KR20120084755A - Ｒｓｖ-특이적 결합 분자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 RSV에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 기능적 등가물에 관한 것이다. 상기 항체를 코딩하는 핵산 서열뿐만 아니라 항체를 생성하는 세포 및 상기 항체의 제조 방법도 제공된다.
Description
본 발명은 생물학 및 의약의 분야에 관한 것이다.
호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus; RSV)는 파라믹소바이러스(paramyxovirus)의 패밀리에 속하는 흔한 감기 바이러스이다. RSV는 병독성을 나타내고 용이하게 전염될 수 있고 2세 미만의 아동에서 하기도(lower respiratory tract) 질환의 가장 흔한 원인이다. 보육시설 이용 아동의 98% 이하가 단일 RSV 계절에 감염될 것이다. RSV 감염을 갖는 아동의 0.5% 내지 3.2%는 입원을 필요로 한다. 연간 약 90,000명의 병원 입원 및 4500명의 사망이 미국에서 보고되었다. RSV로 인한 입원에 대한 주된 위험 인자는 조산, 만성 폐질환, 선천성 심장 질환, 손상된 면역, 및 달리 건강한 아동에서 6주보다 더 어린 연령이다. 적절한 영양공급 및 산소 요법 형태의 보조 관리 이외에 RSV 양성 세기관지염의 효과적인 치료는 이용가능하지 않다. 항바이러스 요법, 예컨대, 리바비린(Ribavirin)은 RSV 감염에 있어서 효과적인 것으로 입증되지 않았다. 한 단일클론 항체인 팔리비주마브(Palivizumab)(신나기스(Synagis)로도 지칭됨)는 RSV 감염에 대한 예방용으로 등록되어 있다. 팔리비주마브는 RSV의 융합 단백질(F 단백질)에 대한 유전적으로 조작된(인간화된) 단일클론 항체이다. RSV의 F 단백질은 바이러스 막 단백질이고 부착 후 비리온과 숙주 세포의 융합을 책임진다. 또한, 세포융합체의 형성을 통한 이웃 세포들의 감염은 F 단백질에 의해 촉진되고 그의 기능은 상기 단백질의 원래의 올리고머 구조에 의해 좌우되는 것으로 생각된다. 그러나, 팔리비주마브가 항상 효과적인 것은 아니다. 따라서, RSV에 대한 대안적 및/또는 보충적 항체 및 요법이 당업계에서 필요하다.
본 발명의 목적은 RSV에 대한 개선된 항체 또는 이 항체의 기능적 등가물을 제공하는 것이다. 추가적 목적은 기존 RSV-특이적 항체와 조합될 때 상승작용적 효과를 제공하는 RSV에 대한 보충적 항체를 제공하는 것이다. 본 발명의 추가적 목적은 공지된 RSV-특이적 항체를 유도하는 에피토프와 상이한 에피토프에 대해 유도되는, RSV F 단백질에 대한 인간 또는 인간화된 항체, 또는 이의 기능적 등가물을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스에 특이적으로 결합할 수 있고 하기 서열을 포함하는 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다:
- 서열 KLSIH(서열번호 4)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열,
- 서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열,
- 서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열,
- 서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열,
- 서열 GASSRAT(서열번호 24)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 LSSDSSI(서열번호 28)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열.
도 1: 신규 전장 인간 단일클론 항체인 AM22는 팔리비주마브에 비해 Hep2 세포 상에서 RSV A2 바이러스를 매우 효율적으로 중화시킨다.
도 2: AM22 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열.
도 3: 인간 항-RSV 단일클론 항체는 ELISA 및 FACS 염색에 의해 확인될 때 RSV의 융합(F) 단백질 상의 입체구조적 에피토프를 인식한다. 도 3a는 RSV F 또는 RSV G 단백질로 가성유형화된(pseudotyped) 수포성 구내염 바이러스(VSV)로 감염된 EL-4 세포와 항체의 결합을 보여준다. 도 3b는 RSV로 감염된 HEp2의 용해물로 코팅된 ELISA 플레이트(좌측 패널) 또는 재조합 HIS 태그 포함 F 단백질로 코팅된 Ni-NTA 히스소르프(HisSorp) 플레이트(퀴아젠)(우측 패널)와 항-RSV F 항체의 결합을 보여준다. F 단백질에의 항체 결합은 HRP-접합된 IgG 검출 항체(희석 1:2500, 잭슨)에 의해 검출된다. 도 3c는 폴리 HIS 태그를 함유하는 재조합 RSV F 긴 균주(Long strain)와 원래의 B 세포 클론의 결합을 보여주는데, 이때 B 세포 수용체(BCR)에의 결합은 항-펜타HIS 항체에 의해 검출된다. 도 3d에서 본 발명자들은 삼량체화 도메인(ILZ 도메인)을 함유하는 재조합 RSV F 구축물로 형질감염된 293T 세포와 인간 항-RSV 항체의 세포내 결합을 보여준다.
도 4: 인간 면역글로불린으로 예방적으로 처리된 코튼(Cotton) 래트에서의 RSV 챌린지(challenge). 도 4a는 코튼 래트에서 표시된 투여량의 항체의 근육내 투여 후 1일째 날 및 5일째 날에 혈청으로부터의 인간 IgG1의 회수를 보여준다. 도 4b는 RSV-X로의 감염 24시간 전에 표시된 항체로 처리된 코튼 래트의 폐 내의 RSV 적재를 보여준다. RSV 적재는 TCID50 배양물로의 감염 후 5일째 날에 측정되었다. 실험은 처리군 당 4마리 내지 6마리의 개별 동물들을 사용하여 2회 수행하였다. 폐 병리는 동일한 동물 군(도 4c)에서 연구되었고, AM22 및 팔리비주마브의 평균 폐 병리가 표시되어 있다(표 2 또한 참조).
도 2: AM22 중쇄 및 경쇄 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열.
도 3: 인간 항-RSV 단일클론 항체는 ELISA 및 FACS 염색에 의해 확인될 때 RSV의 융합(F) 단백질 상의 입체구조적 에피토프를 인식한다. 도 3a는 RSV F 또는 RSV G 단백질로 가성유형화된(pseudotyped) 수포성 구내염 바이러스(VSV)로 감염된 EL-4 세포와 항체의 결합을 보여준다. 도 3b는 RSV로 감염된 HEp2의 용해물로 코팅된 ELISA 플레이트(좌측 패널) 또는 재조합 HIS 태그 포함 F 단백질로 코팅된 Ni-NTA 히스소르프(HisSorp) 플레이트(퀴아젠)(우측 패널)와 항-RSV F 항체의 결합을 보여준다. F 단백질에의 항체 결합은 HRP-접합된 IgG 검출 항체(희석 1:2500, 잭슨)에 의해 검출된다. 도 3c는 폴리 HIS 태그를 함유하는 재조합 RSV F 긴 균주(Long strain)와 원래의 B 세포 클론의 결합을 보여주는데, 이때 B 세포 수용체(BCR)에의 결합은 항-펜타HIS 항체에 의해 검출된다. 도 3d에서 본 발명자들은 삼량체화 도메인(ILZ 도메인)을 함유하는 재조합 RSV F 구축물로 형질감염된 293T 세포와 인간 항-RSV 항체의 세포내 결합을 보여준다.
도 4: 인간 면역글로불린으로 예방적으로 처리된 코튼(Cotton) 래트에서의 RSV 챌린지(challenge). 도 4a는 코튼 래트에서 표시된 투여량의 항체의 근육내 투여 후 1일째 날 및 5일째 날에 혈청으로부터의 인간 IgG1의 회수를 보여준다. 도 4b는 RSV-X로의 감염 24시간 전에 표시된 항체로 처리된 코튼 래트의 폐 내의 RSV 적재를 보여준다. RSV 적재는 TCID50 배양물로의 감염 후 5일째 날에 측정되었다. 실험은 처리군 당 4마리 내지 6마리의 개별 동물들을 사용하여 2회 수행하였다. 폐 병리는 동일한 동물 군(도 4c)에서 연구되었고, AM22 및 팔리비주마브의 평균 폐 병리가 표시되어 있다(표 2 또한 참조).
본 발명은 도 2에 도시된 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 갖는 "AM22"로 명명된 항체를 제공한다. 특히 AM22의 항원 결합성에 기여하는 AM22의 CDR 서열도 도 2에 도시되어 있다. 항체 AM22는 전장 인간 항체이고 RSV에 특이적으로 결합할 수 있으므로(도 3), 인간 개체에 대한 예방적 및/또는 치료적 사용을 위해 바람직하다.
전술된 바와 같이, 유일하게 입수가능한 임상적으로 사용되는 항-RSV 항체는 팔리비주마브이다. 이것은 RSV의 F 단백질의 항원성 부위 내의 에피토프에 대해 유도된 인간화된 단일클론 항체이다. 인간화된 항체는 마우스 항체의 일부를 여전히 함유하고 면역원성이 전장 마우스 항체에 비해 감소되어 있지만 인간화된 항체의 부작용은 인간화된 항체가 인간에 적용될 때 발생할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은 RSV-특이적 항체를 생성하는 인간 B 세포를 수득하고 배양하는 데에 성공함으로써, 완전한 인간 서열의 결과로서 (가능한 한) 상당히 감소된 면역원적 활성을 갖는 인간 RSV-특이적 항체를 제공한다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 항체는 팔리비주마브에 비해 우수한 특성을 갖는다(도 1 및 표 1). 본 발명자들은 본 발명에 따른 항체를 근육내 주사로 제공받은 후 RSV-X를 사용한 비강내챌린지를 제공받은 코튼 래트(시그모돈 히스피두스(Sigmodon hispidus))가 팔리비주마브를 제공받은 후 RSV-X를 사용한 챌린지를 제공받은 코튼 래트보다 더 낮은 병리 지수를 가짐을 보였다(도 4c 및 표 2). 본 명세서에서 사용된 병리 지수는 폐 손상에 대한 3개의 개별 마커를 분류하기 위한 점수의 합계이다. 이들 3개의 마커는 기관지 및 세기관지 상피의 비대, 기관지 및 세기관지 주변의 염증((세)기관지주위염) 및 폐포 내의 염증(폐포염)이다. 또한, 본 발명에 따른 항체를 근육 내로 주사받은 후 RSV-X 챌린지를 제공받은 코튼 래트는 팔리비주마브를 제공받은 후 RSV-X를 사용한 챌린지를 제공받은 코튼 래트보다 더 낮은 폐 바이러스 역가(TCID50(50% 조직 배양 감염량) 분석에 의해 측정됨)를 가졌다(도 4b). 따라서, AM22는 팔리비주마브보다 바람직하다.
