미노산 측쇄 특성 및 천연에서 발견되는 상동 단백질 중의 높은 치환 빈도에 의해 정의된다. 아미노산 측쇄의 6가지 일반적 분류는 범주화되고 다음을 포함한다: 클래스 I (Cys); 클래스 II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); 클래스 III (Asn, Asp, Gln, Glu); 클래스 IV (His, Arg, Lys); 클래스 V (Ile, Leu, Val, Met); 및 클래스 VI (Phe, Tyr, Trp). 예를 들어, Asp의 Asn, Gln, 또는 Glu와 같은 다른 클래스 III로 치환은 보존적 치환이다.
한 구체예에서, 아미노산 서열에서 단지 하나의 치환만이 만들어진다.
다른 구체예에서, 2개의 치환이 만들어진다. 추가 구체예에서, 3개의 치환이 만들어진다. 치환의 최대 수는 비치환 서열에서 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95%의 아미노산을 남기는 아미노산의 수를 초과하지 않아야 한다. 한 특정 구체예에 의해, 다른 것에 의해 3회 이하, 6회 이하로 치환되는 아미노산 잔기를 포함하는 치환은 보존적 치환이다.
추가 구체예에서, 하나 이상의 아미노산은 D-아미노산, 바람직하게는 대응하는 D-아미노산에 의해 치환될 수 있다. 특정 구체예에서, 모든 아미노산은 D-아미노산이다.
따라서, 본 발명은 실질적으로 동일 또는 더 큰 활성을 가지며 본원에서 개시되는 서열(SEQ. ID. NO.1, SEQ. ID. NO. 2, SEQ. ID. NO.3, SEQ. ID. NO.5, SEQ. ID. NO.6, SEQ. ID. NO.7)과 구조적으로 유사한 서열을 포함하는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 인식할 수 있든 항체가 속하는 것으로 이해된다. 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 구조의 변화는 하나 이상의 결실, 첨가 또는 치환을 포함한다. 서열의 임의의 지점에서 생길 수 있는 결실 또는 첨가의 수는 일반적으로 전체 다미노산 수의 25% 미만, 바람직하게는 10% 미만이다.
바람직한 치환은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 2차 구조를 변경하지 않을 것으로 기대되는 변화, 즉 보존적 변화이다. 하기 열거는 원래 아미노산(왼쪽)에 대해 교환될 수 있는 아미노산을 나타낸다(오른쪽).
Figure pct00001
아미노산은 또한 전하, 측쇄의 크기 등과 같은 그것의 본질적 특징에 따라서 그룹화될 수 있다. 하기 열거는 유사한 아미노산의 그룹을 나타낸다. 바람직한 치환은 하기와 같이, 한 그룹 내 존재하는 아마노산을 동일 그룹의 아미노산으로 교환한다:
1. 작고 지방성, 비극성: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
2. 극성의 음으로 하전된 잔기 및 그것의 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln;
3. 극성의 양으로 하전된 잔기: His, Arg, Lys;
4. 크고 지방성인 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val, Cys;
5. 크고 방향성인 잔기: Phe, Tyr, Trp.
아미노산 치환 및 단백질 구조의 추가 언급은 Schulz et al ., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY, 1979, and Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983에서 찾을 수 있다.
상술한 바와 같은 바람직한 보존적 아미노산 치환은 하기 본원에서 설명하는 바와 같은 본 발명의 항체에 의해 인식되는 단백질의 기능 또는 활성을 실질적으로 유지 또는 증가시킬 것으로 기대된다. 물론, 임의의 아미노산 치환, 첨가, 또는 결실은 본 발명의 범주 내인 것으로 고려되며, 결과 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 본 발명의 항체에 의해 인식되는 항원, 즉 본 발명의 항체에 의해 인식되는 단백질에 대한 기능과 실질적으로 동일 또는 더 우수한 항원이다.
본 발명의 항체에 의해 인식되는 단백질은 고체상 합성과 같은 통상적인 화학적 방법(예를 들어, FMOC 및 BOC 기법을 사용), 및 용해상 합성에 의해 만들어질 수 있다. 이 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 또한 하기 주목하는 Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 16에서 상술하는 바와 같은 박테리아 또는 곤충 세포 또는 다른 진핵 세포 생체 내 시스템에서 생성될 수 있다. 생성 후, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 그것들이 만들어진 세포로부터 정제된다. 펩티드 정제 방법은 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어, Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 16, John Wiley and Sons, 2006 및 Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Protein Science, Chapters 5 and 6, John Wiley and Sons, 2006에서 설명된다. 유리하게는, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 글루타티온-S-트랜스페라아제(GST) 등과 같은 제2 단백질, 또는 히스티딘 태그(His-tag) 서열과 같은 서열과 융합으로서 생성될 수 있다. 융합 또는 태그된 단백질의 사용은 상기 주목한 Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 16, 및 His-태그 단백질 발현 및 정제 키트에 대한 설명서에서 설명하는 바와 같은 정제 과정을 단순화한다[예를 들어, Qiagen GmbH, 독일로부터 이용가능].
본 발명의 항체에 의해 인식되는 단백질은 또한, 예를 들어 세포 추출물 또는 리보솜을 사용하여 무세포계에서 합성될 수 있다.
본 발명의 항원은 그것의 기능, 친화도, 또는 안정성을 개선시키도록 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 고리화는 펩티드 상에서 더 큰 안정성 및/또는 전반적인 개선된 성능을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 측쇄 고리화 및 백본 고리화를 포함하는 다수의 다른 고리화 방법이 개발되었다. 이 방법들은 선행기술에 잘 기록되어 있다[예를 들어, Yu et al ., Bioorg. Med. Chem. 7, 161-75, 1999, Patel et al., J. Pept. Res. 53, 68-74, 1999, Valero et al ., J. Pept. Res. 53, 56-67, 1999, Romanovskis et al ., J. Pept. Res. 52, 356-74, 1998, Crozet et al . Mol. Divers. 3, 261-76, 1998, Rivier et al ., J. Med. Chem. 41, 5012-9, 1998, Panzone et al ., J. Antibiot. (Tokyo), 51, 872-9, 1998, Giblin et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 12814-8, 1998, Limal et al ., J. Pept. Res. 52:121-9, 1998, 및 US 5,444,150].
고리화의 특정 방법은 벤젠 환의 파라-치환된 아미노산 유도체를 사용함으로써 양친매성 알파-나선의 안정화를 수반한다[Yu et al . (1999) id ibid]. 고리화의 다른 특정 방법은 Reissmann et al ., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1:51-6, 1994-95, 및 그것의 참고문헌에서 개시된 바와 같은 백본 고리화이다. 측쇄 연결에서 백본을 수반하는 고리화의 다른 방법이 또한 사용될 수 있다[Reissmann et al. (1994-95) id ibid].
그렇더라도, 본 발명에 따라서 본 발명의 항체에 의해 인식되는 단백질은, 자연적으로 발생하는 또는 합성의 아미노산이 아닌 다양한 동일 또는 다른 유기 모이어티를 가지는 N-말단 및/또는 C-말단에서 연장될 수 있다. 이러한 연장에 대한 예로서, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 N-아세틸기를 가지는 N-말단 및/또는 C-말단에서 연장될 수 있다.
펩티드 구조를 개선시키기 위해, 본 발명의 항체에 의해 인식되는 단백질은 라우릴-시스테인(LC) 잔기에서 그것의 N-말단을 통해 및/또는 시스테인(C) 잔기에서 그것의 C-말단을 통해, 또는 면역화를 위한 애주번트/들에서 펩티드의 결합에 적당한 다른 잔기/들에서 커플링될 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에서 설명되는 바와 같은 적어도 하나의 항체를 활성 성분으로서 포함하는 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 조성물의 활성 약제로서 포함된 상기 항체는 KTPAF50, 또는 그것의 임의의 단편, 유사체 또는 유도체를 인식하고 결합하는 항체 또는 그것의 단편이다.
상기 조성물은 다른 하이드리도마로부터 단클론성 항체의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 표 2에서 설명되는 하이브리도마에 따르는 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 하이브리도마 셀라인으로부터 항체들을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 상기 조성물은 진단 방법에서 사용을 위한 것이다.
상기 항체 또는 그것을 포함하는 상기 조성물은 암 및 자가면역 질환의 진단에 유용하다.
특히, 상기 항체 또는 그것을 포함하는 상기 조성물은 폐암 또는 IBD의 진단에 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에서 설명되는 항체 중 적어도 하나를 포함하는 상기 조성물은 암의 치료에 사용될 수 있다.
추가 구체예에서, 본 발명에 설명되는 항체 중 적어도 하나를 포함하는 조성물은 암의 예후에 사용될 수 있다. 특히 예후에 대한 필요는 치료 효능을 위한 지표를 가지는 것이 필수적인 암 치료를 받는 환자에서 존재한다. 따라서, 본 발명에 설명되는 적어도 하나의 항체를 포함하는 조성물은 KTPAF50의 수준의 검출 또는 결정을 통해 치료의 결과를 결정할 수 있어야 한다.
조성물의 제조는 당업계에 잘 알려져 있고, 다수의 논문 및 교재에서 설명되었다, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R. ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990, 및 특히 그중에서도 pp. 1521-1712 참조.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용가능한 애쥬번트, 담체, 희석제 또는 부형제 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분과 반응하지 않는 비활성, 비-독성 물질 중 임의의 하나를 의미한다. 담체는 때로는 요망되는 조제물의 형태를 기반으로 선택된다. 담체는 또한 약물의 안정성을 개선시키기 위해, 클리어런스율을 늦추기 위해, 서방성을 부여하기 위해, 원치않는 부작용을 감소시키기 위해 표적 조직에 활성 성분의 전달 또는 침투를 개선시키는 효과를 가질 수 있다. 담체는 또한 식용 향료 등과 함께 조제물을 제공하기 위해 조제물(예를 들어, 제제)를 안정화시키는 물질일 수 있다. 담체는 또한 통상적으로 사용되는 임의의 담체이고, 물리화학적 고려사항, 예컨대 용해도 및 본 발명의 항체와 반응성의 결여, 및 투여 경로에 의해서만 제한된다. 담체는 첨가제, 착색제, 희석제, 완충제, 붕해제, 습윤제, 보존제, 착향료, 및 약물학적으로 양립가능한 담체를 포함할 수 있다. 게다가, 담체는 예측가능한 방법으로 활성 성분의 작용에 영향을 미치는 물질이라는 정의에 의하는 애쥬번트일 수 있다. 담체의 전형적인 예는 (a) 활성 물질의 유효한 양이 물, 식염수, 천연 주스, 알코올, 시럽 등과 같은 희석제에 용해된 액체 용액; (b)캡슐(예를 들어 계면활성제, 및 비활성 충전제를 함유하는 보통의 경질- 또는 연질-껍질의 젤라틴형), 정제, 로젠지(활성 물질은 수크로오스 및 아카시아 또는 트래거캔스와 같이 향이 있고, 활성 물질은 젤라틴 및 글리세린과 같이 비활성 베이스이다), 및 트로키, 각각은 고체 또는 과립으로서 미리 결정된 양의 활성 약제를 함유; (c) 분말; (d)적절한 액체 중의 현탁액; (e) 적당한 에멀젼; (f) 리포좀 조제물; 및 기타를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 또한 선택적으로, 제한되는 것은 아니지만, 항생제, 사이토카인, 림포카인, 성장인자, 호르몬과 같은 추가적인 활성약제를 더 포함할 수 있다.
또한 본 발명에서 본 발명에 따르는 항체를 만드는 항체-생성 셀라인이 제공된다. 따라서, 본 발명은 KTPAF50에 대해 단클론성 항체를 만드는 하이브리도마 셀라인을 제공한다.
한 구체예에서, 항체-생성 세포는 본 발명의 목적인 항체-생성 셀라인을 만들기 위해 클론으로 분리되고 불멸된다. 세포 불멸은 당업자에게 알려진 방법에 따라서 달성될 수 있고, 예를 들어 Lanzavecchia et al., 2007에 의해 설명된다 [Lanzavecchia A, Corti D, Sallusto F. (2007) Human monoclonal antibodies by immortalization of B cells. Curr Opin Biotechnology; 18(6):523-8].
하기 실시예 2 및 표 2 및 3은 본 발명에 의해 만들어진 모든 하이브리도마, 특히 그것의 생성을 위해 사용된 항원 및 ELISA에 의해 측정된 항원에 대한 그것의 친화도를 나타낸다.
따라서, 본 발명은 또한 항체-생성 셀라인 또는 하이브리도마 셀라인을 제공한다.
특히, 본 발명은 다음의 하이브리도마 셀라인을 제공한다: 3E3G7, 5E11H3, 2B6A3, 2B6A12, 2B6G2, 2B6H1, 5E11B5, 5E11B8, 5E11H5, 3E1F9, 3E1F11, 3E1G4, 3E1G6, 2A8B8, 2A8B12, 2A8H7, 6E2B6, 6E2C5, 6E2C9, 6E2D4, 7D4D6, 7D4E12, 7D4F9, 7D4H10, 6F5A1, 6F5C9, 6F5C12, 3E3B3, 및 3E3C8.
2개의 하이브리도마 셀라인(3E3G7 및 5E11H3)을 다음과 같이 부타페스트 조약의 규정에 따르는 기탁 기구인 Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur (25, Rue du Docteur Roux, F-75724, Paris, Cedex 15, France)에 기탁하였다.
