KR20120081690A

KR20120081690A - 퀴놀린올 화합물을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물

Info

Publication number: KR20120081690A
Application number: KR1020110002945A
Authority: KR
Inventors: 최상기; 최중권; 고아라
Original assignee: 순천대학교 산학협력단; 한국화학연구원
Priority date: 2011-01-12
Filing date: 2011-01-12
Publication date: 2012-07-20
Also published as: KR101254038B1

Abstract

본 발명은 병원성 진균류에 대해 우수한 항진균 효과를 갖는 퀴놀린올 화합물을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물에 관한 것이다.

Description

퀴놀린올 화합물을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물{Antifungal Composition comprising Quinolinol compound as an active ingredient}

본 발명은 단세포성 곰팡이, 사상성 곰팡이 및 효모와 같은 여러 가지 병원성 진균류에 대해 우수한 항진균 활성을 갖는 퀴놀린올 화합물을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물에 관한 것이다.

진균류의 세포벽과 세포막 합성효소 저해제에 대한 연구는 오래전부터 시작되어 왔다. 그러나 세균성장을 저해하는 항생물질에 비해 그 발전속도가 느리고 진균류만을 선택적으로 죽일 수 있는 전반적인 지식이 불충분하여 진균류에 대하여 약효가 우수한 항진균제의 숫자도 매우 한정되어 있다. 더구나 생화학적인 방법으로 발견된 효소저해제의 대부분도 독성이 높고 부작용이 많아서 새로운 효소 저해제에 대한 필요성이 오래전부터 대두하여 왔다.

최근에는 AIDS나 장기이식시의 면역억제제 혹은 항암제 등의 장기간 사용에 따른 기회 감염에 의해 내장 진균증이 더욱더 증가하고 있는 추세이다 [Georgopapadakou NH, Walsh TJ. Human mycoses : drugs and targets for emerging pathogens . Science, 264, 371-373, 1994]. 따라서, 이러한 감염증에 대한 대책으로서 조기진단법의 확립과 선택 독성이 뛰어난 화학요법제의 조속한 개발이 시급하며 이와 더불어 칸디다(Candida)와 아스퍼질러스(Aspergillus) 등과 같은 다양한 진균류에 대해 화학요법제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

현재 개발된 항진균제는 작용부위에 따라 크게 3그룹으로 나눌 수 있다 [Persidis, A., Antibacterial and antifungal drug discovery , Nature Biotech . 17, 1141, 1999].

그중 폴리엔(polyene)은 곰팡이의 세포막의 합성에 필요한 분자에 작용하고 아졸(azole)은 곰팡이의 주요한 스테롤인 에르고스테롤(ergosterol)의 합성을 저해하며, 5-프루오로사이토신(5-fluorocytosine)은 곰팡이의 고분자 합성을 저해하는 특징이 있다. 이들 화합물에 대한 곰팡이의 내성과 부작용이 문제가 되어 왔기 때문에 구조가 유사한 많은 새로운 화합물들이 개발되었다. 그러나 곰팡이가 흡수된 특정 약을 배출시키는 현상이 남아 있는 등 여전히 개발된 약에 대한 곰팡이의 저항성이 계속 증가하고 있다[Cardenas, M. E. et al., Antifungal activities of antineoplastic agents : Saccharomyces cerevisiae as a model system to study drug action . Clin Microbiol Rev 12, 583-611, 1999]. 따라서 이러한 저항성을 이겨내기 위해서는 여러 유용한 새로운 화합물에 대한 요구가 시급하다.

이러한 요구는 기존에 알려진 약의 표적이 아닌 다른 부위에 작용하는 화합물을 찾아야 하며, 또한, 곰팡이에 매우 특이적이고 숙주인 사람, 동물 등에는 부작용이 없어야 하는 등의 특성이 우선시되어야 한다.

한편, 곰팡이는 진핵세포로서 사람과 비슷한 특성이 있기 때문에 곰팡이에만 특이성을 갖는 항진균제를 찾기가 어렵다.

일반적으로 항진균성 물질을 탐색하는 데는 크게 두 가지 방법이 있다. 첫째 전통적인 방법으로 세포성장을 저해하는 물질을 찾는 것이고, 두 번째는 특정한 표적 단백질의 기능을 억제하는 물질을 생화학적 반응시스템을 이용하여 찾는 것이다.

