KR20120035150A

KR20120035150A - 신경 보호 인자 및/또는 혈관 신생 억제 인자를 암호화 및 분비하는 캡슐화 세포를 사용하는 안 질병 치료 방법

Info

Publication number: KR20120035150A
Application number: KR1020117028535A
Authority: KR
Inventors: 조스트 비. 조나스; 크리스틴 발라프; 에릭 퇴네스; 피터 게이그레; 송호미트라 판다-조나스
Original assignee: 바이오컴페터블즈 유케이 리미티드
Priority date: 2009-05-12
Filing date: 2010-05-11
Publication date: 2012-04-13
Also published as: CA2758293A1; AU2010246603A1; WO2010130418A2; EP2429569A2; JP2012526524A; CN102438647A; WO2010130418A3; EP2251028A1; US20120263794A1

Abstract

본 발명은 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질을 암호화 및 분비하는 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포, 또는 기타 임의의 작당한 세포에 관한 것이다. 상기 안 질병으로서는 녹내장 및 기타 시신경 질환, 망막 질병 특히, 망막 색소 변성증(RP), 노인성 황반 변성증(AMD) 및 당뇨병성 망막 병증 등을 포함한다. 본원에 사용된 세포는, 바람직하게는 코어와 하나 이상의 표면층을 포함하여 치료 대상인 환자의 면역 시스템이 반응하는 것을 막아주는 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화되어 있다. 본 발명은 또한, 이와 같은 안 질병을 치료하기 위해 ((약학) 조성물을 제조하는데 있어서) 본원에 정의된 바와 같은 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 있어서 이와 같은 (구형) 마이크로캡슐(들) 또는 이와 같은 인자의 용도에 관한 것이기도 하다.

Description

신경 보호 인자 및/또는 혈관 신생 억제 인자를 암호화 및 분비하는 캡슐화 세포를 사용하는 안 질병 치료 방법{TREATMENT OF EYE DISEASES USING ENCAPSULATED CELLS ENCODING AND SECRETING A NEUROPROTECTIVE FACTOR AND/OR AN ANTI-ANGIOGENIC FACTOR}

본 발명은 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질을 암호화 및 분비하는 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포나 간엽 간질 세포, 또는 기타 임의의 적당한 세포에 관한 것이다. 상기 안 질병의 예로서는 녹내장 및 기타 시신경 질환, 망막 장애 특히, 망막 색소 변성증(RP), 노인성 망막 변성증(AMD) 및 당뇨병성 망막병증 등을 포함한다. 본원에 사용된 세포는 바람직하게는 코어(core)와 하나 이상의 표면 층을 포함하는 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화되어, 치료될 환자의 면역 시스템의 반응을 막아준다. 본 출원은 또한 상기한 바와 같은 안 질병의 치료용인 (약학 조성물을 제조하기 위한) 것으로 본원에 정의된, 안 질병의 (안구 내) 치료를 위한 (구형) 마이크로캡슐(들) 또는 인자들의 용도에 관한 것이기도 하다.

몇몇 환자에 있어서 안 질병 또는 안 질환은 시 지각 기능(visual perception)을 심각하게 손상시키고, 심지어는 실명에 이르게 할 수 있기 때문에, 이와 같은 안 질병 또는 안 질환에 특히 관심이 집중되고 있다. 이와 같은 안 질병 또는 안 질환 중에서도 특히 녹내장과 기타 시신경 질병, 그리고 망막 장애에 관심이 집중되고 있다. 이와 같은 망막 장애로서는 여러 가지가 있으나 예를 들어, 망막 색소 변성증(RP), 황반 변성증(MD), 노인성 황반 변성증(AMD 또는 ARMD), 황반 부종, 특히, 다른 이유로 인한 황반 부종, 망막 혈관 폐색증, 고혈압성 망막 병증 및 당뇨병성 망막 병증 등을 포함할 수 있다.

상기 내용 중, 망막 색소 변성증(RP)은 유전성 안 병태(genetic eye condition) 군으로 분류된다. 망막 색소 변성증의 증상이 진행될 때, 일반적으로, 야맹증이 터널 시야 증상보다 수년 또는 심지어 수십 년까지 앞서 진행된다. 망막 색소 변성증이 발병한 사람들 다수가 40대 또는 50대가 될 때까지 시각 장애인임을 법적으로 인정받지 못한채, 여생 동안 미약하게나마 시력을 유지하게 된다. 일부의 사람들은 망막 색소 변성증으로 인해 완전히 시력을 상실하고, 일부 환자의 경우에는 유년기에 이미 시력이 상실된다. 망막 색소 변성증은 유전 질환군에 속하는 유전성 망막 이 영양증의 가장 일반적인 형태 중 하나로서, 광 수용기 세포의 점진적인 상실, 망막의 광 수용기(간상 세포 및 원추 세포) 및/또는 망막 색소 상피(RPE)의 이상증(이로써, 시력을 점자 상실하게 됨)을 특징으로 한다. 발병 개체는 처음에, 암 순응 장애 또는 야맹증(야맹증)을 경험하게 되고, 이어서, 주변 시야(터널 시야라고도 알려짐)가 줄어들게 되며, 질병에 따라서는 구체적으로, 질병 진행 단계 중 말기 즈음에 중심 시력이 상실된다. 진행성 난청과 관련된 망막 색소 변성증을 어셔 증후군(Usher syndrome)이라고 부른다. 유전성 망막 이 영양증의 한 형태로서, 다수의 유전자에 돌연 변이가 발생하면 망막성 색소 변성증으로 표현될 것이다. 1989년에, 로돕신 유전자를 돌연 변이시켜 색소 즉, 저조도 조건 하에서도 시각 기능이 나타나도록 만들어줄 수 있는 시각 감각 변환 케스케이드(visual transduction cascade)에 있어서 중요한 역할을 하는 색소를 동정하였다. 이때부터, 상기 유전자에서 100가지 이상의 돌연 변이들이 관찰되었다[모든 종류의 망막 변성증 중 15%를 차지함]. 이와 같은 돌연 변이들은 대부분 미스센스 돌연 변이로서, 통상적으로는 유전된다. 뿐만 아니라, 로돕신 유전자는 광 수용기 외부 분절의 주요 단백질을 암호화한다. 연구 결과, 이 유전자에서 발생하는 돌연 변이는 망막 색소 변성증과 관련된 상 염색체 형태 중 약 25%에서 발생함을 알 수 있다. 뿐만 아니라, 단백질의 추간판 내 도메인의 Pro23His 돌연 변이가 1990년에 처음 보고된 것을 시작으로 하여, 현재까지 망막 색소 변성증과 관련된 옵신 유전자 내에서 발생한 돌연 변이 150가지 이하가 보고되고 있다. 이러한 돌연 변이는 옵신 유전자에서도 살펴볼 수 있는데, 상기 돌연 변이는 단백질의 3가지 도메인(즉, 추간판내, 경막 및 세포질 도메인)을 따라서 발생한다. 유전적인 원인은 별도로 하고, 망막 세포 변성증을 유발하는 돌연 변이는 또한 생화학 현상들 예를 들어, 단백질 미스폴딩이나 샤프론 분자가 관여함으로 인한 것일 수도 있다. 현재, 망막 색소 변성증을 완전히 치료할 수 있는 의학적 치료제는 존재하지 않는다. 비록 비타민 A를 사용하는 치료 방법이 가장 일반적으로 행해지고 있는 치료법이긴 하지만, 이 방법은 예를 들어, 15,000IU의 비타민 A 팔미테이트를 매일 섭취함으로써 질병의 진행을 단지 지연시킬 수 있다는 것에 그친다. 추가의 치료 방법으로서는, 망막을 이식하는 방법, 인공 망막을 이식하는 방법, 유전자 치료법, 줄기 세포 치료법, 영양 보충 등의 방법을 포함할 수 있다.

망막 질환의 다른 형태로서는 황반 변성증(MD)을 포함할 수 있다. 황반 변성증은 노인(50세 이상) 층과 근시인 개체들 사이에서 실명을 유발하는 주요 원인 중 하나인 의학적 병태이다. 황반 변성증(MD)의 증상으로서는 통상적으로, 이 황반 부위의 안쪽에 존재하는 망막에 손상을 입어서 시야 중심(황반) 시력이 상실되는 것을 포함한다. 황반 변성증은 글씨를 읽거나 얼굴을 인식하는데 어려움을 느끼거나 또는 불가능하게 될 수 있긴 하지만, 주변 시력은 충분히 남아있어서 일상 생활 중 상기 활동 이외의 활동은 무난하게 소화할 수 있다. MD의 진단은 예를 들어, 플루오레세인 혈관 조영술을 통하여 수행될 수 있는데, 이를 통하여, 비정상적인 혈관 발달 상태를 확인하고 그의 위치를 파악할 수 있다. 뿐만 아니라, 광 간섭성 단층 촬영 및 기타 새로 개발된 조영 기술을 사용하여, MD 치료에 대한 응답을 진단 및 평가할 수 있다

MD의 한 형태로서는 노인성 황반 변성증(AMD 또는 ARMD)이라고 불리는 것이 있다. 상기 노인성 황반 변성증은, 녹내장 및 당뇨병성 망막 병증을 제외하고, 서구에서 시력 손상 및 시력 상실을 일으키는 가장 일반적인 원인 중 하나가 되고 있다. 통상적으로, 노인성 황반 변성증의 발병은 황반(세밀한 중심 시력을 제공하는 망막의 중심 부위("중심와(fovea)"라 칭함)), 구체적으로 말하자면, 망막 색소 상피 및 이를 감싸고 있는 맥락막 사이에 생성되는 특징적인 황색 침착물("결정체(drusen)"라 칭함)과 관련되어 있다. 이와 같은 초기 변화(노인성 황반 병증이라 칭함)가 나타나는 사람들은 대부분, 통상적으로 시력이 손상되지 않는다. 그러나, 이와 같은 초기 변화들이 후기 AMD로 진행될 수 있는 것을 자주 살펴볼 수 있다. 상기 안 질병의 위험성은, 상기 결정체의 크기와 수가 증가하고 황반 안쪽에 존재하는 색소 세포층에 발생하는 장애 현상과 관련되어 있을 때 한층 더 커지게 된다. 통상적으로, 고도의 시력 상실의 원인이 되는 후기 AMD는 2가지 형태(건조형 및 습윤형)로 발생한다. 후기 AMD의 "건조형"(중심 지도 모양 위축이라고도 알려짐)은 통상적으로, 망막 바깥쪽에 있는 망막 색소 상피 층(아마도, 맥락막 모세 혈관층)의 위축으로 인하여 발병하는 것으로서, 눈의 중심부에 있는 광 수용기(간상 세포 및 원추 세포) 상실로 인한 시력 상실을 유발한다. 또한, 망막과 맥락막 사이에 세포 조각(결정체라고 부름)이 축적될 수도 있다. 이와 같은 병태에 허용 가능한 치료 방법은 아직 없지만, 다량의 항산화제, 루테인 및 제아잔틴과 비타민 보충제를 함께 투여할 경우, 건조형 황반 변성증의 진행을 지연시킬 수 있으며, 몇몇 환자의 경우에는 시력의 민감성이 개선된다는 사실도 입증된바 있다[미국 국립 보건원 안과 협회 및 기타 기관]. 후기 AMD의 "습윤형"(신생 혈관성 또는 삼출성 AMD라고도 알려짐)은 더욱 심각한 형태의 AMD로 발현된다. 삼출성 노인성 황반 변성증(AMD)(AMD의 습윤형)은 통상적으로, 눈 혈관의 비정상적인 성장을 특징으로 하는데, 이 경우, 상기 비정상적으로 성장한 혈관으로부터 혈액과 체액이 누출된다. 부르크 막을 거쳐 맥락막 모세 혈관층의 혈관이 비정상적으로 성장하여 망막 하 공간(subretinal space)에 이르게 되고, 궁극적으로는 이 황반 바깥쪽으로 혈액과 단백질이 누출되어 시력이 상실될 수 있다. 이와 같은 혈관으로부터의 출혈, 누출, 그리고 이 혈관의 상처로 인하여 결과적으로는 광 수용기가 회복 불가능한 손상을 입게 되고, 황반에는 상처가 생기는 것이며, 이를 치료하지 않고 방치할 경우에는 비교적 빠른 속도로 시력을 상실하게 된다.

오늘날에 이르기까지, AMD 특히, 습윤형 AMD에 효능을 나타내는 치료 방법으로서는 소수의 방법만이 존재한다. 현재, 삼출성 노인성 황반 변성증(AMD)은 통상적으로, 안구 내 투여 의약품으로 치료되고 있으며, 극소수의 경우에만 (부가적으로) 레이저 응고 처리를 통해 치료되고 있다. 상기 안구 내 투여 의약품으로서는, 비정상적인 혈관을 퇴화시키고, 눈의 유리액에 직접 주입시 시력을 개선할 수 있는 혈관 신생 억제제를 포함한다. 이와 같은 혈관 신생 억제제 예를 들어, VEGF를 억제하는데 효과적인 제제(항-혈관 내피 세포 성장 인자)를 사용하여 비정상적 신생 혈관들이 눈에 형성되는 것을 막을 수 있으며, 또한 누출이 이미 시작된 혈관들을 말릴 수도 있다. 그러나, 불행하게도, 이와 같은 제제는 두 달에 한 번씩, 또는 매달 반복적으로 주사하여야 하며, 주사시에도 주사와 관련된 위험성(특히, 안구 내 감염 위험성)을 가진다. 이와 같은 제제의 예로서는, 루센티스(Lucentis)™, 아바스틴(Avastin)™(루센티스™와 구조적으로 매우 밀접함) 및 마큐겐(Macugen)™을 포함한다. 이러한 혈관 신생 억제제 중, 루센티스와 마큐겐만이 2009년 1월에 FDA 승인을 받았다. 마큐겐은 신생 혈관 AMD 치료에 있어서 비교적 효능이 떨어지는 것으로 확인되었는데, 이 마큐겐™을 사용하기보다는 루센티스™를 사용하는 것이 치료에 더욱 효과적이다.

본원에 있어서, WO 02/067971 A2(스위스 바젤 소재, 노바티스 아게)에는, 눈의 신생 혈관 형성을 치료하는 방법에 관하여 개시되어 있다. 이러한 목적으로, WO 02/067971 A2에서는, 치료될 환자에 엔도스타틴을 암호화하는 (아데노)바이러스 벡터를 직접 투여하거나, 또는 엔도스타틴-생산 세포를 투여하는 방법을 이용하고 있다. 그러나, 세포를 투여할 경우에는 치료될 환자의 체 내에서 원치 않는 면역 반응이 일어나게 된다. 또한, WO 02/067971 A2에는 마이크로캡슐 형태로 세포를 전달한다고해서, 이 마이크로캡슐화된 세포가 효율적으로 생산되고, 원치않는 면역 반응이 일어나는 것을 막을 수 있으며, 또한 눈의 신생 혈관 형성 또는 기타 안 질병을 치료하는데 유효하다고 볼 수 있는 것은 아니라고 제시되어 있다. 뿐만 아니라, WO 02/067971 A2에는 이와 같이 마이크로캡슐화된 세포가 환자에 성공적으로 투여되었음을 보여주고 있지 않다.

비교적 일반적으로 알려진 기타 망막 질환으로서는 망막 혈관 폐색증을 포함한다. 인구를 바탕으로 행해진 최근 연구에 따르면, 일반적으로 40세 이상인 인구 중 약 1%가 망막 혈관 폐색증 주로, 망막 정맥 폐색증 또는 망막 동맥 폐색증을 앓고 있다고 한다. 망막 동맥 폐색증의 경우, 지금까지 증거를 바탕으로 하는 치료법은 없었다. 동맥 폐색증은 일반적으로, 동맥이 다시 뚫린 후 제한된 기간 동안에만 지속적으로 발병된 상태에 있게 된다. 그러므로, 이 동맥이 다시 관류할 때까지 손상된 망막 세포가 살아있도록 도와주는 치료법이 바람직하다. 망막 정맥 폐색증의 경우에는, 망막 레이저 응고 처리 및/또는 안구 내 약품의 투여를 수행함으로써, 황반 부종을 줄이고, 또한 안구 내에 원치 않는 신생 혈관이 형성될 위험성도 감소하게 된다. 또한, 망막 정맥 폐색증의 경우, 신경 보호 치료법은 주변 조건이 좋아질 때까지 세포가 살아있도록 도와주는 것을 보장해준다.

녹내장은, 망막 신경절 세포 및 이의 축삭(axon)이 소실되어, 검안경을 통해 관찰할 수 있는 전형적인 시신경 헤드(optic nerve head)의 외관을 갖게 되는 것을 특징으로 하는 질병의 이종 군이다. 안구 내 압력은 상승할 수 있거나(이러한 경우를 "고압 녹내장(high pressure glaucoma)"이라 부름), 또는 통계학적으로 정상일 수 있다(이러한 경우를 "정상압 녹내장(normal pressure glaucoma)"이라 부름). 비교적 최근의 연구에 따르면, 정상압 녹내장 환자 중 일부는 안와의 뇌 척수액 압력 즉, 경-사상판 역압이 비정상적으로 낮을 수 있다고 한다. 녹내장은 만성일 수 있거나(대부분의 개방 각 녹내장이 이에 해당함) 또는 극심한 통증을 동반하여 급성으로 발병할 수 있다(우각 폐색성 녹내장 중 일부의 경우가 이에 해당함). 녹내장도 각각 성질이 다른데, 이는 녹내장의 치료 방식이 상이할 수밖에 없는 이유를 뒷받침해준다. 일반적으로, 녹내장 치료에 있어서 모든 경우, 안구 내 압력을 낮추어 주어야 한다. 뿐만 아니라, 신경 보호 치료법 또는 심지어 신경 재생 치료법은 손상된 세포를 지지하여, 살아있도록 만들거나 또는 심지어 재생되도록 만드는데 필요하다.

일반적으로, AMD 및 기타 망막 질환, 그리고 시신경 질환의 치료에 다수의 추가 제제를 사용할 수 있다. 신규의 치료 기술을 추가로 개발하기 위하여 다수의 실험을 통해 관찰을 행하는 외에도, AMD 및 언급된 기타 질병의 치료법에 사용되는 신규 약품의 임상 효능을 관찰하기 위한 다수의 연구(1단계, 2단계 및 3단계 연구)가 진행중에 있다. 그러나, 현재는 시신경을 포함하는 망막 조직, 섬유주대 및/또는 혈관 세포를 보호할 수 있거나, 또는 더욱 바람직하게 재생을 가능하게 하는 유효한 치료법(전술한 바와 같은 장기 치료법)이 존재하지 않는 상황이다. 망막 색소 변성증(RP) 치료용 의약품(예를 들어, 비타민 A 및 비타민 A 팔미테이트)을 사용하는 치료 방법과, AMD 치료용 약물(예를 들어, 루센티스™ 및 마큐겐™)을 사용하는 치료 방법은 상기 RP 및 AMD의 진행을 지연시키는 것으로 파악되지만, 이와 같은 치료 기술은 모두, 세포 소실에 대해 보호 효능을 나타낼 수 없으므로, 효율적인 치료 방법이 될 수는 없는 것이다. 외과적 개입 방법 예를 들어, 망막 이식법이나 인공 망막 이식법은 초기 실험 단계에서는 여전히 수행되고 있다. 이와 유사하게, 효율적인 치료법 예를 들어, 유전자 치료법과 줄기 세포 치료법, 영양 보충법 등은 현재까지 임상 단계에 있을 뿐 아직 구체적으로 개발되지는 않았다.

그러므로, 본 발명의 목적은, 상기한 바와 같은 문제들을 일으키지 않고, 약물을 반복적으로 자주 투여할 필요가 없으며/없거나 원치않는 부작용이 발생할 위험 없이 효율적인 장기 치료 방법을 제공할 수 있는, 전술한 안 질병 및 안 질환 특히, 망막 변성으로 인해 유발되는 안 질병 및 안 질환에 대한 효율적인 치료법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 이하 첨부된 특허 청구 범위의 청구항에 의해 달성된다.

본 발명의 목적은 특히, 본원에 정의된 안 질병 또는 안 질환 바람직하게는 예를 들어, 망막 질병 특히, 망막 색소 변성증(RP), 노인성 황반 변성증(AMD), 당뇨병성 망막 병증, 망막 혈관 폐색증 및 시신경 병증의 (안구 내) 치료를 위해 (약학 조성물을 제조하기 위하여) 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 임의의 기타 단백질 또는 단백질 유사 물질(본원에서 안 질병의 (안구 내) 치료 방법으로서 적당하다고 개시된 물질), 또는 이의 단편이나 변이체를 사용함으로써 달성된다.

더욱 바람직하게 본 발명의 목적은 본 발명에 사용될 수 있는 세포로서, 본원에 정의된 안 질병 바람직하게는 예를 들어, 망막 질병 특히, 망막 색소 변성증(RP), 노인성 황반 변성증(AMD), 당뇨병성 망막 병증, 망막 혈관 폐색증 및 시신경 병증의 (안구 내) 치료를 위해 (약학 조성물을 제조하기 위하여), 본원에 정의된 안 질병 또는 안 질환의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 임의의 기타 단백질 또는 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포나, 기타 임의의 세포(유형)에 의해 달성되며, 이 경우, 세포는 (구형의) 마이크로캡슐 내에 캡슐화되어, 치료될 환자의 면역 시스템의 반응을 방지하는 것이 바람직하다. 본 발명의 내용에 있어서, "~를 암호화하는 세포"란 용어는 통상적으로, "~를 암호화하는 핵산을 함유하거나 포함하도록 조작된 세포"를 의미하는 것이다.

