KR20120084139A - 호로파 추출물을 포함하는 뇌암 치료용 조성물 및 미백 기능성 화장품 - Google Patents

호로파 추출물을 포함하는 뇌암 치료용 조성물 및 미백 기능성 화장품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 건조된 호로파(葫蘆巴,fenugreek) 분쇄물로부터 지방족 극성 용매를 이용하여 추출되고 유효성분인 호로파 추출물 및 약리학적으로 허용 가능한 담체들을 포함하는 뇌암 치료용 조성물을 제공한다. 상기 호로파 추출물은 미량만으로도 뇌암 세포의 사멸 및 증식 억제를 유도할 수 있어 다양한 약학적 제형에 폭 넓게 적용될 수 있다.

Description

호로파 추출물을 포함하는 뇌암 치료용 조성물 및 미백 기능성 화장품{Composition for Treatment of Brain cancer and Functional Whitening cosmetic Comprising Extract of TRIGONELLAE SEMEN}
본 발명은 호로파 추출물을 이용하는 기술에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 뇌암에 대해 탁월한 예방 또는 치료 효능을 나타내는 호로파 추출물을 유효성분으로 함유하는 치료용 조성물 및 상기 호로파 추출물에 부수하는 미백기능을 이용한 기능성 화장품에 관한 것이다.
호로파(葫蘆巴,fenugreek)의 씨는 대개 햇볕에 말려 약용한다. 씨에는 매우 적은 양의 정유가 들어 있으며 이 정유에는 약 40개의 성분, 즉 여러 종류의 알칼로이드, 단백질, 지방 등이 들어 있다. 성질이 따뜻하고 독이 없어 아프리카?중동?인도 등지에서는 옛부터 방광과 신장의 병을 치료하는 데에 이용했고 식은땀이 흐르거나 배가 찬 사람을 치료하는 데에도 이용해오고 있다. 오늘날은 몸 속의 혈당과 인슐린의 균형을 유지하는 데에 효과가 있으며 체중조절에도 효과가 있는 것으로 알려져 활발히 연구되고 있다.
씨와 잎 등은 독특한 향과 맛을 내서 향미료로 이용되고 잎은 익혀서 요리해 먹기도 하며 샐러드나 카레요리에 넣어 먹는다. 또 차 또는 술로 만들어 먹을 수도 있다.
또한, 호로파는 소화기 계통의 염증을 완화시켜주고 종기나 염증에 대한 찜질약으로도 사용되어져 왔다.
한편, 뇌암은 뇌조직이나 뇌를 둘러싸고 있는 뇌막에서 발생되는 원발성 뇌종양과 두개골이나 그 주변 구조물에서 발생하거나 체내 다른 부위의 암에서 전이된 2차성 뇌종양의 총칭. 뇌하수체샘종, 수막종, 신경아교종(glioma) 등이 포함되며 신경아교종은 다른 장기로의 전이가 드물게 나타나지만 원칙적으로는 전이되지 않는다. 뇌는 단단한 두개골로 둘러싸여 있기 때문에 뇌종양이 증대되어 뇌압이 상승하면 죽게 된다. 뇌종양발생부위에 따라 나타나는 신경증상도 다르다. 치료법은 수술이나 방사성치료 또는 화학요법인데 종양의 종류나 존재부위에 따라 달라진다.
특히, 화학요법의 경우 부작용이 심하다는 단점과 아울러 그 치료적 의의가 미미한 실정인바 이 부분에 대한 연구가 보다 심도있게 진행될 필요성이 크고, 그에따라 새로운 치료물질의 개발이 요구되는 실정이다.
본 발명의 목적은 호로파 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌암 치료용 조성물 및 그 조성물을 이용한 미백 기능성 화장품을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 치료용 조성물은 건조된 호로파(葫蘆巴,fenugreek) 분쇄물을 지방족 극성 용매에 침잠시켜 추출된 유효성분을 포함하는 호로파 추출물, 및 약리학적으로 허용 가능한 담체들을 포함한다.
상기 호로파 추출물 용액 100μg/ml을 8.0 X 103 개의 U-87 MG 세포에 48시간 처리한 후, 알라머 블루(Alamar Blue) 분석법에 의하여 분석할 경우 U-87 MG 세포의 생존률은 6% 이하로 감소할 수 있다. 또한, 상기 호로파 추출물의 EC50 값은 29.456 μg/ml 이다.
