KR20120042083A

KR20120042083A - 홍마늘 추출물을 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20120042083A
Application number: KR1020100103571A
Authority: KR
Inventors: 강다원; 성낙주; 신정혜; 한재희
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2010-10-22
Filing date: 2010-10-22
Publication date: 2012-05-03
Also published as: WO2012053862A2; WO2012053862A3; KR101239591B1

Abstract

본 발명은 홍마늘 추출물을 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 홍마늘 추출물이 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제시키므로 상기 홍마늘 추출물을 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

홍마늘 추출물을 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition for preventing or treating diseases induced respiratory cell death comprising extract of aged red garlic}

본 발명은 홍마늘 추출물을 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 담배연기 흡입으로 인한 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 조성물에 관한 것이다.

담배연기는 이 세상에서 존재하는 가장 복잡한 구조의 혼합물 가운데 하나로 담배에 불을 붙여 피우게 되면 약 4,000가지 이상의 물질이 생성되며 이것은 공기중 산소의 양과 기온에 따라 다양하게 나타난다. 이러한 담배연기를 사람이 한 번 들이 마실 때에 약 50cc정도의 담배연기가 식도 및 기관지를 거쳐 폐속으로 들어가게 되는데 그 중 일산화탄소(CO) 전량과 니코틴(Nicotine)의 90％, 타르(Tar)의 70％가 몸속으로 흡수되며, 그 외에도 담배연기에는 페인트 제거에 사용되는 아세톤, 최루탄에 사용되는 포름알데히드, 방부제에 사용되는 나프티라민, 로켓연료에 사용되는 메타놀, 발암물질인 디메칠니트로사민, 좀약에 사용되는 나프 타린, 자동차의 배터리에 사용되는 카드늄, 자동차 배기가스 중 독성가스인 카본 모노사이드, 발암물질인 벤조피렌, PVC의 원료인 비닐크롤라이드, 청산가리, 암모니아, 산업용 용제에 사용되는 우레탄, 비소, 부탄, 폴로늄, 살충제인 DDT 등 약 4,000여 가지의 화학적 성분이 포함되어 있고, 이 중 40가지 정도는 암을 유발하는 발암물질로 알려져 있다.

이와 같이, 담배연기에는 발암물질을 비롯하여 다양한 종류의 물질을 포함하고 있어 흡연자 뿐만 아니라, 흡연자 주변에서 담배연기를 흡입하게 되는 간접 흡연자에게도 악영향을 미치게 된다. 담배연기를 흡입함으로써 발생하는 대표적인 질환은 폐기종, 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐암 등의 호흡기 질환이다.

한편, 마늘(Allium sativum L.)은 전국에서 재배되는 다년생 초본으로서 그 인경을 약재 또는 식품 재료로 널리 사용하며, 그 구성 성분으로는 칼슘, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 C 등의 성분이 알려져 있으며, 항암작용, 항진균 작용, 항원충작용 등이 보고된 바가 있다. 이러한 마늘은 생으로 섭취하는 것이 영양 및 그 효과면에서 가장 바람직하나, 마늘 특유의 냄새와 매운맛으로 인해 생으로 섭취하기가 상당히 곤란하였다. 최근에는 이러한 생마늘의 냄새와 맛을 개선하기 위하여 생마늘을 특정 조건에서 특정시간 동안 숙성시킨 흑마늘, 홍마늘 등이 제조되고 있다.

홍마늘은 특정온도에서 특정시간 동안 생마늘을 숙성함으로써 제조된 마늘가공품으로서, 본 발명자에 의해 제조되었다. 홍마늘은 생마늘에 비하여 맛과 향이 개선되어 섭취가 용이하고, 기존의 생마늘 가공품인 흑마늘보다 제조시간이 단축되어 오랜 숙성기간 동안 발생할 수 있는 유해물질의 발생 가능성이 감소된다.

이와 같이, 생마늘 또는 가공된 마늘에 대한 다양한 약리활성이 보고되어 있으나, 생마늘 또는 가공된 마늘이 담배연기의 흡입으로 인한 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 호흡기 질환의 치료효과를 가지고 있음은 아직까지 보고된 바 없다.