Figure pct00002
기탁물은 외국 특허법에 의해 국가 내에서 필요하다면 이용가능하며, 대상 적용의 대응물, 또는 그것의 후손이 출원된다. 그러나, 기탁물의 이용가능성은 정부 조치에 의해 부여되는 환자 권리의 저촉시 대상 발명을 실행하기 위한 라이센스를 구성하지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
추가로, 대상 하이브리도마 기탁물은 미생물의 기탁을 위한 부다페스트 조약의 규정에 따라서 저장되고 공중에게 이용가능하며, 즉, 그것들은 기탁물의 샘플을 공급을 위한 최근의 요청 후 적어도 5년의 기간 동안, 및 어떤 경우에, 기탁일 후 적어도 30년 동안 또는 배양물을 드러내는 공표를 할 수 있는 임의의 환자의 강제할 수 있는 삶 동안 그것들을 생존시키고 오염되지 않도록 유지할 모든 관리 필요성과 함께 저장된다. 기탁자들은 기탁소가 기탁물(들)을 대체하는 의무를 인정한다. 기탁자는 기탁물(들)을 대신하는 의무가 기탁소가 기탁물의 조건에 기인하여 필요하다면, 샘플을 제공할 수 없다는 것임을 인정한다. 대상 배양 기탁물의 공중에서 이용가능성에서 모든 제한은 그것들을 드러내는 환자에 부여시 변경할 수 없게 제거될 것이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 셀 라인에 의해 만들어진 항체를 제공한다.
다른 추가 양태에서, 본 발명은 진단 조성물의 제조에서 KTPAF50을 인식하는 본 발명에서 설명되는 항체의 사용을 제공한다. 특히, 상기 조성물은 암 및 자가면역 질환 중 임의의 하나의 진단을 위한 것이다.
따라서, 본 발명은 암의 진단을 위한 진단 조성물의 제조에서 항-KTPAF50 항체의 사용을 제공한다.
본원에서 암을 언급할 때, 제한되는 것은 아니지만, 골수성 백혈병, 예컨대 만성 골수성 백혈병, 성숙한 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 증가된 호염기성을 갖는 급성 비-림프구 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 호산구증가증이 있는 급성 단구성 백혈병, 악성 림프종, 예컨대 버킨 비-호지킨, 림프성 백혈병, 예컨대 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 골수증식성질환, 고형종양, 예컨대 양성 수막종, 침샘의 혼합종양, 입술 및 구강의 종양, 인두, 후두, 부비강, 대장선종, 선암, 예컨대 소세포폐암, 신장, 자궁, 전립선, 방광, 난소, 대장, 육종, 지방육종, 점액성, 활막육종, 횡문근육종 (치경음), 골격외 연골육종, 유잉 종양, 고환 및 난소 미분화세포종을 포함하는 기타, 망막모세포종, 윌름 종양, 신경모세포종, 악성 흑색종, 중피종, 유방, 피부, 전립선 및 난소 암, 눈꺼풀의 암종, 결막의 암종, 결막의 악성 흑색종, 포도막의 악성 흑색종, 망막모세포종, 눈물샘의 암종, 안와세포육종, 뇌, 척수, 혈관계, 혈관육종 및 카포시 육종을 포함한다.
실시예 1 및 도 2에 따라서 본원에서 증명되는 바와 같이, KTPAF50 혈청 수준은 폐 암에서 상승되었고, 따라서, 항-KTPAF50 항체는 폐암의 진단에서 가치가 있음을 나타내었다.
본 발명의 항체, 또는 그것을 포함하는 조성물은 또한 유방 및 난소암의 진단에서 사용을 위한 것이다.
게다가, 본 발명은 자가면역질환의 진단을 위한 진단 조성물의 제조에서 항-KTPAF50 항체의 사용을 제공한다.
본원에서 언급되는 바와 같은, 자가면역 질병은 염증성장질환(IBD), 크론병, 다발성경화증, 자가면역 포도막염, 자가면역 포도막망막염, 자가면역 갑상선염, 하시모토병, 췌도염, 쇼그렌 증후군, 자연유산, 실험적 자가면역 심근염, 류마티스 관절염 (RA), 루프스 (SLE), 건선 및 당뇨병, 특히 제I형을 포함한다. 자가면역 질환의 추가적인 예는 급성 괴사성 출혈성 백질뇌염, 에디슨병, 무감마글로블린혈증, 알레르기 천식, 알레르기 비염, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 사구체 신염, 항인지질항체 증후군 (APS), 자가면역 재생불량성 빈혈, 자가면역 자율신경실조증, 자가면역 간염, 자가면역 고지혈증, 자가면역 면역결핍, 자가면역 내이질환 (AIED), 자가면역 심근염, 자가면역 혈소판감소성자반병(ATP), 엑손 및 뉴런 신경장애, 발스 질환(Bal's disease), 베체트 병, 수포성류천포창, 심근증, 캐슬만병, 복강스프루(비열대성), 샤가스병, 만성피로증후군, 만성염증성탈수초화다발성신경병증(CIDP), 척-스트라우스 증후군, 반흔성유천포창/양성 점막 유사천포창, 코간증후군, 한랭응집소병, 선천 심차단, 콕사키 심근염, CREST병, 필수 혼합된 한냉글로불린 혈증, 말이집탈락성 신경병증, 피부근염, 데빅병, 원반모양 루프스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산구 근막염, 결절성 홍반, 실험적 알러지성 뇌수막염, 에반 증후군, 섬유근육통, 섬유화 폐포염, 거대 세포동맥염(측두 동맥염), 구드파스튜어증후군, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 용혈성 빈혈, 헤느흐 쉰라인 자반증, 임신포진, 저감마글로불린혈증, 특발성 혈소판감소성자반증(ITP), IgA 신병증, 면역조절 리포단백질, 포함체 근육염, 인슐린-의존성 당뇨병 (제1형), 간질성 방광염, 소아기 관절염, 소아기 당뇨병, 가와사키 증후군, 램버트-이튼 증후군, 백혈구파쇄성맥관염, 편평태선, 경화성태선, 목질결막염, 선상 IgA 질병(LAD), 라임병, 메니에르병, 현미경다발혈관염, 혼합 결합 조직병(MCTD), 무렌각막궤양, 무카-하베르만병, 중증근무력증, 근육염, 기면증, 백혈구 감소증, 안반흔성유천포창, 골관절염, 재발성 류마티즘, 소뇌변성, 발작성 야간혈색소뇨증(PNH), 파르소나지-터너 증후군(Parsonnage-Turner syndrome), 평면부염 (말초 포도막염), 천포창, 말초신경증, 정맥 주위성 뇌척수염, 악성빈혈, POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, 제 I, II, 및 III 자가면역 다선증후군, 류마티스성 다발성근육통, 다발성 근염, 심근 경색후 증후군, 심막절개술후 증후군, 프로게스테론피부염, 원발성 담즙성 간경변증, 건선성 관절염, 특발성 폐섬유화증, 괴저성 농피증, 적아구로, 레이노증후군, 복합부위 통증 증후군, 라이터 증후군, 재발성 다발 연골염, 하지불안증후군, 류마티스성 열, 유육종증, 슈미트 증후군, 공막염, 강피증, 정자 및 고환 자가면역, 전신근강직증후군, 아급성 세균성 심내막염(SBE), 교감성 안염, 타카야스 동맥염, 측두동맥염/거세포 동맥염, 혈소판 감소성 자반증(TTP), 자가면역 갑상성 질환, 톨로자 헌터 증후군, 횡단성 척수염 및 괴사성 척수병증, 궤양성 대장염, 미분화 결합조직 질환(UCTD), 혈관염, 수포성 피부염, 백반증 및 베게너육아종증을 포함한다.
추가 양태에서, 본 발명은 암, 자가면역질환, 이식편 거부반응, 신경퇴행성질환 및 당뇨병의 치료를 위한 치료 조성물의 제조에서 KTPAF50에 특이적인 본 발명에서 설명되는 항체의 사용을 제공한다.
특히 상기 조성물은 암의 치료를 위한 것이다.
실시예 3에서 나타내는 바와 같이, 세포 생육성의 감소를 야기한 KTPAF50-특이적 항체에 의한 처리는, 이 항체들이 세포 사멸을 유발하거나, 또는 아포토시스를 유발하기 위해 사용될 수 있다는 것을 제안한다. 암 세포에서 세포 사멸의 유발은 그것의 제거를 위한 효과적인 수단일 수 있다.
따라서, 본 발명은 암의 치료를 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 적어도 하나의 항체, 또는 그것의 조합의 치료적으로 유효한 양을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다.
추가로, 본 발명에서 제공되는 항체, 또는 그것의 단편은 샘플 중에서 본 발명의 항체들의 생성을 위한 항원으로서 사용되는 단백질을 양적 또는 질적으로 검출하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 형광(면역형광염색법), 효소 반응의 크로모제닉 생성물, 침전의 생성물, 화학발광 또는 생물발광 중 임의의 하나 일 수 있는 시각적으로 검출가능한 신호를 제공하는 기술에 의해 수행될 수 있다. 형광성 또는 색-표지된 항체를 사용하는 것은 광학 현미경, 유동 세포 분석법, 또는 하기 설명하는 바와 같은 화학 형광계 검출과 결합될 수 있다. 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있는 다른 기법 및 표지는, 제한되는 것은 아니지만, 콜로이드성 금, 방사능 태그, GFP (녹색 형광 단백질) 등, 아비딘/스트렙타비딘-비오틴, 자기 비드 뿐만 아니라 물리적 시스템, 예를 들어 실제 결합에 민감한 나노기술 시스템을 포함한다.
본 발명에서 제공되는 항체 또는 그것의 단편은 면역조직화학법, 면역형광염색법 또는 면역전자현미경법에서 뿐만 아니라 단백질의 인시츄 검출에 대해서와 같이 조직 염색에서 사용될 수 있다. 인시츄 검출은 피험자로부터 조직 표본을 제거하고, 이러한 표본과 본 발명의 표지된 항체를 접촉함으로써 수행될 수 있다. 항체(또는 단편)은 생물학적 샘플(상기 표본)에 표지된 항체(또는 단편)을 적용 또는 더함으로써 접촉된다. 이러한 과정의 사용을 통해, 항원의 존재뿐 아니라 시험 조직에서 그것의 분포를 결정하는 것이 가능하다. 본 발명을 사용하여, 당업자는 임의의 매우 다양한 조직학적 방법, 예컨대 염색 과정이 이러한 인시츄 검출을 달성하기 위해서 변형될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다.
본 발명에 따르는 항체를 표지 및 직접 검출하는 방법 중 하나는 효소에 동일한 것을 연결하고, 효소 면역분석(EIA)에서 사용하는 것이다. 이 효소는 적절한 기질에 노출된 후, 차례로 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 만드는 방법으로, 예를 들어, 분광측색방법, 형광분석에 의해 또는 시각적 수단에 의해 기질과 반응할 것이다. 항체를 검출가능하게 표지하기 위해 사용될 수 있는 효소는, 제한되는 것은 아니지만, 말레이트 탈수소효소, 포도상구균 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라아제, 효모 알코올 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 겨자무과산화효소, 알칼리성 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코오스 옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린-에스터라아제를 포함한다. 검출은 효소에 대한 크로모제닉 기질을 사용하는 비색법에 의해 수행될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준과 기질의 효소적 반응의 정도의 시각적 비교에 의해 수행될 수 있다(이 과정은 예를 들어 니트로셀룰로오스 또는 플라스틱 지지체 상에서 가용성 색이 있는 생성물 및 비-가용성의 색이 있는 생성물에 대해 적당하다).
본 발명에서, 항원과 항체의 반응을 검출하는 것은 적절한 예에서, 리간드와 반응하는 제2 항체 또는 다른 리간드 또는 다른 에피토프와 특이적으로, 또는 비특이적으로 반응된 항체의 사용에 의해 추가로 도움이 될 수 있다.
면역형광 분석(IFA), 광도계 분석, 효소결합 면역흡착 분석법 (ELISA), ELISPOT 분석, 및 면역 블로팅과 같은 효소 면역분석이 특이적 항체의 검출을 수행하기 위해 용이하게 적용될 수 있다.
또한 사용될 수 있는 다른 검출 시스템은 스타필로코커스 아우레우스 코완 균주 I(Staphylococcus aureus Cowan strain I)로부터 유래된 단백질 A, 그룹 C Streptococcus sp. (균주 26RP66)로부터의 단백질 G, 또는 비오틴-아비딘 결합 반d응의 사용을 채용하는 시스템의 사용에 기반한 것을 포함한다.
본 발명의 항체가 사용될 수 있는 면역효소 검출의 다른 방법은 웨스턴 블롯, 및 도트 블롯이다. 샘플은 전기영동에 의해 분리되고 니트로셀룰로오스 막 또는 다른 적당한 지지체에 전달된다. 시험되는 샘플(예를 들어, 배양물 상청액)은 이어서 막과 접촉되고, 형성된 면역 복합체의 존재는 이미 설명한 방법에 의해 검출된다. 이 방법상의 변화에서, 정제된 항체는 막에서 순서대로 또는 부분으로 사용되고 결합된다. 막은 이어서 배양물이 시험되기 전과 후에 샘플과 접촉되고, 형성된 면역 복합체는 본원에서 설명한 기술을 사용하여 검출된다.