상기 호로파의 건조는 음지에서 이루어질 수 있다. 한편, 상기 지방족 극성 용매는 탄소수 1 내지 3인 알코올일 수 있고 예를 들면, 에탄올 등을 들 수 있다. 추출 과정은 60℃ 미만의 온도 하에서 이루어 질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 호로파 추출물의 제조 방법은 음지에서 1차 건조된 호로파를 분쇄하여 호로파 분쇄물을 준비하는 단계, 상기 호로파 분쇄물을 탄소수 1 내지 3인 알코올 용매에 60℃ 미만의 온도 하에서 침잠시켜 유효성분을 추출하는 단계, 상기 유효성분을 포함하는 알코올 용매를 2차 건조하여 상기 유효성분의 고형분을 수득하는 단계, 및 상기 유효성분의 고형분을 냉동 보관하는 단계를 포함한다. 상기 2차 건조는 60℃ 미만의 감압 상태에서 이루어질 수 있다.
한편, 본 발명에서 용어, "추출물(extract)"은 천연물로부터 분리된 활성성분을 의미한다. 추출물은 물, 유기용매, 또는 이의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 치료용 조성물은 뇌암 세포에 대한 사멸 및 성장 억제 효과가 우수하고, 호로파 추출물은 천연물로서 부작용이 거의 없어서 치료용 조성물 외의 화장품 분야 등 다양한 이종의 분야에도 널리 활용될 수 있다.
나아가, 미량으로도 뇌암 세포에 대한 사멸 효과가 우수하여 다양한 제형에도 본 발명에 따른 호로파 추출물이 유연한 함량으로 응용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 실시예 2에서 수행된 실험에 대응한 U-87 MG 세포의 생존율을 도시한 그래프이다. 도면의 가로축은 추출물의 농도를, 세로축은 뇌암 세포의 생존율을 나타낸다.
도 2는 인간 뇌암 U-87 MG 세포에서 강황 추출물의 도입이 뇌암 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위한 Alamar Blue 분석 결과이다. 도면의 가로축은 추출물의 농도를, 세로축은 뇌암 세포의 생존률을 나타낸다.
이하에서는 본 발명에 따른 호로파 추출물을 포함하는 뇌암 치료용 조성물 및 미백 기능성 화장품에 대하여 상세하게 설명하도록 한다.
이하에서는 구체적인 실시예들을 들어 본 발명의 일 실시예에 따른 호로파 추출물에 대하여 설명하도록 한다. 그러나 이하의 실시예들에 의하여 본 발명의 기술사상이 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
[실시예 1]: 호로파 추출물의 제조
입수된 호로파를 실온에서 음지인 장소에 보관하며 5일간 건조하였다. 건조된 호로파는 소정의 크기로 분쇄되었다. 분쇄된 호로파는 95% 에탄올 용액에 침잠되어 50℃의 온도 하에서 24시간 동안 추출 과정을 거쳤다. 호로파 추출물 및 에탄올 용액의 혼합물은 45℃의 온도 하에서 감압 건조되었다. 건조된 후 고형분의 호로파 추출물이 수득되었다. 수득된 고형분의 호로파 추출물을 -20℃의 저온 하에서 보관하였다.
[실시예 2]: 호로파 추출물이 뇌암 세포의 성장에 미치는 영향
실시예 1에서 수득된 고형분의 호로파 추출물이 뇌암 세포의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 사람 뇌암 세포인 U-87 MG에 대하여 알라마 블루(Alamar Blue) 분석을 시행하였다. 알라마 분석은 MTT 분석의 변형된 형태인데, 특정 효소에 의해서 분해되는 화합물을 살아있는 세포에 처리한 후 화합물이 분해되면서 나오는 생성물의 형광 세기를 측정함으로써 약물을 처리한 후 살아있는 세포의 상대적인 숫자를 알아내는 실험방법이다.
본 실시예에서 사용된 뇌암 세포인 U-87 MG 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 분양받아 실험에 이용하였고, 뇌암 세포인 U-87 MG에 대하여 세포 성장 억제효과를 확인 하였다.
10% FBS(fetal bovine serum, 소태아혈청)(Welgene)와 25 mM HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)를 포함하는 MEM(Minimal Essential Medium) 배지에서 배양하였다. 상기 세포는 37℃, 5% CO2의 수분이 있는 상태로 유지하고, 2-3일 정도 계대배양된 후 96 웰 플레이트에 각 웰 당 8.0 X 103 개의 세포를 주입하고 DMSO에 녹인 실시예 1의 호로파 추출물을 0 내지 100 μg/ml 농도로 48 시간 동안 처리하였을 때, 세포 성장을 저해하는 정도를 확인하였다. 각 농도의 추출물을 처리한 후, 96-웰 플레이트에서 각 웰에 채워진 0.2 ml의 세포 배양액에 20 μl의 알라마 블루 시약을 첨가한 후 플레이트를 인큐베이터에서 2시간 동안 배양하였다. 각 웰의 세포를 고르게 반응시키기 위하여 플레이트를 천천히 흔들고, 544 nm의 파장에서 조사광을 조사하면서 590 nm에서 형광의 세기를 형광광도계(Fluorescence Microplate Reader; Molecular Devices Corp.)로 흡광도를 측정하였다. 도 1은 본 실시예에서 수행된 실험에 대응한 U-87 MG 세포의 생존율을 도시한 그래프이다. 아래 표 1은 본 실시예의 실험결과를 기재한 표이다. 각각의 농도 실험은 5회 반복한 결과이고, 그 평균값의 변화를 도 1에 도시하였다.
