KR20120067413A

KR20120067413A - Ｔｌｒ 작동제를 포함하는 유방암 방사선 치료 보조제

Info

Publication number: KR20120067413A
Application number: KR1020100128793A
Authority: KR
Inventors: 정유진; 조정현; 강수진; 이효지; 김근철
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2010-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2012-06-26
Also published as: KR101250419B1

Abstract

본 발명자들은 인간 유방암 세포주 MCF-7에서 TLR3와 TLR7이 발현됨을 밝혔고, 특정 리간드의 자극에 의하여 TLR이 이 세포주에서 항종양 효과를 유도함을 밝혀내었다. 네 종류의 시판되는 TLR3와 TLR7의 합성 작동제 중에서 Poly(I:C)와 이미퀴모드(IMQ)는 다른 작동제에 비하여 항종양 활성이 우수한 것으로 증명되었다. MCF-7 세포에서 위 2종 TLR 작동제 중의 하나로 처리는 경우 세포 성장률이 저하됨을 관찰하였다. 성장률 저하는 자가탐식현상(autophagy) 및 자가탐식현상에 의하여 유도되는 세포 사멸에 기인하였다. 왜냐하면 자가탐식현상 저해제인 3-메틸아데닌으로 처리한 경우 종양세포 성장률이 회복되고, 이미퀴모드 또는 poly(I:C)를 처리한 MCF-7 세포에서 자가탐식현상 관련 유전자의 발현 수준이 증가하였기 때문이다. 뿐만 아니라, 세포들이 TLR 작동제와 γ-선 조사에 동시에 노출된 경우 MCF-7 세포의 생존율은 현저히 감소하였다. 따라서, 본 발명의 결과는 유방암의 방사선 치료에 있어서 TLR 작동제를 치료 보조제로 사용할 수 있음을 말해준다.

Description

ＴＬＲ 작동제를 포함하는 유방암 방사선 치료 보조제{An Adjuvant for breast cancer radiotherapy containing toll-like receptor agonists}

본 발명은 유방암의 방사선 치료 민감성을 높여주는 TLR 작동제를 포함하는 유방암 방사선 치료 보조제에 관한 것이다.

항원 제시 세포(antigen presenting cells) 내에서 주로 발현되는 톨-유사 수용체(Toll-like receptor; 이하 본 출원서에서 "TLR"이라 함)는 병원체의 특정 구조 패턴을 인식하고 신호를 전달하여 염증 반응을 유도함으로써 내재된 면역체계에서 결정적인 역할을 수행한다. 비록 다양한 고형암들이 엔도좀 TLR들 즉, TLR3, 7, 8, 및 9를 발현한다고 보고되었지만, 암 발생에서 TLR의 세포학적 및 분자적 기능은 아직 밝혀지지 않았다.

TLR들은 내재적 면역계에서 병원균 특이적 분자 양상(pathogen associated molecular patterns; PAMPs)을 인식하고, 획득성 면역반응(adaptive immune reaction)을 유도하는 것으로 알려져 있다(Akira, 2006; Medzhitov and Janeway, 2000a; Medzhitov and Janeway, 2000b). TLR 리간드는 감염성 질병, 자가면역 질병 및 종양 치료제 개발의 잠재적 타겟으로 생각되어 왔다(Suzuki et al., 2002; Tse and Horner, 2007). 비록 TLR 리간드의 항종양 활성이 다양한 종양 세포주와 동물 모델에서 이미 밝혀졌지만, 선행 연구의 주요 포커스는 수지상 세포의 활성화에 의하여 Th1-매개 면역으로 항종양 면역성이 증대될 수 있다는 것이었다(Schwartz et al., 2009; Smits et al., 2008; Vidal et al., 2004; Watts et al. 2010). 최근 TLR3 리간드인 Poly(I:C)와 TLR7 리간드인 이미퀴모드(IMQ)가 항종양 활성을 나타내며, 이 활성은 흑색종과 대장암에서 자가탐식현상(autophagy)에 의해 매개된다는 것이 보고된 바 있다(Mathew et al., 2007; Tormo et al., 2009; Yi et al., 2009). 그러나, 다른 TLR 리간드들이 Poly(I:C) 또는 이미퀴모드(IMQ)와 동일 또는 유사한 효과를 나타낸다거나 이들 두 TLR 작동제들이 다른 종양에서 자가탐식현상-관련된 세포 사멸을 유도한다는 것에 대해서는 명확히 밝혀지지 않았다.