팔리비주마브 이외에, 몇몇 다른 RSV-특이적 항체들이 공지되어 있다. 국제특허출원 공개 제2008/147196호는 RSV 결합 분자, 즉 항체 D25, AM14, AM16 및 AM23의 서열을 개시한다. 본원의 실시예 1에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, RSV-특이적 항체 AM22는 항체 D25, AM14, AM16 및 AM23과 동일한 공여자로부터 수득되었다. 그러나, 놀랍게도 AM22는 동일한 공여자로부터 수득된 모든 다른 항체들보다 더 효율적으로 RSV를 인식한다. AM22의 IC50 값인 1.15 ng/㎖은 팔리비주마브, D25, AM14, AM16 또는 AM23의 IC50 값보다 더 낮다. 따라서, RSV-관련 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 AM22의 사용은 다른 RSV-특이적 항체들의 사용에 비해 장점을 갖는다. 유사한 효과를 수득하기 위해 다른 항체에 비해 보다 적은 AM22 항체가 필요하다. 따라서, RSV-관련 장애의 치료 및/또는 예방을 위해 보다 적은 AM22가 개체에게 투여되어야 한다. 대안적으로, 유사한 양의 AM22의 사용을 통해 다른 항체들에 비해 RSV-관련 장애의 보다 효과적인 치료 및/또는 예방이 달성된다.
나아가, 본 발명에 따른 RSV-특이적 항체는 이전에 개시된 RSV 결합 분자와 상이한 에피토프를 인식한다. 이전에 확인된 항체들(국제특허출원 공개 제WO2008/147196호)과 유사한 AM22는 RSV F 단백질에 결합할 수 있다(도 3a). 그러나, AM22는 단량체성 RSV F 단백질에 결합하지 못한다(도 3b 좌측 및 우측 패널). AM22와 대조적으로, 공지된 항체인 팔리비주마브 및 AM16(국제특허출원 공개 제2008/147196호 및 도 3b에 개시됨)은 F 단백질의 단량체 형태에 결합할 수 있다. 중요하게는, 항원 특이적 B 세포 수용체(BCR)를 발현하는 AM22 B 세포주는 F 단백질의 재조합 형태를 인식하지 못한다(도 3c). 따라서, AM22는 팔리비주마브, D25, AM23 및 AM16과 상이한 F 단백질의 에피토프에 결합한다. 재조합 F 단백질이 8개의 HIS 태그를 갖는 이소류신 지퍼 삼량체화 모티프(ILZ-8xHIS)를 함유하는 벡터에서 발현된 경우, AM22는 이 삼량체성 입체구조 의존성 구조를 인식하였다(도 3d). 대조적으로, AM14는 F 단백질의 단량체 형태 또는 ILZ-8xHIS F 단백질을 인식하지 못하였다. 따라서, AM22는 AM14와도 상이한 F 단백질의 에피토프에 결합한다. 더욱이, AM22가 RSV로 감염된 Hep2 세포와 D25 또는 팔리비주마브의 결합을 방해하지 못함이 발견되었다. 따라서, AM22는 D25, AM14, AM16, AM23 및 팔리비주마브에 비해 F 단백질의 상이한 에피토프에 결합한다. 따라서, 본 발명에 따른 RSV-특이적 항체, 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 이미 공지된 RSV-특이적 항체, 예컨대, 팔리비주마브, D25, AM14, AM16 및 AM23과 조합된다. 본 발명에 따른 항체를 공지된 RSV-특이적 항체와 조합함에 의해 RSV의 2개 이상의 상이한 에피토프들이 동일한 요법 동안 인식된다. 이 방식으로 RSV에 대한 보다 강한 면역원성 반응이 수득된다. 나아가, 공지된 RSV-특이적 항체들 중 하나와 본 발명에 따른 AM22 항체를 조합함에 의해 RSV에 대한 보다 높은 항체 특이성이 달성된다. 이러한 조합은 RSV에 대한 보다 강한 면역원성 반응 및 RSV에 대한 보다 높은 특이성을 가짐으로써 RSV-관련 장애의 보다 효과적인 치료 및/또는 예방을 유발할 것이다. 마지막으로, 약 1.15 ng/㎖의 낮은 IC50 값에 의해 입증되는 바와 같이 AM22가 팔리비주마브, D25, AM14, AM16 및 AM23에 비해 F 단백질에 대한 보다 강한 결합 성능을 갖기 때문에 보다 낮은 총 항체 투여량이 요구된다.
따라서, 한 실시양태는 HEp-2 세포가 RSV A2 바이러스로 감염되는 시험관내 중화 분석에서 1.25 ng/㎖ 미만의 IC50 값을 갖는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다. 상기 항체 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 1.2 ng/㎖ 미만, 바람직하게는 0.5 ng/㎖ 내지 1.2 ng/㎖의 IC50 값을 갖는다. 추가로, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 HEp-2 세포가 RSV A2 바이러스로 감염되는 시험관내 중화 분석에서 팔리비주마브의 IC50 값보다 120배 이상 더 낮은, 보다 바람직하게는 130배 이상 더 낮은 IC50 값을 갖는다. 상기 항체 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 약 1.15 ng/㎖의 IC50 값을 갖는다. 따라서, 하나 이상의 입수가능한 RSV-특이적 항체와 조합되는 본 발명에 따른 RSV-특이적 항체 또는 이의 기능적 등가물의 사용을 통해 RSV-관련 장애의 보다 효과적인 치료 및/또는 예방이 달성된다.
항체의 기능적 등가물은 항체의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체로서 본 명세서에서 정의된다. 항체의 기능적 등가물은 바람직하게는 항체의 하나 이상의 CDR 서열을 포함하는 인공 결합 화합물이다.
항체의 기능적 부분은 종류 면에서 상기 항체와 동일한(그러나, 양 면에서는 반드시 동일할 필요가 없는) 하나 이상의 성질을 갖는 부분으로서 정의된다. 상기 기능적 부분은 상기 항체와 동일한 항원에 결합할 수 있으나 반드시 동일한 정도로 결합할 필요는 없다. 항체의 기능적 부분은 바람직하게는 단일 도메인 항체, 단일쇄 항체, 단일쇄 가변 단편(scFv), Fab 단편 또는 F(ab')2 단편을 포함한다.
항체의 기능적 유도체는 생성된 화합물의 하나 이상의 성질(바람직하게는 항원 결합성)이 종류 면에서 본질적으로 동일하도록(그러나, 양 면에서는 반드시 동일할 필요가 없도록) 변경된 항체로서 정의된다. 유도체는 많은 방식으로, 예를 들면, 전체적인 기능이 심각하게 영향을 받지 않을 정도로 한 아미노산 잔기가 일반적으로 유사한 성질(크기, 소수성 등)을 갖는 또 다른 잔기로 치환되는 보존적 아미노산 치환을 통해 제공된다.
당업자는 항체의 유사 화합물들을 잘 발생시킬 수 있다. 이것은 예를 들면, 펩티드 라이브러리 또는 파지 디스플레이 라이브러리의 사용에 의해 수행된다. 이러한 유사체는 본질적으로 종류 면에서 상기 항체와 동일한(그러나, 양 면에서는 반드시 동일할 필요가 없는) 하나 이상의 성질을 갖는다.
본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간 항체이다. 인간에서 예방 및 치료를 위한 인간 항체의 사용은 비인간 서열에 대한 인간 개체에서의 면역반응으로 인한 부작용의 발생을 감소시킨다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체는 인간화된 항체이다. 인간화된 항체는 비인간 초가변 도메인을 인간 항체 내로 혼입시킴에 의해 제조되므로 면역원성이 전장 비인간 항체에 비해 감소된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체는 키메라 항체이다. 이 방식으로 원하는 서열, 예컨대, 원하는 결합 부위가 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물 내로 포함될 수 있다.
당업자에게 잘 공지되어 있는 바와 같이, 항체의 중쇄는 면역글로불린 분자를 구성하는 2종의 쇄들 중 보다 큰 쇄이다. 중쇄는 불변 도메인 및 가변 도메인을 포함하고, 상기 가변 도메인은 항원 결합에 관여한다. 항체의 경쇄는 면역글로불린 분자를 구성하는 2종의 쇄들 중 보다 작은 쇄이다. 경쇄는 불변 도메인 및 가변 도메인을 포함한다. 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 항원 결합에 관여한다.
상보성 결정 영역(CDR)은 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인에 존재하는 초가변 영역이다. 항체의 중쇄 및 연결된 경쇄의 CDR은 함께 항원 결합 부위를 형성한다.
본 발명이, 도 2에 도시된 CDR 서열이 원하는 결합 특성을 제공한다는 통찰을 제공하는 한, 당업자는 하나 이상의 변경된 CDR 서열을 포함하는 변이체를 잘 발생시킬 수 있다. 예를 들면, 보존 아미노산 치환이 적용된다. AM22에 비해 하나 이상의 변경된 성질을 갖는 변이체 항체 또는 이의 기능적 등가물을 발생시키기 위해 도 2에 도시된 하나 이상의 CDR 서열을 변경시킬 수도 있다. 바람직하게는, AM22의 유리한 결합 특성이 적어도 부분적으로 유지되거나 심지어 개선되도록 도 2에 도시된 CDR 서열과 70% 이상 동일한 CDR 서열을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 제공된다. 도 2에 도시된 CDR 서열은 바람직하게는 생성된 항체 또는 이의 기능적 등가물이 AM22에 비해 하나 이상의 개선된 성질, 예컨대, 개선된 안정성 및/또는 결합 친화성을 포함하도록 변경된다. 결합 특이성은 바람직하게는 유지된다(종류 면에서는 유지되나 양 면에서는 반드시 유지되지는 않음). 따라서, 도 2에 도시된 CDR 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 변이체 항체 또는 이의 기능적 등가물도 본 발명의 범위 내에 있다. 아미노산 서열을 변경시키는 다양한 방법이 당업계에서 이용가능하다. 예를 들면, 원하는 CDR 서열을 갖는 중쇄 또는 경쇄 서열을 인공적으로 합성한다. 바람직하게는, CDR 서열을 코딩하는 핵산 서열을 예를 들면, 랜덤 또는 부위 지정 돌연변이유발을 이용하여 돌연변이시킨다.
