KR20120046506A - Ｃｄｋ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체를 함유하는 조성물은 Cdk1 및 Cdk2를 억제함으로써 인간 간암세포주인 SNU-354 세포의 세포성장을 억제하고, Cdk7 및 Cdk9를 억제함으로써 상기 세포의 세포사멸을 유도하므로 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,
R¹ 및 R²는 본 명세서에서 정의한 바와 같다.)

Description

ＣＤＫ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pyrrolopyrimidinone carboxamide derivatives, inhibiting CDK or pharmaceutically acceptable salts thereof and pharmaceutical composition for prevention or treatment of the apoptosis in hepatocellular carcinoma cells as an active ingredient}

본 발명은 ＣＤＫ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

간세포암(hepatocellular carcinoma(HCC))은 간경변을 가지고 있는 환자들에게서 가장 사망률이 높은 질병이다. 또한 간세포암은 세계에서 여섯번째로 발병률이 높으며, 암 중에서도 사망률은 세번째에 이른다. 이 병은 미국에서 1978년부터 1980년 사이에 10만명 당 1.3명 발생하였다가 1998년부터 2001년에 이르기까지 10만명 당 3.3명으로 증가하였다. 이러한 발병률의 증가는 해가 거듭될 수록 계속되고 있으며, 수십년 전에는 원인으로 헤파티티스(hepatitis) C 바이러스(HCV)의 감염이 가장 크게 대두되었지만 그 후 세계적으로 HCV보단 hepatitis B virus(HBV)의 감염이 널리 퍼지게 되었고 최근에는 세계적으로 간세포암의 원인으로 HBV 간염이 가장 크게 대두되고 있다. 또한 현재는 서양보다 아시아나 아프리카에서 보다 높은 발병률을 나타내고 있다. 이러한 간세포암의 치료는 복합적으로 여전히 어려운 문제인데, 그 이유로는 간세포암은 다양한 약물의 내성 유전자를 발현하고 있고 화학요법치료에도 낮은 민감도를 나타내고 있기 때문이다. 이러한 간세포암은 조직 및 세포 내에 Cdk(cyclin dependent kinase)의 활성이 매우 높은 상태로 유지되고 있다. 이것은 세포내의 Cdk 억제제들(p16Ink4, p21Waf1, p27Kip1 등)의 활성이 억제되어 있거나 또는 Cdk와 복합체를 형성하는 싸이클린(cyclin)들이 비정상적인 활성을 가지고 있기 때문이다. 상기와 같은 이유로 Cdk의 억제제들은 간세포암의 치료에 좋은 후보군이 될 수 있고, 그 억제제들 중 일부(플라보피리돌(flavopiridol)과 로즈코비틴(roscovitine) 등)는 이미 임상시험에 적용 중이기도 하다.

세포내에서 Cdk를 억제하는 분자들(p16Ink4, p21Waf1, p27Kip1 등)은 세포주기(cell cycle)에서 매우 중요한 체크 포인트에 관여하여 세포주기를 조절하는 중요한 역할을 한다. 이미 보고된 내용에 따르면 세포주기에서 G1/S나 G2/M 체크 포인트의 분열은 세포를 성장이 조절되지 않는 상태로 변하게 함으로써 암을 유발하거나 혹은 세포사멸을 유도하도록 한다. 따라서 Cdk 억제제를 통한 작용기전을 연구하는 것은 암치료를 위해 매우 중요하다.

Cdk는 암세포의 성장에 필수적인 두 부분(세포 주기(cell cycle progression)와 유전자 전사(gene transcription))를 조절한다. Cdk는 Rb 단백질과 같은 세포주기에 중요한 분자들을 인산화시킴으로써 세포주기의 각 단계로 진입하는 것을 조절한다. Cdk는 사이클린과 헤테로다이머(heterodimers)를 형성하여 새로운 활성을 갖는 복합체를 형성하게 된다. 예를 들어, Cdk2/cyclin E는 S 단계(phase)로 진입하는데 필수적이며, Cdk2/cyclin A는 S 단계에서 G2 단계로 넘어가기 직전에 필수적이다. Cdks는 또한 RNA 폴리머라제 II 큰 부분(large subnuit)의 카르복실-터미날 도메인(carboxyl-terminal domain)을 인산화시킴으로써 유전자 전사를 조절한다. 인간에서, RNA 폴리머라제 II의 카르복실-터미날 도메인은 인산화가 잘 될 수 있는 헵타펩타이드(heptapeptide) (YSPTSPS) 형태의 서열이 52회 반복되는 부분이 포함되어 있다. 다양한 Cdk들이 이러한 부분을 인산화 시키는 것으로 알려져 있다. 그 중 대표적으로 전사 시작(transcriptional initiation)을 유도하는 TFIIH 복합체의 부분인 Cdk7/cyclin H/Mat1과 전사에서 신장(transcriptional elongation)에 관여하는 P-TEFb라 불리워지는 Cdk9/cyclin T가 있다.

이에 본 발명자는 새로운 Cdk 억제제 화합물을 합성하기 위하여 연구하던 중, 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체를 합성하고, 상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체가 생체외(in vitro) 실험 및 동물 모델 실험에서 우수한 Cdk 억제 효과를 나타내어 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,

R¹ 및 R²는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.)

또한, 본 발명은 상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체를 함유하는 조성물은 Cdk1 및 Cdk2를 억제함으로써 인간 간암세포주인 SNU-354 세포의 세포성장을 억제하고, Cdk7 및 Cdk9를 억제함으로써 인간 간암세포주인 SNU-354 세포의 세포사멸을 유도하므로 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk1 및 Cdk2의 인산화 정도의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk1 및 Cdk2의 인산화 정도의 전기영동 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 p-뉴클레오린에 대한 Cdk1의 인산화 정도 및 p-Rb에 대한 Cdk2의 인산화 정도를 웨스턴 블랏 분석한 전기영동 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 p-뉴클레오린에 대한 Cdk1의 인산화 정도 및 p-Rb에 대한 Cdk2의 인산화 정도를 웨스턴 블랏 분석한 전기영동 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk7 활성도의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk7 활성도의 전기영동 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk9 활성도의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk9 활성도의 전기영동 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk7 활성도의 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk7 활성도의 웨스턴 블랏 분석한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk9 활성도의 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk9 활성도의 웨스턴 블랏 분석한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Mcl-1, survivin, XIAP 단백질 양 감소에 대한 웨스턴 블랏 분석결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Mcl-1, survivin, XIAP 단백질 양 감소에 대한 PCR 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 세포 생존력에 대한 MTT 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 세포 생존력에 대한 ³H-티미딘 인코포레이션 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물에 의한 PARP 절단 확인 효과를 웨스턴 블랏 분석을 통해 나타낸 도면이다.
도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 농도 변화에 따른 카스파제-3의 활성 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 농도 변화에 따른 SNU-354 세포의 sub G1 비율 변화의 FACS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 시간 변화에 따른 SNU-354 세포의 sub G1 비율 변화의 FACS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 투여 농도에 의한 동물의 무게 변화를 나타낸 도면이다.
도 22는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 투여군에서 이종이식 암의 성장을 나타낸 도면이다.
도 23은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 투여군인 이종이식 암 및 간 조직에 H&E 염색, TUNEL 분석 및 끊어진 카스파제-3 발현 양을 측정한 도면이다.
도 24는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물들을 SNU-354 세포에 처리한 후 Sub G1 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 25는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물들을 SNU-354 세포에 처리한 후 카스파제-3 활성 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.

상기 화학식 1에서,

R¹은 수소 또는 R³C(=O)이고;

R³은 C₁~C₆의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C₃~C₈의 시클로알킬 또는 페닐이고;

R²는 수소 또는 아세틸기이다.

더욱 바람직하게는, 상기 R³는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, t-부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 또는 페닐이다.

화학식 1로 표시되는 구체적인 화합물은 다음과 같다.

(1) 4-아미노-6-브로모-1-((2S,3R,4R,5S)-3,4-디하이드록시-5-(하이드록시메틸)-테트라하이드로퓨란-2-일)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카복사마이드;

(2) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 이소부티레이트;

(3) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 피발레이트;

(4) (2S,3R,4S,5S)-2-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-5-(이소부티릴옥시메틸)-테트라하이드로퓨란-3,4-디일 디아세테이트;

(5) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 벤조에이트;

(6) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 프로피오네이트; 및

(7) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 사이클로헥산카복실레이트.

본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 약학적으로 허용가능한 염이란 표현은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1의 염기 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 화학식 1의 염기 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트가 바람직하다.

또한, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체는 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액의 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 표시되는 바와 같이,

화학식 2의 화합물에 BSA를 가한 후 TMSOTf 존재하에 화학식 3의 화합물과 반응시켜 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계(단계 1);

화학식 4의 화합물에 암모늄하이드록사이드 용액을 가하여 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계(단계 2); 및

화학식 5의 화합물에 과산화수소를 가하여 화학식 1a의 화합물을 제조하는 단계(단계 3)를 포함하는 신규 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법을 제공한다.

[반응식 1]

.