현재 곰팡이에 특이적으로 존재하는 많은 표적 단백질들이 발굴되고 있으며 이들의 기능 또한, 계속해서 확인되고 있는 중이다. 상기 후자의 경우는 정확하게 표적의 기능이 밝혀지지 않으면 스크리닝이 잘 되지 않는 단점이 있다. 한가지 예로는 그 표적 단백질이 세포 내에서 유일하게 존재하지 않는 대사과정 중에 있는 경우로서 항진균제의 개발을 위한 표적으로 적합하지 않다.

항진균성 물질의 표적이 밝혀지지 않은 경우에 그 물질을 탐색하는 방법 또한, 유용하게 사용될 수 있다. 그러나 탐색될 수 있는 화합물이 제한되어 있고, 표적에 의거한 화합물은 세포막을 통과하지 못하는 등의 2차적인 문제점이 있다. 따라서 고전적인 방법에 의해 항진균성 물질을 탐색한 후에 그 표적이 발견된다면, 이를 기반으로 그 표적의 기능을 검색하는 반응을 이용하여 항진균 활성이 우수한 항진균제를 개발될 수 있다.

Georgopapadakou NH, Walsh TJ. Human mycoses: drugs and targets for emerging pathogens. Science, 264, 371-373, 1994 Persidis, A., Antibacterial and antifungal drug discovery, Nature Biotech. 17, 1141, 1999 Cardenas, M. E. et al., Antifungal activities of antineoplastic agents: Saccharomyces cerevisiae as a model system to study drug action. Clin Microbiol Rev 12, 583-611, 1999

이에 본 발명자들은 여러 가지 화합물 중, 퀴놀린올 화합물을 선정하고 이를 다양한 진균류에 대해 스크리닝한 결과, 특정 퀴놀린올 화합물이 병원성 진균류를 효과적으로 저해할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 진균류의 성장을 효과적으로 저해할 수 있는 항진균 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 퀴놀린올 화합물을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물을 제공한다:

본 발명에 따른 퀴놀린올 화합물은 병원성 진균류에 대해 우수한 항진균 활성을 가져 각종 항진균제, 약제학적 조성, 식품 보존 첨가제, 화장품 첨가제, 항진균용 건축자재, 항진균용 농약 및 생활용품 첨가제 등으로 바람직하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 퀴놀린올 화합물의 단세포성 곰팡이의 성장저해를 보여주는 그래프이고, 그 중 (a)는 캔디다 알비칸(Candida albicans), (b) 캔디다 글라바타(Candida glabrata ), (c) 크립토코커스 네오포르만(Cryptococcus neoformans ), (d) 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 퀴놀린올 화합물의 사상성 곰팡이의 성장저해를 보여주는 그래프이고, 그 중 (a)는 아스퍼질러스 휴미거투스(Aspergillus fumigatus), (b)는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), (c)는 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)이다.
도 3은 본 발명에 따른 화학식 1의 퀴놀린올 화합물의 항진균 효과를 보여주는 사진이다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 퀴놀린올 화합물을 포함한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1의 퀴놀린올 화합물은 3-메틸-1-(2-메틸페닐)- 1H-피롤로[3,2-c]퀴놀린-6-올(3-methyl-1-(2-methylphenyl)-1H-Pyrrolo[3,2-c]quinolin-6-ol)로 명명된다.

상기 퀴놀린올 화합물은 본 발명자에 의해 특허출원 제1997-26506호로 특허출원하여 위산 분비 억제제로서의 용도를 제시한 바 있으며, 세크레타아제 억제제 등의 다른 용도에 대해서도 출원한 바 있으며, 화합물의 관능기를 변화시켜가며 위산분비 억제제(특허출원 1997-38512호)로서 용도를 제시하였으나 아직까지 항진균 효과에 대한 내용은 제시된 바가 없다.

본 발명에서 제시하는 퀴놀린올 화합물은 특별한 언급이 없는 한 퀴놀린올 염 및 이의 광학 이성질체를 모두 포함한다. 상기 퀴놀린올 화합물이 염의 형태로 사용하는 경우, 유효 성분인 퀴놀린올 화합물에 관하여 존재하는 염 중에서 각각의 용도에 적합하거나 허용되는 염을 선택하면 양호하며, 바람직하기로 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다.