본 발명의 항-RSV 항체를 사용하는 예방, 치료, 진단 및 연구 방법의 효능을 측정하는 데에 있어서 항원과 항체 사이의 친화성 상수 및 결합 특이성의 측정이 바람직하다. "결합 친화성"은 일반적으로 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 명시되지 않은 한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍(예를 들면, 항체와 항원)의 구성원들 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유의 결합 친화성을 지칭한다. 상기 친화성은 일반적으로 비 koff/kon으로서 계산되는 평형 해리 상수(Kd)로 표시될 수 있다. 예를 들면, 문헌(Chen, Y., et al., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881)을 참조한다. 친화성은 당업계에 공지된 통상적인 방법, 예컨대, 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석, 예컨대, 비아코어(BiaCore) 또는 아이비아이에스 테크놀로지스 비브이(IBIS Technologies BV)(네덜란드 헨겔로 소재)의 IBIS-iSPR 장치, 또는 용액상 분석, 예컨대, 키넥사(Kinexa)에 의해 측정될 수 있다.
바람직한 실시양태에 따라, 본 발명의 본 항-RSV 항체는 1x10-2 M, 1x10-3 M, 1x10-4 M, 1x10-5 M, 1x10-6 M, 1x10-7 M, 1x10-8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M, 1x10-11 M, 1x10-12 M, 1x10-13 M, 1x10-14 M 또는 1x10-15 M 미만의 해리 상수(Kd)를 포함하는, RSV F 단백질 상의 에피토프에 대한 결합 친화성을 갖는다. 한 실시양태에서, 항-RSV 항체는 10-7 M 미만, 5x10-8 M 미만, 10-8 M 미만, 5x10-9 M 미만, 10-9 M 미만, 5x10-10 M 미만, 10-10 M 미만, 5x10-11 M 미만, 10-11 M 미만, 5x10-12 M 미만, 10-12 M 미만, 5x10-13 M 미만, 10-13 M 미만, 5x10-14 M 미만, 10-14 M 미만, 5x10-15 M 미만 또는 10-15 M 미만의 Kd를 갖는다.
본 발명은 하기 서열을 포함하는 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 추가로 제공한다:
- 서열 KLSIH(서열번호 4)와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열,
- 서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열,
- 서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열,
- 서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열,
- 서열 GASSRAT(서열번호 24)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 LSSDSSI(서열번호 28)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물은 도 2에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물은 도 2에 도시된 CDR 서열 중 하나 이상과 95% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 전술된 바와 같이 특히 바람직한 항체인 AM22는 도 2에 도시된 CDR 서열로 구성된 CDR 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 특히 바람직한 실시양태는 RSV에 특이적으로 결합할 수 있고 하기 서열을 포함하는 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다:
- 서열 KLSIH(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1 서열,
- 서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)를 포함하는 중쇄 CDR2 서열,
- 서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)를 포함하는 중쇄 CDR3 서열,
- 서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR1 서열,
- 서열 GASSRAT(서열번호 24)를 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 LSSDSSI(서열번호 28)를 포함하는 경쇄 CDR3 서열.
한 실시양태에서, 도 2에 도시된 중쇄 CDR1 및 CDR2 서열 및 경쇄 CDR1 및 CDR2 서열, 또는 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상 동일한 서열을 포함하는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 제공된다. 따라서, 서열 KLSIH(서열번호 4)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열 및 서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 및 서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열 및 서열 GASSRAT(서열번호 24)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열을 포함하는 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다. 상기 항체 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 전술된 중쇄 CDR 서열 및 경쇄 CDR 서열과 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 CDR 서열을 포함한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 기능적 등가물은 서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열 및/또는 서열 LSSDSSI(서열번호 28)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열도 포함한다. 항체 또는 이의 기능적 등가물은 전술된 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열뿐만 아니라 전술된 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열도 포함하는 항체 또는 이의 기능적 등가물도 제공된다.
선택적으로, 상기 하나 이상의 인간 CDR 서열은 바람직하게는 결합 효능 또는 안정성을 개선시키도록 최적화된다. 이것은 예를 들면, 생성된 화합물의 안정성 및/또는 결합 효능이 바람직하게는 시험되고 개선된 항체 또는 이의 기능적 등가물이 선택된 후 돌연변이유발 실험에 의해 수행된다.
CDR 서열의 최적화 이외에, 골격 영역 중 하나 이상에서 하나 이상의 서열을 최적화하는 것이 종종 유리하다. 이것은 바람직하게는 결합 효능 또는 안정성을 개선시키기 위해 수행된다. 골격 서열은 예를 들면, 바람직하게는 생성된 항체 또는 이의 기능적 부분의 특성이 시험된 후 상기 골격 서열을 코딩하는 핵산 분자를 돌연변이시킴에 의해 최적화된다. 이 방식으로, 개선된 항체 또는 이의 기능적 부분을 수득할 수 있다. 따라서, 도 2에 도시된 중쇄 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 중쇄 아미노산 서열을 포함하는 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체도 제공된다. 이러한 중쇄 서열은 항체 AM22에 의해 입증되는 바와 같이 원하는 결합성을 제공한다. 뿐만 아니라, 도 2에 도시된 경쇄 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 아미노산 서열도 항체 AM22에 의해 입증되는 바와 같이 원하는 결합성을 제공한다. 따라서, 서열 QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS(서열번호 16)와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 중쇄 서열, 및/또는 서열 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK(서열번호 32)와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 경쇄 서열을 갖는 본 발명에 따른 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다.
본 발명에 따른 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 도 2에 도시된 중쇄 서열 및/또는 경쇄 서열과 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 중쇄 서열 및/또는 경쇄 서열을 포함한다. 상동성이 높을수록 상기 항체 또는 이의 기능적 등가물은 항체 AM22를 보다 유사하게 닮는다. 본 발명에 따른 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체는 바람직하게는 AM22의 중쇄 및 경쇄를 닮은 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 따라서, 도 2에 도시된 중쇄 서열 및 경쇄 서열과 각각 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 중쇄 서열 및 경쇄 서열을 포함하는 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체가 추가로 제공된다. 한 실시양태에서, 도 2에 도시된 중쇄 서열 및 도 2에 도시된 경쇄 서열을 갖는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 제공된다.
한 실시양태는 도 2에 도시된 중쇄 서열로 구성된 중쇄 서열을 포함하고/하거나 도 2에 도시된 경쇄 서열로 구성된 경쇄 서열을 포함하는 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다. 대안적으로, 당업자에게 잘 공지되어 있는 바와 같이, 원하는 결합성을 유지하면서 단축된 중쇄 또는 경쇄 서열을 발생시킬 수 있다. 바람직하게는, 원래의 중쇄 또는 경쇄에 비해 보다 짧은 불변 영역을 갖는 이러한 단축된 중쇄 또는 경쇄가 발생된다. 가변 도메인은 바람직하게는 유지된다. 예를 들면, 도 2에 도시된 중쇄 서열 또는 경쇄 서열에 기초한 Fab 단편, F(ab')2 단편, 단일 도메인 항체, 단일쇄 항체, 나노바디(nanobody), 유니바디(unibody) 또는 scFV 단편이 생성된다. 따라서, 적어도 도 2에 도시된 서열의 기능적 부분을 포함하는 항체의 기능적 부분도 제공된다. 상기 기능적 부분은 20개 이상의 아미노산의 길이를 갖고 도 2에 도시된 중쇄 CDR1 서열과 70% 이상 동일한 서열, 도 2에 도시된 중쇄 CDR2 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열, 도 2에 도시된 중쇄 CDR3 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열, 도 2에 도시된 경쇄 CDR1 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열, 도 2에 도시된 경쇄 CDR2 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열 및 도 2에 도시된 경쇄 CDR3 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 항체 및 이의 기능적 등가물은 RSV F 단백질 삼량체의 유일한(unique) 에피토프를 인식한다. 따라서, 이 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체 및 이의 기능적 등가물이 제공된다. 상기 유일한 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 이미 공지된 RSV-특이적 항체, 예컨대, 팔리비주마브, D25, AM14, AM16 및 AM23과 조합된다. 상기 유일한 에피토프를 특이적으로 인식하는 본 발명에 따른 항체 또는 기능적 등가물을 공지된 RSV-특이적 항체와 조합함에 의해 RSV의 2개 이상의 상이한 에피토프가 동일한 요법 동안 인식된다. 이 방식으로, RSV에 대한 강한 면역원성 반응 및/또는 RSV에 대한 보다 높은 항체 특이성이 달성된다. 이러한 조합은 RSV에 대한 강한 면역원성 반응 및 보다 높은 특이성을 가짐으로써 RSV-관련 장애의 보다 효과적인 치료 및/또는 예방을 유발할 것이다.
따라서, 본 발명은 하기 서열을 포함하는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다:
- 서열 KLSIH(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1 서열,
- 서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)를 포함하는 중쇄 CDR2 서열,
- 서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)를 포함하는 중쇄 CDR3 서열,
- 서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR1 서열,
- 서열 GASSRAT(서열번호 24)를 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 LSSDSSI(서열번호 28)를 포함하는 경쇄 CDR3 서열.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 AM22 항체에 의해 인식되는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제공한다:
- 서열 KLSIH(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1 서열,
- 서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)를 포함하는 중쇄 CDR2 서열,
- 서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)를 포함하는 중쇄 CDR3 서열,
- 서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR1 서열,
- 서열 GASSRAT(서열번호 24)를 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 LSSDSSI(서열번호 28)를 포함하는 경쇄 CDR3 서열.
본 발명의 추가적 실시양태는 이펙터 기능을 변경시키기 위한 일부 항체 불변 영역(Fc) 변형을 고려한다. 예를 들면, Fc 영역을 포함하는 단백질의 혈청 반감기는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합 친화성을 증가시킴에 의해 증가된다. 본 명세서에서 사용된 용어 "항체 반감기"는 항체의 투여 후 항체 분자의 평균 생존 시간의 척도인 항체의 약물동력학적 성질을 의미한다. 항체 반감기는 예를 들면, 혈청(즉, 순환 반감기) 또는 다른 조직에서 측정될 때 환자 체내(또는 다른 포유동물) 또는 이의 특정 구획으로부터 면역글로불린의 공지된 양의 50%를 제거하는 데에 요구되는 시간으로서 표시될 수 있다. 반감기는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 클래스마다 다를 있다. 일반적으로, 항체 반감기의 증가는 투여된 항체에 대한 순환계 내에서의 평균 체류 시간(MRT)을 증가시킨다.