0
μg/ml		 3.125
μg/ml		 6.25
μg/ml		 12.5
μg/ml		 25
μg/ml		 50
μg/ml		 100
μg/ml
평균 1.000 0.976 0.959 0.938 0.692 0.336 0.221
표준편차 0.000 0.038 0.078 0.048 0.085 0.026 0.022
상기 표 1 및 도 1에서 나타난 바와 같이 호로파 추출물의 처리 농도가 높을수록 뇌암 세포의 성장이 감소하였으며, 이로부터 호로파 추출물이 뇌암 치료효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
상기 뇌암 치료용 조성물은 호로파 추출물 및 약리학적으로 허용 가능한 담체들을 포함한다. 호로파 추출물을 제조하기 위해서는 우선 호로파를 건조하는 단계가 필요하다. 호로파의 건조 방법은 특별히 국한되지 않으나, 상기 건조는 외부의 강한 광원에 의하여 호로파에 함유된 고유 화합물들이 변성되지 않도록 음지에서 이루어질 수 있다. 건조된 호로파는 추출 효율의 극대화를 위하여 적당한 형태로 분쇄되어 사용되고, 분쇄 정도 즉, 호로파 분쇄물의 사이즈는 추출물의 화학적 성질 변화와 무관하므로, 물리적인 측면에서 결정되면 충분하다. 또한, 상기 건조는 상온에서 이루어질 수 있고, 건조 기간은 특별히 한정되지는 않으나 대략 수일(數日) 정도 이루지는 것이 바람직하다.
상기 지방족 극성용매로서는 80℃ 미만, 나아가 60℃ 미만의 온도 하에서도 호로파의 추출 효율이 우수한 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 탄소수 1 내지 4인 지방족 알코올을 사용한다. 추출 용매로서는 예를 들면, 에탄올을 들 수 있다. 열수추출 등의 고온 추출 방식은 호로파 내 함유된 뇌암 사멸 인자인 화합물의 변성이나 파괴를 유발할 수 있어 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 치료용 조성물에 포함되는 호로파 추출물의 추출방법은 저온 추출 방식이 바람직하다.
상기 호로파 추출물은 뇌암 세포 성장 억제제, 뇌암 분화치료제의 기능을 함유한다.
상기 분쇄된 호로파는 전술한 바와 같이 에탄올 등의 유기 용매에 추가적인 조치 없이 침잠됨으로써 추출물이 발생될 수 있다. 발생된 추출물은 60℃ 미만의 온도 하에서 건조될 수 있으며, 건조 효율을 개선을 위하여 감압 하에서 이루어질 수 있다. 건조가 완료되면, 고형인 호로파 추출물이 수득될 수 있다. 수득된 고형의 호로파 추출물은 수분 등 외부 조건에 의한 유효 성분의 변성을 방지하고 추출물 내 유효 화합물의 안정성을 확보하기 위하여 극저온 상태(-15℃ 이하)에서 보관되는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 치료용 조성물은 상기 호로파 추출물을 단독으로 포함할 수 있으며, 기타 약리학적으로 허용 가능한 담체들을 포함할 수 있다. 상기 약리학적으로 허용 가능한 담체의 예로서는 물, 글리세린, 유단, 전분, 식염수 등을 들 수 있다.
또한, 상기 호로파 추출물은 뇌암 예방 및 치료용 조성물, 약제, 식품 또는 식품 첨가제로 사용할 수 있으며, 약제로 사용하는 경우 경구 또는 비경구로 사용될 수 있다. 상기 조성물의 제형은 사용방법이나 유효성을 고려하여 다양하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물의 제형으로서 경고제, 과립제, 로션제, 산제, 시럽제, 액제, 주사제, 캅셀제, 환원제 등의 예를 들 수 있다.