(상기 반응식 1에서,

상기 화학식 1a는 상기 화학식 1에 포함된다.)

이하, 본 발명에 따른 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.

단계 1

본 발명에 따른 상기 단계 1은 출발물질인 화학식 2의 화합물을 용매 하에서 BSA와 반응시킨 후 화학식 3의 화합물과 반응시켜 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계이다.

상기 반응은 유기화학 분야에서 통상적으로 널리 알려져 있으며, 반응 용매, 반응 온도, 반응 시간 등의 반응 조건은 반응물질, 생성물질 등을 고려하여 적절히 선택할 수 있다. 일례로 본 발명에서는 반응 용매는 DCE 및 톨루엔을 사용하였고 80 ℃에서 반응시켜 상기 화학식 4의 화합물을 수득하였다.

단계 2

본 발명에 따른 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 제조된 화학식 4의 화합물을 용매하에 반응시켜 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계이다.

구체적으로 상기 화학식 4의 화합물을 메탄올에 현탁시킨 후 상온에서 암모니아수를 가하고 교반하여 화학식 5의 화합물을 수득하였다.

단계 3

본 발명에 따른 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 제조된 화학식 5의 화합물을 따로 분리하지 않고 바로 반응을 진행하여 화학식 1a의 화합물을 제조하는 단계이다.

구체적으로, 화학식 5의 화합물이 생성된 것을 확인한 후 바로 과산화수소를 가한 후 상온에서 8시간 교반하여 화학식 1a의 화합물을 수득하였다.

나아가, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이 화학식 1a의 화합물을 에스터화 반응을 통해 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계(단계 4)를 더 포함할 수 있다.

[반응식 2]

(상기 반응식 2에서,

R¹ 및 R²는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같으나 단, R¹은 H를 제외한다.)

단계 4

본 발명에 따른 상기 단계 4는 화학식 1a의 화합물의 말단 1급 하이드록시기에 에스터화하거나 또는 2급 하이드록시기를 보호하여 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계이다.

나아가, 상기 반응식 1의 출발물질인 화학식 2의 화합물은 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이,

화학식 6의 화합물인 테트라시아노에틸렌을 아세톤과 에틸아세테이트 존재하에 하이드로겐브로마이드를 가하여 화학식 7의 화합물을 제조하는 단계(단계 1); 및

화학식 7의 화합물에 트리에틸올소포메이트 및 암모니아수를 가하여 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계(단계 2)를 포함하여 제조할 수 있다.

[반응식 3]

또한, 상기 반응식 1의 화학식 3의 화합물은 하기 반응식 4에 나타난 바와 같이,

화학식 8의 L-자일로스를 붕산과 반응시킨 후 아세트산 및 무수 아세트산을 가하여 고온에서 반응시키는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.

[반응식 4]

.

나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 간세포암은 간세포에서 발생하는 암을 말하며 일반적으로 간암이라고 하면 대부분 간세포에서 기원하는 간세포암을 말한다.

상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 Cdk 저해작용을 가지며, 바람직하게 상기 Cdk는 Cdk1, Cdk2, Cdk7 및 Cdk9를 포함한다.

본 발명에 따른 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체는 Cdk1 및 Cdk2의 억제를 통해 인간 간암세포주인 SNU-354 세포의 세포 성장을 억제하고, Cdk7 및 Cdk9의 억제를 통해 인간 간암세포주인 SNU-354 세포의 세포사멸을 유도함으로써 간세포암의 예방 또는 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 화학식 1의 피롤로피리미디논 카복사미드유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

상기 화학식 1의 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체를 유효 성분으로 하는 약학 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.

이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1의 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 1 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

< 제조예 1> 4-아미노-6- 브로모 -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -5- 카보나이트릴 (4-Amino-6-bromo-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-5-carbonitrile) (4)의 제조

단계 1: 2-아미노-5- 브로모 -1H-피롤-3,4- 디카보나이트릴 (2- Amino -5- bromo -1H-pyrrole-3,4-dicarbonitrile) (3)의 제조

테트라시아노에틸렌 (10.02 g, 78.23 mmol)을 아세톤(60 ml)과 에틸 아세테이트(120 ml)의 혼합용매에 녹인 후 0~5 ℃하에서 아세트산에 녹아있는 하이드로겐브로마이드(33wt%, 60 ml)를 가했다. 추가로 한 시간 정도 교반하여 얻어지는 노란색 고체는 필터를 이용하여 분리하였다. 차가운 증류수(100 ml)로 두 번 씻어준 뒤 공기 중에서 건조시켜 목적물(11.02 g, 52.22 mmol, 66.8%)을 얻었다.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆, δH) 12.3 (br s, 1, N-H); 6.46 (br s, 2, NH₂).

mp > 210 ℃.

단계 2: 4-아미노-6- 브로모 -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -5- 카보나이트릴 (4-Amino-6-bromo-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-5-carbonitrile) (4)의 제조

상기 단계 1에서 수득한 화학식 3의 화합물(10.57 g, 50.09 mmol)을 증류된 아세토나이트릴(170 mL)에 현탁 시켰다. 여기에 트리에틸올소포메이트(20.0 mL, 182 mmol)를 가하고 끓는점까지 온도를 높여 4시간 동안 가열하였다. 흑갈색 용액을 상온으로 식힌 뒤 필터 용지를 이용해 남은 찌꺼기를 여과하고, 아세토나이트릴은 진공을 이용하여 제거하여 갈색 고체 형태의 2-브로모-5-(에톡시메틸렌)이미노피롤-3,4-디카보나이트릴을 얻었다. 상기 갈색 고체를 다시 포화 암모니아수(100 mL)에 녹이고 생성된 용액은 탈색용 카본(5.0 g)을 넣어 섞은 후 셀라이트 패드를 통과시켜 여과하고 이 과정을 한번 더 반복하였다. 여과된 노란색 액체에 흰 침전이 생길 때 까지 아세트산(80 mL)을 천천히 가하였다. 상기 현탁액은 -5 ℃의 온도에서 8 시간 동안 보관한 뒤 필터를 이용해서 여과하였다. 걸러낸 흰 고체를 진공오븐을 이용하여 120 ℃에서 8시간 동안 건조시켜 목적물(9.99 g, 41.97 mmol, 84%)을 얻었다.

¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆, δH) 13.80 (bs, NH), 8.21 (s, H-2), 7.21(bs, NH₂).

^l3C-NMR (125 MHz, DMSO-d₆, δC) 156.33, 150.36, 149.86, 125.33, 116.25, 103.99, 84.75.

HRMS (FAB+) Calcd for C₇H₅BrN₅ (M+) 237.9728, Found 237.9722.

< 제조예 2> 1,2,3,5- 테트라 -O-아세틸-L- 자일로퓨라노스 (1,2,3,5- Tetra -O-acetyl-L-xylofuranose) (5)의 제조

화학식 10의 L-자일로스(5.00 g, 33.3 mmol)와 붕산(4.53 g, 73.3 mmol)을 아세트산(120 mL)에 녹인 뒤 1시간 동안 50 ℃로 가열하며 교반한 후 무수 아세트산(120 mL)을 가하였다. 반응 혼합물은 50 ℃에서 3일 동안 더 가열하고 상온으로 식힌 후 물(600 mL)과 에틸 아세테이트(3 × 300 mL)를 이용하여 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물은 포화 소듐바이카보네이트 수용액, 소금물로 씻어주고 마그네슘설페이트를 이용하여 용매에 남아 있는 물을 제거하였다. 농축시켜 시럽 형태의 자일로퓨라노스인 화학식 5의 화합물(10.45 g, 32.8 mmol, 99%, α : β = 1 : 1.8)을 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃, δH) 6.42 (d, 0.35 H, J 4.6 Hz), 6.10 (s, 0.65 H), 5.52 (dd, 0.35 H, J 6.5, 6.5 Hz), 5.36(dd, 0.65 H, J 1.7, 5.6 Hz), 5.30 (dd, 0.35 H, J 4.6, 6.2 Hz), 5.20 (d, 0.65 H, J 1.0 Hz), 4.67-4.60 (m, 1 H), 4.27-4.18 (m, 1.65 H), 4.12 (dd, 0.35 H, J 4.2, 12.2 Hz), 2.12 (s, 2H), 2.11 (s, 2 H), 2.09 (s, 3 H), 2.07 (s, 3 H), 2.06 (s, 2 H).

¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃, δC) 170.5, 170.3, 169.6, 169.5, 169.3, 169.2, 169.1, 98.8, 92.8, 79.9, 79.4, 75.3, 75.3, 74.3, 73.8, 62.3, 61.6, 21.0, 20.9, 20.8, 20.7, 20.6, 20.5, 20.4.

HRMS (ESI) calcd for (M + Na) C₁₃H₁₈O₉: 341.0843, found 341.0845.