항체-항원 복합체의 존재는 또한 응집에 의해 검출될 수 있다. 본 발명에 따르는 항체는, 예를 들어 균일한 현탁액을 형성하는 라텍스 입자를 코팅하기 위해 사용될 수 있다. 샘플, 예를 들어 항체에 의해 인식되는 특이적 항원들을 함유하는 혈청과 혼합될 때, 라텍스 입자는 응집을 야기하고, 거대한 응집물은 존재는 시각적으로 검출될 수 있다.
면역분석 기법에 의한 항체의 측정에 해당하는 면역학적 및 면역분석 과정의 검토를 위해, Basic and Clinical Immunology [D. Stites et al. (eds.) (1994) Basic and Clinical Immunology , 8th ed.] 참조.
항체와 항원의 반응을 검출하는 것은 당업계에 알려진 검출가능한 모이어티로 표지된 항체 또는 리간드의 사용에 의해 용이하게 될 수 있다. 이러한 검출가능한 모이어티는 침전 또는 색 변화의 시각적 검출, 현미경에 의한 시각적 검출, 또는 분광분석 또는 복사측정 등에 의한 자동화된 검출을 허용한다. 검출가능한 모이어티의 예는 플루오레세인 및 로다민(형광 현미경 검사를 위함), 겨자무과산화효소 및 알칼리성 포스파타아제(광학 현미경 또는 전자 현미경 및 생화학적 검출 및 색 변화에 의한 생화학적 검출을 위함), 및 비오틴-스트렙타비딘(광학 또는 전자 현미경을 위함)을 포함한다. 사용된 검출 방법 및 모이어티는, 예를 들어 이러한 선택을 위해 사용된 표준 기준에 의해 상기 열거 또는 다른 적당한 예로부터 선택될 수 있다[Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY].
검출은 임의의 다양한 다른 면역분석을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 항체들 또는 항체 단편들을 방사성 표지함으로써, 방사면역측정법(RIA)의 사용을 통해 항원을 검출할 수 있다. RIA의 양호한 설명은 본원에 참고로써 포함되는 Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, by Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978) 특히 Chard, T.에 의한 제목이"An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques"인 chapter에서 찾을 수 있다. 방사성 동위원소는 감마/베타 계측기 또는 신틸레이션 계측기의 사용과 같은 수단에 의해 또는 자기방사법에 의해 검출될 수 있다.
형광 화합물로 본 발명에 따르는 항체를 표지하는 것이 또한 가능하다. 형광성으로 표지된 항체가 적절한 파장의 광에 노출되었을 때, 그것의 존재는 형광성 때문에 검출될 수 있다. 가장 흔히 사용되는 형광성 표지 화합물 중에서 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드 및 플루오레사민이 있다.
항체는 또한 152E와 같은 형광성 방출 금속, 또는 다른 란탄계열을 사용하여 검출가능하게 표지될 수 있다. 이 금속들은 디에틸렌트리아민 펜타아세트산(ETPA)과 같은 금속 킬레이트 그룹을 사용하여 항체에 부착될 수 있다.
항체는 또한 화학발광 화합물에 그것을 커플링함으로써 검출가능하게 표지될 수 있다. 화학발광-태그된 항체의 존재는 화학 반응의 과정 동안 상승하는 발광의 존재를 측정함으로써 결정된다. 특히 유용한 화학발광 표지 화합물의 예는, 루미놀, 이소루미놀, 써로매틱(theromatic) 아크리디늄 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르이다.
마찬가지로, 생발광 화합물이 본 발명의 항체를 표지하기 위해 사용될 수 있다. 생발광은 촉매 단백질이 화학발광 반응의 효능을 증가시키는 생물학적 시스템에서 발견되는 화학발광의 종류이다. 생발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 결정된다. 표지의 목적을 위한 중요한 생발광 화합물은 루시페린, 루시페라아제 및 에쿼린이다.
본 발명의 항체 분자는 또한 "2-자리" 또는 "샌드위치" 분석으로서 알려진 면역계수측정법에서 이용에 적합할 수 있다. 전형적인 면역계수측정법에서, 비표지 항체의 양(또는 항체의 단편)은 고체 지지체 또는 담체에 결합되고, 검출가능하게 표지된 가용성 항체의 양이 첨가되어서 고체상 항체, 항원, 및 표지된 항체 사이에서 형성된 3중 복합체의 검출 및/또는 정량화를 허용한다.
본 발명의 항체는 다수의 다른 암을 이미징하기 위해 사용되도록 방사선표지될 수 있다. In111 및 Tc99와 같은 방사성동위원소는 항체를 표지하고 이미징 기술에 의한 시각화를 위해 사용된다. 방사-면역신티그래피(RIS)는 종양의 생체내 이미징을 허용하는 기능적 시험이다. 이것은 방사선 표지된 항체 및 표준 감마 신틸레이션 카메라를 사용하여 수행된다.
따라서, 본 발명은 피험자에서 종양 또는 암의 존재의 검출 또는 표시를 위한 스크리닝 분석으로서 유용하다. 본원에서 설명되는 검출가능한 마커에 직접 콘쥬게이트될 때, 항체 또는 그것의 단편은 암세포의 존재를 나타내는 생체내 항원(또는 그것의 단편)의 검출에 사용될 수 있고, 진단되어야 하는 피험자에 주입 및 이미징에 의한 검출에 의해 이미징 기술의 도움으로 시각화될 수 있다.
추가로, 본 발명에 의해 제공되는 항체는 암의 치료에서 그 자체 또는 조합의 부분으로서 사용되기 위한 세포독성 약물에 콘쥬게이트될 수 있다.
따라서 상기 언급한 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 항체는 암, 또는 전암 세포를 사멸시키기 위한 독성 약물에 대한 전달 시스템으로서 적당하다.
세포독성 약물의 한 예는 항체에 직접 또는 링커를 통해 공유적으로 커플링될 수 있는 항-증식성 약물 분자이고, 상기 항체는 선택적으로 암세포에서 풍부한 또는 암세포에 의해 분비되는 프로테아제에 의해 특이적으로 분해될 수 있고, 따라서 바람직하게는 프로테아제의 작용에 의해 암세포 내, 암세포 근처 또는 암세포에서 항-증식성 약물을 방출한다.
항-증식성 약물의 예는 시클로포스파미드, 클로르암부실, 부술판, 멜파란, 티오테파, 이포스파미드, 질소 머스타드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 시토신 아라비노사이드, 6-티오구아닌, 6-머캅토퓨린, 독소루비신, 다우노루비신, 이도루비신, 닥티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 플리카마이신, 에피포도필로톡신 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈슬레스틴, 에토포사이드, 테니포사이드, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조신, 아드레노코르티코이드, 에스트로겐, 항에스트로겐, 프로게스틴, 아로마타아제 억제제, 안드로겐, 항-안드로겐, 다카르바진, 헥사메틸멜라민, 히드록시우레아, 미토탄, 프로카르바지드, 시스플라스틴, 카르보플라틴, 멜팔란, 메토트렉세이트, 및 클로르암부실이다.
대안으로, 항체는 금속이온과 같은 특이적 물질을 종양에 옮길 수 있고, 따라서 독성 물질(앞서 언급한 바와 같은 방사성활성 또는 세포독성 화학물질, 즉 리신과 같은 독소 또는 세포독성 알킬화제 또는 세포독성 프로드러그)을 종양에 전달하기 위한 수단 또는 담체로서 도움을 준다. 항체 및 독소 또는 방사성동위원소의 결합은 화학적일 수 있다. 직접 결합된 독소의 예는 독소루비신, 클로르암부실, 리신, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소 등이다. 혼성 독소는 항원 및 독소에 대해 이중으로 특이성을 갖도록 만들어질 수 있다. 이러한 2가의 분자는 종양에 결합하고 세포독성 약물을 종양에 전달하고 또는 T3-Ti 수용체 복합체에 결합과 같이 세포독성 림프구에 결합하고 활성화하는 것에 도움을 줄 수 있다.
실시예 3, 4 및 6, 및 그것 각각의 도면에서 나타내는 바와 같이, 본 발명의 항체는 세포 성장을 억제할 수 있다.
따라서, 추가 양태에서, 본 발명은 세포 성장을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나의 항-KTPAF50 항체, 또는 그것의 조합, 또는 그것을 포함하는 조성물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 시험관 내 또는 생체 외 방법일 수 있다.
또한 실시예 5에서 나타내는 바와 같이, 본 발명의 항체는 사이토카인 발현, 특히 TNF-α, IFN-γ 또는 IL-10을 억제할 수 있다.
따라서, 다른 추가 양태에서, 본 발명은 사이토카인 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나의 항-KTPAF50 항체 또는 그것의 조합, 또는 그것을 포함하는 조성물의 유효한 양을 상기 사이토카인을 발현시키는 세포와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 시험관내 또는 생체 외 방법일 수 있다.
특히, 본 발명은 전구-염증사이토카인을 억제하기 위한 방법을 제공한다.
전구-염증 사이토카인은 염증을 유발함으로써 작용한다. 이 사이토카인은 내인성 발열원(IL1, IL6, TNF-알파)으로서 작용하고, 대식세포 및 간엽세포(섬유아세포, 상피 및 내피 세포를 포함)에 의해 제2 매개자 및 전구-염증 사이토가인의 합성을 상향조절하고, 급성기 단백질의 생성을 자극하고, 또는 염증세포를 끌어들인다.
전구-염증 사이토카인은 IL-1, TNF-α(종양 괴사 인자 α), INF-γ(인터페론 γ), TNF-β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13을 포함한다. 이 사이토카인은 Th1 및 Th2 림프구의 조절에 수반된다.
특히 TNF-α의 하향 조절은 류마티스 관절염, IBD 및 건선과 같은 자가면역 질환의 치료에 중요한 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 항-KTPAF50 항체, 또는 그것을 포함하는 조성물은 이 인간 자가면역 질환을 치료하기 위한 극도로 강력한 도구이다.
본 문맥에서, 본 발명의 항체는 또한 자가면역질병, 신경퇴행성 질환 및 당뇨병뿐만 아니라 이식편거부반응을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 암, 자가면역 질환, 이식편거부반응, 신경퇴행성 질환 및 당뇨병으로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 필요한 피험자에게 KTPAF50-특이적 항체, 또는 그것을 포함하는 조성물의 치료적으로 유효한 양을 투여하는 단계를 포함한다.
상기 항체로 치료될 수 있는 특정 자가면역 질환은 IBD, 류마티스 관절염 및 건선이다.
신경퇴행성 질환은 운동계, 감각계, 또는 인지체계에서 뉴런의 선택적 및 대칭적 상실을 특징으로 하는 만성 및 진행성 질환이다. 신경퇴행성 질환의 비-제한적 열거는 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성측색경화증, 헌팅턴병, 가족성 아밀로이드 다발성 신경병증, 및 타우병증을 포함한다.
당뇨병은 유기체가 충분히 인슐린을 생성하지 않기 때문에, 또는 세포가 생성된 인슐린에 반응하지 않기 때문에 고혈당을 특징으로 한다. 이 고혈당은 다뇨증(빈뇨), 조갈증(증가된 갈증) 및 대식증(증가된 배고픔)의 전형적인 증상을 만든다. 당뇨병의 3가지 주된 형태는 인슐린을 만드는 신체의 이상으로부터 초래되고, 인슐린 투여시 치료가능한 제1형 당뇨병; 인슐린 내성으로부터 초래되는 제2형 당뇨병; 및 임신전에는 당뇨병에 결코 걸린 적이 없지만, 임신동안 높은 혈액 글로코오스 수준을 가지는 임산부의 임신성 당뇨병이 있다. 당뇨병의 다른 형태는 인슐린 분비의 유전적 결함에 기인하는 선천적 당뇨병, 낭포성 섬유증-관련 당뇨병, 글로코코르티코이드의 고용량에 의해 유발된 스테로이드 당뇨병, 및 몇몇 형태의 일유전자성 당뇨병을 포함한다.
본 발명은 또한 이미 진단된 암의 예후를 평가하는데 사용될 수 있는 방법을 제공한다. 특히, 처리 전-, 처리 동안 및 처리 후를 알아보는 것은 중요하다. 대안으로, 상기 방법은 또한 특히 시험되는 샘플이 환자로부터 얻은 샘플 중 가장 "환자-우호적" 형태인 혈액 샘플 일 때 암 스크리닝을 위해 적절하다.
따라서, 다른 추가 양태에서, 본 발명은 피험자에서 암의 진단 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
a. 상기 피험자로부터 샘플을 제공받는 단계;
b. 상기 샘플을 항-KTPAF50 항체인 본 발명에 따르는 적어도 하나의 항체, 또는 그것을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계;
c. 상기 적어도 하나의 항체와 그것의 특이적 항원 사이의 복합체 형성을 검출 수단을 통해 검출하는 단계;
이에 의해, 복합체의 검출은 상기 피험자가 암에 걸렸다는 것을 나타낸다.
본원에서 피험자에 대해 언급할 때, 상기 피험자는 포유동물, 인간 또는 비-인간일 수 있다. 비-인간 포유동물은, 제한되는 것은 아니지만, 소, 말, 개, 고양이, 마우스, 래트, 기니아-피그 등을 포함한다. 보통 피험자는 인간, 특히 환자, 또는 건강한 개인이다.
본 발명의 진단 방법의 한 구체예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플이다.
