KR20120050729A

KR20120050729A - ｃｈｋ１ 단백질 및 ＨＪＵＲＰ 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드, 이를 포함하는 항암제 및 항암제를 스크리닝하는 방법

Info

Publication number: KR20120050729A
Application number: KR1020100112131A
Authority: KR
Inventors: 김광석; 배상우; 최규진
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2010-11-11
Filing date: 2010-11-11
Publication date: 2012-05-21
Also published as: KR101254243B1

Abstract

본 발명은 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질의 상호작용을 억제하는 펩티드, 이를 포함하는 항암제 및 항암제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 상기 펩티드는 암세포에서 높아진 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질간의 결합력을 억제하여 정상세포와 유사한 상호작용을 가지도록 함으로써, 유전자 발현 조절이나 신호전달 억제와 같은 광범위한 세포 반응 및 영향을 지양하여 부작용이 적은 항암제를 제공할 수 있다. 또한, Chk1 단백질 및 HJURP 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 저해할 수 있는 부작용이 적으며, 특이성이 높은 항암 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다.

Description

ｃｈｋ１ 단백질 및 ＨＪＵＲＰ 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드, 이를 포함하는 항암제 및 항암제를 스크리닝하는 방법{PEPTIDE FOR INHIBITION OF INTERACTION BETWEEN CHK1 AND HJURP PROTEIN, PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING CANCER INCLUDING THE SAME AND A METHOD OF SCREENING PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING CANCER}

본 발명은 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드, 이를 포함하는 항암제 및 항암제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

대사 중에 발생하는 활성산소, 외부환경으로부터 가해지는 이온화방사선 (ionizing radiation; IR)같은 다양한 DNA 손상인자에 의해 세포내에서는 다양한 단백질의 신호 전달에 의해 DNA 손상을 복구하고 유전정보의 안정성(genomic stability)을 유지하는 고도의 정밀한 조절기구를 가지고 있다. DNA 손상이 발생하게 되면 DNA 손상 조절점(DNA damage checkpoint)이 활성화되어 세포주기 정지, DNA 복구기구 작동, 크로마틴 리모델링(chromatin remodeling) 전사기작 조절, 세포 사멸 및 세포노화와 같은 다양한 세포반응을 유도하게 된다. DNA 손상 신호전달계는 DNA 손상을 인지하는 센서 분자에 의해 활성화되어 DNA 손상신호를 순차적으로 전달하는 'transducer' 시스템에 의해 증폭, 전달되어 키나제와 같은 'effect'에 의해 최종 표적단백질들의 활성을 조절함으로써 세포반응을 유도하게 된다. 이러한 DNA 손상복구계는 정상적인 세포의 증식과 암 발생 억제에 필수적이다.

이러한 세포 주기 체트 포인트 시그널(cell cycle check point signaling)에서 DNA 손상을 인지하는 역할을 ATM과 ATR이라는 물질이 관여하게 된다. ATM은 Chk2와 53BPI를 활성화시키고 ATR은 Chk1, BRCA1, NBS1를 활성화시키는데 후자의 경우 상동재조합 매개 복구 복제(Homologous recombination-mediated repair replication)에 관여한다. 그리고 Chk1이라는 키나제는 DNA 손상의 인식과 수복에 핵심적인 역할을 담당한다. 따라서 손상 신호에서 Chk1이 인산화되면 세포주기가 정지되어 수복과정을 거치는데, 빨리 분열하고자 하는 스트레스를 세포가 받게 되면 Chk1의 발현이 억제되어야 한다. Chk1의 발현이 억제된 상황에서 DNA 손상이 오면, DNA 손상의 수복을 위한 세포주기 지연 또는 정지가 이루어지지 않은 채 세포분열과정이 진행되어 비정상적인 세포사멸(mitotic catastrophe)이 일어난다.

암세포에서는 Chk1의 발현이 증가되어 있어 암세포의 유전정보의 안정성을 높이는 동시에, 복제 및 DNA 손상 저항성의 성격을 띤다. 따라서, Chk1은 유전정보의 유지 및 세포주기 조절이라는 매우 중요한 기능을 가지고 있음에도 불구하고, 폐암을 비롯한 유방암, 난소암, 대장암, 흑색종, 신경교종과 같은 암의 치료의 표적 단백질로 인식되어 다양한 저해제의 개발이 되어 왔다.

Chk1의 저해제 종류는 핵산 형태의 RNA interference(siRNA)와 인산화 활성을 억제하는 화합물이 잘 알려져 있다.

siRNA는 특정 유전자의 발현 대사 과정을 조절하기 위하여 임의의 중요한 mRNA를 특이적으로 파괴를 유도하여 세포의 생육을 결정하는 매우 강력한 치료 방법이다. 그러나 이 방법은 계속적인 mRNA 파괴가 필요한 질환의 경우 이 방식이 유용하며, 표적으로 하는 유전자가 정상 세포의 생육에 영향이 적은 것들에 적용이 가능하다. Chk1은 ATR과 마찬가지로 발생단계에서 유전자가 손실되면 죽게 되는, 생명체에서는 없어서는 안 되는 필수 단백질로 알려져 있다. 즉, Chk1 siRNA의 사용은 결국 암세포 표적 뿐 아니라 정상세포에도 치명적인 결함을 가져다주며, 결국 유전자 손상 반응에 의해서 비정상적인 사멸을 유도하게 된다. 따라서, Chk1 siRNA의 개발은 이미 유효성이 없어졌으며, 결국에는 Chk1 저해제는 인산화 활성 저해 물질 개발에 집중되어 왔다. 그러나, 대부분의 화학 저해제가 그렇듯 Chk1 특이적인 활성 저해제를 찾기는 쉽지 않다. 개발된 Chk1 저해제 중 가장 잘 알려진 UCN-01은 방사선이나 캄포떼신(camptothecin)과 같은 항암제와 혼합 치료하여 한정적인 암치료 결과를 얻었지만, 낮은 농도의 UCN-01의 사용은 Chk1에 대한 특이적 선택성이 없어 다양한 키나제의 저해 효과가 나타나고 높은 농도의 UCN-01은 기대치 않은 부작용이 나타나기 때문에 임상적용에 많은 제약을 받고 있다.

