KR20120089247A - Ｎ-아실 또는 ｎ-구아니딜 보호된 1,4-뷰테인다이아민 전구체를 통한 1,4-뷰테인다이아민의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 1,4-다이아미노뷰테인[DAB]의 신규 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 DAB의 하나 이상의 N-보호된 전구체를 생체촉매로 생성시킴을 포함하는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하고, a) DAB의 N-보호된 전구체를 생체촉매로 제조하여 DAB의 N-보호된 전구체를 함유하는 생체촉매 반응 혼합물을 수득하는 단계, b) 생체촉매 반응 혼합물로부터 N-보호된 전구체를 회수하는 단계, 및 c) N-보호된 전구체를 DAB로 전환시키는 단계를 포함하는, DAB의 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 DAB의 하나 이상의 N-보호된 전구체가 N5-보호된 오르니틴, N-보호된 DAB 및 N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, DAB의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

Ｎ-아실 또는 Ｎ-구아니딜 보호된 1,4-뷰테인다이아민 전구체를 통한 1,4-뷰테인다이아민의 제조 방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF 1,4-BUTANEDIAMINE VIA N-ACYL OR N-GUANIDYL PROTECTED 1,4-BUTANEDIAMINE PRECURSORS}
본 발명은 하나 이상의 생체촉매(biocatalytic) 사용 단계를 포함하는 1,4-다이아미노뷰테인[DAB]의 제조 방법에 관한 것이다.
화합물 DAB는 동종중합체 형태의 또는 예컨대 약 5중량%의 폴리아마이드-6 단량체(카프로락탐)와 공중합되는 주요 엔지니어링 플라스틱중 일부, 즉 폴리아마이드-4,6을 제조하기 위한 중요한 원료이다. 동종중합체 폴리아마이드-4,6(나일론-4,6)은 1938년에 보고되었다[US-A-2,130,948 호, 캐로더즈(Carothers)]. 이는 단량체 DAB와 아디프산의 중축합 생성물이다. 현재, 네덜란드 소재의 디에스엠(DSM)에서 폴리아마이드-4,6의 특별한 화합물을 생산하여 상표명 스타닐(STANYL)®로 시판하고 있다.
DAB의 합성을 위해 다수의 화학적 경로가 공지되어 있다. 이들 화학적 경로는 출발 물질이 재생불가능한 것으로 생각되는 공급원으로부터 수득되어야 하는 단점을 갖는다. 그러나, 재생가능한 탄소 공급원으로부터 출발하고 생화학적 공정("생물학적 물질 변환"이라고도 일컬어짐)을 이용하는 DAB 합성을 위한 신규의 실행가능한 경로를 제공할 필요가 상당히 존재한다.
하나 이상의 발효 단계를 포함하는 DAB 제조 방법이 WO 2006/005603 호 및 WO 2006/00504 호로 공개된 PCT 출원에 기재된 바 있다. 두 문서는 증가된 수준의 오르니틴 데카복실라제 활성을 갖는 미생물에서의 DAB의 발효에 의한 생산을 기재한다.
본 발명은 DAB를 제조하기 위한 다른 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법은 DAB의 하나 이상의 N-보호된 전구체를 생체촉매로 생성시킨 후 시험관 내에서(in vitro) N-보호된 전구체를 DAB로 전환시킴을 포함하는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함한다.
생체촉매에 의해 생성된 후 DAB를 회수하는 데에는 상당한 어려움이 있는 것으로 밝혀졌다. WO 2007/079944 호에는 DAB 같은 유기 아민의 회수가 기재되어 있다. 상기 문헌에 기재된 특정 실시양태에서는, 아민의 황산염 또는 인산염(따라서, 예컨대 DAB-다이설페이트)을 함유하는 무세포 배양액을 농축시키고 암모니아 같은 염기를 첨가한다. 조건에 따라 2-층 시스템이 형성된다. 주로 유기 화합물을 함유하는 층으로부터 목적하는 아민을 회수할 수 있다.
하나의 실시양태에 따라, DAB의 제조 방법은 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하고, (a) DAB의 N-보호된 전구체를 생체촉매로 제조하여 DAB의 N-보호된 전구체를 함유하는 생체촉매 반응 혼합물을 수득하는 단계, (b) 생체촉매 반응 혼합물로부터 N-보호된 전구체를 회수하는 단계, 및 (c) N-보호된 전구체를 DAB로 전환시키는 단계를 포함한다.
특정 실시양태에 따라, DAB를 생성시키기 위한 본 발명은 N5-보호된 오르니틴, N-보호된 DAB 및 N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 DAB의 하나 이상의 N-보호된 전구체를 생체촉매로 생성시킨 다음, 시험관 내에서 N-보호된 전구체를 DAB로 전환시킴을 포함하는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함한다.
"시험관 내에서의 전환"은 본원에서 세포 외부의 매질에서 DAB의 N-보호된 전구체를 DAB로 전환시킴을 의미한다. 시험관 내에서의 전환은 하나 이상의 생체촉매에 의한 전환일 수 있거나, 또는 하나 이상의 화학적 단계를 포함하는 화학적 전환일 수 있거나, 또는 하나 이상의 생체촉매 사용 단계와 하나 이상의 화학적 단계의 조합일 수 있다.
"DAB의 N-보호된 전구체"란 본원에서 보호된 아미노기를 함유하고 하나 이상의 화학적 반응 또는 생체촉매 반응 또는 화학적 반응과 생체촉매 반응의 조합에 의해 DAB로 전환될 수 있는 화합물을 의미한다.
"N5-보호된 오르니틴"은 본원에서 그의 N5 원자에 보호기를 갖는 오르니틴 분자를 의미하고; "N-보호된 DAB"는 본원에서 그의 아미노기중 하나에 보호기를 갖는 DAB 분자를 의미하며; "N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드"란 본원에서 아미노기에 보호기를 갖는 4-아미노뷰티르알데하이드 분자를 의미한다.
상기에서 언급된 보호기는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 아실 부류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있거나 또는 구아니딜기일 수 있다. 이러한 보호기는 생체촉매에 의한 생성, 생체촉매 반응 혼합물(예를 들어, 발효액)로부터의 N-보호된 전구체의 회수의 용이성 및 궁극적으로 DAB를 생성시키기 위한 후속 생체촉매 반응 및/또는 화학적 반응중 하나 이상을 허용하도록 선택되어야 한다.
예를 들어 4-아미노뷰티르알데하이드 또는 오르니틴을 아실화시킴으로써, 예를 들어 폼산 중에서 아세트산 무수물로 아실화시켜 폼일 보호기를 생성시킴으로써, 또는 C2 내지 C6 카복실산 무수물 또는 아실 클로라이드를 반응시켜 각각 N-아세틸, N-프로피온일, N-뷰티릴, N-발레릴 또는 N-카프로일 보호기를 도입함으로써, N-보호된 DAB 전구체를 제조할 수 있다.
N-구아니딜 보호된 전구체는 예를 들어 단백질 발생성(proteinogenic) 아르기닌 또는 N-구아니딜-아미노뷰티르알데하이드 또는 N-구아니딜-DAB이다. 발효 경로는 예컨대 EP 1260588 호에 기재되어 있는데, 이 문헌은 아르기닌 데카복실라제의 영향하에 아르기닌으로부터 아그마틴을 생화학적으로 생성시킴을 기재한다. 아그마틴은 N-구아니딜-보호된 DAB이다. 산성 가수분해에 의해, 예를 들어 진한 염산 또는 황산 같은 진한 무기산 수용액 중에서 아그마틴을 환류시킴으로써, 아그마틴(N-구아니딜-보호된 DAB)을 순탄하게 탈보호할 수 있다. 이는 DAB의 이산 염 및 부산물인 이산화탄소와 암모니아(암모니아는 사용되는 무기산의 암모늄 염의 형태)를 생성시킨다. DAB를 그의 유리 아민 형태로 수득하기 위하여, 생성된 이산 염을 단리하고 재용해시킨 후 염기로 중화시켜야 한다.
추가의 특정 실시양태에 따라, 본 발명은 N5-아세틸 오르니틴, N-아세틸 DAB 및 N-아세틸 4-아미노뷰티르알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 DAB의 하나 이상의 N-보호된 전구체를 생성시키는, DAB의 제조 방법에 관한 것이다.
하나의 특정 실시양태에 따라, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법은 (a) N5-아세틸 오르니틴을 생체촉매로 제조하여 N5-아세틸 오르니틴을 함유하는 생체촉매 반응 혼합물을 수득하는 단계, (b) 생체촉매 반응 혼합물로부터 N5-아세틸 오르니틴을 회수하는 단계, 및 (c) N5-아세틸 오르니틴을 DAB로 전환시키는 단계를 포함한다.
하나의 특정 실시양태에 따라, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법은 (a) N-아세틸 DAB를 생체촉매로 제조하여 N-아세틸 DAB를 함유하는 생체촉매 반응 혼합물을 수득하는 단계, (b) 생체촉매 반응 혼합물로부터 N-아세틸 DAB를 회수하는 단계, 및 (c) N-아세틸 DAB를 DAB로 전환시키는 단계를 포함한다.
하나의 특정 실시양태에 따라, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법은 (a) N-아세틸 4-아미노뷰티르알데하이드를 생체촉매로 제조하여 N-아세틸 4-아미노뷰티르알데하이드를 함유하는 생체촉매 반응 혼합물을 수득하는 단계, (b) 생체촉매 반응 혼합물로부터 N-아세틸 4-아미노뷰티르알데하이드를 회수하는 단계, 및 (c) N-아세틸 4-아미노뷰티르알데하이드를 DAB로 전환시키는 단계를 포함한다.
본원에서 아민 또는 N-보호된 아민, 예컨대 N-보호된 DAB를 명시적으로 또는 암시적으로 칭하는 경우, 이들 용어는 중성 아민기, 상응하는 하전된 양성자화된 아민뿐만 아니라 이들의 염을 포함하는 의미이다.
도 1은 N-Ac-오르니틴의 N-Ac-DAB로의 생물학적 전환의 최종 시간(end time) 샘플의 TLC이다. 1) 글루탐에이트 DC; 2) 아스파테이트 DC; 3) LysA; 4) KdcA; 5) KivD; 6) Kgd; 7) 라이신 DC; 8) ODC LJ110; 9) ODC DH5α; 10) 효소 블랭크; 11) 화학적 블랭크; 12) N-Ac-오르니틴 기준 샘플; 13) N-Ac-DAB 기준 샘플; 14) N-Ac-오르니틴 및 N-Ac-DAB 기준 샘플.
정의
본원에 사용되는 용어 "또는"은 달리 규정되지 않는 한 "및/또는"으로 정의된다.
본원에 사용되는 용어 "하나"는 달리 규정되지 않는 한 "하나 이상"으로서 정의된다.
명사(예를 들어, 화합물, 첨가제 등)를 단수형으로 칭하는 경우, 복수형이 포함되는 의미이다.
입체 이성질체가 존재하는 화합물을 일컫는 경우, 화합물은 이러한 입체 이성질체중 임의의 것 또는 이들의 조합일 수 있다. 따라서, 예컨대 거울상이성질체가 존재하는 아미노산이 칭해지는 경우, 아미노산은 L-거울상이성질체 또는 D-거울상이성질체 또는 이들의 조합일 수 있다. 천연 입체 이성질체가 존재하는 경우, 화합물은 바람직하게는 천연 입체 이성질체이다.
괄호 사이에 효소 부류(EC)를 인용하면서 효소를 언급하는 경우, 효소 부류는 생화학 및 분자 생물학 국제 연합의 명명 위원회(NC-IUBMB)에 의해 제공되는 효소 명명법에 기초하여 효소를 분류하거나 분류할 수 있는 부류이며, 이 명명법은 웹사이트(http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)에서 찾아볼 수 있다. (아직) 규정된 부류로 분류되지 않았지만 그렇게 분류될 수 있는 다른 적합한 효소가 포함되는 의미이다.
용어 "동종성" 또는 "호몰로그(homolog)" 또는 "오솔로그(ortholog)"는 기능상의 관계를 갖고 일반적으로 서열 동일성 정도에 기초하여 결정되는 관련 서열을 가리킨다. 이들 용어는 하나의 종, 아종, 변종, 재배종 또는 균주에서 발견되는 유전자와 다른 종, 아종, 변종, 재배종 또는 균주에서의 상응하는 또는 대등한 유전자 사이의 관계를 기재할 수 있다. 이들은 또한 자연에서 발견되는 유전자와 인공적으로 구축된 유전자 사이의 관계, 또는 2개의 인공적으로 구축된 유전자 사이의 관계를 기재할 수도 있다. 기능적인 관계는 (a) 서열 동일성의 정도; 및 (b) 동일하거나 유사한 생물학적 기능을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 다수의 방식중 임의의 하나로 표시될 수 있다. 바람직하게는 (a) 및 (b) 둘 다 표시된다. 용어 호몰로그는 또한 유전 암호의 축퇴로 인해 다른 핵산 서열과는 상이하고 동일한 폴리펩타이드 서열을 코딩하는 핵산 서열(폴리뉴클레오타이드 서열)을 포함하는 의미이다.
폴리펩타이드와 관련하여 용어 "호몰로그"가 본원에서 사용되는 경우, 이는 기준 폴리펩타이드와 동일하거나 유사한 생물학적 기능 및 특정 정도의 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 가리키고자 한다. 특히, 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 65% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 특히 85% 이상, 더욱 특히 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내고자 한다.
"서열 동일성" 또는 "서열 유사성"은 본원에서, 서열을 비교함으로써 결정되는, 둘 이상의 폴리펩타이드 서열 또는 둘 이상의 핵산 서열 사이의 관계로서 정의된다. 통상적으로, 서열 동일성 또는 유사성은 서열의 전체 길이에 걸쳐 비교되지만, 서로 정렬된 서열의 일부에 대해서만 비교될 수도 있다. 당분야에서, "동일성" 또는 "유사성"은 또한, 서열 사이에서의 매치(match)에 의해 결정되는, 경우에 따라 폴리펩타이드 서열 또는 핵산 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. 동일성 또는 유사성을 결정하는 바람직한 방법은 시험되는 서열이 가장 잘 매치되도록 디자인된다. 본 발명과 관련하여, 두 서열 사이의 동일성 및 유사성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 NCBI 및 다른 공급처로부터 공개적으로 구입가능한 BLASTP 및 BLASTN[앨츌(Altschul, S. F.) 등, J. Mol. Biol. 1990, 215, 403-410]을 포함한다(BLAST 매뉴얼, 앨츌 등, NCBI NLM NIH, 메릴랜드주 20894 베데스다). BLASTP를 사용하여 폴리펩타이드 서열을 비교하는데 바람직한 매개변수는 갭 개방 10.0, 갭 연장 0.5, 블로섬(Blosum) 62 매트릭스이다. BLASTN을 사용하여 핵산 서열을 비교하는데 바람직한 매개변수는 갭 개방 10.0, 갭 연장 0.5, DNA 풀(full) 매트릭스(DNA 동일성 매트릭스)이다.
"생물학적 물질 변환" 또는 "생체촉매 반응"은 본원에서 효소가 촉매로서 사용되는 생화학적 반응을 의미한다. 본원의 본 발명에 따라, 생체촉매가 사용되는 것으로 표시되면, 방법의 하나 이상의 반응 단계가 생물학적 물질 또는 생물학적 공급원으로부터 유래되는 잔기, 예를 들어 생물체 또는 그로부터 유래되는 생체 분자에 의해 촉진된다. 특히, 생물학적 물질 변환은 발효 단계일 수 있다. 생체촉매는 특히 하나 이상의 효소를 포함할 수 있다. 생체촉매는 임의의 형태로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서는, 하나 이상의 효소가 자연 환경으로부터 단리되어(그가 생성되는 생물체로부터 단리되어), 예를 들어 용액, 유화액, 분산액, 동결 건조된 세포(의 현탁액), 용해물로서, 또는 지지체상에 고정되어 사용된다. 하나의 실시양태에서는, 하나 이상의 효소가 살아있는 생물체(예컨대 살아있는 전세포)의 일부를 구성한다. 효소는 세포 내부에서 촉매 기능을 수행할 수 있다. 세포가 존재하는 배지 중으로 효소를 분비시키는 것도 가능하다.
"생체촉매 반응 혼합물"이란 본원에서 생체촉매 반응이 일어나는 환경을 의미한다. 이는 세포 환경(세포내 또는 세포외 생체촉매 반응의 경우) 또는 무세포 환경일 수 있다.
"발효 단계"는 본원에서 단세포 숙주에서, 더욱 특히는 세포 배양액중 미생물에서 특정 화합물의 형성 또는 전환이 수행되는 공정 단계를 의미한다. "발효로 제조한다"는 것은 본원에서 발효가능한 탄소 공급원을 갖는 세포 배양액중의 생체촉매를 포함하는 미생물에서 특정 화합물을 생성시킴을 의미하며, 이 때 탄소 공급원은 제조되어야 하는 특정 화합물로 전환되어야 하는 상기 화합물중 임의의 것을 함유하거나 또는 세포는 탄소 공급원으로부터 제조되어야 하는 특정 화합물로 전환되어야 하는 화합물을 제조한다. 미생물은 특정 화합물의 천연 생산자(producer)일 수 있거나 또는 이는 재조합 DNA 기법을 이용하여 하나 이상의 적합한 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환됨으로써 특정 화합물을 생성시키는 능력을 수득할 수 있다. 특정 화합물의 천연 생산자는 또한 목적하는 특정 화합물의 생성을 증가시키고/시키거나 목적하는 특정 화합물의 생산성을 방해할 수 있거나 본 발명에 따른 공정의 추가적인 단계를 방해하는 성분의 생성을 감소시키기 위하여 제조합 DNA 기법을 이용하여 하나 이상의 적합한 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환될 수도 있다.