< 실시예 1> 4-아미노-6- 브로모 -1-((2S,3R,4R,5S)-3,4- 디하이드록시 -5-( 하이드록시메틸 )- 테트라하이드로퓨란 -2-일)1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -5- 카복사미드 (4- amino -6- bromo -1-((2S,3R,4R,5S)-3,4- dihydroxy -5-( hydroxymethyl )-tetrahydrofuran-2-yl)-1H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-5-carboxamide) (1a)의 제조

단계 1: (2S, 3R, 4S, 5S)-2-( 아세톡시메틸 )-5-(4-아미노-6- 브로모 -5- 시아노 -7H-피 롤로[2,3-d]피리 미딘-1-일) 테트라하이드로퓨란 -3,4- 디일 디아세테이트 ((2S,3R,4S,5S)-2-( Acetoxymethyl )-5-(4- amino -6- bromo -5- cyano -7H- pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-1-yl)tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate ) (6)의 제조

상기 제조예 1에서 얻은 화학식 2의 화합물(552 mg, 2.3 mmol)을 증류된 DCE(23 mL)에 현탁시킨 후 BSA(1.2 mL, 3.1 mmol)을 넣고 80 ℃ 에서 한 시간 동안 가열하였다. 현탁액이 맑아지면 진공을 이용하여 용매를 제거하고 남아있는 물질을 증류된 톨루엔(5 mL)에 다시 녹였다. 상기 용액에 톨루엔에 녹인 화학식 3의 테트라-O-아세틸-β-d-자일로퓨라노즈(382 mg, 1.2 mmol)와 TMSOTf(0.24 mL, 289 mg, 1.3 mmol)를 가한 뒤 80 ℃에서 한 시간 정도 더 가열하였다. 반응이 끝난 뒤 상온으로 식히고 물(50 mL)을 가한 후 유기물은 에틸 아세테이트로 추출해 내고, 포화 소듐바이카보네이트 수용액과 소금물로 씻어주었다. 유기 추출물들은 소듐설파이트를 이용하여 남아있는 물을 제거하고 용매도 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리한 노란빛을 띠는 고체 형태의 목적물(1.087 g, 2.2mmol, 94%)을 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃, δH) 8.46 (s, 1H), 6.54 (d, 1H), 6.14 (s, 2H), 5.50 (m, 1H), 5.44 (m, 1H), 4.72 (m, 1H), 4.40-4.50 (m, 2H), 2.21 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.04 (s, 3H).

¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃, δC) 170.6 169.0 155.0 145.75 140.6 134.6 116.3 106.1 91.1 85.3 80.5 79.7 74.2 61.0 21.0 20.9 20.7.

단계 2 및 단계 3: 4-아미노-6- 브로모 -1-((2S,3S,4S,5S)-3,4- 디하이드록시 -5-(하 이드록시메 틸) 테트라하이드로퓨란 -2-일)-1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -5- 카르복스아미드 (4- Amino -6- bromo -1-((2S,3S,4S,5S)-3,4- dihydroxy -5-( hydroxymethyl ) tetrahydrofuran -2- yl )-1H- pyrrolo [2,3-d]pyrimidine-5-carboxamide) (1a)의 제조

단계 2

상기 단계 1에서 얻은 화학식 4의 화합물(3.183 g, 6.41 mmol)을 메탄올에 현탁시킨 뒤 포화 암모늄하이드록사이드 용액 (25 mL)을 가하여 30분 정도 교반시켰다. 반응은 씬레이어크로마토그라피(TLC)를 통해 관찰하였고 출발물질이 없어지는 것으로 화학식 5의 화합물이 형성됨을 확인하였다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆, δH) 8.44 (s, 1H), 6.06 (s, 1H), 6.00 (dd, 1H), 5.42 (m, 1H), 4.85 (m, 1H), 4.29 (d, 1H), 4.24 (d, 1H), 3.95 (s, 1H), 3.77 (m, 2H).

단계 3

출발물질이 모두 없어진 후 30% 과산화수소 용액(12 mL)을 천천히 가하여 8시간 동안 교반하고 난 후 진공을 이용하여 용매를 제거하였다. 컬럼 크로마토그라피를 통해 물질을 분리해 낸 뒤 다시 뜨거운 물에 녹여서 4 ℃에서 4시간 동안 보관하였다. 생성된 침전물을 필터로 여과하고 진공 하에서 건조시켜 노란색 가루 형태의 화학식 1a의 화합물(1.421 g, 3.66 mmol, 57%)을 얻었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆, δH) 9.98 (d, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.26 (d, 1H), 7.65 (bs, 1H), 7.11 (bs, 1H), 6.03 (s, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.70 (s, 1H), 4.88 (t, 1H), 4.25 (m, 2H) 3.97 (s, 1H), 3.73-3.81 (m, 2H).

HRMS (FAB) calcd for (M+H) C₁₂H₁₅BrN₅O₅: 388.0257, found 388.0262.

< 실시예 2> ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6- 브로모 -5- 카바모일 -1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -1-일)-3,4- 디하이드록시 - 테트라하이드로퓨란 -2-일) 메틸 이소부티레이트 (((2S,3R,4R,5S)-5-(4- amino -6- bromo -5- carbamoyl -1H- pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxy-tetrahydrofuran-2-yl)methyl isobutyrate ) (1b)의 제조

상기 실시예 1의 단계 3에서 얻은 화학식 1a의 화합물(452 mg, 1.16 mmol)을 피리딘(5.8 mL)에 녹인 뒤 온도를 -40 ℃로 낮추었다. 상기 용액에 시린지 펌프를 이용하여 한 시간에 걸쳐 이소프로필 무수물(193 ㎕, 1.16 mmol)을 천천히 가하였다. 반응물은 -40 ℃에서 6시간 더 교반 시킨 뒤 상온으로 가온시키고 반응 혼합물을 물(20 mL)과 에틸아세테이트(20 mL)로 세 번 추출 반복하였다. 에틸 아세테이트 추출물은 포화 소듐바이카보네이트 수용액, 소금물로 씻어주고 마그네슘설페이트를 이용하여 건조시킨 뒤 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그라피를 통하여 목적물인 화학식 1b의 화합물(215 mg, 0.47 mmol, 40%)을 분리하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃, δH) 10.54 (d, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.16 (bs, 1H), 6.07 (d, 1H), 5.73 (s, 1H), 5.64 (bs, 1H), 4.79 (s, 1H), 4.64 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.41 (s, 1H) 4.31 (m, 1H), 4.27 (s, 1H), 2.59 (q, 1H), 1.17 (m, 6H).

< 실시예 3> ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6- 브로모 -5- 카바모일 -1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -1-일)-3,4- 디하이드록시 - 테트라하이드로퓨란 -2-일) 메틸 피발레이트 (((2S,3R,4R,5S)-5-(4- amino -6- bromo -5- carbamoyl -1H- pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxy-tetrahydrofuran-2-yl)methyl pivalate ) (1c)의 제조

디메틸포름아미드(3 mL)에 피발로일 클로라이드(130 uL, 1.06 mmol)를 녹인 뒤 0 ℃에서 이미다졸(158mg, 2.32mmol)을 추가하였다. 0 ℃에서 2시간 정도 교반하고 피리딘(2 mL)에 녹아있는 상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1a의 화합물(410 mg, 1.06 mmol)을 서서히 투입하였다. 반응물은 0 ℃에서 6시간 더 교반 시킨 뒤 상온으로 가온시키고 반응 혼합물을 물(20 mL)과 에틸아세테이트(20 mL)로 세 번 추출 반복하였다. 에틸 아세테이트 추출물은 포화 소듐바이카보네이트 수용액, 소금물로 씻어주고 마그네슘설페이트를 이용하여 건조시킨 뒤 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그라피를 통하여 목적물(168 mg, 0.38 mmol, 35.8%)을 분리하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃, δH) 9.98 (d, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.27 (d, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.05 (m, 2H), 5.95 (d, 1H), 4.40 (m, 3H), 4.30 (d, 1H), 4.01 (m, 1H) 1.15 (s, 9H).

< 실시예 4> (2S,3S,4R,5S)-2-(4-아미노-6- 브로모 -5- 카바모일 -1H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -1-일)-5-( 이소부티릴옥시메틸 ) 테트라하이드로퓨란 -3,4- 디일 디아세테이트 ((2S,3S,4R,5S)-2-(4- amino -6- bromo -5- carbamoyl -1H- pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-1-yl)-5-(isobutyryloxymethyl)tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate ) (1d)의 제조

상기 실시예 1의 단계 1 및 단계 2와 동일한 방법으로 수행하여 얻은 화학식 1a의 화합물(257 mg, 0.56 mmol)을 피리딘(3 mL)에 녹인 뒤 무수 아세트산(317 uL, 3.36 mmol)을 가하였다. 상기 반응 혼합물을 40 ℃에서 6시간 동안 교반한 후 물(10 mL)과 에틸 아세테이트(3 × 10 mL)를 이용하여 추출한 후 추출해 낸 에틸 아세테이트층은 포화 소듐바이카보네이트 수용액과 소금물로 씻어준 뒤 마그네슘설페이트로 건조하고 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피를 이용해 목적물(247 mg, 0.45 mmol, 81%)을 분리하였다.