일반적으로 세포 실험에서 사용한 농도의 약 100배 내지 200배를 동물실험에서 사용하므로, 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌암 치료용 조성물의 투여량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도 및 병용되는 약물을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
[실시예 3] EC50 값 측정
EC50라 함은 본 발명에 따른 호로파 추출물이 나타낼 수 있는 최대 효과를 100%라 했을 때, 50%의 효과를 나타내는 농도를 의미하여, 50% 유효농도 또는 50% 효능 농도라고 한다. EC50 산출결과 29.456 μg/ml의 값이 구하여 졌다.
[실시예 4] 안정성 평가
본 발명에 따른 호로파는 한약제로 구분되어 있어 안정성에 문제가 없을 것으로 판단하였으나, 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행하여 이를 확인하고자 하였다.
6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 실시예 1의 호로파 추출물을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 5 g/㎏의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 호로파 추출물은 모두 랫트에서 5 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD50)은 5 g/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.
[비교예 1]
강황은 폐암, 자궁암, 유방암 등의 다양한 종류의 암에 대하여 항암 활성을 나타내는 물질이다. 본 발명자들은 상기 강황이 뇌암 세포의 성장에 미치는 정도를 확인함으로써 본 발명의 사상자 추출물의 유효성을 확인하였다.
구체적으로, 서울 약재상에서 구입한 강황(국산) 3 ㎏을 음지 및 실온에서 5일간 건조하고 분쇄하였다. 상기 분쇄된 강황을 95% 에탄올(ethanol) 30 ℓ에 침지시키고 50℃에서 24시간 동안 추출하였다. 이것을 여과지를 통하여 여과한 후 45℃ 감압 조건에서 건조 및 농축하여 총 추출물 474 g을 수득하고, -20℃에서 보관하였다.
상기 강황 추출물을 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 U-87 MG 세포의 성장 억제 정도를 확인하고, 그 결과를 하기 표 2 및 도 2에 기재하였다.
사상자 농도 뇌암 세포 생존율 (평균) 표준편차
0 ㎍/㎖ 1.000 0.000
3.125 ㎍/㎖ 1.020 0.076
6.25 ㎍/㎖ 1.042 0.097
12.5 ㎍/㎖ 1.060 0.092
25 ㎍/㎖ 1.021 0.081
50 ㎍/㎖ 0.987 0.090
100 ㎍/㎖ 0.913 0.029
그 결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 강황은 그 처리 농도가 높은 경우에도 거의 뇌암 세포의 성장을 감소시키지 못하였다. 이와 같이, 항암 물질로 널리 알려진 강황은 거의 뇌암 치료 효능이 없는데 반하여, 본 발명의 사상자 추출물은 우수한 U-87 MG 세포 사멸 활성을 가지며, 나아가 뇌암 치료 및 예방 활성을 가진다는 것을 나타낸다.
한편, 본 발명은 호로파의 뇌암 치료효능을 확인하는 이외에도 부수적 효능으로 미백효능을 갖는 기능성 화장품의 제조에도 응용되어질 수 있음을 확인하였다.
[제조예] 호로파 추출물을 유효성분으로 미백 기능성 화장품의 제조
[제조예 1]크림 형태의 미백화장품
실시예 1로부터 얻은 호로파 추출물을 각각 유효성분으로 첨가하고, 하기에 기재된 성분과 함량으로 크림형태의 화장품을 제조하였다.
조성물(중량%)
호로파 추출물 1.0
스테아린산 15.0
세탄올 1.0
수산화칼륨 0.7
글리세린 5.0
프로필렌 글리콜 3.0
방부제 적량
향 적량
정제수 to 100
[제조예 2]화장수 형태의 미백화장품
실시예 1로부터 얻은 호로파 추출물을 각각 유효성분으로 첨가하고, 하기에 기재된 성분과 함량으로 화장수형태의 화장품을 제조하였다.
조성물(중량%)
호로파 추출물 0.2
에탄올 10.0
폴리라우린산폴리옥시에틸렌소르비탄 1.0
파라옥시안식향산메틸 0.2
글리세린 5.0
1,3-부틸렌글리콜 6.0
향 적량
색소 적량
정제수 to 100

Claims (6)

  1. 호로파(葫蘆巴,fenugreek) 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 뇌암 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 에탄올 추출물은 50℃에서 24시간 동안 추출되는 것을 특징으로 하는 뇌암 치료용 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 에탄올 추출물은 45℃ 감압 조건에서 건조 및 농축되는 것을 특징으로 하는 뇌암 치료용 조성물.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 에탄올은 95%인 것을 특징으로 하는 뇌암 치료용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 것을 특징으로 하는 뇌암 치료용 조성물.
  6. 화장품에 허용 가능한 보조 첨가제를 포함하는 호로파(葫蘆巴,fenugreek) 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 미백 기능성 화장품.
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