발효에 의해 DAB의 N-보호된 전구체를 제조하는데 바람직한 미생물은 진핵 또는 원핵 기원일 수 있다. 특히 이는 동물(사람 포함) 세포, 식물 세포, 세균, 고세균, 효모 및 진균으로부터 선택될 수 있다. 더욱 특히, 미생물은 바실러스(Bacillus)[특히, 바실러스 서브틸리스(B. subtilis)], 브레비박테륨(Brevibacterium)[특히, 브레비박테륨 케토글루타미쿰(B. ketoglutamicum)], 코리네박테륨[특히, 코리네박테륨 글루타미쿰(C. glutamicum)], 에스케리치아(Escherichia)[특히, 에스케리치아 콜라이(E. coli)], 클렙시엘라(Klebsiella)[특히, 클렙시엘라 뉴모니애(K. pneumoniae)], 락토바실러스[특히, 락토바실러스 락티스(L. lactis)], 프로피오니박테륨, 슈도모나스(특히, 슈도모나스 푸티다(P. putida)], 로도코커스[특히, 로도코커스 에리트로폴리스(R. erythropolis)], 스트렙토마이세스(Streptomyces)[특히, 스트렙토마이세스 코엘리콜(S. coelicor) 및 스트렙토마이세스 클라불리게루스(S. clavuligerus)] 같은 세균; 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)[특히, 클루이베로마이세스 락티스(K. lactis)], 페니실륨(Penicillium)[특히, 페니실륨 크리소게눔(P. chrysogenum)], 사카로마이세스(Saccharomyces)[특히, 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae)], 아스퍼길러스(Aspergillus)[특히, 아스퍼길러스 니거(A. niger)], 피키아(Pichia)[특히, 피키아 파스토리스(P. pastoris)], 한세눌라(Hansenula), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)[특히, 쉬조사카로마이세스 폼베(S. pombe)], 야로위아(Yarowia)[특히, 야로위아 라이폴리티카(Y. lypolytica)] 같은 효모; 탈라로마이세스(Talaromyces) 같은 진균으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
가장 바람직한 실시양태에서, N-보호된 전구체의 발효에 의한 생산은 미생물에서 이루어지는데, 이 때 N-보호된 전구체는 생체 내에서 형성된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 N-보호된 전구체의 제조는 임의의 적합한 탄소 공급원으로부터 N-보호된 전구체로의 생물학적 물질 변환이다.
발효 공정의 탄소 공급원은 특히 일가 알콜, 다가 알콜, 카복실산, 이산화탄소, 지방산 및 글라이세라이드로 이루어진 군(상기 화합물중 임의의 것을 포함하는 혼합물 포함)으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물을 함유한다. 적합한 일가 알콜은 메탄올 및 에탄올을 포함한다. 적합한 폴리올은 글라이세롤 및 탄수화물을 포함한다. 적합한 지방산 또는 글라이세라이드는 특히 식용유, 바람직하게는 식물 기원의 식용유 형태로 제공될 수 있다.
특히 탄수화물을 사용할 수 있는데, 통상적으로 탄수화물은 농업과 관련된 생성물, 바람직하게는 농업 폐기물 같은 생물학적으로 재생가능한 공급원으로부터 다량 수득될 수 있기 때문이다. 바람직하게는, 탄수화물은 글루코즈, 프럭토즈, 슈크로즈, 락토즈, 사카로즈, 전분, 셀룰로즈 및 헤미-셀룰로즈로 이루어진 군으로부터 선택되어 사용된다. 글루코즈, 글루코즈를 포함하는 올리고사카라이드 및 글루코즈를 포함하는 폴리사카라이드가 특히 바람직하다.
또한, 탄소 공급원으로서 아미노산 또는 이들의 유도체, 글루탐에이트 또는 그의 유도체, 및/또는 오르니틴 또는 그의 유도체를 사용할 수 있다.
질소 공급원으로서 암모니아, 암모니아 염, 우륨(ureum), 나이트레이트 및 나이트라이트 같은 무기 질소-함유 화합물, 또는 아미노산 또는 이들의 유도체 같은 유기 질소-함유 화합물, 더욱 구체적으로는 글루탐에이트 또는 그의 유도체 및/또는 오르니틴 또는 그의 유도체를 사용할 수 있다.
본원에서 생체촉매를 인용하는 경우, 이는 생체촉매 기능과 관련된 하나 이상의 효소를 발현하는 생물체를 나타낼 수 있거나, 또는 이는 생물체로부터 수득되거나 유래되는 하나 이상의 효소를 나타낼 수 있다. 생물체는 원핵 또는 진핵 생물체일 수 있다. 구체적으로, 생물체는 동물(사람 포함), 식물, 세균, 고세균, 효모 및 진균으로부터 선택될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 생체촉매는 동물, 특히 그의 일부, 예를 들어 간, 췌장, 뇌, 신장, 심장 또는 다른 기관으로부터 유래된다. 동물은 구체적으로 포유동물로부터 선택될 수 있고, 더욱 구체적으로 영장류[호모 사피엔스(Homo sapiens) 등], 토끼과(Leporidae), 쥐과(Muridae), 멧돼지과(Suidae) 및 소과(Bovidae)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
생체촉매의 기원으로서 적합한 식물은 구체적으로 고사리과(Asplenium); 박과(Cucurbitaceae), 특히 호박(Cucurbita), 예를 들어 쿠쿨비타 모스카타(Cucurbita moschata)(호박) 또는 오이(Cucumis); 산쪽풀(Mercurialis), 예를 들어 머쿠리알리스 페레니스(Mercurialis perennis); 대풍자(Hydnocarpus); 및 캐럽콩(Ceratonia)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물이다.
생체촉매의 기원으로서 적합한 세균은 구체적으로 아시네토박터(Acinetobacter), 아그로박테륨(Agrobacterium), 알칼리게네스(Alcaligenes), 바실러스, 브레비박테륨, 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테륨, 데이노코커스(Deinococcus), 엔테로박터(Enterobacter), 엔테로코커스(Enterococcus), 어위니아(Erwinia), 에스케리치아, 게오바실러스(Geobacillus), 클렙시엘라, 락토바실러스, 락토코커스(Lactococcus), 레기오넬라(Legionella), 마이코박테륨(Mycobacterium), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 노보스핑고븀(Novosphingobium), 파라코커스(Paracoccus), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스, 랄스토니아(Ralstonia), 로도박터(Rhodobacter), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스타필로코커스(Staphylococcus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 스트렙토마이세스, 써무스(Thermus), 비브리오(Vibrio) 및 자이모모나스(Zymomonas)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
생체촉매의 기원으로서 적합한 고세균은 구체적으로 애로피룸(Aeropyrum), 아캐오글로부스(Archaeoglobus), 할로박테륨(Halobacterium), 메타노박테륨(Methanobacterium), 메타노브레비박터(Methanobrevibacter), 메타노칼도코커스(Methanocaldococcus), 메타노코커스(Methanococcus), 메타노피루스(Methanopyrus), 메타노살시나(Methanosarcina), 메타노스패라(Methanosphaera), 파이로바쿨룸(Pyrobaculum) 및 써모플라즈마(Thermoplasma)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
생체촉매의 기원으로서 적합한 진균은 구체적으로 아스퍼길러스, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실륨, 리조푸스(Rhizopus) 및 트리코더마(Trichoderma)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
생체촉매의 기원으로서 적합한 효모는 구체적으로 칸디다(Candida), 사이토파기아(Cytophagia ), 한세눌라, 후미콜라(Humicola), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 무콜(Mucor), 리조크토니아(Rhizoctonia), 사카로마이세스 및 야로위아(Yarrowia)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
당 업자는 적합한 활성을 갖는 천연 발생 생체촉매(야생형) 또는 천연 발생 생체촉매의 돌연변이체를 본 발명에 따른 방법에 사용할 수 있음을 명백히 알 것이다. 예를 들어 분자 진화 또는 이성적 디자인 같은 당업자에게 공지되어 있는 생물학적 기법에 의해 천연 발생 생체촉매의 특성을 개선할 수 있다. 예를 들어 당업자에게 공지되어 있는 돌연변이 발생 기법(임의 돌연변이 발생, 부위-지향적인 돌연변이 발생, 방향 진화, 유전자 재조합 등)을 이용하여, 생체촉매로서 작용할 수 있거나 생체촉매 잔기(예컨대 효소)를 생성시킬 수 있는 생물체의 코딩 DNA를 변형시킴으로써 야생형 생체촉매의 돌연변이체를 제조할 수 있다. 구체적으로는, DNA가 야생형 효소와 하나 이상의 아미노산이 상이한 효소를 코딩하여 DNA가 야생형과 비교하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 효소를 코딩하도록, 또는 돌연변이체가 둘 이상의 모 효소의 서열을 합하도록, 또는 이렇게 변형된 DNA를 적합한 (숙주) 세포에서 발현시킴으로써, DNA를 변형시킬 수 있다. 후자의 경우는, 예컨대 WO 2008/000632 호에 기재된 방법에 기초하여, 코돈 최적화 또는 코돈 쌍 최적화 같은 당업자에게 공지되어 있는 방법에 의해 달성할 수 있다.
돌연변이 생체촉매는 예를 들어 다음과 같은 면중 하나 이상과 관련하여 개선된 특성을 가질 수 있다: 기질에 대한 선택성, 활성, 안정성, 용매 저항성(tolerance), pH 프로파일, 온도 프로파일, 기질 프로파일, 저해에 대한 감수성, 보조 인자 이용효율 및 기질-친화력. 당업자에게 공지되어 있는 방법에 기초하여 예를 들어 적합한 고 처리량 선별 또는 선택 방법을 적용함으로써 개선된 특성을 갖는 돌연변이체를 동정할 수 있다.
특정 공급원으로부터의 생체촉매, 구체적으로는 효소를 언급함에 있어서, 공여 생물체로부터 유래되지만 (유전자 변형된) 숙주 생물체에서 실제로 생성되는 재조합 생체촉매, 구체적으로는 효소는 상기 첫 번째 생물체로부터의 생체촉매, 구체적으로는 효소로서 포함됨을 구체적으로 의미한다.
본 발명과 관련하여 임의의 생체촉매 사용 단계의 반응 조건은 생체촉매, 특히 효소에 대해 공지되어 있는 조건, 본원에 개시되어 있는 정보 및 임의적으로는 일부 통상적인 실험에 따라 선택될 수 있다.
사용되는 반응 매질의 pH는 생체촉매가 그 pH 조건하에서 활성인 한 넓은 한계 내에서 선택될 수 있다. 생체촉매 및 다른 인자에 따라 알칼리성, 중성 또는 산성 조건을 이용할 수 있다. 방법이 예를 들어 본 발명의 방법을 촉진하는 효소를 발현시키기 위하여 미생물을 사용함을 포함하는 경우, pH는 미생물이 그의 의도되는 기능 또는 기능들을 수행할 수 있도록 선택된다. pH는 본질적으로 25℃의 수성 시스템의 경우 중성 pH보다 4 pH 단위 아래 및 중성 pH보다 2 pH 단위 위의 범위 내에서, 즉 pH 3 내지 pH 9에서 구체적으로 선택될 수 있다. 물이 유일한 용매이거나 또는 우세한 용매(전체 액체를 기준으로 하여 50중량보다 많고, 특히 90중량%보다 많음)인 경우 시스템은 수성인 것으로 생각되는데, 이 때 예컨대 소량의 알콜 또는 다른 용매(전체 액체를 기준으로 하여 50중량% 미만, 특히 10중량% 미만)는 존재할 수 있는 미생물이 활성을 유지하도록 하는 농도로 용해될 수 있다(예컨대, 탄소 공급원으로서). 특히 효모 및/또는 진균이 사용되는 경우, 산성 조건이 바람직할 수 있으며, 구체적으로 pH는 본질적으로 25℃의 수성 시스템에 기초하여 pH 3 내지 pH 8일 수 있다. 요구되는 경우, 산 및/또는 염기를 사용하여 pH를 조정하거나 또는 산과 염기의 적합한 조합으로 pH를 완충시킬 수 있다.
생체촉매가 충분한 활성 및/또는 생육을 나타내는 한, 배양 조건은 넓은 한계 내에서 선택될 수 있다. 이는 호기성, 미세호기성, 산소 제한 및 혐기성 조건을 포함한다.
혐기성 조건은 본원에서 산소가 전혀 없거나 또는 생체촉매, 특히 미생물에 의해 산소가 실질적으로 소비되지 않는 조건으로서 정의되며, 통상 5밀리몰/l.h 미만의 산소 소비, 특히 2.5밀리몰/l.h 미만 또는 1밀리몰/l.h 미만의 산소 소비에 상응한다.
호기성 조건은 제한되지 않는 생육에 충분한 수준의 산소가 매질에 용해되어 있고, 10밀리몰/l.h 이상, 더욱 바람직하게는 20밀리몰/l.h 이상, 더욱더 바람직하게는 50밀리몰/l.h 이상, 가장 바람직하게는 100밀리몰/l.h 이상의 산소 소비 속도를 뒷받침할 수 있는 조건이다.
산소-제한 조건은 기체로부터 액체로의 산소 전달에 의해 산소 소비가 제한되는 조건으로서 정의된다. 산소-제한 조건의 하한은 혐기성 조건의 상한, 즉 통상 1밀리몰/l.h 이상, 특히 2.5밀리몰/l.h 이상, 또는 5밀리몰/l.h 이상에 의해 결정된다. 산소-제한 조건의 상한은 호기성 조건의 하한, 즉 100밀리몰/l.h 미만, 50밀리몰/l.h 미만, 20밀리몰/l.h 미만, 또는 10밀리몰/l.h 미만에 의해 결정된다.
조건이 호기성, 혐기성 또는 산소 제한인지의 여부는 방법을 수행하는 조건에 따라, 구체적으로는 들어가는 기류의 양 및 조성, 사용되는 기기의 실제 혼합/질량 전달 특성, 사용되는 미생물의 유형 및 미생물 농도에 의해 달라진다.
사용되는 온도는 생체촉매, 특히 효소가 실질적인 활성을 나타내는 한 중요하지 않다. 일반적으로, 온도는 0℃ 이상, 특히 15℃ 이상, 더욱 특히 20℃ 이상일 수 있다. 목적하는 최대 온도는 생체촉매에 따라 달라진다. 일반적으로, 이러한 최대 온도는 당분야에 공지되어 있거나(예를 들어, 시판되는 생체촉매의 경우 제품 데이터 시트에 표시됨), 또는 통상적인 일반 지식 및 본원에 개시된 정보에 기초하여 통상적으로 결정될 수 있다. 온도는 통상 90℃ 이하, 바람직하게는 70℃ 이하, 특히 50℃ 이하, 더욱 특히 40℃ 이하이다.
특히 생체촉매 반응이 숙주 생물체 외부에서 수행되는 경우에는, 반응 매질에서 충분한 활성을 보유하는 효소가 사용되는 경우 유기 용매를 높은 농도로(예를 들어, 50% 이상, 또는 90중량% 이상) 포함하는 반응 매질을 사용할 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 DAB의 N-보호된 전구체로서 N5-보호된 오르니틴을 생성시키는 생체촉매 공정에 관한 것이다. 예를 들어, N5-아세틸 오르니틴은 하기 효소-촉진되는 반응중 하나 이상을 포함할 수 있다:
1) 글루탐에이트의 N-아세틸 글루탐에이트로의 전환;
2) N-아세틸-글루탐에이트의 N-아세틸-글루탐에이트 5-포스페이트로의 전환;
3) N-아세틸-글루탐에이트 5-포스페이트의 N-아세틸-글루탐에이트 세미알데하이드로의 전환;
4) N-아세틸-글루탐에이트 세미알데하이드의 N2-아세틸-오르니틴으로의 전환; 및
5) N2-아세틸-오르니틴의 N5-아세틸-오르니틴으로의 전환.
반응 1)은 아실트랜스퍼라제(EC 2.3.1)로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 아미노산 N-아세틸트랜스퍼라제(EC 2.3.1.1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소에 의해 촉진될 수 있다. 바람직하게는, 효소는 아세틸기 공여체로서 아세틸-CoA 및 아세틸기 수용체로서 글루탐에이트에 대해 특이적이다. 아미노산 N-아세틸트랜스퍼라제는 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 반응 1)을 촉진할 수 있는 예시적인 단백질이 유니프롯(Uniprot) 데이터베이스에서의 이들의 수납 번호 및 이들의 공급원인 (미)생물과 함께 표 1에 기재된다.
반응 2)는 아세틸-글루탐에이트 키나제(EC 2.7.2.8)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소에 의해 촉진될 수 있다. 효소는 보조 인자로서 ATP를 사용할 수 있다. 아세틸-글루탐에이트 키나제는 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 반응 2)를 촉진할 수 있는 예시적인 단백질이 유니프롯에서의 이들의 수납 번호 및 이들의 공급원인 (미)생물과 함께 표 1에 기재된다.
반응 3)은 옥시도리덕타제(EC 1.2.1)로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 N-아세틸-감마-글루탐일-포스페이트 리덕타제(EC 1.2.1.38)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소에 의해 촉진될 수 있다. 효소는 보조 인자로서 NADH 또는 NADPH를 사용할 수 있다. N-아세틸-감마-글루탐일-포스페이트 리덕타제는 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 반응 3)을 촉진할 수 있는 예시적인 단백질이 유니프롯에서의 이들의 수납 번호 및 이들의 공급원인 (미)생물과 함께 표 1에 기재된다.
반응 4)는 트랜스아미나제(EC 2.6.1)로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 아세틸오르니틴 트랜스아미나제(EC 2.6.1.11)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소에 의해 촉진될 수 있다. 효소는 아미노기 공여체로서 글루탐에이트를 사용할 수 있다. 아세틸오르니틴 트랜스아미나제는 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 반응 4)를 촉진할 수 있는 예시적인 단백질이 유니프롯에서의 이들의 수납 번호 및 이들의 공급원인 (미)생물과 함께 표 1에 기재된다.
반응 5)는 글루탐에이트 N-아세틸트랜스퍼라제(EC 2.3.1.35) 같은 N-아실트랜스퍼라제에 의해 촉진될 수 있다.
글루탐에이트는 당분야에 널리 공지되어 있는 글루탐에이트 생합성 반응을 통해 적합한 탄소 공급원으로부터 유도될 수 있다. 바람직하게는, 다량의 글루탐산을 축적하는 미생물, 예를 들어 코리네박테륨 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)을 이용한다. 예를 들어 유전공학에 의해 글루탐산 생산을 개선하는 방법이 당분야에 널리 공지되어 있다[기무라(Kimura E.), Adv Biochem Eng Biotechnol. 2003; 79: 37-57].
다르게는, N5-아세틸 오르니틴의 제조는 하기 효소-촉진되는 반응중 하나 이상을 포함할 수 있다:
6) 글루탐에이트의 N-아세틸-글루탐에이트로의 전환;
7) N-아세틸-글루탐에이트 및 오르니틴의 N2-아세틸-오르니틴으로의 전환; 및
8) N2-아세틸-오르니틴의 N5-아세틸-오르니틴으로의 전환.