반감기의 증가는 환자에게 제공된 약물의 양의 감소뿐만 아니라 투여 빈도의 감소를 허용한다. 본 발명에 따른 항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들면, 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이 재이용(salvage) 수용체 결합 에피토프를 항체(특히, 항체 단편) 내로 혼입할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "재이용 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 것을 책임지는, IgG 분자(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다. 대안적으로, 증가된 반감기를 갖는 본 발명의 항체는 Fc와 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로서 확인된 아미노산 잔기를 변형시킴에 의해 생성될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제6,821,505호 및 제7,083,784호 참조). 또한, 본 발명의 항체의 반감기는 당업계에서 널리 이용되는 기법에 의한 PEG 또는 알부민에의 접합에 의해 증가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 Fc 변이체 영역을 포함하는 항체는 천연 Fc 영역을 포함하는 항체에 비해 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 125% 또는 약 150% 이상의 증가된 반감기를 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 변이체 영역을 포함하는 항체는 천연 Fc 영역을 포함하는 항체에 비해 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 10배, 약 20배 또는 약 50배 이상, 또는 2배 내지 10배, 5배 내지 25배 또는 15배 내지 50배의 증가된 반감기를 갖는다. 따라서, 본 발명은 재이용 수용체 결합 에피토프, Fc와 FcRN 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로서 확인된 변형된 아미노산 잔기, 및/또는 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 본 발명에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 제공한다. 또 다른 바람직한 실시양태는 PEG 또는 알부민에 접합되어 있는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 Fc 변이체를 제공하고, 이때 Fc 영역은 카바트 등(Kabat et al.)(J. Immunol. 1991; 147(5):1709-19)에 의해 기재된 EU 지수에 의해 번호 매겨진 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 및 443으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 변형(예를 들면, 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노산 결실)을 포함한다. 선택적으로, 상기 Fc 영역은 당업자에게 공지된 추가적 및/또는 대안적 위치에서 비천연 아미노산 잔기를 포함한다(예를 들면, 미국 특허 제5,624,821호, 제6,277,375호, 제6,737,056호, 제7,083,784호, 제7,317,091호, 제7,217,797호, 제7,276,585호 및 제7,355,008호; 미국 특허출원 공개 제2002/0147311호, 제2004/0002587호, 제2005/0215768호, 제2007/0135620호, 제2007/0224188호 및 제2008/0089892호; 및 국제특허출원 공개 제WO 94/29351호 및 제WO 99/58572호 참조).
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 Fc 변이체 항체를 제공하고, 이때 Fc 영역은 252, 254 및 256으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 한 실시양태에서, 비천연 아미노산은 252Y, 254T 및 256E로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 종래 기술의 항체에 비해 개선된 성질을 갖는 RSV-특이적 항체 및 이의 기능적 등가물을 제공한다. 본 발명자들은 현재 공지된 최저 IC50 값을 갖는 RSV-특이적 항체를 발생시키는 데에 성공하였다. 이러한 항체는 RSV에 대한 특히 높거나 강한 친화성을 가지므로 RSV 감염 및/또는 RSV 감염의 부작용을 저해하고/하거나 적어도 부분적으로 예방하는 데에 특히 적합하다. 따라서, 한 실시양태는 실시예에 기재된 시험관내 중화 분석에서 측정되었을 때 1.25 ng/㎖ 미만, 바람직하게는 1.2 ng/㎖ 미만, 보다 바람직하게는 1.19 ng/㎖ 미만, 보다 바람직하게는 1.18 ng/㎖ 미만, 가장 바람직하게는 1.1 ng/㎖ 내지 1.17 ng/㎖의 IC50 값을 갖는 항체를 제공한다(도 1 참조).
본 발명은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물의 하나 이상의 항원 결합 부분을 코딩하는, 15개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 30개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 75개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 단리, 합성 또는 재조합 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 추가로 제공한다. 이러한 핵산은 예를 들면, 본 발명에 따른 항체를 생성할 수 있는 B 세포로부터 단리된다. 바람직한 실시양태는 도 2에 도시된 핵산 서열의 15개 이상의 뉴클레오티드와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공한다. 본 발명에 따른 핵산 서열은 바람직하게는 도 2에 도시된 핵산 서열의 15개 이상의 뉴클레오티드와 75% 이상의, 보다 바람직하게는 80% 이상의, 보다 바람직하게는 85% 이상의, 보다 바람직하게는 90% 이상의, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 바람직하게는, 도 2에 도시된 상기 핵산 서열은 하나 이상의 CDR 코딩 서열을 포함한다.
한 바람직한 실시양태는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물의 하나 이상의 CDR 서열을 코딩하는, 15개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 단리, 합성 또는 재조합 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다. 상기 핵산 서열은 바람직하게는 항체 AM22의 CDR 영역과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 하나 이상의 CDR 서열을 코딩한다. AM22 CDR 영역을 코딩하는 핵산 서열은 도 2에 도시되어 있다. 따라서, aaattatccattcac(서열번호 3), ggttatgagggtgaggtcgatgagattttctacgcacagaagttccagcac(서열번호 7), ctaggtgtgacagtgactgaggctggactggggatcgatgactac(서열번호 11), agggccagtcagattgttagcaggaaccacttagcc(서열번호 19), ggtgcgtccagtcgggccact(서열번호 23) 및 ctgtcctctgattcctccata(서열번호 27)로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 단리, 합성 또는 재조합 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물이 추가로 제공된다.
상기 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 전술된 핵산 서열들 중 임의의 핵산 서열과 75% 이상의, 보다 바람직하게는 80% 이상의, 보다 바람직하게는 85% 이상의, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 도 2에 도시된 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물이 추가로 제공되고, 이때 상기 일부는 15개 이상의 뉴클레오티드를 갖고 도 2에 도시된 하나 이상의 CDR 영역을 코딩한다.
본 발명에 따른 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 AM22 CDR 영역, AM22 중쇄 및/또는 AM22 경쇄와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 영역을 코딩한다. 따라서, 한 실시양태는 서열 KLSIH(서열번호 4)와 70% 이상의 서열 동일성, 서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)와 70% 이상의 서열 동일성, 서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)와 70% 이상의 서열 동일성, 서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)와 70% 이상의 서열 동일성, 서열 GASSRAT(서열번호 24)와 70% 이상의 서열 동일성, 서열 LSSDSSI(서열번호 28)와 70% 이상의 서열 동일성, 서열 QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS(서열번호 16)와 70% 이상의 서열 동일성, 및/또는 서열 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK(서열번호 32)와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 단리, 합성 또는 재조합 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 제공한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물은 삼량체성 RSV F 단백질 상에 존재하는 유일한 에피토프를 인식할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 핵산 서열은 바람직하게는 이 유일한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 CDR 서열을 코딩한다. 따라서, 하기 서열을 포함하는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 CDR 서열을 코딩하는 단리, 합성 또는 재조합 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물도 본 발명에 의해 제공된다:
- 서열 KLSIH(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1 서열,
- 서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)를 포함하는 중쇄 CDR2 서열,
- 서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)를 포함하는 중쇄 CDR3 서열,
- 서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR1 서열,
- 서열 GASSRAT(서열번호 24)를 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 LSSDSSI(서열번호 28)를 포함하는 경쇄 CDR3 서열.
바람직하게는, 상기 핵산 서열은 본 발명에 따른 (예를 들면, 중쇄 또는 경쇄를 포함하는) 전장 항체 또는 이의 기능적 등가물을 코딩한다. 따라서, 하기 서열을 포함하는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 기능적 등가물을 코딩하는 단리, 합성 또는 재조합 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물이 추가로 제공된다:
- 서열 KLSIH(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1 서열,
- 서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)를 포함하는 중쇄 CDR2 서열,
- 서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)를 포함하는 중쇄 CDR3 서열,
- 서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR1 서열,
- 서열 GASSRAT(서열번호 24)를 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
- 서열 LSSDSSI(서열번호 28)를 포함하는 경쇄 CDR3 서열.
본 발명의 한 실시양태에서, 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물은 서열 KLSIH(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1 서열, 서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)를 포함하는 중쇄 CDR2 서열, 서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)를 포함하는 중쇄 CDR3 서열, 서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR1 서열, 서열 GASSRAT(서열번호 24)를 포함하는 경쇄 CDR2 서열 및 서열 LSSDSSI(서열번호 28)를 포함하는 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 AM22 항체에 의해 인식되는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩한다.
본 발명에 따른 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 1x10-2 M, 1x10-3 M, 1x10-4 M, 1x10-5 M, 1x10-6 M, 1x10-7 M, 1x10-8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M, 1x10-11 M, 1x10-12 M, 1x10-13 M, 1x10-14 M 또는 1x10-15 M 미만의 해리 상수(Kd)를 갖는 항체 또는 이의 기능적 등가물을 코딩한다.
본 발명에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터가 추가로 제공된다. 이러한 벡터는 다양한 적용에 적합하다. 예를 들면, 치료적으로 유리한 핵산 서열을 포함하는 본 발명의 벡터는 예방적 또는 치료적 적용에 적합하다. 이러한 벡터를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것은 생체 내에서 상기 예방적 또는 치료적 핵산 서열의 발현을 유발한다. 상기 벡터는 원하는 핵산 서열의 시험관내 발현을 수반하는 적용에서, 예를 들면, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물의 (상업적) 제조를 위해 사용될 수도 있다. 본 발명에 따른 핵산 서열을 갖는 벡터를 구축하는 방법은 당분야에 잘 공지되어 있다. 본 발명의 벡터의 발생에 적합한 벡터의 비제한적 예는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터이다.
용어 "% 서열 동일성"은 2개의 서열을 정렬하고 필요하다면 갭(gap)을 도입하여 최대 % 동일성을 달성한 후 기준 서열 내의 잔기와 동일한 후보 아미노산 서열 또는 후보 핵산 서열 내의 잔기의 백분율로서 본 명세서에서 정의된다. 상기 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 서열은 바람직하게는 뉴클레오티드의 쇄, 보다 바람직하게는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자 또는 핵산 서열은 다른 종류의 핵산 구조체, 예컨대, DNA/RNA 나선(helix), 펩티드 핵산(PNA), 잠겨진 핵산(LNA) 및/또는 리보자임을 포함한다. 이러한 다른 핵산 구조체는 핵산 서열의 기능적 등가물로서 지칭된다. 용어 "핵산 서열의 기능적 등가물"은 천연 뉴클레오티드와 동일한 기능을 나타내는 비천연 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비뉴클레오티드 구축 블록을 포함하는 쇄도 포함한다.