항-KTPAF50 항체, 또는 그것을 포함하는 조성물을 이용하는 본 발명의 상기 진단 방법의 추가 구체예에서, 상기 암은 폐, 유방 및 난소암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
따라서, 본 발명은 또한 암 치료의 효능을 모니터링하는 방법을 제공한다. 치료의 효능을 모니터링하는 것은 암 치료의 예후를 평가하기 위해 필수적이다. 따라서, 본원에서 존재하는 진단 방법은 암 치료 전, 치료 동안 또는 치료 후 피험자에게서 달성될 수 있고, 각 시점에 얻은 결과의 분석(적어도 2개의 항원-항체 복합체 사이의 관계의 패턴)은 정상 모집단의 동일한 복합체의 패턴과 비교된다. 정상 모집단의 패턴에 대해 피험자의 가장 밀접한 패턴은 성공적인 치료를 표시한다.
본원에서 언급하는 바와 같은 암치료는 방사선치료, 화학치료 등을 포함하는 질병을 근절하기 위한 임의의 치료에 관한 것이다.
본 발명의 항체는 또한 인간 및 뮤린 면역계에서 면역 반응을 유발하는 화합물의 고속대량스크리닝뿐만 아니라 소화기계, 및 다른 계에 대해서도 염증 및 암을 유발하는 화합물의 스크리닝을 위한 다중 면역측정법으로 사용될 수 있으며, 본 발명의 항체는 서로 조합하여 또는 다른 항체와 조합하여 사용될 수 있다. 다중 면역측정법은 당업자에게 알려져 있고, 특히 Anderson and Davison [Anderson and Davison (1999) Am. J. Pathol. 154:1017-1022]에 의해 설명된다.
본 발명을 설명하기 위해 본원에서 사용되는 "종양", "암", "악성 증식성 장애" 및 "악성"은 모두 동일하게 조직 또는 기관의 과다형성에 관한 것이다. 조직이 림프계 또는 면역계의 부분이라면, 악성 세포는 순환 세포의 비-고형 종양을 포함할 수 있다. 다른 조직 또는 기관의 악성종양은 고형종양을 만들 수 있다. 일반적으로, 비-고형 및 고형 종양은, 예를 들어, 암종, 흑색종, 백혈병 및 림프종이다.
암 및 종양은, 제한되는 것은 아니지만, 만성 골수성 백혈병, 성숙한 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 증가된 호염기성을 갖는 급성 비-림프구 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 호산구증가증이 있는 급성 단구성 백혈병, 악성 림프종, 예컨대 버킨 비-호지킨, 림프성 백혈병, 예컨대 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 골수증식성질환, 고형종양, 예컨대 양성 수막종, 침샘의 혼합종양, 입술 및 구강의 종양, 인두, 후두, 부비강, 대장선종, 선암, 예컨대 소세포폐암, 신장, 자궁, 전립선, 방광, 난소, 대장, 육종, 지방육종, 점액성, 활막육종, 횡문근육종 (치경음), 골격외 연골육종, 유잉 종양, 고환 및 난소 미분화세포종을 포함하는 기타, 망막모세포종, 윌름 종양, 신경모세포종, 악성 흑색종, 중피종, 유방, 피부, 전립선 및 난소 암, 눈꺼풀의 암종, 결막의 암종, 결막의 악성 흑색종, 포도막의 악성 흑색종, 망막모세포종, 눈물샘의 암종, 안와세포육종, 뇌, 척수, 혈관계, 혈관육종 및 카포시 육종을 포함한다.
암의 검출, 진단, 예후의 평가, 스크리닝 및 치료를 위해 본원에서 사용되는 방법은 임의의 단계의 암에 대해 적당하다.
다른 구체예에서, 본 발명은 임의의 단계의 암에서 수행되고, 특히 암의 진단을 위해 다른 현재 사용되는 기법과 비교할 때 가장 유리하다. 예를 들어 기술적으로 환자에게 큰 불편함을 야기하고, 상대적으로 높은 정도의 긍정오류 결과(수많은 환자에서 필요없는 걱정을 수반한 추가적인 생검을 제출하도록 전환한다)를 가지는 맘모그래피와 비교할 때, 본 발명에서 설명한 진단 방법은 혈액 시험을 기초로 하며, 잠재적으로 긍정오류 결과의 훨씬 더 적은 발생정도를 가진다. 모든 현재 거대-수준 진단 도구 - 맘모그램, 직장수지검사(DRE) 및 초음파(각각 유방, 전립선 및 난소암에 대해)는 의심스러운 종양 덩어리가 이미 시각적으로 검출가능한 크기로 발생된 후에만 암을 진단할 수 있었고, 환자의 더 낮은 생존률 및 감소된 삶의 질을 초래하였다. 예를 들어 미국에서만 유방암에 대해, 약 3천만건의 맘모그래피 처리가 매년 수행되고 백만건 이상의 외과적 유방 생검이 의심스러운 유방 병변이 있는 여성에 대해 수행된다.
이에 대해, 암의 병기(staging) 체계와 유사하게 되는 것이 중요하다. 병기는 암이 발생하는 방법의 지식을 기반으로 한다. 암 세포는 조절 없이 나누어지고 성장하여 종양 형성을 명령한다. 종양이 성장함에 따라, 그것은 근처의 기관 및 조직을 침범할 수 있다. 암 세포는 또한 종양으로부터 부서져서 혈류 또는 림프계에 들어갈 수 있다. 혈류 또는 림프계를 통해 이동함으로써, 암은 1차적 자리로부터 퍼져서 다른 기관에서 새로운 종양을 형성할 수 있고, 이것은 전이로 명명된다.
대부분의 암의 종류는 TNM (종양 크기, 노드 침습, 전이) 지정을 가지지만, 일부는 그렇지 않다. 예를 들어, 뇌 및 척수의 암은 그것의 세포 종류 및 등급에 따라서 분류된다. 또한 다른 병기 체계가 림프종과 같은 혈액 또는 골수의 다수의 암에 대해 사용될 수 있다. 앤 아버(Ann Arbor) 병기 분류가 림프종의 병기를 결정하기 위해 통상적으로 사용되고 AJCC (American Joint Committee on Cancer) 및 UICC (International Union Against Cancer)에 의해 채택되었다. 그러나 백혈병의 대부분의 종류를 포함하는 혈액 또는 골수의 다른 암은 명백한 병기 체계를 가지지 않는다. 국제산부인과학회(International Federation of Gynecology and Obstetrics)에 의해 개발된 다른 병기 체계는 자궁경부, 자궁, 난소, 질 및 외음부 암의 병기를 결정하기 위해 사용된다. 이 체계를 TNM 포맷을 사용한다. 추가적으로 소아암은 TNM 체계 또는 소아과의 임상 시도를 수행하는 그룹인 아동암협회(Children's Oncology Group)의 병기 기준을 사용하여 병기결정된다.
TNM 병기체계는 다음과 같다: T는 종양의 크기 및 그것의 조직 근처에 침범하였는지 여부를 설명하고, N은 수반된 임의의 림프절을 설명하고, M은 전의의 존재를 설명한다.
1차 종양(T)
TX 1차 종양은 평가될 수 없다
T0 1차 종양의 증가가 없다
Tis 원 위치(in situ)에서 암종(이웃하는 조직에 퍼지지 않은 초기 암)
T1,T2,T3,T4 크기 및/또는 1차 종양의 정도
지역적 림프절(N)
NX 지역적 림프절을 평가할 수 없다
N0 지역적 림프절 수반이 없음(림프절에서 발견된 암이 없음)
N1,N2,N3 지역적 림프절의 수반(퍼진 수 및/또는 정도)
전이 (M)
MX 전이를 평가할 수 없다
M0 전이 없음(암이 신체의 다른 부분으로 퍼지지 않았다)
M1 전이(암이 신체의 다른 부분으로 퍼졌다)
TNM 체계에 따르는 예는: 림프절 근처의 유방 바깥쪽으로 퍼졌지만, 신체의 다른 부분으로는 퍼지지 않은 큰 종양에 대해 유방암 T3 N2 M0이다. 전립선 암 T2 N0 M0는 종양이 전립선에만 위치하고, 림프절 또는 신체의 다른 부분에 퍼지지 않은 것을 의미한다.
NCI의 감시, 역학 및 최종결과 프로그램(SEER)와 같은 다수의 암 등록소는 약식의 병기를 사용한다. 이 체계는 모든 종류의 암에 대해 사용된다. 그것은 암의 경우들을 5가지의 주요 카테고리로 그룹화한다:
- 원 위치(in situ)는 암이 시작하는 세포층에서만 존재하는 초기 암이다;
- 국소는 퍼진 증거 없이 암이 시작하는 기관에 제한된 암이다;
- 국부는 림프절 또는 기관 및 조직 근처에서 원래(1차) 자리를 지나서 퍼진 암이다;
- 원위는 1차 자리로부터 먼 기관 또는 먼 림프절로 퍼진 암이다;
- 미확인은 병기를 나타내는 정보가 충분하지 않은 경우를 설명하기 위해 사용된다.
다른 통상적으로 사용된 병기 시스템은 로마숫자를 사용한다:
0기: 원위치 암종(암이 시작하는 세포층에서만 존재하는 초기 암).
I, II 및 III기: 더 높은 숫자는 더 광범위한 질병, 더 큰 종양 크기 및/또는 1차 종양에 인접한 림프절 및/또는 기관 근처의 암의 퍼짐을 나타낸다.
IV기: 암이 다른 기관에 퍼졌다.
따라서, 본 발명에 의해 제공되는, 예를 들어 본원에서 설명하는 표지된 항체를 사용하는 암의 진단 및 검출 방법은 또한 종양의 병기 결정에 매우 유용하다[종양은 그것이 성장함에 따라 변화한다]. 예를 들어, 그것이 특히 암의 초기 단계에서 다른 현재 이용가능한 기술에 의해 검출될 수 없다면, 성장을 검출 및/또는 국소화할 수 있다.
따라서, 다른 추가 양태에서, 본 발명은 피험자의 자가-면역 질병의 잔단 방법을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
a. 상기 피험자로부터 샘플을 제공받는 단계;
b. 상기 샘플을 항-KTPAF50 항체인 본 발명에 따르는 적어도 하나의 항체, 또는 그것을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계;
c. 상기 적어도 하나의 항체와 그것의 특이적 항원 사이의 복합체 형성을 검출 수단을 통해 검출하는 단계;
이에 의해, 복합체의 검출은 상기 피험자가 자가면역질환에 걸렸다는 것을 나타낸다.
상기-설명한 방법은 또한 자가면역질환의 예후, 이에 따른 복합체의 검출을 위해 적용될 수 있고, 치료 동안 다른 시점(치료전, 치료 동안, 치료후)에서 그것의 수준을 비교하는 것은 자가면역질환을 겪고 있는 또는 잠재적으로 겪는 피험자에서 이것에 의한 효능의 평가 및 결과의 평가를 제공한다.
본 발명의 상기 진단 방법의 구체예에서, 상기 샘플은 혈액 샘플이다.
본원에서 정의되는 "샘플"은 피험자, 일반적으로 포유동물 피험자로부터 얻은 임의의 샘플을 말한다. 생물학적 샘플의 예는 체액 및 조직 표본을 포함한다. 샘플의 공급원은 혈액, 혈청, 혈장, 모유, 고름, 뇌척수액, 면봉표본, 조직 찰과표본, 세척물, 소변, 대변, 체강의 세척으로부터 얻은 헹굼액, 가래, 신체 영역으로부터 얻은 표본(목, 질, 귀, 눈, 피부, 림프절과 같은 염증 조직 등)으로서 생리적 매개물로부터 유래될 수 있다. 조직 표본은 비장, 림프절 및 임의의 림프구-함유 조직의 생검을 포함한다.
본 명세서 및 특허청구범위의 용어 "샘플"은 그것의 가장 광범위한 의미로 본원에서 사용된다.
통상 선험적으로 액체가 아닌 표본 및 샘플은 액체 배지와 접촉되고 이어서 검출 약제와 접촉된다.
본 발명의 한 특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 상기 샘플은 체액 또는 배양물-유래 샘플 중 임의의 하나이다.
배양물-유래 샘플은 세포 추출물, 배지 샘플, 또는 체액으로부터의 배양물, 예를 들어 혈액의 배양물 일 수 있다.
"전혈"은 동물 또는 인간으로부터 수집된 혈액을 의미한다. 전혈은 헤파린, EDTA, 시트레이트 또는 응고 및 응혈을 방지하는 임의의 다른 물질과 함께 수집될 수 있다.
생물학적 샘플은 니트로셀룰로오스와 같은 고체상 지지체 또는 담체, 또는 세포, 세포 입자 또는 가용성 단백질을 고정할 수 있는 다른 고체 지지체 또는 담체로 처리될 수 있다. 지지체 또는 담체는 이어서 적당한 완충제로 세척된 다음, 상기 주목한 바와 같이 본 발명에 따르는 검출가능하게 표지된 항체로 처리될 수 있다. 고체상 지지체 또는 담체는 이어서 완충제로 2회 세척되어 결합되지 않은 항체가 제거될 수 있다. 그 다음에 상기 지지체 또는 담체 상에서 결합된 항원 또는 표지의 양은 통상적인 수단에 의해 검출될 수 있다.