유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 아황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 말레산, 퓨마르산, 글루코산, 메탈설폰산, 아세트산, 글리콜산, 석신산, 타타르산, 4-톨루엔설폰산, 갈락투론산, 엠본산, 글루탐산, 시트르산, 아스파르탄산 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄설폰산 또는 염산을 사용할 수 있다.

이때 상기 부가염은 통상의 방법, 즉, 화학식 1의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 당량 또는 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조하거나, 또는 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조하거나 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물은 시판되는 것을 구입하거나 직접 제조하여 사용이 가능하다. 일례로 특허출원 제1997-26506호에 기재된 바에 의해 직접 제조가 가능하다. 또한, 화학식 1의 화합물의 제조는 헤테로 방향족 고리계를 제조하는 방법이 당업계에 널리 공지되어 있다. 특히, 합성 방법은 문헌 [Comprehensive Heterocyclic Chemistry, Vol. 1 (Eds.: ARKatritzky, CW Rees), Pergamon Press, Oxford, 1984 and Comprehensive Heterocyclic Chemistry II: A Review of the Literature 1982-1995 The Structure, Reactions, Synthesis, and Uses of Heterocyclic Compounds, Alan R. Katritzky (Editor), Charles W. Rees (Editor), E.F.V. Scriven (Editor), Pergamon Pr, June 1996]에서 논의된다. 중요한 화합물의 합성을 돕는 다른 일반적인 방법으로는 문헌 [March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Wiley-Interscience; 5th edition (January 15, 2001)]을 들 수 있다. 국제특허 WO 2007/091106호; 대한민국특허 2009-010025호; Tetrahedron Letters, 49(29-30), 4466, 2008)에서 논의된 합성 방법이 특히 적합하다.

상기 화학식 1로 표시되는 퀴놀린올 화합물은 병원성 진균류에 대해 우수한 항진균 활성을 나타낸다.

구체적으로, 화학식 1의 퀴놀린올 화합물은 병원성 진균의 IC₅₀이 0.1?10 ㎍/㎖로 우수한 항진균 활성을 가진다.

이러한 병원성 진균으로는 캔디다 알비칸(Candida albicans), 크립토코커스 네오포르만(Cryptococcus neoformans ), 캔디다 글라바타(Candida glabrata ), 캔디다 러시타니에(Candida lusitaniae), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger ), 아스퍼질러스 휴미거투스(Aspergillus fumigatus ), 푸자리움 옥시스포룸( Fusarium oxysporum), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)가 있으며, 이들 모두에 대해 우수한 항진균 활성을 나타내었다.

이와 같이 본 발명에 따른 퀴놀린올 화합물은 각종 병원성 미생물에 대한 항진균 활성이 우수하고, 독성이 없으며 미량으로도 효과가 우수하여 각종 항진균제, 약제학적 조성, 식품 보존 첨가제, 화장품 첨가제, 항진균용 건축자재, 농약, 생활용품 첨가제 등으로 사용이 가능하다.

상기 퀴놀린올 화합물의 인체에 대한 독성 여부는 선행 기술을 통해 위산분비 억제제, 세크레타아제 억제제 등의 용도가 공지되어 있는 바, 이의 기술 내용을 본 발명에 따른 화학식 1의 퀴놀린올 화합물은 약제학적 제조가 가능하고 인체에 대한 독성이 없음을 알 수 있다.

본 발명은 상기 항진균 활성을 가지는 퀴놀린올 화합물을 유효성분으로 함유하여 항진균제 또는 약제학적 조성 물질로 사용함에 따라 각종 병원성 미생물의 활성을 저해하거나 균사체 형성을 저지한다.

항진균제 조성물은 화학식 1의 퀴놀린올 화합물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명에 의한 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하고 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용할 수 있으며, 제제화할 경우에는 일반적으로 사용되는 항진균제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 상기 항진균제로는 케토코나졸, 이트라코나졸, 플루코나졸, 미코나졸, 클로트리마졸, 펜티코나졸, 에코나졸, 비포나졸, 옥시코나졸, 클로코나졸, 롤시클레이트, 암포테리신 B, 플루사이토신,그리세오플빈, 터비나핀, 니스타틴, 톨나프테이트, 나프티핀, 할로프로진 및 사이클로피록스, 트리클로산, 노프로삭신, 시프로삭신 및 염으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물이 사용될 수 있다.

