KR20120085495A

KR20120085495A - 콩 함유 이소플라본의 극초단파 산 가수분해를 통한 아글리콘 추출방법

Info

Publication number: KR20120085495A
Application number: KR1020110006845A
Authority: KR
Inventors: 정명근
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2011-01-24
Publication date: 2012-08-01
Also published as: KR101233117B1

Abstract

본 발명은 극초단파 처리를 이용한 산 가수분해에 의해 콩 이소플라본 아글리콘을 효율적으로 추출하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 건조 및 분쇄한 콩 종자 분말을 산 용액에 침지하고 극초단파를 조사하면서 가수분해시키는 과정, 상기 가수분해 된 콩 종자 분말과 산 용액의 혼합물에 알콜을 첨가하고 실온에서 방치하여 이소플라본 아글리콘을 추출하는 과정, 및, 상기 이소플라본 아글리콘을 여과하여 분리하는 과정을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의하면, 극초단파를 적용할 경우 기존의 드라이 오븐 처리를 이용한 콩 이소플라본 아글리콘의 추출 방법과 비교하여 더 쉽고, 시간이 적게 소요되며, 재현성 및 신뢰성이 높은 산 가수분해 방법을 제공할 수 있다.

Description

콩 함유 이소플라본의 극초단파 산 가수분해를 통한 아글리콘 추출방법{Extracting method of isoflavone aglycone from soybean isoflavone by microwave assisted acid hydrolysis}

본 발명은 콩으로부터 이소플라본 배당체를 비배당체인 이소플라본 아글리콘의 형태로 간단하고 쉽게 가수분해 후 분리 추출하는 방법에 관한 것이다.

콩[Glycine max (L.) Merr.] 함유 이소플라본은 In vitro 및 In vivo 계에서 유사 에스트로겐/항 에스트로겐 활성, 항증식(antiproliferation), 세포-주기 저지(cell-cycle arrest) 및 암세포 사멸(apoptosis)의 유도, 산화 방지, 숙주 면역계의 조절 및 세포 신호변화 등 다양한 인체 건강 효과가 있다는 다수의 연구보고가 있어 많은 주목을 받아왔다. 또한, 이소플라본은 콩이 나타내는 심혈관계 질환의 위험을 낮추거나 자궁을 절제한 쥐에서 뼈의 무기질 손실을 방지하는 등의 효과에 상당한 영향을 미치는 것으로 보고되고 있다.

이러한 이소플라본을 추출하는 방법은 고전적인 속실렛(soxhlet) 추출, 자석 교반(magnetic stirring), 초임계 유체(supercritical fluid) 추출, 고압의 액체 추출(pressurized liquid extraction), 고상 추출(solid phase extraction) 및 초음파 추출(ultrasound assisted extraction) 등의 방법이 있으며, 이소플라본의 분석은 대개 수용성 유기용매(메탄올, 에탄올 또는 아세토니트릴)를 사용하여 추출한 후, HPLC-UVD(UV detector)를 이용한 분석법으로 수행되고 있다.

일반적으로 식물체에 함유된 이소플라본은 아글리콘과 당이 결합된 이소플라본 배당체 형태로 존재하며, 콩에 함유된 이소플라본 역시 아글리콘과 β-글루코사이드(β-glucoside) 사이에 콘쥬게이트(conjugates)된 글리코사이드 유도체 즉 배당체 형태로 존재한다. 따라서, 상기한 방법으로 콩의 이소플라본을 추출하는 경우에는 대부분 이소플라본 배당체 형태로 추출된다.

현재 콩에 함유된 이소플라본은 약 12종이 알려져 있고, 이들 중 9종 성분은 배당체 형태로, 나머지 3종의 성분은 미량으로서 아글리콘 형태로 존재하는 것으로 알려져 있으며, 9종의 배당체 유도체는 가수분해에 의해 상기 3종의 아글리콘 형태로 전환된다. 이에, 식품 및 콩에 함유된 총 이소플라본의 정량적 분석을 위한 실험적 방법으로서 배당체 형태의 이소플라본으로 분석할 경우 12종의 분리, 분석에 따른 오랜 분석시간이 소요되는 점, 아울러 12종의 정량적 표준품이 구비되어야 하는 등 많은 시간 및 경제적 불이익으로 인해 가수분해 방법을 이용하여 3종의 아글리콘 형태로 전환하여 간편하게 분석하는 방법을 많이 이용하고 있다.

