KR20090090460A - 이미다조퀴놀린을 함유하는 대장암 항암제 및 방사선항암치료 보조제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장암 항암제 및 방사선 항암치료 보조제에 관한 것으로서, 좀더 자세히는 이미다조퀴놀린을 대장암 항암제 및 방사선 항암치료 보조제로 사용하는 기술에 관한 것이다.

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Description

이미다조퀴놀린을 함유하는 대장암 항암제 및 방사선 항암치료 보조제{Anti-colorectal cancer preparation containing imidazoquinoline and aid for radiotheraphy}

본 발명은 대장암 항암제 및 방사선 치료 보조제에 관한 것이다.

국내의 사망 원인 중 1위를 차지하고 있는 암은 고령화로 인해 더욱 증가하는 추세에 있다. 생명공학의 진보적인 발전 속에서도 가장 큰 난제 중의 하나로 남아 있는 암에 관한 연구는 근래에 암 유전자의 종양 억제 유전자의 발견에 따라 발암기전에 관한 분자 수준에서의 연구, 새로운 치료제의 개발 등 각 분야에 걸쳐 심도 있는 연구가 이루어져 왔으나 현재의 암 치료제 개발은 주로 암 세포 증식에 관련하는 생리·생화학적 기작을 조절하는 측면으로 많은 연구가 진행되고 있다. 암 치료는 주로 항암제 투여, 방사선 치료, 외과적 수술 등이 있으며 이들을 적절히 병행하는 방법도 사용되고 있으나 모든 암에 적용되는 것은 아니고, 몇몇 종류의 암 치료에만 한정되어 그 효과를 나타내고 있는 실정이다.

방사선 치료는 질병의 진단을 위해 사용하는 방사선보다는 높은 에너지의 방사선을 이용하여 인체에 발생하는 각종 암, 일부 양성종양 및 특정한 양성 질환을 치료하는 의학의 전문분야이다. 종양의 치료는 치료부위, 종양의 종류 및 진행정도 등에 따라 방사선치료, 수술 혹은 항암 약물 치료를 단독 혹은 병행하여 시행하는데, 완치 목적의 방사선치료가 단독으로 시행되는 가장 대표적인 예로 자궁경부암, 비인강암, 초기 성문암이 있다. 수술과 함께 방사선 치료를 시행하는 경우는 수술 전 방사선치료와 수술 후 방사선치료로 나눌 수 있으며 유방암, 직장암, 비소세포성 폐암 등의 치료시 흔히 사용된다. 수술 전 방사선 치료는 종양의 크기를 작게 만들어 수술을 용이하게 하거나 장기의 기능을 보존할 수 있는 수술이 가능하도록 하며 수술 후에 시행하는 방사선 치료는 수술부위 및 인접 림프절에서의 국소재발을 방지하려는 목적으로 시행하고 있다. 또한 전신전이 혹은 국소적으로 질병의 진행이 심한 경우 완치는 시킬 수 없으나 증상을 완화시키고 생명을 연장할 목적으로도 방사선 치료가 시행되고 있다.

미국에서는 암환자의 60% 이상이 방사선 치료를 받는데, 국내에서는 아직 환자의 20% 정도만 방사선 치료를 받고 있는 실정이다. 또한 방사선 치료는 약물요법보다 먼저 암의 표준 치료법으로 인정받았다.

그런데, 방사선 치료는 인체의 조혈기능을 저하시키고 면역계를 억제시켜 암 치료의 효율성을 낮춘다. 또한, 반복적인 방사선 조사로 인해 암세포가 저항성을 획득하게 되어 방사선 치료의 어려움을 가져온다.

톨-유사 수용체(Toll-like receptor; 이하 본 출원서에서 "TLR"이라 함)는 주로 면역세포에서 발현되며 포유동물의 본래의 면역 반응에 중요한 역할을 한다. 다양한 TLR은 상이한 포유동물 세포형에서 광범위하게 다양하고 또한 TLR과 결합하고 신호화 경로를 활성화시키는 분자구조에 있어서 다양하다.