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃, δH) 10.47 (s, 1H), 8.34 (d, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.02 (d, 1H), 5.65 (s, 1H), 5.49 (d, 1H), 5.43 (m, 1H), 4.73 (m, 1H), 4.41 (m, 2H), 2.51 (m, H) 2.21 (d, 3H), 2.12 (d, 3H), 1.13 (m, 3H), 1.08 (m, 3H).

< 실시예 5> ((2S,3S,4S,5S)-5-(4-아미노-6- 브로모 -5- 카바모일 -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -7-일)-3,4- 디하이드록시테트라하이드로퓨란 -2-일) 메틸 벤조에이 트 (((2S,3S,4S,5S)-5-(4- amino -6- bromo -5- carbamoyl -7H- pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl benzoate ) (1e)의 제조

디메틸포름아미드(2 mL)에 벤조일 클로라이드 (232 uL, 2.01 mmol)를 녹인 뒤 0 ℃에서 이미다졸(280 mg, 4.02 mmol)을 추가하였다. 0 ℃에서 2시간 정도 교반하고 피리딘(2 mL)에 녹아있는 상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1a의 화합물(410 mg, 1.00 mmol)을 서서히 투입하였다. 상기 반응 혼합물을 40 ℃에서 몇 시간 동안 가열하고 상온으로 식힌 후 반응의 진행 정도를 HPLC를 통하여 확인하였다. 반응이 완료를 확인한 후 물(20 mL)과 에틸 아세테이트(3 × 20 mL)로 추출하였다. 추출해 낸 에틸 아세테이트 층은 포화 소듐바이카보네이트 수용액과 소금물로 씻어준 뒤 마그네슘설페이트로 건조하고 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피를 이용해 목적물(192 mg, 0.39 mmol)을 분리하였다.

¹H NMR (500 MHz, Acetonitrile-d₃, δH) 10.36 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.01 (d, 2H), 7.65 (m, 1H), 7.51 (m, 2H), 7.08 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 6.20 (s, 1H), 6.06 (d, 1H), 5.83 (s, 1H) 4.73 (m, 1H), 4.64 (m, 3H), 4.31 (s, 1H), 4.24 (d, 1H).

< 실시예 6> ((2S,3S,4S,5S)-5-(4-아미노-6- 브로모 -5- 카바모일 -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -7-일)-3,4- 디하이드록시테트라하이드로퓨란 -2-일) 메틸 프로피오네이트 (((2S,3S,4S,5S)-5-(4- amino -6- bromo -5- carbamoyl -7H- pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl propionate ) (1f)의 제조

프로피오닉산(83 uL, 1.10 mmol)을 피리딘(3 mL)에 녹인 후 0 ℃에서 카보닐디이미다졸(178 mg, 1.10 mmol)를 천천히 가하였다. 0 ℃에서 1.5시간 동안 교반하고 상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1a의 화합물(388 mg, 1.00 mmol)을 피리딘(2 mL)에 녹인 용액에 상기 혼합물을 천천히 가하였고 반응의 진행 정도는 HPLC를 통하여 확인하였다. 반응이 완료된 후 물(20 mL)과 에틸 아세테이트(3 × 20 mL)로 추출하였다. 추출해 낸 에틸 아세테이트 층은 포화 소듐바이카보네이트 수용액과 소금물로 씻어준 뒤 마그네슘설페이트로 건조하고 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피를 이용해 목적물(178 mg, 0.40 mmol)을 분리해 내었다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆, δH) 9.98 (d, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.28 (d, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.08 (d, 1H), 6.04 (s, 1H), 5.98 (d, 1H), 4.41 (m, 3H), 4.31 (d, 1H), 4.03 (dd, 1H), 2.35 (m, 2H), 1.04 (t, 3H).

< 실시예 7> ((2S,3S,4S,5S)-5-(4-아미노-6- 브로모 -5- 카바모일 -7H- 피롤로[2,3-d]피리미딘 -7-일)-3,4- 디하이드록시테트라하이드로퓨란 -2-일) 메틸 사이클로헥실레이트 (((2S,3S,4S,5S)-5-(4- amino -6- bromo -5- carbamoyl -7H- pyrrolo [2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl cyclohexylate ) (1g)의 제조

디메틸포름아미드(1 mL)에 사이클로헥산카복시산 클로라이드 (136 uL, 1.06 mmol)를 녹인 뒤 0 ℃에서 이미다졸(150 mg, 2.20 mmol)을 추가하였다. 0 ℃에서 2시간 정도 교반하고 피리딘(5 mL)에 녹아있는 상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1a의 화합물(388 mg, 1.00 mmol)을 서서히 투입하였다. 반응물은 0 ℃에서 6시간 더 교반 시킨 뒤 상온으로 가온시키고 반응 혼합물을 물(20 mL)과 에틸아세테이트(20 mL)로 세 번 추출 반복하였다. 에틸 아세테이트 추출물은 포화 소듐바이카보네이트 수용액, 소금물로 씻어주고 마그네슘설페이트를 이용하여 건조시킨 뒤 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그라피를 통하여 목적물(184 mg, 0.37 mmol, 37%)을 분리하였다.

¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆, δH) 9.98 (d, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.27 (d, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.08 (d, 1H), 6.04 (s, 1H), 5.99 (m, 1H), 4.40 (m, 2H), 4.32 (d, 1H), 4.02 (td, 1H), 1.25-1.82 (m, 10H).

< 실험예 1> 생체외 ( in vitro ) 키나아제 저해 활성 측정

<1-1> 세포 배양

인간의 간세포암(human hepatocellular carcinoma) 세포주인 SNU-354 세포는 한국의 인간유전체기능연구사업단(The Center for Functional Analysis of Human Genome)으로부터 구하였고 기존의 Cdk 억제제인 올로마우신 및 로즈코비틴은 칼바이오캠(Calbiochem) 회사(San Diego, CA, USA)로부터 구매하였으며, DMSO에 50 mM 농도로 녹여서 -20 ℃에 보관하였다.

SNU-354 세포는 RPMI 1640 배지(Invitrogen, CA, USA)에서 10% FBS(Invitrogen)와 항생제(antibiotics/antimycotics(Invitrogen))를 첨가하여 CO₂ 배양기에서 5% CO₂, 37℃ 조건에서 배양하였다. 이소-피롤로피리미디논 카복사미드은 SNU-354 세포에 10 ~ 50μM(최종 농도)의 농도로 24시간 동안 처리하였다.

<1-2> Cdk1 및 Cdk2 의 저해 활성 측정

본 발명에 따른 화합물이 Cdk 1 및 Cdk2의 활성을 억제하는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<1-2-1> 생체외 키나아제 분석

키나아제 분석 완충액(50 mM 트리스 (pH 7.4), 10 mM 마그네슘클로라이드, 1 mM EGTA, 40 mM β-글리세로포스페이트, 0.1 mM Na₃VO₄, 1 mM DTT, 0.1 μg/ml 류펩틴, 0.1 μg/ml 펩스테틴 A, 0.1 μg/ml 안티파인 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드)에 기질로써 5 μg의 히스톤 H1, 효소(enzyme)로써 20 ng의 Cdk1/cyclin B 또는 40 ng의 Cdk2/cyclin A 재조합 단백질(recombinant proteins)(Upstate, NY, USA), 2.5 μ 큐리(Ci)의 [γ-32P]ATP, 100 μM의 MgAc/ATP를 첨가하여 반응액(reaction volume)은 총 50 ㎕로 맞추고, 상기 실시예 2의 화합물을 넣은 후 키나아제 반응을 30 ℃에서 20분 동안 진행하였다. 반응 후 12%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하고, 방사능사진촬영으로 확인하여 상기 실시예 2 화합물의 농도에 따른 Cdk1 및 Cdk2의 인산화 정도를 도 1, 도 2 및 하기 표 1에 나타내었다.

단, 실험 결과에서 밴드(bands)의 양(intensity)은 밀도측정(densitometry)(GS-800, Bio-Rad)으로 분석하였다.

실시예	농도 (nM)	인산화 정도(%)
		Cdk1	Cdk2
실시예 2	0	100	100
	10	99.4	86.5
	20	92.2	75.0
	40	74.1	59.0
	50	50	50
	60	41.6	43.0
	80	15.3	39.2
	100	4.3	4.5

도 1, 도 2 및 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2의 화합물을 0 nM 처리하였을 때의 Cdk1 및 Cdk2 각각의 인산화 정도를 각각 100%로 간주하였다. 실시예 2의 화합물을 10 nM 처리하였을 때 Cdk1 히스톤 H1의 인산화 정도는 100%로 0 nM일 때와 변화가 없었지만 Cdk2 히스톤 H1의 경우 86.5%로 인산화 정도가 감소하였고, 처리 농도를 20 nM로 증가시켰을 때 Cdk1 및 Cdk2 히스톤 H1의 인산화 정도가 각각 92.2, 75.0%로 감소하는 것을 확인하였다. 실시예 2의 화합물의 처리 농도를 40 ~ 100 nM로 처리했을 때, Cdk1 히스톤 H1의 인산화 정도는 74.1~4.3%로 감소하는 것을 확인할 수 있고, Cdk2 히스톤 H1의 인산화 정도는 59.0~4.5%로 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이는 실시예 2의 화합물 농도에 대해 Cdk1 및 Cdk2의 인산화가 의존적으로 억제된다는 것을 보여주며 이 때, Cdk1 및 Cdk2 각각의 IC₅₀ 값은 50 nM임을 확인할 수 있다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 화합물은 Cdk1 및 Cdk2의 활성을 유의적으로 억제하는 것을 알 수 있다.