본원에 정의된 바와 같은, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 임의의 기타 단백질 또는 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를, 본원에 정의된 바와 같은 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어에 매립된 세포를 통해 투여함으로써, 상기와 같은 인자들을 반복적으로 투여함에 따른 번거로움을 피할 수 있다. 그러므로, 본원에 정의된 바와 같은 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 임의의 기타 단백질이나 단백질 유사 물질은, 이러한 인자를 암호화 및 발현하는 핵산을 가지는 환자에 세포를 안구 내 제공함으로써 투여될 수 있다. 이와 같은 세포를 이식함으로써, 이식된 세포로부터 상기 인자들이 분비됨에 따라서 이 인자들을 장기간 동안 확실하게 생체 내 제공할 수 있게 되는 것이다. 이와 같은 세포는 상기 인자들을 반복적으로 투여할 필요 없이 목적으로 하는 부위에 직접 제공해준다. 면역 시스템은 통상적으로 외래 세포를 인지하여 면역 반응을 촉발함으로써 이와 같은 외부 물질로부터 유기체를 보호하는 것으로 당 업계에 알려져 있다. 그러므로, 본원에 정의된 바와 같이, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 임의의 기타 단백질 또는 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를 발현할 수 있는 세포를 이식하면, 유기체 내 면역 반응을 유도할 수 있다. 이와 같은 방어 반응은 치료시 상당히 바람직하지 않은 부작용을 유발할 수 있으며, 또한 심각한 합병증을 일으킬 수 있거나 또는 치료된 유기체를 사멸시키기까지 할 수 있다. 이와 같은 문제점이 발생하는 것을 막기 위한 한 가지 기술로서 본원에 예시된 것으로서는, 자가 조직 세포 즉, 환자 자신으로부터 유래하는 세포를 이용하는 방법이 있는데, 여기서, 상기 자가 조직 세포는 유전적으로 변형되어, 본원에 정의된 바와 같이, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 임의의 기타 단백질 또는 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를 일시적으로 발현한다. 이와 같은 방법은 치료될 특정 환자의 세포에 한정된 것이 바람직하다.

본 발명의 내용 중, "안 질병"이란 용어는 구체적으로, 망막 변성에 의해 유발되는 안 질병 및 안 질환을 포함하는 것으로서 예를 들어, 망막 색소 변성증(RP), 황반 변성증(MD), 노인성 황반 변성증(AMD 또는 ARMD), 망막 병증, 당뇨병성 망막 병증, 임의의 원인으로 인한 황반 부종, 혈관 내피 세포 및 주연 세포의 이상, 망막 혈관 폐색증, 녹내장 예를 들어, 섬유주대 발생 녹내장 및 기타 시신경 병증 예를 들어, 섬유주대 변성증, 및 각막 내피 세포의 이상 증상 등, 또는 이 질병과 관련된 임의의 질병 또는 질환으로부터 선택되는 기타 망막 질병을 의미한다. 본 발명의 내용 중, 안 질병은 또한, 황반 변성증, 맥락막 혈관 신생, 황반 변성증으로 인한 맥락막 혈관 신생, 영속성 및 재발성 맥락막 혈관 신생, 히스토플라스마증 및 병리적 근시로 인한 맥락막 혈관 신생, 혈관양선조, 전방 허혈성 시신경병증, 박테리아성 심내막염, 베스트병, 버드샷 망막 맥락막증(birdshot retinochoroidopathy), 맥락막 혈관종, 맥락막 모반, 맥락막 비관류, 맥락막 골종, 맥락막 파열, 맥락막 결여, 만성 망막 박리, 망막의 안검 홍채 맥락막의 선천적 결손, 결정체 생성, 내인성 칸디다 내 안구염, 망막 색소 상피 세포의 외부 유두형 과오종, 황반안저, 특발성 황반 홀(idiopathic macular hole), 악성 흑색종, 막성 증식성 사구체 신염(제II형), 금속성 안구 내 이물, 나팔꽃 디스크 증후군, 다발성 조락성 백반 증후군(MEWDS), 거상연, 수술 현미경 범(operating microscope bum), 시신경 헤드 핏(optic nerve head pit), 광 응고술, 천공 내 맥락막 병증, 풍진, 유육종증, 포행성 또는 지도형 맥락 망막 병증, 망막 하 액 배출(subretinal fluid drainage), 측만 디스크 증후군(tilted disc syndrome), 탁소플라스마 맥락 망막염, 결핵 또는 보그트-고야나기-하라다 증후군(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)으로 인한 맥락막 혈관 신생, 당뇨병성 망막 병증, 비 당뇨병성 망막병증, 분지 정맥 폐색증, 중심 망막 정맥 폐색증, 미성숙 유아의 망막 병증, 홍채 혈관 신생, 신생 혈관 녹내장, 중심와 주변 모세 혈관 확장증, 겸상 적혈구 망막 병증, 일스병(Eale's disease), 망막 혈관염, 본 힙펠 린도병(Von Hippel Lindau disease), 방사선 망막 병증, 망막 냉동 손상, 망막 색소 변성증, 맥락 망막성 안검 홍채 맥락막의 선천적 결손으로 인한 혈관 신생, 헤르페스 심플렉스 각막염, 각막 궤양, 각막 이식술, 프테리가이아(pterigyia) 또는 외상으로 인한 각막 혈관 신생일 수 있다. 본 발명의 내용 중 안 질병으로서는 눈의 종양성 질병 또는 교모세포종을 포함하지 않는 것이 바람직하다.

상기 발명에 대한 해결책을 제공하는데 사용된 세포로서, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 임의의 기타 단백질 또는 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포는 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화되어, 치료될 환자의 면역 시스템의 반응을 유발하는 것을 막는 것이 바람직하다. 본 발명의 내용 중, 이와 같은 (구형) 마이크로캡슐은 (구형) 코어[즉, 구형일 수 있거나 그렇지 않은 코어] 및 하나 이상의 표면 코팅층을 포함하는 것이 바람직한데, 이 경우,

* (구형) 코어는 본 발명에서 사용될 수 있으며, 본원에 정의된 바와 같은 신경 보호 인자 또는 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체(바람직하게는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 것)를 암호화 및 분비하는, 통상적으로 가교된 중합체 및 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포, 또는 기타 임의의 세포(유형)(의 혼합체)를 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있고;

* 하나 이상의 표면 코팅층은 통상적으로 가교된 중합체를 포함하거나, 또는 이것으로 이루어져 있다.

상기 표면 코팅층은 단지 (숙주 유기체의) 투여 위치에 투여시(예를 들어, 주사시 또는 주입시)에만 상기와 같은 (구형) 마이크로캡슐의 면역학적 유효 장벽을 제공하는 것이 바람직하므로, 이 (구형의) 마이크로캡슐은 본원에 정의된 바와 같은 임의의 표면 코팅층 없이 단지 코어만을 가지는 형태로서 형성되지 않는 것이 바람직하다.

본원에 사용된 세포로서, 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 임의의 기타 단백질 또는 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포를 포함하는 (구형) 마이크로캡슐은 통상적으로, 본원에서 (구형) 마이크로캡슐의 총 지름으로서 정의된 입자 크기를 가진다. 일반적으로, 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 총 지름은 특정 치료 방법과 투여 방식에 따라서 상당히 달라질 수 있다. 본 발명의 내용에 있어서, 치료 방법은 본원에 정의된 눈의 질병 및 질환에 엄격하게 제한되어 있다. 이 치료 방법은 통상적으로, 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐을 특정 투여 부위에 예를 들어, 주사 또는 이식에 의해 투여함으로써 국소 방식으로 행하여지므로, 투여 방식은 예를 들어, 주사 캐뉼러 지름에 의해서 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 총 지름을 한정할 수 있다. 상기 마이크로캡슐의 지름과 캐뉼러 지름은 둘 다 최소한 부분적으로나마 상호 의존적이고, 또한 (구형) 마이크로캡슐의 총 지름에 영향을 미치므로, 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 총 지름은 이 (구형) 마이크로캡슐 코어의 지름과 하나 이상의 표면 코팅층의 두께에 의해 추가로 결정된다.

본원에 정의된 안 질병의 치료에 있어서, 본 발명의 발명자들은 놀랍게도, (구형) 마이크로캡슐의 총 지름(입자 크기)이 약 120?약 800㎛, 바람직하게는 총 지름 약 120?약 700㎛, 더욱 바람직하게는 총 지름 약 150?약 650㎛이며, 더더욱 바람직하게는 총 지름 약 165?약 600㎛인 것을 사용할 수 있음을 파악하였다. 특히, (구형) 마이크로캡슐의 총 지름(입자 크기)이 약 120?약 300㎛, 더욱 바람직하게는 총 지름 약 150?약 250㎛, 더더욱 바람직하게는 총 지름 약 165?약 225㎛, 그리고 가장 바람직하게는 총 지름 약 180?약 200㎛ 예를 들어, 약 180㎛, 약 185㎛, 약 190㎛ 또는 약 200㎛인 것이 유리하다. 총 지름이 상기한 바와 같은 (구형) 마이크로캡슐은 통상적으로, 치료될 눈의 선택된 주사 위치에 머무르고 주변 조직으로는 이동하지 않는다. 이로써, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 임의의 기타 단백질 또는 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를, 상기 인자에 의해 나타나는 유리한 효능의 전체 스펙트럼을 제공하는데 충분한 시간 동안, 치료 중 주사 위치에서 연속적으로 발현시킬 수 있다.

(구형) 마이크로캡슐(또는 본원에 정의된 바와 같은 (구형) 코어)에 관한 내용 중, "구형"이란 용어는 최 광의로 해석된다. 구형 입자는 구와 유사한 형태를 가져서, 그 형태는 대칭이거나 비대칭일 수 있는데 예를 들어, (구형) 마이크로캡슐 및/또는 이의 코어는 타원형을 하고 있을 수 있는 것으로 이해하는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따라서 사용된 마이크로캡슐 또는 코어는 상기 의미에 속하면서 구형이 아닐 수도 있지만 예를 들어, 마이크로캡슐 표면상에 돌출 분절 또는 함입 분절을 가지는 임의의 형태를 가질 수 있거나, 또는 섬유(구체적으로, 속이 빈 섬유) 또는 시트(구체적으로, 편평하거나 굴곡이 있는 시트)의 형태로 존재할 수 있다. "구형" 마이크로캡슐 또는 코어에 대해서 언급된 본 발명 중 어느 곳에서든, "구형이 아닌" 마이크로캡슐 또는 코어도 또한 제공, 제조 또는 사용될 수 있다. 그러나, 바람직한 구체예에 의하면, 상기 (구형) 마이크로캡슐은 구형의 마이크로캡슐이거나 타원형의 마이크로캡슐이다. 바람직하게 상기 (구형) 마이크로캡슐은 "구형이 아닌" 마이크로캡슐이다. 더욱 바람직하게 상기 (구형) 마이크로캡슐은 섬유(구체적으로, 속이 빈 섬유) 또는 시트(구체적으로, 편평하거나 굴곡이 있는 시트)의 형태로 존재하지는 않는다.

본원에 정의된 바와 같이, 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐은 (구형) 코어를 포함하는 것이 바람직한데[즉, 코어는 구형이거나 구형이 아닐 수 있음], 이 경우, 상기 (구형) 코어는 본 발명에서 사용될 수 있으며, 또한 본원에 정의된 바와 같은 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질 또는 단백질-유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 가교 중합체 및 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포이거나, 또는 임의의 기타 세포(유형)(의 혼합체)를 포함하거나 또는 이것들로 이루어져 있다.

본 발명의 내용 중, 통상적으로 상기 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어의 가교 중합체는 그것의 공동 내부에, 본 발명의 내용 중 사용될 수 있는 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포 또는 기타 임의의 세포(유형) 매립 스캐폴드(scaffold) 구조를 형성한다. 이와 같은 세포는 스캐폴드 구조 내에 개별적으로 매립될 수 있거나, 아니면 통상적으로는 응집체 예를 들어, 약 10?약 10,000개의 세포 예를 들어, 약 10?약 500개, 약 10?약 1,000개, 또는 약 10?약 10,000개의 세포로 이루어진 응집 세포(의 풀)로서 매립될 수 있다. 상기 (구형) 코어에는 본원에 정의된 바와 같은 가교 중합체와 매립 세포가 균일하게 분포되어 있는 것이 바람직하다. 바람직하게 본원에 정의된 바와 같은 스캐폴드 구조와 매립 세포를 포함하는 코어는 이하 기술되어 있는 방법에 따라서 제조된다. 본 발명에 있어서, (구형) 마이크로캡슐을 이루는 캡슐화 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포, 자가 조직 세포 또는 기타 임의의 세포(유형)를 매립하는 것은 매우 중요한데, 이 경우, 상기 세포는 본 발명에 따라서 사용되는 (구형) 마이크로캡슐을 제조할 때, 본 발명에 있어서 전체적으로 중합체 매트릭스 내에 포함될 수 있다.

본원에 정의된 바와 같은 매립 세포로서 본 발명에 있어서 (구형) 마이크로캡슐에 사용될 수 있는 매립 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포, 또는 기타 임의의 세포(유형)는 코어에, 가교 스캐폴드 중합체 1㎖당, 약 1×10⁴?약 1×10⁸개 세포, 1×10⁹개 세포 또는 1×10¹⁰개 세포의 농도, 바람직하게는 약 1×10⁵개 세포의 농도, 약 1×10⁶개 세포의 농도 또는 약 1×10⁷개 세포의 농도로부터 가교 스캐폴드 중합체 1㎖당 약 5×10⁸개 세포의 농도[또는 심지어 가교 스캐폴드 중합체 1㎖당 약 1×10⁹ 또는 1×10¹⁰개 세포의 농도], 더욱 바람직하게는 가교 스캐폴드 중합체 1㎖당, 약 1×10⁵개 세포의 농도, 약 1×10⁶개 세포의 농도, 또는 약 1×10⁷개 세포의 농도로부터, 가교 스캐폴드 중합체 1㎖당 1×10⁸개 세포의 농도, 그리고 가장 바람직하게는 가교 스캐폴드 중합체 1㎖당, 약 1×10⁵개 세포의 농도, 약 1×10⁶개 세포의 농도, 또는 약 2×10⁷개 세포의 농도로부터 가교 스캐폴드 중합체 1㎖당 6×10⁷개 세포의 농도로 존재할 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 코어의 지름(입자 크기)은 통상적으로 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 총 지름보다 작다. 통상적으로, 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 코어의 지름은 약 50?약 220㎛, 바람직하게는 지름 약 100?약 200㎛이며, 이와 유사하게, 바람직하게는 지름 약 115?약 185㎛, 더욱 바람직하게는 지름 약 130?약 170㎛이고, 더더욱 바람직하게는 지름 약 145?약 155㎛로서 예를 들어, 약 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150 또는 155㎛이다. 특히 바람직하게 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐 코어의 지름은, 바람직하게는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 총 지름보다 작은, 약 1?약 80㎛이고, 더욱 바람직하게는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 총 지름보다 작은, 약 15?약 70㎛이며, 가장 바람직하게는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 총 지름보다 작은, 약 30?약 60㎛이다. 다시 말해서, 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 코어 지름은 약 50㎛, 약 60㎛, 약 70㎛, 약 80㎛, 약 90㎛, 약 100㎛, 약 110㎛, 약 120㎛, 약 125㎛, 약 130㎛, 약 135㎛, 약 140㎛, 약 145㎛, 약 150㎛, 약 155㎛, 약 160㎛, 약 165㎛, 약 170㎛, 약 175㎛, 약 180㎛, 약 185㎛, 약 190㎛, 약 195㎛, 약 200㎛, 약 205㎛, 약 210㎛, 약 215㎛, 또는 심지어 약 220㎛일 수 있거나, 아니면 상기 구체적으로 언급한 수치에서 선택된 임의의 2개로 이루어진 임의의 범위에 포함될 수 있다.

본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 코어는 본원에 정의된 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포를 포함한다. 이와 같이 본 발명에 의한 (구형) 코어에 사용될 수 있는 세포들 예를 들어, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포, 또는 기타 임의의 세포(유형)로서, 코어 주변에 위치하거나, 스캐폴드 구조로부터 돌출된 세포는 면역학적으로 문제를 일으킬 수 있는데, 그 이유는, 면역 시스템이 이러한 마이크로캡슐을 외래 성분으로 인식하여, 이 마이크로캡슐을 공격할 것이기 때문이다.

이와 같은 현상은 초기 용액 중 세포의 농도를 낮춤으로써 해결할 수 있지만, 본 발명은 코어에 존재하는 세포 부분을 증가시킴으로써 마이크로캡슐의 효능을 개선할 수 있다. 코어 내 세포의 농도가 높을수록, 제조되어 이식될 마이크로캡슐의 총 부피는 작아지는데, 즉, 이 마이크로캡슐은 주사 위치에서 더욱 효율적으로 기능을 수행할 수 있다. (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 중심부 중 세포의 농도가 높을 때 발생하는 면역학적 문제점을 없애기 위해서, 본 발명은 (구형) 코어에 하나 이상의 표면 코팅층을 도포한다. 이와 같은 표면 코팅층은 세포가 코어 주변에 아주 가까이 위치하더라도 면역 반응을 일으키지 않는데, 그 이유는, 장벽으로 작용하는 표면 코팅층으로 인해 이와 같은 세포가 숙주의 면역 시스템과 접촉할 수 없게 되기 때문이다. 이러한 표면 코팅층은 통상적으로, 본원에 정의된 가교 중합체로 이루어져 있으며, 세포는 전혀 포함하고 있지 않다. 특히 바람직한 구체예에 의하면, 상기 정의된 (구형) 코어는 하나 이상 또는 하나보다 많은 수의 표면 코팅층(들) 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 5~10개 이상의 표면 코팅층(들), 더욱 바람직하게는 1개, 2개 또는 3개의 표면 코팅층(들), 가장 바람직하게는 하나의 표면 코팅층으로 코팅되어 있다. 통상적으로, 각각의 표면 코팅층은 코어 주위에 균일한 두께로 형성되어 있다. 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 표면 코팅층(들)의 두께는 대부분 임의로 바꾸어줄 수 있으며, 통상적으로는 약 1?약 80㎛, 더욱 바람직하게는 약 15?약 70㎛, 그리고 가장 바람직하게는, 약 20?약 40㎛(예를 들어, 약 30㎛)이다.

본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어(그리고 임의로는 이 (구형) 마이크로캡슐을 이루고 있는 하나 이상의 표면 코팅)는 가교 중합체(의 혼합체)를 포함하거나 이것으로 이루어져 있다. 본 발명에서, 당 업계에 알려져 있으며, 캡슐화에 적당한 임의의 약학적 허용 가능(가교 가능) 중합체는 (구형) 코어를 형성하는데 사용될 수 있으며, 본 발명에 따라서 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 하나 이상의 표면 코팅층(들)은 서로 독립적일 수 있다. 한편으로는 가교 상태일 때 외부로부터 영양소와 산소가 투과되어 공급될 수 있고, 다른 한편으로는 코어 세포에 의해서 암호화되어 마이크로캡슐로부터 환자의 조직이나 체액으로 분비되는 펩티드를 확산시킬 수 있는 중합체를 사용하는 것이 바람직하다. 뿐만 아니라, 가교 중합체는 매트릭스를 통하여 개체의 면역 시스템을 구성하는 요소들이 침투되어 들어오는 것을 막아준다. 예를 들어, 중합체 예를 들어, 합성, 반합성 및 천연 수용성 (생체) 중합체 예를 들어, 단백질 또는 단백질계 중합체(예를 들어, 콜라겐 및 알부민 등), 폴리아미노산(예를 들어, 폴리-L-리신 및 폴리-L-글루탐산 등), 다당류 및 이의 유도체(예를 들어, 카복실 메틸 셀룰로스, 황산 셀룰로스, 아가로스, 알기네이트 예를 들어, 갈조류(예를 들어, 라미나랄레스(Laminarales), 엑토카페일스(Ectocarpales) 및 푸칼레스(Fucales))의 알기네이트, 카라기난, 히알루론산, 헤파린 및 관련 황산 글리코사미노, 덱스트란 및 이의 유도체, 키토산 및 이의 유도체로부터 선택되는 천연 중합체로부터 유래하는 (생체) 중합체를 사용할 수 있다. 합성 중합체 예를 들어, 지방족 폴리에스테르(예를 들어, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리하이드록시부티레이트 등), 폴리아미드, 폴리언하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 폴리포스파젠, 열가소성 폴리우레탄, 폴리비닐 알콜, 폴리하이드록시에틸메타크릴레이트, 폴리메틸메타크릴레이트 및 폴리테트라플루오로에틸렌 등도 사용할 수 있다.

뿐만 아니라, 본원에 블록 중합체 즉, 상기 언급한 중합체 중 2개 이상을 조합하여 형성한 중합체도 사용할 수 있다. 이와 같은 블록 중합체는 원하는 특성 예를 들어, 공극 크기, 가교 상태, 독성, 취급성 및 생체 친화성에 따라서 당업자에 의해 선택될 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 중합체 중 임의의 것을 "화학적으로 상이한 중합체"라고 정의하였는데, 이는 곧, 이들 중합체 각각이 통상적으로 동일한 몰 질량으로 존재하지 않으며, 또한 상기 중합체 중 기타 임의의 것을 포함하는 구조를 가지지 않는다는 것을 의미하는 것이다. 이와는 반대로, "화학적으로 동일한 중합체"란, 중합체가 동일한 몰 질량으로 존재하며, 동일한 구조를 가지는 경우를 의미하는 것이다.