또한 현재 상업적으로 유통되고 있는 이소플라본 배당체 유도체의 분석 표준품이 거의 존재하지 않거나, 간혹 유통된다 하더라도 극미량이 엄청난 고가이므로 이러한 요인이 이소플라본의 정성 및 정량적 분석의 어려움으로 작용하여 왔으며, 이러한 문제를 극복하기 위해 이소플라본 분석 시 배당체 유도체의 가수분해 후 아글리콘으로의 전환을 유도한 후, 분리 및 검출을 실시하고, 이 가수분해 방법에 의해 유리된 아글리콘의 양자화(quantization)의 이용을 야기하였다.

이소플라본 배당체의 가수분해를 위한 방법이 몇몇 연구자에 의해 보고된 바 있는데, 그 중에서 드라이 오븐을 이용하고 염산(HCl)에 의한 산 가수분해는 가장 널리 사용되는 방법이며, 기타 효소 및 알칼리에 의한 가수분해법 또한 보고된 바 있다.

그러나, 상기한 가수분해 방법들은 상대적으로 복잡하고, 많은 노동력을 필요로 하는 시간 소모적이며, 다양한 실험 설비를 필요로 하고, 재현성 부족 등의 문제점이 있다. 또한, 드라이 오븐을 이용한 산 가수분해 방법은 이소플라본 분석에 많이 사용되어 왔으나, 콩 종자에 함유된 이소플라본의 함량 분석을 위한 정확한 산 가수분해 시간, 산 가수분해 후 이소플라본 아글리콘의 추출 시간 및 추출량에 대한 정확한 정보가 제공되지 않은 실정이다.

따라서, 이소플라본을 연구하는 다양한 연구자들에게 간편, 효율적이고, 경제적이며, 신뢰할 수 있는 효율적 가수분해 기술의 제공은 반드시 필요할 것이다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 콩의 산 가수분해 시 극초단파 처리를 이용할 경우 콩으로부터 이소플라본을 비배당체인 이소플라본 아글리콘 형태로 단시간에 간단하고 고효율로 전환, 추출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 극초단파 처리를 이용한 산 가수분해 방법에 의하여 콩으로부터 이소플라본을 이소플라본 아글리콘 형태로 전환, 추출할 수 있는 새로운 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 일례로서 본 발명의 콩 이소플라본 아글리콘의 추출방법은, 건조 및 분쇄한 콩 종자 분말을 산 용액에 침지하고 극초단파를 조사하면서 가수분해시키는 과정, 상기 가수분해 된 콩 종자 분말과 산 용액의 혼합물에 알콜을 첨가하고 실온에서 방치하여 이소플라본 아글리콘을 추출하는 과정, 및, 상기 이소플라본 아글리콘을 여과하여 분리하는 과정을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명의 콩 이소플라본 아글리콘의 추출방법을 과정별로 구체적으로 설명한다.

먼저, 건조 및 분쇄한 콩 종자 분말을 산 용액에 침지하고 극초단파를 조사하면서 가수분해시키는 과정이다.

콩 종자는 건조 및 분쇄하여 준비하며, 여기에 산 용액을 혼합한다. 산 용액은 염산(HCl)을 비롯하여 다양한 유기 및 무기산을 사용하는 것이 가능하며, 농도는 0.1 N 내지 6 N 수준으로 조절하는 것이 바람직하다. 이러한 산 용액은 콩 건조 중량대비 5 내지 30 배 첨가하여 산 용액에 건조된 콩 분말이 충분히 침지되도록 하는 것이 바람직하다.

한편, 극초단파는 식물이나 식품으로부터 유기 화합물을 추출하기 위한 고전적인 방법의 대안으로 사용되어 왔다. 이는 극초단파에 의한 시료 내 수분의 선택적이고 빠른 국소 가열의 원리를 이용하는 것으로, 국소 가열에 의하여 시료의 세포내 압력이 증가하고, 화합물이 세포로부터 추출 용매 속으로 빠르게 전이된다. 또한, 추가적으로, 밀폐된 용기를 사용하면 극초단파에 의한 추출이 높은 온도에서 수행될 수 있으므로 시료 매트릭스로부터 목표하는 화합물의 전이를 가속화시킨다. 따라서, 극초단파는 용매 함량을 감소시킬 수 있고 추출 효율을 향상시킬 수 있다.