TLR은 PAMP(병원체-관련된 분자 패턴)을 검출하고 MyD88-의존성 인터루킨 1 수용체(IL-1R)-TLR 신호화 경로를 통해서 면역 세포를 자극하며, 그 결과 전사 인자 NF-κB2의 활성화를 유도한다. 열 가지의 작용성 TLR 패밀리 구성원(TLR1 내지 TLR10)이 인간에게서 동정되었다[참조: Akira S. et al., Nature Immunol., 2,675-680 (2001)]. TLR2, TLR4, 및 TLR5는 펩티도글리칸, 리포폴리사카라이드 및 플라겔린의 인식에 중요하다[Hayashi, F. et al.,Nature, 410,1099-1103 (2001)]. TLR6는 TLR2와 연관되어 있으며 미코플라스마로부터의 지단백질을 인식한다[Ozinsky, A.,et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA., 97,13766-13771 (2000)]. TLR9는 바이러스성 DNA 함유 비메틸화된 CpG 모티프를 검출하고, TLR3은 이중-가닥 RNA에 대한 반응으로 면역 세포를 활성화시킨다[Hemmi, H. etal., Nature, 408,740-745 (2000)].

구아노신 유사체, 치환된 피리미딘 및 이미다조퀴놀린을 포함한 많은 화합물이 TLR7에 대한 리간드로 보고되어 있다[Hemmi et al., Nature Immunol., 3, 196-200 (2002) (imiquimod and R-848 (resiquimod)); Jurk et al., Nat. Immunol., 3, 499 (2002) (R-848); and Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 100, 6646-6651 (2003). 여기에서, 구아노신 유사체 록소리빈, 7-티아-8-옥소구아노신(이사토리빈), 및 7-데아자구아노신, 및 이미다조퀴놀린 화합물인 이미퀴모드 및 R-848(레시퀴모드)는 TLR7을 선택적으로 활성화시킨다].

퀴놀린 화합물의 일종인 이미퀴모드(imiquimod; 본 출원서 및 도면에서 "IMQ"와 혼용함)는 파필로마 바이러스에 의한 국소 생식기 감염증을 치료하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이미다조퀴놀린류중 두 번째, 즉, 레시퀴모드는 HCV의 치료에 대해서 시험한 결과 관용적인 경구 용량으로 항-HCV 효과를 나타내지 못하였다[Pockros et al.,Gastroenterology, 124(Suppl 1), A-766 (2003)].

이미 미국과 유럽의 다국적 제약회사들은 TLR 약품의 중요성을 인지하여 다양한 질환에 대한 치료 및 예방 백신의 형태로 개발하여 그 중 일부는 임상실험을 통해 시판 단계에까지 이르렀다(3M의 Aldara^TM 등). TLR을 타겟으로 하는 신약은 다양한 감염성 질환의 치료, 알러지나 천식과 같은 질환의 치료뿐 아니라 백신 등의 형태로 광범위하게 개발되고 있다.

미국의 Coley Pharmaceutical사는 TLR9을 활성화시키는 CpG 올리고뉴클레오타이드를 개발하여 수지상 세포의 활성화에 사용하고 있다. 상기 CpG 올리고뉴클레오타이드는 대식세포, 수지상세포, NK(natural killer) 세포들을 활성화시켜 IL-1, IL-12, IL-18, TNF-α와 같은 사이토카인들의 분비를 촉진시키고, 공동자극분자나 MHC class I과 MHC class II의 발현을 증가시켜 Th1 면역반응을 특이적으로 유도하여 기저세포암 등의 항암효과를 나타내며 현재 비소세포성 폐암을 대상으로 임상 3기 실험중인 것으로 알려졌다.

한편 미국의 제약기업 3M사가 개발한 국소연고제 알다라(Aldara^TM; 이미퀴모드의 제품명)가 가장 흔한 형태의 표재성 기저세포암(피부암의 일종) 치료에도 효과적인 것으로 나타났다. 미국 식품의약국(FDA)은 당초 곤지름(성기사마귀) 치료제 로 승인을 받은 이 약물을 최근 표재성 기저세포암 치료제로 추가 승인했다. FDA는 그러나 표재성 기저세포암의 가장 바람직한 치료법으로 알려진 외과적 절제가 적절치 않은 환자에게만 이 약물을 처방하도록 조건부 승인했다. 임상시험결과 알다라는 약 12주 동안 바를 경우 환자들의 75%에서 기저세포암 세포가 사라진 것으로 나타났다. 또 다른 임상시험에서는 이 연고를 2년간 바른 기저세포암 환자의 79%가 완치된 것으로 밝혀졌다. 그러나, 암을 대상으로 하는 TLR 신약의 개발은 직접적으로 암세포를 살상하는 자연살해세포나 CTL(Cytotoxic T Lymphocyte)을 이용한 단일요법이나 백신의 형태로 TLR9을 타겟으로 하는 CpG 연구에 치중되고 있다.