"고체상 지지체", "고체상 담체", "고체 지지체", "고체 담체", "지지체" 또는 "담체"는 항원 또는 항체들과 결합할 수 있는 임의의 지지체 또는 담체도 의도된다. 잘-알려진 지지체 또는 담체들은 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론 아밀라아제, 천연 및 변형 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 및 마그네타이트를 포함한다. 담체의 특성은 본 발명의 목적을 위해 일정한 정도로 가용성 또는 불용성일 수 있다. 지지체 재료는 커플링된 분자가 항원 또는 항체와 결합할 수 있도록 하기 위해 사실상 어떤 가능한 구조적 배치를 가질 수 있다. 따라서 지지체 또는 담체 배치는 비드와 같은 구형, 테스트 튜브의 내면, 또는 막대의 외면과 같은 원통형일 수 있다. 다른 담체들은 동일한 튜브 내에서 다른 항원들에 대해 사용될 수 있다. 대안으로, 표면은 시트, 테스트 스트립 등과 같이 편평할 수 있다. 특정 지지체 또는 담체들은 폴리스티렌 비드를 포함한다. 당업자는 항체 또는 항원과 결합을 위한 다수의 다른 적당한 담체들을 알 것이고, 또는 통상적인 실험의 사용에 의해 그것을 확인할 수 있을 것이다.
분석에 추가될 수 있는 세척, 교반, 진탕, 여과 등과 같은 다른 단계들은 특정 상황에 대해 관습적 또는 필수적이다.
본원에서 정의되는 "배양물 배지"는 본 발명을 실행하기 위한 샘플을 지속시키는 데 사용될 수 있는 임의의 배지를 의미하며, 제한되는 것은 아니지만 바람직하게는 적절한 항생물질 및 글루타민, 및 선택적으로 항-진균제, 비-필수 아미노산, DTT, 피루브산나트륨 등과 같은 다른 첨가제로 보충된 송아지(소) 태아 혈청이 있는 RPMI 1640 또는 송아지(소) 태아 혈청이 없는 RPMI 1640를 포함한다. 본 발명을 실행하는데 사용될 수 있는 다른 배양물 배지는, 제한되는 것은 아니지만, Eagles, Dulbecco's, McCoy's, Media 199, Waymout's 배지, 및 보충물이 있는 무혈청 배지 또는 보충물이 없는 무혈청 배지를 포함한다. 다른 구체예에서, 자극제는 배지가 없다.
본 발명은 또한 본 발명의 항체의 치료적으로 유효한 투약을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다. 특히, 상기 항체는, 치료를 위해 사용될 때 세포독성 약물에 콘쥬게이트되고, 또는 표적 세포에 독성 물질의 전달을 위한 담체로서 작용한다. 본 문맥에서, 표적 세포는 본 발명의 항체에 의해 인식되는 세포이며, 이는 종양-결합된 항원을 발현시키고, 따라서 비정상적 성장과 관련되는 세포를 의미한다.
다른 추가 양태에서, 본 발명은 진단, 치료 효능의 모니터링 또는 암의 예후의 평가 중 임의의 하나를 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 다음의 구성요소들을 포함한다:
a. 본 발명의 본원에서 설명하는 적어도 하나의 항체 또는 그것을 포함하는 조성물; 및
b. 샘플 내 항원의 존재하에서 검출을 수행하기 위한 설명서, 상기 항원은 본 발명의 상기 항체에 의해 특이적으로 인식된다.
상기 키트는 하기 구성요소 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다:
a. 시험되어야 하는 샘플을 수집하기 위한 적어도 하나의 수단;
b. 상기 항체에 의해 상기 항원의 상기 인식의 검출에 필요한 적어도 하나의 시약; 및
c. 적어도 하나의 대조군 샘플.
본 발명은 또한 암의 진단 및/또는 예후의 평가를 위한 키트를 제공한다.
키트는 피험자에서 항체에 특이적인 종양 항원의 검출에 필수적이다. 피험자는 포유동물, 인간 또는 비-인간일 수 있다. 보통 피험자는 인간 환자, 암 환자, 또는 건강한 개인이다.
추가 양태에서 본 발명은 또한 자가면역질환의 진단, 및 치료 효능의 모니터링, 및 예후 중 적어도 하나를 위한 키트를 제공하며, 상기 키트는 다음의 구성요소를 포함한다:
a. 본 발명의 본원에서 설명하는 적어도 하나의 항체 또는 그것을 포함하는 조성물; 및
b. 샘플 내 항원의 존재하에서 검출을 수행하기 위한 설명서, 상기 항원은 본 발명의 상기 항체에 의해 특이적으로 인식된다.
유사하게, 상기 키트는 하기 구성요소 중 적어도 하나를 추가로 포함할 수 있다:
a. 시험되어야 하는 샘플을 수집하기 위한 적어도 하나의 수단;
b. 상기 항체에 의해 상기 항원의 상기 인식의 검출에 필요한 적어도 하나의 시약; 및
c. 적어도 하나의 대조군 샘플.
한 구체예에서, 임의의 이러한 키트는, 예를 들어 ELISA 키트와 같은 항체(또는 인식하는 약제) 포획 분석 키트이며, 이것은 고체 지지체, 본 발명에서 정의되는 적어도 하나의 항체, 및 선택적으로 적절하다면 제2 항체를 포함한다. 키트는 추가로 상기 설명한 바와 같은 검출가능한 모이어티, 효소 기질 및 착색 시약과 같은 임의의 필요한 시약을 선택적으로 포함할 수 있다. 항체 포획 진단 키트는, 대안으로 본원에서 설명되는 성분 및 시약을 일반적으로 포함하는 면역블롯 키트이다. 본 발명의 진단 키트에 포함되는 특정 시약 및 다른 성분은 키트에서 실행되는 특정 진단 방법에 따라서 당업자로부터 선택될 수 있다. 이러한 키트는 피험자로부터 얻은 조직 또는 유체, 특히 전혈, PBMC 또는 배양 전 및/또는 후의 백혈구와 같은 생물학적 샘플 중에서 항체를 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 적당한 수단을 언급하는 경우, 상기 적당한 수단은 면역 친화도 과정, 효소 분석, 또는 그 중에서도 구조적 특징을 검출하기 위한 수단일 수 있다.
상기 적당한 수단이 면역 친화도 과정인 경우, 상기 과정은 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA), 웨스턴 블롯, 면역-침전법, FACS 중 임의의 하나, 또는 본 발명에 설명되는 항체를 이용하는 어떤 다른 면역친화도 과정이다.
하나의 특정 구체예에서, 검출은 포획 ELISA를 통해 달성된다.
포획 ELISA (또한"샌드위치" ELISA로서 알려짐)는 물질(예컨대, 호르몬, 세포 신호전달 화학물질, 전염성 질병 항원 및 사이토카인)의 양을 피코그램 내지 마이크로그램으로 정량화하는 민감한 분석이다. ELISA의 이런 종류는 분석되는 물질이 너무 묽어서 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(예컨대 세포 배양물 상청액에서 단백질)에 결합할 수 없고 또는 플라스틱(예컨대 소유기 분자)에 잘 결합하지 않을 때 추구된다. 포획 항체, 샘플, 대조군에 대한 최적의 희석, 및 항체를 검출하는 것 뿐만 아니라 인큐베이션 시간은 경험적으로 결정되고, 대규모 적정을 필요로 할 수 있다. 효소-표지 검출 항체를 사용하는 것이 이상적이다. 그러나, 검출 항체가 비표지라면, 제2 항체는 코팅 항체 또는 샘플과 교차 반응해서는 안 된다. 적합한 음성 및 양성 대조군이 또한 포함되어야 한다.
사용되는 포획 또는 코팅 항체는 탄산염-중탄산염 완충제 또는 PBS 중에서 희석되어야 한다. 포획 항체들은 전형적으로 0.2 내지 10 μg/ml에서 플레이팅된다. 친화도 정제 항체를 사용하거나 또는 IgG 분획을 최소로 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로 샘플은 10 ng-10 μg/웰 범위에서 PBS 중에서 희석된다(더 민감한 분석은, 더 적은 샘플이 요구된다).
본 명세서에서 본원에서 사용되는 바와 같은, 용어 "검출가능한 모이어티"는 그것의 임의의 원자, 분자 또는 부분을 말하며, 이것의 존재, 부재 또는 수준은 직접 또는 간접적으로 모니터링될 수 있다. 한 예는 방사성동위원소를 포함한다. 다른 샘플은 (i) 색 또는 광 방출(발광) 반응을 촉매할 수 있는 효소 및 (ii) 형광단을 포함한다. 검출가능한 모이어티의 검출은 예를 들어 형광단의 경우와 같이 검출가능한 모이어티가 그 자체로 검출가능하도록 직접 제공될 수 있다. 대안으로, 검출가능한 모이어티의 검출은 간접적일 수 있다. 후자의 경우에, 그 자체가 직접 검출가능한 검출가능한 모이어티와 반응하는 제2 모이어티가 바람직하게 사용된다. 검출가능한 모이어티는 항체에 내재될 수 있다. 예를 들어, 항체의 불변 영역은 직접 검출가능한 모이어티를 가지는 제2 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 간접적으로 검출가능한 모이어티로서 작용할 수 있다
따라서, 제2 항체는 본 발명의 항체의 검출을 위한 특히 적당한 수단이다. 이 2차 항체는 검출가능한 모이어티에 그 자체가 콘쥬게이트될 수 있다. 본 발명에 따르는 항체가 검출가능하게 표지될 수 있는 한 방법은 그것을 효소에 결합하는 것에 의한다. 이 효소는 차례로, 적절한 기질에 노출된 후에, 예를 들어, 분광측색방법, 형광측정에 의해 또는 시각적 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 모이어티를 만들기 위한 방식으로 기질과 반응할 것이다. 항체를 검출가능하게 표지하기 위해 사용될 수 있는 효소는, 제한되는 것은 아니지만, 겨자무과산화효소, 알칼리성 포스파타아제, 말레이트 탈수소효소, 포도상구균 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라아제, 효모 알코올 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이소머라아제, 아스파라기나아제, 글루코오스 옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코오스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린-에스터라아제를 포함한다.
검출은 효소에 대한 크로모제닉 기질을 사용하는 비색법에 의해 수행될 수 있다. 검출은 또한 유사하게 제조된 표준과 기질의 효소적 반응의 정도의 시각적 비교에 의해 수행될 수 있다.
제1 항체가 결합되는 고체 지지체는 임의의 수-불용성, 수-불현탁성의 고체 지지체일 수 있다. 적당한 고체 지지체의 예는 폴리스티렌, 여과지, 테스트 튜브 및 마이크로타이터 플레이트의 거대 비드를 포함한다. 제1 항체는 공유 결합 또는 흡착에 의해 고체 지지체에 결합할 수 있다. 고체 지지체 사용의 이점은 고체와 액체상의 분리에 대해 원심분리 단계가 없다는 것이다.
상기 언급한 고체 지지체는 폴리스티렌, 아가로오스, 세파로오스, 셀룰로오스, 유리 비드와 같은 폴리머 및 셀룰로오스 또는 다른 폴리머의 자화될 수 있는 입자를 포함할 수 있다. 고체-지지체는 거대 또는 소 비드 또는 입자, 튜브, 플레이트의 형태 또는 기타 형태로 있을 수 있다.
고체 지지체로서, 사용은 제1 항체, 예를 들어 본 발명의 발명자들에 의해 제조된 특이적인 항체, 또는 그것의 임의의 단편 또는 유도체로 코팅된 내벽이 있는 마이크로타이터 플레이트의 테스트 튜브로 구성된다.
본 발명의 방법에 의해 사용되는 "결정하는"은 특이적 샘플에 존재하는 바이오마커의 양을 추정, 정량화, 계산 또는 달리 유도하는 것을 포함한다. 이것은 예를 들어, 검출가능한 생성물의 출현, 예를 들어 기질 수준에서 임의의 검출가능한 변화 또는 생성물의 출현 또는 기질의 소실 속도의 어떤 변화일 수 있는 종말점 표시를 측정함으로써, 또는 본 발명에 의해 설명되는 바이오마커에 결합된 항체의 양을 측정함으로써 달성될 수 있다.
상기 시험 키트 모두에서, 시험되는 샘플을 수집하기 위하 상기 수단은 면봉, 피펫, 또는 유사한 수집 수단일 수 있고, 상기 인큐베이션 수단은 플레이트, 테스트 튜브, 유리 또는 플라스틱 표면, 웰, 또는 흡착지의 조각, 또는 유사한 수단에 위치되는 액체 또는 반고체 배양물 배치일 수 있다.
키트의 어떤 버전은 시험이 스캐너 상에서 실행되고 결과가 컴퓨터에 실시간으로 공급되도록 설계되었다는 것이 인식되어야 한다. 이것은 완전한 정보가 모든 관련된 곳에 직접 보내질 수 있고 어떤 미래의 참고를 위해 완전하게 저장될 것임을 보장할 것이다.
키트의 다른 구체예에서, 상기 샘플은 체액 및 배양물-유래 샘플 중 하나이다.
본 발명의 항체와 접촉되는 샘플은 어레이(array)에서 배열될 수 있다.
본 방법에 의해 사용되는 용어 "어레이" 및 본 발명의 키트는 인식-약제, 즉 적어도 하나의 본 발명의 항체의 "처리된" 공간적 배열을 말한다. 어레이의 각 "처리"는 인식 에이전트를 함유하는 사전결정된 특이적 공간 영역이다. 예를 들어, 어레이는 복수의 용기(시험 튜브), 플레이트, 각각 다른 항체를 함유하는 마이크로-플레이트중에서 마이크로-웰일 수 있다. 어레이는 또한 별개 영역(점, 선, 컬럼)에서 다른 및 알려진 인식 에이전트, 예를 들어 항체를 보유하는 임의의 고체 지지체일 수 있다. 어레이는 바람직하게는 빌트-인의 적절한 대조군, 예를 들어 샘플이 없는 영역, 항체가 없는 영역, 즉, 용매 및 시약 단독 및 항체에 의해 인식되는 합성 또는 분리된 단백질 또는 펩티드를 함유하는 영역(양성 대조군)이 없는 영역을 포함한다. 본 발명의 어레이에 대해 사용된 고체 지지체는 본 발명에 의해 제공되는 키트와 함께 이후에 본원에서 더욱 상세하게 설명된다.