마지막으로, 상기 중합체의 혼합물도 본 발명에 포함되는데, 이 경우, 이와 같은 혼합물 중에 포함된 중합체의 양은 원하는 특성(예를 들어, 상기 개략적으로 설명한 바와 같음)에 따라서 당 업자에 의해 선택될 수 있다. 이와 관련하여, 중합체의 혼합물은, 만일 생성된 중합체 혼합물의 전체 몰 질량과, 이 혼합물을 구성하는 단일 중합체들의 몰 백분율로서, 상기 중합체 혼합물의 전체 몰 질량과 상응하는 몰 백분율이 기타 중합체 혼합물과 동일하다면, 이 중합체 혼합물은 다른 중합체 혼합물("화학적으로 동일한 중합체")과 화학적으로 동일한 것으로 간주할 수 있다.

바람직하게 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어의 가교 중합체(그리고, 임의로는 이 (구형) 마이크로캡슐을 이루는 하나 이상의 표면 코팅층) (혼합물)는 알기네이트(들)를 포함하거나, 이것으로 이루어져 있다. 본 발명에 따르면, 알기네이트를 (구형) 코어 및/또는 하나 이상의 표면 코팅층을 형성하기 위한 중합체로서 사용하는 것이 특히 유리한데, 그 이유는, 이 알기네이트가 생체 친화성과 가교 특성이 있기 때문이다. 화학적인 관점에서 볼 때, 알기네이트는, β-D-만누론산 및 α-L-굴루론산의 이형 중합체 부위에 의해 격리되어 있는, β-D-만누론산 및 α-L-굴루론산의 동종 중합체 기로부터 유래하는 음이온 다당류이다. 알기네이트는 수용성으로서 1가 양이온 예를 들어, 나트륨이나 칼륨이 존재할 때 고 점도 용액을 형성한다. 하나의 알기네이트 사슬과 2가, 3가 또는 다가 양이온(예를 들어, 칼슘, 바륨 또는 폴리리신)이 상호 작용을 함에 따라서 가교 수 불용성 하이드로겔이 생성된다. 바람직하게 정제된 알기네이트[예를 들어, DE 198 36 960에 의한 정제 알기네이트; 본 문헌의 구체적인 개시 사항은 본원에 참고용으로 인용되어 있음], 더욱 바람직하게는 생리 염 용액 중 칼륨 또는 나트륨 알기네이트가 캡슐화에 사용된다. 이와 같은 알기네이트의 평균 몰 질량은 약 20?약 10,000kDa이고, 더욱 바람직하게는 몰 질량 약 100?약 1,200kDa이다. 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 코어 및/또는 하나 이상의 표면 코팅층을 형성하는데 사용되는 알기네이트는 용액, 더욱 바람직하게는 수용액으로 제공될 수 있는데 예를 들어, 사용될 알기네이트의 수성 알기네이트 용액 0.2%(w/v)의 점도는 약 2?약 50mPa의 범위 내, 더욱 바람직하게는 약 3?약 10mPa의 범위 내일 수 있다. 만일, 본 발명에 따라서 알기네이트를 사용한다면, α-L-굴루론산 중에 풍부한 알기네이트가 바람직하다. 다시 말해서, 50% 이상의 α-L-글루쿠론산(그리고, 50% 미만의 β-D-만누론산)을 함유하는 알기네이트가 바람직하다. 사용될 알기네이트는 50?70%의 α-L-굴루론산과, 30?50%의 β-D-만누론산을 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 제조에 적당한 알기네이트는, 임의의 종의 조류 예를 들어, 갈조류 예를 들어, 라미나랄레스, 엑토카페일스 및 푸칼레스 등과, 알기네이트를 생산하는 기타 종의 조류(이에 한정되는 것은 아님)로부터 추출하여 얻을 수 있다. 알기네이트는 당 업자에게 공지된 임의의 알기네이트 생산 방법에 따라서 신선한 조류 물질 또는 건조된 물질로부터 분리할 수 있다.

본원에 정의된 가교 중합체로서, 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어를 제조하는데 사용되는 가교 중합체와, 본원에 정의된 가교 중합체로서/가교 중합체이거나 이 (구형) 마이크로캡슐의 하나 이상의 표면 코팅층을 제조하는데 사용되는 가교 중합체는, 선택 중합체와 선택 농도에 있어서 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명의 제1 구체예에 의하면, 상기 (구형) 코어와 하나 이상의 표면 코팅층을 제조하는데 사용된 가교 중합체는 화학적으로 동일한 중합체를 동일한 농도 또는 상이한 농도로 포함할 수 있다. 바람직하게 (구형) 코어와 하나 이상의 표면 코팅층에 존재하는 중합체는 상기 정의한 중합체들 중 임의의 것으로부터 선택되는 비 가교 중합체 용액을 이용하여 제조된다. 이와 같은 중합체 용액에 있어서, 비 가교 중합체는 통상적으로, 농도 약 0.1?약 8%(w/v)의 비 가교 중합체, 더욱 바람직하게는, 농도 약 0.1?약 4%(w/v)의 비 가교 중합체, 더더욱 바람직하게는 농도 약 0.5?약 2.5%(w/v)의 비 가교 중합체로 존재하고, 가장 바람직하게는 농도 약 1?약 2%(w/v)의 비 가교 중합체로 존재한다. 만일 상기 개시된 알기네이트가 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어와 본원에 정의된 가교 중합체 제조용 중합체로서 사용되고/사용되거나, 이 (구형) 마이크로캡슐의 하나 이상의 표면 코팅층 제조용 중합체로서 사용되면, (구형) 코어 제조용 중합체 용액의 농도와, 이 (구형) 마이크로캡슐의 하나 이상의 표면 코팅층 제조용 중합체 용액의 농도는 각각 독립적으로, 비 가교 중합체 농도 0.1?4%(w/v), 바람직하게는 비 가교 중합체 농도 0.4?2%(w/v)로부터 선택될 수 있다. 상기 두 가지 용액을 제조하는데 사용되는 알기네이트의 농도는 동일할 수 있다. 대안적으로, 상이한 알기네이트 농도는 본 발명에 의하여 사용되는 (구형) 마이크로캡슐의 하나 이상의 표면 코팅층과 (구형) 코어를 제조하는데 사용될 수 있다. 바람직하게 (구형) 코어 및/또는 하나 이상의 표면 코팅층을 제조하는데 사용된 비 가교 중합체는 화학적으로 동일한 중합체를, 본원에 정의된 중합체와 함께, 더욱 바람직하게는 동일한 농도로 예를 들어, 본원에 정의된 농도로 포함한다. 본 발명에 있어서, "%(w/v)"란 용어는 예를 들어, (가교 전) 적당한 용매 중에 비 가교 중합체를 용해한 이후의 비 가교 중합체의 농도를 의미하는 것으로서, 통상적으로는 건조된 형태인 중합체의 임의의 양 대 중합체 용액의 총 부피를 기준으로 결정된다. 그러나, 상기 농도는 예를 들어, 표준 조건(실온 및 정상 압력 등)에서 유체 응집체의 형태로 존재하는 중합체가 사용될 경우, 상기 "%(w/v)"에 상응하여 "% v/v" 농도로 나타낼 수도 있다.

본 발명의 제2 구체예에 의하면, (구형) 코어 및 하나 이상의 표면 코팅층을 제조하는데 사용되는 가교 중합체는 화학적으로 상이한 중합체를 동일하거나 상이한 농도로 포함할 수 있다. 그러므로, 농도 및 중합체는 각각 독립적으로 (구형) 코어 및 하나 이상의 표면 코팅층에 대해서 본원에 정의된 바와 같이, 개별적으로 선택될 수 있다. 뿐만 아니라, 중합체는 본원에 정의된 중합체 예를 들어, 천연 중합체, 합성 중합체 그리고 이 중합체의 조합체(즉, 블록 중합체)로부터 선택될 수 있다. 코어 또는 하나 이상의 표면 코팅층에 사용되는 중합체의 성질은 또한, 사용된 중합체의 분자량의 차이 및/또는 동일한 중합체의 가교 상의 차이로 인해 달라질 수도 있다.

(구형) 마이크로캡슐이 하나 이상의 표면 코팅층을 포함하는 경우, 하나 이상의 표면 코팅층 각각에 존재하는 중합체는 동일하거나 상이할 수 있는데, 다시 말해서, 각각의 표면 코팅층을 이루는 가교 중합체는 화학적으로 동일하거나 상이한 중합체를 동일하거나 상이한 농도로 포함할 수 있으며 예를 들어, 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐은 본원에 정의된 바와 같은 임의의 중합체로 이루어진, 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 표면 코팅층과, 다가의 양이온으로 이루어진 부가 외부 표면 코팅층 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 폴리아미노산 예를 들어, 폴리-L-리신 및 폴리-L-글루탐산 등을 포함할 수 있다. 이와 유사하게, 표면 코팅층을 상이하도록 만드는데 사용되는 중합체의 특성은, 사용된 중합체의 분자량의 차이 및/또는 동일한 중합체의 가교 상의 차이로 인하여 달라질 수 있다.

부가적으로, 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어는 세포를 포함한다. 이와 같은 세포는 통상적으로, 본 발명에 사용될 수 있는 것으로서, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 줄기 세포 또는 간질 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포로부터 선택되거나, 또는 기타 임의의 세포(유형)로부터 선택된다. 이와 같은 세포는 통상적으로, 세포를, 이하 정의한 바와 같은, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질을 암호화하는 핵산, 또는 이의 단편이나 변이체, 또는 이와 같은 핵산, 이의 단편이나 변이체를 함유하는 벡터로 안정하게 형질 감염함으로써 얻을 수 있다.

본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어에 적당한 세포는 (미분화) 줄기 세포 예를 들어, 전능 세포(totipotent cell), 다능 세포(pluripotent cell) 또는 다능 세포(multipotent cell)로부터 선택될 수 있다. 본 발명에서 사용된 줄기 세포는, 배아 줄기 세포, 또는 외배엽, 중배엽 또는 내배엽으로부터 유래하는 줄기 세포, 또는 성체 줄기 세포 예를 들어, (사람의) 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포(MSC, hMSC)(예를 들어, 사람의 골수 또는 지방 조직으로부터 유래하는 것), 조혈 모세포, 피부 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 미성숙 섬유 아세포 예를 들어, 피부로부터 유래하는 섬유 아세포(근 섬유 아세포) 등을 포함하는 것이 바람직하다. 이와 같이 (미분화된) 줄기 세포는 통상적으로, 대칭적 줄기 세포 분열 즉, 동일한 복사체를 만들어내는 세포 분열을 수행할 수 있다. 줄기 세포는 임의의 세포 유형으로 변형되는 능력을 유지한다. 뿐만 아니라, 줄기 세포는 비대칭적으로 분열하여, 줄기 세포 복사체와, 줄기 세포 복사체와 상이한 기타 세포 예를 들어, 분화된 세포가 될 수 있다. 본원에 정의된 줄기 세포 특히, 본원에 사용되는 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어에 사용하기 적당한 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포는 부가적으로, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 것으로서, 암호화되어 분비되는 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 임의의 기타 단백질 또는 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체의 효능을 지지해주는 내인성 영양 인자 군을 생산할 수도 있다. 이와 같이 간엽 간질 세포의 주변 분비 세포 보호 기작에 대해 생물학적으로 활성인 인자는 예를 들어, 시토킨 GRO, IL-6, IL-8, MCP-1 및 성장 인자 VEGF, GDNF 및 뉴로트로핀-3일 수 있다. 특히 바람직한 구체예에 의하면, (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내부의 세포는 VEGF, IL-6, IL-8, GDNF, NT3 및 MCP1 등으로부터 선택되는 내인성 단백질 또는 펩티드를 주변 분비 인자로서 분비하며, 이 내인성 단백질 또는 펩티드는 캡슐을 통과하여 치료학적 수준으로 방출된다.

본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 코어는 대안적으로 (분화된) 세포로부터 선택되는 세포로서 예를 들어, 상기 줄기 세포 또는 간질 세포 예를 들어, 결합 조직 군 세포 예를 들어, (성숙) 섬유 아세포, 연골 세포(연골 세포), 뼈 세포(조골 모세포/골 세포, 파골 세포), 지방 세포(지방 세포) 또는 평활근 세포, 또는 혈액 세포 예를 들어, 림프양 선조 세포 또는 이로부터 유래하는 세포 예를 들어, NK 세포, T-세포, B-세포 또는 수지상 세포, 또는 일반적인 골수계 전구 세포 또는 이로부터 유래하는 세포 예를 들어, 수지상 세포, 단핵구, 대식 세포, 파골 세포, 호중구, 호산구, 호염구, 혈소판, 거핵 세포 또는 적혈구, 또는 대식 세포, 신경 세포 예를 들어, 성상 세포, 희돌기 교세포 등, 또는 상피 세포 또는 표피 세포로부터 얻을 수 있는 세포를 함유할 수도 있다. 이와 같이 분화된 세포는 통상적으로, 분화된 모 세포의 동일한 복사체를 생산하는 세포 분열인 대칭적 세포 분열을 수행할 수 있다. 뿐만 아니라, 몇몇 경우에 있어서, 이와 같이 분화된 세포는 비대칭적으로 분열하여, 모 세포와 동일한 복사체 및 모 세포와 상이한 또 다른 세포 즉, 모 세포보다 분화가 더 진행된 세포를 생산할 수 있다. 대안적으로, 몇몇 경우에 있어서, 본원에 정의된 분화 세포는 예를 들어, 선택적인 분화 인자를 첨가하여 세포 분열을 진행시킬 필요 없이도, 추가로 분화될 수 있다.

더욱이, 본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포는, 치료될 환자 자신으로부터 유래하는 세포(즉, 자가 조직 세포)이거나 동종 유래 세포로부터 유래하는 세포(예를 들어, 시험관 내 배양되어 확립된 세포주 예를 들어, HEK293 세포 및 hTERT-MSC 세포 등으로부터 유래하는 세포)일 수 있다. 본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐 내 (구형) 코어를 매립하고 있는 표면 코팅층으로 인하여, 치료될 환자에 의해 원치않는 면역 반응을 유발시키지 않고서도 동종 유래 세포를 사용할 수 있다.

본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포는 또한, 본원에 정의된 (분화 및/또는 미분화) 세포 유형의 조합체일 수도 있다. 본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어는 예를 들어, 사람의 간엽 줄기 세포 또는 사람의 간엽 간질 세포를 함유할 수 있는데, 여기서, 이 세포의 일부는 시험관 내 또는 생체 내에서 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 세포 유형 예를 들어, 지방 세포(지방 조직으로 이식하는데 적당한 지방 세포) 등으로 분화될 수 있다. 그러므로, (예를 들어, 특정한 줄기 세포 유형으로부터 유래하는) 다양한 세포 유형 예를 들어, 계통이 공통된 세포 유형을 코어에 배치할 수 있다.

요약하면, 본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어를 제조하는데 적당한 세포는 미분화 세포 또는 분화 세포로부터 선택될 수 있다. 하나의 구체예에 의하면, 본원에 정의된 미분화 세포가 바람직할 수 있다. 이와 같은 미분화 세포는 유리한 특성을 제공할 수 있는데 예를 들어, 이와 같은 미분화 세포의 수명이 연장됨으로 인해서, 본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐 효능이 연장되어 발현될 수 있는데 예를 들어, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를 발현 및 분비하는 효능이 연장되어 발현될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 본원에 정의된 분화 세포는 본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어를 제조하는데 바람직할 수 있는데, 그 이유는, 이 세포가 통상적으로 더 이상 증식하지 않으므로, 본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에서도 세포가 원치 않게 증식하지 않기 때문이다. 세포의 특이적인 분화는, 당 업자에 의하여 당 업계에 공지된 방법에 따라 시험관 내에서 전구체 세포에 선택된 분화 인자를 첨가하여 수행될 수 있다. 바람직하게 세포는 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 대다수의 세포(또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 및 가장 바람직하게는 99% 이상의 세포)가 동일한 세포 유형에 속하도록 분화되는 것이 바람직하다. 특히, 본원에 정의된 바와 같은 간엽 줄기 세포는 시험관 내에서 예를 들어, 조골 모세포, 연골 세포, 지방 세포 예를 들어, 지방 세포, 뉴런 유사 세포 예를 들어, 뇌 세포 등으로 분화되어, 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 미분화 세포 또는 분화 세포가 본원에 정의된 바와 같은 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어를 제조하는데 사용되는지 여부는, 치료될 질병의 특이적인 요구 사항 예를 들어, 발병 위치, 투여 방식, 이식용으로서 선택된 조직 등에 따라서 달라질 수 있다. 이와 같은 기준을 평가하는 당 업자에 의해서 적당한 세포를 선택할 수 있다.

뿐만 아니라, 본원에 정의된 바와 같은 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어를 제조하는데 적당한 세포는 무한 증식 세포 또는 비-무한 증식 세포일 수 있는데, 무한 증식 세포인 것이 바람직할 수 있다. 만일 무한 증식 세포를 사용하면, 이 세포는 전술한 바와 같은 대칭 및/또는 비대칭 세포 분열 능력을 보유하는 것이 바람직하다. 본 발명에 의하면, 세포의 수명이 정상 세포(즉, 비-무한 증식 세포) 수명의 2배를 초과할 때, 그 세포를 무한 증식성 세포라고 정의한다. 정상 2배체 세포의 시험관 내 최대 수명은 세포 유형(예를 들어, 태아 세포 대 성체 세포)과 배양 조건에 따라서 달라진다. 그러므로, 시험관 내 배양된 정상 세포의 최대 수명은 60?80회의 집단 배가(population doubling) 시간과 맞먹는다. 예를 들어, 각질 세포는 약 80회 분열할 수 있으며, 섬유 아세포는 50회 이상, 그리고 림프구 세포는 약 20회 분열할 수 있다. 정상적인 골수 간질 세포의 최대 수명은 30?40회의 집단 배가 시간이다. 바람직하게 본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어를 제조하는데 사용되는 세포주는 350회의 집단 배가 단계를 거쳐 연속적으로 성장할 수 있으며, 이 경우, 어린 세포의 특징을 이루는 정상 성장 속도를 여전히 유지할 수 있다.

본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어를 제조하는데 사용되는 세포를 무한 증식시키는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 이 방법을 본원에서도 이용할 수 있다[본원에 참고용으로 인용되어 있는 WO 03/010305 및 WO 98/66827 참조]. (WO 03/010305에 따른) 대표적인 방법은 다음과 같은 단계들을 포함한다:

a) 세포 예를 들어, 줄기 세포 구체적으로, 당 업자에게 공지된 통상의 표준적인 세포 배양 방법에 따라서 사람의 골수로부터 생산된 줄기 세포(예를 들어, (사람의) 간엽 줄기 세포(MSC, hMSC))를 배양하는 단계;

b) 다음과 같은 단계들 즉, b1)?b5)에 의하여, 사람의 텔로머라제 역전사 효소(hTERT) 유전자 또는 이의 변이체의 최소한의 단편을 포함하는 레트로바이러스 벡터를 상기 세포 배양액에 형질 도입하는 단계:

b1) 패키징 세포주(packaging cell line)(예를 들어, PA317 세포, PG13 세포 및 피닉스(Phenix) 등)를 배양하는 단계로서, 상기 패키징 세포주는 레트로바이러스 벡터를 생산하는 세포인 것인 단계,

b2) (예를 들어, 원숭이 쥐과 동물 백혈병 바이러스 등으로부터 유래하는) 레트로바이러스 벡터를 구성하는 단계로서, 상기 레트로바이러스 벡터는 사람의 텔로머 반복부(hTRT) 유전자 또는 이의 변이체의 촉매 서브유닛의 최소한의 단편, 더욱 바람직하게는 hTRT cDNA 단편 예를 들어, pGRN145(게론 코포레이션)로부터 유래하는 3452 염기쌍의 EcoRI 단편을 포함하는 것인 단계,

b3) 상기 패키징 세포주를 상기 레트로바이러스 벡토로 형질 감염하는 단계,

b4) 바람직하게는 형질 감염된 세포를 레트로바이러스 벡터와 함께 원심 분리하여, 상기 패키징 세포주에 상기 형질 감염된 세포를 형질 도입하는 단계, 그리고

b5) 상기 단계 a)에 의하여 배양된 세포에 상기 단계 b4)의 패키징 세포를 형질 도입하는 단계로서, 상기 세포는 상기 레트로바이러스 벡터를 포함하는 것인 단계 ;

c) 무한 증식 세포주를 생산하는 단계로서, 여기서, 상기 무한 증식성 세포주는 상기 단계 a)의 세포와 비교하였을 때 실질적으로 동일한 특징 및 특성을 나타내는 것인 단계. 결과적으로, 사람의 텔로머 서브유닛(hTRT) 유전자로부터 유래하는 폴리뉴클레오티드 서열로서 상기 벡터에 삽입된 서열은 전사 및 번역되어, 기능성 털로머라제를 생산할 수 있다. 당업자는 코돈의 축퇴성으로 인하여, 다수의 폴리뉴클레오티드 서열이 동일한 텔로마라제를 암호화할 것이라는 사실을 인식할 것이다. 뿐만 아니라, 야생형 텔로머라제 서열과 실질적으로 동일한 서열을 가지며, 야생형 텔로머라제 폴리펩티드의 기능을 가지는 텔로머라제 변이체(예를 들어, 야생형 텔로머라제 폴리펩티드 내 아미노산의 보존적 치환으로 생성되는 변이체)가 포함된다.

본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포는 통상적으로, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하도록 조작되거나, 또는 천연의 상태에서 암호화 및 분비한다.