그러나, TLR7의 자극물질(agonist)인 이미퀴모드를 피부암이나 혈액암에 사용하는 기술 및 유방암, 항문암, 편평세포암, 자궁경부암에 다른 약품들 즉, H base cream^TM, BCG 백신, Valtrex^TM과 함께 사용하는 발명은 공개되어 있으나(US 2006/0062576 A1), 이미퀴모드를 대장암의 치료에 이용하여 현저한 치료효과를 나타내었다는 보고는 아직까지 없었다.

따라서, 본 발명은 이미퀴모드 또는 가디퀴모드와 같은 이미다조퀴놀린을 대장암 항암 치료제 또는 방사선 항암치료 보조제로 이용하려는 것이다.

또한, 본 발명은 20%에 불과한 암의 방사선 치료의 빈도를 구미 선진국의 수준으로 끌어올리고, 방사선 치료의 효율을 증대시키기며 방사선 치료의 부작용을 최소화시키기 위한 방법을 제공하려는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명자들은 TLR7의 자극물질인 이미다조퀴놀린을 대장암 세포에 투여하여 세포사멸 효과를 확인하고, 또한 대장암 세포의 방사선 치료에 이미다조퀴놀린을 병행투여함으로써 상기 물질이 방사선 치료의 효과를 증대시키는지 여부를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따르면, 이미다조퀴놀린은 다른 항암제 등의 병행 처리 없이 단독으로 처리하여 대장암 세포의 사멸을 유도하였으며, 대장암 세포 방사선 치료 효과를 증진시켰다. 따라서, 본 발명에 의하면 방사선 치료 선량을 감소시키고, 정상 세포에 대한 손상을 최소화하며, 방사선 내성 암세포에 대한 치료 효율을 증가시켜 방사선 치료 효과를 극대화할 수 있을 뿐만 아니라, 이미다조퀴놀린 단독으로도 대장암의 항암제로서 사용할 수 있다.

본 발명은 이미퀴모드(imiquimod) 또는 가디퀴모드(gardiquimod)와 같은 이미다조퀴놀린을 주요 활성성분으로 포함하는 대장암 항암제에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 항암제에 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 이미퀴모드(imiquimod) 또는 가디퀴모드(gardiquimod)와 같은 이미다조퀴놀린을 주요 활성성분으로 포함하는 방사선 항암치료 보조제에 관한 것이다.

또한, 상기 방사선 항암치료 보조제는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 "항암"이라는 용어는 암세포의 증식을 억제하거나 사멸하는 능력을 의미한다. 이미다조퀴놀린을 대장암 세포주에 처리할 때 대장암 세포주에서 세포 성장이 억제되고 세포사멸이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명에서 "방사선 치료 보조제”라 함은 방사선 치료 효과를 높이기 위하여 사용되는 약물로서, 통상 방사선 치료 이전에 일정 기간 동안 투여한 후 방사선 치료를 받으면 방사선 치료만 받는 경우에 비하여 암세포 사멸 효과가 높아지고 방사선 치료에 의해 파괴되는 줄기세포의 방사선 저항성을 높이는 약물을 의미한다.

본 발명의 항암제로 예방 또는 치료할 수 있는 암은 대장암이다. 또한, 본 발명의 방사선 치료 보조제로 예방 또는 치료할 수 있는 암은 대장암을 비롯한 고 형암과 혈액암이다. 이미다조퀴놀린 중 이미퀴모드를 방사선 항암치료 보조제로 시험한 결과 TLR7이 발현되는 고형암 즉, 자궁암세포주 Hela, 피부암세포주 A431 및 유방암세포주 MCF-7에서 대조군에 비해 실험군이 방사선에 민감해진다는 결과를 얻었다(데이터 미기재).

상기 항암제 및 방사선 치료 보조제를 본 출원서에서는 통칭 “조성물”이라는 용어를 사용하였다.

상기 항암제 및/또는 방사선 치료 보조제 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하고 인체 또는 동물용으로 제형화될 수 있다.

경구 투여용의 약제학적 조성물은 예컨대 캅셀제 또는 정제, 산제 또는 과립제, 용제, 시럽 또는 현탁제를 포함한다.