본 발명에 따른 핵산 서열 또는 벡터는 RSV에 대해 특이적인 항체 또는 이의 기능적 등가물을 발생시키는 데에 특히 유용하다. 이것은 예를 들면, 세포의 핵산 번역 기구가 코딩된 항체 또는 이의 기능적 등가물을 생성하도록 상기 핵산 서열 또는 벡터를 세포 내로 도입함에 의해 수행된다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 핵산 서열 또는 벡터는 소위 생산자 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0(마우스 골수종) 또는 293(T) 세포주(이들 중 일부는 상업적 항체 제조에 적합하게 개조됨)에서 발현된다. 상기 생산자 세포의 증식은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물을 생성할 수 있는 생산자 세포주를 발생시킨다. 바람직하게는, 상기 생산자 세포주는 인간에서 사용되는 항체를 생성하기에 적합하다. 따라서, 상기 생산자 세포주는 바람직하게는 병원체, 예컨대, 병원성 미생물을 함유하지 않는다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 서열 또는 벡터를 사용하여 인간 서열로 구성된 항체 또는 이의 기능적 등가물을 발생시킨다.
따라서, 본 발명에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 생성할 수 있는 단리 또는 재조합 항체 생성 세포뿐만 아니라, 본 발명에 따른 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 또는 벡터를 갖는 세포를 제공하는 단계 및 상기 세포가 상기 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 또는 벡터를 번역하도록 허용하여 상기 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 생성하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 제조하는 방법도 제공된다.
항체 생성 세포는 항체 또는 이의 기능적 등가물을 생성하고/하거나 분비할 수 있는 세포, 및/또는 항체 또는 이의 기능적 등가물을 생성하고/하거나 분비할 수 있는 세포로 발달될 수 있는 세포로서 본 명세서에서 정의된다. 본 발명에 따른 항체 생성 세포는 바람직하게는 상업적 항체 제조에 적합하게 개조된 생산자 세포이다. 바람직하게는, 상기 생산자 세포는 인간에서 사용되는 항체를 생성하기에 적합하다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 본 발명에 따른 상기 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 회수하고/하거나, 정제하고/하거나, 또는 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 본 발명에 따른 수득된 항체 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 선택적으로 추가적 정제, 단리 또는 가공 단계 후 인간 요법에서 사용된다.
본 발명에 따른 개선된 호흡기 세포융합 바이러스-특이적 항체 또는 이의 기능적 등가물(인간 항체 또는 이의 기능적 등가물을 포함함) 및 이를 코딩하는 핵산 서열 및 벡터가 제공되는 한, 개선된 예방적 및/또는 치료적 적용이 이용가능하게 되었다. RSV는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물에 의해 저해된다. 따라서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물은 선택적으로 당업계에 공지된 하나 이상의 다른 RSV-특이적 항체와 조합되어 약제 또는 예방제로서 사용되기에 특히 적합하다. 바람직하게는, 인간 개체가 치료될 때 불리한 부작용의 발생을 감소시키기 위해 인간 서열로 구성된 또는 5% 이하의 비인간 서열을 갖는 항체 또는 이의 기능적 등가물이 사용된다. 따라서, 약제 및/또는 예방제로서 사용되는 본 발명에 따른 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체, 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 벡터, 또는 세포 또한 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명에 따른 핵산 또는 이의 기능적 등가물, 또는 벡터가 투여되는 경우, 이것은 제자리(in situ)에서 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물로 번역될 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 항체 AM22 또는 이의 기능적 등가물을 포함한다. 상기 약제 또는 예방제는 바람직하게는 RSV에 의한 감염을 저해하거나 적어도 부분적으로 예방하기 위해 사용된다. 따라서, RSV와 관련된 장애의 적어도 부분인 치료 및/또는 예방용 약제 및/또는 예방제로서 사용하기 위한, 본 발명에 따른 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체, 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 벡터, 또는 세포가 추가로 제공된다. 당업계에 공지된 하나 이상의 다른 RSV-특이적 물질, 바람직하게는 항체와 조합된 AM22를 포함하는 약제는 이러한 조합의 사용에 의해 RSV에 대한 보다 강한 면역원성 반응이 수득되고/되거나 RSV에 대한 보다 높은 항체 특이성이 달성되기 때문에 특히 유리하다. 따라서, 약제 및/또는 예방제로서 사용되는, 본 발명에 따른 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체, 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 벡터, 또는 세포와 또 다른 상이한 RSV-특이적 물질, 바람직하게는 항체 또는 이의 기능적 등가물의 조합물이 추가로 제공된다. 본 발명에 따른 조합물은 바람직하게는 AM22, 및 팔리비주마브, D25, AM14, AM16 및 AM23으로 구성된 군으로부터 선택된 항체를 포함한다. 전술한 바와 같이, 이러한 조합물은 RSV-관련 장애를 적어도 부분적으로 치료하거나 예방하기에 특히 적합하다. 따라서, RSV와 관련된 장애의 적어도 부분적인 치료 및/또는 예방용 약제 및/또는 예방제의 제조를 위한 본 발명에 따른 조합물의 용도가 추가로 제공된다. 따라서, RSV-관련 장애의 적어도 부분적인 치료 및/또는 예방용 약제 및/또는 예방제의 제조를 위한 본 발명에 따른 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체, 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 벡터, 또는 세포의 용도뿐만 아니라, 치료 유효량의 본 발명에 따른 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 RSV-관련 장애의 치료 또는 예방이 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, RSV-관련 장애를 적어도 부분적으로 치료하거나 예방하는 방법도 제공된다. 한 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 다른 RSV-특이적 물질, 바람직하게는 또 다른 RSV-특이적 항체와의 조합물이 사용된다. 상기 개체는 바람직하게는 치료 전에 RSV에 의해 감염된 것으로 진단받았다.
상기 항체는 바람직하게는 항체 AM22 또는 이의 기능적 부분을 포함한다. 상기 하나 이상의 다른 RSV-특이적 항체는 바람직하게는 팔리비주마브, D25, AM14, AM16 또는 AM23이다. 가장 바람직하게는 AM22와 D25의 조합물이 사용된다.
호흡기 세포융합 바이러스와 관련된 장애를 적어도 부분적으로 치료하거나 예방하기 위해, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 감염이 발생하기 전에 개체에게 투여된다. 대안적으로, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물은 개체가 이미 감염된 경우 투여된다. 상기 항체 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 합병증의 증가된 위험을 갖는 개체, 예컨대, 입원한 개체 및/또는 손상된 면역을 갖는 개체에게 투여된다. 장년층 개체들도 RSV 감염의 증가된 위험을 갖는다. 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물은 바람직하게는 1회 이상의 주사를 통해 투여된다. 본 명세서에서 전술된 바와 같이 예방적 또는 치료적 적용에서 사용되는 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물의 투여량 범위는 엄격한 프로토콜 요건이 존재하는 임상시험에서 상승 투여량 연구에 기초하여 디자인된다. 전형적인 투여량은 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 10 mg이다. 예방적 또는 치료적 적용의 경우, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물은 전형적으로 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 조합된다. 적합한 담체의 예는 예를 들면, 키홀 림펫 해모시아닌(KLH), 혈청 알부민(예를 들면, BSA 또는 RSA) 및 오브알부민을 포함한다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 적합한 담체는 용액, 예컨대, 식염수를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 기능적 등가물을 코딩하는 핵산 또는 벡터가 사용된다. 전술된 바와 같이, 상기 핵산 또는 벡터의 투여시, 항체 또는 이의 기능적 등가물이 숙주의 기구에 의해 생성된다. 생성된 항체 또는 이의 기능적 등가물은 호흡기 세포융합 바이러스 감염 및/또는 이러한 감염의 부작용을 적어도 부분적으로 예방하고/하거나 저해할 수 있다. 따라서, 약제 및/또는 예방제로서 사용되는 본 발명에 따른 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 또는 벡터도 본 발명에 의해 제공된다. RSV-관련 장애의 적어도 부분적인 치료 및/또는 예방용 약제 및/또는 예방제의 제조를 위한 본 발명에 따른 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 또는 벡터의 용도가 추가로 제공된다.
본 발명에 따른 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체, 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 벡터, 또는 세포; 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물이 추가로 제공된다. 상기 약학 조성물은 바람직하게는 인간에서 사용되기에 적합하다. 한 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 AM22이다. 추가적 바람직한 실시양태에서, 상기 핵산은 AM22 또는 이의 기능적 등가물을 코딩한다. 한 실시양태에서, 상기 약학 조성물은 하나 이상의 다른 RSV-특이적 항체, 바람직하게는 팔리비주마브, D25, AM14, AM16 및/또는 AM23을 추가로 포함한다.
본 발명은 하기 실시예에 추가로 설명되어 있다. 이 실시예는 본 발명의 범위를 한정하지 않고 본 발명을 명확하게 설명하는 데에 기여한다.
참고문헌
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미국 특허 제7,217,797호;
미국 특허 제7,276,585호;
미국 특허 제7,355,008호;
미국 특허출원 공개 제2002/0147311호;
미국 특허출원 공개 제2004/0002587호;
미국 특허출원 공개 제2005/0215768호;
미국 특허출원 공개 제2007/0135620호;
미국 특허출원 공개 제2007/0224188호;
미국 특허출원 공개 제2008/0089892호;
국제특허출원 공개 제WO 94/29351호;
국제특허출원 공개 제WO 99/58572호; 및
국제특허출원 공개 제WO 2008/147196호.