세포예정사는 종양 치료에서 타게팅된 중요한 단계이다 (Cormary et al., 2005; Reed, 2008). 세포예정사 중 가장 널리 연구된 세포자멸사(Apoptosis)는 캐스페이즈(caspases)에 의존적이다(Gyrd-Hansen and Meier, 2010). 세포자멸사와 분명히 구분되는 다른 세포예정사의 메카니즘은 자가탐식현상(autophagy)이다 (Djavaheri-Mergny et al. 2010). 자가탐식현상(Autophagy)은 식균세포(phagocytic cells) 내에서 병원체를 제거하는 주요 방어 메카니즘 중 하나이며, 이를 통하여 자가탐식 공포(autophagic vesicles)는 라이소좀과 융합하여 외래 유기체를 분해한다. 자가탐식현상은 면역 체계에서 방어 메카니즘으로서 병원체를 청소하는 것에 관여할 뿐 아니라 손상된 단백질 또는 소기관을 세포질로부터 제거함으로써 항상성을 유지하는 데도 관여한다. 자가탐식현상을 하는 동안 세포는 엔도멤브레인 리모델링을 나타내며, 이중막 소포 내에 세포질 일부를 감싸서 자가탐식소체(autophagosomes)를 형성한다. 자가탐식소체는 라이소좀과 융합하고, 융합된 소포 내의 내용물은 최종적으로 분해된다(Xie and Klionsky, 2007). 효모에서 인간까지 보존된 atg 유전자 그룹은 자가탐식현상과 관련되어 있는 것으로 나타났다(Hanada et al., 2007).

본 발명은 종양의 전통적 화학 치료 대신 세포의 면역 기능을 살리는 치료제를 개발하려는 것을 목적으로 한다.

많은 연구자들은 종양 면역치료법(Cancer immunotherapy)이 전통적인 종양 치료법에 비하여 많은 장점이 있을 것으로 판단하여 면역치료법에 대한 연구가 활발해지고 있다. MCF-7 세포는 비교적 화학치료 및 방사선 치료에 저항성을 나타내는 유방암 세포주로 보고되었다(Kumar et al., 2007; Mougel et al., 2004). 본 발명자들은 MCF-7 세포에 대하여 TLR 작동제를 처리함으로써 자가탐식현상- 유도 세포 사멸을 불러 일으키는 실험을 수행하였다. 그 결과, TLR 작동제는 세포자멸사(apoptosis) 저항성 종양세포를 치료하는 대안이 될 수 있음을 알게 되었다.

많은 고형암들이 엔도좀 TLR을 발현하지만, 종양에서 발현되는 TLR들이 종양 발생이나 전이에서 어떤 분자적, 세포적 기능을 수행하는지에 대해서는 명확히 알려져 있지 않다. 최근, 몇몇 연구팀들이 흑색종, 신경교종 및 자궁암에서 발현되는 TLR 자극방법이 종양의 면역학적 치료법의 타겟이 될 수 있음을 밝혔다(Huang et al., 2008; Tormo et al., 2009). 합성 TLR 작동제 중에서 TLR9의 작동제인 CpG 모티프는 디자인이 쉽고, 강한 면역 조절을 유도하기 때문에 가장 널리 사용된다(Choi et al., 2010; Krieg, 2007).

본 발명자들은 엔도좀 TLR 작동제인 Poly(I:C)와 이미퀴모드, 록소리빈, 가디퀴모드에 대하여 MCF-7 유방암 세포주에서 자가탐식현상 및 자가탐식현상에 의해 유도되는 세포 사멸을 평가하였다. 저강도 γ-선을 조사할 때 Poly(I:C)와 이미퀴모드는 자가탐식현상에 의해 유도되는 세포 사멸을 촉진하였다.