따라서, Chk1의 발현이 높아진 암세포에서 인체에 부작용을 최소화할 수 있는 항암제 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드를 포함하는 항암제를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질의 상호작용을 조절하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.

Chk1 단백질 또는 HJURP 단백질을 표적으로 하는 직접 억제제, 예를 들어 siRNA는 정상세포에도 치명적 결함을 줄 수 있는 바, 본 발명자들은 Chk1 단백질과 HJURP 단백질과 상호 작용을 함을 최초로 발견하고, 암세포에서는 세포사멸과 관련된 단백질의 상호작용 정도가 다르다는 점에 착안하여, Chk1 단백질과 결합하여 Chk1 단백질과 HJURP 단백질의 상호작용을 조절할 수 있는 신규한 펩티드를 발견하였고, 상기 신규한 펩티드가 Chk1 단백질과 HJURP 단백질 간의 상호작용을 조절함으로써, 세포사멸을 조절하여 항암제로서 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1(PNKTLSV)의 적어도 7개의 연속된 아미노산을 포함하는 8 내지 12 mer 크기의 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 펩티드는 서열번호 2(APNKTLSVNKMV)의 아미노산을 포함할 수 있다.

상기 서열번호 1의 적어도 7개의 연속된 아미노산은 서열번호 3의 인간 HJURP(NCBI reference sequence: NP_060880.3)의 558번째 내지 564번째 잔기(PSKTLSV; 서열번호 4)와 약 85% 상동성을 가질 수 있다. 상기 펩티드는 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 수준은 크게 감소시키지 않으면서, HJURP와 Chk1 사이의 결합 친화력(binding affinity)을 감소시킬 수 있다. 이에 따라, HJURP와 Chk1이 상호작용하여 Chk1의 분해가 억제되는 것을 방지되나, HJURP와 Chk1의 상호작용이 억제될 경우 Chk1의 분해가 용이해져 HJURP 및/또는 Chk1이 과다발현된 세포에서 세포사멸을 유도할 수 있다. 또한, 방사선이나, 캄포테신 및 히드록시우레아와 같은 항암제를 투여시 Chk1의 분해는 물론 세포사멸이 더 잘 일어나도록 할 수 있다.

상기 펩티드는 세포 내화(cell internalization)의 감수성(susceptibility)을 위한 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드의 N-말단에 서열번호 5의 아미노산 서열(RRRRRRRRR; R9)을 더 포함할 수 있다. 상기 펩티드에서 N-말단에 위치하는 세포 내화를 위한 아미노산과 C-말단에 위치하는 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드의 아미노산(예를 들어, 염기서열 2의 아미노산)은 링커 단백질을 통해 융합될 수도 있다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1(PNKTLSV)의 적어도 7개의 연속된 아미노산을 포함하는 8 내지 12 mer 크기의 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드를 유효성분으로 포함하는 항암제를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 항암제는 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교할 때 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질이 과발현되는 암을 표적으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 암은 폐암, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 흑색종 및 신경교종으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 암은 폐암 또는 자궁경부암일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 항암제는 캄포테신(camptothecin; CPT) 또는 히드록시우레아(hydroxyurea; HU)를 더 포함할 수 있다.

상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교할 때 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질이 과발현되는 암세포에 후보 물질을 접촉시키는 단계; 및 상기 후보 물질에 의해 상기 Chk1 단백질의 발현이 억제되는지 여부를 종양 세포가 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 성기 후보물질을 접촉시키는 단계 및 종양 세포가 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교하여 확인하는 단계 사이에 상기 암세포에 방사선을 조사하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 후보 물질은 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드일 수 있다. 일 예로 상기 펩티드는 서열번호 1(PNKTLSV)의 적어도 7개의 연속된 아미노산을 포함하는 8 내지 12 mer 크기의 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 서열번호 2(APNKTLSVNKMV)의 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 펩티드는 세포 내화(cell internalization)의 감수성(susceptibility)을 위한 아미노산 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드의 N-말단에 서열번호 5의 아미노산 서열(RRRRRRRRR; R9)을 더 포함할 수 있다. 상기 펩티드에서 N-말단에 위치하는 세포 내화를 위한 아미노산과 C-말단에 위치하는 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드의 아미노산(예를 들어, 염기서열 2의 아미노산)은 링커 단백질을 통해 융합될 수도 있다.

상기 항암제를 스크리닝하는 방법은 HJURP와 Chk1 사이의 결합 친화력을 감소시키는 지 여부를 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 후보 물질에 의해 상기 Chk1 단백질의 발현이 억제되는지 여부를 종양 세포가 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교하여 확인하는 단계를 통해, 상기 후보 물질이 Chk1의 안정성이 조절되는 것을 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 펩티드는 암세포에서 높아진 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질간의 결합력을 억제하여 정상세포와 유사한 상호작용을 가지도록 함으로써, 유전자 발현 조절이나 신호전달 억제와 같은 광범위한 세포 반응 및 영향을 지양하여 부작용이 적은 항암제를 제공할 수 있다. 또한, Chk1 단백질 및 HJURP 단백질의 단백질-단백질 상호작용을 저해할 수 있는 부작용이 적으며, 특이성이 높은 항암 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공할 수 있다. 이를 방사선이나 캄포테신 또는 히드록시우레아와 같은 항암제와 병용투여할 경우 암세포 특이적 민감도를 증가시킬 수 있다.