본 발명에서는 콩 함유 이소플라본 배당체의 산 가수분해를 위해 극초단파 조사를 이용한다. 이때 상기 극초단파의 조사는 45 내지 55 분간, 바람직하기로는 50 분간 수행되는 것이 콩 이소플라본 아글리콘의 수득율 측면에서 좋으며, 상기와 같이 극초단파의 조사를 이용하여 이루어지는 가수분해는 95 내지 105 ℃ 조건에서 45 내지 55 분간, 바람직하기로는 100 ℃에서 50 분간 수행되는 것이 좋다.

다음으로, 상기 가수분해 된 콩 종자 분말과 산 용액의 혼합물에 알콜을 첨가하고 실온에서 방치하여 이소플라본 아글리콘을 추출하는 과정이다.

극초단파 조사를 이용하여 수행된 상기한 가수분해가 이루어진 후 가수분해 된 콩 종자 분말과 산 용액의 혼합물에 알콜을 첨가하는데, 이러한 알콜로는 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜을 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 에탄올을 사용하는 것이 좋다. 이러한 알콜은 가수분해 된 콩 종자 분말과 산 용액의 혼합물 중량대비 1 내지 20 배 첨가하는 것이 좋다. 상기와 같이 알콜을 첨가하고 실온에 방치하는데, 상기 실온 방치는 2 내지 3 시간 동안, 바람직하기로는 3 시간 수행되는 것이 좋다.

상기와 같이 극초단파 조사를 이용하여 수행된 가수분해를 통하면 콩 이소플라본 배당체는 비배당체인 이소플라본 아글리콘으로 전환되고, 이후 알콜을 첨가하여 실온에서 일정시간 방치하는 동안 콩 이소플라본 비배당체인 이소플라본 아글리콘은 알콜 추출용액으로 완전하게 용해되어 추출된다.

마지막으로, 상기 이소플라본 아글리콘 추출용액을 여과하여 분리하는 과정이다.

상기 과정에서 가수분해 된 콩 분말과 산 용액의 혼합물에 알콜을 첨가하여 실온에 일정시간 방치한 후 여과하여 고형분을 제거한 반응용액을 희석하고 RP-HPLC를 수행하면 전환율을 확인할 수 있고, 상기 과정에 의해 콩의 이소플라본 아글리콘을 고효율로 얻을 수 있다.

본 발명은 콩에 함유된 이소플라본 함량을 고려한 적정 산 가수분해 조건으로 기존의 드라이 오븐 처리와 비교하여 보다 짧은 시간에 간단한 방법으로 이소플라본 아글리콘을 추출할 수 있는 극초단파 처리를 이용한 산 가수분해 방법을 처음으로 제시하였다. 본 발명은 산 가수분해 방법, 가수분해 시간 및 이소플라본 추출 시간의 3 가지 매개 변수에 따른 콩 이소플라본 함량 측정을 수행함으로서, 산 가수분해 시 극초단파 처리를 도입할 경우 기존의 방법보다 빠르고, 효율적이며, 신뢰성 있는 산 가수분해 방법의 제공에 관한 것이다. 또한 최적의 조건이 극초단파를 사용하여 100 ℃에서 50분간 1 N HCl을 이용하여 콩을 가수분해하는 것임을 확인하였다.

상기한 본 발명에 의하면 극초단파 처리에 의한 산 가수분해 방법이 배당체 형태인 이소플라본 글리코사이드를 그들의 아글리콘으로 전환하는데 사용될 수 있는 매력적인 방법임을 확인할 수 있다.

상기한 본 발명에 의하면, 극초단파를 이용하여 드라이 오븐 처리 등과 같은 기존의 콩 이소플라본 아글리콘 추출 방법과 비교해서 더 쉽고, 빠르며, 효율적이고, 비용이 적게 소요되며, 신뢰성 높은 산 가수분해 방법을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 콩과 콩 유래 식품으로부터 이소플라본의 탈글리코실화(deglycosylation)의 방법으로서 적용될 수 있는 효과를 기대할 수 있다.