본 발명자들은 최초로 Poly(I:C)와 이미퀴모드에 의해 유도되는 세포 사멸이 자가탐식현상과 관련이 있음을 밝혔다. 세포자멸사(apoptosis)도 TLR 작동제 처리에 의해 어느 정도 유도되는 것으로 보이나, 세포자멸사를 저해하더라도 세포 생존율에는 큰 차이가 없었다. MCF-7 세포에서 TLR 작동제를 처리하면 자가탐식현상과 관련된 유전자들 즉, LC3, Atg5-12 복합체 및 베클린(beclin)-1의 발현 수준이 증가한다. 이는 MCF-7 세포질에서 자가탐식소체 형성에 필수적인 분자적 사건이다(도 3A). 나아가, TLR 작동제를 선처리하면 MCF-7 세포의 방사선 민감성을 증대시키고, 이는 종양세포 생존율을 저하시키며, 자가탐식소체를 함유하는 세포 수를 증가시켜 세포 사멸을 일으킨다.

본 발명자들은 TLR3와 TLR7의 작동제가 유방암 방사선 치료에서 항종양 상승 효과를 나타내는지를 평가하기 위하여 실험을 수행하였다. 인간 유방암 세포주 MCF-7을 Poly(I:C) 및 이미퀴모드로 처리하면 자가탐식현상에 의하여 세포 사멸이 유도되었고, 이는 자가탐식현상 관련 유전자 발현 수준의 증가와 자가탐식소체를 가지고 있는 세포 수의 증가로 확인할 수 있었다. 나아가, Poly(I:C)와 이미퀴모드는 MCF-7 세포의 방사선 민감성(radiosensitivity)을 증대시켰고, 이는 γ-선 노출 하에서 종양세포 생존율이 저하되는 것으로 나타났다. 따라서, TLR 작동제는 유방암 방사선 치료에서 상승효과를 나타내는 보조제로서 이용할 수 있다.

본 발명은 TLR 작동제를 포함하는 유방암 세포의 방사선 민감성을 높이는 방사선 치료 보조제를 제공한다.

본 발명에서 TLR 작동제는 Poly(I:C)와 이미퀴모드(IMQ) 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에서 상기 TLR 작동제는 방사선 치료 전 선처리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의하면, 유방암 세포에 TLR 작동제를 처리한 후 약한 강도의 감마선을 조사하면, 방사선 치료에 저항적인 유방암 세포의 생존율을 현저히 낮출 수 있다.