본 발명의 키트에서 사용에 적당한 고체 지지체는 전형적으로 액체상에서 실질적으로 불용성이다. 본 발명의 고체 지지체는 지지체의 특정 형태로 제한되지 않는다. 오히려, 다수의 지지체가 이용가능하고 당업자에게 공지되어 있다. 따라서, 유용한 지지체는 고체 및 반-고체 매트릭스, 예컨대 에어로졸 및 하이드로겔, 수지, 비드, 바이오칩(필름 코팅된 바이오칩을 포함), 마이크로플루이딕 칩, 규소 칩, 다중-웰 플레이트(또한 마이크로타이터 플레이트 또는 마이크로플레이트로서 언급됨), 막, 필터, 전도성 및 비전도성 금속, 유리(현미경 슬라이드를 포함) 및 자기 지지체를 포함한다. 유용한 고체 지지체의 더 구체적인 예는 실리카 겔, 폴리머 막, 입자, 유도체화된 플라스틱 필름, 유리 비드, 면, 플라스틱 비드, 알루미나 겔, 다당류, 예컨대 세파로오스, 나일론, 라텍스 비드, 자기 비드, 상자성 비드, 초상자성 비드, 전분 등을 포함한다.
임의의 시약이 임의의 본 방법에 포함되고 본 발명의 키트는 상기 설명한 임의의 고체 지지체 물질에 포매, 결합, 연결, 부착, 위치된 또는 융합된 시약으로서 제공될 수 있다.
본 발명의 방법 및 키트에 의해 사용된 임의의 항체는 또한 다클론성, 단클론성, 재조합체, 예를 들어 키메라 또는 본 발명의 항체로부터 유도된 단일쇄 항체(ScFv)일 수 있다.
본 발명은 특허청구범위에 의해 한정되며, 그 내용은 본 명세서의 개시 내에 포함된 바와 같이 읽혀진다.
본 발명은 본원에서 개시되는 특정 실시예, 공정 단계 및 재료로 제한되지 않고, 공정 단계 및 재료는 다소 다양할 수 있는 것으로 이해되어야 한다는 것이 개시되고 설명된다. 또한 본 발명의 범주는 단지 후술하는 특허청구범위 및 그것의 동등물에 의해서만 제한될 것이기 때문에 본원에서 사용되는 전문용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 목적을 위해 사용되며, 제한하고자 하는 의도는 아니라는 것이 이해되어야 한다.
본 명세서 및 후술하는 특허청구범위에서 사용되는 바와 같은, 단수 형태는 내용이 달리 명확하게 지시되지 않는다면 복수 대상을 포함하는 것임을 주의하여야 한다.
본 명세서 및 하기의 특허청구 범위를 통해, 내용이 달리 요구하지 않는다면, 단어 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹의 제외를 의미하지 않는다는 것이 이해될 것이다.
하기 실시예는 본 발명의 양태를 수행하는 발명자에 의해 사용된 대표적인 기술이다. 이 기술들은 본 발명의 실행을 위한 대표적인 바람직한 구체예인 한편, 본 명세서에 비추어 당업자는 본 발명의 의도된 범주로부터 벗어나지 않고 수많은 변형이 만들어질 수 있다는 것을 인식할 것임이 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 관련된 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다.
실시예
방법
수많은 면역학적 기술이 당업자에게 잘 알려져 있기 때문에, 예를 들어 ELISA와 같이 본원에서 상세하게 설명된 각각의 예에 있지는 않고, 예를 들어, Harlow and Lane (1988) Antibodies : a laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory에서 상세하게 설명된다.
분자 생물학의 일반 방법
다수의 분자 생물학 분야의 방법은 그것들이 당업자에게 잘 알려져 있기 때문에 본원에서 설명하지 않는다. 이러한 방법은, PCR, cDNA의 발현, 인간 세포의 트랜스펙션 등을 포함한다. 이러한 방법을 설명하는 교재는, 예를 들어 Sambrook et al . (1989) Molecular Cloning , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN: 0879693096; F. M. Ausubel (1988) Current Protocols in Molecular Biology, ISBN: 047150338X, John Wiley & Sons, Inc에 있다. 추가로, 다수의 면역학적 기법은 그것들이 당업자에게 잘 알려져 있기 때문에, 예를 들어 웨스턴 블롯과 같이 본원에서 상세하게 설명되는 각각의 예에 있지 않다. 예를 들어, Harlow and Lane (1988) Antibodies : a laboratory manual , Cold Spring Harbor Laboratory 참조.
ELISA 일반 프로토콜
효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 용이하게-분석되는 효소에 커플링되는 항체 또는 항원을 사용함으로써 항체의 특이성과 단순한 효소 분석의 감수성을 조합한다. ELISA는 항원 또는 항체 농도의 유용한 측정을 제공할 수 있다. ELISA는 5-단계 과정이 있다: 1) 마이크로타이터 플레이트 웰을 PBS 중에서 희석한 항원으로 코팅하고, 4C에서 밤새 인큐베이션하고 세척하는 단계; 2) 비결합 자리를 PBS 중의 BSA/FCS에서 차단하여 긍정오류 결과를 방지하고, 1시간 동안 인큐베이션하고 세척하는 단계; 3) 항체를 웰에 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하고 세척하는 단계; 4) 효소에 콘쥬게이트된 항-인간 IgG를 첨가하고, 1시간 동안 인큐베이션하고 세척하는 단계; 5) 기질과 효소의 반응으로 색이 있는 생성물을 만들고, 마지막으로 포지티브 반응을 나타내는 단계.
FACS 프로토콜
1. 세포를 수확하고, 세척하고, 빙냉 PBS, 10% FCS, 1% 아지드화나트륨 중에서 1-5x106 세포/ml의 농도로 현탁액 중에서 조절하였다.
2. 0.1-10 ㎍/ml의 1차 표지된 항체를 첨가하였다. 필요하다면, 항체를 3% BSA/PBS로 희석하였다.
3. 세포 + 항체를 실온 또는 4℃에서 적어도 30분 동안 인큐베이션하였다.
4. 세포를 5분 동안 400g에서 3회 원심분리에 의해 세척하고, 500㎕ 내지 1ml의 빙냉 PBS, 10% FCS, 1% 아지드화나트륨에서 재현탁하였다.
5. 이어서 세포를 준비하여 유세포 분석기로 분석하였다.
KTPAF50 의 검출을 위한 ELISA 과정:
1. 교정 곡선: PRT3의 연속 희석을 2000 pg/ml 내지 31 pg/ml의 PBS(Biological Industries, Catalog No. 02-023-5A) 중에서 제조하였다.
2. 샘플을 재빨리 37℃욕 중에서 녹였다.
3. 각 혈액 샘플(희석하지 않음)의 70㎕ 2개(duplicate) 및 표준 샘플의 70㎕ 3개(triplicate)를 Maxisorp 96-웰 플레이트(NUNC, F96 Maxisorp, Catalog No. 442404)에 장약하였고, 4℃에서 진탕하면서 밤새 인큐베이션하였다.
4. 세척: 플레이트를 PBS 중에서 300 ㎕ 0.05% TW-20 (Amresco, Catalog No. 0777-1L)로 4회 세척하였다.
5. 차단: PBS 중에서 300 ㎕의 차단 완충제 5% BSA (MP biomedicals, Catalog No. 160069)를 각 웰에 장약하였고, 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다.
6. 세척: 단계 #4와 동일.
7. 검출: KTPAF50-특이적 항체를 희석제(PBS 중에서 0.05% TW-20, 0.1% BSA) 중에서 1:250으로 희석하였다(친화도 정제됨). 100㎕의 검출 항원을 각 웰에 장약하였고 실온에서 2시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다.
8. 세척: 단계 #4와 동일.
9. HRP 콘쥬게이트: 염소 항-토끼 HRP 콘쥬게이트 항체(Cell signaling, Catalog No. 7074)를 희석제 중에서 1:200으로 희석하였다. 100㎕의 HRP 콘쥬게이트를 각 웰에 장약하였고, 30분 동안 실온에서 진탕하면서 인큐베이션하였다.
10. 세척: 4 대신 5회의 세척으로, 상기 단계 #4와 동일
11. 발생: 100㎕ TMB (3,3',5,5'-테트라메티벤지딘, 겨자무과산화효소 기질, Millipore, Catalog No. ES001-500ML)를 각 웰에 첨가하였다. 청색의 발생과 함께, 50㎕ 2N H2SO4 (Frutarom, Catalog No. 5552540)를 첨가하였다.
12. 플레이트 판독: 마이크로플레이트 판독기에서, 흡착을 450 nm에서 확인하였다.
다클론성 항체의 제조
다클론성 항체의 제조를 위한 표준 프로토콜을 사용하여 토끼에서 다클론성 항체를 만들었다.
KTPAF50-특이적 다클론성 항체의 제조에 사용한 항원은 SEQ ID NO. 3에 의해 표시되는 서열과 대응하는 KTPAF50 단백질 (EKGAAFSPIYPRRK)의 C-말단에서 마지막 14개의 아미노산에 대응하는 펩티드였다.
도 1은 KTPAF50-특이적 항체의 그것의 항원에 대한 특이성의 곡선을 나타낸다.
KTPAF50 -특이적 단클론성 항체의 제조 및 교정
KTPAF50에 대한 단클론성 항체를 항체의 당업자에게 알려진 표준 프로토콜에 따라서 Genemed Synthesis, Inc. (San Antonio, TX, USA)에 의해 주문 제작하였다. 항체 친화도의 교정을 다음과 같이 ELISA에 의해 수행하였다:
1. KTPAF50 펩티드를 PBS 중에서 1000, 500, 100 및 0 ng/ml로 희석하여 교정 곡선을 만들었다. 이 농도를 2개의 MAXISORPTM ELISA Nunc ImmunoTM 플레이트(Nunc #442404) 상의 듀플리케이트에서 30회 장약하였다. 플레이트를 밤새 4℃에서 부드러운 진탕으로 인큐베이션하였다.
2. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS (300 ㎕/웰) 중에서 0.05% Tween-20를 사용하여 4회 세척하였다.
3. 웰을 PBS 중에서 300 ㎕/웰 1% BSA을 장약함으로써 차단한 후, 4℃에서 부드러운 진탕으로 밤새 인큐베이션하였다.
4. 인큐베이션 후, 플레이트를 단계 2에서 설명한 바와 같이 세척하였다. 100 ㎕의 각각 30개의 단클론성 KTPAF50 항체를 각 KTPAF50 희석 곡선 중의 듀플리케이트에 장약하였다. 대조군으로서, 다클론성 KTPAF50 항체 (1:250 희석)를 또한 각 플레이트 상에 장약하였고, 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
5. 인큐베이션 후, 플레이트를 단계 2에서 설명한 바와 같이 세척하였다. 50 ㎕의 1:200 Peroxidase-AffiniPure 염소 항-마우스 IgG (Jackson ImmunoResearch #115-035-206)를 0.1% BSA 중에서 희석하였고, PBS 중의 0.05% Tween-20를 각 웰에 장약하였다. 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
6. 인큐베이션 후, 플레이트를 단계 2에서 설명한 바와 같이 세척하였다. 100 ㎕ TMB/E (Millipore #ES001-500ML)를 각 웰에 장약하였고, 15분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
7. 50 ㎕ 2N H2SO4를 각 웰에 장약하였다.
8. 플레이트를 450nm에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다.
TDS 프로토콜( eBioscience TM 제)
1. Corning Costar 9018 ELISA 플레이트를 Coating Buffer 중에서 100 ㎕/웰의 포획 항체로 코팅하였다(분석증명서에서 주목한 바와 같이 희석, 시약 세트를 함께 포함). 플레이트를 봉인하였고 밤새 4℃에서 인큐베이션하였다.
2. 웰을 흡입하였고 >250 ㎕/웰 세척 완충제로 5회 세척하였다. 각 세척 단계 동안 소킹(soaking)을 위한 시간을 허용하는 것은 세척의 효율을 증가시켰다. 잔여 완충제를 흡착 페이퍼 상의 플레이트로부터 제거하였다.
3. 1부 5X 농축 분석 희석제(Assay Diluent)를 4부 순수(DI water)로 희석하였다. 웰을 200 ㎕/웰의 1X Assay Diluent로 차단하였고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
4. 세척을 5회 반복하였다.
5. 표준 곡선에 대해, 100 ㎕/웰의 희석한 표준을 적절한 웰에 첨가하였고, 2-배 연속 희석을 맨 위의 표준으로부터 제조하여 표준 커브를 만들었다. 100 ㎕/웰의 샘플을 적절한 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮거나 또는 밀봉하고 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다(또는 최대 감수성을 위해 4℃에서 밤새)
6. 세척을 5회 반복하였다.
7. 1X Assay Diluent* 중에서 희석한 100 ㎕/웰의 검출 항체를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하였고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다.
8. 세척을 5회 반복하였다.