또한, 이소플라본은 식물체 내에서는 대부분 식물체내 보관상 가장 안정한 형태인 이소플라본 배당체 형태로 존재하고 있으나, 인체 내에서는 배당체 형태로 흡수 후 분해되어 이소플라본 아글리콘 형태로 대사되는 것으로 알려져 있다. 이를 위해서 이소플라본 배당체 형태로 섭취된 이소플라본은 체내 간에서 효소적 반응에 의해 탈글리코실화 작용을 받아 이소플라본 아글리콘으로 전환되며, 본 발명에 의하면 배당체 형태의 이소플라본이 실제 체내 이용 및 대사형태인 이소플라본 아글리콘 형태로 쉽게 전환 및 분리될 수 있고, 이소플라본 아글리콘 형태로 섭취가 가능하기 때문에 체내 간에 대한 부담을 줄여줄 수 있는 등의 잇점도 있다.

또한, 본 발명에 의하면 이소플라본 아글리콘 표준품 생산의 용이성 제공과 함께 이소플라본 아글리콘 형태로 섭취될 수 있는 약품, 식품 등의 제조분야를 비롯하여 다양한 관련 산업분야에 큰 영향을 미칠 수 있을 것으로 기대한다.

도 1에서 (A)는 콩에 함유된 12 종 이소플라본의 화학구조를 나타낸 것이고, (B)는 국내 육성 콩 품종인 신팔달콩의 비 가수분해(80% 에탄올 수용액, 85℃, 3 시간 추출) 시료 추출물의 콩 이소플라본 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다[1; 다이아드진, 2; 글라이시틴, 3; 제니스틴, 4; 말로닐다이아드진, 5; 말로닐제니스틴, 6; 다이아드제인, 7; 글라이시테인, 8; 제니스테인].
도 2는 100 ℃ 드라이 오븐에서 가수분해 시간에 따른 콩 이소플라본 배당체의 아글리콘화를 HPLC 크로마토그램으로 나타낸 것이다[A; 30 분, B; 60 분, C; 90 분, D; 120 분, E; 180 분, F; 240 분, 1; 다이아드진, 2; 글라이시틴, 3; 제니스틴, 4; 말로닐다이아드진, 5; 말로닐제니스틴, 6; 다이아드제인, 7; 글라이시테인, 8; 제니스테인].
도 3은 100 ℃ 드라이 오븐에서 가수분해 시간에 따른 다이아드제인, 글라이시테인, 제니스테인 및 총 이소플라본 함량의 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 극초단파 처리법을 적용하고 가수분해 시간에 따른 콩 이소플라본의 HPLC 크로마토그램을 나타낸 것이다[A; 10 분, B; 20 분, C; 30 분, D; 40 분, E; 50 분, F; 60 분, 1; 다이아드진, 2; 글라이시틴, 3; 제니스틴, 4; 말로닐다이아드진, 5; 말로닐제니스틴, 6; 다이아드제인, 7; 글라이시테인, 8; 제니스테인].

이하, 본 발명을 실시예 등에 의하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 다음 실시예 등에 의하여 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 사용한 시료, 화학물질 및 사용기구

콩 종자는 신팔달콩(Shinpaldalkong)을 농촌진흥청 산하 국립식량과학원 기능성작물부로부터 분양받아 사용하였다. 콩 종자는 40℃에서 24 시간동안 건조시키고 마이크로 밀(Culatty AG, Zurich, Swiss) 을 사용하여 분쇄한 후 1.0 mm 스크린의 체로 체질하고 플라스틱 봉지에 밀봉하여 4 ℃로 보관하면서 사용하였다.

메탄올, 에탄올, 아세토니트릴 및 염산(HCl)은 머크사(Merck Co. Darmstadt, Germany)로부터 구입하였다. 이소플라본 표준품 중 다이아드제인(daidzein), 제니스테인(genistein) 및 글라이시테인(glycitein)은 선행연구자(Lee et al., 2008)로부터 제공받았다. 다이아드진(daidzin), 제니스틴(genistin) 및 글라이시틴(glycitin)은 알핀 사(Apin Chemicals LTD. Oxon, UK)로부터 구입하였다. 말로닐 글루코사이드(glucosides)와 아세틸 글루코사이드(acetyl glucosides)는 푸지코 사(Fujicco Co LTD.Kobe, Japan)와 나카라이 테스케 사(Nacalai Tesque Inc. Kobe, Japan)로부터 구입하였다. 초순수는 밀리포어사(Millipore, Bedford, MA, USA)의 밀리-Q 정수 시스템(Mili-Q water purifier system)을 이용하여 제조하였다. 이소플라본 글루코사이드와 아글리콘의 상대순도는 98% 이상이었고, 말로닐 글루코사이드와 아세틸 글루코사이드의 상대순도는 90% 이상이었다. 각 이소플라본의 스탁 용액(stock solutions)은 메탄올 함량 80%(v/v)로 준비하였으며, -20℃에 저장하면서 사용하였다.