반응 단계 1 내지 8의 효소
반응 단계 유니프롯
수납 번호		 효소 미생물
1/6 P0A6C5 아미노산 아세틸트랜스퍼라제 에스케리치아 콜라이
1/6 P40360 아미노산 아세틸트랜스퍼라제, 미토콘드리아 사카로마이세스 세레비지애
2 Q01217 단백질 ARG5,6, 미토콘드리아 사카로마이세스 세레비지애
2 P0A6C8 아세틸글루탐에이트 키나제 에스케리치아 콜라이
3 Q01217 단백질 ARG5,6, 미토콘드리아 사카로마이세스 세레비지애
3 Q8ZKL8 N-아세틸-감마-글루탐일-포스페이트 리덕타제 살모넬라 타이피무륨
4 P18335 아세틸오르니틴/석신일다이아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제 에스케리치아 콜라이
4 P18544 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라제 사카로마이세스 세레비지애
5/7/8 Q04728 아르기닌 생합성 이작용성 단백질 ARG7, 미토콘드리아 사카로마이세스 세레비지애
5/7/8 Q9HW04 글루탐에이트 N-아세틸트랜스퍼라제 슈도모나스 애루기노사
(Pseudomonas aeruginosa)
5/7/8 Q59280 글루탐에이트 N-아세틸트랜스퍼라제 코리네박테륨 글루타미쿰
반응 6)은 반응 1)과 동일하고 동일한 유형의 효소에 의해 촉진될 수 있다.
반응 7)은 아실트랜스퍼라제(EC 2.3.1), 바람직하게는 글루탐에이트 N-아세틸트랜스퍼라제(EC 2.3.1.35)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소에 의해 촉진될 수 있다. 바람직하게는, 효소는 아세틸기 수용체로서 오르니틴을 사용함으로써, 반응 생성물로서 글루탐에이트 및 N-아세틸-오르니틴을 생성시킨다. 글루탐에이트 N-아세틸트랜스퍼라제는 가수분해 생성물로서 글루탐에이트와 아세테이트를 생성시키는, N-아세틸-글루탐에이트에 대한 가수분해 활성을 갖는다. 바람직하게는, 사용되는 효소는 검출가능한 가수분해 활성을 갖지 않거나; 다르게는, 가수분해 활성이 야생형 효소에 비해 상당히 더 낮도록 야생형 효소를 적합화시킬 수 있다. 글루탐에이트 N-아세틸트랜스퍼라제는 원핵생물 또는 진핵생물로부터 유래될 수 있다. 반응 7)을 촉진할 수 있는 예시적인 단백질이 유니프롯에서의 이들의 수납 번호 및 이들의 공급원인 (미)생물과 함께 표 1에 기재되어 있다.
반응 8)은 반응 5와 동일하고 동일한 효소에 의해 촉진될 수 있다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 N5-보호된 오르니틴으로부터 N-보호된 DAB를 생성시키는 생체촉매 공정에 관한 것이다. 일반적으로, 적합한 데카복실라제는 N5-보호된 오르니틴이 N-보호된 DAB로 전환되는 것을 촉진할 수 있는 N5-보호된 오르니틴 데카복실라제 활성을 갖는다.
N5-보호된 오르니틴을 탈카복실화시킬 수 있는 효소는 특히 데카복실라제(E.C. 4.1.1)로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 오르니틴 데카복실라제(EC 4.1.1.17), 다이아미노피멜레이트 데카복실라제(EC 4.1.1.20), 분지쇄 알파-케토산 데카복실라제(EC 4.1.1.72), 알파-케토아이소발레레이트 데카복실라제 및 알파-케토글루타레이트 데카복실라제(EC 4.1.1.71)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
하나 이상의 다른 적합한 데카복실라제는 옥살레이트 데카복실라제(EC 4.1.1.2), 아세토아세테이트 데카복실라제(EC 4.1.1.4), 발린 데카복실라제/류신 데카복실라제(EC 4.1.1.14), 아스파테이트 1-데카복실라제(EC 4.1.1.11), 3-하이드록시글루탐에이트 데카복실라제(EC 4.1.1.16), 라이신 데카복실라제(EC 4.1.1.18), 아르기닌 데카복실라제(EC 4.1.1.19), 2-옥소글루타레이트 데카복실라제(EC 4.1.1.71) 및 다이아미노뷰티레이트 데카복실라제(EC 4.1.1.86)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
데카복실라제는 특히 호박; 오이; 효모; 진균, 예를 들어 칸디다 플라레리(Candida flareri), 한세눌라(Hansenula) 종, 클루이베로마이세스 막시아누스(Kluyveromyces marxianus), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa), 리조푸스 야바니쿠스(Rhizopus javanicus) 및 사카로마이세스 세레비지애; 포유동물, 특히 포유동물의 뇌; 및 바실러스 카다베리스(Bacillus cadaveris), 에스케리치아 콜라이, 락토코커스 락티스, 마이코박테륨 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 슈도모나스 종 및 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 같은 세균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물체의 데카복실라제일 수 있다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드를 거쳐 N-보호된 DAB를 생성시키는 생체촉매 공정에 관한 것이다. 예를 들어, N-아세틸-DAB의 제조는 하기 효소-촉진되는 반응중 하나 이상을 포함할 수 있다:
9) 글루탐에이트의 4-아미노뷰티레이트로의 전환;
10) 4-아미노뷰티레이트의 N-아세틸-4-아미노뷰티레이트로의 전환;
11) N-아세틸-4-아미노뷰티레이트의 N-아세틸-4-아미노뷰티르알데하이드로의 전환; 및
12) N-아세틸-4-아미노뷰티르알데하이드의 N-아세틸-DAB로의 전환.
반응 9)는 데카복실라제(EC 4.1.1)로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 글루탐에이트 데카복실라제(EC 4.1.1.15)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소에 의해 촉진될 수 있다. 글루탐에이트 데카복실라제는 원핵생물 또는 진핵생물 또는 고세균으로부터 유래될 수 있다.
반응 10)은 아실트랜스퍼라제(EC 2.3.1)로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 아미노산 N-아세틸트랜스퍼라제(EC 2.3.1.1), 글라이신 N-아실트랜스퍼라제(EC 2.3.1.13), 아스파테이트 N-아세틸트랜스퍼라제(EC 2.3.1.17), 글루탐에이트 N-아세틸트랜스퍼라제(EC 2.3.1.35), D-아미노산 N-아세틸트랜스퍼라제(EC 2.3.1.36) 및 다이아민 N-아세틸트랜스퍼라제(EC 2.3.1.57)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소에 의해 촉진될 수 있다. 바람직하게는, 사용되는 효소는 기질 4-아미노뷰티레이트에 대해 선택적이다. 야생형 효소는 아미노기 수용체로서의 4-아미노뷰티레이트에 대해 낮은 활성/선택성을 갖는다. 4-아미노뷰티레이트에 대한 활성/선택성이 야생형 효소에 비해 상당히 더 높도록 이러한 야생형 효소를 적합화시킬 수 있다. 사용되는 효소는 아세틸기 공여체로서 아세틸-CoA를 사용할 수 있다. 다르게는, 효소는 또한 아세틸기 공여체로서 N-아세틸-글루탐에이트 같은 N-아세틸화된 아미노산을 사용할 수 있다. 효소는 원핵생물 또는 진핵생물 또는 고세균으로부터 유래될 수 있다.
다르게는, 하기 효소-촉진되는 반응에 의해 N-아세틸-4-아미노뷰티레이트를 N-아세틸-4-아미노뷰티르알데하이드로 전환시킬 수 있다:
11a) N-아세틸-4-아미노뷰티레이트의 N-아세틸-4-아미노뷰티레이트 포스페이트로의 전환; 및
11b) N-아세틸-4-아미노뷰티레이트 포스페이트의 N-아세틸-4-아미노뷰티르알데하이드로의 전환.
반응 11a)는 포스포트랜스퍼라제(EC 2.7.2)로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 아세테이트 키나제(EC 2.7.2.1), 아스파테이트 키나제(EC 2.7.2.4), 뷰티레이트 키나제(EC 2.7.2.7), 아세틸글루탐에이트 키나제(2.7.2.8) 및 글루탐에이트 5-키나제(2.7.2.11)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소에 의해 촉진될 수 있다.
반응 11b)는 옥시도리덕타제(EC 1.2.1)로 이루어진 군으로부터, 바람직하게는 N-아세틸-감마-글루탐일-포스페이트 리덕타제(EC 1.2.1.38)로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소에 의해 촉진될 수 있다.
반응 단계 9) 내지 11)을 촉진할 수 있는 예시적인 단백질이 유니프롯에서의 이들의 수납 번호 및 이들의 공급원인 (미)생물과 함께 표 2에 기재된다.
반응 단계 9 내지 11(a/b)의 효소
반응
단계		 유니프롯
수납 번호		 효소 미생물
9 P69908 글루탐에이트 데카복실라제 E. 콜라이
9 Q04792 글루탐에이트 데카복실라제 S. 세레비지애
10 P0A951 다이아민 아세틸트랜스퍼라제 E. 콜라이
10 P21673 다이아민 아세틸트랜스퍼라제 H. 사피엔스
10 P41929 라이신 아세틸트랜스퍼라제 야로위아 리폴리티카
(Yarrowia lipolytica)
11 P77674 감마-아미노뷰티르알데하이드 데하이드로게나제 E. 콜라이
11a P0A6C8 아세틸글루탐에이트 키나제 E. 콜라이
11b P11446 N-아세틸-감마-글루탐일-포스페이트 리덕타제 E. 콜라이
11b Q01217 N-아세틸-감마-글루탐일-포스페이트 리덕타제 S. 세레비지애
반응 12)는 N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드로부터 N-보호된 DAB를 생성시키는 생체촉매 공정에 관한 것이다.
일반적으로, 적합한 아미노트랜스퍼라제는 N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드가 N-보호된 DAB로 전환되는 것을 촉진시킬 수 있는, N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드 아미노트랜스퍼라제 활성을 갖는다.
아미노트랜스퍼라제는 특히 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제, 오메가-아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1), 부류 III-아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1), 4-아미노-뷰티레이트 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.19), L-라이신 6-아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.36), 5-아미노발레레이트 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.48), 라이신:피루베이트 6-아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.71) 및 퓨트레신-아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.82)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 아미노트랜스퍼라제는 알라닌 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.2), 류신 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.6), 알라닌-옥소-산 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.12), β-알라닌-피루베이트 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.18), (S)-3-아미노-2-메틸프로피온에이트 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.22) 및 L,L-다이아미노피멜레이트 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.1.83)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
아미노트랜스퍼라제는 특히 포유동물, 식물 또는 미생물로부터의 아미노트랜스퍼라제에서 선택될 수 있다. 더욱 특히, 아미노트랜스퍼라제는 아스플레늄(Asplenium), 더욱 특히 아스플레늄 우닐라테랄레(Asplenium unilaterale) 또는 아스플레늄 셉텐트리오날레(Asplenium septentrionale), 바실러스, 특히 바실러스 웨이헨스테파넨시스(Bacillus weihenstephanensis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 세라토니아(Ceratonia), 특히 세라토니아 실리쿠아(Ceratonia siliqua), 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아, 더욱 특히 어위니아 카로토보라(E. carotovora), 에스케리치아, 더욱 특히 E. 콜라이, 레기오넬라, 머쿠리알리스(Mercurialis), 특히 머쿠리알리스 페레니스(Mercurialis perennis), 더욱 특히 머쿠리알리스 페레니스의 새싹, 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 슈도모나스, 특히 슈도모나스 애루기노사, 로도박터, 특히 로도박터 스패로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도슈도모나스, 살모넬라, 더욱 특히 S. 타이피(typhi), S. 파라타이피(paratyphi), 시겔라(Shigella), 더욱 특히 Sh. 보이디(boydii), Sh. 플렉스네리(flexneri), S. 소네이(sonnei), 스타필로코커스, 특히 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오, 특히 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 또는 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래될 수 있다.
효소가 포유동물의 효소인 경우, 이는 특히 포유동물의 신장, 포유동물의 간, 포유동물의 심장 또는 포유동물의 뇌로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 효소는 포유동물의 간으로부터의 4-아미노-뷰티레이트 아미노트랜스퍼라제, 특히 돼지 간으로부터의 4-아미노-뷰티레이트 아미노트랜스퍼라제; 포유동물의 뇌로부터의 4-아미노-뷰티레이트 아미노트랜스퍼라제, 특히 사람, 돼지 또는 래트의 뇌로부터의 4-아미노뷰티레이트 아미노트랜스퍼라제; 비브리오 플루비알리스의 오메가-아미노트랜스퍼라제, E. 콜라이로부터의 4-아미노-뷰티레이트 아미노트랜스퍼라제, 및 클로스트리듐, 특히 클로스트리듐 아미노발레리쿰(Clostridium aminovalericum)으로부터의 5-아미노발레레이트 아미노트랜스퍼라제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
구체적으로, 아미노 공여체는 암모니아, 암모늄 이온, 아민 및 아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 적합한 아민은 1급 아민 및 2급 아민이다. 아미노산은 D- 또는 L-배열을 가질 수 있다. 아미노 공여체의 예는 알라닌, 글루탐에이트, 아이소프로필아민, 2-아미노뷰테인, 2-아미노헵테인, 페닐메탄아민, 1-페닐-1-아미노에테인, 글루타민, 티로신, 페닐알라닌, 아스파테이트, 알파-아미노아이소뷰티레이트, 베타-알라닌, 4-아미노뷰티레이트 및 알파-아미노아디페이트이다.
다른 바람직한 실시양태에서, N-보호된 DAB를 제조하는 방법은 공여체의 CH-NH2 기 상에서 작용하는 옥시도리덕타제(EC 1.4)로 이루어진 군으로부터, 특히 아미노산 데하이드로게나제(E.C. 1.4.1)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암모니아 공급원의 존재하에 환원성 아민화 반응을 촉진할 수 있는 효소의 존재하에서의 생체촉매 반응을 포함한다. 일반적으로, 적합한 아미노산 데하이드로게나제는 N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드가 N-보호된 DAB로 전환되는 것을 촉진하는, 6-아미노카프로산 6-데하이드로게나제 활성을 갖는다. 특히, 적합한 아미노산 데하이드로게나제는 다이아미노피멜레이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.16), 라이신 6-데하이드로게나제(EC 1.4.1.18), 글루탐에이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.3; EC 1.4.1.4) 및 류신 데하이드로게나제(EC 1.4.1.9)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시양태에서, 아미노산 데하이드로게나제는 수용체로서의 NAD 또는 NADP와 함께 작용하는 글루탐에이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.3), 수용체로서의 NADP와 함께 작용하는 글루탐에이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.4), 류신 데하이드로게나제(EC 1.4.1.9), 다이아미노피멜레이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.16) 및 라이신 6-데하이드로게나제(EC 1.4.1.18)로서 분류되는 아미노산 데하이드로게나제 중에서 선택될 수 있다.
아미노산 데하이드로게나제는 특히 코리네박테륨, 구체적으로 코리네박테륨 글루타미쿰; 프로테우스(Proteus), 구체적으로 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris); 아그로박테륨, 구체적으로 아그로박테륨 투메파시엔스; 게오바실러스(Geobacillus), 구체적으로 게오바실러스 스테아로써모필루스(Geobacillus stearothermophilus); 아시네토박터(Acinetobacter), 구체적으로 아시네토박터 종 ADP1; 랄스토니아(Ralstonia), 구체적으로 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum); 살모넬라, 구체적으로 살모넬라 타이피무륨(Salmonella typhimurium); 사카로마이세스, 구체적으로 사카로마이세스 세레비지애; 브레비박테륨, 구체적으로 브레비박테륨 플라붐(Brevibacterium flavum); 및 바실러스, 구체적으로 바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 바실러스 서브틸리스로 이루어진 군으로부터 선택되는 생물체로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 적합한 아미노산 데하이드로게나제는 바실러스, 특히 바실러스 스패리쿠스로부터의 다이아미노피멜레이트 데하이드로게나제; 브레비박테륨 종으로부터의 다이아미노피멜레이트 데하이드로게나제; 코리네박테륨으로부터의 다이아미노피멜레이트 데하이드로게나제, 특히 코리네박테륨 글루타미쿰으로부터의 다이아미노피멜레이트 데하이드로게나제; 프로테우스로부터의 다이아미노피멜레이트 데하이드로게나제, 특히 프로테우스 불가리스로부터의 다이아미노피멜레이트 데하이드로게나제; 아그로박테륨, 특히 아그로박테륨 투메파시엔스로부터의 라이신 6-데하이드로게나제; 게오바실러스, 특히 게오바실러스 스테아로써모필루스로부터의 라이신 6-데하이드로게나제; 아시네토박터로부터의, 보조 인자로서 NADH 또는 NADPH와 함께 작용하는 글루탐에이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.3), 특히 아시네토박터 종 ADP1로부터의 글루탐에이트 데하이드로게나제; 랄스토니아로부터의 글루탐에이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.3), 특히 랄스토니아 솔라나세아룸으로부터의 글루탐에이트 데하이드로게나제; 살모넬라로부터의, 보조 인자로서 NADPH와 함께 작용하는 글루탐에이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.4), 특히 살모넬라 타이피무륨으로부터의 글루탐에이트 데하이드로게나제; 사카로마이세스로부터의 글루탐에이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.4), 특히 사카로마이세스 세레비지애로부터의 글루탐에이트 데하이드로게나제; 브레비박테륨으로부터의 글루탐에이트 데하이드로게나제(EC 1.4.1.4), 특히 브레비박테륨 플라붐으로부터의 글루탐에이트 데하이드로게나제; 및 바실러스로부터의 류신 데하이드로게나제, 특히 바실러스 세레우스 또는 바실러스 서브틸리스로부터의 류신 데하이드로게나제 중에서 선택될 수 있다.
생체촉매 효소는 임의의 형태로 사용될 수 있다. 예를 들어, 생체촉매 효소는 조질 효소로서, 시판되는 효소로서, 시판중인 제제로부터 추가로 정제된 효소로서, 자연적으로 또는 유전자 변형을 통해 가수분해 활성을 갖는 전세포(임의적으로는 투과성으로 된 및/또는 고정된)에서 또는 이러한 활성을 갖는 세포의 용해물에서 공지 정제 방법의 조합에 의해 그의 공급원으로부터 수득되는 효소로서, 예컨대 분산액, 유화액, 용액의 형태로 또는 고정된 형태로(예컨대, 지지체, 예를 들어 미립자 또는 한 덩어리 담체 물질 상에 로딩되어) 사용될 수 있다.
생체촉매 효소는 임의의 생물체로부터, 구체적으로는 동물, 식물, 세균, 사상균, 효모 또는 진균으로부터 수득되거나 유래될 수 있다.