정제 또는 경질 젤라틴 캅셀제에 적합한 부형제로는 락토스, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 스테아르산 또는 이의 염이 있다. 연질 젤라틴 캅셀제에 사용하기 적합한 부형제로는 예를 들어, 식물성 오일, 왁스, 지방, 반-고형물 또는 액상 폴리올 등이 있다. 용제 및 시럽제를 제조하기 위해 사용될 수 있는 부형제로는 예를 들어, 물, 폴리올 및 당이 있다. 현탁제를 제조하기 위하여 오일(예: 식물성 오일)을 사용하여 수중유 또는 유중수 현탁제를 제공할 수 있다. 경피 투여용 약제학적 조성물은 장시간 동안 수용자의 표피와 친밀하게 접촉될 수 있도록 하기 위한 별개의 패치로서 제시될 수 있다.

비경구 투여용 약제학적 조성물에는 산화방지제, 완충제, 정균제(bacteriostat) 및 수용자의 혈액과 실질적으로 등장성인 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사 용제; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁제가 포함된다. 주사용 용제에 사용될 수 있는 부형제에는 예컨대 물, 알코올, 폴리올, 글리세린 및 식물성 오일이 포함된다. 이러한 조성물은 단위-용량(1회분) 또는 다중-용량(수 회분) 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰플 및 바이알에 저장할 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예컨대 주사용수를 부가하기만 하여 사용할 수 있도록 동결-건조 조건 하에 저장할 수 있다.

즉석 주사 용제 및 현탁제는 멸균성 산제, 과립제 및 정제로부터 제조할 수 있다.

본 발명 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 상기 나열한 투여방법으로만 제한되지는 않는다. 또한 제약 조성물은 활성 물질을 표적 세포로 이동시킬 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 여기에서 "약제학적으로 유효한 양"이라 함은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질병 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과 를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 약제학적으로 유효한 양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명 조성물을 포함하는 약제학적 제제는 목적하는 바에 따라 경구 방식, 비경구 방식 즉, 피하 투여, 근육 투여 또는 국소적용할 수 있으며, 용량은 일일 투여량 0.001㎍~10㎎/㎏의 양을 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본 발명은 TLR7의 자극물질인 이미퀴모드 또는 가디퀴모드와 같은 이미다조퀴놀린을 포함하는 대장암 항암제 조성물에 관한 것으로, 이미다조퀴놀린은 대장암 세포사멸 활성이 우수하여 대장암 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 TLR7의 자극물질인 이미다조퀴놀린을 대장암 세포에 처리하여 세포사멸 효과가 있음을 확인하는 단계와 이미다조퀴놀린을 처리한 대장암 세포에 방사선을 조사한 결과 이미다조퀴놀린 처리 없이 방사선을 조사한 대조군에 비하여 그 세포사멸 정도를 확인하는 단계로 이루어진다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 TLR7의 자극물질인 이미다조퀴놀린은 대장암세포 Caco-2 세포주에 대하여 세포사멸효과를 나타내었고, 방사선 치료 효과를 현저히 증진시키는 것으로 나타났다.

이하 본 발명을 다음 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 좀더 상세하게 설명하기 위한 것으로서 본 발명의 권리범위가 실시예의 기재에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험방법 1: 세포주 및 이미퀴모드 입수

본 발명에 사용한 Caco-2(colorectal adenocarcinoma) 세포는 ATCC(HTB-37)로부터 구입하여 사용하였으며, Caco-2 세포주의 배양배지는 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)에 10% FBS(Fetal Bovine Serum)를 넣고 37℃ 5% CO₂에서 배양하였다. 이미퀴모드(R837)는 InvioGen에서 구입하여 5㎍/㎖의 농도로 사용하였다.

실험방법 2: 면역조직화학( Immunohistochemistry )

Caco-2 세포 2x10⁵개를 12mm 트랜스웰 필터(transwell filter)에 넣고 전기전이저항(transelectrical resistance)이 형성될 수 있도록 5일 정도 배양한 후, 나이트로셀룰로스 필터(nitrocellulose filter)만 오려 형광염색방법으로 염색하였다. 먼저 100% 메탄올로 세포가 배양된 나이트로셀룰로스 필터를 고정한 후 5% BSA(Bovine Serum Albumin)가 들어간 0.2% TBST(Tris Buffered Saline Tween-20)에서 블로킹하고 Cell Signaling Technology에서 구입한 E-카데린(24E10, cat No. 3195)을 1:250으로 희석하여 1시간 배양하고 0.2% TBST로 세 번 세척하고 Alexa Flour-488 염소 항-토끼 IgG(goat anti-rabbit IgG;Invirogen, cat No A-31565) 2차 항체로 30분 배양한 후 0.2% TBST로 세 번 세척하였다. 그 후 공초점 레이저 주사 현미경(Laser scanning confocal microscope; Zeiss LSM4)으로 관찰하였다.