자외-가시광선 흡수 스펙트라는 Infinite M200 spectrophotometer(Tecan Austria GmbH, Untersbergstrasse 1A, Austria)를 이용하여 측정하였다. HPLC 분석은 HPLC 분석기(Agilent 1200 series, Wilmington, DE)로서, 쿼터너리 펌프(quaternary pump), 포토다이오드 어레이 디텍터(photo diode array detector)(Agilent 1200 series), 노바-팍 C18 가드 칼럼(Waters, Milford, MA)을 장착한 YMC ODS AM 303 칼럼(5 μm; 250 x 4.6 mm i.d., Waters, Milford, MA)을 사용하였다.

비교예 1. HPLC 에 의한 콩 이소플라본의 분석

HPLC에 의한 콩 이소플라본의 분석을 위해 분석파장을 254 nm로 설정한 포토 다이오드 어레이 디텍터가 장착된 HPLC 분석기(Agilent 1200 series HPLC system, Wilmington, DE)를 사용하였다. 분리는 노바-팍 C18 가드 칼럼(Waters, Milford, MA)을 장착한 YMC ODS AM 303 칼럼(5 μm; 250 x 4.6 mm i.d., Waters, Milford, MA)을 사용하여 수행되었다. 칼럼 온도는 30℃로 유지하였고, 이동상은 A 용매(밀리-Q로 정수된 초순수 중 0.1%(v/v) 아세트산 수용액)와 B 용매(아세토니트릴 중 0.1%(v/v) 아세트산 용액)로 이루어졌다. 분리는 하기한 B 용매의 농도구배를 이용하여 수행되었다. 즉 15 ~ 28%로 10분, 28 ~ 35%로 20분, 35 ~ 55%로 10분 및 55 ~ 75%로 10분, 이어서 등용매 용리(isocratic elution)를 10분간 수행하였다. 유속은 1.0 mL/min로, 시료 주입량은 20 μL로 조절하였다. 이소플라본의 함량은 외부 표준검량 곡선에 의해 HPLC 피크 면적과 비교하여 계산하였다. 외부 표준검량 곡선(r = 0.999^**)은 이소플라본 표준품 함량으로 0.05 내지 1 ㎍ 이 포함된 80% 메탄올 용액 20 μL를 주입하여 작성하였다.

비교예 2. 드라이 오븐 처리에 의한 이소플라본의 가수분해

신팔달콩(Shinpaldalkong)의 이소플라본 함유 양상을 분석하기 위하여, 비가수분해(non-hydrolysis) 콩 종자(대조군, 1.0 g)에 80% 에탄올 수용액 50 mL을 첨가하여 85 ℃에서 3 시간동안 환류추출기를 사용하여 추출하였다(Murphy, Barua, & Hauck, 2002). 또한 드라이 오븐 처리에 의한 산 가수분해를 위하여, 콩 종자 1.0 g 을 1N HCl 용액 10 mL와 함께 25 mL 캡-반응 바이알에 투여하였다. 혼합물은 각 가수분해 시간(30 내지 240 분) 동안 100 ℃ 드라이 오븐에서 가열한 후 실온에서 냉각시켰다. 냉각 후, 15 mL 의 에탄올을 각 혼합물에 첨가하고, 3 시간동안 방치하여 이소플라본을 추출하였다.

최적의 이소플라본 추출시간을 결정하기 위하여 120 분간 산 가수분해된 콩 시료를 사용하여 추출 시간(1, 3, 6, 9, 및 12 시간)에 따라 얻어진 결과물을 여과지와 0.45 ㎛ 막 필터(Millex-HN, Millipore, Bedford, MA, USA)를 사용하여 여과하고, 반응용액을 에탄올과 혼합하여 희석하였다(반응 용액 1 mL: EtOH 1 mL). 상기 20 μL 의 반응 용액을 HPLC에 주입하여 분석하였다.