도 1은 MCF-7 유방암 세포주에서 TLR3 및 TLR7의 발현과 TLR 작동제의 종양세포 성장 저해효과를 나타낸다.
(A) RT-PCR을 수행하여 MCF-7 유방암 세포주에서 TLR3 및 TLR7의 발현 수준을 탐지하였다. 총 RNA를 추출하여 cDNA로 전환시키고, 한 쌍의 특정 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. TLR3 및 TLR7 전사체(transcripts)는 각각 688bp 및 544bp로 증폭되었고, β-액틴은 대조군으로 사용하였다. "No RNA"는 역전사 반응 단계에서 RNA 주형이 없는 음성 대조군을 나타내며, "No Taq"은 Taq 폴리머레이즈가 없는 시료를 말한다.
(B) TLR7 작동제 처리군에서는 MCF-7 세포 성장률이 감소하였다. 각 작동제 농도는 실시예에 기재되어 있다. □: CON, 대조군; ■: IMQ, 이미퀴모드; 진한 회색: LOX, 록소리빈(loxoribin); 연한 회색: GDQ, 가디퀴모드.
(C) TLR3 작동제 Poly(I:C)는 MCF-7 세포의 성장을 억제하였다. 이미퀴모드 처리군과 비교할 때 Poly(I:C)는 MCF-7 세포에서 이미퀴모드보다 낮은 억제 활성을 나타내었다. 데이타는 각 시각에서 세 개의 웰로부터 얻어진 결과의 평균±표준편차로 나타내었다. 3회 실험은 유사한 결과를 나타내었다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p <0.001.
도 2는 자가탐식현상 저해가 MCF-7 세포에서 세포 생존율을 높임을 나타낸다.
(A) MCF-7 세포를 이미퀴모드 또는 Poly(I:C)로 처리하면 생존 세포 분획이 감소하고, 3-메틸아데닌(3-MA)으로 자가탐식현상을 억제하면 생존 세포가 대조군(CON)의 80%까지 증가하였다. 팬케스페이즈 저해제로 세포자멸사(apoptosis)를 저해하면 세포 생존율에 현저한 효과가 나타나지 않았다. 자가탐식현상 활성제인 라파마이신을 양성 대조군으로 이용하였다. 데이타는 세 번의 독립적인 실험으로부터 얻어진 결과를 평균±표준편차로 나타내었다.
(B) 이미퀴모드 또는 Poly(I:C)를 처리한 MCF-7 세포에서 자가탐식현상 관련 유전자의 발현 수준의 변화를 웨스턴 블랏으로 분석하였다. 대조군(0 h)과 비교할 때, 48 내지 72시간 동안 이미퀴모드 또는 Poly(I:C)를 처리한 MCF-7 세포에서 LC3-I에서 LC3-II로의 이동이 탐지되었다. 또한, 48시간 동안 이미퀴모드 또는 Poly(I:C)를 처리한 MCF-7 세포에서 Atg5-12 복합체(complex) 및 베클린(beclin)-1의 발현 수준이 현저히 증가하였다. β-액틴은 로딩 대조군(loading control)으로 이용하였다.
도 3은 MCF-7 세포에서 TLR 작동제는 γ-선 조사로 유도된 세포사멸 효과를 상승시킴을 나타낸다.
(A) 방사선 조사와 더불어 Poly(I:C) 또는 이미퀴모드를 처리한 경우 세포 사멸 동반 상승 효과를 확인하기 위하여 집락형성 분석(clonogenic assay)을 실시하였다. 세포를 각 작동제로 처리한 다음 2 또는 5 Gy의 γ-선으로 조사하였다. 대표적인 집락형성 분석 이미지를 나타내었다. CON: 대조군.
(B) TLR 작동제의 자극이 낮은 강도(2 Gy) 및 고강도(5 Gy) 방사선 조사로 유도된 세포 사멸을 가속화하였다. 집락 수 비율을 정량적으로 분석하여 나타내었다. TLR 작동제와 2 Gy의 γ-선 조사를 조합하면 MCF-7 세포의 생존률을 감소시켰다. 세 번의 실험으로부터 유사한 결과를 얻었다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p <0.001. NS: 유의성 없음(no significance).
도 4는 이미퀴모드 또는 Poly(I:C)로 처리한 MCF-7 세포에서는 γ-선에 노출시 자가탐식소체 형성이 유발되고 가속화됨을 나타낸다.
(A) MCF-7 세포를 72시간 동안 이미퀴모드 또는 Poly(I:C)의 존재 또는 부존재 하에 배양한 다음 면역형광염색을 이용하여 내재성(endogenous) LC3를 탐지하였다. 세포를 고정시킨 후, 항-LC3 항체로 면역레이블 하였고, FITC-접합된 염소 항 토끼 IgG(녹색)를 가하였다. 또한, DAPI(4'-6-Diamidino-2-phenylindole)로 핵(청색)을 가시화하였다. 위쪽 패널은 세 개의 독립적인 사본의 면역형광 이미지를 나타낸다. TLR 작동제로 처리하면 자가탐식소체 표면에 LC3 집합체(aggregation) 형성이 유도된다.
(B) 세포를 Poly(I:C)나 이미퀴모드로 세 시간 동안 선처리하고 2 Gy의 γ-선을 조사하였다. 72h 배양 후 내재성 LC3 및 DAPI로 염색하였다. A에서 한 가지로 자극 받은 시험군과 대비할 때 작동제와 방사선 조사를 동시에 받은 시험군에서는 강한 LC3 집합체가 관찰되었다.
(C) 세포 수와 LC3-양성 반점(puncta)을 가지고 있는 세포수를 현미경 하에서 카운트하고 그 비율은 총 세포수로 나누어 계산하였다. LC3-양성 반점을 가진 세포의 증가율은 이미퀴모드 또는 Poly(I:C) 단독 자극시 측정하였다. TLR 작동제와 γ-선 조사를 동시에 수행한 시험군에서는 증가율이 40% 이상으로 나타났다. 세 번의 측정치에 대한 평균 백분율±표준편차로 나타내었다.