본 발명의 내용 중, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체는 안 질병과 관련하여 신경 보호 효과 및/또는 혈관 신생 억제 효과 또는 추가의 긍정적인 효과 예를 들어, 항 세포 고사 효과를 나타내는 것으로 공지된 임의의 단백질 또는 펩티드로부터 당 업자에 의해 선택될 수 있다.

본 발명의 내용 중, "신경 보호 효과"란 용어는, 바람직하게는 예를 들어, 본원에 정의된 질병으로 인한 세포 고사 또는 변성이 뉴런에서 일어나지 않도록 막아주는, 신경계 내에서 진행되는 기작을 의미한다. 그러므로, "신경 보호 인자"란, 바람직하게는 신경계 내에서 진행되는 기작을 이용하고, 더욱 바람직하게는 본원에 정의된 안 질병에 있어서 뉴런이 세포 고사하거나 변성되는 것을 막아주는 화합물, 더욱 바람직하게는 펩티드를 의미한다.

안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체 바람직하게는, 본원에 정의된 바와 같은 신경 보호 인자를 사용하는 안구 내 약물 요법의 신경 보호 측면, 또는 더욱 정확하게는 세포 보호 측면은, 망막 예를 들어, 시신경(망막의 확장부), 각막 내피(진행성 각막 내피 이 영양증 또는 기타 질환), 그리고 전방 우각 내 섬유주대(안구 내 압력 상승을 유도하고 결과적으로는 고압 녹내장을 일으키는, 수양액 유출 저항성이 상승하는 위치)에 발병한 대부분의 질환에 영향을 미칠 수 있다. 이와 같은 세포 보호 요법의 목적은 눈의 기능에 필요한 세포가 소실되는 것을 막거나 또는 최소한 지연시키는 것이다. 이 요법의 신경 보호 측면/효과는 특히 당뇨병성 망막 병증에 중요한데, 그 이유는, 당뇨병성 망막 미소 혈관증으로 인한 망막 세포 소실이 당뇨병성 망막 병증 환자에 있어서 눈의 시각 기능을 감소시키는 가장 중요한 이유가 되기 때문이다. 안구 내 세포 보호 요법으로서는 또한, 당뇨병이 진행되고 있는 각막 내피 및 모세 혈관 주위 세포에 있어서, 이 모세 혈관을 혈액 관류를 위해 개방 상태로 유지시키는 것, 또는 혈액 공급이 잘되지 않던 망막 조직을 혈액 공급이 잘되도록 만들기 위하여 이 모세 혈관이 다시 관류하도록 만드는 것을 포함할 수도 있다.

뿐만 아니라, "혈관 신생 억제 효과"란 용어는, 혈관 신생 즉, 새로운 혈관이 성장하는 것을 억제하는 기작을 의미한다. 그러므로, "혈관 신생 억제 인자"는 본원에 정의된 안 질병에 있어서, 혈관 신생 예를 들어, 새로운 혈관의 성장을 억제하는 화합물인 것이 바람직하고, 펩티드인 것이 더욱 바람직하다.

안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체는, 직접 투여할 수 있거나, 본원에 정의된 벡터에 의해 암호화될 수 있거나, 또는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포를 통하여 투여될 수 있다.

안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체가 본원에 개시된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포를 통하여 투여되면, 이 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포는 통상적으로, 코어를 제조하기 전에, 이와 같이 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질을 암호화하는 핵산 서열, 또는 이의 단편이나 변이체로 형질 감염된다. 이와 같은 형질 감염을 통하여, 세포는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를 발현 및 분비할 수 있게 된다.

특히 바람직한 구체예에 의하면, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 이의 단편 또는 변이체는 혈관 신생 억제 인자, 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체로부터 선택될 수 있다. 바람직하게 혈관 신생 억제 인자는 엔도스타틴(Endostatin), 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체이다. 엔도스타틴은 콜라겐 XVIII의 천연 생성 C-말단 절단 생성물(20kDa)이다. 이는 안지오스타틴과 트롬보스폰딘과 유사하게, 혈관 신생 억제제로서 사용된다고 보고되고 있다. 엔도스타틴은 작용 스펙트럼이 넓은 혈관 신생 억제 인자로서, 성장 인자 예를 들어, 염기성 섬유 아세포 성장 인자(bFGF/FGF-2) 및 혈관 성장 인자(VEGF)의 혈관 신생 촉진 작용(pro-angiogenic action)을 방해할 수 있다.

기타 바람직한 구체예에 의하면, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체는 본원에 정의된 신경 보호 인자, 또는 이의 단편이나 변이체로부터 선택될 수 있다. 바람직하게 상기 신경 보호 인자는 본원에 정의된 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드, 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체로부터 선택될 수 있다.

하나의 바람직한 구체예에 의하면, 신경 보호 인자는 GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체로부터 선택될 수 있다.

신경 보호(및 바람직하게는 세포 고사 억제) 인자 GLP-1은 널리 연구된 글루카곤 유전자(프리프로글루카곤을 암호화하는 유전자)상에 위치하고 있다[예를 들어, 문헌(White, J.W.외 다수, 1986, Nucleic Acid Res. 14(12) 4719-4730) 참조]. 분자량이 큰 전구체 분자인 프리프로글루카곤 분자는 췌장의 알파 세포와 공장 그리고 결장 L 세포에서 합성된다. 프리프로글루카곤은 길이 180 아미노산인 프로호르몬으로서, 이의 서열은 글루카곤 서열 이외에 관련 구조물의 서열을 2개 함유한다: 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1) 및 글루카곤 유사 펩티드-2(GLP-2). 프리프로글루카곤 분자에 있어서, GLP-1과 GLP-2 사이에는 17 아미노산 펩티드 서열(또는 15 아미노산 서열 + C-말단 RR 절단 위치) 및 개입 펩티드 2(intervening peptide 2; IP2)가 존재한다. (전구체 분자의 GLP-1과 GLP-2 사이에 위치하는) IP2 서열은 일반적으로 GLP-1의 37 아미노산 뒤에서 생체 내 단백 분해된다. 그러므로, 프리프로글루카곤 모듈은 세포와 환경에 따라서 다양한 펩티드 예를 들어, GLP-1(1~37), 37 아미노산 펩티드(가공되지 않은 형태)로 절단된다. 일반적으로, 이와 같은 가공 과정은 췌장 및 소장 내에서 진행된다. GLP-1(1~37) 서열은 활성 GLP-1(7~37), 31 아미노산의 가공된 형태, 또는 이의 추가 변형 생성물 GLP-1(7~36) 아미드로 추가 단백 분해 가공될 수 있다. 그러므로, GLP-1(7~37)이란, 미지의 단편이 모 펩티드인 GLP-1의 N-말단으로부터 세었을 때 7번 아미노산으로부터 (시작하여)(또한 이 7번 아미노산을 포함) 37번 아미노산(또한 이 37번 아미노산을 포함)에 이르기까지의 아미노산 잔기들을 포함한다는 의미이다. GLP-1의 아미노산 서열(7~36), GLP-1(7~36) 아미드 및 GLP-1의 아미노산 서열(7~37)을 이하 화학식 I에 나열하였다(서열 번호 25):

[화학식 I]

His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X

[상기 식 중, X가 NH₂일 때에는 GLP-1(7~36) 아미드를 나타내거나, X가 존재하지 않을 때에는 GLP-1(7~36)을 나타내고, X가 Gly-OH일 때에는 GLP-1(7~37)을 나타냄]

GLP-1은 내장 호르몬으로서, 베타-세포 내 촉진성 아데닐레이트 사이클라제 및 단백질 키나제 활성을 나타내는 작용을 하는, 가장 강력한 내인성 인슐린 분비 촉진제이다. 생리적으로, 상부 위장관으로부터 유래하는 위장관 억제 폴리펩티드와 함께, 상기 GLP-1은, 혈중 글루코스 수치를 낮추어주는 인슐린 분비 자극 호르몬으로서 작용한다. 그러므로, 음식물 섭취에 반응하여 분비되는 GLP-1은 예를 들어, 모두 함께 혈중 당을 조절하는 역할을 하는 위, 간, 췌장 및 뇌에 다수의 효과를 나타낸다. 결과적으로, 글루카곤 유사 펩티드 GLP-1(7~36) 아미드와 이의 비-아미드화 유사체 GLP-1(7~37)은, 이것의 탄수화물 기작에 대한 강력한 작용성과 당뇨병 예를 들어, 제2형 당뇨병의 치료에 대한 잠재적인 효능으로 인하여, 상당한 효과를 나타낸다. 추가의 신경 보호 특성은 관상 심장병의 치료시에만 나타난다.

본 발명의 하나의 구체예에 의하면, 상기 GLP-1 펩티드는 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 임의의 공지 GLP-1 펩티드 서열로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 있어서, GLP-1 펩티드는 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 분비될 수 있으므로, (구형) 코어를 제조하기 전에 본원에 정의된 GLP-1 펩티드를 암호화하는 핵산 서열로 상기 세포를 형질 감염시켜, 이 세포가 GLP-1을 발현 및 분비할 수 있도록 만들 수 있다. 바람직하게 본원에 사용된 GLP-1 펩티드는 (구형) 마이크로캡슐 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있는 것으로서, 이는 (야생형) GLP-1의 7~35번 아미노산을 포함하는 펩티드와, 이 펩티드와의 동일성이 80% 이상, 90% 이상, 90% 이상 또는 99% 이상인 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 일반적으로, 상기 GLP-1 펩티드는 (i) (야생형) GLP-1의 1~37번 아미노산을 포함하는 펩티드, (ii) (야생형) GLP-1의 7~35, 36 또는 37번 아미노산을 포함하는 펩티드, (iii) GLP-1(7~36) 아미드 및 (iv) 변형된 펩티드를 포함하여 상기 펩티드들 중 임의의 것과의 동일성이 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상인 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 있어서, "변형 GLP-1 펩티드"란, (야생형) GLP-1의 생물학적 기능을 보유하는 임의의 GLP-1 변이체 또는 GLP-1 단편 예를 들어, 이의 조합(예를 들어, 변이체의 단편)을 의미하는 것이다. 변이체 및 단편은 비 변형 GLP-1 서열 예를 들어, GLP-1(7~35, 36 또는 37)의 변형체로서 분류된다. 본 발명의 의미 내에서, 임의의 변이체 또는 단편은 기능을 가져야 하는데 예를 들어, 비 변형 (GLP-1) 펩티드와 동일하거나 유사한 생물 활성을 수행해야 한다. "활성"이란 용어는, 생물학적 활성을 의미하는 것으로서 예를 들어, 수용체 결합, 수용체 활성화, GLP-1에 관하여 공지된 유익한 효과의 발현 예를 들어, 선행 기술에 공지된 GLP-1의 효과와 관련하여 전술한 심장 조직의 잠재적 사멸 및 허혈 또는 산소 결핍에 의해 유발된 손상을, 본원에 정의된 천연 생성 GLP-1 펩티드와 이의 임의의 단편 또는 변이체에 대한 조건과 동일한 조건 하에서 비교하였을 때, 상당 수준 감소시키는 활성을 포함하는 생물학적 활성 중 하나 이상을 의미한다. 바람직하게 본원에 정의된 GLP-1 펩티드의 변이체 또는 단편은 25% 이상의 GLP-1(7~35, 36 또는 37) 활성, 더욱 바람직하게는 50% 이상의 (생물학적) 활성, 더더욱 바람직하게는 60, 70, 80 또는 90%의 (생물학적) 활성, 그리고 가장 바람직하게는 95% 이상 또는 99% 이상의 본원에 정의된 GLP-1(7~35, 36 또는 37)의 (생물학적) 활성을 나타낸다. 생물학적 활성은 표준적인 검정법에 의해 측정될 수 있는데, 이 검정법은 바람직하게는 예를 들어, 제2형 당뇨병에 대한 동물 모델을 사용하여 혈중 글루코스 수치를 낮추는 호르몬인 인슐린 분비 자극 호르몬의 활성을 측정할 수 있다.

특히 바람직한 구체예에 의하면, 본원에 정의된 GLP-1 펩티드 또는 GLP-융합 펩티드[(구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화될 수 있는 GLP-1 펩티드 또는 GLP-융합 펩티드]의 N-말단에는 본원에 정의된 (천연) GLP-1(1~37) 서열의 천연 생성 아미노산(1~6)이 포함되어 있지 않다. 더욱 바람직하게 본원에 정의된 GLP-1 펩티드 또는 이하 정의된 GLP-융합 펩티드의 N-말단에는 본원에 정의된 천연 GLP-1(1~37) 서열의 천연 생성 아미노산(1, 2, 3, 4, 5 및/또는 6번)이 포함되어 있지 않다. 바람직하게 이와 같은 단서는 본원에 정의된 GLP-1 펩티드가 예를 들어, GLP-1의 7~35, 36 또는 37번 아미노산을 포함하는 펩티드, GLP-1(7~36) 아미드 및 상기 펩티드 중 임의의 것(변형된 펩티드 포함)과의 동일성이 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 99% 이상인 펩티드와, 이와 같은 GLP-1 펩티드를 함유하는 융합 GLP-1 융합 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 GLP-1 펩티드임을 의미한다. 그러나, 상기 단서는 이와 같이 본원에 정의된 GLP-1 펩티드 또는 본원에 정의된 GLP-1 융합 펩티드가, N-말단(또는 C-말단) 서열의 변형부 또는 부가 아미노산 또는 이에 융합된 펩티드(예를 들어, 신호 펩티드 서열 및/또는 리더 펩티드 서열 등)를 포함하긴 하지만, 야생형 GLP-1의 1~6번 아미노산으로 이루어진 서열과는 구별된다는 사실을 배제하지는 않는다. 기타 바람직한 구체예에서, GLP-1(7~35, 36 또는 37번)의 N-말단에 부착된 임의의 아미노산 또는 이의 상동체는 GLP-1(7~35, 36 또는 37번)의 6번 위치에 있는 천연 생성 아미노산과 상응하지 않는다. 추가의 바람직한 구체예에 의하면, GLP-1(7~35, 36 또는 37번)의 N-말단에 (바로) 부착되어 있는 임의의 아미노산 또는 이의 상동체는, 바람직하게는 GLP-1 내에 원래의 순서대로 배열되어 있는 천연 GLP-1의 천연 생성 아미노산(6번), 천연 생성 아미노산(5번 및 6번), 천연 생성 아미노산(4, 5 및 6번), 천연 생성 아미노산(3, 4, 5 및 6번), 또는 천연 생성 아미노산(2, 3, 4, 5 및 6번), 또는 천연 생성 아미노산(1, 2, 3, 4, 5 및 6번)과 상응하지 않는다. 특히 바람직한 구체에에 의하면, GLP-1(7~35, 36 또는 37번)의 N-말단에 부착된 임의의 아미노산 또는 이의 상동체는 프리프로글루카곤의 해당 서열과 상응하지 않는다.

천연 GLP-1 특히, GLP-1(7~36)은 생체 내 반감기가 짧기 때문에, 일반적으로 치료적 처치시(빈번한 투여가 엄격히 제한되어야 하거나, 또는 장기 투여가 예상되는 경우) 사용에 제한이 따른다. GLP-1이 혈장 내에 존재할 때에는, DPP-IV(디펩티딜 펩티다제 IV)에 의해서 8번 및 9번 잔기 사이가 신속하게 분해되어(수 분내), 비활성 NH₂-말단이 절단된 대사 물질 GLP-1(9~36번)이 생성된다. 또한, 천연 GLP-1은 통상적으로 신장 배설 기능에 관여한다. 이와 같은 요인들은, 어떤 펩티드, GLP-1(7~36) 또는 NH₂-말단 절단 대사 물질 GLP-1(9~36번)이 생체 내에서 활성을 띠는 부분인지 여부와, 천연 GLP-1 또는 이의 단편에 의해 치료가 행하여졌을 때 생리적 효과가 나타나는지 여부에 있어서 이슈가 된다. 결과적으로, 그리고 생체 내 신속하게 분해가 된다는 이유로, 천연 GLP-1 또는 이의 단편은 예를 들어, 급성 안 질병이 발병한 환자에 잠재적으로 유용한 단기 대사 제어에 적당한 도구(예를 들어, 중환자실용 도구)로서 사용될 수 있다.

이와 같이 급속하게 분해되는 것을 막기 위해서, 천연 생성 GLP-1(예를 들어, GLP-1(7~37))의 (DPP-IV에 의한 분해에 대해) 안정화된 유사체를 합성하기 위한 시도가 다수 행해졌다. 특히, 8번째 잔기(생체 내 Ala)는 다른 잔기 예를 들어, Gly, Ser 또는 Thr으로 치환하였다[Burcelin, R.외 다수(1999) Metabolism 48, 252-258]. Gly8 또는 G8 유사체 둘 다를, 합성된 분자로서 광범위하게 테스트하고, 돌연 변이 폴리펩티드를 분비하도록 유전자 조작된 세포주에 의해 생산하였다[Burcelin, R.외 다수(1999), Annals of the New York Academy of Sciences 875: 277-285]. 기타 다양한 변형을 예를 들어, GLP-1(7~37)에 도입하여, 그 자체의 생물학적 활성을 무력화하지 않고서 생체 내 안정성을 강화하였다.

이러한 연구를 통하여, GLP-1을 DPP-IV에 의한 분해에 대해 안정화함으로써[예를 들어, GLP-1 펩티드와 함께 DPP-IV 억제제를 추가로 투여함으로써], GLP-1의 생체 내 반감기가 짧다는 문제점을 해결할 수 있다. DPP-IV 억제제는 시험관 내 시스템에서 효율적으로 사용될 수 있기 때문에, GLP-1 펩티드와 함께 DPP-IV 억제제를 추가로 투여하는 것은 복잡한 과정이며, 통상적으로 원하는 만큼의 장기간 동안 치료를 수행할 수 없다. 뿐만 아니라, GLP-1의 투여를 필요로 하는 환자는 장기간 동안 즉, 치료 대상 질병을 환자가 앓고 있는 동안, 또는 최악의 경우 환자의 전 생애에 걸쳐서, 여전히 이 GLP-1 또는 이의 유사체나 변이체를 1회 또는 다수 회 투여받아야 한다. 이는 곧, 약물을 반복적으로 투여할 필요가 있음을 의미하는 것이다. 그러나, 눈에 약물을 투여하는 것은 고통스러울 수 있으며, 안구 내 주사는 안구 내 감염 또는 안구 구조에 물리적인 병변을 일으킬 위험성을 내포하고 있다. 뿐만 아니라, 생체 내 GLP-1의 반감기는 비교적 짧기 때문에 짧은 시간 간격을 두고 약물을 다시 투여해야 한다. 이와 같은 과정은 외과적인 과정에 해당하므로, GLP-1은 의사에 의해 투여되어야 한다. 상기 GLP-1 투여시 수정체 병변(백내장 유발) 또는 망막 병변(망막 박리 유발)이 생길 위험성이 매우 높으므로, 이 GLP-1은 환자 자신이 투여할 수는 없다. 뿐만 아니라, 이 약물이 반복적으로 자주 투여되면 약물을 안구 내에 반복적으로 투여함에 따라서 수정체와 망막에 의원성 병변이 생길 위험이 증가하고, 또한 감염이 일어날 위험도 증가하게 된다. 그러므로, 필요한 약물의 재투여 횟수를 눈에 띌 정도로 줄이는 방법과 기술을 개발할 것이 고도로 요망된다.

따라서, 대안적인 구체예에 의하면, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체는, 본원에 정의된 GLP-1 융합 펩티드, 또는 이의 단편이나 변이체로부터 선택되는 신경 보호 인자일 수 있다. 본원에 사용된 GLP-1 융합 펩티드는, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있다. 본 발명에 있어서, (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포(본원에 정의됨)는 통상적으로, GLP-1 융합 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 코어를 제조하기 전에 형질 감염되므로, 이와 같은 세포는 GLP-1 융합 펩티드를 암호화, 발현 및 분비하는 것이다.

본원에 정의된 GLP-1 융합 펩티드는 2개 이상의 성분 예를 들어, 성분 (I) 및 (II); 성분 (I) 및 (III); 또는 성분 (I), (II) 및 (III)을 가지고, 본원에 정의된 GLP-1의 생물학적 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 통상적으로 C-말단 연장에 의해 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I)에 안정성을 부여한다. 본원에 정의된 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I)은 통상적으로 상기 정의된 바와 같은 GLP-1 펩티드의 서열, 바람직하게는 서열 번호 1의 서열과의 서열 동일성이 80% 이상, 더욱 바람직하게는 85% 이상 및 더더욱 바람직하게는 90% 이상인 서열을 함유한다. 서열 번호 1은 GLP-1(7~37)의 천연 아미노산 서열(길이 = 31 아미노산)을 나타내는 것으로서, 포유 동물 사이에서 고도로 보존되어 있다. 특히 바람직한 구체예에 의하면, 본원에 정의된 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I)은 서열 번호 1의 서열, 또는 서열 번호 1 중 36번 및/또는 37번 아미노산이 결여된 서열과 동일한 서열을 포함한다.