실시예 . 극초단파 처리에 의한 이소플라본의 산 가수분해

극초단파 처리에 의한 이소플라본의 산 가수분해는 극초단파 추출기(ETHOS TOUCH CONTROL, Milestone, Sorisole, Italy) 상에서 수행되었다. 이소플라본의 극초단파 산 가수분해는 100 ℃, 500 W에서 자석 교반(magnetic stirring)하며 수행하였고, 1회에 4개의 용기(3개의 시료와 온도 프루브를 장착한 1개의 참조용)를 사용하였다. 각각의 가수분해 시간(10 내지 60 분)동안 콩 이소플라본의 가수분해가 수행되었다.

즉, 캡-반응 바이얼에 담긴 분쇄한 콩 1g 이 포함된 10 mL의 1N HCl 용액을 각 가수분해 시간동안 상기 극초단파 추출기에 넣고 가수분해를 수행한 후 혼합물은 실온에서 냉각시켰다. 15 mL의 에탄올을 각 혼합물에 첨가하고 3 시간동안 방치하여 이소플라본을 추출하였다. 이를 여과지와 0.45 ㎛ 막 필터(Millex-HN, Millipore, Bedford, MA, USA)를 사용하여 여과한 후 반응용액을 에탄올과 혼합하여 희석하였다(반응 용액 1 mL: EtOH 1 mL). 상기 반응용액 20 μL 를 HPLC에 주입하여 분석하였다.

참고예 2. 통계 분석

통계 분석은 SAS 통계 프로그램(Version 9.1, 2002, SAS Cary, NC)을 사용하여 일반 선형 모델(the general linear model procedure, GLM)에 의하여 수행되었다. 본 명세서의 실험설계는 난괴법(randomized block design)에 의하여 수행되었고 3 반복으로 실시되었다. 던칸의 다중검증(Duncan's multiple range test, DMRT)은 확률 수준 0.05 로 설정하였다.

실험예 1. 콩 이소플라본의 HPLC 크로마토그램

신팔달콩 종자를 환류 추출하여 수득한 콩 이소플라본 추출물의 HPLC 크로마토그램에 의하면 8 개의 이소플라본 피크를 얻을 수 있었다. 상기 8개의 이소플라본은 다이아드진(daidzin), 글라이시틴(glycitin), 제니스틴(genistin), 말로닐다이아드진(malonyldaidzin), 말로닐제니스틴(malonylgenistin), 다이아드제인(daidzein), 글라이시테인(glycitein), 및 제니스테인(genistein)이며, HPLC 분석 시 머무름 시간 50분 이내에서 베이스라인 분리(base-line resolution)가 아주 양호하였다[도 1의 B].

일반적으로, 콩 종자는 도 1의 A에 나타낸 바와 같이 총 12 개의 이소플라본을 함유하고 있으며(Lee, Yan, Ahn, & Chung, 2003; Rostagno, Palma, & Barroso, 2004), 본 실험예에서는 신팔달콩 종자의 콩 추출물에서 8개의 이소플라본을 확인하였다. 유전자형에 따라 개별적인 이소플라본의 조성 및 함량에 차이가 있음은 선행 연구로 잘 알려져 있다(Lee, Yan, Ahn, & Chung, 2003; Lee et al., 2003).

실험예 2. 드라이 오븐처리에 의한 적정 산 가수분해와 추출 시간의 결정

콩 이소플라본은 각각의 가수분해 시간(30, 60, 90, 120, 180, 및 240 분)동안 100 ℃ 드라이 오븐에서 1N HCl을 사용하여 산 가수분해시켜 얻었다.

가수분해 시간에 따라 얻어진 각각의 콩 이소플라본 HPLC 크로마토그램은 도 2에 도시하였다. 각 시간별 가수분해가 완료되었을 때, 이소플라본 아글리콘의 함량도 증가하였으며, 대부분의 다이아드진, 글라이시틴, 제니스틴, 말로닐다이아드진, 및 말로닐제니스틴은 120 분에서 아글리콘으로 가수분해 되었다[도 2의 D]. 또한, 이소플라본 글루코사이드는 180 분에서 각각의 아글리콘으로 완전히 전환되었다[도 2의 E]. 도 3 및 도 4 는 100 ℃ 드라이 오븐 처리 시 가수분해 시간에 따른 다이아드제인, 글라이시테인, 제니스테인 및 총 이소플라본 함량의 변화를 보여준다.