이하, 좀더 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

재료와 방법

세포주와 시약

인간 유방암 세포주 MCF-7을 ATCC(American Type Culture Collection) (Manassas, USA)에서 입수하였고, 10% 우태혈청(FBS; Lonza, Walkersville, USA), 10,000 U/L 페니실린, 및 100 mg/L 스트렙토마이신(Gibco-BRL, Gaithersburg, USA)이 함유된 RPMI 배지에서 배양, 유지하였다. 폴리이노신산: 폴리사이티딘산 (Poly(I:C), 10 ㎍/㎖) (TLR3 작동제(agonist)), 지다당(lipopolysaccharide) (LPS, 1 ㎍/㎖) (TLR4 작동제(agonist)), 가디퀴모드(gardiquimod(GDQ), 2.4 ㎍/㎖) (TLR7 작동제(agonist)), 이미퀴모드(imiquimod(IMQ), 5 ㎍/㎖) (TLR7 작동제(agonist)), 및 록소리빈(loxoribine(LOX), 1 mM) (TLR7 작동제(agonist))은 InvivoGen (San Diego, USA)에서 구입하였다. 3-메틸아데닌(Methyladenine(3-MA), 10 mM), 및 라파마이신(100 nM)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, USA)에서 구입하였다. 팬케스페이즈 저해제(pancaspase inhibitor(Z-VAD-FMK), 10 μM)는 Promega (Madison, USA)에서 구입하였다.

실시예 1: RNA 분리 및 RT-PCR

RNeasy Mini 컬럼(Qiagen, Austin, USA)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 세포의 총 RNA를 추출하였다. 2 ㎍의 총 RNA와 올리고 dT로부터 M-MLV 역전사효소(Takara, Otsu, Japan)를 이용하여 공급자의 지시대로 cDNA를 역전사하였다. cDNA는 PCR로 증폭한 다음 1.2% 아가로즈 젤에 로딩하여 각 앰플리콘의 크기를 확인, 분석하였다. TLR3 증폭용 프라이머 서열은 5'-CGCCAACTTCACAAGGTA-3' 및 5'-GGAAGCCAAGCAAAGGAA-3'이고, TLR7 증폭용 프라이머 서열은 5'-AGTGTCTAAAGAACCTGG-3' 및 5'-CCTGGCCTTACAGAAATG-3'이다. β-액틴 증폭용 프라이머 서열은 5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CAG GGC-3' 및 5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3'이다.

실시예 2: 세포 생존율 시험

세포 생존율은 세포 카운팅 및 발색 분석으로 확인하였다. 세포 카운팅은 웰당 1 X 10⁵ 개의 세포를 시딩한 후 6-웰 플레이트 내에서 수행하였다. 각각 지시된 시각에 세포를 하비스트하고, 생존 세포를 카운트하고, 사멸 세포는 트리판 블루 염색으로 제외시켰다. 결과는 세 번의 측정에 대하여 평균 ± 표준편차로 표시하였다. 발색 분석은 세포 생존율 및 세포 독성 분석 키트인 WST-1 (Takara, Otsu, Japan)을 이용하여 수행하였다. 간략하게, MCF-7 세포를 96-웰 플레이트의 각 웰에 5 X 10³개씩 시딩한 다음 이틀 동안 배양하였다. 3-MA 또는 팬케스페이즈 저해제(pancaspase inhibitor)를 두 시간 동안 처리한 후 이미퀴모드(IMQ) 또는 Poly(I:C)를 배지에 가하였다. 지시된 시각에 10 ㎕의 발색시약을 각 웰에 가하고 다시 네 시간 동안 배양하였다. 배양 후 450 nm에서 각 시료 세트의 평균 흡광도를 ELISA 판독기(Biotec, Winooski, USA)로 측정하였다.

실시예 3: 집락형성 분석법(Clonogenic assay)

γ-선 조사 후 MCF-7 세포 생존율을 결정하기 위하여, 200 ~ 1 X 10³ 세포를 60 mm 디쉬에 시딩하고 TLR 작용제(agonist)가 있거나 또는 없는 상태에서 2 또는 5 Gy의 γ-선에 노출시켰다. 배양 14일 후 집락(colonies)은 트리판 블루(0.4%)로 염색하고 현미경 하에서 카운트하였다.