경구투여를 위한 고형제제는 본 발명에 의한 하나 이상의 이미다졸 유도체에 적어도 하나의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose), 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등의 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제에는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 포함되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 사용할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 상기 비수성용제 또는 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있으며, 상기 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 또한, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 퀴놀린올 화합물을 마우스에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 퀴놀린올 화합물의 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1g/㎏ 이상인 것으로 나타나 안전한 물질로 판단된다.

또한, 화학식 1의 퀴놀린올 화합물은 식품 보존 첨가제로서 사용하여 식품을 장기간 보존할 수 있다. 상기 식품은 식품가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 건강보조식품, 조미식품, 제빵 및 제과류, 유가공품, 절임 식품, 발효 식품 또는 음료 등을 포함하며, 상기 사료는 가축 사료를 포함하여 그 용도에 제한되지 아니하고, 고체 또는 액체일 수 있다.

그리고 상기 항진균 활성을 가지는 퀴놀린올 화합물은 화장품 첨가제로 사용되어 손 또는 발의 청결유지를 위한 화장료 조성물 제조에 이용할 수 있다. 일례로, 비누(고형비누, 액체비누, 포상비누, 바디비누, 핸드비누 등), 클렌싱 거품, 샴프(두발용 샴프, 드라이샴프 등) 등을 들 수 있다. 이들 중에서도 비누가 바람직하고, 특히 액체비누, 바디비누 등의 제형으로 사용될 수 있다.

이외에도, 화학식 1의 퀴놀린올 화합물은 항진균용 건축자재, 농약, 생활용품 첨가제 등으로 다양하게 사용이 가능하며, 그 분야에서 사용하는 공지된 항진균제와 혼합하여 사용할 수 있다. 일례로, 농약 관련 항진균제는 예를 들어 농약 사전[참조: Pesticide Manual, 12th ed., British Crop Protection Council, 2000]에 기재되어 있다.

전술한 바의 용도를 위해 화학식 1의 퀴놀린올 화합물은 각 용도에 유효한 효과를 나타낼 수 있도록 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 중량% 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 50 중량% 포함될 수 있다.　

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실험예 1 : 단세포성 곰팡이의 성장 저해 실험 및 MIC 측정

(1) 성장 저해 실험

한국화합물은행으로부터 화학식 1의 3-메틸-1-(2-메틸페닐)- 1H-피롤로[3,2-c]퀴놀린-6-올을 공급받아 병원성 진균에 대한 성장 저해 실험을 수행하였다. 상기 3-메틸-1-(2-메틸페닐)- 1H-피롤로[3,2-c]퀴놀린-6-올에 대한 물성은 하기와 같다:

¹H NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ 1.89(s, 3H), 2.49(s, 3H), 6.49(dd, 1H), 6.89~7.50(m, 7H), 9.00(s, 1H).

m/e : 288(M+).

mp : 137?139℃.

실험을 위해 YPD 배지(bacto-peptone 20g, bacto-yeast extract 10g, 2% dextrose/ℓ)에 단세포성 곰팡이와, 감자 덱스트로즈 아가 배지(potato starch 0.4%, dextrose 20%, Agar 15%)에 사상성 곰팡이를 각각 배양하였다. 이때 단세포성 곰팡이로는 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 캔디다 글라바타(Candida glabrata ), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans ), 캔디다 러시타니에(Candida lusitaniae), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)을, 사상성 곰팡이로는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 및 아스퍼질러스 휴미거투스(Aspergillus fumigatus)을 사용하였다.

얻어진 진균을 다시 RPMI-1640 배지 3㎖에 각각 최종 O.D 값이 0.01이 되도록 희석하고, 접종하여 16시간 동안 전 배양하였다.

실험에 앞서 현미경을 이용한 세포 계수기(hemocytometer)로 O.D 값을 0.1에서㎖당 균수를 계산하였고, 이를 바탕으로 진균의 접종량을 O.D 값을 0.01에서 10㎕로 결정할 수 있었다. 이렇게 하여 최초의 접종량이 O.D 값을 기준으로 통일하여 모든 화합물에 대해 동일한 조건에서 수행하였다. 다만, 상기 크립토코커스 네오포르만스는 다른 균주에 비해 균주의 크기가 커서 적은 균수로도 O.D 값이 높아 접종시 O.D 값을 0.02로 접종하여 실험하였다.