당 업자는 생체촉매 활성을 갖는 천연 발생(야생형) 효소의 돌연변이체도 본 발명에 따른 공정에 사용할 수 있음을 명백히 알 것이다. 예를 들어 당업자에게 공지되어 있는 돌연변이 발생 기법[임의 돌연변이 발생, 부위-지향성 돌연변이 발생, 방향 진화, 유전자 혼합(shuffling) 등]을 이용하여 야생형 효소를 코딩하는 DNA를 변형시켜, DNA가 야생형과 하나 이상의 아미노산이 상이한 효소를 코딩하도록 또는 아생형에 비해 더 짧은 효소를 코딩하도록 하고, 이렇게 변형된 DNA를 적합한 (숙주) 세포에서 발현시킴으로써, 야생형 효소의 돌연변이체를 제조할 수 있다. 생체촉매 효소의 돌연변이체는 예를 들어 하기 면중 하나 이상과 관련하여 개선된 특성을 가질 수 있다: 기질에 대한 선택성, 활성, 안정성, 내용매성, pH 프로파일, 온도 프로파일, 기질 프로파일.
특정 공급원으로부터의 효소를 언급하는 경우, 제 1 생물체로부터 유래되지만 실제로는 (유전자 변형된) 제 2 생물체에서 생성되는 재조합 효소는 상기 제 1 생물체로부터의 효소로서 포함됨을 구체적으로 의미한다.
본 발명의 방법에서 하나 또는 수개의 반응 단계를 촉진하기 위한 하나 이상의 효소를 포함하는 세포, 특히 재조합 세포는 그 자체로 당분야에 공지되어 있는 분자 생물학적 기법을 이용하여 구축될 수 있다[마니아티스(Maniatis) 등 1982 "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 뉴욕주 콜드 스프링 하버; 밀러(Miller) 1972 "Experiments in molecular genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, 콜드 스프링 하버; 샘브룩(Sambrook) 및 러셀(Russell) 2001 "Molecular cloning: a laboratory manual" (제3판), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 오스벨(F. Ausubel) 등 편집, "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, 뉴욕 1987]. 예를 들어, 하나 이상의 생체촉매가 재조합 세포(이종 시스템일 수 있음)에서 생성되어야 하는 경우, 이러한 기법을 이용하여 상기 생체촉매중 하나 이상을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 벡터(예컨대, 재조합 벡터)를 제공할 수 있다. 각각 이러한 유전자중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 벡터는 하나 이상의 조정 요소, 예를 들어 하나 이상의 프로모터를 포함할 수 있으며, 상기 프로모터는 생체촉매를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 폴리뉴클레오타이드 요소(또는 코딩 서열 또는 핵산 서열)를 기능적인 관계로 연결함을 가리킨다. 핵산 서열은 다른 핵산 서열과 기능적인 관계로 위치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서(enhancer)가 코딩 서열의 전사에 영향을 끼치면 이는 코딩 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 것이다.
본원에 사용되는 용어 "프로모터"는 유전자의 전사 개시 부위의 전사 방향과 관련하여 상류(upstream)에 위치하는, 하나 이상의 유전자의 전사를 제어하는 기능을 하고, DNA-의존성 RNA 폴리머라제용 결합 부위, 전사 개시 부위 및 전사 인자 결합 부위, 리프레서(repressor) 및 액티베이터(activator) 단백질 결합 부위 및 프로모터로부터의 전사량을 조절하도록 직접적으로 또는 간접적으로 작용하는 것으로 당업자에게 공지되어 있는 뉴클레오타이드의 임의의 다른 서열을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는 임의의 다른 DNA 서열의 존재에 의해 구조적으로 확인되는 핵산 단편을 가리킨다. "항상 발현되는(constitutive)" 프로모터는 대부분의 환경 및 생육 조건하에서 활성인 프로모터이다. "유도성(inducible)" 프로모터는 환경 또는 생육 조절하에 활성인 프로모터이다. 소정 (재조합) 핵산 또는 폴리펩타이드 분자와 소정 숙주 생물체 또는 숙주 세포 사이의 관계를 나타내는데 사용되는 용어 "동종"은 천연에서 핵산 또는 폴리펩타이드 분자가 동일한 종, 바람직하게는 동일한 변종 또는 균주의 숙주 세포 또는 생물체에 의해 생성됨을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 효소, 특히 본원에서 상기 기재된 것과 같은 아미노트랜스퍼라제, 아미노산 데하이드로게나제 또는 데카복실라제를 코딩하는 핵산 서열의 발현을 달성하기 위해 사용될 수 있는 프로모터는 발현되어야 하는 효소를 코딩하는 핵산 서열의 원산물일 수 있거나, 또는 그가 작동하능하게 연결되는 핵산 서열(코딩 서열)에 이종일 수 있다. 바람직하게는, 프로모터는 숙주 세포에 동종, 즉 내생성이다.
(관심있는 효소를 코딩하는 핵산 서열에 대해) 이종 프로모터를 사용하는 경우, 이종 프로모터는 바람직하게는 코딩 서열의 원산물인 프로모터보다 더 높은 정상상태 수준의 코딩 서열을 포함하는 전사체를 생성시킬 수 있다(또는 단위 시간당 더 많은 전사체 분자, 즉 mRNA 분자를 생성시킬 수 있다). 이와 관련하여 적합한 프로모터는 항상 발현되는 천연 프로모터 및 유도성 천연 프로모터뿐만 아니라 처리된(engineered) 프로모터 모두를 포함하며, 이들은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
"강력한 항상 발현되는 프로모터"는 천연 숙주 세포에 비해 높은 빈도로 mRNA가 개시되도록 하는 것이다. 그램-양성 미생물에서 이러한 강력한 항상 발현되는 프로모터의 예는 SP01-26, SP01-15, veg, pyc(피루베이트 카복실라제 프로모터) 및 amyE를 포함한다.
그램-양성 미생물에서 유도성 프로모터의 예는 IPTG 유도성 Pspac 프로모터, 자일로즈 유도성 PxyIA 프로모터를 포함한다.
그램-음성 미생물에서 항상 발현되는 프로모터 및 유도성 프로모터의 예는 tac, tet, trp - tet, lpp, lac, lpp - lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara (P BAD ), SP6, λ-PR 및 λ-PL을 포함하지만, 이들로 국한되는 것은 아니다.
(사상) 진균 세포의 프로모터는 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제 gpdA 프로모터, pepA, pepB, pepC 같은 프로테아제 프로모터, 글루코아밀라제 glaA 프로모터, 아밀라제 amyA, amyB 프로모터, 카탈라제 catA 프로모터, 글루코즈 옥시다제 goxC 프로모터, 베타-갈락토시다제 lacA 프로모터, 알파-글루코시다제 aglA 프로모터, 번역 신장 인자 tefA 프로모터, xlnA, xlnB, xlnC, xlnD 같은 자일라나제 프로모터, eglA, eglB, cbhA 같은 셀룰라제 프로모터, areA, creA, xlnR, pacC, prtT 같은 번역 레귤레이터(regulator)의 프로모터, 또는 다른 프로모터일 수 있으며, 특히 NCBI 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/)에서 찾아볼 수 있다.
핵산(DNA 또는 RNA) 또는 단백질과 관련하여 사용되는 용어 "이종"은 그가 존재하는 생물체, 세포, 게놈 또는 DNA 또는 RNA 서열의 일부로서 자연적으로 발생되지 않거나, 또는 그가 천연에서 발견되는 것과는 상이한 세포에서 또는 게놈 또는 DNA 또는 RNA 서열에서의 위치 또는 위치들에서 발견되는 핵산 또는 단백질을 나타낸다. 이종 핵산 또는 단백질은 그가 도입되는 세포에 대해 내생성이 아니며, 다른 세포로부터 수득되거나 합성에 의해 또는 재조합에 의해 생성되었다. 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 이러한 핵산은 DNA가 전사 또는 발현되는 세포에 의해 통상적으로 생성되지 않는 단백질을 코딩한다. 유사하게 외인성 RNA는 외인성 RNA가 존재하는 세포에서 통상적으로 발현되지 않는 단백질을 코딩한다. 이종 핵산 및 단백질은 또한 외래 핵산 또는 단백질로도 일컬어질 수 있다. 그가 발현되는 세포에 대해 외인성 또는 외래인 것으로 당업자가 인식하는 임의의 핵산 또는 단백질은 본원에서 용어 이종 핵산 또는 단백질에 의해 포괄된다.
본 발명에 따른 방법은 신규일 수 있는 숙주 생물체에서 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 방법중 하나 이상의 반응 단계를 촉진할 수 있는 하나 이상의 효소를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명에 따른 숙주 세포는 N-보호된 글루탐에이트 세미알데하이드로부터 N2-보호된 오르니틴을 생성시키기 위하여 아미노기 전이 반응 또는 환원성 아민화 반응을 촉진할 수 있는 효소를 코딩하거나, 또는 N2-보호된 오르니틴으로부터 N5-보호된 오르니틴을 형성하기 위하여 N-아실트랜스퍼라제 반응을 촉진할 수 있는 효소를 코딩하거나, 또는 N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드로부터 N-보호된 DAB를 생성시키기 위하여 아미노트랜스퍼라제 반응을 촉진할 수 있는 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 세포이다. 상기 서열은 벡터의 일부일 수 있거나 또는 염색체 DNA 내로 삽입될 수 있다.
DAB 의 N-보호된 전구체의 회수
N-보호된 전구체를 DAB로 전환하기 전에, N-보호된 전구체를 생체촉매 반응 혼합물로부터 회수해야 한다.
생체촉매 반응 혼합물로부터 유사한 화합물을 회수하기 위하여 당분야에 공지되어 있는 방법에 의해, 생체촉매 반응 혼합물로부터의 N-보호된 전구체의 회수를 수행할 수 있다. 특히 발효에 의한 생산 방법의 경우, 이러한 회수 공정은 세포 분리(여과, 막 분리(MF), 침강(중력 또는 원심분리)), 결정화로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단계를 포함하여 세포를 제거할 수 있다. 경제적으로 유리한 정제를 위해 N-보호된 전구체의 추가적인 농축 및 정제가 요구될 수 있다. 추가적인 농축을 위하여, 증발 및 막 분리(RO, NF 및 UF) 같은 기법을 적용할 수 있다. 또한, (공정) 동결 농축 같은 기법을 이용할 수 있다.
이온-교환 (크로마토그래피) 또는 결정화/침전에 의한 추가적인 단리가 필요할 수 있다.
이 공정에 의해 반드시 N-보호된 전구체가 엄격하게 정제되어야 하는 것은 아니지만, N-보호된 전구체는 적어도 N-보호된 전구체의 DAB로의 후속 전환이 생체촉매 반응 혼합물로부터 유래되는 오염물질 및 부산물에 의해 상당히 방해받지 않도록 하는 정도까지는 정제되어야 한다. 임의적으로, N-보호된 전구체는 또한 농축될 수 있다.
뿐만 아니라, 하나 이상의 후속 변환 단계에 최적화된 매질로 N-보호된 전구체를 전달할 수 있다.
DAB 의 N-보호된 전구체의 DAB 로의 전환
본 발명에 따른 N-보호된 전구체의 DAB로의 직접적인 또는 간접적인 전환은 하나 이상의 생체촉매(특히 효소) 전환 단계 또는 화학적 전환 단계를 포함할 수 있다. 이는 또한 생체촉매 전환 단계와 화학적 전환 단계의 조합도 포함할 수 있다.
예를 들어, 생체촉매에 의해 생성된 N-보호된 DAB가 보호되지 않은 DAB로 전환되는 것은 생체촉매에 의한 가수분해 공정 또는 화학적 가수분해 공정에 의해 수행될 수 있다. 생체촉매 공정의 경우, 적합한 하이드롤라제를 사용할 수 있다. 본 발명의 유리한 방법에서는, 탈아실화가 생체 촉진된다. 특히, N-Ac-DAB의 탈아실화를 촉진할 수 있는, 더욱 특히 N-아세틸-DAB의 탈아세틸화를 촉진할 수 있는 가수분해 효소를 사용할 수 있다.
화학적 가수분해 또는 생체촉매에 의한 가수분해에 의해 N-아세틸-DAB를 DAB로 전환시키는 경우, 이는 통상적으로 DAB 및 아세테이트를 생성시킨다. DAB를 회수한 후, 아세테이트를 함유한 부분을 바람직하게는 공정에 재사용한다. 발효 공정의 경우에는, 미생물을 생육시키기 위한 탄소 공급원으로서, 또는 N-보호된-DAB 또는 발효 공정에서 N-보호된 DAB로 전환될 수 있는 화합물을 생성시키기 위한 탄소 공급원으로서, 아세테이트를 재사용할 수 있다.
용어 "가수분해 효소"는 본원에서 분류 군 E.C. 3으로부터의 효소에 사용된다. 바람직하게는, 카복실산 에스터 하이드롤라제(E.C. 3.1.1), 티올에스터 하이드롤라제(E.C. 3.1.2) 및 펩티다제(E.C. 3.4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 가수분해 효소를 사용한다.
특히 펩티다제(E.C. 3.4)를 사용할 수 있다. 바람직한 펩티다제는 세린-형 카복시펩티다제(E.C. 3.4.16), 메탈로카복시펩티다제(E.C. 3.4.17), 시스테인-형 카복시펩티다제(E.C. 3.4.18), 세린 엔도펩티다제(E.C. 3.4.21), 시스테인 엔도펩티다제(E.C. 3.4.22), 아스파르트산 엔도펩티다제(E.C. 3.4.23) 및 메탈로엔도펩티다제(E.C. 3.4.24)로 이루어진 군으로부터, 특히 세린 엔도펩티다제(E.C. 3.4.21)로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티다제이다. 세린 엔도펩티다제, 바람직하게는 서브틸리신 칼스버그(Carlsberg) 같은 서브틸리신(E.C. 3.4.21.62)으로 특히 우수한 결과를 달성하였다.
가수분해 효소가 유래될 수 있는 생물체의 예는 트리코덜마 리세이(Trichoderma reesei) 같은 트리코덜마 종; 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae) 같은 리조푸스 종; 바실러스 리체니폴미스, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스, 바실러스 클라우시(Bacillus clausii), 바실러스 렌투스(Bacillus lentus), 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus), 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans) 같은 바실러스 종; 아스퍼길러스 오리재(Aspergillus oryzae) 또는 아스퍼길러스 니거(Aspergillus niger) 같은 아스퍼길러스 종; 스트렙토마이세스 캐스피토수스(Streptomyces caespitosus) 또는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) 같은 스트렙토마이세스 종; 칸디다(Candida) 종; 진균; 후미콜라(Humicola) 종; 리조크토니아(Rhizoctonia) 종; 사이토파기아(Cytophagia); 무콜 종; 및 특히 돼지 췌장, 소 췌장 또는 양 췌장 같은 췌장으로부터의 동물 조직을 포함한다.
상기 나타낸 바와 같이, 바람직한 효소는 서브틸리신이다. 다양한 서브틸리신이 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어 US 5,316,935 호 및 그에 인용된 참조문헌을 참조한다. 서브틸리신 A는 노보자임즈(Novozymes)에서 시판중인 서브틸리신이다. 특히 바람직한 것은 서브틸리신 칼스버그이다. 알칼라제(Alcalase)®는 본 발명의 방법에 사용하기 특히 적합한 것으로 밝혀졌다. 이 제품은 노보자임즈(덴마크 박스버드)에서 구입할 수 있다. 알칼라제®는 바실러스 리체니폴미스에서 생산되는 값싸고 산업적으로 이용가능한 단백질 분해 효소 혼합물(주요 효소 성분으로서 서브틸리신 칼스버그를 함유함)이다. 정제된 서브틸리신을 사용한 실험에서 서브틸리신이 에스터 교환, 활성화 및 펩타이드 결합 형성을 촉진시킴을 확인하였다.
노보자임즈(덴마크 박스버드)는 오보자임, 리쿼나제, 알칼라제®, 알칼라제-울트라®(알칼리성 pH에서 특히 효과적임), 듀라밀, 에스퍼라제, 칸나제, 사비나제, 사비나제 울트라, 터마밀, 터마밀 울트라, 노보베이트, 폴라자임, 뉴트라제, 노볼린, 피라제, 노보콜(세균의 알칼리성 프로테아제)을 제공한다.
프로테이나제-K는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)(미국 매사추세츠주 입스위치)에서 구입할 수 있다.
노보 놀디스크 바이오켐 노쓰 어메리카 인코포레이티드(Novo Nordisk Biochem North America Inc)(미국 노쓰 캐롤라이나주 플랭클린턴)는 프로테아제 바실러즈 종(에스퍼라제 6.0 T; 사비나제 6.0 T), 프로테아제 바실러스 서브틸리스(뉴트라제 1.5 MG), 프로테아제 바실러스 리체니폴미스(알칼라제 3.0 T)를 공급한다.
아마노 인터내셔널 엔자임 캄파니(Amano International Enzyme Co)(미국 버지니아주 트로이)는 프로테아제 바실러스 서브틸리스(프롤레터; 프로테아제 N) 및 프로테아제 아스퍼길러스 오리재(프로자임 6)를 공급한다.
이 부류의 효소의 적합한 예는 예를 들어 리조푸스 야포니쿠스 리파제, 아스퍼길러스 니거의 리파제 AP-6, 알칼리게네스(Alcaligenes) 종의 리파제 QL, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스의 프로테아제 B(서열 번호 19), 바실러스 리체니폴미스의 델볼라제(서열 번호 20), 리조푸스 오리재 리파제, 에스퍼라제, 알칼라제, 아스퍼길러스 종 아실라제, 프로자임, 프로테아제 M, 프로테아제 N이다. 하이드롤라제는 바람직하게는 에스터 결합 상에서 작용하는 하이드롤라제(리파제, 에스터라제)(EC 3.1), 펩타이드 결합 상에서 작용하는 펩타이드 하이드롤라제(펩티다제, 프로테이나제)(EC 3.4) 및 펩타이드 결합 외의 C-N 결합 상에서 작용하는 하이드롤라제(EC 3.5)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특히, 펩타이드 외의 C-N 결합 상에서 작용하는 하이드롤라제는 카복실산 에스터 하이드롤라제(EC 3.1.1) 및 선형 아마이드 상에서 작용하는 아미다제(EC 3.5.1)로 이루어진 군으로부터, 구체적으로는 아미노 아미다제로 이루어진 군으로부터, 더욱 구체적으로는 마이코박테륨으로부터의 아미노 아미다제로 이루어진 군으로부터, 더욱 구체적으로는 마이코박테륨 네오아우룸(Mycobacterium neoaurum)으로 이루어진 군으로부터의 아미노 아미다제로부터 선택될 수 있다.
N-보호된 DAB의 화학적 가수분해는 유사한 반응에 대해 당분야에 공지되어 있는 방법을 포함할 수 있다. 적합한 방법은 트라이페닐 포스페이트의 용액을 염소로 적정함으로써 동일 반응계 내에서 제조된 (PhO)3P.Cl2에 의한 탈아실화를 포함한다. 이 방법은 사기아리(Saggiari) 등의 문헌[Organic Letters (2004), 6 (22), pp. 3885-3888]에 포괄적으로 기재되어 있다.