다이아드제인, 글라이시테인 및 제니스테인의 함량은 가수분해 시간에 따라 확연히 상이하게 나타났다. 가수분해 시간이 180 분까지 증가할 때, 다이아드제인과 글라이시테인의 함량은 증가하여 최고 함량에 도달하고, 180 분 이후에는 평형을 이루었다. 반면 제니스테인은 120 분에 최고 함량에 도달하였다[도 3]. 제니스테인의 함량은 최고 함량에 도달한 후 감소하는 경향을 보였는데(120 분 이후), 이는 아마도 가수분해 시간 증가에 따라 제니스테인 분자가 분해된데 기인한 것으로 보인다(Chiang, Shih, & Chu, 2001). 또한, 가수분해 시간에 따른 총 이소플라본 함량은 제니스테인 함량과 유의한 상관을 보였다.

상기한 결과는 100 ℃ 드라이 오븐에서 120 분간 수행되는 산 가수분해가 콩 종자로부터 이소플라본 아글리콘을 최대 함량으로 얻을 수 있는 가장 좋은 조건임을 의미한다. 산 가수분해 된 시료로부터 최대 함량의 이소플라본을 추출하기 위해서, 120 분 동안 산 가수분해 된 시료에 알콜을 첨가하여 이소플라본 추출 시간을 1 시간에서 3, 6, 9 및 12 시간으로 증가시키며 추출효율을 검토한 결과는 다음 표 1에 나타내었다.

추출시간(시간)	이소플라본 함량(㎍/g)
추출시간(시간)	다이아드제인	글라이시테인	제니스테인	총 함량
1	508.7a^a	173.3a	648.8c	1330.8b
3	484.3b	159.7a	700.2b	1334.3ab
6	500.5ab	173.6a	714.2ab	1388.3a
9	494.2ab	172.2a	692.4b	1358.8ab
12	496.9ab	167.7a	731.9a	1396.5a
^aData with different letters in a same column differed significantly at p = 0.05.

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 콩의 산 가수분해 용액에 존재하는 대부분의 이소플라본 아글리콘은 추출 3 시간 만에 거의 99% 추출되었고, 총 이소플라본은 12 시간 추출에 의하여 최대 함량을 얻었다. 총 이소플라본 함량에 대한 3, 6, 9 및 12 시간 추출시간 간에 통계적 유의성은 인정되지 않았으며, 따라서 3 시간 이상의 추출은 큰 의미가 없음을 알 수 있다.

즉, 콩 종자에서 최대의 이소플라본 함량을 얻기 위해서는 100 ℃ 드라이 오븐 처리를 이용할 경우 120 분간 산 가수분해와 가수분해 완료 후 실온에서 3 시간의 추출을 위한 방치가 필요하다.

실험예 3. 극초단파 처리에 의한 산 가수분해와 추출 시간의 결정

극초단파 조사를 이용할 경우 적정 가수분해 시간의 결정을 위해서, 콩 시료를 1N HCl로 10 내지 60 분 동안 시간별로 가수분해 시켰다. 극초단파 조사를 이용하여 각 시간별로 가수분해하여 얻어진 결과물의 HPLC 크로마토그램은 도 4에 나타내었다. 모든 이소플라본 글루코사이드는 50분 만에 그들의 아글리콘으로 완전히 가수분해 되었다[도 4의 E]. 가수분해 시간에 따른 이소플라본 아글리콘의 함량 변화는 표 2에 나타내었다.

가수분해시간(분)	이소플라본 함량(㎍/g)
가수분해시간(분)	다이아드제인	글라이시테인	제니스테인	총 함량
10	239.2d^a	148.8c	420.3d	808.3e
20	384.3e	170.4ab	674.8c	1229.4d
30	406.1b	178.9a	681.6c	1266.5d
40	418.7b	167.0ab	724.4b	1313.0c
50	487.5a	167.8b	792.9a	1448.2a
60	485.5a	174.6ab	718.6b	1378.6b
^aData with different letters in a same column differed significantly at p = 0.05.

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 각 이소플라본 아글리콘의 함량은 가수분해 시간에 따라 증가되었다. 다이아드제인과 제니스테인은 50 분에 최대 함량에 도달하였고, 반면 글라이시테인의 최대 함량은 30분 만에 도달하였다. 또한, 총 이소플라본 함량은 상이한 가수분해 시간에 따른 다이아드제인 및 제니스테인의 변화양상과 유사한 경향을 보였다. 총 이소플라본 함량은 50분까지 가수분해되는 동안 유의적으로 증가하였고, 반면 60분 가수분해의 경우 이소플라본의 총 함량은 50분의 경우보다 감소되었다.