9. 1X 분석 희석제 중에서 희석한 100 ㎕/웰의 Avidin-HRP*를 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하였고 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
10. 마지막 세척에서, 웰을 Wash Buffer 중에서 흡입 전 1 내지 2분 동안 소킹하였고, 세척을 총 7회 반복하였다.
11. 50 ㎕의 정지액 100 ㎕/웰의 기질 용액을 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였고, 반응을 50 ㎕의 정지액으로 정지시켰다.
12. 플레이트를 450nm에서 판독하였다. 파장 차감이 이용가능하다면, 570 nm의 값을 450 nm의 값으로부터 차감하고, 데이터를 분석하였다.
Thawing Poietics ® 세포에 대한 처리
DNase I는 배양물 세포, 및 단핵 세포의 응집을 방지하는 작용을 하며, 배치지에 첨가하였다.
1. 냉동 세포의 바이알을 37℃ 수욕 중에서 해동하였다.
2. 최대 2 ml의 세포 현탁액을 50 ml 코니칼 튜브에 무균성으로 이동시켰다.
3. 바이알을 20U/ml에서 10% FBS 또는 1% BSA, 및 DNase I를 함유하는 1 ml의 사전 가온한 배지로 헹구었다.
4. 몇 방울의 배지의 첨가 후 부드럽게 교반하는 동안(=3분), 전체 부피는 5ml이었다.
5. 몇 방울의 배지의 첨가 후 부드럽게 교반하는 동안(= 5 내지 10분), 1 ml 내지 2 ml 부피의 배지 적가에 의해 부피 증가를 완료하였다.
6. 세포 현탁액을 15분 동안 실온에서 200 X로 원심분리하였다.
7. 세포 펠렛을 남아있는 배지 중에서 부드럽게 재현탁하였다.
8. 세척 배지로 부피를 서서히 증가시켜, 각 배지의 첨가 후 부드럽게 교반하는 동안 1 ml 내지 2 ml 부피의 배지를 첨가함으로써 튜브를 채웠다.
9. 세포 현탁액을 실온에서 15분 동안 200 X에서 원심분리하였다.
10. 2 ml의 세척물을 주의깊게 제거하였고 세포 펠렛을 남아있는 2 ml 배지 중에서 부드럽게 재현탁하였다. 세포를 계측하였다. 세포 계수가 기대한 것 보다 더 낮다면, 단계 7로부터 저장한 현탁액 중에서 추가 세척을 할 수 있으며, 필요하다면 세포를 합하였다.
11. 세포는 37℃ 및 5% CO2에서 한 시간 동안 남아 있었고, 초시간을 측정한 다음 배양물에 두었다.
* DNase의 첨가를 위해, 10% FBS 및 20 U/ml의 DNase I (Sigma D 4513)를 함유하는 20 ml의 배지를 제조해야 했다. DNase-함유 배지를 세포를 희석하기 위해 사용하였다.
동물
Balb/C 마우스를 Harlan Israel로부터 구입하였다.
Figure pct00003
실시예 1: 인간 혈액 샘플에서 KTPAF50 의 검출
19명의 인간 혈액 혈청 샘플은 50-65세의 남성 및 여성으로부터 Asterand®로부터 얻었다: 9개의 폐암 환자 샘플, 및 10개의 건강한 개인. 모든 샘플을 사용할때까지 -80℃ 이하에서 유지하였다.
혈액 샘플을 다클론성 항-KTPAF50 항체를 사용하여 KTPAF50 단백질의 존재에 대해 시험하였다. 도 2에서 제시되는 바와 같이, KTPAF50의 발현은 폐 암 샘플에서보다 상당히 더 높다.
따라서, 항-KTPAF50 항체는 폐암의 검출을 위한 진단 도구로서 사용될 수 있다.
실시예 2: 항-KTPAF50-특이적 단클론성 항체의 생성
KTPAF50-특이적 단클론성 항체를 항원으로서 KTPAF50 펩티드 (항원 1, 2 또는 3, 하기 표 참조) 또는 전장 KTPAF50 단백질을 사용하여 만들었다. 항원을 하기 표 1에서 구체화하였다. 항원 2는 N-말단의 프롤린과 C-말단의 시스테인을 가지는 다클론성 항체의 제조를 위해 사용한 것과 본질적으로 동일하다. 항체를 Genemed Synthesis, Inc.(San Antonio, TX, USA)로부터 주문하였다.
Figure pct00004
30개의 다른 단클론성 항체들을 Genemed Synthesis, Inc. (San Antonio, TX, USA)에 의해 만들었고 KTPAF50에 대한 그것의 친화도를 확인하였다
표 2는 각 하이브리도마의 항원 특이성을 요약한다.
Figure pct00005
각 단클론성 항체에 대한 친화도 교정 곡정 곡선의 결과를 표 3에서 요약한다.
Figure pct00006
Figure pct00007
실시예 3: 암컷 Balb /C 비장세포의 생육성에서 단클론성 KTPAF50 항체의 효과
30 KTPAF50-특이적 단클론성 항체를 비장세포 생육성에서 그것의 효과에 대해 시험하였다. 생육성을 레자주린 분석을 사용하여 시험하였다.
과정:
1. 하나의 암컷 Balb/C (20주령) 비장을 수확하였고, 적혈구를 1X RBC 라이시스 버퍼(eBioscience # 00-4333)를 사용하여 용해하였다.
2. 세포를 2개의 F96 MicroWell™ 플레이트 (Nunc #167008)로 나누었다. 각 플레이트에서 5x5 웰을 200 ㎕ Karyotyping 배지에서 50,000 세포로 장약하였다(Biological industries 01-201-1B). 세포를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
3. 인큐베이션 후, 다음의 처리를 5개(quintuplicate)로 각 웰에 첨가하였다:
a. 대조군 (항-p53 항체 [Santa Cruz CS- 65334] -10 ㎕)
b. 100 ng/ml KTPAF50
c. 1000 ng/ml KTPAF50
d. 15 ㎕의 α-KTPAF50 1 (하이브리도마 3E3G7)
e. 15 ㎕의 α-KTPAF50 2 (하이브리도마 5E11H3)
4. 37℃, 5% CO2에서 제1 플레이트를 24시간 동안 인큐베이션하였고 제2 플레이트를 48시간 동안 인큐베이션하였다.
5. 인큐베이션 시간 후, 20 ㎕의 레자주린(R&D systems #AR002)을 각 웰에 첨가하였고, 웰 형광성 (530/590 nm)을 4 및 24시간에 플레이트 판독기를 사용하여 확인하였다.
결과를 도 3A-3C에 나타낸다. 본질적으로, 레자주린으로 24시간의 처리 및 4-시간의 인큐베이션 후, 세포 생육성은 각각 3E3G7 및 5E11H3으로 처리한 배양물에서 54% 및 58%으로 감소하였다(도 6A). 레자주린으로 24시간 인큐베이션 후 세포 생육성의 감소는 각각 3E3G7 및 5E11H3으로 처리한 배양물에서 29% 및 35%으로 훨씬 더 현저하였다(도 6B).
KTPAF50-특이적 항체로 48시간 처리는 24시간 처리와 유사한 정도로 세포 생육성이 감소되었다(도 6C).
결과는 KTPAF50에 대한 단클론성 항체가 Balb/C 비장세포의 생육성을 극적으로 감소시킬 수 있다는 것을 나타내며, KTPAF50가 마우스 비장세포의 생육성을 유지하는 중심 역할을 한다는 것을 제안한다. 특이적 단클론성 항체가 있는 KTPAF50 활성을 중화하는 것은 마우스에서 유발된 자가면역질환을 치료하기 위한 매우 강력한 도구로서 작용할 수 있다. 유사하게, KTPAF50-특이적 단클론성 항체는 인간 임상 시험에서 사용될 것이다.
실시예 4: C57 /블랙 비장세포의 생육성에서 단클론성 KTPAF50 항체의 효과
30개의 KTPAF50-특이적 단클론성 항체를 비장세포 생육성에서 그것의 효과에 대해 시험하였다. 생육성을 레자주린 분석을 사용하여 시험하였다.
과정:
1. 한 마리의 암컷 및 한 마리의 수컷 C57/블랙 (8주령) 비장을 수확하였고, 적혈구를 1X RBC 라이시스버퍼(eBioscience # 00-4333)를 사용하여 용해하였다.
2. 세포를 2개의 F96 MicroWell™ 플레이트 (Nunc #167008)로 나누었다. 각 플레이트에서 5x5 웰을 200 ㎕ Karyotyping 배지에서 50,000 세포로 장약하였다(Biological industries 01-201-1B). 세포를 37℃, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
3. 인큐베이션 후, 다음의 처리를 5개로 각 웰에 첨가하였다:
a. 대조군 (항-p53 항체 [Santa Cruz CS- 65334] -10 ㎕)
b. 15 ㎕의 항-KTPAF50 1 (항체 5E11H3)
c. 15 ㎕의 항-KTPAF50 2 (항체 3E3G7)
d. 100 ng/ml KTPAF50
e. 500 ng/ml KTPAF50
4. 37℃, 5% CO2에서 제1 플레이트를 24시간 동안 인큐베이션하였고 제2 플레이트를 48시간 동안 그리고 제3 플레이트를 72시간 동안 인큐베이션하였다.
5. 인큐베이션 시간 후, 20 ㎕의 레자주린(R&D systems #AR002)을 각 웰에 첨가하였고, 웰 형광성 (530/590 nm)을 4 및 24시간에 플레이트 판독기를 사용하여 확인하였다.
결과를 도 7A-7C에 나타낸다. 본질적으로, 레자주린으로 24시간의 처리 및 4-시간의 인큐베이션 후, 세포 생육성은 5E11H3 및 3E3G7으로 처리한 배양물에서 36%로 감소하였고(도 4A), 암컷 세포에서 세포 생육성은 각각 5E11H3 및 3E3G7으로 처리한 배양물에서 52% 및 58%로 감소하였다(도 4B). KTPAF50-특이적 항체로 48시간 처리는 암컷의 24시간 처리와 유사한 정도로 수컷과 암컷 세포의 세포 생육성을 감소시켰다(도 4C 및 4D).
항체로 연장된 처리(72시간 처리)는 세포 생육성의 추가 감소가 없었다(도 4E 및 4F).
결과는 KTPAF50에 대해 단클론성 항체가 C57Bl/6 비장세포의 생육성을 극적으로 감소시킬 수 있다는 것을 명확하게 나타내며, KTPAF50이 마우스 비장세포의 생육성을 유지하는데 중요한 역할을 한다는 것을 제안한다. 특이적 단클론성 항체에 의한 KTPAF50 활성을 중화하는 것은 마우스에서 유발된 자가면역 질환을 처리하기 위한 매우 강력한 도구로서 작용할 수 있다. 유사하게, KTPAF50-특이적 단클론성 항체들은 인간 임상 시험에 사용될 것이다.
실시예 5
KTPAF50 항체로 처리에 더하여, 세포를 ELISA 분석을 사용하는 상청액 중의 KTPAF50의 존재에 대해 평가하였다.
과정:
1. 섹션 A(과정하에서 단계 4)로부터의 24시간 대조군 샘플을 Maxisorp 면역플레이트에 3개의 각 웰에서 100 ㎕로 장약하였다(Maxisorp #442404). 정제를 위해, PRT3의 연속 희석을 또한 장약하였다(2000 내지 63 pg/ml). 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
2. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS 중에서 300 ㎕ 0.05% TW-20 (Amresco #0777-1L)로 다중-피펫을 사용하여 4회 세척하였다.
3. 플레이트를 PBS 중에서 5% BSA (MP biomedicals #160069)를 사용하여 차단하였다. 300 ㎕를 각 웰에 장약하였다. 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션.
4. 플레이트를 단계 2에서 설명한 바와 같이 세척하였다.
5. PRT3 다클론성 항체(정제된 친화도)를 희석제(PBS 중에서 0.05% TW-20, 0.1% BSA) 중에서 1:250으로 희석하였다. 100 ㎕의 항체를 각 웰에 장약하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다.
6. 플레이트를 단계 2에서 설명한 바와 같이 세척하였다.
7. 염소 항-토끼 HRP 콘쥬게이트 항체(Cell signaling, 7074)를 희석제 중에서 1:200으로 희석하였다. 100 ㎕의 HRP 콘쥬게이트를 각 웰에 장약하였다. 플레이트를 30분 동안 실온에서 진탕하면서 인큐베이션하엿다.
8. 플레이트를 단계 2에서 설명한 바와 같이, 단지 4회 대신 5회의 세척으로 세척하였다.
9. 100 ㎕ TMB (Millipore TM, ES001-500ML)를 각 웰에 장약하였고, 50 ㎕ 2N H2SO4 (Frutarom, 5552540)를 색 발생 후 장약하여 반응을 정지시켰다.
10. 플레이트를 마이크로플레이트 판독기에서 450nm에서 판독하였다.
결과는 도 5에서 있으며, 상청액 중에서 mKTPAF50의 존재를 확인한다.
실시예 6: 인간 단핵구 상에서 단클론성 KTPAF50 항체의 효과
인간 단핵구 상에서 KTPAF50 항체의 효과를 세포 생육성, 사이토카인 발현, 상청액 중의 KTPAF50 단백질의 존재 및 세포 형태에 대해 분석하였다.