도 1은 재조합(recombinant) Chk1 단백질의 생성 및 분리, 및 상기 단백질을 이용하는 파지 디스플레이 스크리닝을 설명하기 위한 도면이다(N; 비유도성 세포 라이세이트 (non-inducing lysate), I; Chk1-유도성 세포 라이세이트(Chk1-inducing lysate).
도 2는 Chk1-결합 펩티드인 pCN8의 화학적 합성 및 정제를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 시험관 내에서 pCN8의 Chk1-결합력을 설명하기 위한 도면이다.
도 4a 내지 4c는 pCN8의 세포 내화 및 세포독성을 설명하기 위한 도면이다.
도 4a는 Hela 세포주에 2mM의 R9 또는 pCN8을 1시간 동안 처리한 후, FITC 결합된 항-스트렙타비딘으로 염색 후의 면역형광현미경(immunofluorescence microscopy)으로 분석한 결과이다(단, NC는 R9 또는 pCN8을 처리하지 않은 대조군을 나타냄).
도 4b는 H460 세포주에 R9 또는 pCN8을 지시된 농도(indicated dose)로 처리하고 48시간 후 표준 MTT 분석(standard MTT assay)으로 정량화시킨 결과를 설명하기 위한 도면으로, R9 또는 pCN8 농도별 세포 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 4c는 Hela 세포주에 R9 또는 pCN8을 지시된 농도(indicated dose)로 처리하고 48시간 후 표준 MTT 분석(standard MTT assay)으로 정량화시킨 결과를 설명하기 위한 도면으로, R9 또는 pCN8 농도별 세포 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 5a는 pCN8 펩타이드를 방사선이나 캄포테신 또는 히드록시우레아와 같은 항암제와 병용투여할 시 세포 생존율을 측정한 도면이다. 도 5a는 Hela 세포주를 6-well 디쉬에 2x10⁴ 세포수를 분주한 다음, R9 또는 pCN8을 1시간 전처리 한 후, 500nM의 캄포테신, 5mM의 히드록시우레아, 5Gy의 방사선을 처리하였고, 24시간 동안 배양한 후, 세포수 측정을 하여 대조군 기준 세포 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 5b 내지 5d는 방사선 반응에 대한 pCN8의 영향을 설명하기 위한 도면이다.
도 5b는 Hela 세포주 및 H460 세포주에 방사선 조사(5Gy) 전에, 5μM R9 또는 pCN8을 1시간 동안 처리하고, 24시간 동안 배양시킨 후, MTT 분석에 의해 세포 생존율을 측정한 결과를 설명하기 위한 도면이며(단, NC는 R9 또는 pCN8을 처리하지 않은 대조군을 나타냄), Hela 세포주 및 H460 세포주에서 R9 또는 pCN8 처리 여부에 따른 세포 생존율을 나타내는 그래프이다.
도 5c는 Hela 세포주 및 H460 세포주에 방사선 조사(5Gy) 전에, 5μM R9 또는 pCN8을 1시간 동안 처리하고, 24시간 동안 배양시킨 후, 특이적인 항체(specific antibody)를 이용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 Chk1 및 인산화-Chk1(phospho-Chk1) 수준을 측정한 결과이다(단, NC는 R9 또는 pCN8을 처리하지 않은 대조군을 나타냄).
도 5d는 Hela 세포주 및 H460 세포주에 방사선 조사(5Gy) 전에, 5μM R9 또는 pCN8을 1시간 동안 처리하고, 24시간 동안 배양시킨 후, Chk1 항체 및 FITC 결합된 항-스트렙타비딘으로 염색 후에 면역형광현미경으로 Chk1 및 펩티드들의 국소화를 분석한 결과를 나타낸다(단, NC는 R9 또는 pCN8을 처리하지 않은 대조군을 나타냄).
도 6a는 Chk1의 결합 파트너로서의 HJURP를 설명하기 위한 도면이다. 도 6a는 Hela 세포주의 추출물 동량에 IgG 또는 HJURP 항체를 각각 결합시킨 후 면역침강법을 이용하여 HJURP와 결합한 단백질을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 6b는 pCN8이 HJURP와 Chk1 사이의 결합 친화력을 감소시킬 수 있음을 설명하기 위한 도면이다. 도 6b는 Hela 세포주에 5μM R9 또는 pCN8을 1시간 동안 각각 처리하고 세포분쇄 완충용액으로 세포를 분쇄한 다음, 추출물 동량에 Chk1 항체를 결합시킨 후 면역침강법을 이용하여 HJURP와 Chk1의 결합 정도를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과이다. 또한, R9 또는 pCN8에 의한 Chk1과 HJURP의 발현 변화를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 6c는 pCN8에 의한 HJURP와 Chk1 사이의 결합력이 감소한 세포생물학적 영향을 형광현미경으로 분석한 결과에 대한 도면이다. 도 6c는 Hela 세포주에 5μM R9 또는 pCN8을 6시간 동안 각각 처리하고 3.7% 파라-포름알데하이드 용액으로 고정한 다음, HJURP는 HJURP 항체 결합 후 Alexa Fluor 488 항-래빗 2차 항체로, Chk1은 Chk1 항체 결합 후 Alexa Fluor 594 항-마우스 2차 항체로 각각 형광을 나타내고 핵은 DAPI로 형광을 입혀 형광현미경으로 분석한 결과이다.
도 7a는 HJURP 유전자 발현을 siRNA로 억제시켰을 때의 Chk1 단백질 발현 변화를 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과이다.
도 7b 및 도 7c는 HJURP 유전자의 발현으로 인한 방사선 민감성을 설명하기 위한 도면이다.
도 7b는 H460 세포주에 과발현을 위해서는 HJURP 유전자를 도입하고, 발현억제를 위해서는 HJURP siRNA 도입하였으며, 이들의 대조군으로써 유전자가 삽입되지 않은 벡터(empty vector; vec)를 도입하였다. 각각이 도입된 세포를 6-웰 디쉬의 각 웰에 2×10⁴ 세포를 플레이팅하고, 2, 4 또는 6일 째 세포수 측정을 수행한 결과이며, 시간(일)별 세포수를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 H460 세포주에 과발현을 위해서는 HJURP 유전자를 도입하고, 발현억제를 위해서는 HJURP siRNA 도입하였으며, 이들의 대조군으로써 유전자가 삽입되지 않은 벡터(empty vector; v)를 도입하였다. 각각이 도입된 세포에 특정 도스(0, 1, 2 및 4Gy)의 방사선으로 각각 노출시킨 후, 콜로니 형성 분석법을 이용하여 분석한 결과로써 생존분획을 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하지만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 방법