<1-2-2> 웨스턴 블랏 분석

SNU-354 세포에 상기 실시예 2의 화합물을 처리한 후 세포 펠렛을 리시스(lysis) 완충액 (0.5% 트리톤 X-100, 20 mM 트리스-염산 (pH 7.5), 2 mM 마그네슘클로라이드, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM β-글리세로포스페이트, 25 mM 소듐플루오라이드, 1 mM Na₃VO₄, 2 μg/ml 류펩틴, 2 μg/ml 펩스테틴 A, 100 μg/ml 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1 μg/ml 안티파인)으로 4 ℃에서 1시간 동안 용해(lysis)시킨 후에 단백질 정량을 한다. 적정량의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 전기영동 한 후 폴리비닐리딘 디플루오라이드 막(Millipore Co., Bedford, MA)에 이동시켰다. 막을 억제 용액(포스페이트에 완충된 염분(PBS), 5% 스킴밀크, 0.1% 트윈-20)에 상온에서 1-2시간 동안 반응시킨 후 억제 용액에 1:1000으로 희석시킨 1차 항체(antibody)(goat anti-phospho-Rb, rabbit anti-nucleolin)를 막에 반응시킨 후 막을 세척완충액(PBST)으로 세척하고 적합한 2차 항체(horseradish peroxidase(HRP)가 결합한)를 상온에서 1시간 반응시키고, ECL(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 용액을 이용하여 감광하여 그 결과를 도 3, 도 4 및 하기 표 2에 나타내었다.

항바이러스	실시예 2의 화합물 처리 후 시간	인산화 정도(%)
p-뉴클레오린(Cdk1)	0	100
	6	96.9
	12	11.7
	18	3.1
	24	3.0
p-Rb(Cdk2)	0	100
	6	3.6
	12	2.7
	18	0.6
	24	0.3

표 2에 나타난 바와 같이, p-뉴클레오린에 대한 Cdk1의 인산화 효과는 12시간 이후부터 급격한 감소를 나타내는 것을 확인할 수 있고, p-Rb에 대한 Cdk2의 인산화 효과는 6시간 이후로 급격히 감소하여 0%에 가까운 인산화 정도를 보임을 확인할 수 있다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 실시예 2의 화합물은 Cdk1 및 Cdk2의 활성을 저해함을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물은 생체 외 키나아제 분석 및 세포 내 웨스턴 블랏 분석을 통해 Cdk1 및 Cdk2의 활성을 강력하게 억제하는 것을 확인하였고 그로 인해 간세포암의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

<1-3> Cdk7 및 Cdk9 의 생체외 키나아제 분석

본 발명에 따른 화합물이 Cdk7 및 Cdk9활성을 억제하는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<1-3-1> 생체외 키나아제 분석

키나아제 분석 완충액에 기질로써 RNA Pol II-CTD-GST protein(Jena Bioscience, Germany), 효소로써 Cdk9/cyclin T1 또는 Cdk7/cyclin H/MAT1 재조합 단백질(Upstate), 2.5μ Ci의 [γ-32P]ATP, 100μM의 MgAc/ATP를 첨가하여 반응액은 총 50ul 로 맞추었고, 키나아제 분석 반응은 30 ℃에서 20분 동안 진행되었다. 반응 후 8%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하였고, 방사능 사진촬영으로 확인하였으며 결과인 실시예 1 및 2의 화합물 농도에 따른 Cdk7 및 Cdk9 인산화 정도를 도 5 내지 도 8 및 하기 표 3에 나타내었다.

단, 실험 결과에서 밴드(bands)의 양(intensity)은 밀도측정(densitometry)(GS-800, Bio-Rad)으로 분석하였다.

	처리한 화합물	처리농도 (nM)	Cdk7 활성	Cdk9 활성
비교군	로즈코비틴 (Roscosvitine)	0	100	100
		10	92.0	55.6
		100	43.4	44.6
		1000	17.4	42.2
처리군	실시예 1의 화합물	0	100	100
		10	41.8	15.8
		100	10.8	1.0
		1000	5.8	0.1
	실시예 2의 화합물	0	100	100
		10	92.2	95.4
		100	91.1	40.5
		1000	6.5	3.3

표 3은 Cdk7 및 Cdk9의 억제제로 이미 알려져있는 로즈코비틴을 비교군으로 설정하고 본 발명에 따른 화합물인 실시예 1의 화합물 및 실시예 2의 화합물을 Cdk7, Cdk9 각각에 처리한 결과이다.

상기 표 3에 따르면, Cdk 억제제로 알려진 로즈코비틴을 10~1000 nM 처리했을 때의 Cdk7의 활성은 92~17.4%, Cdk9의 활성은 55.6~42.2% 범위를 나타내며 감소하는 것에 비해 본 발명에 따른 실시예 1의 화합물을 10~1000 nM 처리했을 때 Cdk7의 활성은 41.8~5.8%, Cdk9의 활성은 15.8~0.1%로 감소하는 것으로 나타나 현재 Cdk의 억제제로 알려진 화합물인 로즈코비틴보다 좋은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명에 따른 실시예 2의 화합물을 10~1000 nM 처리했을 때 Cdk7의 활성은 92.2~6.5%,, Cdk9의 활성은 95.4~3.3% 범위를 나태내머 감소하는 것을 보면 로즈코비틴을 처리하였을 때보다 Cdk7 및 Cdk9 모두 좋은 활성을 가지는 것을 확인할 수 있다. 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 화합물은 Cdk7 및 Cdk9의 활성을 강력히 억제한다는 것을 알 수 있다.

<1-3-2> 웨스턴 블랏 분석

1차 항체(antibody)로서 rabbit anti-phospho RNA Pol II (Ser5), and rabbit anti-phospho RNA Pol II (Ser2) (from Bethyl, TX, USA)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 수행하여 얻은 결과를 도 9 내지 도 12 및 하기 표 4, 표 5에 나타내었다.

	처리한 화합물	처리농도 (nM)	Cdk7 활성
비교군	로즈코비틴 (Roscosvitine)	0	100
		0.1	96.0
		0.5	73.1
		1	51.5
		5	51.6
		10	49.9
		50	4.0
처리군	실시예 1의 화합물	0	100
		0.1	90.1
		0.5	76.3
		1	37.6
		5	3.0
		10	1.7
		50	0.3
	실시예 2의 화합물	0	100
		0.1	88.4
		0.5	44.0
		1	12.7
		5	3.3
		10	1.6
		50	0.6

표 4에 나타난 바와 같이, 비교군인 로즈코비틴은 처리농도를 0~10 nM로 증가시킴에 따라 Cdk7 활성을 저해시키는 정도가 농도 의존적으로 50% 감소한 것에 반해, 실시예 1의 화합물의 경우 처리 농도를 0~50 nM로 증가시킴에 따라 농도 의존적으로 Cdk7의 활성이 감소하는 것을 확인하였고, 10 nM의 농도 이상의 경우 Cdk7의 활성이 거의 0에 가깝게 줄어드는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 발명에 의한 화합물인 실시예 2의 화합물의 처리 농도를 0~50 nM로 증가시킴에 따라 농도 의존적으로 Cdk7의 활성이 줄어들었으며, 특히 5 nM 의 농도부터는 0%에 가까운 활성도를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이는 실시예 2의 화합물에 의한 Cdk7의 활성저하 효과가 매우 뛰어나다는 것을 의미한다. 상기 결과로 인해 본 발명에 따른 실시예 1 및 2의 화합물은 Cdk7의 활성을 저하시키는 효과가 있음을 확인하였다.

	처리한 화합물	처리농도 (nM)	Cdk9 활성
비교군	로즈코비틴 (Roscosvitine)	0	100
		0.1	69.3
		0.5	48.5
		1	38.1
		5	35.7
		10	34.6
		50	2.2
처리군	실시예 1의 화합물	0	100
		0.1	90.4
		0.5	87.0
		1	46.1
		5	1.9
		10	1.3
		50	0.2
	실시예 2의 화합물	0	100
		0.1	81.5
		0.5	27.3
		1	11.0
		5	2.2
		10	1.1
		50	0.7

표 5에 나타난 바와 같이, 비교군인 로즈코비틴의 경우 처리농도를 0~10 nM까지 증가시킴에 따라 Cdk 활성도는 100~34.6% 감소하고 50 nM의 고농도로 처리하였을 때 Cdk9의 활성이 2.2%로 거의 사라짐을 확인할 수 있는 반면, 본 발명에 의한 화합물인 실시예 2의 화합물의 경우 1 nM의 농도로 Cdk9 활성도를 11%로 감소시키며 5 μM을 처리하였을 때엔 0%에 가까운 활성도를 보여 Cdk9 활성이 거의 사라짐을 확인할 수 있다. 이는 실시예 2의 화합물이 Cdk9 활성을 저해하는 효과가 뛰어난 것을 의미하며 실시예 1의 화합물의 경우에도 농도 의존적으로 Cdk9의 활성을 감소시키는 결과를 보였으며 특히 5 μM 이상 처리하였을 때엔 Cdk9의 활성이 거의 사라지는 것을 확인할 수 있다. 상기 결과로부터 본 발명에 다른 화합물은 Cdk 9의 활성을 억제하는 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물은 생체 외 카나아제 분석 및 세포 내 웨스턴 블랏 분석을 통해 Cdk7 및 Cdk9의 활성을 강력하게 억제하므로 간세포암의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

<1-4> Mcl -1, survivin , XIAP 의 mRNA 및 단백질의 양 측정

세포의 생존에 필수적인 분자들인 Mcl-1, survivin, XIAP의 mRNA 및 단백질의 양에 미치는 본 발명에 따른 화합물의 영향을 알아보기 위하여 하기와 같이 웨스턴 블랏 분석 및 RT-PCR 실험을 수행하였다.