본 발명자는 홍마늘 추출물이 담배연기에 의한 인간 기관지 평활근 세포의 사멸을 방지하는 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은 하나의 양태로서, 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 홍마늘은 기존의 생마늘을 특정조건 및 특정시간 동안 숙성시킴으로써 생마늘 특유의 냄새 및 매운 맛을 개선시킨 적갈색을 띄는 중간숙성 마늘로서 하기의 방법으로 제조되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

먼저 각각의 생마늘 조각들을 400W-600W의 전자레인지에서 5분간 가공한 후, 스테인레스 스틸 팬을 사용하여 마늘이 위치하는 높이가 아래로부터 4cm 미만이 되도록 고정하였다. 그 후, 팬을 인큐베이터에 넣은 후 90℃의 온도, 60%의 습도에서 24시간 동안 숙성하였다. 24시간 후, 온도와 습도를 각각 50℃, 50%로 감소시킨 후 마늘 조각들을 30시간 동안 더 숙성하였다. 이후, 12시간동안 50℃, 30시간동안 5℃, 36시간동안 70℃의 온도에서 더 숙성하였다. 숙성한 후, 30분내 온도를 40℃로 낮추고난 후 다시 30시간 동안 숙성과정을 진행하여 홍마늘을 제조하였다.

본 발명은 홍마늘로부터 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는데, 홍마늘 추출물을 얻기 위한 추출방법에는 제한이 없다.

구체적으로, 생마늘로부터 제조된 홍마늘을 무기용매 또는 유기용매 추출을 통해 홍마늘 추출물을 얻을 수 있다. 본 발명의 홍마늘 추출물은 바람직하게는 열수 추출법에 의해 추출할 수 있다.

무기용매 추출하는 경우, 제조된 홍마늘의 껍질을 벗기고 으깬 후, 10배 부피의 증류수와 혼합하고, 60℃ 이상, 바람직하게는 70℃ 이상의 온도에서 7시간 이상, 바람직하게는 8시간 이상 가열하고, 가열된 혼합물을 여과하여 추출할 수 있다. 이때, 70℃보다 높은 온도에서 가열하는 경우 시간은 줄어들지만 유효성분이 파괴되어 손실될 수 있고, 60℃ 보다 낮은 온도에서 가열하게 되면 혼합물의 유효성분이 완전 추출되지 않을 수 있다.

또한, 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 추출 유기용매도 이용될 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 등의 알코올, 아세톤, 헥산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합물을 이용할 수 있고, 가장 바람직하게는 1,3-부틸렌글리콜을 이용하여 실온에서 또는 가온하여 추출할 수 있다.

최종 추출물은 부유하는 고체입자를 제거하기 위하여 나일론 등의 필터를 이용하거나 냉동여과법에 의해 여과시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물 뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 홍마늘 추출물에 포함되는 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명의 홍마늘 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

상기 호흡기 세포는 호흡을 담당하는 코, 입, 기관지, 폐, 폐포 또는 가로막(횡경막) 등의 기관을 구성하는 세포로서, 바람직하게는 기관지, 폐, 폐포를 구성하는 평활근 세포이며, 보다 바람직하게는 기관지 평활근 세포이다.

상기 평활근은 장방추형의 근세포로 횡문이 없고 불수의근으로 내장기관에서 내용물을 이동하는 벽의 율동적 수축 활동을 하며, 식도에서 직장까지의 관벽, 기관지, 호흡기의 통로, 기관벽, 방광벽, 맥관벽, 생식기관의 대부분, 안구의 모양근, 동공 괄약근 등을 구성한다.

평활근은 평활근 세포로 구성되어 있는데, 상기 기관지 평활근 세포는 기관지 평활근을 구성하는 세포로서 기관지 평활근 세포가 사멸하게 되면 기도변형(airway remodeling) 등이 야기되어 여러 가지 호흡기 질환이 발병하게 되는 등 호흡기에 심각한 기능손실을 초래하게 된다.