본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 융합 펩티드[또는 더욱 일반적으로는, 융합 펩티드의 단편 또는 변이체를 포함하는 임의의 GLP-1 펩티드]의 성분 (II)는 통상적으로, 9개 이상의 아미노산을 가지는 펩티드 서열을 함유한다. GLP-1 융합 펩티드 성분 (II)의 서열 길이는 통상적으로, 9?30 아미노산, 바람직하게는 9?20 아미노산, 가장 바람직하게는 9?15 아미노산일 수 있다. 일반적으로 말해서, 성분 (II) 내 서열이 짧으면 서열이 긴 경우보다 GLP 수용체와의 결합 활성이 훨씬 우수하므로, 성분 (III) 내 서열이 짧을수록 바람직할 수 있다. 성분 (II)의 서열은 필수 전제 조건은 아니지만, 이 서열은 중성이거나 또는 pH7에서 음 하전을 띠는 것이 바람직할 수 있다. 또한, GLP-1 융합 펩티드의 성분 (II)는 자체의 서열 내에 하나 이상의 프롤린 잔기를 함유할 수도 있다. 프롤린 잔기는 턴(turn) 형성 4량체 아미노산 서열 내에 공통적으로 존재하는 아미노산이다. 그러므로, GLP-1 융합 펩티드의 성분 (II)는 β-턴 유사 구조를 형성할 수 있다. β-턴 구조는 단백질 또는 펩티드의 전형적인 2차 구조 요소이다. 이 구조는 통상적으로, 펩티드 또는 단백질 주쇄 방향을 역전하는, 4개의 아미노산으로 이루어진 연장 부에 의해 형성된다. 만일 GLP-1 융합 펩티드 내에 상기 구조가 존재한다면, 프롤린 잔기는 일반적으로, GLP-1 융합 펩티드의 성분 (II) 내에 형성되는 4량체 β-턴 서열 모티프의 2번 또는 3번 위치, 바람직하게는 2번 위치에 위치한다.

본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 융합 펩티드, (또는 더욱 일반적으로는, 이 융합 펩티드의 단편 또는 변이체를 포함하는 임의의 GLP-1 펩티드)의 성분 (II)는 VAIA, IAEE, PEEV, AEEV, EELG, AAAA, AAVA, AALG, DFPE, AADX, AXDX 및 XADX [식 중, X는 임의의 아미노산(천연 생성 아미노산 또는 변형된 비-천연 아미노산)을 나타냄]으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 모티프를 함유할 수 있다. 이와 같은 4량체 모티프는 성분 (II)의 서열 중 임의의 곳에 위치할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 융합 펩티드 성분 (II)는, AA, XA, AX, RR, RX 및 XR[식 중, X는 임의의 아미노산(천연 생성 아미노산 또는 변형된 비-천연 아미노산)을 나타냄]로 이루어진 군으로부터 선택된 N-말단 서열 모티프에 의해 성분 (I)의 C-말단에 결합되어 있는 펩티드 서열이다.

본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해서 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (II)로서 특히 바람직한 것은, 서열 번호 48 [X₁X₁DFPX₂X₂X₃X₄]에 의한 서열을 함유하는 펩티드 서열로서, 사람 또는 쥣과 동물 IP-2의 부분 서열에 상응하는 서열인데, 이 경우, 통상적으로 X₁은 각각 독립적으로 임의의 천연 생성 아미노산, 바람직하게는 아르기닌(R) 또는 알라닌(A), 더욱 바람직하게는 알라닌(A)으로부터 선택되거나, 또는 존재하지 않을 수 있으며; 여기서, 통상적으로 X₂는 각각 독립적으로 아스파르트산(D) 또는 글루탐산(E)으로부터 선택되고, 통상적으로 X₃ 및 X₄는 각각 독립적으로 임의의 천연 생성 아미노산, 바람직하게는 알라닌(A), 글리신(G), 이소루신(I), 루신(L), 트레오닌(T) 또는 발린(V)으로부터 선택된다. X₄는 또한 존재하지 않을 수도 있다.

본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해서 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (II)로서 더욱 바람직한 것으로서는, 서열 번호 22(RRDFPEEVAI), 서열 번호 27(DFPEEVAI), 서열 번호 28(RDFPEEVA), 또는 서열 번호 29(RRDFPEEV), 서열 번호 30(AADFPEEVAI), 서열 번호 31(ADFPEEVA), 또는 서열 번호 32(AADFPEEV)에 의한 서열을 함유하는 펩티드 서열[여기서, 모든 펩티드 서열은 1 문자 암호로 표시함], 또는 서열 번호 22, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32와의 서열 동일성이 80% 이상인 서열을 함유하는 펩티드 서열이 있다. 서열 번호 22는 전장 IP-2(개입 펩티드 2) 서열의 부분 서열로서, 15개의 아미노산으로 이루어진 전장 IP-2 서열 중 N-말단 아미노산을 10개 함유한다. IP-2는 본원에 사용된 성분 (II)의 바람직한 예이다. 그러므로, 기타 더욱 바람직한 서열로서, 본원에 정의된 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (II) 내에 함유된 서열로서는, IP-2의 길이가 긴 부분 아미노산 서열 예를 들어, 사람에 존재하는 14개의 아미노산으로 이루어진 N-말단 아미노산 서열(서열 번호 23: RRDFPEEVAIVEEL) 또는 쥣과 동물에 존재하는 이의 상보체(서열 번호 24: RRDFPEEVAIAEEL), 또는 서열들[(서열 번호 33: AADFPEEVAIVEEL) 또는 (서열 번호 34: AADFPEEVAIAEEL)], 또는 이 서열 번호 23, 24, 33 또는 34의 서열과 서열 동일성이 80% 이상인 서열이 있다. GLP-1 융합 펩티드의 성분 (II) 내에 포함될 요소로서 가장 바람직한 것으로서는, 15개의 아미노산으로 이루어진 천연 생성 IP-2 서열 전부[서열 번호 2(RRDFPEEVAIVEELG; 사람), 또는 서열 번호 3(RRDFPEEVAIAEELG; 쥣과 동물), 또는 서열 번호 35(AADFPEEVAIVEELG), 또는 서열 번호 36(AADFPEEVAIAEELG)]를 가지는 전장 IP-2 서열, 또는 상기 서열 번호 2, 3, 35 또는 36의 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 서열을 가지는 전장 IP-2 서열이 있다. 본 발명의 범위 내에는 IP2의 포유 동물 아형(포유동물 중 IP2의 천연 변이체) 전부도 포함된다. 성분 (II)에 포함되는 서열의 복사체 중 하나 이상(예를 들어, IP2의 2개 또는 3개 이상의 복사체, 또는 이 IP2의 단편이나 변이체)이 제공될 수 있다.

그러므로, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비된 GLP-1 융합 펩티드는 서열 번호 8에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG) 즉, 어떠한 링커 서열도 없이 C-말단을 통하여 쥣과 동물의 IP2에 결합된 GLP-1(7~37), 또는 서열 번호 12에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELG) 즉, 어떠한 링커 서열도 없이 C-말단을 통하여 사람의 IP2에 결합된 GLP-1(7~37), 또는 서열 번호 37에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIAEELG) 즉, 어떠한 링커 서열도 없이 C-말단을 통하여 IP2에 결합된 GLP-1(7~37), 또는 서열 번호 38에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIVEELG) 즉, 어떠한 링커 서열도 없이 C-말단을 통하여 IP2에 결합된 GLP-1(7~37), 또는 서열 번호 39에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIAEELG), 서열 번호 40에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIAEELG), 서열 번호 41에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADAAAAVAIAAALG), 서열 번호 42에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFP), 서열 번호 43에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVA), 서열 번호 44에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELGRRHAC), 서열 번호 45에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIVEELG), 서열 번호 46에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIVEELG), 서열 번호 47에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADAAAAVAIVAALG), 또는 서열 번호 48에 의한 서열(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIVEELGRRHAC) 즉, 어떠한 링커 서열도 없이 C-말단을 통하여 IP2 서열의 특이 유사체나 변이체에 결합된 GLP-1(7~37)을 함유하거나, 포함하거나 또는 이것들로 이루어진 것이 바람직하다. 서열 번호 8, 12 및 37~48에 의한 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 변이체 또는 단편, 또는 이의 단편이나 변이체도 또한 본 발명에 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 바람직한 GLP-1 융합 펩티드는 서열 번호 13, 14, 19 및 20에 의한 서열을 추가로 포함할 수 있다.

어떠한 이론에도 국한되지 않았을 때, 본 발명의 발명자들은 예를 들어, 만일 본 발명에 의하여 사용된 이식 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 둘러싸인 환자 조직 내로 GLP-1(7~35, 36 또는 37)이 생체 내 분비되면, 이 GLP-1의 불안정성은 자체의 보호되지 않은 3차원 구조로 인한 것이라는 결론을 내릴 수 있었다. 프로테아제는 GLP-1(7~35, 36 또는 37) 펩티드를 절단하여, 이의 생체 내 생리 활성을 신속하게 없앨 수 있다. GLP-1(7~35, 36 또는 37)의 C-말단에 펩티드 서열을 결합시킴으로써, 이 GLP-1(7~35, 36 또는 37)의 구조는 효소 분해에 대해 안정해질 수 있다. 만일 (본 발명에 의한 융합 펩티드의 성분 (II) 내에 함유된) 추가의 C-말단 펩티드 서열이 예를 들어, 이것 자체의 1차 구조에 의해 β-턴 구조 요소가 형성되고, 성분 (II)에 견고함(rigidity)이 제공되면서 다시 폴딩(folding)된다면, 상기 구조는 더욱 안정해질 수 있다. 본원에 정의된 GLP-1 융합 펩티드는, 바람직하게 β-턴 구조 요소를 함유하는 자체의 C-말단 펩티드 연장부로 인하여, DPP-IV 비활성화에 대한 내성이 증강되는 것으로 파악된다. C-말단 펩티드는 표적 세포 내에 존재하는 수용체를 대상으로 작동하기 전에 GLP-1 서열(7~35, 36 또는 37)로부터 절단되지 않거나, 또는 이 C-말단 펩티드가 생체 내에서 효소에 의해 절단되어 GLP-1(7~35, 36 또는 37)을 형성할 수 있다. GLP-1 수용체가 존재하는 위치에 결합되어 있는 GLP-1 펩티드의 정확한 형태와는 상관없이, 본원에 정의된 GLP-1 펩티드는 활성 신경 보호 화합물로서의 기능을 수행한다. β-턴 요소를 형성하는 1차 구조로 인하여, 본원에 정의된 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (II)로서 적당한 것으로 간주되는 GLP-1 펩티드 서열은 예를 들어, 정확한 분광 분석법 예를 들어, 원편광 이색성 분광 측정법, 또는 기타 당 업자에게 공지된 방법에 의하여 용이하게 동정할 수 있다.

본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의하여 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (II) 및 성분 (I)은 직접 결합할 수 있거나, 또는 링커 서열을 통해 결합할 수 있다. 상기 성분들은 둘 다 상호 직접 결합하고 있는 것이 바람직하다. 상기 두 개의 성분이 링커(또는 스페이서)를 통해 결합하고 있는 경우, 이 링커는 펩티드 링커인 것이 바람직하다. 상기 펩티드 링커의 길이는 통상적으로 1?10 아미노산, 바람직하게는 1?5 아미노산, 더욱 바람직하게는 1?3 아미노산이고, 몇몇 경우에 있어서, 상기 링커 서열은 11?50 아미노산을 포함하여 상기한 바보다 더욱 길 수 있다. 상기 펩티드 링커는 다양한 (천연 생성) 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 바람직하게 펩티드 링커는 결합될 성분들 사이에 구조적 가요성(structural flexibility)을 도입할 것이다. 구조적 가요성은 예를 들어, 링커 서열 내에 다양한 글리신 또는 프롤린 잔기, 바람직하게는 30% 이상, 더욱 바람직하게는 40% 이상, 그리고 더더욱 바람직하게는 60% 이상의 프롤린과 글리신 잔기를 함유하는 펩티드 링커를 포함시켜 얻을 수 있다. 특이 서열과는 상관없이, 펩티드 링커는 면역학적으로 비활성인 것이 바람직할 수 있다.

본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 융합 펩티드는 성분 (III)을 추가로 함유할 수 있다. 일반적으로, 성분 (III)은 4개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 10개 이상의 부가적 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 20개 이상, 또는 가장 바람직하게는 30개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 기능상 용어에 있어서, 성분 (III)은 본원에 정의된 GLP-1 펩티드의 안정성을 더욱 강화하는 경향이 있다. 성분 (III)은 GLP-1 융합 펩티드의 생물학적 기능을 방해하지 않는 것으로 예상되는데, 여기서, 상기 GLP-1 융합 펩티드의 생물학적 활성은 GLP-1(7~37)의 생물학적 활성과 거의 비슷하다. 일반적으로 말해서, 상기 정의된 바와 같은 GLP-1 펩티드 예를 들어, GLP-1(7~35, 36 또는 37), 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체가 본원에 정의된 성분 (II), 성분 (III), 또는 이 성분 (II)와 (III)의 조합체인지 여부에 따라서, 본원에 정의된 성분 (I)의 C-말단을 연장하면 성분 (I)의 안정성이 강화된다.

바람직하게 본원에 정의된 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (III)은 임의의 포유동물 유기체 GLP-2의 아형(또는 포유동물 GLP-2의 천연 생성 변이체) 예를 들어, 쥣과 동물 또는 사람 GLP-2 아형의 N-말단 서열(서열 번호 4 및 5) 중 4개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 더욱 바람직하게는 20개 이상의 부가 아미노산 잔기를 포함한다. GLP-2는 프로-글루카곤에서 생성되며, 또한 탄수화물 대사에 관여하기도 한다. 본 발명의 내용중, "GLP-2 펩티드"라는 용어는, 바람직하게 GLP-2(1~33, 34 또는 35번 아미노산)를 의미하는 반면에, "변형된 GLP-2 펩티드"는 임의의 GLP-2 단편 또는 변이체, 또는 GLP-2(1~33, 34 또는 35)의 단편 또는 변이체를 의미한다. 변이체 또는 단편은 비 변형 서열 예를 들어, GLP-2(1~33, 34 또는 35)의 변형체로 분류된다. 성분 (I)에 포함된 생물학적 활성 서열(GLP-1 펩티드)에 있어서, 성분 (III)은 또한 GLP-2의 천연 생성 형태의 변이체 또는 단편을 포함할 수도 있다. 대안적으로, 성분 (III)은 또한 GLP-1(7?37)의 (N-말단) 서열 중 부가 아미노산 잔기[본원에 정의된 모든 포유동물 아형 또는 이의 모든 기능상 단편이나 변이체에 해당]를 4개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 더욱 바람직하게는 20개 이상 포함할 수도 있다. 일반적으로 말해서, 성분 (III)은 GLP-1 펩티드 또는 변형 GLP-1 펩티드의 임의의 형태의 것을 함유할 수 있는데, 이 경우, 상기 GLP-1 펩티드 또는 변형 GLP-1 펩티드는 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I)로서 적당한 것으로 본원에 개시되어 있다. 추가의 대안적인 구체예에서, 성분 (III)은 또한 GLP-1(7~37) 및 GLP-2의 키메라 형태를 함유할 수도 있다. 이 키메라 형태는 GLP-1(7~37) 및 GLP-2(또는 이의 단편이나 변이체)를 각각 커플링시킨 후, 이 키메라 형태를 성분 (III)으로서 GLP-1 융합 펩티드에 도입함으로써 생산될 수 있다. 바람직하게 상기 키메라 형태는 GLP-1(7~37)의 부분 서열과 GLP-2의 부분 서열이 서로 결합되어 있는 형태로 제조된다. 예를 들어, 키메라 형태는 GLP-1의 N-말단 아미노산 5?30개와, GLP-2의 C-말단 아미노산 5?30개를 포함할 수 있거나, 또는 이와 반대로 포함할 수도 있다. 예를 들어, 이 키메라 형태는 GLP-1(7~37)의 7번 또는 8번 아미노산으로부터 22, 23, 24, 25, 26, 27 또는 28번까지의 아미노산과 예를 들어, GLP-2의 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24번 위치로부터 이 GLP-2의 C-말단까지의 아미노산을 포함할 수 있다. 만일 GLP-2 또는 GLP-1(7?37)의 천연 생성 형태의 것이 각각 변형되면, 이와 같이 변형된 것은 성분 (III)으로서 포함되며, 이 성분 (III)은 서열 번호 1, 4 또는 5의 서열, 또는 서열 번호 1, 4 또는 5의 서열 중 임의의 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 서열을 함유하는 것이 바람직하다.

다른 구체예에서, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (III)은 성분 (I), (II) 또는 (III)에 대하여 전술한 바와 같은 서열들을 다수 함유할 수 있다. 예를 들어, 성분 (III)은 GLP-1(7~37) 및/또는 GLP-2의 복사체를 2개 이상, 바람직하게는 2, 3 또는 4개 함유할 수 있거나, 또는 서열 번호 1, 4 또는 5와의 서열 동일성이 80% 이상인 서열의 복사체를 2개 이상 함유할 수 있다. 뿐만 아니라, 성분 (III)은 예를 들어, 결과적으로는 GLP-1(7~37) 및/또는 GLP-2, 또는 서열 동일성이 80% 이상인 변형체와 함께 키메라 조합체를 형성하는, 상기 정의된 GLP-1(7~37) 또는 GLP-2의 키메라 복사체를 하나 이상 함유할 수 있다. GLP-1 융합 펩티드는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있는 것으로서, 2개 이상, 바람직하게는 2개의 성분 (III)을 포함할 수도 있으며, 여기서, 상기 성분 (III)은 예를 들어, (1) 이것의 N-말단을 성분 (I) 또는 (II)의 C-말단에 결합시키고, 또한 (2) 이것의 C-말단은 성분 (I)의 N-말단에 링커를 통하거나 직접 결합시킴으로써 포함될 수 있다. 만일 성분 (III) 2개가 제공될 경우, 이 성분 (III) 2개는 서로 동일하거나 상이할 수 있다.

바람직한 구체예에 의하면, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비된 GLP-1 융합 펩티드는 상기 성분 (I), (II) 및 (III)을 포함할 수 있다. 상기 성분을 모두 함유하는 특정 구체예는 다음과 같은 것들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다: 서열 번호 6(N-GLP-1(7~37)-IP2(쥣과 동물)-RR-GLP-1(7~37)-C [본원에서는 쥣과 동물 CM1이라고도 명명함], 서열 번호 7(N-GLP-1(7~37)-IP2(쥣과 동물)-RR-GLP2-C [본원에서는 쥣과 동물 CM2라고도 명명함], 서열 번호 10(N-GLP-1(7~37)-IP2(사람)-RR-GLP-1(7~37)-C [본원에서는 사람 CM1이라고도 명명함], 그리고 서열 번호 11(N-GLP-1(7~37)-IP2(사람)-RR-GLP-2-C [본원에서는 사람 CM2이라고도 명명함), 또는 서열 번호 6, 7, 10, 또는 11과의 서열 동일성이 80% 이상인 서열, 또는 이의 단편이나 변이체. 전술한 서열에 있어서, "N" 및 "C"란 상기 융합 펩티드의 N-말단 및 C-말단을 나타내는 것이다. 서열 번호 6, 7, 10 및 11에 의한 모든 서열은 IP2(성분 (II))의 C-말단에, 절단해 버릴 수도 있는 RR-링커(2개의 아르기닌 잔기)를 함유한다. 서열 번호 6, 7, 10 또는 11에 의한 각 구체예에 있어서 성분 (I)은 GLP-1(7~37)인 반면에, (성분 (II)의 C-말단에 결합된 각 구체예에 있어서) 성분 (III)은 GLP-1(7~37) 또는 GLP-2이다. 본 발명에 있어서, 바람직한 GLP-1 융합 펩티드는 서열 번호 15, 16, 17, 18 및 26에 의한 서열을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 기타 바람직한 구체예에서, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 융합 펩티드는 성분 (I) 이외에도 성분 (III)을 포함하는데[본원에 정의된 성분 (II)는 전혀 포함하지 않음], 이는 성분 (I)의 C-말단 및/또는 성분 (I)의 N-말단에 결합되어 있다. 바람직하게 성분 (III)은 성분 (I)의 C-말단에 위치한다. 성분 (III)이 (그것의 C-말단에 의해서) 성분 (I)의 N-말단과 결합하고 있는지, 아니면 (그것의 N-말단에 의해서) 성분 (I)의 C-말단과 결합하고 있는지 여부에 상관없이, 커플링 과정은 직접적으로 행해지거나, 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 행해질 수 있다. 여기서, 링커 서열은, GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I)과 성분 (II)를 연결하는 링커와 관련하여 GLP-1 융합 펩티드에 대해 개시된 바와 같다.

본 발명의 바람직한 대안적 구체예에서, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 융합 펩티드는 성분 (I) 및 (II) 이외에도 성분 (III)을 함유하는데, 여기서, 상기 성분 (III)은 성분 (II)의 C-말단과 결합하며/결합하거나, 성분 (I)의 N-말단과 결합한다. 바람직하게 성분 (III)은 성분 (II)의 C-말단에 위치하고 있다. 성분 (III)이 (C-말단에 의해) 성분 (I)의 N-말단과 결합하고 있는지, 아니면 (N-말단에 의해) 성분 (II)의 C-말단과 결합하고 있는지 여부에 상관없이, 커플링 과정은 직접적으로 행해지거나, 또는 링커 서열을 통해 간접적으로 행해질 수 있다. 여기서, 링커 서열은, GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I)과 성분 (II)를 연결하는 링커와 관련하여 GLP-1 융합 펩티드에 대해 개시된 바와 같다.