실시예
실시예 1. B 세포 배양, 불멸화 및 선별
방법
B 세포를 공지된 바와 같이 불멸화하고 배양하였다(문헌(Scheeren FA, et al. (2005) Nat. Immunol 6: 303-313), 문헌(Diehl SA, et al. (2008) J. Immunol 180: 4805-4815) 및 문헌(Kwakkenbos MJ, et al. (2009) Nat. Med. in press)). 요약하건대, 본 발명자들은 피콜 분리, CD22 MACS 마이크로비드(밀테니이 바이오테크(Miltenyi Biotech) 및 후속적으로 FACSAria(벡톤 딕킨슨(Becton Dickinson)) 상에서의 CD19+CD3-CD27+IgM-IgA-(IgG 기억 세포)에 대한 세포 분류를 이용하여 말초혈(네덜란드 암스테르담 샌퀴인)로부터 B 세포를 단리하였다. 이들 조직의 사용은 의학 윤리 위원회에 의해 승인되었고 공식적인 동의를 조건으로 하였다. 레트로바이러스 형질도입된 B 세포를 재조합 마우스 IL-21(25 ng/㎖, R&D 시스템스)로 보충된 IMDM 중에서 2x105개 세포/㎖로 유지하고 CD40L(CD40L-L 세포, 105개 세포/㎖)을 안정하게 발현하는 γ-조사된(50 Gy) 마우스 L 세포 섬유모세포와 함께 36시간 동안 공-배양하였다. BCL6 및 Bcl-xL 레트로바이러스 구축물은 이미 공지되어 있고(문헌(Shvarts A, et al. (2002) Genes Dev. 16: 681-686) 및 문헌(Jaleco AC, et al. (1999) Blood 94: 2637-2646)), LZRS 레트로바이러스 벡터 내로 클로닝되었고 공지된 바와 같이 포에닉스(Phoenix) 팩키징 세포 내로 형질감염되었고 자극된 B 세포에 첨가되었다(문헌(Shvarts A, et al. (2002) Genes Dev. 16: 681-686) 및 문헌(Scheeren FA, et al. (2005) Nat. Immunol. 6: 303-313)). 형질도입된 B 세포를 재조합 IL-21 및 CD40L-L 세포의 존재 하에 연장된 시간 동안 IMDM 중에서 유지하였다. BCL6+Bcl-xL 형질도입된 B 세포에 의해 상대적으로 높은 양의 분비된 항체가 주어지면, 본 발명자들은 특정 항체의 분비에 기초하여 항원-특이적 B 세포를 선별할 수 있는지를 조사하였다. 건강한 공여자의 BCL6+Bcl-xL 형질도입된 기억 B 세포를 100개 세포/웰로 시딩하고 CD40L-L 세포 및 IL-21로 증폭시켰다. 2주 동안의 배양 후, 상청액을 회수하고 미세중화 실험에서 RSV 중화 항체의 존재에 대해 스크리닝하였다. 384개의 배양물(100개 세포/웰) 중 31개의 배양물이 HEp2 세포의 RSV A2 감염을 예방하였다. 4개의 미세배양물(이들로부터 D25, AM14, AM16 및 AM23이 제한 희석에 의해 서브클로닝됨) 이외에, 본 발명자들은 AM22를 수득하였다. AM22는 RSV A2 바이러스에 대한 1.15 ng/㎖의 중간 절반 최대 억제 농도(IC50)를 갖는다(도 1).
AM22의 면역글로불린 좌위의 중쇄 및 경쇄의 서열을 수득하기 위해, 본 발명자들은 RNeasy(등록상표) 미니 키트(퀴아젠)를 사용하여 총 RNA를 단리하고 cDNA를 발생시키고 PCR을 수행하고 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 pCR2.1 TA 클로닝 벡터(인비트로겐) 내로 클로닝하였다. 역전사효소 또는 DNA 중합효소 유도된 돌연변이를 배제하기 위해, 본 발명자들은 여러개의 독립된 클로닝 실험을 수행하였다. 재조합 AM22 mAb를 생성하기 위해, 본 발명자들은 AM22 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 인간 IgG1 및 카파 불변 영역과 인 프레임(in frame)으로 pcDNA3.1(인비트로겐) 기재 벡터 내로 클로닝하고 293T 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 본 발명자들은 단백질 A를 사용하여 배양물 상청액으로부터 재조합 AM22를 정제하였다.
결과
본 발명자들은 AM14, AM16, AM23 및 D25로 명명된 4종의 강력한 입체구조 의존성 항-RSV 항체를 이미 개발하였다. 이들 항체는 국제특허출원 공개 제2008/147196호 및 문헌(Kwakkenbos MJ et al. (2009) Nat. Med. in press)에 기재되어 있다. 동일한 공여자로부터, 본 발명자들은 RSV A2 바이러스에 대한 1.15 ng/㎖의 IC50으로부터 입증되는 바와 같이 다른 항체들에 비해 훨씬 더 효율적으로 RSV 바이러스를 인식하는 AM22도 발견하였다(표 1 및 도 1). AM22의 VH 및 VL 쇄의 아미노산 서열은 이 항체가 다른 항체들과 상이함을 보여주었다(도 2).
실시예
2.
시험관내
결합 실험
AM22 항체의 항원 특이성을 추가로 측정하기 위해, 본 발명자들은 상기 단백질이 RSV F 또는 G 단백질을 인식하고 어떠한 형태의 입체구조를 인식하는지를 밝히기 위해 시험관내 결합 실험을 수행하였다.
방법
(1) RSV G 또는 F 단백질의 FACS 염색
RSV G 단백질을 발현하거나(VSV-G) 또는 RSV F 단백질(VSV-F)을 발현하는 야생형 및 재조합 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 바이러스 원액[실험은 엠 루켄스(M. Lukens)(네덜란드 위트레흐트 소재의 더블유케이제트(WKZ))에 의해 수행되었고, VSV 바이러스는 예일 의과대학의 제이 에스 칸(J.S. Kahn) 및 제이 케이 로스(J.K. Rose)에 의해 친절하게 제공되었음]을, 5% FCS, 페니실린/스트렙토마이신 및 50 μM 2-머캡토-에탄올을 함유하는 DMEM 중에서 성장된 BHK 세포에서 제조하였다. VSV 감염은 5% FCS, 페니실린/스트렙토마이신 및 50 μM 2-머캡토-에탄올로 보충된 이스코브의 변형된 둘베코스 배지(IMDM, 깁코, 인비트로겐) 중에서 배양된 EL-4 세포에서 수행되었다. VSV 바이러스 변이체로 감염된 EL-4 세포를 재조합 항체와 함께 항온처리한 후 마우스-항-인간 PE로 염색하였다(도 3A).
(2) RSV ELISA
플레이트를 37℃에서 1시간 동안 또는 4℃에서 밤새 PBS 중에서 RSV에 감염된 HEp-2 세포의 용해물로 코팅하고 ELISA 세척 완충제(PBS, 0.5% 트윈-20) 중에서 세척하였다. 효소-접합된 항-IgG 항체와 함께 항-RSV 항체 또는 다중클론 염소 항-RSV(바이오디자인)가 첨가되기 전에(HRP-접합된 항-IgG(잭슨)의 경우 희석 1:2500) 플레이트를 PBS 중에서 4% 우유와 함께 항온처리함으로써 차단하였다. TMB 기질/정지 용액(바이오소스)을 ELISA의 현상에 사용하였다(도 3b의 좌측 패널). RSV A2에 감염된 HEp-2 세포의 용해물 이외에, RSV 긴 균주[(문헌(Ternette N, et al, (2007) Vaccine 25: 7271-7279)에 기초하여 프랭크 코엔자에르츠(Frank Coenjaerts)(네덜란드 위트레흐트 소재의 유엠씨유(UMCU))에 의해 친절히 제공됨]로부터의 HIS 태그 포함 F 단백질을 사용하여 Ni-NTA 히스소르프 플레이트(퀴아젠)를 코팅하였다(도 3b의 우측 패널). RSV F 항체의 결합을 HRP-접합된 IgG 검출 항체(희석 1:2500, 잭슨)로 검출하였다. 또 다른 셋팅에서, 원래의 B 세포 클론을 FACS 분석에 사용하였다(도 3c). B 세포를 재조합 HIS 태그 포함 F 단백질과 함께 항온처리하고, BCR에의 결합을 표지된 항-펜타 HIS 항체 ALEXA 플루오르(fluor) 647(퀴아젠)로 검출하였다.
(3) RSV 삼량체
재조합 RSV 긴 균주로부터 유래된 F 단백질 이외에, 본 발명자들은 F 단백질의 개방 판독 프레임을 이소류신 지퍼 도메인에 이어서 8 HIS 반복부(ILZ-8xHIS)에 융합된 구축물 내로 삽입함으로써 RSV A2 F 삼량체를 생성하였다. 단백질 구축물을 293T 세포에서 일시적으로 발현시키고 BD의 픽스 펌(Fix Perm) 키트를 사용하는 세포내 염색 프로토콜을 이용하여 검출하였다(도 3d).
결과
모든 항체들이 재조합 VSV에 의해 발현될 때 RSV F 단백질을 인식하였다(도 3a). 나아가, AM16을 제외하고, 항체들이 RSV에 감염된 HEp-2 세포의 용해물을 인식하지 못하였기 때문에 인식은 RSV F 단백질 내의 입체구조적 에피토프의 존재에 의존하였다(도 3b의 좌측 패널). 또한, 정제된 HIS 태그 포함 재조합 RSV F 긴 균주 단백질은 직접적 ELISA에서 시험되었을 때 D25, AM14, AM22 및 AM23에 의해 인식되지 않았다(도 3b의 우측 패널). 그러나, 원래의 안정한 BCR 발현 B 세포주가 HIS 태그 포함 RSV F 단백질의 이 비정제된 배양물 상청액과 함께 항온처리되었을 때, 본 발명자들은 B 세포 클론 AM16 및 AM23에의 결합 및 D25에의 보다 덜 강한 결합을 관찰하였다(도 3c). 이 비정제된 배양물 상청액 중의 단백질은 BCR에 결합하지만 히스소르프 플레이트 상의 단량체로서만 포획되는 RSV F 삼량체의 분획을 함유할 가능성이 있다. 그러나, AM14 및 AM22 B 세포주의 BCR에 의한 RSV F 단백질의 포획은 여전히 전혀 관찰되지 않았다(도 3c). 따라서, AM14 및 AM22는 상이한 에피토프에 결합한다. 가능하게는 낮은 백분율의 단백질 F 동종삼량체 또는 이량체가 F 단백질 생성 세포주의 비처리된 배양물 상청액에 존재하였다. 이들 보다 천연적인 F 입체구조는 ELISA 절차의 변성 조건 하에 상실된, AM23 및 D25에 의해 인식되는 에피토프를 발현할 수 있다. 흥미롭게는, 본 발명자들이 ILZ-8xHIS 서열을 함유하는 RSV 삼량체화 구축물로 형질감염된 293T 세포 상의 세포내 염색을 수행하였을 때, 본 발명자들은 AM22가 RSV F를 인식하나(도 3d), AM14는 여전히 이 단백질 구조를 인식하지 못함을 발견하였다. 따라서, AM22는 변성 조건 하에 존재하지 않아 단량체 형태의 단백질로 존재하지 않는 RSV F 단백질의 입체구조를 인식하기 때문에 유일하다. RSV F 단백질이 함께 머물러 있게 되어 삼량체를 형성하는 경우에만, 본 발명자들은 AM22 항체에 의한 F 결합, 즉 바이러스 입자 상에 존재하여 AM22의 높은 중화 효능을 설명하는 입체구조를 검출할 수 있다.