(1) Chk1 단백질의 발현 및 분리

서열번호 6의 정방향 프라이머(5′-CGCGGATCCGCAGTGCCCTTTGTGGAAGACT-3′) 및 서열번호 7의 역방향 프라이머(5′-CGCCAAGCTTACTTGAGGGGTTTGTTGTACCATC-3′)를 이용하는 중합연쇄반응(polymerase chain reation; PCR)을 Chk1의 N-말단 도메인을 코딩하는 DNA 단편(2-270 잔기)을 증폭하는데 이용하였다. 상기 증폭 산물은 코딩 영역의 시작점에 헥사히스티딜 태그(hexahistidyl tag; His-tag, 이중 밑줄(double underlined)을 병합하였다. 상기 밑줄 친 뉴클레오타이드는 각각 BamHI 및 HindIII 부위를 표시한다. 증폭된 단편은 적절한 제한 효소로 잘랐고, 단백질 발현 가능 벡터(pQE30, Qiagen)에 제한효소 부위를 이용하여 삽입시켜 pQE30-Chk1N-His 플라스미드를 제작하였다. 유사한 방법으로, 서열번호 8의 정방향 프라이머(5′-CGCGGTACCAAAGGGGCAAAAAGGCCCCGAG-3′) 및 서열번호 9의 역방향 프라이머(5′-CGCGGATCCGCAGTGCCCTTTGTGGAAGACT-3′)를 이용하는 중합연쇄반응(PCR)을 이용하여 Chk1의 C-말단 도메인의 발현 구조물인 DNA 단편(271-476 잔기)을 증폭하여, pQE30-His 벡터 시스템에 도입하였다. 세균(bacteria)에 도입시키고 1mM의 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 6시간 동안 처리하여 His-Chk1 융합 단백질을 발현시켰다. 상기 발현 단백질을 포함하는 배지에 Ni-친화성(Affinity) 크로마토그래피(Qiagen)를 수행하여, Chk1의 두 도메인, 즉, 키나아제(kinase) 도메인 및 조절(regulatory) 도메인을 정제하였고, 300 mM NaCl 및 20 mM 인산나트륨(sodium phosphate), pH 8.0의 완충용액을 칼럼 부피의 약 3배의 양으로 세척하였다. 상기 단백질을 300mM 이미다졸(imidazole)을 포함하는 상기 동일한 완충용액으로 녹여서 분리하였다. 정제한 Chk1 단백질을 농축시켰고, 상기 단백질의 농도는 BCA 단백질 분석 키트(Pierce Chemical)를 이용하여 측정하였다.

(2) 파지 디스플레이 선택(Phage display selection)

PhD-12 파지 디스플레이 라이브러리 키트(New England Biolabs, Beverly, MD)를 이용하였다. 무작위의 12-mer 펩티드를 발현시키고, 4개의 아이노산 링커(linker)로 분리된 M13 박테리오파지의 pIII의 코트 단백질의 N-말단에 결합시켰다.

0.1M NaHCO₃(pH 8.6) 용액으로 Chk1 재조합 단백질을 100㎍/㎖ 농도로 제조한 용액을 12-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였고, 상기 표면이 완전히 젓을 때까지 반복하여 휘젓고, 배양기(humidified container)에서 부드럽게 흔들어주면서(gentle agitation) 4℃에서 하룻밤 배양시켰다. 1㎖ 5% 탈지우유로 25℃에서 1시간 동안 블로킹 시킨 후, 2×10¹¹ pfu 파지를 상기 재조합 Chk1-코팅된 플레이트에 첨가시켰다. 상기 혼합물을 부드럽게 흔들어 주면서 25℃에서 2시간 동안 배양시켰다. 다음으로, TBST 완충용액으로 대략 6번 정도 세척하여 결합되지 않은 파지를 제거하였다. 결합된 파지 입자들을 0.2M 글리신-HCl(pH 2.2)으로 녹여서 분리하였고, 1M 트리스-HCl(pH 9.1)로 중화시켰고, 역가 분석(titer assay)에 이용하였고, 증폭을 위해 E. coli ER2738에 감염(infection)시켰다. 상기 파지 역가(phage titer)는 IPTG 및 X-gal을 포함하는 아가 플레이트(agar plate) 상에 푸른색 플라크 형성 분석(blue plaque-forming assay)으로 측정하였다. 선택적으로 파지 클론을 증폭시키기 위해 상기 파지를 20㎖ E. coli ER2738 배양액에 혼합시켰고, 37℃에서 활발하게 흔들어주면서(vigorous shaking) 4.5 시간동안 배양시켰다. 그리고 나서, 상기 파지 입자들을 획득하였고, 0.02% 아지드화 나트륨(sodium azide)을 포함하는 50㎕ TBS(50mM 트리스-HCl pH 7.5, 150mM NaCl)로 다시 부유시켰고, 제조자의 지시에 따라 역가(titer)를 측정하였다. 약 2 및 3회 파지를 선별과정을 위해, 재조합 단백질-코팅된 플레이트에서 상기 첫 번째로 선별된 입자들로부터 2×10¹⁰ 및 2×10⁹ 파지 수득하는 과정을 수행하였고, 특이적인 Chk1 결합 펩티드를 얻기 위해 상기 방법을 반복하였다. 3번의 선별과정 후에, DNA 시퀀싱을 할 50 단일 플라크(50 종)를 최종적으로 선별되었다(도 1 참조).