먼저 N5-보호된 아르니틴을 특이적으로 탈카복실화시켜 N-보호된 DAB를 생성시킨 후, 이전에 기재된 바와 같이 N-보호된 DAB를 가수분해시켜 보호되지 않은 DAB를 수득함으로써, N5-보호된 오르니틴이 보호되지 않은 DAB로 전환되는 것을 진행시킬 수 있다.
N5-보호된 오르니틴을 특이적으로 탈카복실화시켜 N-보호된 DAB를 생성시키기 위하여, 리아제 활성을 갖는 효소 같은 적합한 생체촉매를 사용할 수 있다. 리아제 활성을 갖는 적합한 효소는 부류 EC 4에 속한다. 더욱 특히, 에스케리치아 콜라이의 오르니틴 데카복실라제(SpeC)(EC 4.1.1.17); 락토코커스 락티스의 분지쇄 알파-케토산 데카복실라제(KdcA; 서열 번호 8) 및 알파-케토아이소발레레이트 데카복실라제(KivD; 서열 번호 10); 및 에스케리치아 콜라이의 라이신 데카복실라제(LysA; 서열 번호 12)에 의해 예시되는 카복실라제(EC 4.1.1) 같은 탄소-탄소 리아제(EC 4.1)를 사용할 수 있다.
다르게는, 유사한 화합물에 대해 당분야에 공지되어 있는 화학적 전환에 의해, 처음으로 언급된 N5-보호된 오르니틴의 특이적인 탈카복실화를 수행할 수 있다. 임의적으로 촉매량의 유기 퍼옥사이드의 존재하에 다이페닐메테인 같은 고비등 용매 중에서 화합물을 가열함으로써, 또는 1당량 이상의 케톤 또는 알데하이드와 함께 화합물을 가열함으로써, 이러한 목적에 적합한 화학적 탈카복실화 반응을 수행할 수 있다.
생체촉매에 의해 생성되는 N-보호된 DAB에 대해 상기 기재된 생체촉매 공정 또는 화학적 공정에 의해, N-보호된 DAB의 후속 가수분해를 수행할 수 있다.
상기 기재된 2단계 전환에 대한 대안으로서, N5-보호된 오르니틴으로부터 DAB를 생성시키는 단일 용기 방법을 이용할 수 있다. 이 방법은 유사한 화합물에 대해 당분야에 공지되어 있는 방법에 따라 먼저 N5-보호된 오르니틴을 탈아실화시킨 후 탈카복실화시킴으로써, 또는 N5-보호된 오르니틴을 먼저 탈카복실화시킨 후 탈아실화시킴으로써 진행될 수 있다. 탈카복실화는 상기 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. N-보호된 DAB에 대해 상기 기재된 방법에 의해 탈아실화를 수행할 수 있다.
먼저 알데하이드 산소를 아미노기로 특이적으로 대체함으로써 N-보호된 DAB를 생성시키고, 이어 이를 탈보호시킴으로써, N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드를 보호되지 않은 DAB로 전환시킬 수 있다. 첫번째 전환을 위해, 앞서 기재된 바와 같은 트랜스퍼라제 활성을 갖는 효소(EC 2) 같은 적합한 생체촉매를 사용할 수 있다. 이러한 특정 목적에 적합한 트랜스퍼라제 활성을 갖는 효소는 질소 기를 전달하는 트랜스퍼라제(EC 2.6), 더욱 구체적으로는 아미노트랜스퍼라제(트랜스아미나제)(EC 2.6.1), 더욱 구체적으로는 포유동물의 간으로부터의 4-아미노-뷰티레이트 아미노트랜스퍼라제, 더욱 구체적으로는 돼지 간으로부터의 4-아미노-뷰티레이트 아미노트랜스퍼라제; 포유동물의 뇌로부터의 4-아미노-뷰티레이트 아미노트랜스퍼라제, 더욱 구체적으로는 사람, 돼지 또는 래트 뇌로부터의 4-아미노뷰티레이트 아미노트랜스퍼라제; 비브리오 플루비알리스의 오메가-아미노트랜스퍼라제; E. 콜라이로부터의 4-아미노-뷰티레이트 아미노트랜스퍼라제 및 클로스트리듐, 더욱 구체적으로는 클로스트리듐 아미노발레리쿰(Clostridium aminovalericum)으로부터의 5-아미노발레레이트 아미노트랜스퍼라제, 오르니틴트랜스아미나제(EC 2.6.1.11), L-알라닌:3-옥소프로피온에이트 아미노트랜스퍼라제(EC 2.6.2.18) 및 예컨대 시겔라 또는 살모넬라의 푸트레신 아미노 트랜스퍼라제에 의해 예시된다. 특히 적합한 아미노트랜스퍼라제는 예를 들어 비브리오 플루비알리스의 오메가-아미노트랜스퍼라제(서열 번호 5), 또는 슈도모나스 애루기노사의 아미노트랜스퍼라제[gi9946143(서열 번호 1) 또는 gi9951072(서열 번호 3)], 파라코커스 데니트리피칸스(Paracoccus denitrificans)(ZP00628577; 서열 번호 14), 바실러스 웨이헨스테파넨시스(Bacillus Weihenstephanensis)(ZP01186960; 서열 번호 16)이다.
N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드를 N-보호된 DAB로 전환시킴에 적합한 다른 생체촉매는 옥시도리덕타제(EC 1), 더욱 구체적으로는 공여체의 CH-NH2 기 상에서 작용하는 옥시도리덕타제(EC 1.4) 또는 공여체의 CH-NH 기 상에서 작용하는 옥시도리덕타제(EC 1.5), 더욱 구체적으로는 부류 EC 1.4.1, 1.4.3(바람직하게는 1.4.3.4) 및 1.4.99의 효소이다.
다르게는, 유사한 화합물에 대해 당분야에 공지되어 있는 화학적 전환에 의해, N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드의 첫번째 전환을 수행할 수 있다. 이 목적에 적합한 화학 반응은 유사한 화합물에 대해 당분야에 공지되어 있는 방법(예컨대, DE 4322065 호 참조)에 따라 N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드를 환원에 의해 아민화시킴으로써 수행될 수 있다. 적합한 방법은 예를 들어 불균일 촉매(예컨대, RaNi, Ni/SiO2 및/또는 Al2O3, Ru/C, Rh/C) 또는 균일 촉매(예컨대, 균일 Rh 촉매) 상에서 암모니아 및 수소와 반응시키는 것이다.
생체촉매에 의해 생성된 N-보호된 DAB에 대해 상기 기재된 생체촉매 공정 또는 화학적 공정에 의해 N-보호된 DAB를 후속 가수분해시킬 수 있다.
실시예
일반적인 방법
분자 및 유전자 기법
표준 유전자 및 분자 생물학 기법은 당분야에 널리 공지되어 있으며, 문헌[마니아티스 등, 1982 "Molecular cloning: a laboratory manual". Cold Spring Harbor Laboratory, 뉴욕주 콜드 스프링 하버; 밀러 1972 "Experiments in molecular genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, 콜드 스프링 하버; 샘브룩 및 러셀 2001 "Molecular cloning: a laboratory manual" (제3판), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 오스벨 등 편집, "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, 뉴욕 1987]에 이미 기재되어 있다.
플라스미드 및 균주
pBAD/Myc-HisC를 인비트로겐(Invitrogen)(미국 캘리포니아주 칼스바드)으로부터 수득하였다. 플라스미드 pBAD/Myc-His-DEST를 WO 2005/068643 호에 따라 구축하고 단백질 발현에 사용하였다. E. 콜라이 TOP10(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)을 모든 클로닝 절차 및 표적 유전자의 발현에 사용하였다.
배지
LB 배지(10g/l 트립톤, 5g/l 효모 추출물, 5g/l NaCl)를 E. 콜라이의 생육에 사용하였다. 항생제(50㎍/ml 카베니실린)를 보충하여 플라스미드를 유지시켰다. pBAD/Myc-His-DEST 유도된 플라스미드에서 PBAD 프로모터의 제어하에 유전자 발현을 유도하기 위하여, L-아라비노즈를 0.2%(w/v)의 최종 농도까지 첨가하였다.
마이코박테륨 네오아우룸의 아미노 아미다제의 생산
하기 조건하에서 마이코박테륨 네오아우룸 균주 ATCC 25795를 생육시킴으로써 아미노 아미다제를 수득하였다. 4.8g/l 나이트릴로트라이아세트산(NTA), 4g/l 우레아, 6g/l 글루코즈, 20g/l 효모 탄소 베이스[디프코(Difco)로부터의 YCB], 1.55g/l K2HPO4 및 0.85g/l NaH2PO4.H2O를 함유하는 마이코메드(Mycomed) 배지 1리터를 pH 7까지 조정하고, 마이코박테륨 네오아우룸 균주 ATCC 25795의 글라이세롤 모 배양액을 접종하였다. 예비 배양액을 37℃에서 168시간동안 뉴 브룬스윅 사이언티픽(New Brunswick Scientific) G53 쉐이커(150rpm, 진폭 4cm) 상에서 쉐이킹하였다. 3.45의 광학 밀도(OD620nm)에 도달하면, 예비 배양액 500ml를 사용하여 마이코메드 배지 9l에 접종하였다. 마이코메드 배지에 존재하는 NTA에 의해 아미다제 발현을 유도하였다. 발효 배양액을 0.5 내지 2l/분의 통기 속도에서 375 내지 750rpm으로 교반하였다. H3PO4 및 NaOH를 첨가함으로써 pH를 7에서 일정하게 유지시켰다. 생육 온도는 37℃였다. 44시간동안 생육시킨 후, 10g/l YCB를 첨가함으로써 배양액에 영양을 공급하였다. 68시간동안 생육시킨 후, 10g/l 글루코즈를 첨가함으로써 배양액에 영양을 공급하였다. 94시간동안 생육시킨 후, 12,000g에서 10분간 원심분리시킴으로써 배양액을 수획하였다. 세포 펠렛을 20mM HEPES/NaOH 완충액, pH 7 중에서 세척한 다음 저장을 위해 동결 건조시켰다.
플라스미드의 동정
형질전환체의 항체에 대한 저항성, 형질전환체의 PCR 진단 분석 또는 플라스미드 DNA의 정제, 정제된 플라스미드 DNA의 제한 분석 또는 DNA 서열 분석 같은 당분야에 널리 공지되어 있는 유전학적, 생화학적 및/또는 표현형 수단에 의해 상이한 유전자를 갖는 플라스미드를 동정하였다.
표적 유전자의 클로닝
발현 컨스트럭트(construct)의 디자인
리보좀 결합 부위 및 출발 코돈의 상류 및 정지 코돈의 하류의 모든 유전자에 attB 부위를 첨가하여 게이트웨이 기법(인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스바드)을 이용한 클로닝을 용이하게 하였다.
유전자 합성 및 플라스미드의 구축
합성 유전자를 DNA2.0으로부터 수득하고, DNA2.0의 표준 절차에 따라 E. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화시켰다. 각각 비브리오 플루비알리스 JS17 오메가-아미노트랜스퍼라제(서열 번호 6) 및 바실러스 웨이헨스테파넨시스 KBAB4 아미노트랜스퍼라제(ZP_01186960)(서열 번호 17)의 아미노산 서열을 코딩하는 V. 플루비알리스 JS17(서열 번호 5) 및 B. 웨이헨스테파넨시스 KBAB4(서열 번호 16)로부터의 아미노트랜스퍼라제 유전자를 코돈 최적화시키고, 생성되는 서열(서열 번호 7 및 서열 번호 18)을 DNA 합성에 의해 수득하였다.
제조업체의 프로토콜(www.invitrogen.com)에 기재되어 있는 바와 같이 도입된 attB 부위 및 진입 벡터로서의 pDONR201을 통해 게이트웨이 기법(인비트로겐)을 이용하여 유전자 컨스트럭트를 pBAD/Myc-His-DEST 발현 벡터에 클로닝하였다. 이러한 방식으로 각각 발현 벡터 pBAD-Vfl_AT 및 pBAD-Bwe_AT를 수득하였다. 개별적인 pBAD-발현 벡터로 화학적으로 경쟁하는 E. 콜라이 TOP10(인비트로겐)을 형질전환시킴으로써 상응하는 발현 균주를 수득하였다.
유사한 방식으로, 서열 번호 15의 아미노산 서열을 코딩하는 파라코커스 데니트리피칸스로부터의 아미노트랜스퍼라제 유전자(서열 번호 14)로 발현 벡터를 제조하였다.
PCR 에 의한 클로닝
표 3에 나열되는 프라이머를 사용하여 제조업체의 규정에 따라 PCR 슈퍼믹스 하이 피델러티(Supermix High Fidelity)(인비트로겐)를 사용하는 PCR에 의해 게놈 DNA로부터 아미노트랜스퍼라제 유전자를 증폭시켰다.
유전자의 기원 유전자
서열 번호		 효소
서열 번호		 전진 프라이머 서열 번호 후진 프라이머 서열 번호
슈도모나스 애루기노사 gi9946143 1 2 23 24
슈도모나스 애루기노사 gi9951072 3 4 25 26
아가로즈 겔 전기영동에 의해 PCR 반응을 분석하였고, 퀴아퀵(QIAquick) PCR 정제 키트[퀴아겐(Qiagen), 독일 힐덴]를 사용하여 겔로부터 올바른 크기의 PCR 생성물을 용리시켰다. 제조업체의 프로토콜에 기재된 바와 같이 도입된 attB 부위 및 진입 벡터로서의 pDONR-zeo(인비트로겐)를 통해 게이트웨이 기법(인비트로겐)을 이용하여, 정제된 PCR 생성물을 pBAD/Myc-His-DEST 발현 벡터 내로 클로닝하였다. PCR에 의해 클로닝된 유전자의 서열을 DNA 서열 결정에 의해 입증하였다. 이러한 방식으로 발현 벡터 pBAD-Pae-_gi9946143_AT, pBAD-Pae_gi9951072_AT 및 pBAD-Pde_AT_ZP00628577을 수득하였다. pBAD 컨스트럭트를 사용하여 화학적으로 경쟁하는 E. 콜라이 TOP10(인비트로겐)을 형질전환시킴으로써 상응하는 발현 균주를 수득하였다.
단백질 발현을 위한 E. 콜라이의 생육
0.02%(w/v) L-아라비노즈를 함유하는 940㎕ 배지를 사용하여 96개의 깊은 웰이 있는 플레이트에서 소규모 생육을 수행하였다. 96개-웰 스탬프[퀴너(Kuhner), 스위스 비르스펠덴]를 사용하여 동결된 모 배양액으로부터 세포를 옮김으로써 접종을 수행하였다. 플레이트를 25℃에서 48시간동안 오비탈 쉐이커(orbital shaker)(300rpm, 5cm 진폭) 상에서 배양하였다. 전형적으로, 2 내지 4의 OD620nm에 도달하였다.
세포 용해물의 제조
용해 완충액의 제조
용해 완충액은 하기 표 4에 나열된 구성성분을 함유하였다:
1M MOPS pH 7.5 5ml
DNAse I 등급 II[로슈(Roche)] 10mg
라이소자임 200mg
MgSO4.7H2O 123.2mg
다이티오트레이톨(DTT) 154.2mg
H2O[밀리큐(MilliQ)] 100ml가 될 때까지의 나머지량
용액을 사용 직전에 새롭게 제조하였다.
용해에 의한 무세포 추출물의 제조
소규모 생육(앞 단락 참조)으로부터의 세포를 원심분리에 의해 수획하고, 상청액을 따라버렸다. 원심분리동안 생성된 세포 펠렛을 -20℃에서 16시간 이상동안 동결시킨 다음 얼음 위에서 해동시켰다. 새롭게 제조된 용해 완충액 500㎕를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 2 내지 5분간 격렬하게 볼텍싱(vortexing)시킴으로써 세포를 재현탁시켰다. 용해를 달성하기 위하여, 플레이트를 실온에서 30분간 배양하였다. 세포 찌꺼기를 제거하기 위하여, 플레이트를 4℃ 및 6000g에서 20분간 원심분리하였다. 상청액을 새로운 플레이트로 옮기고 추후 사용할 때까지 얼음 위에 유지시켰다.
초음파 처리에 의한 무세포 추출물의 제조
중간규모 생육(앞 단락 참조)으로부터의 세포를 원심분리에 의해 수획하고 상청액을 따라버렸다. 인산칼륨 완충액 pH 7 1ml를 습윤 세포 펠렛 0.5g에 첨가하고, 격렬하게 볼텍싱시킴으로써 세포를 재현탁시켰다. 용해를 달성하기 위하여, 세포를 20분간 초음파 처리하였다. 세포 찌꺼기를 제거하기 위하여, 용해물을 4℃ 및 6000g에서 20분간 원심분리시켰다. 상청액을 새로운 관으로 옮기고 추후 사용할 때까지 -20℃에서 동결시켰다.
N-아세틸-4- 아미노뷰티르알데하이드의 N-아세틸- DAB 로의 생물학적 전환
선별 조건
모든 효소를 100mM 인산칼륨 완충액 pH 7.5에 100㎕의 최종 부피까지 현탁시켰다. 아민 공여체(L-알라닌 또는 (S)-알파 메틸벤질아민) 및 보조 인자(PLP)를 함유하는 모 용액 150㎕를 첨가함으로써 효소 반응을 개시하였다. 250㎕ 반응 혼합물중 최종 농도는 다음과 같았다: N-아세틸-아미노뷰탄알(70mM), 아민 공여체(140mM), PLP(12.5mM). 2개의 아민 공여체를 개별적으로 시험하였다. 반응 혼합물을 IKA 오비탈 쉐이커 상에서 560rpm으로 쉐이킹하면서 28℃에서 하룻밤동안(16.5시간 및 16시간) 항온 처리하였다. 항온 처리 후, 0.2% 폼산을 갖는 아세토나이트릴 60% 희석액 750㎕를 첨가함으로써 반응 혼합물을 중단 및 희석시켰다. 미소적정 플레이트를 3500rpm에서 20분간 원심분리하였다. LC-MS 분석에 의해 분석을 수행하였다[분석 작업(Resolve Job) 2009-02-00649 참조].
분석 방법:
작업 2009-01-00306에 기재된 분석 방법을 이용하여, LC-MS에 의해 총 148개의 샘플을 분석하였다. 검출 한계; 선형 범위: 아민 공여체 L-알라닌의 경우 0μ몰/L-550μ몰/L 및 아민 공여체 (S)-알파 메틸벤질아민의 경우 0μ몰/L-280μ몰/L.