대조군으로는 화학식 1의 퀴놀린올 화합물을 미첨가하여 수행하였으며, 모든 실험에서 상기 화합물은 디메틸술폭사이드(DMSO)에 희석하여 사용하였다.

진균의 성장 저해 실험은 96 웰 플레이트에 RPMI배지 100㎕를 분주한 후 각각의 웰에 화합물을 3㎕씩 혼합하여 최종 12.5μM이 되었으며 배양된 균주는 10㎕ 첨가하여 30℃에서 48시간 배양한 후 600nm에서 12시간 간격으로 O.D 값을 측정하였고, 얻어진 결과를 도 1에 각각 나타내었다.

도 1은 본 발명에 따른 퀴놀린올 화합물의 단세포성 곰팡이의 성장저해를 보여주는 그래프이고, 그 중 (a)는 캔디다 알비칸스(Candida albicans), (b) 캔디다 글라바타(Candida glabrata ), (c) 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans ), (d) 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)를 나타낸다.

도 1을 참조하면, 퀴놀린올 화합물이 상기 진균들의 성장을 효과적으로 저해함을 알 수 있다. 이외 직접 도시하지 않았으나, 캔디다 러시타니에(Candida lusitaniae) 또한, 상기 거동과 동일한 결과를 보였다.

(2) 최소생육저지농도 측정

상기 실험예 1에서 수행한 결과를 바탕으로 다양한 진균류에 대한 성장 저해 농도(MIC)를 측정하기 위해 하기와 같이 수행하였다.

(2-1) 균주 배양

균주 배양 배지는 PDA (Potato Dextrose Agar)배지에서 배양하였다. 균주의 접종은 PDA 배지에서 2일간 배양한 균주에 0.1% 트윈 20/0.85% 살린 용액을 5㎖ 정도 분주하여 루프로 가볍게 긁어낸 다음에 15㎖ 팔콘 튜브에 피펫을 이용하여 담았다. 그리고 24시간 동안 4℃에서 정치시켜 놓고 이후 RPMI 배지 3㎖에 상층액 100㎕을 분주하여 30℃에서 24시간 배양한 후 O.D를 측정하여 접종 O.D 값을 0.01로 맞추고 실험에 10㎕ 분주하여 실험하였다. 배양한 균주의 포자를 수확한 후 DMSO에 희석하였으며, 대조군은 화합물 대신 10% DMSO 10㎕을 분주하여 사용하였다.

상기 균주로는 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 캔디다 러시타니에(Candida lusitaniae), 캔디다 글라바타(Candida glabrata), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)을 사용하였다.

(2-2) 최소생육저지농도( MIC ) 측정

최소생육저지농도(MIC)는 화학식 1의 퀴놀린올 화합물 0.1㎖를 0.9㎖의 DMSO에 혼합하여 10×씩 화합물을 희석하여 큰 범주에서 성장 저해 농도를 확인한 다음(macrodilution방법), 다시 퀴놀린올 화합물 100㎕를 100㎕의 용매에 혼합하여 2×씩 화합물을 희석하여 최소 저해 농도에 근접한 값을 구하였다(microdilution방법). 이어 농도 기울기가 생기면 수식을 이용하여 MICs 값을 산출하였다(Espinel-Ingroff A. and Kish C.W., J. Clin . Microbiol . 30, 3138(1992)).

이때 대조군은 종래 항진균 효과가 있다고 알려진 이트라코나졸(Itraconazole) 및 케토코나졸(Ketoconazole)을 사용하여 얻어진 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

균주		MIC₅₀ (㎍/㎖)
캔디다 알비칸(Candida albicans)	화학식 1의 화합물	0.32
	이트라코나졸	0.32
	케토코나졸	0.16
캔디다 러시타니에(Candida lusitaniae)	화학식 1의 화합물	0.16
	이트라코나졸	0.32
	케토코나졸	0.08
캔디다 글라바타(Candida glabrata )	화학식 1의 화합물	0.08
	이트라코나졸	0.32
	케토코나졸	0.32
캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)	화학식 1의 화합물	0.16
	이트라코나졸	0.16
	케토코나졸	0.32
크립토코커스 네오포르만(Cryptococcus neoformans )	화학식 1의 화합물	0.02
	이트라코나졸	0.08
	케토코나졸	0.08

상기 표 1을 참조하면, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 종래 항진균제로 사용하고 있는 이트라코나졸 및 케토코나졸과 비교하여 1?4배 이상의 우수한 수준의 항진균 효과를 나타내었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 이트라코나졸 및 케토코나졸을 대체할 수 있는 항진균제로서 사용이 가능함을 알 수 있다.