본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 융합 펩티드는 또한, 전술한 바와 같은 융합 단백질 성분의 조합 중 임의의 것[즉, 성분 (I) 및 (II), 성분 (I) 및 (III), 또는 성분 (I), (II) 및 (III)] 이외에도, 담체 단백질, 특히, 트랜스페린 또는 알부민을 성분 (IV)로서 추가로 포함할 수도 있다. 이와 같은 성분 (IV)는 상기 GLP-1 융합 단백질 성분의 전술한 바와 같은 조합 중 임의의 것[즉, 성분 (I) 및/또는 (II), 성분 (I) 및/또는 (III), 또는 성분 (I), (II) 및/또는 (III)]의 N-말단 및/또는 C-말단과 직접 결합하거나, 본원에 정의된 링커를 통해 결합할 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 본원에 정의된 GLP-1 (융합) 펩티드로서, 본 발명에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 (융합) 펩티드는 성분 (I) 및/또는 (III)으로서 다음과 같은 화학식 II의 아미노산 서열을 포함하는 변형 GLP-1 펩티드를 함유한다:

[화학식 II]

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37

상기 식 중, Xaa7는 L-히스티딘이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile 또는 Lys(여기서, Gly가 특히 바람직함)이며; Xaa16은 Val 또는 Leu이고; Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이며; Xaa19는 Tyr 또는 Gln이고; Xaa20은 Leu 또는 Met이며; Xaa22는 Gly 또는 Glu이고; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이며; Xaa25는 Ala 또는 Val이고; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa27은 Glu 또는 Leu이고; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이며; Xaa33은 Val 또는 Lys이고; Xaa34는 Lys, Glu, Asn 또는 Arg이며; Xaa35는 Gly이고; Xaa36은 Arg, Gly, Lys 또는 아미드이거나, 존재하지 않으며; Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys 또는 아미드이거나, 존재하지 않고[여기서, 상기 아미노산들은 본원에 정의된 안 질병 치료시, 본원에 정의된 GLP-1 (융합) 펩티드가 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비된 것인지 여부에 따라서, 상기 펩티드의 투여를 필요로 하는 환자에게 투여할 것으로 선택하는 것이 바람직함]; 또는 Xaa7는 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, 3-하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘, N-아세틸-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필)카복실산, (1-아미노시클로부틸)카복실산, (1-아미노시클로펜틸)카복실산, (1-아미노시클로헥실)카복실산, (1-아미노시클로헵틸)카복실산, 또는 (1-아미노시클로옥틸)카복실산이며[이 경우, Gly이 특히 바람직함]; Xaa16은 Val 또는 Leu이고; Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이며; Xaa19는 Tyr 또는 Gln이고; Xaa20은 Leu 또는 Met이며; Xaa22는 Gly, Glu 또는 Aib이고; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이며; Xaa25는 Ala 또는 Val이고; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa27은 Glu 또는 Leu이고; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이며; Xaa33은 Val 또는 Lys이고; Xaa34는 Lys, Glu, Asn 또는 Arg이며; Xaa35는 Gly 또는 Aib이고; Xaa36은 Arg, Gly, Lys 또는 아미드이거나 존재하지 않으며; Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys 또는 아미드이거나 존재하지 않는다[이 경우, 상기 아미노산들은 본원에 정의된 안 질병 치료시, 본원에 정의된 GLP-1(융합) 펩티드가 이것의 투여를 필요로 하는 환자에게 직접 제공되는지 여부에 따라서 선택하는 것이 바람직함].

본 발명의 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 정의된 것으로서, 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비된 GLP-1 (융합) 펩티드의 성분 (I) 및/또는 (III)은 하기 화학식 III의 아미노산 서열을 포함하는 변형 GLP-1 펩티드를 함유한다:

[화학식 III]

Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37

상기 식 중, Xaa7은 L-히스티딘이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile 또는 Lys이며; Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이고; Xaa22는 Gly 또는 Glu이며; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이고; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이고; Xaa34는 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa35는 Gly이고; Xaa36은 Arg, Lys 또는 아미드이거나 존재하지 않으며; Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Lys 또는 아미드이거나 존재하지 않고[이 경우, 상기 아미노산은 본원에 정의된 안 질병 치료시, 본원에 정의된 GLP-1 (융합) 펩티드가 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비된 것인지 여부에 따라서, 상기 펩티드의 투여를 필요로 하는 환자에게 투여할 것으로 선택하는 것이 바람직함], 또는 Xaa7은 L-히스티딘, D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, -하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘, N-아세틸-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 또는 4-피리딜알라닌이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Lys, Aib, (1-아미노시클로프로필)카복실산, (1-아미노시클로부틸)카복실산, (1-아미노시클로펜틸)카복실산, (1-아미노시클로헥실)카복실산, (1-아미노시클로헵틸)카복실산, 또는 (1-아미노시클로옥틸)카복실산이며; Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이고; Xaa22는 Gly, Glu 또는 Aib이며; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이고; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이고; Xaa34는 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa35는 Gly 또는 Aib이고; Xaa36은 Arg, Lys 또는 아미드이거나 존재하지 않으며; Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Lys 또는 아미드이거나 존재하지 않는다[이 경우, 상기 아미노산들은 본원에 정의된 안 질병 치료시, 본원에 정의된 GLP-1(융합) 펩티드가 이것의 투여를 필요로 하는 환자에게 직접 제공되는지 여부에 따라서 선택하는 것이 바람직함].

특히 바람직한 구체예에서는, 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 (융합) 펩티드가 사용되는데, 이 경우, 성분 (I) 및/또는 (III)은 (변형된) GLP-1 펩티드를 함유하고, 여기서, 상기 (변형된) GLP-1 펩티드는 GLP-1(7?35), GLP-1(7?36), GLP-1(7?36)-아미드, GLP-1(7?37), 또는 이의 변이체, 유사체 또는 유도체로부터 선택된다. 바람직하게는 본원에 정의된 안 질병 치료시, 본원에 정의된 GLP-1 (융합) 펩티드가 이것의 투여를 필요로 하는 환자에게 직접적으로 제공되는지 여부에 따라서, 자체의 성분 (I) 및/또는 (III)에, 변형된[즉, 상기 GLP-1 펩티드의 8번 위치에 Aib 잔기를 가지거나, 또는 7번 위치에 아미노산 잔기를 가지는] GLP-1 펩티드를 포함하는 GLP-1 (융합) 펩티드도 바람직한데, 여기서, 상기 7번 위치에 올 수 있는 아미노산 잔기는 D-히스티딘, 데스아미노-히스티딘, 2-아미노-히스티딘, 하이드록시-히스티딘, 호모히스티딘, N-아세틸-히스티딘, α-플루오로메틸-히스티딘, α-메틸-히스티딘, 3-피리딜알라닌, 2-피리딜알라닌 및 4-피리딜알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

특히 바람직한 다른 구체예에서는, 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있는 GLP-1 (융합) 펩티드가 사용되는데, 이 경우, 본원에서 화학식 II 및 III으로 정의된, GLP-1 (융합) 펩티드의 성분 (I) 및/또는 (III)에 관한 두 가지 구체예는 상기 GLP-1 (융합) 펩티드에 관해 제시된 것과 합하여질 수 있다. 다시 말해서, 일반식 II 및 III에는 예를 들어, 상기 성분 (II)에 관해 제시된 것, 링커, 그리고 제조 방법을 적용할 수 있다.

본원에 정의된 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드, 바람직하게는 상기 정의된 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I), 그리고 이것들의 단편과 변이체는 상기 개략적으로 기술한 바와 같이 단백 분해, 더욱 바람직하게는 DPP-IV 분해에 대해 보호되는 것이 바람직하다. 그러므로, 본원에 정의된 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 이것들의 단편과 변이체, 특히, GLP-1 융합 펩티드는 [GLP-1 융합 펩티드가 성분 (I) 및/또는 (III)의 일부일 경우] DPP-IV에 내성인 GLP-1 서열 예를 들어, GLP-1(7?35, 36 또는 37)을 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서, 디펩티딜 아미노펩티다제 IV에 의한 분해에 대한 펩티드의 내성은 예를 들어, 다음과 같은 분해 검정법에 의해 측정될 수 있다: 정제된 디펩티딜 아미노펩티다제 IV의 분취액과 펩티드 분취액을 4?22시간 동안 적당한 완충액(pH 7?8; 완충액은 알부민이 아님) 중에서 항온 처리(37℃)한다. 여기에 트리플루오로아세트산을 첨가하여 효소 반응을 종결시키고, 펩티드 분해 산물을 분리한 다음, HPLC 또는 LC-MS 분석법을 이용하여 정량한다. 이와 같은 분석법을 수행하기 위한 한 가지 방법으로서는 다음과 같은 방법이 있다: 혼합물을 조르박스(Zorbax) 300SB-C18(공극 지름 = 30㎚, 입자 지름 = 5㎛)[컬럼 크기 = 150×2.1㎜; 용리 속도 = 0.5㎖/분; 0.1% 트리플루오로아세트산 중 아세토니트릴 선형 구배(30분, 0?100% 아세토니트릴)]에 가한다. 펩티드 및 이의 분해 산물을 대상으로 214㎚(펩티드 결합) 또는 280㎚(방향족 아미노산)에서의 흡광도를 측정하여 모니터할 수 있었으며, 또한 이로부터 얻어진 그래프의 피크 표면적을 합하여 상기 분해 산물을 정량하였다. 분해 패턴은 LC-MS를 사용하여 측정할 수 있는데, 이 경우, 개별 피크의 MS 스펙트럼을 측정할 수 있다. 소정의 시간에서의 비 변형/분해 화합물의 %를 이용하여, 펩티드 DPP-IV 안정성을 평가하였다.

상기 내용 중, 상기 변형 GLP-1 펩티드 서열이 소정 시간에 존재하는 비 변형 화합물의 %를 바탕으로 판단하건대, GLP-1의 비 변형 펩티드 서열(7?37)보다 10배 더 안정할 때, 본원에 정의된 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드, 바람직하게는 상기 정의된 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I), 그리고 이의 단편 및/또는 변이체는 안정화된 DPP-IV로서 정의된다. 그러므로, DPP-IV 안정화 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드, 바람직하게는 상기 정의된 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I)은 예를 들어, GLP-1(7?37)의 경우보다, 바람직하게는 10배 이상, 더욱 바람직하게는 20배 이상 더 안정하다. 안정성은 당 업자에게 공지된 임의의 방법 예를 들어, 테스트할 펩티드 용액에 DPP-IV를 첨가하여 예를 들어, 분광 분석법, 웨스턴-블럿 분석법, 항체 스크리닝 등을 통하여 예를 들어, 일정 기간에 걸쳐 펩티드의 분해 정도를 측정함으로써 평가할 수 있다.

뿐만 아니라, 상기 정의된 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드, 바람직하게는 상기 정의된 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I), 그리고 이의 단편 및/또는 변이체는 예를 들어, GLP-1의 천연 수용체(GLP-1 수용체)에 결합함으로써 이 GLP-1(7?37)의 효능을 나타내는 화합물로서 정의된다. 바람직하게, 본원에 정의된 GLP-1 (융합) 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 이것의 단편 및/또는 변이체는 GLP-1 수용체에 대해 결합 친화성을 가지는데, 이 결합 친화성은 천연 생성 GLP-1 펩티드 결합 친화성의 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상에 해당한다. 결합 친화성은 임의의 적당한 방법 예를 들어, 표면 플라스몬 공명법 등에 의해 측정될 수 있다. 더욱이, 만일 본원에 정의된 GLP-1 (융합) 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 이의 단편 및/또는 변이체가 그것의 세포 외 수용체(즉, 신호를 세포로 보내는 수용체)와 결합함으로 인하여 세포 내에 cAMP가 형성되는 것을 촉진하는 것이 바람직하다.

본 발명의 기타 바람직한 구체예에 의하면, 본원에 정의된 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질 또는 단백질-유사 물질, 또는 GLP-1 융합 펩티드의 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 및 (III), 및/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드는 상기 펩티드 또는 단백질 서열의 변형된 형태로부터 선택될 수 있다. 다양한 변형 형 특히, 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드의 변형 형은, 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있거나, 또는 안 질병의 치료 방법에 직접 사용될 수 있다. 이와 같은 변형된 형태에 관하여는 이하에 더욱 상세하게 기술되어 있으며 예를 들어, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 단백질 또는 단백질 유사 물질의 단편이나 변이체 등, 또는 GLP-1 융합 펩티드의 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 및 (III)의 단편이나 변이체 등, 및/또는 상기 정의한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드를 포함한다. 상기 내용 중, 이들 펩티드 또는 단백질의 단편 및/또는 변이체의 천연 펩티드 또는 단백질에 대한, 상기 펩티드 또는 단백질의 단편 및/또는 변이체의, 천연 비 변형 아미노산 서열 전체 길이에 걸친 서열 동일성은, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 99% 이상일 수 있다. 각각의 (암호화) 핵산 서열의 경우에도 이와 마찬가지일 수 있다.

본원에 정의된 "서열 동일성"이라는 용어는 통상적으로, 서열이 다음과 같이 비교될 때를 의미하는 것이다. 2개의 아미노산 서열의 동일성 %를 측정하기 위해서, 서열들을 최적으로 비교하도록 배열할 수 있다[예를 들어, 제1 아미노산 서열의 서열 내에 갭을 도입할 수 있음]. 이후, 상응하는 아미노산 위치들에 존재하는 아미노산들을 비교할 수 있다. 제1 서열 내 위치에 제2 서열 내 상응하는 위치에 존재하는 아미노산과 동일한 아미노산이 존재할 때, 그 분자는 그 위치가 동일한 분자이다. 2개의 서열 사이 동일성 %는 이 서열들이 공유하는 동일 위치의 수에 따라서 달라지는데 예를 들어, 특정 펩티드가 한정된 길이의 기준 폴리펩티드에 대해 특정 %의 동일성을 갖는다고 가정하면, 동일성 %는 이 기준 펩티드에 대해 상대적이다. 그러므로, 길이 100 아미노산인 기준 폴리펩티드와 50% 동일한 펩티드는, 기준 폴리펩티드 중 길이 50 아미노산인 부분과 완전히 동일한 50 아미노산 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 전체 길이에 걸쳐서 기준 폴리펩티드와 50% 동일한 폴리펩티드는, 길이 100 아미노산인 폴리펩티드일 수도 있다. 물론, 다른 폴리펩티드도 동일한 기준을 충족할 것이다. 이와 같이 2개의 서열 간 동일성 %를 측정하는 것은 수학적 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 2개의 서열 간 비교를 위해 이용된 수학적 알고리즘에 관한 비 제한적인 예로서는, 문헌[Karlin외 다수(1993), PNAS USA, 90:5873-5877]에 개시된 알고리즘이 있다. 이러한 알고리즘은 본 발명의 아미노산 서열에 대한 동일성이 원하는 수준인 서열을 동정하는데 사용될 수 있는 NBLAST 프로그램에 통합되어 있다. 비교의 목적으로 갭이 도입된 배열을 생성하기 위해서, 문헌[Altschul외 다수(1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402]에 개시된 바와 같은 갭 형성 BLAST(Gapped BLAST)를 이용할 수 있다. BLAST 및 갭 형성 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램(예를 들어, NBLAST)의 디폴트 매개 변수를 사용할 수 있다. 서열은 또한 제네틱 컴퓨팅 그룹스 갭(Genetic Computing Group's GAP; 전반적인 배열 프로그램)의 버전 9 즉, (갭의 첫번째 0점에 대한) 갭 오픈 패널티(gap open penalty)가 -12이고, (갭 내 각각의 부가 연속 0점 당) 갭 연장 페널티(gap extension penalty)가 -4인 디폴트(BLOSUM62) 매트릭스(수치: -4?+11)를 사용하여 배열될 수 있다. 배열 후, 매칭 횟수를 대상 서열 내 아미노산의 수에 관한 백분율로 표시하여 동일성 %를 계산한다. 2개의 아미노산 서열의 동일성 %를 측정하는 방법을 핵산 서열에도 그대로 적용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 혈관 신생 억제 인자, 신경 보호 인자, 기타 임의의 단백질 또는 단백질 유사 물질의 "단편", GLP-1 융합 펩티드의 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III) 등의 단편, 및/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드의 단편은 통상적으로, 상기 펩티드 또는 단백질의 임의의 단편을 의미한다. 통상적으로, 이와 같은 단편은 특히, 천연 펩티드 또는 단백질 예를 들어, 혈관 신생 억제 인자, 신경 보호 인자, 본원에 정의된 추가의 단백질 또는 단백질 유사 물질, 단일 성분 (I), (II) 또는 (III) 등, 및/또는 [천연 펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열(또는 이의 암호화 핵산 서열)과 비교하였을 때 N-말단, C-말단 및/또는 서열 내부가 절두된 아미노산 서열(또는 암호화 핵산 서열)에 관하여] 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드의 원하는 생물학적 활성을 보유하는 짧은 펩티드를 포함한다. 그러므로, 이와 같은 절두 과정은 아미노산 수준 또는 이에 상응하는 핵산 수준에서 진행될 수 있다. 생물학적 기능을 가지는 단편은, 펩티드 분자의 말단 중 어느 한쪽으로부터 (펩티드 수준 또는 아미노산 수준으로) 아미노산을 제거한 후, 생성된 펩티드 또는 단백질을 예를 들어, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질에 대한 생물학적 특성에 대해 테스트함으로써 용이하게 분석할 수 있다. 대안적으로, 천연 펩티드 또는 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단 중 어느 한쪽으로부터 하나 이상의 아미노산을 한번에 제거하는 프로테아제를 사용하여, 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단편을 결정할 수 있다. 결론적으로, 단편은 펩티드 서열 내부에 위치하는 아미노산 및/또는 펩티드 서열 말단에 위치하는 아미노산을 결실시킴으로써 생성될 수 있다.

뿐만 아니라, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질의 "변이체", GLP-1 융합 펩티드를 이루는 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III)의 변이체 등, 그리고/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드의 변이체는, 단백질 서열 또는 이것을 암호화하는 핵산 서열(또는 이의 단편)을 포함하는 것이 바람직하고, 여기서, 상기 천연 단백질 또는 펩티드 서열의 아미노산은 교환된다. 그러므로, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질(의 변이체), GLP-1 융합 펩티드의 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III) 등(의 변이체), 및/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드(의 변이체)를 생산할 수 있으며, 여기서, 이와 같은 단백질 또는 펩티드는 아미노산의 돌연 변이(들) 예를 들어, 아미노산의 치환, 삽입 및/또는 결실이 1회 이상 발생하였다는 점에서 천연 단백질 또는 펩티드 서열과 상이한, 아미노산 서열을 가진다. 바람직하게 이와 같은 변이체는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 전장 천연 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, GLP-1 융합 펩티드의 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III) 등, 및/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드의 생물학적 활성과 비교하였을 때, 이 생물학적 활성이 거의 동일하거나 우수하다. 이와 같이 본원에 정의된 변이체는, 합성된 변이체를 암호화하는 DNA 서열 내에 돌연 변이를 발생시켜 제조할 수 있다. 결실, 삽입 및 치환을 임의로 조합하여, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질의 변이체, GLP-1 융합 펩티드를 이루는 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III)의 변이체 등, 그리고/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드의 변이체에 도입할 수 있는데, 다만, 이와 같을지라도, 최종적으로 생성된 변이체는 원하는 생물학적 활성을 가진다. 분명한 점은, 변이체 펩티드를 암호화하는 DNA 내에서 발생하게 될 돌연 변이는 판독 틀을 변형시키면 안 되며, 2차 mRNA 구조를 형성할 수 있었던 상보성 부위를 생성하지 않는 것이 바람직할 것이다.

그러므로, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질의 변이체, GLP-1 융합 펩티드를 이루는 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III)의 변이체 등, 그리고/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드의 변이체는 또한, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 천연 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, GLP-1 융합 펩티드를 이루는 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III) 등, 그리고/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드와 비교하였을 때, 아미노산 서열의 N-말단 및/또는 C-말단, 또는 심지어 양쪽 말단에 측접하는 부가의 아미노산 잔기들을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 이러한 변이체는 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드의 아미노산 서열의 N-말단 및/또는 C-말단, 또는 심지어 양쪽 말단에 측접하는 부가의 아미노산 잔기들을 함유하는, 본원에 정의된 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드를 포함할 수 있다. 생성된 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드가 본원에 정의된 바와 같이 프로테아제에 대한 저항성 또는 안정성과 작동 능력을 보유하는 한, 이와 같이 임의의 측접 잔기가 코어 펩티드의 기본적인 특징에 영향을 미치는지 여부를 예를 들어, 통상의 실험을 통하여, 상기 생성된 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드가 GLP-1에 대하여 알려진 유리한 효과를 나타내는지 여부로 판단할 수 있다. 본원에 정의된 특정 GLP-1 펩티드에 관하여 언급할 때 "본질적으로 ~으로 이루어진"이란 용어는, 이 특정 GLP-1 펩티드의 기본적인 특징에 영향을 미치지 않는 부가의 측접 잔기가 존재할 수 있음을 의미하는 것이다. 이 용어는 통상적으로 특정 서열 내에서 일어나는 치환, 결실 또는 부가를 포함하는 것은 아니다.

뿐만 아니라, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질의 "변이체", GLP-1 융합 펩티드를 이루는 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III)의 변이체 등, 그리고/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드의 변이체란, 천연 서열과 비교하였을 때 보존적 아미노산 치환을 포함하는 분자를 의미할 수도 있다. 동일 군으로부터 유래하는 아미노산이 상호 간에 교환되는 치환을 보존적 치환이라고 부른다. 이와 관련된 아미노산으로서는 구체적으로, 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 양 또는 음 하전 측쇄를 가지는 아미노산, 측쇄 또는 아미노산에 방향족 기를 가지는 아미노산, 수소 결합에 관여할 수 있는 측쇄 예를 들어, 하이드록실 작용기를 가지는 측쇄를 가지는 아미노산이 있다. 이는 곧 예를 들어, 극성 측쇄를 가지는 아미노산은 유사한 극성 측쇄를 가지는 또 다른 아미노산으로 치환되거나, 또는 예를 들어, 소수성 측쇄를 가지는 것을 특징으로 하는 아미노산은 이와 유사한 소수성 측쇄를 가지는 또 다른 아미노산으로 치환된다는 것을 의미한다. 삽입과 치환은 특히, 3차원 구조로 변형되지 않거나 또는 결합 부위에 영향을 미치지 않는 서열 위치에서 일어날 수 있다. 삽입(들) 또는 결실(들)에 의한 3차원 구조로의 변형은 예를 들어, CD 스펙트럼(원편광 이색성 분광 측정법)[Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger외 다수(ed.), Elsevier, Amsterdam]을 이용하여 용이하게 측정할 수 있다.