실시예 4: 웨스턴 블랏 분석

웨스턴 블랏 분석을 위하여 총 세포 용균액(Total cell lysates)을 제조하였다. 세포 용균액은 0.1% SDS(sodium dodecyl sulfate), 0.1% 데옥시콜린산(deoxycholate), 1% 트리톤(Triton) X-100, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 및 1X 프로테이즈 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktail)이 함유된 용균 완충액을 이용하여 추출하였고, 95 ℃에서 5분간 끓였다. 각 시료의 단백질 농도는 브래드포드 분석 키트(Bio-Rad, Hercules, USA)를 이용하여 결정하였다. 각기 동량의 단백질(30 ㎍)을 SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동으로 분석하였다. 단백질을 PVDF 막(Promega, Madison, USA)으로 이동시킨 다음 단백질 발현 수준은 LC3, 베클린(Beclin)-1, Atg5-12 특이적 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, USA)와 β-액틴에 특이적인 항체(Santa Cruz Biotechnology, Delaware Avenue, USA)로 탐지하였다.

실시예 5: 면역형광염색(Immunofluoscence staining)

MCF-7 세포를 18 mm 직경의 둥근 유리 커버슬립이 있는 12-웰 배양 디쉬에 시딩 하였다. 세포를 PBS로 세척한 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 10분간 고정하였고, 10분간 0.2% 트리톤 X-100이 함유된 PBS로 투과성을 높였다(permeabilized).

배양세포들은 마우스 또는 래빗 항인간 LC3 (MBL, Nagoya, Japan)를 포함하는 1차 항체로 두 시간 동안 염색하였고, PBS로 세 번 세척하였다. 세척으로 과량의 1차 항체를 제거한 다음 배양세포는 한 시간 동안 RT에서 FITC 항 래빗 2차 항체(Jackson Immunoresearch, West Grove, USA)와 함께 배양한 다음 PBS로 3회 세척하였다. MCF-7 세포는 4'-6-다이아마이디노(diamidino)-2-페닐인돌(phenyl indole) (DAPI, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)과 함께 5분 동안 배양한 다음 PBS로 5회 세척하고 고정하여 분석하였다.

결과 1: MCF-7 세포에서 TLR 작동제의 항종양 활성

본 발명자들은 RT-PCR을 이용하여 유방암 세포주 MCF-7에서 TLR3 및 TLR7 의 발현 수준을 결정하였다. MCF-7 세포에서 TLR3 및 TLR7은 각각 688 bp 및 544 bp 크기에서 탐지되었다(도 1A). MCF-7 세포가 발현하고 있는 각 TLR이 특정 리간드에 의하여 자극되어 세포 사멸을 유도하는지를 확인하기 위하여 세포를 시판 중인 TLR 작동제(agonists)로 처리하고 세포 성장률을 관찰하였다. TLR 작동제, 즉 TLR3 작동제인 Poly(I:C)와 TLR7 작동제인 가디퀴모드(GDQ), 록소리빈(LOX), 및 이미퀴모드(IMQ)를 MCF-7 세포에 가하고 정해진 시각에 현미경으로 생존 세포수를 카운트하였다(도 1B 및 1C). 작동제를 처리한 모든 그룹에서 생장 억제 효과가 관찰되었다. 세 가지 TLR7 작동제 중에서는 이미퀴모드가 가장 강력한 항암 효과를 나타내는 것으로 보인다. Poly(I:C)도 항암 활성을 나타내지만, 이미퀴모드보다는 약하다(도 1C). TLR 작동제 처리 4일 후, 이미퀴모드를 처리한 그룹의 세포 생존율은 대조군 생존율의 30% 밖에 미치지 못했고, Poly(I:C)를 처리한 그룹의 생존율은 대조군 생존율의 55%에 미쳤다. 이러한 결과는 TLR3 및 TLR7 작동제가 엔도좀 TLR 경로의 활성을 통하여 MCF-7 세포에서 직접적으로 항암 효과를 행사함을 나타낸다.