실험방법 3: 웨스턴 블랏팅 및 사용 항체

웨스턴 블랏팅의 수행을 위해서는 E-카데린(cadherin)과 α-튜블린(tubulin)(Cell Signaling Technology, cat No 2144)은 각각 10%(w/w), Iκ-B (Cell Signaling Technology, cat No 4814), Bcl-xl(Cell Signaling Technology, cat No 2762), 클로딘(claudin)-4(Zymed, cat No 32-9400)는 각각 15%(w/w) SDS-PAGE를 수행한 후 나이트로셀룰로스 용지에 전이하였다. 전이된 막은 5% 탈지분유가 포함된 0.1% TBST 용액에서 1시간 블로킹한 후 해당 항체와 2시간 배양하였다. 그 후 millipore사의 ECL(Electrogenerated Chemiluminescent) 용액(Chemilucent ECL Detection System cat No 2600)으로 반응하여 분석하였다.

실험방법 4: 집락형성 분석( clonogenic assay )

인체 대장암 세포주인 Caco-2 세포 200개를 60mm 디쉬에 넣고 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 2일 배양하여 세포가 충분히 정착한 후 이미퀴모드 5㎍/㎖를 처리하였다. 16시간이 지난 후 방사선을 4Gy 또는 8Gy를 조사하고 콜로니가 형성될 수 있도록 1주일 이상 배양하였다. 현미경으로 콜로니 형성을 확인하고 메탄올: 아세트산이 3:1의 비율로 혼합된 고정액을 처리하여 콜로니를 고정하였고, 트리판 블루(Trypan blue)로 염색하여 콜로니 개수를 세어 콜로니 형성 정도를 비교하였다.

실시예 1: 이미퀴모드의 암세포 살상 효능 탐색을 위한 Caco -2 세포주 선정

대장암 세포주인 Caco-2는 트랜스웰에 배양하면 세포의 극성이 형성되어 배양 후 3일 안에 세포간 결합단백질인 E-카데린(cadherin)이 기측 도메인(basolateral domain)에 주로 발현되어 전기전이저항(transelectrical resistance)을 완전히 형성하는 잘 분화된 아데노카시노마(adenocarcinoma)이다. 또한 표피성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor) 및 TNF(Tumor Necrosis Factor) α 수용체의 활성화에 반응하고 TLR7과 TLR9를 발현하고 있다. 따라서, 면역 활성 조절제로서 TLR7의 자극물질인 이미퀴모드 처리에 의한 세포 살상을 관찰할 수 있는 최적 세포 모델로 Caco-2 세포주를 선정하였다.

실시예 2: 이미퀴모드 또는 가디퀴모드 처리에 의한 대장암 세포주 살상효과

이미퀴모드의 직접적인 암세포 살상효과를 확인하기 위하여 Caco-2 세포주에 이미퀴모드를 5㎍/㎖로 처리하여 세포의 변화를 Iκ-B의 웨스턴 블랏팅과 집락형성 분석법(clonogenic assay)으로 평가하였다. 그 결과 Caco-2 세포주에서 이미퀴모드의 처리에 의해 Iκ-B의 발현 정도가 급격히 감소하였다. 이를 통하여 TLR7 자극물질인 이미퀴모드가 NF-κB 활성을 유도하여 TLR7의 정상적인 신호를 활성화시킨다는 것을 알 수 있다. 또한 집락형성 분석 방법으로 확인해 본 결과 Caco-2 의 세포사멸이 유도되었다. Caco-2 세포주의 사멸시 어떠한 분자적 기작이 관여하는지를 확인하기 위하여 세포사멸의 주 수행 인자인 bcl 패밀리 중 항 세포사멸 패밀리이며 Caco-2 세포주에 다량으로 발현하고 있는 bcl-xl의 발현 정도를 웨스턴 블랏팅 으로 관찰하였다. 그 결과 bcl-xl의 발현이 현저히 감소하는 것이 관찰되었다(도 2).