<1-4-1> 웨스턴 블랏 분석

1차 항체(antibody)로서 rabbit anti-Mcl-1 (from Santa Cruz Biochemicals, CA, USA), rabbit anti-survivin, rabbit anti-XIAP (from Cell Signaling, MA, USA), rabbit anti-Actin (from Sigma, USA)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 수행하여 얻은 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에서는 실시예 2의 화합물이 SNU-354 세포의 생존에 필수적인 분자들인 Mcl-1, Survivin, XIAP 각각의 단백질 양을 감소시키는 것을 확인할 수 있다. 이는 곧 간세포암인 SNU-354 세포의 세포사멸을 유도하는 결과이며 실시예 2의 화합물이 간세포암 저해활성을 가지고 있다는 것을 의미하는 것이다.

<1-4-2> RT - PCR ( 역전사 - PCR ) 반응

정해진 방법으로 실시예 2의 화합물을 처리한 SNU-354 세포로부터 총 RNA(total RNA)를 추출하였다. 역전사 반응을 위해 5 μg의 추출한 RNA 및 M-MLV 역전사효소(Promega Corporation, WI, USA)를 사용하였다. 역전사 반응은 37 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 95 ℃에서 5분간 반응시켰다. PCR 반응을 위해, 주형(template)으로써 역전사 반응을 통해 획득한 cDNA 5 ㎕와 DNA 중합효소로써 Taq DNA 폴리머라제를 사용하였고, 50 ㎕의 반응부피로 진행하였다. PCR 조건에서, 변성반응을 미리 시키는 과정으로써 95 ℃에서 5분 동안 반응하고, 95 ℃에서 1분/ 56 ℃에서 1분/ 72 ℃에서 1분 반응을 30회 반복하였다. 마지막 합성으로써 72 ℃에서 10분간 반응하였다. PCR이 끝난 후 생성물(PCR products)을 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 분석한 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14의 PCR 검사에서 사용된 Mcl-1에 대한 정방향 프라이머는 5′- CGG TAA TCG GAC TCA ACC TC-3′ 및 역방향 프라이머는 5′-CCT CCT TCT CCG TAG CCA A-3′이고, XIAP에 대한 정방향 프라이머는 5′-AGT GGT AGT CCT GTT TCA GCA TCA-3′, 역방향 프라이머 5′-CCG CAC GGT ATC TCC TTC A-3′이며, survivin에 대한 정방향 프라이머는 5′-TGC CTG GCA GCC CTT TC-3′, 역방향프라이머는 5′-CCT CCA AGA AGG GCC AGT TC-3′이다. 또한, GAPDH에 대한 정방향 프라이머는 5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3′, 역방향 프라이머는 5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′를 사용하였고, 프라이머는 ㈜바이오닉스(Seoul, Republic of Korea)에서 제공받았다.

도 14에서는 실시예 2의 화합물이 SNU-354 세포의 생존에 필수적인 분자들인 Mcl-1, Survivin, XIAP 각각의 단백질 양의 감소가 mRNA 양의 감소(트랜스크립션의 억제)에 의해 발생하는 것 확인할 수 있다. 이는 곧 간세포암인 SNU-354 세포의 세포사멸을 유도하는 결과이며 실시예 2의 화합물이 간세포암 저해활성을 가지고 있다는 것을 의미하는 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물은 SNU-354 세포에서 Mcl-1, survivin, XIAP의 단백질의 양을 감소시켰고 이러한 세포내의 단백질 양의 감소가 상기 단계 2의 RT-PCR 실험을 통해 mRNA양의 감소에 의해 발생하는 것으로 보아 간세포암인 SNU-354 세포에서 Cdk7 및 Cdk9의 활성을 억제시키고 이로 인해 RNA 폴리머라이제 2의 활성이 억제되며 그에 따른 세포 생존에 필수적인 분자들인 Mcl-1, survivin, XIAP의 전사를 억제되므로 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<1-5> HCC 세포의 세포 성장 측정

본 발명에 따른 화합물이 HCC 세포 성장에 끼치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<1-5-1> MTT 분석

MTT 분석을 통해 세포의 생존력(cell viability)을 측정하였다. 세포의 성장곡선 중 로그 기(log phase) 상태에 있는 SNU-354 세포를 24-웰 플레이트에 2×104 세포/웰 농도로 분주하고 24시간 후에 약물(실시예 1의 화합물, 실시예 2의 화합물, 로즈코비틴 또는 올로마우신)을 다양한 농도로 처리하였다. 실험에 적합한 약물 반응시간 후 MTT 시약(PBS에 5 mg/ml의 MTT를 녹인)(Sigma-Aldrich, USA)을 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 그 후 상층액은 제거하고 침전된 포마잔 결정(formazan crystals)을 디메틸설폭사이드로 녹인 다음 바로 엘리사 플레이트 리더(ELISA plate reader)로 흡광도(absorbance)를 측정하여 도 15 및 하기 표 6에 나타내었다.

		세포 생존력(%)
화합물		올로마우신	로즈코비틴	실시예 1의 화합물	실시예 2의 화합물
화합물 농도 (μM)	0	100	100	100	100
	0.5	98.9	95.9	96.4	86.3
	1.0	99.9	92.5	84.3	75.5
	2.0	99.9	94.5	74.0	64.7
	5.0	98.5	87.9	68.0	47.6
	10.0	101.4	84.7	55.6	35.4
	50.0	96.0	61.4	36.6	16.8

표 6에서는, 기존 Cdk 저해제로 사용되고 있는 올로마우신 및 로즈코비틴을 비롯하여 본 발명에 따른 화합물인 실시예 1 및 실시예 2의 화합물의 농도에 따른 SNU-354 세포의 생존력을 나타내었다. 전체적으로 화합물의 농도 의존적으로 세포 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있다. 올로마우신의 경우 최대 농도에서 세포 생존율은 96%로 나타났고, 로즈코비틴의 경우 61.4%, 본 발명에 따른 실시예 1의 화합물의 경우 36.6%, 실시예 2의 화합물 경우 16.8%로 나타나 본 발명에 따른 화합물이 기존 Cdk 저해제로 사용되고 있는 올로마우신 및 로즈코비틴보다 낮은 세포 생존력을 보였다. 이는 본 발명에 따른 화합물에 의한 SNU-354 세포 성장 억제효과가 더욱 강력하다는 것을 의미하며 특히, 실시예 2의 화합물 경우는 16.8%로 가장 낮은 세포 생존율을 나타내어 SNU-354 세포 성장을 가장 강력히 억제하는 것으로 밝혀졌다.

<1-5-2> ³H-티미딘 인코포레이션 분석

SNU-354 세포를 6-웰 플레이트에 5×104 세포/웰 농도로 분주하고 24시간 후 혈청(FBS)을 제거한 배지에 24시간 배양한 후 혈청이 첨가된 배지와 다양한 농도의 실시예 1 및 실시예 2의 화합물 및 1 μCi/ml 트리티에이티드 티미딘 ([³H]dT)(GE Healthcare, UK)과 혈청이 첨가된 배지로 교체하였다. 18 - 24시간 후 차가운 PBS로 세포를 세척하고 차가운 5% 트리클로로아세트산으로 고정한 후 10.25 N 소듐 하이드록사이드로 37 ℃에서 1시간 동안 DNA를 용해시켰다. 세포 내의 DNA 합성과정 동안 인코포레이션(incorporation) 된 [³H]dT을 LSC(liquid scintillation counting) 방법으로 측정하였다. 세포 내의 DNA 합성 정도를 통해 세포의 생존력(cell viability)을 파악하였고 그 결과를 도 16 및 하기 표 7에 나타내었다.