A. 세포 생육성을 레자주린 분석을 사용하여 시험하였다.
과정:
1. 인간 말초혈액 단핵세포(HPBMC) (Lonza #CC-2702)를 공식 프로토콜(Appendix B를 참조)에 따라서 해동하였고, 말초혈액 Karyotyping 배지(Biological industries #01-201-1B) 중에서 배양하였다.
2. 세포를 2개의 F96 MicroWell™ 플레이트(Nunc #167008)로 나누었다. 각 플레이트에서 4x5 웰을 200 ㎕ Karyotyping 배지 중에서 50,000개의 세포로 장약하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
3. 인큐베이션 후 다음의 처리를 각 웰에 첨가하여 4배화 하였다:
a. 대조군 (항-p53 항체 [Santa Cruz CS - 65334] - 10 ㎕)
b. 10 ㎕의 항-KTPAF50 1 (5E11H3)
c. 25 ㎕의 항-KTPAF50 1 (5E11H3)
d. 10 ㎕의 항-KTPAF50 2 (,3E3G7)
e. 25 ㎕의 항-KTPAF50 2 (3E3G7)
4. 37℃, 5% CO2에서 제1 플레이트를 24시간 동안 인큐베이션하였고 제2 플레이트를 48시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 시간 후, 20 ㎕의 레자주린(R&D systems #AR002)을 각 웰에 첨가하였고, 형광성 (530/590 nm)을 2, 4 및 24시간에(24시간 인큐베이션 후) 또는 2 및 4시간에(48시간 인큐베이션 후) 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 결과는 각각 도 6A-6C 및 7A-7B에 있다.
B. ELISA 분석을 사용하여 항-KTPAF50 항체로 처리 후 배지(상청액)에서 사이토카인 발현 변화의 분석
과정:
1. 인간 말초혈액 단핵세포(HPBMC) (Lonza #CC-2702)를 해동 프로토콜(상기 참조)에 따라서 해동하였고, 말초혈액 Karyotyping 배지(Biological industries #01-201-1B) 중에서 배양하였다.
2. 세포를 4개의 6웰 멀티디쉬 플레이트(Nunc #140675)로 나누었다. 각 웰에서 1M 세포를 2 mL Karyotyping 배지 중에서 장약하였다. 세포를 37℃, 5% CO2 중에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
3. 인큐베이션 후, 하기 처리를 각 웰에 첨가하였다:
a. 대조군
b. 100 ㎕의 항-KTPAF50 1 (5E11H3)
c. 10 ㎕의 항-KTPAF50 2 (3E3G7)
d. 100 ng/ml KTPAF50
e. 500 ng/ml KTPAF50
f. 1000 ng/ml KTPAF50
4. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 24, 48, 120 및 144 시간 동안 인큐베이션하였다.
5. 인큐베이션 후, 플레이트를 얼음에 두었고, 샘플을 수집하였고, 10분 동안 300 G에서 원심분리하였다. ELISA 분석을 위해 배지(상청액)를 취하였다.
6. ELISA 분석을 위해 샘플을 Maxisorp 면역플레이트(Nunc #442404)에 장약하였다. 다음의 ELISA 키트를 제조업자의 설명서에 따라서 각 사이토카인을 시험하기 위해 사용하였다(TDS 프로토콜, 하기 참조).
a. 인간 TNF-알파 (eBioscienceTM #88-7346). 1:10으로 희석한 샘플
b. 인간 IFN-감마 (eBioscienceTM #88-7316). 1:10으로 희석한 샘플
c. 인간 IL-10 (eBioscienceTM #88-7106). 1:6으로 희석한 샘플
d. PRT-3. 희석하지 않은 샘플
TNF-α 발현은 24- 또는 48-시간 처리를 위한 항-KTPAF50 처리 시 변하지 않았지만(도 8B-8C), 120-시간 처리 시(도 8D) 및 144-시간 처리시 상당히 감소하였고, 감소는 항체 5E11H3를 사용하여 발생하였다(도 8E).
IFN-γ 발현은 항-KTPAF50 처리 후 감소되었고, 이 감소는 시간에 따라 증가하였다(도 9B-9E).
IL-10 발현은 항-KTPAF50 처리 시 억제되었다(도 10A-10D).
이 결과는 KTPAF50-특이적 항체가 TNF-α 및 IFN-γ와 같은 인간 말초 백혈구로부터 선택된 인간 전구염증사이토카인을 하향조절할 수 있다는 것을 증명한다. 따라서, 본원에서 제공되는 단클론성 항체는 인간 자가면역질환, 이식편 거부반응, 및 다른 질환 등을 처리 하기 위한 잠재적인 약물 후보자이다.
C. ELISA 분석을 사용하는 배지 중에서 KTPAF50 존재의 분석.
과정
1. 섹션 B(과정 하 단계 6)의 2개의 대조군 샘플을 Maxisorp 면역플레이트(Maxisorp #442404)에 3개로 각 웰에서 100 ㎕로 장약하였다. 0(zero) 기준으로서, Karyotyping 배지를 또한 3개로 장약하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
2. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS 중에서 300 ㎕ 0.05% TW-20 (Amresco #0777-1L)가 있는 다중-피펫을 사용하여 4회 세척하였다.
3. 플레이트를 PBS 중에서 5% BSA (MP Biomedicals #160069)를 사용하여 차단하였다. 300 ㎕를 각 웰에 장약하였다. 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다.
4. 플레이트를 단계 2에서 설명한 바와 같이 세척하였다.
5. KTPAF50 다클론성 항체(정제된 친화도)를 희석제 중에서 1:250으로 희석하였다(PBS 중에서 0.05% TW-20, 0.1% BSA). 100 ㎕의 항체를 각 웰에 장약하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다.
6. 플레이트를 단계 2에서 설명한 바와 같이 세척하였다.
7. 염소 항-토끼 HRP 콘쥬게이트 항체(Cell signaling #7074)를 희석제 중에서 1:200로 희석하였다. 100 ㎕의 HRP 콘쥬게이트를 각 웰에 장약하였다. 플레이트를 30분 동안 실온에서 진탕하면서 인큐베이션하였다.
8. 플레이트를 단계 2에서 설명한 바와 같이 단지 4회 대신 5회 세척으로세척하였다.
9. 100 ㎕ TMB (Milipore #ES001-500ML)를 각 웰에 장약하였다. 색 발생 후, 50 ㎕ 2N H2SO4 (Frutarom #5552540)를 장약하여 반응을 중단시켰다.
10. 플레이트를 마이크로플레이트 판독기에서 450nm에서 판독하였다.
결과는 도 11에 있고, 상청액에서 KTAPAF50의 존재를 확인하였다.
D. 항-KTPAF50 처리 후 인간 단핵세포의 형태 변화를 광학 현미경을 통해 분석하였다.
과정:
1. 인간 말초 혈액 단핵 세포(HPBMC) (Lonza #CC-2702)를 해동 프로토콜(상기 참조)에 따라서 해동시켰고, 말초 혈액 Karyotyping 배지(Biological Industries 01-201-1B) 중에서 배양하였다.
2. 세포를 4개의 6웰 멀티디쉬 플레이트(Nunc #140675)로 나누었다. 각 웰에서 1M 세포를 2 mL Karyotyping 배지에 장약하였다. 세포를 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다.
3. 인큐베이션 후, 다음의 처리를 각 웰에 첨가하였다:
a. 대조군
b. 100 ㎕의 항-KTPAF50 1 (5E11H3)
c. 10 ㎕의 항-KTPAF50 2 (3E3G7)
d. 100 ng/ml KTPAF50
e. 500 ng/ml KTPAF50
f. 1000 ng/ml KTPAF50
4. 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 120시간 동안 인큐베이션하였고, 광학 현미경(배율 X100) 및 CCD 카메라를 사용하여 시각화하였다(도 15A-15F).
PHA로 처리한 인간 말초 혈액 세포는 거대한 세포의 덩어리의 생성이 급증하였다. 본 결과는 PHA 처리 다음에 항-KTPAF50 단클론성 항체로 처리할 때, 이 세포들의 증식의 완전한 억제가 관찰된다는 것을 명백히 나타낸다. 이것은 항체가 증식의 조절을 위한 강력한 도구로서, 그리고 세포의 원치않는 증식을 수반하는 임의의 질환, 예컨대 암, 염증 과정을 수반하는 질병 등에 대한 치료로서 제공되도록 한다.
Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) CNCMI-4331 20100624 Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM) CNCMI-4335 20100628
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Claims (36)

  1. KTPAF50 단백질 또는 그것의 단편 또는 유도체를 특이적으로 인식하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 KTPAF50 단백질은 SEQ ID NO. 1 또는 SEQ. ID. NO. 2의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
  3. KTPAF50-유래 펩티드를 특이적으로 인식하는 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 KTPAF50-유래 펩티드는 SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6 및 SEQ ID NO. 7 중 어느 하나의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 항체.
  5. KTPAF50 단백질 또는 그것의 단편 또는 유도체를 특이적으로 인식하는 항체를 활성 성분으로서 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 진단 방법에서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 자가면역질환 및 암 중 하나의 진단에서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제5항 또는 제6항에 있어서, 암의 치료에서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제5항 또는 제6항에 있어서, 암 또는 자가면역질환 중 어느 하나의 예후에서 사용을 위한 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 암은 폐, 유방 및 난소암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 염증성 장 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체를 생성하는 항체-생성 셀라인.
  14. 하이브리도마가 3E3G7 또는 5E11H3인, 하이브리도마 셀라인.
  15. 제13항 또는 제14항에서 정의되는 셀라인으로부터 유래된 항체.
  16. 진단 조성물의 제조에서, 제1항 내지 제4항 및 제15항 중 어느 한 항의 항체의 사용.
  17. 제16항에 있어서, 상기 조성물은 암 및 자가면역질환 중 어느 하나의 진단을 위한 것을 특징으로 하는 사용.
  18. 제17항에 있어서, 상기 암은 폐, 유방 및 난소암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
  19. 제17항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 염증성 장 질환인 것을 특징으로 하는 사용.
  20. 치료 조성물의 제조에서, 제1항 내지 제4항 및 제15항 중 어느 한 항의 항체의 사용.
  21. 제20항에 있어서, 상기 조성물은 암, 자가면역질환, 신경퇴행성 질환, 당뇨병 및 이식편 거부반응으로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 사용.
  22. 피험자에서 암의 진단 방법으로서,
    a. 상기 피험자로부터 샘플을 제공받는 단계;
    b. 상기 샘플을 제1항 내지 제4항 및 제15항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 항체, 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계;
    c. 상기 적어도 하나의 항체와 그것의 특이적 항원 사이의 복합체 형성을 검출 수단을 통해 검출하는 단계;
    를 포함하며, 이에 의해 복합체의 검출은 상기 피험자가 암에 걸렸다는 것을 나타내는,
    피험자에서 암의 진단 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 샘플은 혈액 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 항체는 제4항 또는 제15항의 항체이고, 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 피험자에서 자가면역질환의 진단 방법으로서,
    a. 상기 피험자로부터 샘플을 제공받는 단계;
    b. 상기 샘플을 제1항 내지 제4항 및 제15항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 항체, 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물과 접촉시키는 단계;
    c. 상기 적어도 하나의 항체와 그것의 특이적 항원 사이의 복합체 형성을 검출 수단을 통해 검출하는 단계;
    를 포함하며, 이에 의해 복합체의 검출은 상기 피험자가 자가면역질환에 걸렸다는 것을 나타내는,
    피험자에서 자가면역질환의 진단 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 샘플은 혈액샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 자가면역질환은 IBD인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 치료적으로 유효한 양의 적어도 하나의 항-KTPAF50 항체 또는 그것의 조합, 또는 그것을 포함하는 조성물을 필요한 피험자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 치료 방법.
  29. 적어도 하나의 항-KTPAF50 항체 또는 그것의 조합, 또는 그것을 포함하는 조성물의 유효한 양을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 성장을 억제하는 방법.
  30. 적어도 하나의 항-KTPAF50 항체 또는 그것의 조합, 또는 그것을 포함하는 조성물의 유효한 양을 상기 사이토카인을 발현시키는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 사이토카인 발현을 억제하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 사이토카인은 전구-염증사이토카인인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 사이토카인은 TNF-α, IFN-γ 또는 IL-10으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. a. 제1항 내지 제4항 및 제15항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 항체 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물; 및
    b. 샘플 내 상기 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원 존재의 검출을 수행하기 위한 설명서
    를 포함하는, 암의 진단, 치료 효능을 모니터링 또는 예후의 평가 중 어느 하나를 위한 키트.
  34. 제33항에 있어서, 상기 키트는,
    a. 치료되는 샘플을 수집하기 위한 적어도 하나의 수단;
    b. 상기 항체에 의해 상기 항원의 상기 인식의 검출에 필요한 적어도 하나의 시약; 및
    c. 적어도 하나의 대조군 샘플
    중 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  35. a. 제1항 내지 제4항 및 제15항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 항체 또는 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항의 조성물; 및
    b. 샘플 내 상기 항체에 의해 특이적으로 인식되는 항원 존재의 검출을 수행하기 위한 설명서
    를 포함하는, 자가면역질환의 진단 및 치료 효능을 모니터링, 또는 예후의 평가 중 적어도 하나를 위한 키트.
  36. 제35항에 있어서, 상기 키트는,
    a. 시험되는 샘플을 수집하기 위한 적어도 하나의 수단;
    b. 상기 항체에 의해 상기 항원의 상기 인식의 검출에 필요한 적어도 하나의 시약; 및
    c. 적어도 하나의 대조군 샘플
    중 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.

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