상기 호흡기 세포의 사멸은 호흡기 세포의 죽음을 의미하며, 세포괴사, 아포토시스, 네크로시스 등을 포함하며, 바람직하게는 담배연기 흡입으로 인한 호흡기 세포의 아포토시스, 세포괴사, 네크로시스 등의 호흡기 세포 사멸일 수 있다.

담배연기는 담배에 불을 붙여 피우게 되면 발생하는 약 4,000가지 이상의 화학물질을 포함하는 기체로서 공기 중 산소의 양과 기온에 따라 다양한 성분이 혼합된 담배연기가 발생하며, 코와 입을 통하여 호흡기로 흡입되어 호흡기 세포의 사멸을 초래한다.

담배연기 흡입으로 인한 호흡기 세포의 사멸은 담배연기가 코와 입을 통하여 호흡기에 도달하게 되면 담배연기에 포함된 유해한 화학성분에 의해 호흡기 세포의 사멸이 일어난다. 본 발명의 실험예 1을 보면 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포의 생존율이 급격하게 감소함을 알 수 있다(실험예 1 및 도 1의 A).

호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환은 정상적인 기능을 하고 있는 호흡기 세포가 사멸함에 따라 호흡기에 심각한 기능손실이 발생하여 발병하는 호흡기 질환을 의미하며, 기관지 천식, 폐기종(폐섬유화증), 만성 폐쇄성 폐기종, 소엽중심성 폐기종(centrilobular emphysema), 방선방성 폐기종(panacinar pulmonary emphysema), 급성 기관지염, 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 기관지염, 급성 호흡곤란 증후군(Acute respiratory distress syndrome), 반응성 호흡관 질환, 낭포성 섬유증, 기관지확장증, 후천성 기관지확장증, 카르타게너 증후군(Kartagener's syndrome), 선천성무기폐(apneumatosis), 급성 선천성무기폐, 만성 선천성무기폐, 폐렴, 본태성 혈소판감소증, 레지오넬로시스병(legionellosis), 앵무새병 (parrot disease), 섬유조직형성 규소폐증(pneumoconiocis), 폐의 과민성, 만성 폐쇄성 폐질환 및 특발성 침습성 폐 장애 (idiopathic invasive lung disorder) 등을 포함한다.

상기 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환은 바람직하게는 폐기종, 소엽중심성 폐기종, 방선방성 폐기종, 기관지염, 만성 기관지염, 만성 폐쇄성 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환 또는 폐암일 수 있으며, 보다 바람직하게는 기관지염, 만성 기관지염, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐질환 또는 폐암일 수 있다.

상기 기관지염, 만성 기관지염, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐질환 및 폐암은 흡연이 직접적인 원인으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 담배연기 흡입으로 인한 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 기관지염, 만성 기관지염, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐질환 및 폐암 등의 호흡기 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물 또는 약학적 조성물을 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환이 발병한 또는 발병 가능성이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 치료방법이 제공된다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 홍마늘 추출물은 담배연기에 노출된 인간 기관지 평활근 세포의 생존율을 높이고, 궁극적으로 세포의 증식을 유도하며(실험예 1 및 도 1의 C 내지 F, 도 2의 D), 담배연기에 의한 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 효과(실험예 3 및 도 2의 A)를 보였다. 따라서, 홍마늘 추출물은 담배연기 흡입으로 인한 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, 본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "개체"란 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.

본 발명의 조성물로 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환을 앓고 있는 인간에게 투여함으로써 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 본 발명의 조성물이 약학적 조성물인 경우, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 조성물은 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호로몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 즉, 본 발명의 홍마늘 추출물을 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 첨가할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강 식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태에 해당한다.

본 발명의 홍마늘 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있으며, 이들 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 조성물을 제공한다.