		3H-티미딘 인코포레이션(%)
화합물		올로마우신	로즈코비틴	실시예 1의 화합물	실시예 2의 화합물
화합물 농도 (μM)	0	100	100	100	100
	5.0	99.7	98.2	84.0	50.7
	10.0	96.3	91.0	35.2	20.4
	50.0	77.2	47.2	15.8	8.0

표 7에서는, 기존 Cdk 저해제로 사용되고 있는 올로마우신 및 로즈코비틴을 비롯하여 본 발명에 따른 화합물인 실시예 1 및 실시예 2의 화합물의 농도에 따른 ³H-티미딘 인코포레이션 결과를 나타내었다. ³H-티미딘 인코포레이션이 높을 수록 세포 생존율이 높은 것을 의미한다. 전반적으로 상기 화합물들의 경우 각각 화합물들의 농도가 높아질 수록 세포 성장을 억제하는 효과가 크게 나타남을 확인할 수 있다. 특히, 올로마우신의 경우 최대 농도에서 ³H-티미딘 인코포레이션은 77.2%로 나타났고, 로즈코비틴의 경우 47.2%, 실시예 1의 화합물의 경우 15.8%, 실시예 2의 화합물의 경우는 8%로 나타났다. 이 때 기존 Cdk 저해제로 사용되고 있는 올로마우신 및 로즈코비틴 보다 본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 2의 화합물이 더욱 낮은 ³H-티미딘 인코포레이션 즉, 낮은 세포 생존율을 보였다.이는 본 발명에 따른 화합물에 의한 SNU-354 세포 성장 억제효과가 더 큰 것을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물은 기존의 다른 Cdk 억제제들에 비해 더 강력히 SNU-354 세포의 세포성장을 억제하기 때문에 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

<1-6> HCC 세포의 세포사멸 효과 확인

본 발명에 따른 화합물이 HCC 세포의 세포사멸을 유도하는지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

<1-6-1> 웨스턴 블랏 분석

1차 항체(antibody)로서 rabbit anti-PARP를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 수행하여 얻은 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17에서는 PARP의 절단 확인을 통해 실시예 1의 화합물 및 실시예 2의 ㅎ화합물 모두 SNU-354 세포의 세포사멸을 유도한다는 것을 알 수 있다. 특히 실시예 2의 화합물의 경우, 처리한 후 6시간이 지나면서 PARP의 절단을 확인할 수 있고 실시예 1의 화합물의 경우, 12시간이 지나면서부터 PARP의 절단을 확인할 수 있어 실시예 2의 화합물에 의한 세포사멸 효과가 더 크다는 것을 알 수 있다.

<1-6-2> 카스파제-3(caspase-3)의 활성 측정

실시예 1 및 실시예 2의 화합물을 처리한 SNU-354 세포를 리시스(lysis) 완충액(0.5% 트리톤 X-100, 20 mM 트리스-염산 (pH 7.5), 2 mM 마그네슘 클로라이드, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM β-글리세로포스페이트, 25 mM 소듐플루오라이드, 1 mM Na₃VO₄, 2 μg/ml 류펩틴, 2 μg/ml 펩스테틴 A, 100 μg/ml 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1 μg/ml 안티파인)으로 용해 하였다. 반응에 필요한 프로티아제 분석 완충액(20 mM HEPES (pH 7.5), 10% 글리세롤, 2 mM DTT)에 기질로써 20 μM Ac-DEVD-AMC (BD Biosciences, CA, USA)와 세포 용해물(lysates)을 혼합하여 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 분광형광계(spectrofluorometer)(TECAN, Switzerland)로 380 nm의 여기(excitation) 파장과 460 nm의 방출(emission) 파장 조건에서 카스파제-3(caspase-3)의 활성을 측정하여 도 18 및 하기 표 8에 나타내었다.

		카스파제-3 활성
		실시예 1의 화합물	실시예 2의 화합물
화합물 농도 (μM)	0	1.0	1.0
	0.1	1.0	0.9
	0.5	1.0	7.0
	1.0	3.3	10.4
	5.0	8.2	11.1
	10.0	11.4	11.6
	50.0	8.0	6.5

표 8에서는, 실시예 1 및 실시예 2의 화합물의 농도 변화에 따른 카스파제-3 활성을 나타내었다. 두 가지 화합물 모두 10.0 μM의 농도에서 가장 높은 카스파제-3 활성을 보였다. 실시예 1의 화합물은 1.0 μM부터 대조군의 3배로 활성을 나타내기 시작하였고 실시예 2의 화합물은 0.5 μM 부터 대조군의 7배로 활성을 나타내기 시작했으며 두 화합물 모두 농도 의존적으로 카스파제-3의 활성이 증가함을 보였다.

<1-6-3> FACS 분석

SNU-354 세포를 90 mm 접시에 씨딩 후 적당한 농도의 실시예 1 및 실시예 2의 화합물을 24시간 동안 처리하였다. 세포를 모아서 차가운 PBS로 세척한 후 500 ㎕의 차가운 70% 에탄올을 4 ℃에서 밤샘 반응시켜 세포를 고정하였다. 그 후 세포를 500 ㎕의 PBS로 세 번 세척하고, 50 μg/ml의 프로피디움 아이오다이드(PI)와 50 ㎕의 1 mg/ml 알앤에이즈 A가 첨가된 500 ㎕의 PBS를 상온에서 30분 동안 어두운 조건에서 반응시켰다. PI가 염색된 세포의 형광을 FACS 칼리버 플로우 시토미터(caliber flow cytometer)와 세포 퀘스트 프로그램(Cell Quest program)(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, CA, USA)을 이용하였다. 또한, FACS 분석을 통해 실시예 1 및 실시예 2의 화합물에 의한 HCC SNU-354 세포의 sub G1 비율 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 19, 도 20 및 하기 표 9, 표 10에 나타내었다.

		sub G1 비율(%)
		실시예 1의 화합물	실시예 2의 화합물
화합물 농도 (μM)	0	3.0	3.0
	0.1	2.7	3.8
	0.5	3.2	39.6
	1	3.5	52.0
	5	28.1	69.8
	10	64.2	72.6
	50	71.1	73.1

표 9에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 화합물의 경우 5 μM의 농도에서 급격한 sub G1의 비율의 상승을 나타내고 실시예 2의 화합물의 경우 0.5 μM의 농도에서 급격한 sub G1의 비율의 상승을 보인다. 이는 상기 농도에서부터 SNU-354 세포의 사멸을 급격하게 유도하는 것을 나타낸다.

		sub G1 비율(%)
		실시예 1의 화합물	실시예 2의 화합물
시간(h)	0	10.3	10.3
	6	29.1	51.6
	12	51.8	67.6
	18	71.7	72.3
	24	78.1	81.2

표 10은 실시예 1 및 실시예 2의 화합물 각각을 50 μM 농도로 유지했을 때 시간에 따른 sub G1의 비율을 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 두 가지의 화합물 모두 시간 의존적으로 sub G1 비율이 증가함을 확인할 수 있고 이는 시간 의존적으로 세포 사멸이 유도됨을 의미하는 것이다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물은 HCC SNU-354 세포의 세포사멸을 유도하기 때문에 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 2> 동물 실험

<2-1> SNU -354 암 이종이식( xenograft )

5-6주령 된 수컷 누드 쥐를 한국(Republic of Korea)의 ㈜중앙실험동물 회사로부터 구입하였고, 쥐는 서울대학교 약학대학 실험동물실에서 사육하였다. 모든 동물 실험은 서울대학교 실험동물자원관리원에서 정해놓은 방침에 따라 수행하였다. 인간 간세포암 세포주인 SNU-354 세포 1×10⁷개를 PBS 200 ㎕에 혼합하여 쥐의 오른쪽 앞발 아랫부분에 피하주사법(subcutaneous injection)으로 주입하였고, 이종이식 암의 크기가 100 ± 30 mm³ 될 때까지 관찰하였다. 적합한 크기로 암이 자란 쥐를 3그룹(n=8)으로 나누어, 한 그룹은 대조군(vehicle)으로 하였고 다른 두 그룹은 각각 실시예 2의 화합물을 4 mg/kg과 20 mg/kg씩 1회/일 3주 동안(5회/주) 복강내주사법(intraperitoneal injection)으로 투여하였다. 대조군은 5% 에탄올과 30% 폴리에틸렌 글라이콜 200(Fluka, Netherlands)을 처리하였다. 약물 투여일정은 데이터에 표시해 두었고, 암의 크기가 약 2000 mm³ 될 때까지 매일 암의 크기 및 동물의 몸무게와 동물의 상태를 측정하였다. 암의 크기는 V = a×b×c×π/6 (a = tumor의 긴축, b = tumor의 짧은 축, c = tumor의 높이)로 계산하였다. 약물 투여 33일 후에 동물들을 안락사시켰고, 이종이식 암과 간을 적출하여 무게 및 크기를 측정한 결과를 도 21 및 도 22에 나타내었다. 이로 인해, 실시예 2의 화합물 농도에 의한 몸무게의 변화는 없음을 알 수 있었으나(도 21), 대조군(Vehicle 투여군)에 비하여 실시예 2의 화합물 투여군(4 mg/kg/day, 20 mg/kg/day)에서 이종이식 암의 성장이 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있다(도 22). 특히, 실시예 2의 화합물을 4 mh/kg/day 농도로 투여한 그룹은 암의 성장이 대조군에 비해 평균 15% 감소하였고, 20 mg/kg/day 농도로 투여한 그룹은 대조군에 비해 평균 47% 감소하였다.