(3) 면역침강법(Immunoprecipitation)

pcDNA-HJURP 및 pFlag-Chk1이 동시에 트랜스펙트된(co-transfected) 암세포주인 Hela 세포주를 프로테아제 저해제를 포함하는 IP 완충용액(1% 트리톤(Triton) X-100, 50mM 트리스-HCl, pH 7.4, 300mM NaCl, 5mM EDTA)에서 용해시켰다. 높은 속도의 원심분리 단계(1400rpm, 15분)에서 세포 라이세이트(Lysate)로부터 세포 잔유물(cell debris)을 제거하였다. 동일 양의 세포 추출물(cell extract)에 5㎍의 Chk1(항-Chk1 항체) 또는 HJURP(항-HJURP 항체)에 대한 마우스 단일 클론 항체 또는 토끼 단일 클론 항체를 첨가함으로써 면역 침강시켰고, 0.1% BSA와 함께 4℃에서 하룻밤 배양시켰다. 항체침전용 비드인 단백질 A-세파로스(Sepharose) 비드(Amersham Biosciences, NJ)를 첨가하였고, 혼합하면서 4℃에서 2시간동안 배양하였다. 면역복합체(Immune complex)를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)으로 분석하였다. 단백질을 니트로셀룰로스막에 이동(transfer)시켰고, Chk1 및 HJURP에 대한 다중 클로날 항체로 웨스턴 블롯팅 시켰다. 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)에 결합된 2차 항체 및 3,3′,5,5′-테트라메틸벤지딘(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidene; TMB) (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)를 웨스턴 블롯을 시각화하는데 이용하였다.

(4) 형광 현미경(Fluorescence microscopy)

12-웰 플레이트의 살균한 커버슬립 상에 Hela 세포주를 배양시켰다. 상기 세포들을 펩티드와 함께 37℃에서 2시간 동안 5% 이산화탄소(CO₂) 습식 분위기(humidified air) 하에서 배양하였고, PBS로 3번 세척하였다. DAPI 염색 전에 상기 세포들을 이후 3.7% 파라-포름알데하이드 용액(para-formaldehyde)으로 고정시켰고, 항-Chk1 항체(Snata cruz) 및 Alexa Fluor 594 염소 항-마우스 2차 항체(Invitrogen)로 염색하였고, PBS로 세척하였고, FITC 결합된 항-스트렙타비딘(treptavidin) 항체를 재염색 하였다. 상기 세포들은 20 배율의 Leica DMIRB 현미경(Leica Microsystems)으로 시각화되었고, 형광 이미지들을 병합시켰다.

(5) 방사선 노출(Radiation exposure) 및 콜로니 형성 분석법(Clonogenic assay)

Hela 세포주 및 H460 폐암 세포주를 60㎜ 디쉬에 플레이팅 시켰고, 상기 Hela 세포주 및 H460 폐암 세포주에 과발현을 위한 HJURP 구조물 및 대조군으로서 유전자가 삽입되지 않은 빈 벡터(empty vector)를 도입시켰고, 또한 발현억제(knockdown)를 위한 HJURP siRNA 또는 대조군으로서 siRNA control을 도입시켰다. 36시간동안 배양시킨 후, 모든 세포들에 트립신 처리하였고, 세포수를 세었다. 대응하는 다수의 세포를 10% 소태아혈청(FBS)을 보충한 3㎖ DMEM를 포함하는 60㎜ 디쉬에 깔고(seeding), 감마선(방사선)을 특정 도스(0, 1, 2 및 4Gy)로 각각 노출시켰다. 방사선 조사는 3Gy/분의 선량률(dose rate)로 선형가속기(GC-3000 Elan, MDS Nordion, Canada)에서 상온에서 수행되었다. 방사선 조사 후, 모든 세포들 10-14일 배양시켜 콜로니(colony)를 성장시켰고, 콜로니들은 트리판 블루 용액(trypan blue)으로 염색시켰다. 100 이상의 세포를 포함하는 콜로니들을 세었다. 디쉬(dish)당 평균 콜로니 수를 플레이팅된 세포수로 나눈 평판배양효율(plating efficiency)을 계산하였다. 생존분획(Survival fraction)을 적절한 대조군의 평판배양효율로 표준화시킴으로써 계산하였다.

(6) 세포 생존력 분석(Cell viability assay)

HJURP 유전자를 도입시킨 후, 세포들을 웰 당 1,000 세포수로 96 웰 플레이트에 깔았다. 20㎕ MTT(5㎎/㎖)을 대응하는 테스트 웰에 첨가 하였고, 4시간 동안 배양하였다. 상청액을 버리고, 각 웰 당 200㎕ DMSO를 첨가하여 침전물을 용해시켰다. 590 nm에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 각 실험은 6일 동안 계속하여 수행하였고, 4 웰에서 반복 실험하였다.

2. 결과

(1) 파지 디스플레이로 Chk1-결합 펩티드(Chk1-binding peptide)를 동정

파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝은 시험관 내(in vitro) 단백질-단백질 상호작용 가능성을 설명하기 위한 간편한 스크리닝 방법이며, 예를 들어 효모 2-하이브리드 스크리닝(yeast two-hybrid screening)에서 베이트(bait) 및 포획 구조물(prey constructs)의 정확한 세포 내의 위치화(subcellular localization)와 같은 기술적인 장애 피하도록 한다. Chk1 N-말단 영역의 추정되는 상호작용 파트너를 동정하기 위하여, E. coli 발현 시스템을 이용하여 Chk1 N-말단영역의 재조합 단백질을 준비하였고, 상기 재조합 단백질에 파지 디스플레이 기술을 이용하여 Chk1-타겟화된 DNA 손상 조절자(modulator)로 개발하고자 하였다(도 1 참조). 파지 디스플레이 접근법(phage display approach)을 이용하여, 약 Chk1 단백질에 결합된 50 파지 클론들이 디스플레이 되었고, 20 파지 클론이 선택되었고, 시퀀싱 되었고, 아미노산으로 번역되었다. 알려지지 않은 신규 펩티드인 pCN8을 얻었고, 화학적으로 합성하였다(도 2 참조). 특정 펩티드를 탐지하지 위하여 펩티드의 N-말단에 비오틴을 결합시켰고(biotinylated), 세포 내화(cell internalization)의 감수성(susceptibility) 때문에 RRRRRRRRR(R9) 시퀀스를 붙였다.