상기 글루타티온(Glutathione, GSH)은 글루타메이트(glutamate), 시스테인(cystein), 글라이신(glycine)의 세가지 아미노산으로 구성된 트리펩타이드로 동물, 식물 및 미생물의 세포내에서 0.1~10mM의 농도로 존재하는 생리활성물질이다. 생체 내에서 글루타티온은 백혈구 생성을 통한 면역 활성 증가를 야기함으로써 중요한 항바이러스제의 역할, GST(glutathione S-transferase)의 기질로 작용하여 생체에 해로운 비생체물질(xenobiotics)과 같은 독성물질과 콘쥬게이션되어 해독 작용에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 실험예에 따르면 담배연기에 의한 인간 기관지 평활근 세포의 사멸은 카스페이즈의 활성을 수반하고(실험예 2 및 도 1의 B), 세포내 글루타티온의 농도를 감소시킴을 알 수 있으며(실험예 3 및 도 2의 A), 카스페이즈-3의 활성은 글루타티온의 고갈과 관련되어 있음이 알려져 있다.

결국, 글루타티온의 호흡기 세포내 농도가 감소하면 호흡기 세포의 사멸이 일어나고, 기관지염, 폐포염, 폐기종 등의 호흡기 질환을 야기하게 된다.

따라서, 호흡기 세포내 글루타티온의 농도의 감소를 억제하는 본 발명의 조성물은 글루타티온의 호흡기 세포내 농도 감소와 관련되는 상기 질환들의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 효과를 나타내므로 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 및 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1의 A는 다양한 농도의 담배연기 추출물(CSE)이 인간 기관지 평활근 세포의 생존에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 1의 B는 인간 기관지 평활근 세포에 10%의 담배연기 추출물을 처리한 경우 아포토시스가 일어난 세포를 보인 사진이다.
도 1의 C는 0.01%, 0.1% 및 1% 농도의 생마늘(FRG), 흑마늘(ABG) 또는 홍마늘(ARG)을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 각각 처리한 경우 세포 생존율의 변화를 대조군과 비교한 도면이다.
도 1의 D는 다양한 농도의 홍마늘을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 처리한 경우 세포 생존율의 변화를 보인 도면이다.
도 1의 E 및 F는 다양한 농도의 홍마늘 추출물 투석 내액(IM solution) 및 투석 외액(OM solution)을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 처리한 경우 세포 생존율의 변화를 보인 도면이다.
도 2의 A는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물, L-BSO, GSH를 처리한 경우 세포내 GSH의 농도 변화를 보인 도면이다.
도 2의 B는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물을 처리한 경우 ROS 생성을 보인 사진이다.
도 2의 C는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물 또는 NAC를 처리한 경우 HO-1의 발현 수준의 변화를 보인 도면이다.
도 2의 D는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물, L-BSO, GSH를 처리한 경우 세포 생존율의 변화를 보인 도면이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험재료의 준비

1-1. 세포배양

인간 기관지 평활근 세포(human bronchial smooth muscle cells, PromoCell GmbH, Germany로부터 구입)를 PromoCell사의 설명서에 따라 0.5ng/ml 표피생장인자(epidermal growth factor), 2ng/ml 염기성 섬유모세포 생장인자(basic fibroblast growth factor), 5μg/ml 인슐린, 5% 소태아 혈청(fetal calf serum), 50μg/ml 암포테리신 B(amphotericin B), 및 50ng/ml 젠타마이신을 첨가한 평활근 세포 기저 배지에서 5% CO₂를 포함하는 37℃온도의 가습공기에서 배양하였다. 배양배지는 2일마다 교체하였다.

1-2. 담배연기 추출물의 제조

담배연기 추출물 Nana-Sinkam의 방법에 따라 제조하였다(Nana-Sinkam SP, et al., 2007. Prostacyclin prevents pulmonary endothelial cell apoptosis induced by cigarette smoke. Am J Respir Crit Care Med 175(7):676-685). 먼저, 필터가 없는 카멜 담배(Camel cigarette, R.J. Reynolds, USA) 하나를 100%의 담배연기 추출물을 생산하는 진공펌프를 사용하여 포스페이트 버퍼 살린(phosphate-buffered saline, PBS) 10ml에 통과시켰다. 이 100% 담배연기 추출물을 pH가 7.4가 되도록 하고, 박테리아 및 불순물을 제거하기 위하여 0.2μm 공극필터(Minisart, Germany로부터 구입)를 통과시켜 여과시켰다.