결과 2: Poly(I:C) 및 이미퀴모드는 MCF-7 세포에서 자가탐식현상(autophagy)에 의하여 유도되는 세포 사멸을 활성화한다

종양 치료 과정에 있어서 세포예정사는 결정적인 분자적 사건이다. 그리하여 본 발명자들은 TLR-매개 항종양 활성과 관련된 메카니즘을 시험해 보았다. 세포를 세포예정사에 대한 저해제로 먼저 처리한 다음 Poly(I:C) 또는 이미퀴모드로 자극하였다. TLR7 작동제인 록소리빈(LOX)과 가디퀴모드(GDQ)는 이미퀴모드(IMQ)에 비하여 활성이 낮았기 때문에 이후 실험에서 이들을 제외하였다(도 1B). 팬케스페이즈 저해제(Z-VAD-FMK) 또는 3-MA로 선처리한 경우, Poly(I:C) 또는 이미퀴모드(IMQ) 처리 후 세포 생존율이 회복되었다(도 2A). 3-MA를 선처리한 경우 이미퀴모드로 처리한 MCF-7 세포에서는 세포생존율을 42% 높였고, Z-VAD-FMK를 선처리한 경우에는 이미퀴모드 처리가 세포생존율을 22% 높였다. Poly(I:C) 처리 또한 이와 유사한 결과를 나타내었다. 자가탐식현상을 촉진시키는 약물로 알려진 라파마이신은 자가탐식현상에 의하여 유도되는 세포 사멸의 양성 대조군으로 이용되었다. 이미퀴모드 처리군 또는 라파마이신 처리군에서 생존 세포 백분율은 유사한 값을 나타내었다(도 2A). 세포 사멸 또한 세포자멸사(apoptosis)에 의한 것으로 보이지만, 주요 세포 사멸 메카니즘은 자가탐식현상이었다. 그러므로, Poly(I:C) 및 이미퀴모드 처리는 세포자멸사보다 자가탐식현상에 의하여 세포를 사멸시킨다.

Poly(I:C) 또는 이미퀴모드에 의하여 유도된 자가탐식현상 및 자가탐식현상 관련된 유전자 발현은 MCF-7 세포에서 각 작동제로 처리한 후 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. LC3-Ⅰ이 LC3-II로 이동하는 것은 자가탐식현상에서 가장 결정적인 분자적 사건이기 때문에, Poly(I:C) 또는 이미퀴모드와 함께 MCF-7 세포를 배양한 후 LC3-Ⅰ과 LC3-II 발현을 측정하였다. 자가탐식현상이 일어나는 동안, LC3는 수용성 LC3-I으로 된 다음, 막 결합 LC3-II로 바뀐다(Kabeya et al., 2000; Mizushima and Yoshimori, 2007). LC3-I에서 LC3-II로의 결집 이동(mobilization shift)은 Poly(I:C) 및 이미퀴모드 처리한 세포를 48시간 배양한 이후 급격히 상승하였다. 뿐만 아니라, Atg5-12 복합체(complex) 및 베클린(beclin)-1 발현 수준이 현저히 증가하였는데, 이는 배양 48시간 이후부터 시작되었다. 이러한 결과는 MCF-7 세포에서 TLR 작동제에 의하여 유도된 자가탐식현상을 나타낸다(도 2B).

결과 3: Poly(I:C) 및 이미퀴모드는 γ-선 조사에 의하여 유도된 세포 사멸을 촉진한다

MCF-7 세포가 방사선 조사에 의한 세포사멸에 저항성이 있는 것으로 알려졌기 때문에(Wang et al., 2005), 본 발명자들은 TLR 작동제들이 이 세포주의 방사선 민감성(radiosensitivity)을 증대시킬 수 있는지를 시험하였다. TLR 작동제로 처리한 MCF-7 세포에 비교적 낮은 2 Gy의 γ-선과, 비교적 높은 5 Gy의 γ-선 조사후 세포 사멸을 유도하여 집락형성 분석법으로 측정하였다. 비록 γ-선을 조사하지 않은 대조군 세포와 비교하면 TLR 작동제로 처리한 MCF-7 세포의 생존율은 현저한 차이가 있지만, 각 작동제로 세 시간 처리한 후 낮은 γ-선을 조사한 세포에서는 세포 사멸율이 급격히 높아졌다(도 3).