(2) 시험관 내에서 펩티드의 Chk1-결합력(Chk1-binding ability)

공-침전(co-precipitation) 방법을 이용하여 새롭게 합성한 펩티드가 Chk1 단백질과 정확하게 상호작용하는지 여부를 실험하였다. 합성된 펩티드를 Chk1 단백질 존재 하에서 첨가한 후, 상기 pCN8이 스트렙타비딘-결합 비드(streptavidin-conjugated bead)로 끌어당겨졌다. Chk1은 펩티드 침전으로 검출하였다(도 3 참조).

(3) pCN8의 내화 및 세포독성

융합 펩티드의 내화를 평가하기 위하여, Hela 세포주에 R9 또는 pCN8을 2μM의 농도로 1시간 동안 처리하였고, 이는 상기 펩티드의 상당한 세포내 흡수(cellular uptake)를 야기했다(도 4a 참조). R9 및 pCN8의 내화는 핵 구획(nuclear compartment)에 특히 국소화(localization)되었으며, 반면 DMEM만을 처리한 대조군에서는 형광 신호(fluorescent signal)를 보여주지 못했다.

시험관 내에서 R9 및 pCN8의 세포 독성을 측정하였다. Hela 세포주 및 H460 세포주를 96-웰 플레이트에서 성장 시키고, 상기 펩티드(0, 5, 10 및 20 μM)를 처리하였다. 상기 처리 후 용해된 포르마잔(formazan)의 생성, 즉 세포 증식(cell proliferation)의 대사 지표(metabolic indicator)를 측정하는 MTT 분석(MTT assay)을 수행하였다. 상기 펩티드는 H460 세포주에서는 96시간까지 성장 저해 또는 세포독성 효과가 입증되었으며, pCN8은 96시간 배양 시간동안 농도 의존적 방식으로 Hela 세포주의 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 4b 및 도 4c 참조). 상기 결과로 Hela 세포주에서 관찰된 세포 밀도의 감소는 세포독성 효과가 아니라, 펩티드에 대한 세포반응(cellular response)으로부터 성장 억제에 의한 것임을 알 수 있었다.

(4) 방사선 반응(radiation response)에 대한 pCN8의 영향

Chk1은 방사선 조사와 같은 DNA 손상에 대한 세포반응을 조절하는 메커니즘에서 중요한 역할을 수행한다. Chk1 분해가 광범위할 경우, 지연된 복제분기점(stalled replication fork)이 비가역적으로 손상되어, 영구적인 S기 정지(S phase arrest) 또는 DNA 가닥 절단(DNA strand breakage)을 초래하며, 궁극적으로 세포 사멸(apoptosis)을 초래한다. DNA 손상 하에, Chk1 발현에 있어서의 부분적인 감소는 부적절한 S 기 진입(S phase entry), 복제 중에 DNA 손상 축적 및 유사분열 진입(mitotic entry) 억제 실패를 촉진시킬 수 있다. 먼저, 방사선을 비롯한 캄포테신 및 히드록시우레아와 pCN8 펩타이드를 병용처리하여 암세포 사멸 효과를 측정하기 위해 Hela 세포주에 R9 또는 pCN8을 1시간 동안 전처리후 방사선 및 캄포테신 또는 히드록시우레아를 처리한 다음, 세포 생존율을 측정하였다. Hela 세포주에 pCN8 5μM 전 처리하고, 캄포테신, 히드록시우레아 또는 방사선과 병용처리할 경우 세포 생존율이 상당히 많이 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 5a 참조). Chk1에 대한 pCN8의 기능적인 영향을 알기 위해 방사선 조사 하에서 pCN8의 세포 영향(cellular effect)을 실험하였다. 감마-방사선 조사(5Gy) 전에, Hela 세포주 및 H460 세포주에 R9 또는 pCN8을 1시간 동안 처리하였고, 24시간동안 배양시켰고, MTT 분석을 이용하여 세포 생존율을 측정하였고(도 5b 참조), 웨스턴 블롯팅 분석을 이용하여 Chk1 단백질 수준을 측정하였다(도 5c 참조). pCN8은 Hela 세포주 및 H460 세포주 모두에서 방사선 반응에 의한 세포사멸을 증가시켰으나, R9는 그렇지 않았다. pCN8은 정상 조건(normal condition)에서 Chk1의 인산화를 활성화시켰고, 방사선 반응에서 총 Chk1 수준은 감소시켰다. 형광 현미경 실험을 통해, pCN8 존재 하에서 방사선이 조사된 세포에서 Chk1의 핵 내 체류(nuclear retention)가 상당히 감소되었다(도 5d 참조). 상기 결과로 pCN8이 Chk1 안정성(stability)의 조절(modulating)을 통해서 방사선 민감성(radiation sensitivity)을 증가시키는 것을 확인하였다.

(5) Chk1의 결합 파트너로서의 HJURP(Holliday junction recognition protein)

파지 디스플레이로 동정된 펩티드 정보는 단백질-단백질 상호작용에 매우 유용하다. pCN8 시퀀스와 함께 Chk1 결합 파트너를 조사하였다. BLAST 소프트웨어 및 단백질 데이터베이스를 이용하여, pCN8의 2번째 잔기 내지 8번째 잔기( P N KTLSV )는 인간 HJURP( NCBI reference sequence : NP _060880.3 )의 558번째 내지 564번째 잔기( PSKTLSV )와 약 85% 상동성을 가짐을 확인하였다.