추출된 담배연기 추출물을 적절한 농도로 희석하였고, 담배연기 추출물이 제조된지 10분 안에 인간 기관지 평활근 세포에 첨가하였다.

1-3. 홍마늘의 제조를 위한 숙성

생마늘은 남해에서 수확한 것을 사용하였다. 생마늘 및 흑마늘은 서남해 농협에서 운영하는 마늘 가공공장으로부터 공급받아 생마늘 내부를 적갈색으로 변화시키는 온도와 시간을 조절할 수 있는 챔버에서 숙성시켰다. 홍마늘의 숙성과정을 살펴보면, 먼저 각각의 생마늘 조각들을 전자레인지(400W-600W)에서 5분간 가공한 후, 스테인레스 스틸 팬을 사용하여 마늘 조각이 위치하는 높이가 4cm 미만이 되도록 고정하였다.. 그 후, 팬을 인큐베이터에 넣은 후 90℃의 온도, 60%의 습도에서 24시간 동안 숙성하였다. 24시간 후, 온도와 습도를 각각 50℃, 50%로 감소시킨 후 생마늘 조각들을 30시간 동안 더 숙성하였다. 이후, 12시간 동안 50℃의 온도, 30시간 동안 5℃의 온도, 36시간 동안 70℃의 온도에서 더 숙성하였다. 숙성 후, 30분안에 온도를 40℃로 낮추고 다시 30시간 동안 숙성과정을 진행하여 홍마늘을 제조하였다..

1-4. 마늘 열수 추출물의 제조

모든 마늘조각의 껍질을 벗기고 으깨었다. 으깬 생마늘, 흑마늘, 홍마늘을 10배 부피의 DW 용액(100g/1000ml)과 혼합한 후 70℃ 온도의 물에서 8시간 동안 추출하였다.

잔류물을 같은 조건으로 세 번 재추출하였다. 열수 마늘 추출물을 Whatman 여과지(Grade No. 2, Whatman International Ltd, UK로부터 구입)를 통과시켜 여과한 후, 동결건조하여 파우더 형태의 분말로 만든 후 분석하기 전까지 영하 40℃의 온도에서 저장하였다. 건조된 마늘 분말을 DW 용액에 용해시킴으로써 농도를 조절하였다.

1-5. 수용성 갈변물질( water soluble browning reaction products )의 분리

DW 용액에 용해된 홍마늘 추출물을 투석용 백(molecular weight cut-off of 2,500)을 사용하여 4℃의 온도에서 5시간 동안 투석하였다. 홍마늘 추출물을 5번 투석하여 투석 내액(IM solution) 및 투석 외액(OM solution)으로 나누었다. 각 용액을 동결건조하여 파우더 형태의 분말로 제조한 후, 영하 20℃에서 저장하였다.

실험예 1. 세포 생존율 측정(MTT assey)

인간 기관지 평활근 세포에 대한 담배연기 추출물의 독성을 조사하기 위하여 하기와 같이 MTT 에세이를 수행하였다. 지수적으로 성장하는 세포들을 24 웰 플레이트에 4×10⁴ cells/ml로 분주하였다. 각 웰의 세포에 0.1 내지 10% 농도의 담배연기 추출물을 처리하고 24시간 후에, 5mg/ml MTT 용액(Duchefa, Netherlands로부터 구입) 20μl를 각 웰(0.1 mg/ml)에 첨가하여 4시간 동안 배양하였다. 상청액을 빨아내고, 각 웰의 포르마잔 결정(formazan crystals)을 200μl의 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 37℃의 온도에서 30분 동안 용해시킨 후, 24 웰 플레이트를 마리크로 리더((Bio-Rad, USA로부터 구입)로 측정하였다.

또한, 각 웰의 세포에 10% 담배연기 추출물과 다양한 농도의 마늘, 흑마늘, 홍마늘 추출물, 홍마늘 추출물의 투석 내액 또는 투석 외액을 각각 처리한 후 동일한 방법으로 세포 생존율을 측정하였다.