N-아세틸-4- 아미노뷰티르알데하이드의 N-아세틸- DAB 로의 생물학적 전환의 결과
N-아세틸-DAB를 향한 N-아세틸-4-아미노뷰티르알데하이드의 경로에 대해 총 148개의 트랜스아미나제 효소를 선별하였다. 모든 샘플을 전환율에 대해 LC-MS에 의해 분석하였다. N-아세틸-DAB의 생성에 기초하여 전환율을 계산하였다. 아민 공여체로서 L-알라닌을 사용한 경우 총 31개의 아미노트랜스퍼라제 히트(hit)(>2% 전환율)를 발견하였다. 이들중 20개는 아민 공여체로서 (S)-α-메틸 벤질아민을 사용하는 경우에도 양성이었다. 이들 양성 히트중 5개가 표 5에 예시된다.
N-아세틸-4-아미노뷰티르알데하이드의 N-아세틸-DAB로의 생물학적 전환에서 2%보다 높은 전환율을 나타내는 히트
효소/기원 Orf/인서트(insert) 플랫폼
비브리오 플루비알리스 JS17 클론 SdW/RS AT3
슈도모나스 애루기노사 Pae_AT_gi9946143 SPEED TA 1
슈도모나스 애루기노사 Pae_AT_gi9951072 SPEED TA 1
파라코커스 데니트리피칸스 Pde_AT_ZP00628577 SdW/RS AT3
바실러스 웨이헨스테파넨시스 Bwe_AT_ZP01186960 SdW/RS AT3
N-아세틸- DAB 의 DAB 로의 생물학적 전환
선별 조건
모든 효소를 최종 부피 100㎕의 100mM 인산칼륨(pH 7.5)에 현탁시켰다. 인산칼륨 완충액 100mM중에 13.33mg/ml N-아세틸-DAB.HCl 150㎕를 첨가함으로써 효소 반응을 개시시켰다(최종 반응 농도 8mg/ml≒48mM N-아세틸-DAB). 반응 혼합물을 IKA 오비탈 쉐이커 상에서 460rpm으로 쉐이킹하면서 37℃에서 하룻밤동안 항온 처리하였다. 항온 처리 후, H2O중 100mM HClO4, pH 1.0 750㎕를 첨가함으로써 반응 혼합물을 중단 및 희석시켰다. 미소적정 플레이트를 3500rpm에서 20분간 원심분리시키고, 아래 기재되는 바와 같이 HPLC-PCR-FL 분석에 의해 DAB에 대해 분석하였다.
DAB 를 결정하기 위한 HPLC - MS 분석 방법
샘플 제조:
0.2% 폼산과 아세토나이트릴 및 물의 혼합물을 사용하여 샘플을 희석시킨다. 아세토나이트릴의 백분율은 50% 이상이어야 한다.
LC 조건:
칼럼: 50×4.6mm, HP HILIC, 3㎛[알테크(Alltech)]
칼럼 온도: 실온(24℃)
용리제: A: 0.2% 폼산을 함유하는 아세토나이트릴, B: 0.2% 폼산을 함유하는 물
구배:
Figure pct00001
유동: 1ml/분, MS에 들어가기 전 유동은 1:5로 나뉜다.
주입 부피: 2㎕
MS 조건:
이온화: 양이온 터보 이온스프레이
공급원 조건: 이온스프레이 전압: 5kV; 온도: 400℃; 단편 제거 전위: 51V; 초점 전위: 180V
스캔 모드 (DAB): 선택적인 이온 모드: m/z 72(체류 시간 200msec)
적용된 조건하에서 DAB는 6.3분에 용리된다.
N-아세틸- DAB 의 DAB 로의 생물학적 전환 결과
N-아세틸-DAB의 DAB로의 생물학적 전환에서 가수분해 활성을 나타내는, 시험된 효소로부터의 선택된 효소가 표 6에 나열된다. 이들 효소중 몇몇은 이 특허원에 인용되는 서열 정보에 의해 추가로 특성화된다.
N-아세틸-DAB의 DAB로의 가수분해
생체촉매 공급처 농도
DAB(μM)		 서열
번호		 유니프롯
번호
리조푸스 야포니쿠스 리파제 바이오캐털리스츠 리미티드
(Biocatalysts LTD)		 690
아스퍼길러스 니거 리파제(리파제 AP-6) 아마노(Amano) 278
알칼리게네스 종 리파제(리파제 QL) 메이토 산교
(Meito Sangyo)		 186
바실러스 아밀로리쿼파시엔스 프로테아제(프로테아제 B) 디에스엠-기스트
(DSM-Gist)		 142 19
바실러스 리체니폴미스 프로테아제(델볼라제) 디에스엠-기스트 162 20
리조푸스 오리재 리파제 디에스엠-기스트 1846 P61872
에스퍼라제 노보(NOVO) 158
알칼라제 노보 130
아스퍼길러스 종(아실라제) 시그마(Sigma) 270
프로자임 6 아마노 346
프로테아제 M 아마노 206
바실러스 서브틸리스(프로테아제 N) 아마노 514
마이코박테륨 네오아우룸 L-아미노 아미다제 디에스엠 1174
서다제 노보자임즈 530 21
화학적 블랭크 108
화학적 블랭크 104
결론
다수의 가수분해 효소가 N-아세틸-DAB를 DAB로 전환시키는 생체촉매로서 유용한 것으로 밝혀졌다.
예컨대 4-아미노뷰티르알데하이드 또는 오르니틴을 아실화시킴으로써, 예를 들어 폼산 중에서 아세트산 무수물로 아실화시켜 폼일 보호기를 도입함으로써, 또는 C2 내지 C6 카복실산 무수물 또는 아실 클로라이드를 반응시켜 각각 N-아세틸, N-프로피온일, N-뷰티릴, N-발레일 또는 N-카프로일 보호기를 도입함으로써, 다른 아실-보호기로 N-보호된 DAB 전구체를 제조할 수 있다. N-폼일-DAB 같은 이들 N-보호된 DAB 전구체, 및 C3 내지 C6 아실 보호기를 갖는 고급 동족체를 상기 기재된 효소에 의해 유사하게 전환시킬 수 있을 것으로 예상된다.
N 5 -아세틸-오르니틴의 N-아세틸- DAB 로의 생물학적 전환
세포 생육 및 발현
데카복실라제를 사용하여 이 생물학적 전환을 수행하였다. 표준 조건하에 대부분의 데카복실라제가 E. 콜라이에서 발현되었다.
글라이세롤 원료로부터 pBAD-DEST_lysA, pBAD-DEST_kdcA, pBAD-DEST_kivD 또는 pBAD-DEST_kgd를 갖는 E. 콜라이 Top10으로 5ml LBcarb 배지에 접종함으로써 예비 배양액을 제조하였다. 28℃에서 예비 배양액을 하룻밤동안 배양하고, 각 예비 배양액 0.5ml를 50ml LBcarb 배지에서 희석시켰다. 0.6의 OD600에 도달할 때까지(평균 3 내지 4시간 후) 배양액을 28℃에서 배양하였다. 아라비노즈를 0.02%의 최종 농도까지 첨가함으로써 단백질 발현을 유도하였다. 28℃에서 하룻밤동안 배양한 후, 세포를 수획하였다(10분, 5000rpm, 4℃). SDS-PAGE로 분석하기 위하여, 유도 전에, 유도한지 3시간 후에 및 하룻밤동안 샘플 1ml를 취하였다. 세포를 펠렛화시키고(5분, 13,000rpm) 펠렛을 -20℃에서 저장하였다.
두 오르니틴 데카복실라제 pBAD2_ODC E. 콜라이 DH5α/LJ110을 약간 상이한 조건하에서 생육시키고 발현시켰다. 이 때, 주 배양액은 50μM IPTG로 유도하기 전에 1.5의 OD620까지 생육시켰다. 다른 모든 조건은 상기 기재된 바와 동일하였다.
초음파 처리에 의한 CFE 제조
세포 펠렛을 얼음 위에서 해동시키고, 50mM 인산칼륨(KPi) 완충액 pH 7.5 2부피에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 10초간의 온 및 오프의 펄스로 10분간 초음파 처리하였다. 초음파 처리 후, 세포 찌꺼기를 원심분리(20분, 13,200rpm, 4℃)에 의해 펠렛화시켰다. SDS-PAGE 분석을 이용하여 발현 수준을 결정하였으며, CFE를 -20℃에서 저장하였다.
Figure pct00002
N-Ac-오르니틴의 N-Ac-DAB로의 반응물 모두를 교반하고 37℃에서 배양하였다. 샘플을 0; 2; 18; 28 및 44시간에 채취하고 -20℃에서 저장하였다. 분석을 위해, 각 샘플 500㎕를 아세토나이트릴 500㎕에 첨가하고 10분간 최대 속도로 회전시켰다. 샘플을 TLC 상에서 분석하고, 암모니아:메탄올(1:1)의 용리제를 사용하여 전개하며, 닌하이드라이드 분무로 염색한다. 정성 분석을 위해, 아래 기재되는 방법에 따라 LC-MS-MS에 의해 샘플을 측정한다.
N-아세틸- DAB 의 결정을 위한 HPLC - MS 분석 방법
샘플 제조 :
0.2% 폼산과 아세토나이트릴 및 물의 혼합물을 사용하여 샘플을 희석시킨다. 아세토나이트릴의 백분율은 50% 이상이어야 한다.
어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 제품인 PE SCIEX API2000 LC-MS/MS 상에서 실험을 수행하였다.
LC 조건 :
칼럼: 50×4.6mm, HP HILIC, 3㎛(알테크)
칼럼 온도: 실온(24℃)
용리제: A: 0.2% 폼산을 함유하는 아세토나이트릴, B: 0.2% 폼산을 함유하는 물
구배:
Figure pct00003
유동: 1ml/분, MS에 들어가기 전 유동은 1:5로 나뉜다.
주입 부피: 2㎕
MS 조건:
이온화: 양이온 터보 이온스프레이
공급원 조건: 이온스프레이 전압: 5kV; 온도: 400℃; 단편 제거 전위: 11V; 초점 전위: 350V
스캔 모드 (N-Ac-DAB): 선택적인 이온 모드: m/z 72 및 114(체류 시간 200msec)
적용된 조건하에서 N-Ac-DAB는 4.2분에 용리된다.
N 5 -아세틸-오르니틴의 N-아세틸- DAB 로의 생물학전 전환 결과
오르니틴의 DAB로의 전환율을 위해, 최종 시간 샘플(44시간)을 TLC 상에서 분석한다(도 1).
모든 최종 시간 샘플을 LC-MS-MS로 분석하였다. 대조용 샘플의 수준보다 3μ몰 이상 더 높은 값을 나타내는 것이 표 8에 기재된다.
생물학적 전환의 LC-MS-MS 결과
N-아세틸 DAB
m/z 131→72 m/z 131→114
샘플 μ몰/l μ몰/l
1 9 -
3 3 -
4 4 3
5 10 8
6 5 4
밀리몰/l 밀리몰/l
CB200109 370 344
SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> PROCESS FOR THE PREPARATION OF 1,4-BUTANEDIAMINE VIA N-ACYL OR N-GUANIDYL PROTECTED 1,4-BUTANEDIAMINE PRECURSORS <130> 27102-WO-PCT <140> PCT/EP2010/060480 <141> 2010-07-20 <150> EP 09166374.0 <151> 2009-07-24 <160> 26 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1371 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <220> <221> CDS <222> (1)..(1371) <223> amino transferase gi9946143 <400> 1 atg aac agc caa atc acc aac gcc aag acc cgt gag tgg cag gcg ttg 48 Met Asn Ser Gln Ile Thr Asn Ala Lys Thr Arg Glu Trp Gln Ala Leu 1 5 10 15 agc cgc gac cac cat ctg ccg ccg ttc acc gac tac aag cag ttg aac 96 Ser Arg Asp His His Leu Pro Pro Phe Thr Asp Tyr Lys Gln Leu Asn 20 25 30 gag aag ggc gcg cgg atc atc acc aag gcc gaa ggc gtc tat atc tgg 144 Glu Lys Gly Ala Arg Ile Ile Thr Lys Ala Glu Gly Val Tyr Ile Trp 35 40 45 gac agc gag ggc aac aag atc ctc gat gcg atg gcc ggc ctc tgg tgc 192 Asp Ser Glu Gly Asn Lys Ile Leu Asp Ala Met Ala Gly Leu Trp Cys 50 55 60 gtc aac gtc ggc tac ggc cgc gag gag ctg gtc cag gcc gcc acc cgg 240 Val Asn Val Gly Tyr Gly Arg Glu Glu Leu Val Gln Ala Ala Thr Arg 65 70 75 80 cag atg cgc gag ttg ccg ttc tac aac ctg ttc ttc cag acc gcc cac 288 Gln Met Arg Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His 85 90 95 ccg ccg gtg gtc gag ctg gcc aag gcg atc gcc gac gtc gct ccg gaa 336 Pro Pro Val Val Glu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Asp Val Ala Pro Glu 100 105 110 ggc atg aac cac gtg ttc ttc acc ggc tcc ggc tcc gag gcc aac gac 384 Gly Met Asn His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp 115 120 125 acc gtg ctg cgt atg gtc cgc cac tat tgg gcg acc aag ggc cag ccg 432 Thr Val Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Thr Lys Gly Gln Pro 130 135 140 cag aag aaa gtg gtg atc ggc cgc tgg aac ggc tac cac ggc tcc acc 480 Gln Lys Lys Val Val Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr 145 150 155 160 gtc gcc ggc gtc agc ctg ggc ggc atg aag gcg ttg cat gag cag ggt 528 Val Ala Gly Val Ser Leu Gly Gly Met Lys Ala Leu His Glu Gln Gly 165 170 175 gat ttc ccc atc ccg ggc atc gtc cac atc gcc cag ccc tac tgg tac 576 Asp Phe Pro Ile Pro Gly Ile Val His Ile Ala Gln Pro Tyr Trp Tyr 180 185 190 ggc gag ggc ggc gac atg tcg ccg gac gag ttc ggc gtc tgg gcc gcc 624 Gly Glu Gly Gly Asp Met Ser Pro Asp Glu Phe Gly Val Trp Ala Ala 195 200 205 gag cag ttg gag aag aag att ctc gaa gtg ggc gag gaa aac gtc gcc 672 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Glu Glu Asn Val Ala 210 215 220 gcc ttc atc gcc gag ccg atc cag ggc gcc ggc ggc gtg atc gtc ccg 720 Ala Phe Ile Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro 225 230 235 240 ccg gac acc tac tgg ccg aag atc cgc gag atc ctc gcc aag tac gac 768 Pro Asp Thr Tyr Trp Pro Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ala Lys Tyr Asp 245 250 255 atc ctg ttc atc gcc gac gaa gtg atc tgc ggc ttc ggc cgt acc ggc 816 Ile Leu Phe Ile Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly 260 265 270 gag tgg ttc ggc agc cag tac tac ggc aac gcc ccg gac ctg atg ccg 864 Glu Trp Phe Gly Ser Gln Tyr Tyr Gly Asn Ala Pro Asp Leu Met Pro 275 280 285 atc gcc aag ggc ctc acc tcc ggc tac atc ccc atg ggc ggg gtg gtg 912 Ile Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Val Val 290 295 300 gtg cgc gac gag atc gtc gaa gtg ctc aac cag ggc ggc gag ttc tac 960 Val Arg Asp Glu Ile Val Glu Val Leu Asn Gln Gly Gly Glu Phe Tyr 305 310 315 320 cac ggc ttc acc tat tcc ggt cac ccg gtg gcg gcc gcc gtg gcc ctg 1008 His Gly Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu 325 330 335 gag aac atc cgc atc ctg cgc gaa gag aag atc atc gag aag gtg aag 1056 Glu Asn Ile Arg Ile Leu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Glu Lys Val Lys 340 345 350 gcg gaa acg gca ccg tat ttg cag aaa cgc tgg cag gag ctg gcc gac 1104 Ala Glu Thr Ala Pro Tyr Leu Gln Lys Arg Trp Gln Glu Leu Ala Asp 355 360 365 cac ccg ttg gtg ggc gaa gcg cgc ggg gtc ggc atg gtc gcc gcc ctg 1152 His Pro Leu Val Gly Glu Ala Arg Gly Val Gly Met Val Ala Ala Leu 370 375 380 gag ctg gtc aag aac aag aag acc cgc gag cgt ttc acc gac aag ggc 1200 Glu Leu Val Lys Asn Lys Lys Thr Arg Glu Arg Phe Thr Asp Lys Gly 385 390 395 400 gtc ggg atg ctg tgc cgg gaa cat tgt ttc cgc aac ggt ttg atc atg 1248 Val Gly Met Leu Cys Arg Glu His Cys Phe Arg Asn Gly Leu Ile Met 405 410 415 cgc gcg gtg ggc gac act atg att atc tcg ccg ccg ctg gtg atc gat 1296 Arg Ala Val Gly Asp Thr Met Ile Ile Ser Pro Pro Leu Val Ile Asp 420 425 430 ccg tcg cag atc gat gag ttg atc acc ctg gcg cgc aag tgc ctc gat 1344 Pro Ser Gln Ile Asp Glu Leu Ile Thr Leu Ala Arg Lys Cys Leu Asp 435 440 445 cag acc gcc gcc gcc gtc ctg gct tga 1371 Gln Thr Ala Ala Ala Val Leu Ala 450 455 <210> 2 <211> 456 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 2 Met Asn Ser Gln Ile Thr Asn Ala Lys Thr Arg Glu Trp Gln Ala Leu 1 5 10 15 Ser Arg Asp His His Leu Pro Pro Phe Thr Asp Tyr Lys Gln Leu Asn 20 25 30 Glu Lys Gly Ala Arg Ile Ile Thr Lys Ala Glu Gly Val Tyr Ile Trp 35 40 45 Asp Ser Glu Gly Asn Lys Ile Leu Asp Ala Met Ala Gly Leu Trp Cys 50 55 60 Val Asn Val Gly Tyr Gly Arg Glu Glu Leu Val Gln Ala Ala Thr Arg 65 70 75 80 Gln Met Arg Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Leu Phe Phe Gln Thr Ala His 85 90 95 Pro Pro Val Val Glu Leu Ala Lys Ala Ile Ala Asp Val Ala Pro Glu 100 105 110 Gly Met Asn His Val Phe Phe Thr Gly Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp 115 120 125 Thr Val Leu Arg Met Val Arg His Tyr Trp Ala Thr Lys Gly Gln Pro 130 135 140 Gln Lys Lys Val Val Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr 145 150 155 160 Val Ala Gly Val Ser Leu Gly Gly Met Lys Ala Leu His Glu Gln Gly 165 170 175 Asp Phe Pro Ile Pro Gly Ile Val His Ile Ala Gln Pro Tyr Trp Tyr 180 185 190 Gly Glu Gly Gly Asp Met Ser Pro Asp Glu Phe Gly Val Trp Ala Ala 195 200 205 Glu Gln Leu Glu Lys Lys Ile Leu Glu Val Gly Glu Glu Asn Val Ala 210 215 220 Ala Phe Ile Ala Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro 225 230 235 240 Pro Asp Thr Tyr Trp Pro Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ala Lys Tyr Asp 245 250 255 Ile Leu Phe Ile Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly 260 265 270 Glu Trp Phe Gly Ser Gln Tyr Tyr Gly Asn Ala Pro Asp Leu Met Pro 275 280 285 Ile Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly Gly Val Val 290 295 300 Val Arg Asp Glu Ile Val Glu Val Leu Asn Gln Gly Gly Glu Phe Tyr 305 310 315 320 His Gly Phe Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu 325 330 335 Glu Asn Ile Arg Ile Leu Arg Glu Glu Lys Ile Ile Glu Lys Val Lys 340 345 350 Ala Glu Thr Ala Pro Tyr Leu Gln Lys Arg Trp Gln Glu Leu Ala Asp 355 360 365 His Pro Leu Val Gly Glu Ala Arg Gly Val Gly Met Val Ala Ala Leu 370 375 380 Glu Leu Val Lys Asn Lys Lys Thr Arg Glu Arg Phe Thr Asp Lys Gly 385 390 395 400 Val Gly Met Leu Cys Arg Glu His Cys Phe Arg Asn Gly Leu Ile Met 405 410 415 Arg Ala Val Gly Asp Thr Met Ile Ile Ser Pro Pro Leu Val Ile Asp 420 425 430 Pro Ser Gln Ile Asp Glu Leu Ile Thr Leu Ala Arg Lys Cys Leu Asp 435 440 445 Gln Thr Ala Ala Ala Val Leu Ala 450 455 <210> 3 <211> 1407 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <220> <221> CDS <222> (1)..