실험예 2 : 사상성 곰팡이의 성장 저해 실험 및 MIC 측정

(1) 성장 저해 실험

한국화합물은행으로부터 화학식 1의 3-메틸-1-(2-메틸페닐)- 1H-피롤로[3,2-c]퀴놀린-6-올을 공급받아 병원성 진균에 대한 성장 저해 실험을 수행하였다.

실험을 위해 감자 덱스트로즈 아가 배지(potato starch 0.4%, dextrose 20%, Agar 15%)에 사상성 곰팡이를 각각 배양하였다. 이때 사상성 곰팡이로는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 휴미거투스(Aspergillus fumigatus) 및 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)을 사용하였다.

실험에 앞서 현미경을 이용한 세포 계수기(hemocytometer)로 O.D 0.1에서㎖당 균수를 계산하였고, 이를 바탕으로 진균의 접종량을 O.D 값을 0.01에서 10㎕로 결정할 수 있었다. 이렇게 하여 최초의 접종량이 O.D 값을 기준으로 통일하여 모든 화합물에 대해 동일한 조건에서 수행하였다. 다만, 상기 크립토코커스 네오포르만스는 다른 균주에 비해 균주의 크기가 커서 적은 균수로도 O.D 값이 높아 접종시 O.D값을 0.02로 접종하여 실험하였다.

대조군으로는 화학식 1의 퀴놀린올 화합물을 미첨가하여 수행하였으며, 모든 실험에서 상기 화합물은 DMSO에 희석하여 사용하였다.

진균의 성장 저해 실험은 96-웰 플레이트에 RPMI배지 100㎕를 분주한 후 각각의 웰에 화합물을 3㎕씩 혼합하여 최종 3㎍/㎖이 되었으며 배양된 균주는 10㎕ 첨가하여 30℃에서 48시간 배양한 후 600nm에서 12시간 간격으로 O.D값을 측정하였고, 얻어진 결과를 도 2에 각각 나타내었다.

도 2는 본 발명에 따른 퀴놀린올 화합물의 사상성 곰팡이의 성장저해를 보여주는 그래프이고, 그 중 (a)는 아스퍼질러스 휴미거투스(Aspergillus fumigatus), (b)는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) (c)는 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)이다.

(2) 최소생육저지농도 측정

(2-1) 균주 배양

상기 균주로는 아스퍼질러스 휴미거투스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 및 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)을 사용하였다.

(2-2) 최소생육저지농도( MIC ) 측정

이때 대조군은 종래 항진균 효과가 있다고 알려진 이트라코나졸(Itraconazole) 및 케토코나졸(Ketoconazole)을 사용하여 얻어진 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

균주		MIC₅₀ (㎍/㎖)
아스퍼질러스 휴미거투스(Aspergillus fumigatus )	화학식 1의 화합물	0.65
	이트라코나졸	2.60
	케토코나졸	2.60
아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger )	화학식 1의 화합물	0.32
	이트라코나졸	1.3
	케토코나졸	1.3
푸자리움 옥시스포룸( Fusarium oxysporum)	화학식 1의 화합물	0.16
	이트라코나졸	0.32
	케토코나졸	0.32

상기 표 2를 참조하면, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 종래 항진균제로 사용하고 있는 이트라코나졸 및 케토코나졸과 비교하여 3?4배 이상의 우수한 수준의 항진균 효과를 나타내었다. 이러한 결과를 통해, 본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 이트라코나졸 및 케토코나졸을 대체할 수 있는 항진균제로서 사용이 가능함을 알 수 있다.