도 1의 A는 다양한 농도의 담배연기 추출물이 인간 기관지 평활근 세포의 생존에 미치는 영향을 나타낸다. 도 1의 A를 보면, 24시간 동안 1%, 3%, 5% 및 10% 농도의 담배연기 추출물에 노출시킨 세포의 생존율은 대조군에 비하여 각각 13%, 18%, 18% 및 30% 감소하였다. 0.1% 내지 0.5% 농도의 담배연기 추출물은 세포사멸에 약간의 영향을 미쳤다.

도 1의 C는 0.01%, 0.1% 및 1% 농도의 생마늘(FRG), 흑마늘(ABG) 또는 홍마늘(ARG)을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 각각 처리한 경우 세포 생존율의 변화를 대조군과 비교한 도면이다. 도 1의 C를 보면, 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 생마늘 및 흑마늘을 처리한 경우 세포 생존율이 대조군에 비해 증가하지 않았으나 1%의 홍마늘 추출물을 처리한 경우에는 세포 생존율이 대조군에 비하여 상당히 증가하였다.

도 1의 D는 다양한 농도의 홍마늘을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 처리한 경우 세포 생존율의 변화를 보인 도면이다. 도 1의 D의 왼쪽에서 첫 번째 막대는 담배연기에 노출되지 않은 인간 기관지 평활근 세포의 생존율(100%)을 나타내며, 왼쪽에서 두 번째 막대는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포의 생존율(54.2±4.8%)을 나타낸다. 도 1의 D를 보면, 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 1%의 홍마늘 추출물을 처리한 경우 세포 생존율이 79.0±10.9%로 담배연기에 의한 세포사멸이 상당히 감소하였음을 알 수 있었다.

도 1의 E 및 F는 다양한 농도의 홍마늘 추출물 투석 내액 및 투석 외액을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 처리한 경우 세포 생존율의 변화를 보인 도면이다. 도 1의 E를 보면, 0.3% 및 1% 홍마늘 추출물 투석 내액이 담배연기에 의한 세포사멸을 방지하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 도 1의 F를 보면, 홍마늘 추출물 투석 외액이 0.1%, 0.3% 및 1% 농도에서 담배연기에 의한 세포사멸을 방지함을 확인할 수 있었다.

이러한 결과는 투석 외액은 저분자량의 갈변물질을 많이 함유하고, 투석 내액은 고분자량의 갈변물질을 많이 함유하므로 홍마늘 추출물에서 저분자량의 갈변물질에 세포 사멸을 방지하는데 중추적인 역할을 하는 활성물질이 포함되어 있는 것으로 보인다.

실험예 2. 카스페이즈(Caspase)의 활성 측정

카스페이즈의 활성을 측정하기 위하여 FLICA(a fluorochrome inhibitor of caspase) apoptosis detection kit(Immunochemistry Technologies, USA로부터 구입)을 사용하였다. FAM-VAD-FMK(valylalanylaspartic acid fluoromethyl ketone)의 녹색형광으로 표지된 카복시플루오레신(carboxyfluorescein) 유도체는 카스페이스 활성의 강한 억제제이다.

실험은 하기와 같이 수행하였다. 먼저, 인간 기관지 평활근 세포를 37℃의 온도에서 12시간 동안 10%의 담배연기 추출물을 처리한 후 함께 배양하였다. 1×10⁶cells/ml의 농도로 세포들이 성장하고 있는 각 시료에서 300μL의 표본을 채취한 후, 희석된 FAM-VAD-FMK(1:30, 10μL)를 첨가하였다. 세포들은 37℃의 온도에서 60분 동안 FAM-VAD-FMK로 표지시켰다. 그 후, 세포들을 1×세척 버퍼를 사용하여 세 번 세척하였다. 세척한 후, 488nm(excitation wavelength)와 518nm(emission wavelength)의 band pass filter를 사용하여 카스페이즈 활성을 측정하였다.