또한, 적출한 조직들을 이용하여 TUNEL 분석 및 면역조직화학(immunohistochemistry)을 수행하였다.

<2-2> 카스파제 -3의 면역조직화학( immunohistochemistry ) 및 TUNEL 분석

적출한 모든 이종이식 암과 간 조직을 36% 포름알데하이드 용액(Junsei Chemical Co., Ltd, Tokyo, JAPAN)으로 고정하고, 파라핀으로 임베딩(embedding)하였다. 5 μm 로 절단하여 절편을 만들고, 상기 절편을 이용하여 H&E 염색 및 세포사멸 현상을 위한 TUNEL 분석, 끊어진 카스파제-3(cleaved caspase-3) 단일항체(Cell Signaling, MA, USA)를 통해 조직 내의 끊어진 카스파제-3의 발현 양을 측정하였다. 면역학적 감광을 위해 ABC 퍼옥시다제(Dako Cytomation California, Inc., CA, USA) 레이블링(labeling)을 수행한 결과를 도 23에 나타내었다. 도 23-A에서는, TUNEL 양성 스팟과 카스파제-3 양성 스팟이 대조군보다 실시예 2의 화합물을 투여한 군에서 많이 발생하였고 또한 고농도 투여군(20 mg/kg)에서 더욱 증가함으로 인해 실시예 2의 화합물 투여를 통한 이종이식 암의 성장 억제가 세포 사멸을 통해 유도된다는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 23-B는 실시예 2의 화합물이 정상적인 간 조직에도 영향을 미쳤는지 확인하기 위해 대조군 및 실시예 2의 화합물 투여군 모두에서 간 조직을 적출하여 상기 도 23-A와 같이 TUNEL 분석 및 카스파제-3의 면역조직화학분석을 수행한 결과이다. 이종이식 암이 아닌 간 조직에서는 세포 사멸의 결과를 전혀 확인할 수 없었으며 이로 인해 실시예 2의 화합물은 정상적인 간 조직이 아닌 이종이식 암에만 영향을 미쳤음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물은 간 조직에만 선택적인 작용을 하기 때문에 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 3> 플로우 시토메트리 분석

SNU-354 세포를 90 mm 접시에 씨딩 후 대조군 및 상기 실시예 2 내지 6의 화합물을 각각 10 uM씩 24시간 동안 처리하였다. 세포를 모아서 차가운 PBS로 세척한 후 500 ㎕의 차가운 70% 에탄올을 4 ℃에서 밤샘 반응시켜 세포를 고정하였다. 그 후 세포를 500 ㎕의 PBS로 세 번 세척하고, 50 μg/ml의 프로피디움 아이오다이드(PI)와 50 ㎕의 1 mg/ml 알앤에이즈(RNase) A가 첨가된 500 ㎕의 PBS에 상온 및 30분 동안 어두운 조건에서 반응시켰다. PI가 염색된 세포의 형광을 FACS caliber 플로우 시토미터 및 Cell Quest program(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, CA, USA)을 이용하여 측정하였다. 또한, FACS 분석을 통해 상기 화합물들에 의한 SNU-354 세포의 sub G1 비율 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 24 및 하기 표 11에 나타내었다.

화합물	sub G1 비율 변화
대조군	1.0
실시예 2의 화합물	5.9
실시예 3의 화합물	5.7
실시예 4의 화합물	5.5
실시예 5의 화합물	6.0
실시예 6의 화합물	5.9

표 11에서 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 본 발명에 따른 화합물은 세포 사멸 유도 효과가 매우 좋은 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서 특히 본 발명에 따른 화합물인 실시예 2, 5 및 6의 화합물이 5.5배 이상의 비율 변화를 나타내어 세포사멸 효과가 보다 뛰어남을 보여준다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물은 SNU-354 세포의 사멸 효과가 뛰어나므로 간세포암의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.

< 실험예 4> 카스파제 -3 활성의 측정

실시예 1 내지 6의 화합물을 각각 처리한 SNU-354 세포를 리시스(lysis) 완충액(0.5% 트리톤 X-100, 20 mM 트리스-염산 (pH 7.5), 2 mM 마그네슘클로라이드, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM β-글리세로포스페이트, 25 mM 소듐플루오라이드, 1 mM Na₃VO₄, 2 μg/ml 류펩틴, 2 μg/ml 펨스테틴 A, 100 μg/ml 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1 μg/ml 안티파인)로 용해 하였다. 반응에 필요한 프로티아제 분석 완충액(20 mM HEPES (pH 7.5), 10% 글리세롤, 2 mM DTT)에 기질로써 20μM Ac-DEVD-AMC (BD Biosciences, CA, USA)와 셀 용액을 혼합하여 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 분광형광계(spectrofluorometer)(TECAN, Switzerland)로 380 nm의 excitation 파장과 460 nm의 emission 파장 조건에서 카스파제-3 활성을 측정한 결과를 도 25 및 하기 표 12에 나타내었다.

화합물	농도 (μM)	카스파제-3 활성
실시예 1의 화합물	5	8.4
	10	8.1
실시예 2의 화합물	5	9.7
	10	11.0
실시예 3의 화합물	5	8.2
	10	7.8
실시예 4의 화합물	5	5.1
	10	7.0
실시예 5의 화합물	5	9.0
	10	10.3
실시예 6의 화합물	5	10.7
	10	11.7

표 12에 나타난 바와 같이, 상기 화합물들의 농도를 5, 10 μM 씩 투여하였을 때 카스파제-3의 활성은 실시예 1의 화합물 및 실시예 3의 화합물을 제외하고는 농도를 증가시켰을 때 활성 또한 증가하였다. 특히, 실시예 2, 실시예 5 및 실시예 6의 화합물의 활성이 10 이상으로 나타나 뛰어난 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명에 따른 화합물은 SNU-354 세포 활성을 저해하므로 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체는 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

< 제제예 1> 약학적 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 2 g

유당 1 g

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

1-2. 정제의 제조

피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

1-3. 캅셀제의 제조

피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

1-4. 주사제의 제조

피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

1-5. 액제의 제조

피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 100 ㎎

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액체를 제조한다.

Claims (10)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
   [화학식 1]
   

   

   
   (상기 화학식 1에서,
   R¹은 수소 또는 R³C(=O) 이고;
   R³은 C₁~C₆의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C₃~C₈의 시클로알킬 또는 페닐이고;
   R²는 수소 또는 아세틸기이다.)
   
2. 제 1항에 있어서,
   상기 R³는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, t-부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 또는 페닐인 것을 특징으로 하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
   
3. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
   (1) 4-아미노-6-브로모-1-((2S,3R,4R,5S)-3,4-디하이드록시-5-(하이드록시메틸)-테트라하이드로퓨란-2-일)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카복사마이드;
   (2) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 이소부티레이트;
   (3) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 피발레이트;
   (4) (2S,3R,4S,5S)-2-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-5-(이소부티릴옥시메틸)-테트라하이드로퓨란-3,4-디일 디아세테이트;
   (5) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 벤조에이트;
   (6) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 프로피오네이트; 및
   (7) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 사이클로헥산카복실레이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
   
4. 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
   화학식 2의 화합물에 BSA를 가한 후 TMSOTf 존재하에 화학식 3의 화합물을 추가하여 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계(단계 1);
   화학식 4의 화합물에 암모늄하이드록사이드 용액을 가하여 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계(단계 2); 및
   화학식 5의 화합물에 과산화수소를 가하여 화학식 1a의 화합물을 제조하는 단계(단계 3)를 포함하는 제 1항의 신규 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법:
   [반응식 1]
   

   

   .
   
5. 제 4항에 있어서, 상기 화학식 1a의 화합물은 하기 반응식 2에 나타난 바와 같이,
   에스터화 반응을 통해 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있는 제 1항의 신규 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법:
   [반응식 2]
   

   

   .
   (상기 반응식 2에서,
   R¹ 및 R²는 제 1항에서 정의한 바와 같다.)
   
6. 제 4항에 있어서, 상기 출발물질인 화학식 2의 화합물은 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이,
   화학식 6의 화합물인 테트라시아노에틸렌을 아세톤과 에틸아세테이트 존재하에 하이드로겐브로마이드를 가하여 화학식 7의 화합물을 제조하는 단계(단계 1); 및
   화학식 7의 화합물에 트리에틸올소포메이트 및 암모니아수를 가하여 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계(단계 2)를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 제 1항의 신규 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법:
   [반응식 3]
   

   

   
   
7. 제 4항에 있어서, 화학식 3의 화합물은 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이,
   화학식 8의 L-자일로스를 붕산과 반응시킨 후 아세트산 및 무수 아세트산을 가하여 고온에서 반응시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제 1항의 신규 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법:
   [반응식 4]
   

   

   .
   
8. 제 1항의 신규 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
9. 제 8항에 있어서, 상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 Cdk 저해작용을 가지는 것을 특징으로 하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
10. 제 9항에 있어서, 상기 Cdk는 Cdk1, Cdk2, Cdk7 및 Cdk9를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
    
    
    
    
    

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