그러므로, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질의 변이체, GLP-1 융합 펩티드를 이루는 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III)의 변이체 등, 그리고/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드의 변이체는 또한, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 전체 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, GLP-1 융합 펩티드를 이루는 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III) 등, 및/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드 또는 이의 단편과 실질적으로 유사한 분자를 의미하는 것일 수도 있다. 이와 같은 변이체 펩티드는 당 업계에 널리 알려진 방법을 이용하여 편리하게 제조할 수 있다. 물론, 이러한 변이체는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 천연 혈관 신생 억제 인자, 신경 보호 인자, 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, GLP-1 융합 펩티드를 이루는 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III) 등, 및/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드에 대하여 알려진 유리한 효과와 유사한 효과를 가질 것이다. 예를 들어, GLP-1에 대한 유리한 효과로서는, 이와 상응하는 천연 생성 GLP-1 펩티드의 경우처럼, 허혈이나 산소 결핍에 의해 유발되는 손상과 심장 조직의 잠재적 사멸을 상당 수준 줄이는 활성이 있다.

안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질의 변이체, GLP-1 융합 펩티드를 이루는 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III)의 변이체 등, 그리고/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드의 변이체 내에 포함될 수 있는 보존적 아미노산 치환의 유형은, 상이한 종의 상동성 단백질/펩티드 사이에 아미노산 변형이 발생하는 횟수를 분석한 결과를 바탕으로 분류할 수 있다. 이러한 분석 결과를 바탕으로 하여, 보존적 치환은 다음과 같은 5가지 군 중 어느 하나의 군 내에서 일어나는 치환으로 정의할 수 있다:

I. 소형, 지방족, 무극성 또는 약한 극성을 띠는 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

II. 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이의 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln;

III. 극성, 양으로 하전된 잔기: His, Arg, Lys;

IV. 대형, 지방족, 무극성 잔기: Met, Leu, Ile Val, Cys;

V. 대형, 방향족 잔기: Phe, Try, Trp.

상기 군 내에서, 다음과 같은 치환이 일어나는 경우를 "고도로 보존된" 치환으로 간주한다: Asp/Glu; His/Arg/Lys; Phe/Tyr/Trp; Met/Leu/Ile/Val. 반 보존적 치환은 상기 I?IV 군을 2개의 군으로 합하였을 때, 이 2개의 군, 즉, 상위 군 (A)(상기 I, II 및 III 군 포함) 또는 상위 군 (B)(상기 IV 및 V 군 포함) 사이에서 일어나는 치환으로 정의된다. 치환은 유전적으로 암호화되었거나 또는 천연 생성되는 아미노산에 제한되는 것은 아니다. 상기 정의 내에 포함되는 축퇴성 아미노산 잔기들로 이루어진 바람직한 군에서 일어나는 바람직한 보존적 아미노산 치환은 특히, 다음과 같은 경우를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다:

뿐만 아니라, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질의 변이체, GLP-1 융합 펩티드를 이루는 단일 성분 특히, 성분 (I), (II) 또는 (III)의 변이체 등, 그리고/또는 상기한 바와 같은 전체 GLP-1 융합 펩티드의 변이체도 또한 예를 들어, 용해성을 개선하고자 하는 의도로 아미노산 치환(소수성 아미노산과 친수성 아미노산의 치환)이 도입될 수도 있다.

하나의 특히 바람직한 구체예에서, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있으며 본원에 정의된 바와 같은, GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드는, GLP-1 펩티드의 7, 8, 11, 12, 16, 22, 23, 24, 25, 27, 30, 33, 34, 35, 36 또는 37번 위치에 하나 이상의 치환(들)이 발생하는 것을 특징으로 하는 GLP-1 펩티드[GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I) 및/또는 (III)에 존재]를 포함한다. 명명법의 일례 예를 들어, [Arg34-GLP-1(7?37)]는 천연 생성 GLP-1의 34번 위치에 존재하던 리신이 아르기닌으로 치환된 GLP-1 유사체를 의미하는 것이다.

특히, 본원에 정의된 GLP-1 펩티드, 또는 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I) 및/또는 (III)은, GLP-1(7~35, 36, 37 또는 38)의 변이체 예를 들어, Thr16-Lys18-GLP-1(7~37), 및 Lys18-GLP-1(7~37), Arg34-GLP-1(7~37), Lys38-Arg26-GLP-1(7~38)-OH, Lys36-Arg26-GLP-1(7~36), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7~38), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7~38), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7~38), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7~38), Arg26,34-Lys38-GLP-1(7~38), Arg26-Lys38-GLP-1(7~38), Arg26-Lys38-GLP-1(7~38), Arg34-Lys38-GLP-1(7~38), Ala37-Lys38-GLP-1(7~38), 및 Lys37-GLP-1(7~37)에 해당할 수 있다. 더 일반적으로 말하면, 본원에 언급된 임의의 GLP-1 변이체(특히, 화학식 II 또는 III에 의한 것)는 38번 위치에 Lys 잔기를 부가함으로써 변형시킬 수 있다.

만일 상기한 바와 같은 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드가 안 질병의 치료 방법에서 직접 투여되면, 본원에 정의된 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I) 및/또는 (III)은 또한, GLP-1(7?35, 36, 37 또는 38) 예를 들어, Gln9-GLP-1(7?37), D-Gln9-GLP-1(7?37), 아세틸-Lys9-GLP-1(7?37)의 변이체와도 상응할 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, (성분 (I) 또는 (III)에 대하여) 본원에 정의된 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드는, GLP-1(7?35), GLP-1(7?36), GLP-1(7?36)-아미드, GLP-1(7?37), 또는 이의 단편이나 변이체로부터 선택되는 (변형) GLP-1 펩티드이거나 이를 함유한다.

안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 및/또는 상기 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 또는 이의 단편이나 변이체가 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립되어 있는 세포에 의해 암호화 및 분비되면, 이는 예를 들어, 통상의 분리 기술을 이용하여 그것이 발현된 세포(결과적으로는 마이크로캡슐)로부터 분리함으로써, 시험관 내 제어를 할 수 있다. 그러므로, 세포는 적당한 조건 하에서 성장할 수 있는데 예를 들어, 어떤 지지체 및 영양소를 포함하는지, 시험관 내 배양 여부, 그리고 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 및/또는 상기 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드 등 분비형 단백질, 또는 이의 단편이나 변이체의 종류, 그리고 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해서 암호화 및 분비된 펩티드 또는 단백질, 또는 이의 단편이나 변이체가 세포 외 배지로부터 회수되는지 여부에 따라서 성장할 수 있다. 그러므로, 세포 내에 형질 감염되도록 조직된 (벡터) 서열은 본원에 정의된 신경 보호 인자 또는 혈관 신생 억제 인자(이하 참조)를 분비할 수 있는 신호 (펩티드) 서열(이하 참조)을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 및/또는 상기한 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 또는 이의 단편이나 변이체가 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해서 암호화 및 분비된다면, 상기 인자, 단백질 또는 펩티드 등은 원래부터 내부적으로 신호 서열에 융합되어 있을 수 있거나, 또는 유전자 조작법에 의해서 암호화 핵산 서열을 세포에 형질 감염시켜 도입함으로써, 신호 서열에 융합되어 있을 수 있다. 대안적으로, 상기 펩티드를 암호화하도록 조작된 유전자 서열은 이러한 신호 펩티드 서열을 포함하지 않기 때문에, 세포 내에 발현된 펩티드는 통상적으로 분비되지 않을 것이며, 또한 세포 분해 과정을 포함하는 방법에 의해 세포로부터 회수될 수 있다. 이와 같은 방법에서, 암호화 서열은 배지로부터 생산 펩티드를 효율적으로 추출할 수 있도록 만드는 정제 태그를 포함할 수 있으며; 이 태그는 절단되어 본원에 정의된 바와 같이 분리된 신경 보호 인자 또는 혈관 신생 억제 인자를 방출할 수 있다. 그러나, 이러한 대안은 통상적으로, 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 세포 즉, 환자에게 이식되어, 본원에 정의된 신경 보호 인자 또는 혈관 신생 억제 인자를 생체 내 발현 및 분비하여 주변 조직에 전달해야 하는 (구형) 마이크로캡슐의 세포와는 무관하다. 바람직한 구체예에 의하면, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 및/또는 상기 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 또는 이의 단편이나 변이체가 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해서 암호화 및 분비된다면, 상기 인자, 단백질 또는 펩티드 등은 벡터에 의해서 암호화될 수 있는데, 이 경우, 이와 같은 벡터는 통상적으로 상기 목적으로서 적당한 벡터이다. 더욱 바람직하게 이와 같은 벡터는 바이러스 벡터, 바람직하게는 아데노바이러스 벡터가 아니므로, 만일 이러한 벡터 서열이 예를 들어, 분해되면서 세포로부터 방출되면, 바이러스 서열로 인해 유해한 효과가 발생하는 것을 완전히 막을 수 있다.

달리 언급되지 않은 한, 상기 구체예 또는 특징들 중 임의의 것은 서로 조합 적용할 수 있다.

전술한 바와 같이, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 및/또는 상기 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 또는 이의 단편이나 변이체는 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포에 의해서 암호화 및 분비될 수 있다. 특히 바람직한 추가의 구체예에 의하면, (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포는, 항 세포 고사 인자, 성장 인자, VEGF 및 에리트로포이에틴(EPO), 항 혈소판 인자, 항 응고 인자, 항 혈소판 약물, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 인자 예를 들어, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 단백질 또는 단백질 유사 물질 예를 들어, 폴리펩티드 예를 들어, 섬모 향 신경성 인자(CNTF), 신경 교세포 유래 신경 영양 인자(GDNF), 신경 성장 인자(NGF), 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), NT3, 너터린(nurturin), 섬유 아세포 성장 인자(FGF), ATF, 트롬보스폰딘의 단편, 이의 변이체 등 예를 들어, FGF 예를 들어, 산성 FGF(aFGF), 염기성 FGF(bFGF), FGF-1 및 FGF-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자를 추가로 분비하도록 변형 또는 조작될 수도 있다.

하나의 특정 구체예에 의하면, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포는 에리트로포이에틴(EPO)을 추가로 분비하도록 조작될 수 있다. 에리트로포이에틴(EPO, 에포에틴 또는 프로크릿이라고 알려짐)은 분자량이 약 34,000 달톤인 산성 당단백질 호르몬으로서 예를 들어, 알파, 베타, 오메가 등과 같이 다수의 형태로 생성되는 것이다. 에리트로포이에틴은 적혈구 세포의 생산을 촉진한다. 이는 신장에서 생산되어, 골수 등에서 적혈구가 될 전구체의 분열과 분화를 촉진한다. 일반적으로, 몸이 건강한 상태 즉, 조직이 기존의 수만큼의 적혈구로부터 충분한 산소를 공급받는 상태이면 상기 에리트로포이에틴은 혈장 내에 매우 낮은 농도로 존재한다. 이처럼, 낮은 농도로 존재하더라도, 노화함에 따라서 소실되는 것이 보통인 적혈구 세포가 교체되는 것을 촉진하기에 충분하다. 예를 들어, 혈류 중 혈구 세포에 의한 산소 운반이 줄어드는 저산소증의 조건 하에서는 혈류 중 에리트로포이에틴의 양이 증가한다. 저산소증은 출혈, 방사선에의 과다 노출로 인한 적혈구 세포의 파괴, 고도가 증가하거나 무의식 상태가 지속 됨에 따른 산소 섭취의 감소, 또는 다양한 형태의 빈혈 또는 허혈로 인하여, 다량의 혈액이 소실됨으로써 발생할 수 있다. 저 산소 스트레스를 받고 있는 조직에 대응하여, 에리트로포이에틴은 골수 내 원시 전구체 세포가, 추후 성숙하여 헤모글로빈을 합성하고 적혈구 세포로서 혈류로 방출되는 적아세포로 변환되는 것을 촉진함으로써, 적혈구의 생산량을 증가시킬 것이다. 혈류 중 적혈구 세포의 수가 정상 조직의 산소 요구량을 충족하는데 필요한 수보다 많을 때, 혈류 중 에리트로포이에틴은 감소한다. 에리트로포이에틴은 적혈구 세포의 형성을 유도하지 않거나, 또는 개체 내 헤마토크릿을 증가시키지 않을 농도[예를 들어, 약 1pM?1000μM 미만 예를 들어, 900μM 미만, 700μM 미만, 500μM 미만, 300μM 미만, 100μM 미만 또는 50μM 미만] 또는 기간 동안, (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화된 세포에 의해 발현될 수 있다[또는 제공될 수 있다]. 다른 구체예에서, 에리트로포이에틴은 개체의 체중에 따라서 투여 농도를 달리한다. 에리트로포이에틴은 통상적으로, 개체의 체중 1㎏당 약 1?10,000U 예를 들어, 7,500U/㎏ 미만, 5,000U/㎏ 미만, 2500U/㎏ 미만, 1000U/㎏ 미만, 750U/㎏ 미만, 500U/㎏ 미만, 250U/㎏ 미만, 100U/㎏ 미만, 50U/㎏ 미만, 25U/㎏ 미만, 10U/㎏ 미만, 5U/㎏ 미만 또는 1U/㎏ 미만의 농도로 제공될 수 있다. 본 발명에 있어서, 에리트로포이에틴의 혈청 중 농도는 보통, 5?50mU/㎖의 범위 내에 있다. 본원에 정의된 안 질병 또는 안 질환, 바람직하게는 본원에 정의된 망막 질병 또는 이와 관련된 기타 병태를 앓고 있는 환자에 있어서, 에리트로포이에틴은 증상, 체중, 성별 및 동물의 종 등에 따라서 농도 50?100 U/㎏으로 제공되는 것이 바람직하다. 일반적으로, 치료 옵션으로서 혈중 농도를 약 1?100mU/㎖로 유지하는 것이 바람직한 것으로 예상한다.

또 다른 하나의 특정 구체예에 의하면, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 (구형) 마이크로캡슐의 코어 내에 매립된 세포는 VEGF를 추가로 분비하도록 조작될 수 있다.

또 다른 특정 구체예에 의하면, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 및/또는 상기 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 (구형) 마이크로캡슐의 코어 내에 매립된 세포는 항 세포 고사 인자를 추가로 분비하도록 조작될 수 있다. 이와 같은 인자로서는 APC(카스파제 보충 도메인(caspase recruitment domain)을 보유하는 세포 고사 억제 인자), Bcl-2, Bcl-xL, Che-1/AATF, 클러스테린, 인슐린, Mcl-1 , NF-kB-의존성 항 세포 고사 인자, 세로토닌 및 서바이빈 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 당 업계에 공지된 세포 고사 인자에 대해 억제 인자로서 작용을 하며, 항 세포 고사 인자로서 간주할 수 있는 임의의 인자도 본원에 포함된다. 이와 같은 인자는 핵산에 의해 암호화되고, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 및/또는 상기 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포에 의해 분비되는 것이 바람직하다. 여기서, 상기와 같은 항 세포 고사 인자는 다음과 같은 세포 고사 인자 또는 세포 고사 관련 단백질 예를 들어, AIF, Apaf 예를 들어, Apaf-1, Apaf-2, Apaf-3, 오더(oder) APO-2(L), APO-3(L), 아포파인, Bad, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-x_L, Bcl-x_S, bik, CAD, 칼파인, 카스파제 예를 들어, 카스파제-1, 카스파제-2, 카스파제-3, 카스파제-4, 카스파제-5, 카스파제-6, 카스파제-7, 카스파제-8, 카스파제-9, 카스파제-10, 카스파제-11 , ced-3, ced-9, c-Jun, c-Myc, crm A, 시토크롬 C, CdR1, DcR1, DD, DED, DISC, DNA-PK_CS, DR3, DR4, DR5, FADD/MORT-1, FAK, Fas(Fas-리간드 CD95/fas(수용체)), FLICE/MACH, FLIP, 포드린, fos, G-액틴, Gas-2, 겔솔린, 그란자임 A/B, ICAD, ICE, JNK, 라민 A/B, MAP, MCL-1, Mdm-2, MEKK-1 , MORT-1, NEDD, NF-_카파B, NuMa, p53, PAK-2, PARP, 퍼포린, PITSLRE, PKC델타, pRb, 프레세닐린, prlCE, RAIDD, Ras, RIP, 스핑고미엘리나제, 헤르페스 심플렉스 유래 티미딘 키나제, TRADD, TRAF2, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, 트랜스글루타미나제 중 하나 이상에 대해 저항 활성을 나타낼 수 있다.

안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 암호화 및 분비하는 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포는 또한, 본원에 정의된 부가의 인자 예를 들어, 항 세포 고사 제제 및 VEGF 등을 암호화 및 분비할 수도 있다. 이와 같은 목적으로, 본원에 정의된 신경 보호 인자 또는 혈관 신생 억제 인자 또는 이의 단편이나 변이체, 그리고 또 다른 임의의 인자들은, 통상적으로 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어를 제조하기 전에 세포에 형질 감염된 하나 이상의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 이와 같은 핵산 서열은 세포 내에서 천연 생성될 수 있거나, 또는 (구형) 마이크로캡슐을 제조하기 전에 수행되는 세포 형질 감염 기술에 의해 세포에 도입될 수 있다. 본 발명에 의하면, 임의의 적당한 핵산 서열이 사용될 수 있다.

하나의 구체예에 의하면, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자 예를 들어, 항 세포 고사 인자 및 VEGF 등을 암호화하는 핵산 서열은 임의의 핵산으로부터 선택될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 (하나 이상의) 펩티드 또는 단백질을 암호화하기 적당한 임의의 핵산 즉, 암호화 핵산 예를 들어, 암호화 DNA[예를 들어, 게놈 DNA, cDNA, DNA 올리고뉴클레오티드로부터 선택], 또는 암호화 RNA[예를 들어, (짧은) RNA 올리고뉴클레오티드, 메신저 RNA(mRNA) 등으로부터 선택]로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 내용 중, mRNA는 통상적으로, 몇 개의 구조적 요소 예를 들어, 임의의 5'-UTR 부위, 뒤에 암호화 부위가 있는 상류 리보좀 결합 위치, 임의의 3'-UTR 부위(뒤에 폴리A 테일(및/또는 폴리C 테일)이 올 수 있음)로 이루어진 RNA이다. mRNA가 단일-, 이중- 또는 다중 시스트론 RNA 즉, 상기한 바와 같은 단백질 또는 펩티드 1개, 2개 또는 그 이상의 암호화 서열을 보유하는 RNA로서 생성될 수 있다. 이- 또는 다중 시스트론 mRNA 내에 존재하는 이와 같은 암호화 서열은 하나 이상의 IRES 서열에 의해 분리되어 있을 수 있다. 하나 이상의 핵산 서열은 또한 리보좀 RNA(rRNA), 운반 RNA(tRNA) 또는 바이러스 RNA(vRNA)일 수도 있다. 뿐만 아니라, 하나 이상의 핵산 서열은 환형 또는 선형 핵산일 수 있으며, 바람직하게는 선형 핵산일 수 있다. 더욱이, 하나 이상의 핵산 서열은 (2개의 단일 사슬 핵산의 비 공유 결합에 의해 상기 정의에 포함되는 핵산으로 간주할 수도 있는) 단일 또는 이중 사슬 핵산 서열, 또는 최소한 부분적으로 자기 상보성인 부분 단일 사슬 또는 부분 이중 사슬 핵산 서열일 수 있는데, 여기서, 상기 부분적으로 이중 사슬이거나 부분적으로 단일 사슬인 핵산은 둘 다 통상적으로, 길이가 긴 단일 사슬 핵산 및 길이가 짧은 단일 사슬 핵산, 또는 길이가 거의 동일한 2개의 단일 사슬 핵산에 의해 형성되며, 이 경우, 하나의 단일 사슬 핵산은 다른 단일 사슬 핵산과 부분적으로 상보성이므로, 두 핵산 즉, 부분적으로 이중 사슬인 핵산 또는 부분적으로 단일 사슬인 핵산은 부분적으로 상보성인 부위에서 이중 사슬 핵산을 형성한다.

유전 암호의 축퇴성으로 인하여, 다수의 핵산 서열은 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자 예를 들어, 항 세포 고사 인자 및 VEGF 등을 암호화할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 의하면, 본원에 정의된 세포의 형질 감염에 사용되는 핵산 서열은, 상기 정의한 바와 같은 임의의 핵산 서열, 바람직하게는 (a) 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, 또는 GLP-1 펩티드 특히, 전체 GLP-1 아미노산 서열(GLP-1(1~37)) 또는 기능성 GLP-1(7~35, 36 또는 37) (변이체) 서열 또는 기타 임의의 GLP-1 펩티드 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 암호화할 수 있거나, 또는 (b) 임의로는 상기 (a)에 의한 GLP-1 서열의 N-말단에서 서열을 절단하는 프로테아제를 암호화할 수 있으며, 임의로는 상기 (b)로부터 유래하는 단일 펩티드 서열 상류를 암호화할 수 있고, 또한 (c) 임의로는 상기한 바와 같은 추가의 인자를 암호화할 수 있는 핵산 서열로서, 본원에 정의된 바와 같은 세포의 형질 감염에 적당한 핵산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게 신호 (펩티드) 서열은 이하 정의한 서열로부터 선택된다. 그러므로, 생성된 아미노산 서열은 신호 펩티드 서열, 임의의 프로테아제 절단 서열 및 생물학적으로 유효한 인자 즉, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드(그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자 예를 들어, 항 세포 고사 인자 및 VEGF 등(N-말단에서 C-말단)으로 이루어질 수 있다. 그렇기 때문에, 신호 펩티드 서열과 프로테아제 절단 서열은 숙주 세포(내 천연 생성 서열)와 이종인 것이 바람직하며, 상기 정의한 바와 같은 GLP-1(5~37, 6~37 또는 7~37) 및 이의 변이체는 상기 단서에 의한 정의 내에 포함되는 천연 GLP-1의 1~6번 아미노산과 상이한 것이 바람직하다.