도 1의 B는 인간 기관지 평활근 세포에 10% 담배연기 추출물을 처리한 경우 아포토시스가 일어난 세포를 보인 도면이다. 도 1의 B에 FLICA에 의해 염색된 세포는 아포토시스가 일어난 세포를 나타내며, 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포는 대조군에 비하여 아포토시스가 많이 일어났음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 담배연기 추출물에 의해 호흡기 세포의 사멸이 발생함을 나타낸다.

실험예 3. 세포내 글루타티온( GSH )의 함량 측정

인간 기관지 평활근 세포의 GSH 함량은 dithionitrobenzoic acid-glutathione disulfide(DTNB-GSSG) reductase recycling 에세이 시스템을 사용하는 total GSH detection kit(Assay Designs, Ann Arbor, USA로부터 구입)으로 측정하였다. 먼저, 균질화된 세포들의 현탁액을 GSH 환원제와 마이크로 플레이드에서 혼합하였다. 흡광도는 플레이트 리더(Infinite F200, Tecan, Switzerland로부터 구입)를 사용하여 405nm의 파장에서 1분 간격으로 10번 측정하였다. 환원된 GSH 농도는 전체 GSH 농도에서 4-vinylpyridine을 처리한 시료로부터 측정된 산화된 GSH(GSSG) 농도를 공제하여 구하였다. 사용한 식을 다음과 같다.

환원된 GSH = 전체 GSH - GSSG

도 2의 A는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물, L-BSO, GSH를 처리한 경우 세포내 GSH 농도 변화를 보인 도면이다. 도 2의 A와 같이, 10% 담배연기 추출물에 노출된 세포의 GSH 농도가 대조군에 비하여 상당히 감소하였으나, 홍마늘 추출물을 처리한 경우에는 담배연기에 의한 GSH 농도 감소를 상당히 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

그러나, GSH 합성 억제제인 L-BSO를 홍마늘 추출물과 함께 처리한 경우에 담배연기에 의한 GSH 농도 감소를 억제하는 효과를 보이지 못했으나, L-BSO를 GSH와 함께 처리한 경우에는 담배연기에 의한 GSH 농도가 감소되는 것을 억제시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 홍마늘 추출물이 인간 기관지 평활근 세포의 GSH 생산에 영향을 미치는 것을 나타낸다.

도 2의 D는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물, L-BSO, GSH를 처리한 경우 세포 생존율의 변화를 보인 도면이다. 도 2의 D를 보면, 홍마늘 추출물을 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 처리한 경우 대조군에 비하여 세포 생존율이 증가하였으나, 홍마늘 추출물과 L-BSO를 함께 처리한 경우에는 담배연기에 의한 세포사멸을 방지하지 못하는 것으로 확인되었다. 또한, GSH를 처리한 경우에는 10% 담배연기에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 아무것도 처리하지 않은 경우에 비하여 세포 생존율이 증가하여 세포증식이 일어났음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 홍마늘 추출물이 GSH 생성을 야기하는 효과가 있음을 나타낸다.

실험예 4. ROS 생성 수준 측정

인간 기관지 평활근 세포를 홍마늘 추출물 없이 10%의 담배연기 추출물에 노출시켜 배양하였다. 인간 기관지 평활근 세포에 빛이 없는 환경에서 5μM dichlorodihydrofluorescein(H2DCFDA, Calbiochem, USA로부터 구입)를 30분 동안 처리하고 배양하였다. 배양 후, 세포들을 PBS로 세 번 세척하고, 즉시 공초점 레이저 주사 현미경(IX70 Fluoview, Olympus, Japan로부터 구입)을 사용하여 형광강도를 측정하였다. 녹색 형광((H2DCFDA)을 검출하기 위하여 488nm 및 518nm 레이저를 세포에 조사시켰다. 형광 이미지는 TIFF 포맷으로 저장한 후, Fluoview 소프트웨어 프로그램(version 2.0, Olympus)을 사용하여 분석하였다.