실험예 3: 사상성 곰팡이에 대한 항진균 활성의 가시적 관찰

페트리 디쉬에 PDA 아가 배지를 플레이트 높이 1/2정도 부어서 굳힌 후 여기에 배양된 사상성 곰팡이 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)을 적당한 크기로 잘라서 미리 준비된 PDA 아가 배지 중앙에 포자가 위를 향하도록 올려놓았다.

화학식 1의 퀴놀린올 화합물을 A, 200㎍; B, 20㎍; C, 2㎍의 함량이 되도록 DMSO에 각각 녹인 후 멸균된 페이퍼 디스크에 흡수시킨 다음, 상기 사상성 곰팡이를 기준으로 약 2cm 거리로 배지 위에 페이퍼 디스크를 올린 뒤, 30℃ 배양기에서 4일 동안 배양한 다음, 사진을 찍었다. 이어서 페이퍼 디스크 주위의 클리어존(clear zone) 크기로 생장 저해 활성을 관찰하였으며, 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 본 발명에 따른 화학식 1의 퀴놀린올 화합물의 항진균 효과를 보여주는 사진으로, 배지 중앙에 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)을 접종하고 배지 주변에 화합물을 적신 페이퍼디스크를 놓고 배양한 후 디스크 주변에 균 성장의 억제를 보여준다.

도 3을 참조하면, 본 발명에서 제시한 화학식 1의 화합물이 적셔진 디스크에 푸자리움 균사체가 자라지 않는 것을 확인할 수 있었고, 이로써 퀴놀린올 화합물의 항진균 활성을 분명하게 확인할 수 있었다.

실험예 4: 마우스에 대한 경구투여 급성독성 실험

본 발명에 의한 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

화학식 1의 퀴놀린올 화합물 200㎎을 1%의 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 배산체를 조제하여 5주령의 웅성 ICR계 마우스(20g±2g) 5마리에 1g/10㎖/kg으로 경구투여하고, 2주간 사망율, 체중, 임상증상 등을 관찰하여 최소치사량(MLD,㎎/㎏)을 조사하였다. 그 결과 경구투여 최소치사량이(LD₅₀) 1g/kg 이상으로 안전한 물질로 판단되었다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 제형예를 제시한다. 그러나 하기의 제형예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 제형예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<제제예 1> : 정제의 제조

하기 표 3의 조성으로 통상의 방법을 통해 화학식 1의 화합물을 포함하는 정제를 제조하였다.

조성	중량%
화학식 1의 퀴놀린올 화합물	10.0
옥수수 전분	30.0
감자 전분	30.0
유당	25.0
스테아린산 마그네슘	5.0

<제제예 2> 캡슐의 제조

캡슐 제형을 화학식 1의 퀴놀린올 화합물 100㎎과 락토오즈 100㎎을 혼합하고 생성 혼합물을 표준 불투명 경질 젤라틴 캡슐에 충전시켜 제조하였다.

<제제예 3> : 비누의 제조

하기 표 4의 조성으로 통상의 방법을 통해 화학식 1의 화합물을 포함하는 비누를 제조하였다.

조성	중량%
화학식 1의 퀴놀린올 화합물	5.0
세테아릴 알콜	19.5
코코넛 지방산	15.5
소디엄 라우릴 설패이트	15.5
소디엄 코코에이트	5.0
소디엄 고고일 이세티오네이트	5.0
PEG-400	5.0
코코넛 지방산 디에탄올 아마이드	5.0
소디엄 스테아레이트	5.0
알킬 버테인	5.0
글리세린	2.0
코코일 글루타믹산	2.0
디소디엄 EDTA	0.1
토코페닐 아세테이트	0.1
pH 조절제	적량
향료	적량
물	2.0
비누베이스	잔부

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 퀴놀린올 화합물을 유효성분으로 포함하는 항진균 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 항진균 조성물은 캔디다 알비칸(Candida albicans), 크립토코커스 네오포르만(Cryptococcus neoformans ), 캔디다 글라바타(Candida glabrata), 캔디다 러시타니에(Candida lusitaniae), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger ), 아스퍼질러스 휴미거투스(Aspergillus fumigatus ), 또는 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)에 대한 항진균 활성을 갖는 것인 항진균 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은 전체 조성물 내 0.001 중량% 내지 99.9 중량%의 함량으로 포함되는 것인 항진균 조성물.