실시예 3. 생체내 효능 실험
AM22 단일클론 항체의 생체내 효능을 연구하기 위해, 본 발명자들은 코튼 래트 실험을 수행하였다.
방법
병원체 무함유 7 내지 9주령 코튼 래트(시그모돈 히스피두스, 네덜란드 소재의 할란 레이보레이토리스)를 이소플루란으로 마취시키고, 대조군 항체인 팔리비주마브, AM22, AM23 및 D25의 경우 2.0 mg/kg또는 0.4 mg/kg의 투여량으로 근육내(i.m.) 주사를 통해 0.1 ㎖의 정제된 항체를 상기 래트에게 투여한 반면, AM14를 0.4 mg/kg 및 0.1 mg/kg의 투여량으로 상기 래트에게 투여하였다. 24시간 후, 동물을 마취시키고 혈청 hIgG 측정을 위해 채혈하고 106 TCID50 RSV-X(100 ㎕)의 비강내 잠적주입으로 챌린징하였다. 5일 후, 동물들을 희생시키고 그들의 폐를 회수하였다. 폐 바이러스 역가를 측정하였고, 최저 검출 한계는 2.1 log10 TCID50/g이었다. 네덜란드 백신 연구소의 동물 실험 위원회가 코튼 래트를 수반하는 모든 절차를 승인하였다.
결과
AM16을 제외한 항-RSV 항체 패널이 코튼 래트에서 시험되었다. 일차 RSV A 단리물인 RSV-X를 비강내로 투여하기 전에 동물들을 2.0 mg/kg 또는 0.4 mg/kg의 단일클론 항체로 예방적으로 처리하였다. 상대적으로 낮은 항체 생성으로 인해, AM14 항체를 0.4 mg/kg 및 0.1 mg/kg으로 투여하였다. 1일째 날(바이러스 접종일) 및 5일째 날(희생일)에 코튼 래트 혈청으로부터 회수된 인간 IgG의 농도는 모든 항체들의 경우 동일한 범위 내에 있었고 시간에 따른 항체의 감소는 필적할만하였다(도 4a).
희생된 동물들의 폐로부터의 RSV 바이러스의 회수는 대조군에 비해 2.0 mg/kg의 면역글로불린으로 처리된 모든 동물 군에서 크게 감소되었다(도 4b). 0.4 mg/kg의 팔리비주마브 및 AM23으로 처리된 동물들은 상당한 바이러스 복제를 보인 반면, AM14 및 D25 군들에서 6마리의 동물들 중 1마리가 검출가능한 바이러스 복제를 보였다. AM22로 처리된 동물들로부터는 바이러스가 전혀 회수될 수 없었다. 이들 결과는 RSV F 단백질 상의 입체구조적 에피토프를 특이적으로 인식하는 AM22가 강한 생체내 중화 능력을 보유함을 입증한다.
RSV
챌린징된
코튼
래트의
폐 병리의 분석
비강내 RSV 감염 후 5일째 날에 각각의 코튼 래트로부터 좌측 폐를 제거하고 포르말린으로 고정시켰다. 폐 손상을 하기 3개의 개별 마커들에 대해 0 내지 5로 분류하였다: 1) 기관지 및 세기관지 상피의 비대, 2) 기관지 및 세기관지 주변의 염증((세)기관지주위염) 및 3) 폐포 내의 염증(폐포염). 한 군 내의 모든 동물들의 점수의 평균 합계는 병리 지수(최대 점수 15)를 생성하였다(도 4c 및 표 2). RSV 감염 후 폐 병리는 높은 투여량의 면역글로불린(2 mg/kg)으로 처리된 동물 군들에서 상당히 감소되었다(표 3). 그러나, AM14, AM22 및 AM23 군에서만, 상기 병리가 보다 낮은 농도(0.4 mg/kg)에서 상당히 감소되었다. 병리의 완전한 부재가 2 mg/kg의 AM22 및 AM23으로 처리된 5마리의 동물들 중 3마리의 동물에서 관찰된 반면, 0.4 mg/kg의 AM14 군 및 AM22 군 각각에서 6마리의 동물들 중 2마리 또는 1마리의 동물에서 완전한 보호가 검출되었다(표 3).
실시예 1, 2 및 3의 결과를 조합할 때, AM22는 일부 장점을 갖는다는 결론이 도출된다. AM22는 최저 IC50 값을 나타내었는데, 이는 다른 항체들에 비해 보다 낮은 양의 AM22의 사용을 통해 유사한 예방적 또는 치료적 효과가 달성된다는 것을 의미한다. AM22는 다른 항체들이 인식하는 에피토프와 상이한 RSV F 단백질의 에피토프를 인식하므로 상기 다른 항체들 중 하나와 조합 사용되어 RSV에 대한 보다 강한 면역원성 반응 및 RSV에 대한 보다 높은 항체 특이성을 달성할 수 있다. 마지막으로, AM22를 사용한 코튼 래트의 치료는 이들 코튼 래트에서 병리의 잠재적 완전한 부재와 함께 바이러스 복제의 거의 완전한 억제를 유발하였다.
실시예
4:
RSV
F 단백질에 대한
AM22
의 친화성
AM22의 예방적, 치료적 및 진단적 가치를 확립하기 위해 RSV F 단백질과 AM22 사이의 친화성 상수 및 결합 특이성을 측정하는 것이 바람직하다. 이것은 상기 항체 친화성이 올리고머형 단백질 구조에 대해 측정되어야 하기 때문에 도전적인 특징이다. 통상적으로 칩 상에 포획된 고정화된 물질에 대한 친화성 상수가 측정된다. 그러나, 칩 상에 포획된 단백질 F는 AM14, AM22, AM23 및 D25 항체에 의해 인식되지 않을 것이다.
방법
"결합 친화성"은 일반적으로 분자(예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너(예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 비 koff/kon으로서 계산되는 평형 해리 상수(Kd)로 표시될 수 있다. 친화성은 당업계에 공지된 통상적인 방법, 예컨대, 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의해 측정될 수 있다. 친화성(KD), 결합-속도(ka) 및 해리-속도(kd)는 아이비아이에스 테크놀로지스 비브이(네덜란드 헨겔로 소재)의 IBIS-iSPR 장치를 사용하는 SPR 분석에 의해 측정될 것이다. 요약하건대, 항-RSV 항체를 고정화시키고 정제된 RSV F 단백질(펜타-HIS를 함유함)을 희석하고, 속도 및 친화성 상수를 상기 단백질의 3개 이상의 일련의 희석물의 주입으로 측정한다.
IMIS-iSPR 장치 내의 또 다른 설정은 1) F-펜타 HIS 단백질이 커플링되어 있는 항-펜타 HIS 항체를 고정화시키거나, 또는 2) F-펜타 HIS 단백질을 칩 상에 직접적으로 고정화시킨 후 상기 칩 상의 샘플을 AIMM 항체와 함께 항온처리하여 친화성 상수를 측정하는 것이다.
| RSV A2a | |
| 팔리비주마브 | 152 |
| D25 | 1.28 |
| AM14 | 2.09 |
| AM16 | 78.7 |
| AM22 | 1.15 |
| AM23 | 4.18 |
| 선택된 항-RSV IgG의 IC50(ng/㎖) 값은 RSV A2 바이러스를 갖는 HEp2 세포에 대한 표준 TCID50 배양물 분석으로 측정하였다. | |
| 항체 | mg/kg | 병리 점수(SEM) | P 값 |
| 팔리비주마브 | 2.0 | 3.20(0.4) | 0.0005 |
| 팔리비주마브 | 0.4 | 5.40(0.8) | <0.05 |
| D25 | 2.0 | 3.40(0.4) | 0.0005 |
| D25 | 0.4 | 5.83(1.0) | 0.05 |
| AM14 | 0.4 | 4.20(0.8) | 0.05 |
| AM14 | 0.1 | 3.67(1.2) | 0.05 |
| AM22 | 2.0 | 2.75(0.8) | 0.0005 |
| AM22 | 0.4 | 4.00(0.9) | <0.05 |
| AM23 | 2.0 | 2.40(0.2) | 0.0005 |
| AM23 | 0.4 | 3.50(0.9) | <0.05 |
| 대조군 IgG1 | 2.0 | 8.80(1.1) | N.A. |
| 모의군 | N.A. | 1.80(0.4) | 0.0005 |
| 표시된 항체를 사용한 RSV 감염 24시간 전에 처리된 코튼 래트의 폐의 누적 병리 점수. 감염 후 5일째 날에 수득된 폐 표본은 병리학자에 의해 무작위적으로 평가되었다. 폐 병리는 3개의 개별 마커에 대해 0 내지 5의 점수로 분류되었다: 1) 기관지 및 세기관지 상피의 비대, 2) 세기관지주위염 및 3) 폐포염. 평균의 표준 오차(SEM) 및 대조군 IgG1 군과 관련한 통계적 편차를 갖는 평균 병리 점수(최대 점수 15)가 2-측 윌콕손(2-sided Wilcoxon) 시험에 의해 계산되었다. 실험은 처리군 당 4마리 내지 6마리의 개별 동물들을 사용하여 2회 수행하였다. N.A.는 적용가능하지 않음을 의미한다. | |||
| 항체 | mg/kg | 병리에서 상당한 감소 | 병리 없음 |
| 팔리비주마브 | 2 | 5/5 | 1/5 |
| 팔리비주마브 | 0.4 | 3/5 | 0/6 |
| D25 | 2 | 5/5 | 0/5 |
| D25 | 0.4 | 2/6 | 0/6 |
| AM14 | 0.4 | 5/6 | 2/6 |
| AM14 | 0.1 | 4/5 | 0/5 |
| AM22 | 2 | 5/5 | 3/5 |
| AM22 | 0.4 | 5/6 | 1/6 |
| AM23 | 2 | 5/5 | 3/5 |
| AM23 | 0.4 | 5/6 | 0/6 |
| RSV-X 감염 동안 5일째 날에 폐 병리의 상당한 감소 또는 부재를 갖는 동물의 수. 실험은 처리군 당 4마리 내지 6마리의 개별 동물들을 사용하여 2회 수행하였다. | |||
SEQUENCE LISTING
<110> MEDIMMUNE LTD
<120> RSV-specific binding molecule
<130> P89282PC00
<140> PCT/NL2009/050599
<141> 2009-10-06
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<170> PatentIn version 3.3
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Thr Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Thr Leu Ile
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Arg Leu Thr Val Ile Ala Asp Thr Ala Thr Asp Thr Val Tyr Met Glu
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ctg ggc agg ctc acc tct gac gac acg gcc gtc tat ttc tgt gga aca 96
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Thr Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Thr Leu Ile Lys Leu
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Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
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Gly Gly Tyr Glu Gly Glu Val Asp Glu Ile Phe Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln His Arg Leu Thr Val Ile Ala Asp Thr Ala Thr Asp Thr Val Tyr
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atg gaa ctg ggc agg ctc acc tct gac gac acg gcc gtc tat ttc tgt 288
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gga aca cta ggt gtg aca gtg act gag gct gga ctg ggg atc gat gac 336
Gly Thr Leu Gly Val Thr Val Thr Glu Ala Gly Leu Gly Ile Asp Asp
100 105 110
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<213> Artificial
<220>
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Thr Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Thr Leu Ile Lys Leu
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Ser Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Tyr Glu Gly Glu Val Asp Glu Ile Phe Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln His Arg Leu Thr Val Ile Ala Asp Thr Ala Thr Asp Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Gly Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Gly Thr Leu Gly Val Thr Val Thr Glu Ala Gly Leu Gly Ile Asp Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> Artificial
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20 25 30
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-RSV antibody light chain CDR3
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(21)
<400> 27
ctg tcc tct gat tcc tcc ata 21
Leu Ser Ser Asp Ser Ser Ile
1 5
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 28
Leu Ser Ser Asp Ser Ser Ile
1 5
<210> 29
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-RSV antibody light chain Fw4
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(36)
<400> 29
ttc aca ttc ggc cct ggg acc aag gtg gat ttc aaa 36
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Phe Lys
1 5 10
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 30
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Phe Lys
1 5 10
<210> 31
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Anti-RSV antibody light chain
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<400> 31
gaa att gtg ttg aca cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca gga 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag att gtt agc agg aac 96
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Arg Asn
20 25 30
cac tta gcc tgg tac cag caa aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc 144
His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
atc ttt ggt gcg tcc agt cgg gcc act ggc atc cca gtc cgg ttc agt 192
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
ggc agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc aac gga ctg gcg 240