면연침강 분석을 이용함으로써 HJURP가 Chk1 단백질과 정확하게 상호작용하는지 여부를 실험하였다. HJURP 및 Chk1의 발현이 높은 암세포의 세포분획에서 IgG 항체 및 HJURP 항체 또는 IgG 항체 및 Chk1 항체로 면역침강을 수행한 후, 면역 블랏을 확인한 결과, HJURP와 Chk1이 상호 결합하고 있는 것을 알 수 있었다. pCN8이 HJURP와 Chk1 사이의 상호작용의 억제가 가능한지 여부를 실험하였다. 대조군에서는 정상적으로 HJURP와 Chk1이 상호 결합하고 있었으나, pCN8를 처리한 세포군에서는 HJURP와 Chk1 사이의 결합 친화력(binding affinity)은 감소되었고, HJURP와 Chk1 수준은 크게 감소되지 않았다(도 6b 참조).

pCN8에 의한 HJURP와 Chk1 사이의 결합력이 감소한 세포생물학적 영향을 형광현미경 분석으로 확인하였다. HJURP와 Chk1은 핵에 국소화되어 있는 것으로 나타났다. 그러나, pCN8을 처리한 세포에서는 HJURP와 Chk1이 떨어져 있는 것을 알 수 있었고, HJURP의 국소화는 변화가 없었으나, Chk1은 핵에서 세포질로 국소화가 변경된 것을 볼 수 있었다(도 6c 참조). 이는 Chk1의 분해가 일어날 가능성이 높아졌다는 의미이며, 방사선이나 캄포테신 또는 히드록시우레아와 같은 항암제와 병용투여할 경우 Chk1의 분해는 물론 세포사멸이 더 잘 일어날 수 있음을 알 수 있었다(도 5a 및 도 5b 참조).

(6) 방사선 반응에 대한 HJURP의 세포 영향

인간 암세포에서 HJURP는 높게 발현되고, HJURP의 활성화는 염색체 안정화와 암세포의 불멸화(immortality)와 관련된다. 그러나, DNA 손상 반응에 있어서의 HJURP의 기능에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 방사선 반응에 대한 HJURP의 세포 영향을 설명하기 위하여, H460 세포주에 유전자가 삽입되지 않은 벡터(empty vector), HJURP 유전자를 삽입하여 유전자 발현을 증가시키거나 HJURP siRNA를 세포에 도입시켜서 세포 증식 및 방사선 민감성을 측정하였다. 도 7a를 참조하면, siRNA를 이용한 HJURP 유전자 발현의 감소는 Chk1의 발현량에도 영향을 주어 감소하는 것을 확인하였고, 또한 DNA 손상 반응의 마커 중 하나인 감마-H2AX의 활성도 증가됨을 확인할 수 있었다. 도 7b를 참조하면, 세포수 분석(cell count assay) 결과를 통하여 H460 세포주에 HJURP 유전자가 삽입되어 HJURP 유전자가 과발현되는 경우 세포 증식이 증가됨을 확인할 수 있었고, 반면 siRNA를 이용한 HJURP 유전자 발현의 감소는 암세포 증식이 감소됨을 확인할 수 있었다. 도 7c를 참조하면, H460 세포주에 콜로니 형성 분석법을 이용하여 분석한 결과는 HJURP의 과발현은 암세포의 방사선저항성(radioresistance)을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었고 siRNA를 이용한 HJURP 유전자 발현의 억제는 암세포의 방사선민감도(radiosensitivity)를 증가시킴을 확인할 수 있었다.