이미퀴모드와 2 Gy의 γ-선 동시 처리는 이미퀴모드 단독 처리한 세포에 비하여 세포 생존율을 53% 감소시켰다. 또한, 2 Gy의 γ-선 단독 처리한 경우에 비하여 세포 생존율을 35% 감소시켰다. Poly(I:C) 처리도 유사한 결과를 나타내었다.

5 Gy의 γ-선 조사에 노출된 세포의 생존율은 너무 낮아서 TLR 작동제와 γ-선 동시 처리의 영향을 구분할 수 없었다. 따라서, TLR 작동제는 MCF-7 세포를 γ-선 조사에 더욱 민감하게 만들고, 이러한 조건 하에서 세포 사멸이 더욱 촉진된다고 추론할 수 있다.

결과 4: TLR 작동제는 자가탐식소체 형성을 유발하며, γ-선 조사와 조합하면 자가탐식소체 형성을 촉진시킨다

위의 결과들은 TLR 작동제와 γ-선 조사의 조합은 세포 사멸 절차를 자극하여 종양세포 생존을 감소시키는 것으로 나타났다. 비록 TLR 작동제가 MCF-7 세포의 자가탐식현상에 의해 유도되는 세포사멸을 불러일으키긴 하지만, TLR 작동제와 γ-선 조사를 동시에 적용하는 경우 자가탐식현상이 가속화된다는 것은 분명히 알려지지 않았다.

본 발명자들은 γ-선 조사와 TLR 작동제 전처리가 MCF-7 세포에서 자가탐식소체 형성을 가속화하는지를 시험하였다. 전형적으로 LC3가 자가탐식소체와 관련되어 있기 때문에(Kabeya et al., 2000), Poly(I:C) 또는 이미퀴모드로 선처리한 MCF-7 세포에서 내재성 LC3-양성 반점을 관찰하였다. 도 4A와 같이, Poly(I:C) 또는 이미퀴모드로 처리했을 때 또는 2 Gy의 γ-선에 노출시켰을 때 MCF-7 세포에서 LC3 집합체가 형성되었다. 자가탐식소체를 가지고 있는 세포 숫자는 TLR 작동제로 세 시간 선처리한 후 2 Gy의 γ-선에 노출시켰을 때 증가하였다. MCF-7 세포에 약한 방사선 조사가 LC3 양성 반점을 가지고 있는 세포의 수를 44% 이상 증가시켰지만, 이미퀴모드로 선처리한 경우에는 LC3 양성 세포의 수를 약 83%까지 현저히 증가시켰다. Poly(I:C) 선처리 또한 γ-선 조사 후 LC3-양성 세포수를 48%에서 68%로 증가시켰다. 따라서, 이미퀴모드는 MCF-7 세포에서 가장 강력한 자가탐식현상 유도제가 될 수 있을 것으로 예측되며, 방사선 치료와 조합하면 MCF-7 세포에서 자가탐식현상에 의한 세포 사멸을 유도할 수 있을 것으로 예측된다.

<110> UNIVERSITY-INDUSTRY COOPERATION FOUNDATION KANGWON NATIONAL UNIVERSITY <120> An adjuvant for breast cancer radiotherapy containing toll-like receptor agonists <130> KNU-YJJUNG-1012 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TLR3 <400> 1 cgccaacttc acaaggta 18 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TLR3 <400> 2 ggaagccaag caaaggaa 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TLR7 <400> 3 agtgtctaaa gaacctgg 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TLR7 <400> 4 cctggcctta cagaaatg 18 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for b-actin <400> 5 gtggggcgcc ccaggcacca gggc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for b-actin <400> 6 ctccttaatg tcacgcacga tttc 24

Claims

TLR 작동제를 포함하는 유방암 세포의 방사선 민감성을 높이는 방사선 치료 보조제.
청구항 1에 있어서,
TLR 작동제는 Poly(I:C)와 이미퀴모드(IMQ) 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 보조제.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 TLR 작동제는 방사선 치료 전 선처리하는 것을 특징으로 하는 보조제.