도 2의 B는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물을 처리한 경우 ROS 생성을 보인 사진이다. 도 2의 B를 보면, 10% 담배연기 추출물을 처리한 경우 대조군에 비해 ROS가 2배 정도 더 생성되었음을 알 수 있고, 담배연기에 의한 ROS 생성은 ROS 스캐빈져(scavenger)인 NAC(N-acetylcysteine)을 전처리함으로써 감소하였다. 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물을 처리한 경우에도 NAC를 처리한 경우와 유사하게 ROS 생성이 감소하였음을 확인할 수 있었다.

실험예 5. 웨스턴 블랏

인간 기관지 평활근 세포를 50mM Tris-Cl(pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM dithiothreitol(DTT), 0.5% nonyl phenoxylpolyethoxylethanol(NP-40), 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate(SDS), 1mM ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), 1μM leupeptin, 1μM pepstatin A, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF) 및 0.1μM aprotinin을 포함하는 단백질 추출 용액(PRO-PREPTM, iNtRON Biotechnology Inc,Korea로부터 구입)에 혼합한 후 균질화 하였다. 이 후, 세포들을 간헐적인 볼텍싱을 하면서 30분 동안 얼음에서 배양하였다. 배양한 후, 추출물을 원심분리기(16,609×g; Micro 17TR, Hanil, Korea로부터 구입)를 사용하여 4℃의 온도에서 20분 동안 13,000rpm으로 원심분리하였다.

상청액을 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 분리한 후, 15분 동안 semi-dry transfer(Bio-Rad, USA로부터 구입)를 사용하여 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 5% 무지방 분유를 사용하여 막은 후, heme oxygenase-1(HO-1, oxidant sensing protein) 폴리클로날 항체(1:1000 희석, Biovision, USA로부터 구입) 및 α-tubulin 모노클로날 항체(1:10,000 희석)와 함께 배양하였다. 1차 항체와 함께 배양한 후에 이차 퍼옥시다제 공액 항-레빗 또는 항-마우스 항체(secondary peroxidase-conjugated anti-rabbit or anti-mouse antibody)를 1:10,000의 비율로 함께 배양하였다. 면역 양성 밴드(Immuno-positive bands)는 화학발광(enhanced chemiluminescence, ECL Plus kit, ELPIS, Korea로부터 구입)에 의해 시각화하였다.

웨스턴 블랏 이미지를 캡쳐하기 위하여 발광 이미지 분석기 LAS-4000 (Fujifilm corp, Japan로부터 구입)을 사용하였다. 밴드의 수치화를 위하여 SigmaGel 이미지 분석 소프트웨어(version 1.0, Jandel Scientific, USA로부터 구입) 및 Quantity One 소프트웨어(version 4.6.3, Bio-Rad, USA로부터 구입)를 사용하였다.

도 2의 C는 10% 담배연기 추출물에 노출된 인간 기관지 평활근 세포에 홍마늘 추출물 또는 NAC를 처리한 경우 HO-1 발현 수준의 변화 양상을 보인 도면이다. 도 2의 C를 보면, 10% 담배연기에 노출된 인간 기관지 평활근 세포의 HO-1 발현 수준이 시간 의존적으로 증가하였다(a). NAC에 의해서는 HO-1 발현 수준이 감소하였다(b). 홍마늘 추출물 또한 담배연기에 의한 HO-1 발현 증가를 약화시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다(b 및 c). 이러한 결과는 홍마늘 추출물이 HO-1의 기능을 대체함으로써 HO-1 없이도 담배연기에 의한 세포사멸을 방지할 수 있음을 나타낸다.

Claims

홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 호흡기 세포의 사멸은 담배연기 흡입으로 인한 호흡기 세포의 사멸인 것인 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 홍마늘 추출물은 열수 추출된 것인 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 홍마늘 추출물은 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소를 억제하는 것인 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 호흡기 질환은 기관지염, 만성 기관지염, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐질환 또는 폐암인 것인 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 호흡기 세포는 기관지 평활근 세포인 것인 조성물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 호흡기 세포 사멸에 의해 유도되는 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
홍마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소 억제용 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 호흡기 세포내 글루타티온의 농도 감소는 담배연기 흡입으로 인한 글루타티온의 농도 감소인 것인 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 호흡기 세포는 기관지 평활근 세포인 것인 조성물.