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Gly Leu Ala
65 70 75 80
cct gaa gat ttt gca gtt tac tac tgt ctg tcc tct gat tcc tcc ata 288
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Ser Ser Asp Ser Ser Ile
85 90 95
ttc aca ttc ggc cct ggg acc aag gtg gat ttc aaa 324
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Phe Lys
100 105
<210> 32
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 32
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Val Ser Arg Asn
20 25 30
His Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Phe Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Gly Leu Ala
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Ser Ser Asp Ser Ser Ile
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Phe Lys
100 105
Claims (28)
- 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus: RSV)에 특이적으로 결합할 수 있고 하기 서열을 포함하는 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체:
서열 KLSIH(서열번호 4)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1 서열,
서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2 서열,
서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3 서열,
서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1 서열,
서열 GASSRAT(서열번호 24)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
서열 LSSDSSI(서열번호 28)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3 서열. - 제1항에 있어서,
서열 QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS(서열번호 16)와 70% 이상 동일한 서열을 포함하는 중쇄 서열을 갖고/갖거나, 서열 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK(서열번호 32)와 70% 이상 동일한 경쇄 서열을 갖는 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
PEG 또는 알부민에 접합되어 있고/있거나, (i) 재이용(salvage) 수용체 결합 에피토프, (ii) Fc와 FcRN 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로서 확인된 변형된 아미노산 잔기, 및/또는 (iii) 비천연 아미노산 잔기를 포함하는 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
카바트 등(Kabat et al.)에 의해 기재된 EU 지수에 의해 번호 매겨진 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 251, 252, 254, 255, 256, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 313, 316, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 440 및 443으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 변형을 포함하는 Fc 영역을 포함하고, 이때 상기 변형이 아미노산 치환, 아미노산 삽입 및/또는 아미노산 결실을 포함하는 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체. - 하기 서열을 포함하는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 단리, 합성 또는 재조합 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체:
서열 KLSIH(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1 서열,
서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)를 포함하는 중쇄 CDR2 서열,
서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)를 포함하는 중쇄 CDR3 서열,
서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR1 서열,
서열 GASSRAT(서열번호 24)를 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
서열 LSSDSSI(서열번호 28)를 포함하는 경쇄 CDR3 서열. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
1x10-2 M, 1x10-3 M, 1x10-4 M, 1x10-5 M, 1x10-6 M, 1x10-7 M, 1x10-8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M, 1x10-11 M, 1x10-12 M, 1x10-13 M, 1x10-14 M 또는 1x10-15 M 미만의 해리 상수(Kd)를 갖는 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 항체인 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
인간화된 항체인 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체. - 서열 KLSIH(서열번호 4)와 70% 이상의 서열 동일성, 서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)와 70% 이상의 서열 동일성, 서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)와 70% 이상의 서열 동일성, 서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)와 70% 이상의 서열 동일성, 서열 GASSRAT(서열번호 24)와 70% 이상의 서열 동일성, 서열 LSSDSSI(서열번호 28)와 70% 이상의 서열 동일성, 서열 QVQLVQSGAEVKKPGATVKVSCKISGHTLIKLSIHWVRQAPGKGLEWMGGYEGEVDEIFYAQKFQHRLTVIADTATDTVYMELGRLTSDDTAVYFCGTLGVTVTEAGLGIDDYWGQGTLVTVSS(서열번호 16)와 70% 이상의 서열 동일성, 및/또는 서열 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQIVSRNHLAWYQQKPGQAPRLLIFGASSRATGIPVRFSGSGSGTDFTLTINGLAPEDFAVYYCLSSDSSIFTFGPGTKVDFK(서열번호 32)와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함하는 단리, 합성 또는 재조합 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체의 하나 이상의 CDR 서열을 코딩하는, 15개 이상의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 단리, 합성 또는 재조합 핵산 서열, 또는 이의 기능적 등가물.
- 제9항 또는 제10항에 있어서,
aaattatccattcac(서열번호 3),
ggttatgagggtgaggtcgatgagattttctacgcacagaagttccagcac(서열번호 7),
ctaggtgtgacagtgactgaggctggactggggatcgatgactac(서열번호 11),
agggccagtcagattgttagcaggaaccacttagcc(서열번호 19),
ggtgcgtccagtcgggccact(서열번호 23), 및
ctgtcctctgattcctccata(서열번호 27)
로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물. - 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
도 2에 도시된 뉴클레오티드 서열의 적어도 일부와 70% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 이때 상기 일부가 15개 이상의 뉴클레오티드를 갖고 하나 이상의 CDR 영역을 코딩하는, 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물. - 하기 서열을 포함하는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 CDR 서열을 코딩하는 단리, 합성 또는 재조합 핵산 서열, 또는 이의 기능적 등가물:
서열 KLSIH(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1 서열,
서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)를 포함하는 중쇄 CDR2 서열,
서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)를 포함하는 중쇄 CDR3 서열,
서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR1 서열,
서열 GASSRAT(서열번호 24)를 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
서열 LSSDSSI(서열번호 28)를 포함하는 경쇄 CDR3 서열. - 제13항에 있어서,
하기 서열을 포함하는 항체에 의해 인식되는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 및/또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물:
서열 KLSIH(서열번호 4)를 포함하는 중쇄 CDR1 서열,
서열 GYEGEVDEIFYAQKFQH(서열번호 8)를 포함하는 중쇄 CDR2 서열,
서열 LGVTVTEAGLGIDDY(서열번호 12)를 포함하는 중쇄 CDR3 서열,
서열 RASQIVSRNHLA(서열번호 20)를 포함하는 경쇄 CDR1 서열,
서열 GASSRAT(서열번호 24)를 포함하는 경쇄 CDR2 서열, 및/또는
서열 LSSDSSI(서열번호 28)를 포함하는 경쇄 CDR3 서열. - 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
1x10-2 M, 1x10-3 M, 1x10-4 M, 1x10-5 M, 1x10-6 M, 1x10-7 M, 1x10-8 M, 1x10-9 M, 1x10-10 M, 1x10-11 M, 1x10-12 M, 1x10-13 M, 1x10-14 M 또는 1x10-15 M 미만의 해리 상수(Kd)를 갖는 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 코딩하는 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물. - 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물을 포함하는 벡터.
- 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 및/또는 제16항에 따른 벡터를 포함하는 단리 또는 재조합 세포.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
약제 및/또는 예방제로서 사용하기 위한 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체, 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 벡터, 또는 세포. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
RSV-관련 장애의 적어도 부분적인 치료 및/또는 예방용 약제 및/또는 예방제로서 사용하기 위한 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체, 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 벡터, 또는 세포. - 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체, 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 벡터, 또는 세포; 및
상이한 RSV-특이적 물질, 바람직하게는 항체
를 포함하는 조합물. - 제20항에 있어서,
약제 및/또는 예방제로서 사용하기 위한 조합물. - RSV-관련 장애의 적어도 부분적인 치료 및/또는 예방용 약제 및/또는 예방제의 제조를 위한 제20항에 따른 조합물의 용도.
- 제20항 또는 제21항에 있어서,
상이한 RSV-특이적 물질이 팔리비주마브(Palivizumab), AM14, AM16, AM23 및/또는 D25인 조합물. - RSV-관련 장애의 적어도 부분적인 치료 및/또는 예방용 약제 및/또는 예방제의 제조를 위한, 제1항 내지 제17항, 제20항 및 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체, 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 벡터, 세포, 또는 조합물의 용도.
- 제1항 내지 제17항, 제20항 및 제23항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체, 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물, 벡터, 세포, 또는 조합물; 및
약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제
를 포함하는 약학 조성물. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 생성할 수 있는 단리 또는 재조합 항체 생성 세포.
- 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물 또는 제16항에 따른 벡터를 갖는 세포를 제공하는 단계; 및
상기 세포가 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산 서열 또는 이의 기능적 등가물 또는 제16항에 따른 벡터를 번역하는 것을 허용하여 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 생성하는 단계
를 포함하는, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 제조하는 방법. - 제27항에 있어서,
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 이의 기능적 부분, 유도체 또는 유사체를 회수하고/하거나, 정제하고/하거나, 또는 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
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