(1407) <223> amino transferase gi9951072 <400> 3 atg aac gca aga ctg cac gcc acg tcc ccc ctc ggc gac gcc gac ctg 48 Met Asn Ala Arg Leu His Ala Thr Ser Pro Leu Gly Asp Ala Asp Leu 1 5 10 15 gtc cgt gcc gac cag gcc cac tac atg cac ggc tac cac gtg ttc gac 96 Val Arg Ala Asp Gln Ala His Tyr Met His Gly Tyr His Val Phe Asp 20 25 30 gac cac cgc gtc aac ggc tcg ctg aac atc gcc gcc ggc gac ggc gcc 144 Asp His Arg Val Asn Gly Ser Leu Asn Ile Ala Ala Gly Asp Gly Ala 35 40 45 tat atc tac gac acc gcc ggc aac cgc tac ctc gac gcg gtg ggc ggc 192 Tyr Ile Tyr Asp Thr Ala Gly Asn Arg Tyr Leu Asp Ala Val Gly Gly 50 55 60 atg tgg tgc acc aac atc ggc ctg ggg cgc gag gaa atg gct cgc acc 240 Met Trp Cys Thr Asn Ile Gly Leu Gly Arg Glu Glu Met Ala Arg Thr 65 70 75 80 gtg gcc gag cag acc cgc ctg ctg gcc tat tcc aat ccc ttc tgc gac 288 Val Ala Glu Gln Thr Arg Leu Leu Ala Tyr Ser Asn Pro Phe Cys Asp 85 90 95 atg gcc aac ccg cgc gcc atc gaa ctc tgc cgc aag ctc gcc gag ctg 336 Met Ala Asn Pro Arg Ala Ile Glu Leu Cys Arg Lys Leu Ala Glu Leu 100 105 110 gcc ccc ggc gac ctc gac cac gtg ttc ctc acc acc ggc ggt tcc acc 384 Ala Pro Gly Asp Leu Asp 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Gly Ala Phe Ile Ser Glu Pro Val Phe Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 gtg atc gtc ccg ccc gcg ggc tac cac agg cgg atg tgg gag ctg tgc 768 Val Ile Val Pro Pro Ala Gly Tyr His Arg Arg Met Trp Glu Leu Cys 245 250 255 cag cgc tac gac gtg ctg tac atc tcc gac gaa gtg gtg acc tcc ttc 816 Gln Arg Tyr Asp Val Leu Tyr Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Ser Phe 260 265 270 ggc cgc ctc ggc cac ttc ttc gcc agc cag gcg gtg ttc ggc gta cag 864 Gly Arg Leu Gly His Phe Phe Ala Ser Gln Ala Val Phe Gly Val Gln 275 280 285 ccg gac atc atc ctc acc gcc aag ggc ctc acc tcc ggc tac cag ccg 912 Pro Asp Ile Ile Leu Thr Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Gln Pro 290 295 300 ctg ggc gcg tgc atc ttc tcc cgg cgc atc tgg gag gtg atc gcc gag 960 Leu Gly Ala Cys Ile Phe Ser Arg Arg Ile Trp Glu Val Ile Ala Glu 305 310 315 320 ccg gac aag ggc cgc tgc ttc agc cat ggt ttc acc tac tcc ggc cac 1008 Pro Asp Lys Gly Arg Cys Phe Ser His Gly Phe Thr Tyr Ser Gly His 325 330 335 ccg gtg gcc tgc gcg gcg gcg ctg aag aac atc gag atc atc gag cgc 1056 Pro Val Ala Cys Ala Ala Ala Leu Lys Asn Ile Glu Ile Ile Glu Arg 340 345 350 gag ggc ttg ctc gcc cac gcc gac gag gtc ggc cgc tac ttc gag gag 1104 Glu Gly Leu Leu Ala His Ala Asp Glu Val Gly Arg Tyr Phe Glu Glu 355 360 365 cgc ctg caa agc ctc cgc gac ctg ccc atc gtc ggc gac gtg cgc ggg 1152 Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro Ile Val Gly Asp Val Arg Gly 370 375 380 atg cgc ttc atg gcc tgt gtc gag ttc gtc gcc gac aag gcg agc aag 1200 Met Arg Phe Met Ala Cys Val Glu Phe Val Ala Asp Lys Ala Ser Lys 385 390 395 400 gcg ctg ttt ccg gaa agc ctg aac atc ggc gag tgg gtc cac ctg cgg 1248 Ala Leu Phe Pro Glu Ser Leu Asn Ile Gly Glu Trp Val His Leu Arg 405 410 415 gcg cag aag cgc ggc ctg ctg gtt cgt ccg atc gtc cac ctg aac gtg 1296 Ala Gln Lys Arg Gly Leu Leu Val Arg Pro Ile Val His Leu Asn Val 420 425 430 atg tcg ccg ccg ctg atc ctc acc cgc gaa cag gtc gat acc gtg gtc 1344 Met Ser Pro Pro Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Val Asp Thr Val Val 435 440 445 cgg gtg ctg cgc gag agc atc gag gaa acc gtg gag gat ctt gtc cgc 1392 Arg Val Leu Arg Glu Ser Ile Glu Glu Thr Val Glu Asp Leu Val Arg 450 455 460 gcc ggt cac cgg taa 1407 Ala Gly His Arg 465 <210> 4 <211> 468 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 4 Met Asn Ala Arg Leu His Ala Thr Ser Pro Leu Gly Asp Ala Asp Leu 1 5 10 15 Val Arg Ala Asp Gln Ala His Tyr Met His Gly Tyr His Val Phe Asp 20 25 30 Asp His Arg Val Asn Gly Ser Leu Asn Ile Ala Ala Gly Asp Gly Ala 35 40 45 Tyr Ile Tyr Asp Thr Ala Gly Asn Arg Tyr Leu Asp Ala Val Gly Gly 50 55 60 Met Trp Cys Thr Asn Ile Gly Leu Gly Arg Glu Glu Met Ala Arg Thr 65 70 75 80 Val Ala Glu Gln Thr Arg Leu Leu Ala Tyr Ser Asn Pro Phe Cys Asp 85 90 95 Met Ala Asn Pro Arg Ala Ile Glu Leu Cys Arg Lys Leu Ala Glu Leu 100 105 110 Ala Pro Gly Asp Leu Asp His Val Phe Leu Thr Thr Gly Gly Ser Thr 115 120 125 Ala Val Asp Thr Ala Ile Arg Leu Met His Tyr Tyr Gln Asn Cys Arg 130 135 140 Gly Lys Arg Ala Lys Lys His Val Ile Thr Arg Ile Asn Ala Tyr His 145 150 155 160 Gly Ser Thr Phe Leu Gly Met Ser Leu Gly Gly Lys Ser Ala Asp Arg 165 170 175 Pro Ala Glu Phe Asp Phe Leu Asp Glu Arg Ile His His Leu Ala Cys 180 185 190 Pro Tyr Tyr Tyr Arg Ala Pro Glu Gly Leu Gly Glu Ala Glu Phe Leu 195 200 205 Asp Gly Leu Val Asp Glu Phe Glu Arg Lys Ile Leu Glu Leu Gly Ala 210 215 220 Asp Arg Val Gly Ala Phe Ile Ser Glu Pro Val Phe Gly Ser Gly Gly 225 230 235 240 Val Ile Val Pro Pro Ala Gly Tyr His Arg Arg Met Trp Glu Leu Cys 245 250 255 Gln Arg Tyr Asp Val Leu Tyr Ile Ser Asp Glu Val Val Thr Ser Phe 260 265 270 Gly Arg Leu Gly His Phe Phe Ala Ser Gln Ala Val Phe Gly Val Gln 275 280 285 Pro Asp Ile Ile Leu Thr Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Gln Pro 290 295 300 Leu Gly Ala Cys Ile Phe Ser Arg Arg Ile Trp Glu Val Ile Ala Glu 305 310 315 320 Pro Asp Lys Gly Arg Cys Phe Ser His Gly Phe Thr Tyr Ser Gly His 325 330 335 Pro Val Ala Cys Ala Ala Ala Leu Lys Asn Ile Glu Ile Ile Glu Arg 340 345 350 Glu Gly Leu Leu Ala His Ala Asp Glu Val Gly Arg Tyr Phe Glu Glu 355 360 365 Arg Leu Gln Ser Leu Arg Asp Leu Pro Ile Val Gly Asp Val Arg Gly 370 375 380 Met Arg Phe Met Ala Cys Val Glu Phe Val Ala Asp Lys Ala Ser Lys 385 390 395 400 Ala Leu Phe Pro Glu Ser Leu Asn Ile Gly Glu Trp Val His Leu Arg 405 410 415 Ala Gln Lys Arg Gly Leu Leu Val Arg Pro Ile Val His Leu Asn Val 420 425 430 Met Ser Pro Pro Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Val Asp Thr Val Val 435 440 445 Arg Val Leu Arg Glu Ser Ile Glu Glu Thr Val Glu Asp Leu Val Arg 450 455 460 Ala Gly His Arg 465 <210> 5 <211> 1362 <212> DNA <213> Vibrio fluvialis <220> <221> CDS <222> (1)..(1362) <223> omega-aminotransferase JS17 <400> 5 atg aac aaa ccg caa agc tgg gaa gcc cgg gcc gag acc tat tcg ctc 48 Met Asn Lys Pro Gln Ser Trp Glu Ala Arg Ala Glu Thr Tyr Ser Leu 1 5 10 15 tat ggt ttc acc gac atg cct tcg ctg cat cag cgc ggc acg gtc gtc 96 Tyr Gly Phe Thr Asp Met Pro Ser Leu His Gln Arg Gly Thr Val Val 20 25 30 gtg acc cat ggc gag gga ccc tat atc gtc gat gtg aat ggc cgg cgt 144 Val Thr His Gly Glu Gly Pro Tyr Ile Val Asp Val Asn Gly Arg Arg 35 40 45 tat ctg gac gcc aac tcg ggc ctg tgg aac atg gtc gcg ggc ttt gac 192 Tyr Leu Asp Ala Asn Ser Gly Leu Trp Asn Met Val Ala Gly Phe Asp 50 55 60 cac aag ggg ctg atc gac gcc gcc aag gcc caa tac gag cgt ttt ccc 240 His Lys Gly Leu Ile Asp Ala Ala Lys Ala Gln Tyr Glu Arg Phe Pro 65 70 75 80 ggt tat cac gcc ttt ttc ggc cgc atg tcc gat cag acg gta atg ctg 288 Gly Tyr His Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu 85 90 95 tcg gaa aag ctg gtc gag gtg tcg ccc ttt gat tcg ggc cgg gtg ttc 336 Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Asp Ser Gly Arg Val Phe 100 105 110 tat aca aac tcg ggg tcc gag gcg aat gac acc atg gtc aag atg cta 384 Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys Met Leu 115 120 125 tgg ttc ctg cat gca gcc gag ggc aaa ccg caa aag cgc aag atc ctg 432 Trp Phe Leu His Ala Ala Glu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu 130 135 140 acc cgc tgg aac gcc tat cac ggc gtg acc gcc gtt tcg gcc agc atg 480 Thr Arg Trp Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met 145 150 155 160 acc ggc aag ccc tat aat tcg gtc ttt ggc ctg ccg ctg ccg ggc ttt 528 Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe 165 170 175 gtg cat ctg acc tgc ccg cat tac tgg cgc tat ggc gaa gag ggc gaa 576 Val His Leu Thr Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu 180 185 190 acc gaa gag cag ttc gtc gcc cgc ctc gcc cgc gag ctg gag gaa acg 624 Thr Glu Glu Gln Phe Val Ala Arg Leu Ala Arg Glu Leu Glu Glu Thr 195 200 205 atc cag cgc gag ggc gcc gac acc atc gcc ggt ttc ttt gcc gaa ccg 672 Ile Gln Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Gly Phe Phe Ala Glu Pro 210 215 220 gtg atg ggc gcg ggc ggc gtg att ccc ccg gcc aag ggc tat ttc cag 720 Val Met Gly Ala Gly Gly Val Ile Pro Pro Ala Lys Gly Tyr Phe Gln 225 230 235 240 gcg atc ctg cca atc ctg cgc aaa tat gac atc ccg gtc atc tcg gac 768 Ala Ile Leu Pro Ile Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Pro Val Ile Ser Asp 245 250 255 gag gtg atc tgc ggt ttc gga cgc acc ggt aac acc tgg ggc tgc gtg 816 Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Asn Thr Trp Gly Cys Val 260 265 270 acc tat gac ttt aca ccc gat gca atc atc tcg tcc aag aat ctt aca 864 Thr Tyr Asp Phe Thr Pro Asp Ala Ile Ile Ser Ser Lys Asn Leu Thr 275 280 285 gcg ggc ttt ttc ccc atg ggg gcg gtg atc ctt ggc ccg gaa ctt tcc 912 Ala Gly Phe Phe Pro Met Gly Ala Val Ile Leu Gly Pro Glu Leu Ser 290 295 300 aaa cgg ctg gaa acc gca atc gag gcg atc gag gaa ttc ccc cat ggc 960 Lys Arg Leu Glu Thr Ala Ile Glu Ala Ile Glu Glu Phe Pro His Gly 305 310 315 320 ttt acc gcc tcg ggc cat ccg gtc ggc tgt gct att gcg ctg aaa gca 1008 Phe Thr Ala Ser Gly His Pro Val Gly Cys Ala Ile Ala Leu Lys Ala 325 330 335 atc gac gtg gtg atg aat gaa ggg ctg gct gag aac gtc cgc cgc ctt 1056 Ile Asp Val Val Met Asn Glu Gly Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Leu 340 345 350 gcc ccc cgt ttc gag gaa agg ctg aaa cat atc gcc gag cgc ccg aac 1104 Ala Pro Arg Phe Glu Glu Arg Leu Lys His Ile Ala Glu Arg Pro Asn 355 360 365 atc ggt gaa tat cgc ggc atc ggc ttc atg tgg gcg ctg gag gct gtc 1152 Ile Gly Glu Tyr Arg Gly Ile Gly Phe Met Trp Ala Leu 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gactgcaggc ttcttcccga tgggtgctgt tatcctgggt 900 ccggaactgt ctaaacgtct ggaaactgct atcgaagcaa tcgaagagtt cccgcacggc 960 ttcactgctt ctggtcaccc ggttggttgc gcaatcgcgc tgaaagcaat cgacgttgta 1020 atgaacgaag gtctggcaga aaacgttcgt cgtctggcac cgcgcttcga agagcgtctg 1080 aaacacatcg ctgaacgtcc gaacatcggt gaataccgcg gtatcggctt catgtgggcg 1140 ctggaagcgg ttaaagacaa agcgtctaaa actccgttcg acggtaacct gtctgtttct 1200 gaacgtatcg ctaacacctg tactgacctg ggtctgatct gccgtccgct gggtcagtct 1260 gttgttctgt gcccgccgtt catcctgact gaagcgcaga tggacgaaat gttcgacaaa 1320 ctggaaaaag cgctggataa agttttcgct gaagttgcgt aa 1362 <210> 8 <211> 1644 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <220> <221> CDS <222> (1)..(1644) <223> decarboxylase KdcA <400> 8 atg tat aca gta gga gat tac ctg tta gac cga tta cac gag ttg gga 48 Met Tyr Thr Val Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu His Glu Leu Gly 1 5 10 15 att gaa gaa att ttt gga gtt cct ggt gac tat aac tta caa ttt tta 96 Ile Glu Glu Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Phe Leu 20 25 30 gat caa att att tca cgc gaa gat atg aaa tgg att gga aat gct aat 144 Asp Gln Ile Ile Ser Arg Glu Asp Met Lys Trp Ile Gly Asn Ala Asn 35 40 45 gaa tta aat gct tct tat atg gct gat ggt tat gct cgt act aaa aaa 192 Glu Leu Asn Ala Ser Tyr Met Ala Asp Gly Tyr Ala Arg Thr Lys Lys 50 55 60 gct gcc gca ttt ctc acc aca ttt gga gtc ggc gaa ttg agt gcg atc 240 Ala Ala Ala Phe Leu Thr Thr Phe Gly Val Gly Glu Leu Ser Ala Ile 65 70 75 80 aat gga ctg gca gga agt tat gcc gaa aat tta cca gta gta gaa att 288 Asn Gly Leu Ala Gly Ser Tyr Ala Glu Asn Leu Pro Val Val Glu Ile 85 90 95 gtt ggt tca cca act tca aaa gta caa aat gac gga aaa ttt gtc cat 336 Val Gly Ser Pro Thr Ser Lys Val Gln Asn Asp Gly Lys Phe Val His 100 105 110 cat aca cta gca gat ggt gat ttt aaa cac ttt atg aag atg cat gaa 384 His Thr Leu Ala Asp Gly Asp Phe Lys His Phe Met Lys Met His Glu 115 120 125 cct gtt aca gca gcg cgg act tta ctg aca gca gaa aat gcc aca tat 432 Pro Val Thr Ala Ala Arg Thr Leu Leu Thr Ala Glu Asn Ala Thr Tyr 130 135 140 gaa att gac cga gta ctt tct caa tta cta aaa gaa aga aaa cca gtc 480 Glu Ile Asp Arg Val Leu Ser Gln Leu Leu Lys Glu Arg Lys Pro Val 145 150 155 160 tat att aac tta cca gtc gat gtt gct gca gca aaa gca gag aag cct 528 Tyr Ile Asn Leu Pro Val Asp Val Ala Ala Ala Lys Ala Glu Lys Pro 165 170 175 gca tta tct tta gaa aaa gaa agc tct aca aca aat aca act gaa caa 576 Ala Leu Ser Leu Glu Lys Glu Ser Ser Thr Thr Asn Thr Thr Glu Gln 180 185 190 gtg att ttg agt aag att gaa gaa agt ttg aaa aat gcc caa aaa cca 624 Val Ile Leu Ser Lys Ile Glu Glu Ser Leu Lys Asn Ala Gln Lys Pro 195 200 205 gta gtg att gca gga cac gaa gta att agt ttt ggt tta gaa aaa acg 672 Val Val Ile Ala Gly His Glu Val Ile Ser Phe Gly Leu Glu Lys Thr 210 215 