<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> PEPTIDE FOR INHIBITION OF INTERACTION BETWEEN CHK1 AND HJURP PROTEIN, PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING CANCER INCLUDING THE SAME AND A METHOD OF SCREENING PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING OR PREVENTING CANCER <130> DP-2010-0489 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE FOR INHIBITION OF INTERACTION BETWEEN CHK1 AND HJURP PROTEIN <400> 1 Pro Asn Lys Thr Leu Ser Val 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PEPTIDE FOR INHIBITION OF INTERACTION BETWEEN CHK1 AND HJURP PROTEIN <400> 2 Ala Pro Asn Lys Thr Leu Ser Val Asn Lys Met Val 1 5 10 <210> 3 <211> 748 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Leu Gly Thr Leu Arg Ala Met Glu Gly Glu Asp Val Glu Asp Asp 1 5 10 15 Gln Leu Leu Gln Lys Leu Arg Ala Ser Arg Arg Arg Phe Gln Arg Arg 20 25 30 Met Gln Arg Leu Ile Glu Lys Tyr Asn Gln Pro Phe Glu Asp Thr Pro 35 40 45 Val Val Gln Met Ala Thr Leu Thr Tyr Glu Thr Pro Gln Gly Leu Arg 50 55 60 Ile Trp Gly Gly Arg Leu Ile Lys Glu Arg Asn Glu Gly Glu Ile Gln 65 70 75 80 Asp Ser Ser Met Lys Pro Ala Asp Arg Thr Asp Gly Ser Val Gln Ala 85 90 95 Ala Ala Trp Gly Pro Glu Leu Pro Ser His Arg Thr Val Leu Gly Ala 100 105 110 Asp Ser Lys Ser Gly Glu Val Asp Ala Thr Ser Asp Gln Glu Glu Ser 115 120 125 Val Ala Trp Ala Leu Ala Pro Ala Val Pro Gln Ser Pro Leu Lys Asn 130 135 140 Glu Leu Arg Arg Lys Tyr Leu Thr Gln Val Asp Ile Leu Leu Gln Gly 145 150 155 160 Ala Glu Tyr Phe Glu Cys Ala Gly Asn Arg Ala Gly Arg Asp Val Arg 165 170 175 Val Thr Pro Leu Pro Ser Leu Ala Ser Pro Ala Val Pro Ala Pro Gly 180 185 190 Tyr Cys Ser Arg Ile Ser Arg Lys Ser Pro Gly Asp Pro Ala Lys Pro 195 200 205 Ala Ser Ser Pro Arg Glu Trp Asp Pro Leu His Pro Ser Ser Thr Asp 210 215 220 Met Ala Leu Val Pro Arg Asn Asp Ser Leu Ser Leu Gln Glu Thr Ser 225 230 235 240 Ser Ser Ser Phe Leu Ser Ser Gln Pro Phe Glu Asp Asp Asp Ile Cys 245 250 255 Asn Val Thr Ile Ser Asp Leu Tyr Ala Gly Met Leu His Ser Met Ser 260 265 270 Arg Leu Leu Ser Thr Lys Pro Ser Ser Ile Ile Ser Thr Lys Thr Phe 275 280 285 Ile Met Gln Asn Trp Asn Ser Arg Arg Arg His Arg Tyr Lys Ser Arg 290 295 300 Met Asn Lys Thr Tyr Cys Lys Gly Ala Arg Arg Ser Gln Arg Ser Ser 305 310 315 320 Lys Glu Asn Phe Ile Pro Cys Ser Glu Pro Val Lys Gly Thr Gly Ala 325 330 335 Leu Arg Asp Cys Lys Asn Val Leu Asp Val Ser Cys Arg Lys Thr Gly 340 345 350 Leu Lys Leu Glu Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Arg Pro Gln Ile His 355 360 365 Lys Leu Asp Pro Ser Trp Lys Glu Arg Lys Val Thr Pro Ser Lys Tyr 370 375 380 Ser Ser Leu Ile Tyr Phe Asp Ser Ser Ala Thr Tyr Asn Leu Asp Glu 385 390 395 400 Glu Asn Arg Phe Arg Thr Leu Lys Trp Leu Ile Ser Pro Val Lys Ile 405 410 415 Val Ser Arg Pro Thr Ile Arg Gln Gly His Gly Glu Asn Arg Gln Arg 420 425 430 Glu Ile Glu Ile Arg Phe Asp Gln Leu His Arg Glu Tyr Cys Leu Ser 435 440 445 Pro Arg Asn Gln Pro Arg Arg Met Cys Leu Pro Asp Ser Trp Ala Met 450 455 460 Asn Met Tyr Arg Gly Gly Pro Ala Ser Pro Gly Gly Leu Gln Gly Leu 465 470 475 480 Glu Thr Arg Arg Leu Ser Leu Pro Ser Ser Lys Ala Lys Ala Lys Ser 485 490 495 Leu Ser Glu Ala Phe Glu Asn Leu Gly Lys Arg Ser Leu Glu Ala Gly 500 505 510 Arg Cys Leu Pro Lys Ser Asp Ser Ser Ser Ser Leu Pro Lys Thr Asn 515 520 525 Pro Thr His Ser Ala Thr Arg Pro Gln Gln Thr Ser Asp Leu His Val 530 535 540 Gln Gly Asn Ser Ser Gly Ile Phe Arg Lys Ser Val Ser Pro Ser Lys 545 550 555 560 Thr Leu Ser Val Pro Asp Lys Glu Val Pro Gly His Gly Arg Asn Arg 565 570 575 Tyr Asp Glu Ile Lys Glu Glu Phe Asp Lys Leu His Gln Lys Tyr Cys 580 585 590 Leu Lys Ser Pro Gly Gln Met Thr Val Pro Leu Cys Ile Gly Val Ser 595 600 605 Thr Asp Lys Ala Ser Met Glu Val Arg Tyr Gln Thr Glu Gly Phe Leu 610 615 620 Gly Lys Leu Asn Pro Asp Pro His Phe Gln Gly Phe Gln Lys Leu Pro 625 630 635 640 Ser Ser Pro Leu Gly Cys Arg Lys Ser Leu Leu Gly Ser Thr Ala Ile 645 650 655 Glu Ala Pro Ser Ser Thr Cys Val Ala Arg Ala Ile Thr Arg Asp Gly 660 665 670 Thr Arg Asp His Gln Phe Pro Ala Lys Arg Pro Arg Leu Ser Glu Pro 675 680 685 Gln Gly Ser Gly Arg Gln Gly Asn Ser Leu Gly Ala Ser Asp Gly Val 690 695 700 Asp Asn Thr Val Arg Pro Gly Asp Gln Gly Ser Ser Ser Gln Pro Asn 705 710 715 720 Ser Glu Glu Arg Gly Glu Asn Thr Ser Tyr Arg Met Glu Glu Lys Ser 725 730 735 Asp Phe Met Leu Glu Lys Leu Glu Thr Lys Ser Val 740 745 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> residues 558-564 in Holliday junction recognition protein(HJURP) of Homo sapiens <400> 4 Pro Ser Lys Thr Leu Ser Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for susceptibility of cell internalization <400> 5 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments encoding the N-terminal domain of Chk1 (residues 2-270) <400> 6 cgcggatccg cagtgccctt tgtggaagac t 31 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments encoding the N-terminal domain of Chk1 (residues 2-270) <400> 7 cgccaagctt acttgagggg tttgttgtac catc 34 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification specific fragments encoding C-terminal domain of Chk1 (residues 271-476) <400> 8 cgcggtacca aaggggcaaa aaggccccga g 31 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification specific fragments encoding C-terminal domain of Chk1 (residues 271-476) <400> 9 cgcggatccg cagtgccctt tgtggaagac t 31

Claims

서열번호 1(PNKTLSV)의 적어도 7개의 연속된 아미노산을 포함하는 8 내지 12 mer 크기의 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드.
제 1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 2(APNKTLSVNKMV)의 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드.
서열번호 1(PNKTLSV)의 적어도 7개의 연속된 아미노산을 포함하는 8 내지 12 mer 크기의 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질 간의 상호작용을 억제하는 펩티드를 유효성분으로 포함하는 항암제.
제 3항에 있어서, 상기 항암제는 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교할 때 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질이 과발현되는 암을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 항암제.
제 4항에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 난소암, 대장암, 흑색종 및 신경교종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제.
제 3항에 있어서, 상기 항암제는 방사선, 캄포테신(camptothecin; CPT) 및 히드록시우레아(hydroxyurea; HU)로 이루어진 군에서 선택되는 항암제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제.
동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교할 때 Chk1 단백질 및 HJURP 단백질이 과발현되는 암세포에 후보 물질을 접촉시키는 단계; 및
상기 후보 물질에 의해 상기 Chk1 단백질의 발현이 억제되는지 여부를 종양 세포가 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 항암제를 스크리닝하는 방법.
제 7항에 있어서, 성기 후보물질을 접촉시키는 단계 및 종양 세포가 동일한 조직 유형의 정상 세포와 비교하여 확인하는 단계 사이에 상기 암세포에 방사선을 조사하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제를 스크리닝하는 방법.