또한, 이미퀴모드 외에 이와 화학구조가 유사한 다른 종류의 이미다조퀴놀린(Imidazoquinoline) 화합물인 가디퀴모드(Gardiquimod; 본 출원서 및 도면에서 "GDQ"와 혼용함)에 대해서도 상기와 동일하게 실험하였다. 가디퀴모드는 Invivogen(cat No tlrl -gdq)에서 구입하여 5㎍/㎖의 농도로 사용하였다.

Caco-2 세포주에서 가디퀴모드를 각각 0, 5㎍/㎖ 농도로 처리하고 16시간 후에 단백질을 분리하여 Ik-B로 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과 농도에 따른 Ik-B의 분해 현상을 관찰하였으며(도 6), 이를 통하여 다른 종류의 TLR7 자극물질인 이미다조퀴놀린 화합물에 의해서도 NF-k B를 통한 활성이 수반된다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3: 이미퀴모드가 세포간 결합 단백질에 미치는 영향

Caco-2 세포주는 잘 분화된 아데노카시노마(adenocarcinoma)로 주로 기측 도메인에 E-카데린이 발현하여 세포 간 결합에 참여하고 있다. 이러한 세포 간 결합은 세포 외부로부터 미생물의 침입이나 각종 물질에 의한 염증반응을 억제하는 1차적 방어선의 기능을 담당하고 있으며 암세포주의 암 전이를 억제하는 역할을 수행한다. 따라서 이미퀴모드가 면역세포에서 내재적 면역을 일으키는 기작과 유사하게 암세포에서도 내재적 면역을 이끌 수 있는 1차적 방어선의 붕괴로 세포 간 결합단백질에 이미퀴모드가 미치는 영향을 관찰하였다. 그 결과 주 세포 간 결합단백질인 E-카데린의 현저한 감소가 관찰되었다. 그러나 Caco-2 세포주에서 다량으로 발현하 고 있는 밀착연접단백질인 클로딘(claudin)-4의 발현은 변화는 동반되지 않아 이미퀴모드로 유도되는 NF-kB의 활성을 통하여 특이적으로 E-카데린의 발현이 조절됨을 알 수 있었다(도 3).

이상의 결과를 종합하여 보면 Caco-2 세포주는 TLR7의 자극물질인 이미퀴모드에 의하여 직접적인 세포살상이 유도되는 세포모델임이 확인되었고, 주 세포사멸 기작으로는 Bcl-xl의 분해와 세포 간 결합단백질로 1차적 방어선에 중요한 E-카데린의 분해를 촉진시켜 세포에 사멸에 민감한 환경을 조성하는 것이 본 발명자들에 의하여 밝혀졌다. 따라서 대장암에 이미퀴모드를 방사선 치료 증진제로서 활용할 수 있는지를 검토하고자 이미퀴모드를 전처리한 후 방사선을 조사하여 세포 사멸 정도를 비교하여 보았다.

실시예 4: 이미퀴모드의 방사선 치료 증진 효과

방사선을 4 Gy 와 8 Gy로 조사하여 방사선 조사에 의한 세포사멸의 효과가 이미퀴모드 처리에 의하여 증대되는지를 방사선 조사 후 집락형성 분석법을 수행하여 조사하였다. 그 결과 이미퀴모드를 처리한 세포군에서 방사선에 좀더 민감하게 작용하여 방사선 치료의 효과가 극대화되는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 이미퀴모드의 TLR7 활성에 의한 Bcl-xl과 E-카데린의 발현 감소도 방사선 조사에 의하여 수반되어 극명한 세포사멸의 효과를 촉진하는 것으로 밝혀졌다(도 4).

실시예 5: 이미퀴모드에 의한 간엽줄기의 방사선 저항성 증가

방사선 조사 시 골수 및 위장관계의 줄기세포가 파괴되어 면역력이 저하되는 것이 방사선 치료의 가장 큰 난점이기 때문에 암세포 및 면역세포 특이적 방사선 치료 증진제 및 면역 증진제를 발굴하는데 있어 가장 고려해야 하는 것은 면역세포의 면역력을 증강시켜 방사선에 저항성이 생기며 동시에 암세포에는 세포사멸을 이끌 수 있는 면역증진제를 발굴하는 것이다. 상기 실시예의 결과에서 이미퀴모드 처리에 의해 암세포 세포살상효과 및 방사선 치료증진 효과가 관찰되었기 때문에 이미퀴모드에 의해 정상 면역세포의 방사선 저항성이 동시에 유도되는지를 관찰하고자 하였다.