식물이나 식품으로부터 유기 화합물의 추출에 있어서 전통적인 방법의 대안으로 사용되어 온 극초단파는, 사용되는 용매의 양과 추출시간을 감소시키는 등 추출 효율의 향상을 확인할 수 있다.

드라이 오븐 처리 시 120분간 산 가수분해한 기존의 산 가수분해 방법과 극초단파 처리를 이용한 50 분간 산 가수분해한 본 발명의 방법에 의하여 얻어진 개별적인 아글리콘과 총 이소플라본 함량을 비교한 표 1 및 2를 검토하면, 두 방법에 따른 각각의 이소플라본 아글리콘과 총 이소플라본 함량에는 차이가 없었다.

이러한 결과는 드라이 오븐 처리, 즉 일반적인 기존 산 가수분해에 의하여 최대의 이소플라본 아글리콘을 수득하기 위해서는 적어도 120 분의 산 가수분해 시간이 필요하나[도 2 및 3], 극초단파 처리에 의해 콩 종자로부터 최대 이소플라본 아글리콘을 수득하기 위해서는 50 분의 산 가수분해 시간만이 필요함을 의미한다[도 4 및 표 2]. 따라서, 극초단파 처리에 의한 이소플라본 글리코사이드의 산 가수분해 방법은 상대적으로 작은 시간의 투입만으로도 드라이 오븐 처리와 비교하여 유사한 결과를 얻을 수 있음을 확인할 수 있다.

상기한 결과에 근거할 때, 극초단파 처리를 이용한 산 가수분해가 콩 이소플라본의 함량을 평가하기 위한 더욱 간편하고, 신뢰할 수 있는 산 가수분해법 임을 알 수 있다.

이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다.

도 1에서, 1은 다이아드진(daidzin), 2는 글라이시틴(glycitin), 3은 제니스틴(genistin), 4는 말로닐다이아드진(malonyldaidzin), 5는 말로닐제니스틴(malonylgenistin), 6은 다이아드제인(daidzein), 7은 글라이시테인(glycitein), 8은 제니스테인(genistein)이다.
도 2에서, 1은 다이아드진, 2는 글라이시틴, 3은 제니스틴, 4는 말로닐다이아드진, 5는 말로닐제니스틴, 6은 다이아드제인, 7은 글라이시테인, 8은 제니스테인이다.
도 4에서, 1은 다이아드진, 2는 글라이시틴, 3은 제니스틴, 4는 말로닐다이아드진, 5는 말로닐제니스틴, 6은 다이아드제인, 7은 글라이시테인, 8은 제니스테인이다.

Claims

건조 및 분쇄한 콩 종자 분말을 산 용액에 침지하고 극초단파를 조사하면서 가수분해시키는 과정,
상기 가수분해 된 콩 종자 분말과 산 용액의 혼합물에 알콜을 첨가하고 실온에서 방치하여 이소플라본 아글리콘을 추출하는 과정, 및,
상기 이소플라본 아글리콘을 여과하여 분리하는 과정
을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 콩 이소플라본 아글리콘의 추출방법.
청구항 1에 있어서,
상기 산 용액은 콩 건조 중량대비 5 내지 30 배 첨가하는 것을 특징으로 하는 콩 이소플라본 아글리콘의 추출방법.
청구항 1에 있어서,
상기 극초단파의 조사는 45 내지 55 분간 수행되는 것을 특징으로 하는 콩 이소플라본 아글리콘의 추출방법.
청구항 1에 있어서,
상기 가수분해는 95 내지 105 ℃ 조건에서 45 내지 55 분간 수행되는 것을 특징으로 하는 콩 이소플라본 아글리콘의 추출방법.
청구항 1에 있어서,
상기 알콜은 가수분해된 콩 종자 분말과 산 용액의 혼합물 중량대비 1 내지 20 배 첨가하는 것을 특징으로 하는 콩 이소플라본 아글리콘의 추출방법.
청구항 1에 있어서,
상기 실온 방치는 2 내지 3 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 콩 이소플라본 아글리콘의 추출방법.