220 gta act cag ttt gtt tca gaa aca aaa cta ccg att acg aca cta aat 720 Val Thr Gln Phe Val Ser Glu Thr Lys Leu Pro Ile Thr Thr Leu Asn 225 230 235 240 ttt ggt aaa agt gct gtt gat gaa tct ttg ccc tca ttt tta gga ata 768 Phe Gly Lys Ser Ala Val Asp Glu Ser Leu Pro Ser Phe Leu Gly 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Ser Tyr Asn Asp Ile Pro Met Trp Asn Tyr 465 470 475 480 tcg aaa tta cca gaa aca ttt gga gca aca gaa gat cgt gta gta tca 1488 Ser Lys Leu Pro Glu Thr Phe Gly Ala Thr Glu Asp Arg Val Val Ser 485 490 495 aaa att gtt aga aca gag aat gaa ttt gtg tct gtc atg aaa gaa gcc 1536 Lys Ile Val Arg Thr Glu Asn Glu Phe Val Ser Val Met Lys Glu Ala 500 505 510 caa gca gat gtc aat aga atg tat tgg ata gaa cta gtt ttg gaa aaa 1584 Gln Ala Asp Val Asn Arg Met Tyr Trp Ile Glu Leu Val Leu Glu Lys 515 520 525 gaa gat gcg cca aaa tta ctg aaa aaa atg ggt aaa tta ttt gct gag 1632 Glu Asp Ala Pro Lys Leu Leu Lys Lys Met Gly Lys Leu Phe Ala Glu 530 535 540 caa aat aaa tag 1644 Gln Asn Lys 545 <210> 9 <211> 547 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 9 Met Tyr Thr Val Gly Asp Tyr Leu Leu Asp Arg Leu His Glu Leu Gly 1 5 10 15 Ile Glu Glu Ile Phe Gly Val Pro Gly Asp Tyr Asn Leu Gln Phe Leu 20 25 30 Asp Gln Ile Ile Ser Arg Glu Asp Met Lys Trp Ile Gly Asn Ala Asn 35 40 45 Glu Leu Asn Ala Ser Tyr Met Ala Asp Gly Tyr 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Ala Phe Phe Gly Arg Met Ser Asp Gln Thr Val Met Leu 85 90 95 tcg gaa aag ctg gtc gag gtc tcg cca ttc gac aac ggc cgg gtc ttc 336 Ser Glu Lys Leu Val Glu Val Ser Pro Phe Asp Asn Gly Arg Val Phe 100 105 110 tat acc aat tcc ggc tcc gag gcg aac gac acc atg gtc aag atg ctg 384 Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Asp Thr Met Val Lys Met Leu 115 120 125 tgg ttc ctg cat gcc gcc gag ggc aag ccg caa aag cgc aag atc ctg 432 Trp Phe Leu His Ala Ala Glu Gly Lys Pro Gln Lys Arg Lys Ile Leu 130 135 140 acg cgc tgg aac gcc tat cac ggc gtg acc gcg gtt tcg gcc tcg atg 480 Thr Arg Trp Asn Ala Tyr His Gly Val Thr Ala Val Ser Ala Ser Met 145 150 155 160 acc ggc aag ccc tac aac tcg gtc ttc ggc ctg ccg ctg ccc ggc ttc 528 Thr Gly Lys Pro Tyr Asn Ser Val Phe Gly Leu Pro Leu Pro Gly Phe 165 170 175 atc cac ctg acc tgc ccg cat tac tgg cgc tat ggc gag gaa ggc gag 576 Ile His Leu Thr Cys Pro His Tyr Trp Arg Tyr Gly Glu Glu Gly Glu 180 185 190 acc gag gcg caa ttc gtc gcc cgc ctg gca cgc gag ctt gag gat acc 624 Thr 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gat att gat gga aac 144 Ile Ile Thr Lys Ala Glu Gly Ala Trp Val Thr Asp Ile Asp Gly Asn 35 40 45 cgt tat tta gac ggt atg tcc ggt ctt tgg tgc gtg aat gtt ggg tat 192 Arg Tyr Leu Asp Gly Met Ser Gly Leu Trp Cys Val Asn Val Gly Tyr 50 55 60 ggt cga aaa gaa ctt gca aga gcg gcg ttt gaa cag ctt gaa gaa atg 240 Gly Arg Lys Glu Leu Ala Arg Ala Ala Phe Glu Gln Leu Glu Glu Met 65 70 75 80 ccg tat ttc cct ctg act caa agt cat gtt cct gct att aaa tta gca 288 Pro Tyr Phe Pro Leu Thr Gln Ser His Val Pro Ala Ile Lys Leu Ala 85 90 95 gaa aaa ttg aat gaa tgg ctt gat gat gaa tac gtc att ttc ttt tct 336 Glu Lys Leu Asn Glu Trp Leu Asp Asp Glu Tyr Val Ile Phe Phe Ser 100 105 110 aac agt gga tcg gaa gcg aat gaa aca gca ttt aaa att gct cgt caa 384 Asn Ser Gly Ser Glu Ala Asn Glu Thr Ala Phe Lys Ile Ala Arg Gln 115 120 125 tat cat caa caa aaa ggt gat cat gga cgc tat aag ttt att tcc cgc 432 Tyr His Gln Gln Lys Gly Asp His Gly Arg Tyr Lys Phe Ile Ser Arg 130 135 140 tac cgc gct tat cac ggt aac tca atg gga gct ctt gca gca aca ggt 480 Tyr Arg Ala Tyr His Gly Asn Ser Met Gly Ala Leu Ala Ala Thr Gly 145 150 155 160 caa gca cag cga aag tat aaa tat gaa cca ctc ggg caa gga ttc ctg 528 Gln Ala Gln Arg Lys Tyr Lys Tyr Glu Pro Leu Gly Gln Gly Phe Leu 165 170 175 cat gta gca ccg cct gat acg tat cga aat cca gag gat gtt cat aca 576 His Val Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Arg Asn Pro Glu Asp Val His Thr 180 185 190 ctg gca agt gct gag gaa atc gat cgt gtc atg aca tgg gag tta agc 624 Leu Ala Ser Ala Glu Glu Ile Asp Arg Val Met Thr Trp Glu Leu Ser 195 200 205 caa aca gta gcc ggt gtg att atg gag cca atc att act ggg ggc gga 672 Gln Thr Val Ala Gly Val Ile Met Glu Pro Ile Ile Thr Gly Gly Gly 210 215 220 att tta atg cct cct gat gga tat atg gga aaa gta aaa gaa att tgc 720 Ile Leu Met Pro Pro Asp Gly Tyr Met Gly Lys Val Lys Glu Ile Cys 225 230 235 240 gag aag cac ggt gcg ttg ctc att tgt gat gaa gtt ata tgt gga ttt 768 Glu Lys His Gly Ala Leu Leu Ile Cys Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe 245 250 255 ggc cgg aca ggg aag cca ttt gga ttt atg aat tat ggc gtc aaa cca 816 Gly Arg Thr Gly Lys Pro Phe Gly Phe Met Asn Tyr Gly Val Lys Pro 260 265 270 gat atc att aca atg gca aaa ggt att aca agt gcg tat ctt cct ttg 864 Asp Ile Ile Thr Met Ala Lys Gly Ile Thr Ser Ala Tyr Leu Pro Leu 275 280 285 tca gca aca gca gtt aga cga gag gtt tat gag gca ttc gta ggt agt 912 Ser Ala Thr Ala Val Arg Arg Glu Val Tyr Glu Ala Phe Val Gly Ser 290 295 300 gat gat tat gat cgc ttc cgc cat gta aat acg ttc gga ggg aat cct 960 Asp Asp Tyr Asp Arg Phe Arg His Val Asn Thr Phe Gly Gly Asn Pro 305 310 315 320 gct gct tgc gct tta gct ttg aag aat tta gaa att atg gag aat gag 1008 Ala Ala Cys Ala Leu Ala Leu Lys Asn Leu Glu Ile Met Glu Asn Glu 325 330 335 aaa ctc att gaa cgt tcc aaa gaa ttg ggt gaa cga ctg tta tat gag 1056 Lys Leu Ile Glu Arg Ser Lys Glu Leu Gly Glu Arg Leu Leu Tyr Glu 340 345 350 cta gag gat gta aaa gag cat cca aac gta ggg gat gtt cgc gga aag 1104 Leu Glu Asp Val Lys Glu His Pro Asn Val Gly Asp Val Arg Gly Lys 355 360 365 ggc ctt ctt tta ggc att gaa cta gtg gaa gat aag caa aca aaa gaa 1152 Gly Leu Leu Leu Gly Ile Glu Leu Val Glu Asp Lys Gln Thr Lys Glu 370 375 380 ccg gct tcc att gaa aag atg aac aaa gtc atc aat gct tgt aaa gaa 1200 Pro Ala Ser Ile Glu Lys Met Asn Lys Val Ile Asn Ala Cys Lys Glu 385 390 395 400 aaa ggt cta att att ggt aaa aat ggt gac act gtc gca ggt tac aat 1248 Lys Gly Leu Ile Ile Gly Lys Asn Gly Asp Thr Val Ala Gly Tyr Asn 405 410 415 aat att ttg cag ctt gca cct cca tta agc atc aca gag gaa gac ttt 1296 Asn Ile Leu Gln Leu Ala Pro Pro Leu Ser Ile Thr Glu Glu Asp Phe 420 425 430 act ttt atc gtt aaa aca atg aaa gaa tgt tta tcc cgc att aac ggg 1344 Thr Phe Ile Val Lys Thr Met Lys Glu Cys Leu Ser Arg Ile Asn Gly 435 440 445 cag taa 1350 Gln <210> 17 <211> 449 <212> PRT <213> Bacillus weihenstephanensis <400> 17 Met Gln Ala Thr Glu Gln Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr Asp Glu Lys 1 5 10 15 Tyr Leu Trp His Ala Met Arg Gly Ala Ala Pro Ser Pro Thr Asn Leu 20 25 30 Ile Ile Thr Lys Ala Glu Gly Ala Trp Val Thr Asp 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ttatggcgta aaacctgaca ttattaccat ggctaaaggc 840 attacttccg cttatctgcc gctgagcgcg accgcagttc gccgcgaagt ttatgaagcg 900 tttgttggtt ctgatgatta cgaccgtttc cgtcatgtaa acacgtttgg cggtaaccca 960 gcggcatgtg cgctggcgct gaaaaacctg gaaatcatgg aaaacgaaaa gctgatcgaa 1020 cgtagcaaag aactgggtga acgtctgctg tacgaactgg aagatgtcaa agaacacccg 1080 aacgtgggcg atgttcgcgg taaaggcctg ctgctgggta ttgaactggt tgaagacaaa 1140 cagaccaagg aaccggcttc cattgaaaag atgaacaaag tgattaacgc gtgcaaagag 1200 aaaggcctga tcattggtaa gaacggtgat accgtggcag gttataacaa cattctgcag 1260 ctggcgccgc ctctgagcat cactgaagaa gatttcacct tcatcgtcaa aactatgaag 1320 gagtgcctga gccgcatcaa tggtcagtaa 1350 <210> 19 <211> 300 <212> PRT <213> Bacillus amyloliquefaciens <220> <221> mat_peptide <222> (1)..(300) <223> Protease B <400> 19 Ala Ala Thr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Leu Lys Gly Lys Thr Val Ser 1 5 10 15 Leu Asn Ile Ser Ser Glu Ser Gly Lys Tyr Val Leu Arg Asp Leu Ser 20 25 30 Lys Pro Thr Gly Thr Gln Ile Ile Thr Tyr Asp Leu Gln Asn Arg Glu 35 40 45 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Gln Pro Ala Glu Pro Trp Ser Phe Val Lys Asn Thr Thr 50 55 60 Ser Tyr Pro Pro Met Cys Cys Gln Glu Pro Ile Gly Gly Gln Met Leu 65 70 75 80 Ser Asp Leu Phe Thr Asn Arg Lys Glu Arg Leu Ile Pro Glu Phe Ser 85 90 95 Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Ile Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Thr Lys 100 105 110 Arg Gly Arg Leu Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Gly Leu Val 115 120 125 Val Gly Gly Ala Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Ala Leu Ala Ala His Glu 130 135 140 Asn Val Val Val Val Ala Ile Gln Tyr Arg Leu Gly Ile Trp Gly Phe 145 150 155 160 Phe Ser Thr Gly Asp Glu His Ser Arg Gly Asn Trp Gly His Leu Asp 165 170 175 Gln Val Ala Ala Leu His Trp Val Gln Glu Asn Ile Ala Asn Phe Gly 180 185 190 Gly Asp Pro Gly Ser Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly Gly Glu 195 200 205 Ser Val Ser Val Leu Val Leu Ser Pro Leu Ala Lys Asn Leu Phe His 210 215 220 Arg Ala Ile Ser Glu Ser Gly Val Ala Phe Thr Ala Gly Leu Val Arg 225 230 235 240 Lys Asp Met Lys Ala Ala Ala Lys Gln Ile Ala Val Leu Ala Gly Cys 245 250 255 Lys Thr Thr Thr Ser Ala Val Phe Val His Cys Leu Arg Gln Lys Ser 260 265 270 Glu Asp Glu Leu Leu Asp Leu Thr Leu Lys Met Lys Phe Phe Ala Leu 275 280 285 Asp Leu His Gly Asp Pro Arg Glu Ser His Pro Phe Leu Thr Thr Val 290 295 300 Val Asp Gly Val Leu Leu Pro Lys Met Pro Glu Glu Ile Leu Ala Glu 305 310 315 320 Lys Asp Phe Asn Thr Val Pro Tyr Ile Val Gly Ile Asn Lys Gln Glu 325 330 335 Phe Gly Trp Leu Leu Pro Thr Met Met Gly Phe Pro Leu Ser Glu Gly 340 345 350 Lys Leu Asp Gln Lys Thr Ala Thr Ser Leu Leu Trp Lys Ser Tyr Pro 355 360 365 Ile Ala Asn Ile Pro Glu Glu Leu Thr Pro Val Ala Thr Asp Lys Tyr 370 375 380 Leu Gly Gly Thr Asp Asp Pro Val Lys Lys Lys Asp Leu Phe Leu Asp 385 390 395 400 Leu Met Gly Asp Val Val Phe Gly Val Pro Ser Val Thr Val Ala Arg 405 410 415 Gln His Arg Asp Ala Gly Ala Pro Thr Tyr Met Tyr Glu Phe Gln Tyr 420 425 430 Arg Pro Ser Phe Ser Ser Asp Lys Lys Pro Lys Thr Val Ile Gly Asp 435 440 445 His Gly Asp Glu Ile Phe Ser Val Phe Gly Phe Pro Leu Leu Lys Gly 450 455 460 Asp Ala Pro Glu Glu Glu 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60 cgccac 66 <210> 26 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Reverse primer for aminotransferase of Pseudomonas aeruginosa gi9951072 <400> 26 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt taccggtgac cggcgcgg 48

Claims (13)

1,4-다이아미노뷰테인[DAB]의 하나 이상의 N-보호된 전구체를 생체촉매로 생성시킨 후 시험관 내에서(in vitro) N-보호된 전구체를 DAB로 전환시킴을 포함하는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
a) DAB의 N-보호된 전구체를 생체촉매로 제조하여 DAB의 N-보호된 전구체를 함유하는 생체촉매 반응 혼합물을 수득하는 단계;
b) 생체촉매 반응 혼합물로부터 N-보호된 전구체를 회수하는 단계; 및
c) N-보호된 전구체를 DAB로 전환시키는 단계
를 포함하는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
DAB의 N-보호된 전구체가 N5-보호된 오르니틴, N-보호된 DAB 및 N-보호된 4-아미노뷰티르알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
DAB의 하나 이상의 N-보호된 전구체가 N5-아세틸 오르니틴, N-아세틸 DAB 및 N-아세틸 4-아미노뷰티르알데하이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
생체촉매 사용 단계가 발효 단계인, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
제 5 항에 있어서,
발효 단계가 단세포 숙주에서 수행되는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
제 6 항에 있어서,
발효 단계가 동물 세포, 식물 세포, 세균, 고세균, 효모 및 진균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 숙주 세포에서 수행되는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
제 2 항에 있어서,
생체촉매 반응 혼합물로부터의 N-보호된 전구체의 회수가 여과, 침강, 결정화, 친화력 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 막 분리 및 증발로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단계에 의해 수행되는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
제 2 항에 있어서,
N-보호된 전구체를 DAB로 전환시키는 단계 c)가 하나 이상의 효소 처리 단계 또는 화학적 처리 단계를 포함하는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 있어서,
N-보호된 DAB가 가수분해 효소에 의해 DAB로 전환되는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
제 10 항에 있어서,
가수분해 효소가 카복실산 에스터 하이드롤라제, 티올에스터 하이드롤라제, 리파제 및 펩티다제로 이루어진 군으로부터, 특히 리파제 및 펩티다제로 이루어진 군으로부터 선택되어 사용되는, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
제 10 항에 있어서,
가수분해 효소가 세린-형 카복시펩티다제, 메탈로카복시-펩티다제, 시스테인-형 카복시펩티다제, 세린 엔도펩티다제, 시스테인 엔도펩티다제, 아스파르트산 엔도펩티다제 및 메탈로엔도펩티다제로 이루어진 군으로부터, 특히 세린 엔도펩티다제로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩티다제인, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
제 12 항에 있어서,
세린 엔도펩티다제가 서브틸리신, 바람직하게는 서브틸리신 칼스버그(Carlsberg)인, 하나 이상의 생체촉매 사용 단계를 포함하는 DAB의 제조 방법.
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