이를 위하여 골수 내의 면역세포의 항상성을 담당하고 있으며 방사선 조사시 가장 파괴가 쉽게 되는 줄기세포를 그 후보세포로 선정하였고 비교적 세포배양이 용이하며 TLR1-9를 발현한다고 알려진 정상 사람 간엽 줄기세포를 배양하여 MTT assay법으로 IMQ로 유도되는 방사선 저항성을 조사하였다.

본 발명에 사용한 정상 사람 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)는 Biowhittaker(cat No PT-2501)로부터 구입하여 사용하였으며 간엽줄기세포의 배지는 MSCGM(mesenchymal stem cell growth medium, Biowhittaker, cat No PT-3001)을 사용하였다. 간엽줄기세포는 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다.

MTT 어세이를 위하여 정상 사람 간엽 줄기세포 12,000개를 35mm 디쉬에 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1일 배양하여 세포가 충분히 정착한 후 이미퀴모드 5㎍/㎖를 처리하였다. 16시간이 지난 후 방사선 2Gy를 조사하고 6일을 배양하였다. 배양 액에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide; Sigma, cat No M5655)를 PBS(Phosphate buffered saline)에 2㎎/㎖로 용해시킨 용액 50㎕를 넣고 2시간 반응시킨 다음 100㎕ DMSO(Dimethylsulfoxide, Sigma)를 넣어 세포를 파괴시켜 570nm에서 흡광도를 측정하였다.

이미퀴모드를 16시간 동안 전처리하고 방사선을 조사한 6일 후 세포사멸을 관찰한 결과 TLR7의 활성을 통하여 간엽줄기세포 내의 면역 활성을 유도시킨 후 방사선을 조사한 실험군에서 세포사멸이 지연되는 것을 확인하였다(도 5). 따라서 이미퀴모드는 정상 줄기세포에서는 TLR7의 활성으로 방사선 저항성을 증가시키며, 암세포에서는 암세포의 방사선 민감성을 증폭시켜 적은 선량에도 효율적인 방사선 치료를 수행할 수 있는 방사선 치료 보조제로서 적합하다고 할 수 있다.

따라서 본 연구 수행 결과 TLR7 자극물질인 이미다조퀴놀린은 대장암 세포주에 직접 작용하여 세포 사멸을 유도하며, 방사선 치료의 효율을 증대시키는 것으로 관찰되어 방사선 항암치료 보조제로 활용할 수 있음을 확인하였다.

도 1은 트랜스웰 필터 상의 Caco-2 세포가 E-카데린을 기저발현한 것을 나타내는 사진이다.

도 2 A는 Caco-2 세포에 이미퀴모드 5㎍/㎖를 처리한 경우 Ik-B와 Bcl-xl의 분해를 나타내며, B는 이미퀴모드에 의해 유도된 Caco-2 세포의 항암 활성을 나타내는 도면.

도 3은 이미퀴모드 처리에 의한 E-카데린의 저하를 나타낸다. 클로딘-4는 저하되지 않았다.

도 4 A는 이미퀴모드 처리가 Caco-2 세포의 방사선 치료효과를 증진시킴을 나타내는 그래프이다. B는 이미퀴모드 처리한 Caco-2 세포에 방사선 처리한 경우 Bcl-xl과 E-카데린의 저하를 나타낸다.

도 5는 간엽줄기세포에 이미퀴모드를 전처리한 경우 방사선 조사에 대해 방사선 저항성이 강화됨을 나타내는 그래프이다.

도 6은 가디퀴모드 처리에 의한 Ik-B와 분해를 나타내는 사진이다.

Claims (4)

1. 이미퀴모드 및 가디퀴모드로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상의 이미다조퀴놀린을 주요 활성성분으로 포함하는 대장암 항암제.
2. 제1항에 있어서,

   약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이미다조퀴놀린을 주요 활성성분으로 포함하는 대장암 항암제.
3. 이미퀴모드 및 가디퀴모드로 이루어진 그룹 중 선택된 1종 이상의 이미다조퀴놀린을 주요 활성성분으로 포함하는 방사선 항암치료 보조제.
4. 제3항에 있어서,

   약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 이미다조퀴놀린을 주요 활성성분으로 포함하는 방사선 항암치료 보조제.

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