본원에 정의된 핵산 서열은 벡터 내에 포함될 수 있다. 그러므로, 본 발명에 의해 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포는 본원에 이미 정의된 바와 같은 핵산을 포함하는 벡터를 포함할 수 있다. 이 벡터는 본원에 정의된 바와 같은 세포를 형질 감염시켜 본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐을 제조하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, 이러한 벡터, 구체적으로, 발현 벡터는 본원에 정의된 바와 같은 하나 이상의 핵산 서열 즉, 상기 정의한 바와 같은 암호화 요소 (a)와, 임의로는 (b) 및/또는 (c), 그리고 필요한 경우에는 본원에 정의된 부가의 요소 예를 들어, 상기 정의한 바와 같은 암호화 요소 (a) 및 임의로는 (b) 및/또는 (c), 그리고 임의로는 추가의 인자 예를 들어, 항 세포 고사 인자 및 VEGF 등을 암호화하는 서열을 발현시키는데 적당한 요소를 포함한다. 본원에 사용된 벡터의 제1군은 동물 바이러스(예를 들어, 소 유두종 바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 또는 SV40 등)로부터 유래하는 자가 복제성 염색체 외 플라스미드를 제공하는 DNA 요소를 이용한다. 본원에 사용된 벡터의 제2군은, 원하는 유전자 서열이 숙주 세포 염색체 내에 통합하는 기작에 의존한다.

본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 세포를 매립하기 전에 이 세포를 형질 감염하는데 적당한 벡터는 통상적으로, 상기한 바와 같은 핵산 서열 암호화 요소 (a), 그리고 임의로는 (b) 및/또는 (c) 예를 들어, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 상기 정의한 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을, 적당한 (공) 벡터에 삽입함으로써 제조된다. 이와 같이 적당한 (공) 벡터에 관하여는 당 업자에게 공지되어 있으며, 이에 관하여는 문헌["Cloning Vectors" (Eds. Pouwels P. H.외 다수 Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018)]에서 살펴볼 수 있다. 적당한 (공) 벡터는 또한 당 업자에게 알려진 임의의 벡터 예를 들어, 플라스미드, 파지, 바이러스 예를 들어, SV40, CMV, 바큘로 바이러스(Baculo virus), 아데노 바이러스, 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 트랜스포존, IS-요소, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 선형 또는 환형 DNA를 포함하는 의미일 것이다. 포유 동물 세포 내 통합용으로서는 통상적으로, 선형 DNA를 사용한다. 바람직하게 본 발명에 사용된 벡터의 유형은 특정 숙주 세포 요구 조건을 충족한다. 시판중인 적당한 발현 벡터로서, 본 발명의 핵산 서열과 벡터가 삽입될 수 있는 발현 벡터로서는 pSPORT, pBluescriptIISK, 바큘로바이러스 발현 벡터 pBlueBac, 그리고 원핵 생물 발현 벡터 pcDNAII를 포함하는데, 이들 벡터는 모두 인비트로겐 코포레이션(Invitrogen Corp.)(캘리포니아주 샌 디에고 소재)으로부터 입수할 수 있다.

본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 세포를 매립하기 전에 세포를 형질 감염하는데 적당한, 본원에 정의된 벡터는 통상적으로, 상기 정의한 바와 같은 핵산 서열을 예를 들어, 암호화된 아미노산 서열의 발현을 제어하는 기타 조절 요소와 합한다. 이와 같은 조절 요소는 예를 들어, 1) 신체 조직 또는 일부에 특이적이고; 2) 구성적이며; 3) 글루코스 반응성이고/반응성이거나; 4) 유도성이자 조절 가능하다. 본원의 조절 요소는 (만일 벡터가 자기 복제된다면) 조절 서열과 복제 원으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 본 발명의 범위 내에 포함된 조절 서열로서는, 암호화 핵산 서열의 전사 및/또는 번역의 진행에 영향을 미치는 임의의 요소로서, 당 업자에게 공지된 요소가 있다. 프로모터 서열과는 별도로, 조절 서열로서는 RNA 중합 효소와 DNA 간 상호 작용을 강화하여 발현을 증가시킬 수 있는, 소위 인핸서 서열을 포함한다. 본 발명의 벡터의 추가의 조절 서열로서는 전사 조절 및 번역 개시 신호, 소위, "종결 인자 서열 등, 또는 이의 부분 서열이 있다.

일반적으로, 임의의 천연 생성 프로모터는 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐을 제조하는데 사용될 수 있는 세포를 형질 감염하는데 적당한 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 이와 같은 프로모터는 임의의 진핵 생물, 원핵 생물, 바이러스, 박테리아, 식물, 사람 또는 동물 예를 들어, 포유동물 프로모터로부터 선택될 수 있다. 적당한 프로모터로서는 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 프로모터, lacZ 프로모터, gal 10 프로모터 및 AcMNPV 다면체 프로모터, 프로모터 예를 들어, cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SV40-, SP6, I-PR- 또는 I-PL-프로모터(유리하게는, 그람-음성 박테리아에서 발견되는 프로모터)를 포함한다. 또한, 프로모터는 그람-양성 프로모터 예를 들어, 에이미(amy) 및 SPO2, 효모 프로모터 예를 들어, ADC1 , MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH 또는 포유동물 프로모터 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 근육 특이 프로모터 예를 들어, 포유동물 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, 포유동물 데스민 프로모터, 포유동물 트로포닌 1(TNN12) 프로모터, 또는 포유동물 골격 알파-액틴(ASKA) 프로모터, 또는 간류 피루베이트 키나제 프로모터 특히, (-183 ~ +12) 또는 (-96 ~ +12)에 걸쳐 존재하는 단편[Thompson외 다수, J Biol Chem, (1991). 266:8679-82.; Cuif외 다수, Mol. Cell Biol, (1992). 12:4852-61]; 스팟 14 프로모터(S14, -290 ~ +18)[Jump외 다수, J. Biol Chem, (1990) 265:3474-8]; 아세틸-CoA 카복실라제[O'Callaghan외 다수, J. Biol Chem, (2001) 276:16033-9]; 지방산 합성 효소(-600 ~ +65)[Rufo외 다수, J Biol Chem, (2001) 28:28]; 및 글루코스-6-포스파타제(래트 및 사람)[Schmoll외 다수, FEBS Left, (1996) 383:63-6; Argaud외 다수, Diabetes (1996) 45:1563-71], 또는 CaM-키나제 II, 네스틴(Nestin), L7, BDNF, NF, MBP, NSE, 베타-글로빈, GFAP, GAP43, 티로신 하이드록실라제, 카이나트(Kainat)-수용체-서브유닛 1, 글루타메이트-수용체-서브유닛 B, 또는 사람 유비쿼틴 프로모터 B(ubiB 사람), 사람 페리틴 H 프로모터(FerH) 등으로부터 유래하는 프로모터로부터 얻을 수 있다. 특히 바람직한 프로모터로서는 사람 또는 포유동물로부터 유래하는 프로모터가 있다. 마지막으로, 합성 프로모터가 유리하게 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터에 포함된 프로모터 서열은 또한 시험관 내 제어용으로 유도되어, (예를 들어, 성장 배지 중 영양소 또는 기타 유도제의 존재 또는 부재 여부에 의해서) 발현을 조정할 수도 있다. 이에 관한 하나의 예로서는 박테리오파지 람다 pLAC5로부터 유래하며, IPTG에 의해 유도될 수 있는 lac 오페론이 있다. 마지막으로, 본원에 정의된 프로모터는 상기 정의한 바와 같은 핵산 서열 예를 들어, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자 예를 들어, 항 세포 고사 제제 및 VEGF 등을 암호화하는 핵산 서열과 결합하여, GLP-1 암호화 핵산 서열의 5'-"상류"에 위치할 수 있다. 사람의 프로모터 예를 들어, 사람 유비쿼틴 프로모터 B(ubiB 사람) 또는 사람의 페리틴 H 프로모터(FerH)를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 정의한 핵산 서열에 의해 암호화된 펩티드의 발현을 상향 조절하기 위한 인핸서 서열은, 본원에 정의된 바와 같은 벡터 또는 발현 벡터의 또 다른 구성 성분인 것이 바람직하다. 이와 같은 인핸서 서열은 통상적으로 벡터의 비-암호화 3' 부위 내에 위치한다. 본원에 정의된 벡터 내에 사용된 인핸서 서열은, 바람직하게는 상기 인핸서 서열과 상응하는, 본원에 정의된 바와 같은 프로모터와 함께, 임의의 진핵생물, 원핵생물, 바이러스, 박테리아, 식물, 사람 또는 동물 예를 들어, 포유동물 숙주로부터 얻을 수 있다. 본 발명에서 가장 유용할 인핸서 요소로서는 글루코스 반응성, 인슐린 반응성 및/또는 간 특이적인 인핸서 요소가 있다. 인핸서 요소로서는 (예를 들어, 유비쿼틴 프로모터(Cubi)에 결합된) CMV 인핸서; 하나 이상의 글루코스 반응성 요소 예를 들어, 간 피루베이트 키나제(L-PK) 프로모터의 글루코스 반응성 요소(G1RE)(-172 ~ -142); 그리고 반응성이 강화된 변형체[Cuif외 다수, 상동; Lou 외 다수, J. Biol Chem, (1999). 274:28385-94]; 보조 L3 박스를 보유하는 L-PK의 G1RE(-172 ~ -126)[Diaz Guerra 외 다수, Mol. Cell Biol, (1993) 13:7725-33]; 보조 L3 박스를 보유하고, 반응성이 강화된 G1RE의 변형체; S14(-1448 ~ -1422)의 탄수화물 반응성 요소(ChoRE), 그리고 낮은 글루코스 농도에서 활성화되는 변형체[Shih and Towle, J Biol Chem, (1994). 269:9380-7; Shih외 다수, J Biol Chem, (1995) 270:21991-7; 및 Kaytor외 다수, J Biol Chem, (1997). 272:7525-31]; S14의 인접 보조 인자 부위(-1467 ~ -1422)를 포함하는 ChoRE[외 다수, 상동]; 알돌라제(+1916 ~ +2329)[Gregori외 다수, J Biol Chem, (1998). 273:25237-43; Sabourin외 다수, J. Biol Chem, (1996). 271 :3469-73]; 및 지방산 합성 효소(-7382 ~ -6970)[Rufo외 다수, 상동], 더욱 바람직하게는 인슐린 반응성 요소 예를 들어, 글루코스-6-포스파타제 인슐린 반응성 요소(-780 ~ -722)[Ayala외 다수, Diabetes (1999). 48:1885-9]; 및 간 특이적 인핸서 요소 예를 들어, 프로트롬빈(940 ~ -860)[Chow외 다수, J. Biol Chem, (1991) 266: 18927-33]; 및 알파-1-마이크로글로불린(-2945 ~ -2539)[Rouet외 다수, Biochem J, (1998) 334:577-84)], 근육-특이적 인핸서 예를 들어, 포유동물 MCK 인핸서, 포유동물 DES 인핸서, 그리고 척추동물 트로포닌 I IRE(TNI IRE, 이하, 본원에서 FIRE라 칭함) 인핸서를 포함할 수 있다. 마지막으로, SV40 인핸서 서열도 포함될 수 있다.

인핸서 요소는, 본원에 정의된 핵산 서열에 의해 암호화되는 펩티드의 발현을 상향 조절하기 위한 프로모터로서 본원에 정의된 것과 함께 사용될 수도 있는데 예를 들어, 이와 같은 프로모터/인핸서 조합체로서는 예를 들어, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터와 CMV 인핸서, 유비쿼틴 프로모터(Cubi)에 결합된 CMV 인핸서, 사람 혈청 알부민[HSA] 인핸서를 포함하는 간-특이적 인핸서 요소 군, 사람 프로트롬빈[HPrT] 인핸서, 알파-1 마이크로글로불린[A1MB] 인핸서, 그리고 자체의 상응하는 프로모터와 함께 사용되는 인트론 알돌라제 인핸서, 또는 CMV 프로모터 또는 HSA 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터와 함께 사용되는 HSA 인핸서, 알파-1-항 트립신 프로모터 등과 함께 사용되는 알파-1 마이크로글로불린[A1MB] 및 사람 프로트롬빈[HPrT]로 이루어진 군으로부터 선택되는 CMV 프로모터 인핸서 요소와 함게 사용되는 알파-1 마이크로글로불린[A1MB] 및 사람 프로트롬빈[HPrT]으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인핸서 요소를 포함한다.

뿐만 아니라, 본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 구성 성분으로서 사용될 수 있는 세포를 형질 감염하는데 적당한, 본원에 정의된 벡터는 적당한 숙주에 의해 인지된 전사 및/또는 번역 신호, 바람직하게는 전사 및/또는 번역 신호 예를 들어, 전사 조절 신호 및 번역 개시 신호를 포함할 수 있다. 전사 및/또는 번역 신호는, 바람직하게는 본원에 정의된, 상기 전사 및/또는 번역 신호에 상응하는 프로모터와 함께, 임의의 진핵 생물, 원핵 생물, 바이러스, 박테리아, 식물, 바람직하게는 사람 또는 동물 예를 들어, 포유동물 숙주로부터 얻을 수 있다. 그러므로, 숙주 세포가 상기 정의한 펩티드 예를 들어, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자를 암호화하는 핵산 서열과 함께 전사 조절 및 번역 개시 신호를 인지하도록, 숙주의 성질에 따라서 다양한 전사 및 번역 조절 서열이 사용될 수 있다. 천연 생성 GLP-1 암호화 핵산 서열에 인접한 5' 부위는, 본 발명의 벡터의 전사 및 번역 조절을 위해서 보유 및 사용될 수 있다. 이 부위는 통상적으로, 전사 및 번역의 개시와 관련된 서열들 예를 들어, TATA 박스, 캡핑 서열 및 CAAT 서열 등을 포함할 것이다. 통상적으로, 상기 부위의 길이는 약 150 염기쌍 이상, 더욱 통상적으로는 약 200bp, 그리고 드물게는 약 1 ~ 2kb를 초과할 것이다.

본원에 정의된 벡터에 적당한 것으로서, 억제 또는 활성화를 제어할 수 있어서, 상기 정의한 바와 같은 펩티드 예를 들어, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자를 암호화하는 핵산 서열의 발현을 조정할 수 있는 전사 개시 조절 신호가 선택될 수 있다. 이와 같이 제어 가능한 조정 기술의 일례로서는 온도에 변화를 주어 발현을 억제 또는 개시하는, 온도에 감수성인 조절 신호를 이용하는 기술이 있다. 또 다른 제어 가능 조정 기술로서는 임의의 화학 물질에 감수성인 조절 신호를 이용하는 기술이 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 필요한 구조물을 제조할 때 시험관 내 방법에 사용되는 것이 바람직하다. 뿐만 아니라 예를 들어, 캡슐화된 세포 내에서 일시적으로 발현시키기 위해서, 세포 외부로부터 어떠한 추가의 수단도 가하여지지 않고서도 생체 내 발현의 억제 또는 활성화를 제어할 수 있는 전사 개시 조절 신호를 본원에서 사용할 수 있다. 이와 같은 전사 및/또는 번역 신호로서는 예를 들어, 전사 종결 조절 서열 예를 들어, 종결 신호 및 폴리아데닐화 부위를 포함한다. 뿐만 아니라, 전사 종결 조절 서열은 상기 정의한 바와 같은 펩티드 예를 들어, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는, 본원에 정의된 바와 같은 벡터의 비-암호화 3' 부위 내에 위치할 수 있다. 적당한 종결 서열로서는 예를 들어, 소 성장 호르몬, SV40, lacZ, EF1 알파 및 AcMNPV 다면체 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.

본 발명에 의하여 사용될 수 있는 (구형) 마이크로캡슐을 제조하는데 사용될 수 있는 세포를 형질 감염하는데 적당한 발현 벡터로서는 또한, 상기 정의한 펩티드 예를 들어, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자를 암호화하는 핵산 서열을 최적으로 발현하는데 사용되는 기타 서열을 포함할 수도 있다. 이와 같은 서열로서는 신호 (펩티드) 서열을 암호화하는 서열 즉, 분비된 단백질이 막을 통과하도록 만드는, N-말단 위치 펩티드 서열을 암호화하는 서열; 발현 산물의 안정성을 제공하는 서열; 그리고 제한 엔도뉴클레아제에 의한 절단에 사용되는 위치를 제공하는 제한 효소 인지 서열을 포함한다. 상기 서열 모두는 당 업계에 공지되어 있으며, 시판되고 있다[예를 들어, 문헌(Okayama (1983), Mol. Cell. Biol., 3: 280) 참조].

본원에 정의된 "신호 서열"이란, 분비될(즉, 세포막을 통과할), 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 발현 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 추가의 단백질이나 단백질-유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편 또는 변이체, 또는 추가의 인자의 N-말단에 위치하는 약 8 ? 30개의 아미노산[GLP-1의 1?6번 아미노산에 관한 상기 조건의 정의 내에 포함]을 통상적으로 포함하는 신호 (펩티드) 서열을 말한다. 이와 같은 신호 (펩티드) 서열은 보통 야생형 GLP-1 전구체 단백질과 결합하고 있는 신호 (펩티드) 서열[즉, 전장 프로글루카곤 전구체 분자의 신호 (펩티드) 서열(들)], 그리고 보통 야생형 GLP-1 전구체 단백질과 결합하고 있지 않은 신호 (펩티드) 서열들 즉, 야생형 GLP-1 전구체 단백질에 이종인 신호 (펩티드) 서열을 포함할 수 있다. 본원에 정의된 "신호 (펩티드) 서열"은 예를 들어, 신호 펩티드 서열 또는 리더 서열(예를 들어, 분비 신호 (및 리더) 서열)일 수 있다. 뿐만 아니라, 본원에 정의된 신호 (펩티드) 서열은 바람직하게 프로테아제 예를 들어, 신호 서열 프로테아제에 의해 절단되어 전구체 펩티드를 제공하게 된다. 프로테아제에 의해서 전구체 펩티드로부터 신호 서열을 절단하면 예를 들어, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 생물학적 활성 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자가 생산된다. 이와 같은 신호 (펩티드) 서열은 통상적으로, 절단 작용이 있는 프로테아제에 의해 인지되는 절단 위치를 암호화하는 부위를 포함한다. 대안적으로, 절단 작용이 있는 프로테아제에 의해 인지되는 절단 위치를 암호화하는 부위가 신호 (펩티드) 서열에 도입될 수 있다. 뿐만 아니라, 절단 작용이 있는 프로테아제에 의해 인지되는 절단 위치를 암호화하는 (하나 이상의) 부가 서열이 신호 (펩티드) 서열에 부가될 수 있다.

본원에 정의된 벡터에 의해 암호화될 수 있는 신호 (펩티드) 서열의 예로서는 분비된 단백질 예를 들어, GLP-1, 또는 GLP-1 이외에도 예를 들어, 시토킨, 응고 인자, 면역 글로불린, 분비형 효소 또는 호르몬(뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩티드(PACAP)/글루카곤 상과 포함) 및 혈청 단백질로부터 유래하는 신호(펩티드) 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 정의된 신호 (펩티드) 서열은 분비형 매트릭스 메탈로프로티나제(MMP)(예를 들어, 스트로멜리신 리더 서열), 분비형 사람 알칼라인 포스파타제(SEAP), 프로엑센딘(예를 들어, 프로엑센딘-4 리더 서열), 프로-헬로더민, 프로-글루코스-의존성 인슐린 분비 폴리펩티드(GIP), 프로-인슐린-유사 성장 인자(IGF1), 프리프로글루카곤, 알파-1 안티트립신, 인슐린-유사 성장 인자 1, 사람 인자 IX, 사람 림포톡신 A(유전자 은행(Genbank) 수탁 번호: BAA00064), 또는 사람 클러스터린(유전자 은행 수탁 번호: AAP88927)으로부터 유래할 수 있다. 본원에 정의된 신호 (펩티드) 서열의 구체예로서는, 신호 펩티다제, 푸린(furin) 또는 기타 프로호르몬 전환 효소(예를 들어, PC3)에 의한 전구체 절단 신호의 암호화 부위를 포함하는 서열이 있다. 예를 들어, 푸린(미국 특허 제5,460,950호에 의하면 PACE라고도 알려짐), 기타 서브틸리신(예를 들어, PC2, PC1/PC3, PCAE4, PC4, PC5/PC6, LPC/PC7/IPC8/SPC7 및 SKI-1; Nakayama, Biochem. J., 327:625-635 (1997)); 엔테로키나제(미국 특허 제5,270,181호 참조) 또는 키모트립신에 의해 절단되는 신호는 본원에 정의된 신호 (펩티드) 서열에 도입될 수 있다. 상기 각각의 문헌에 개시된 사항은 본원에 참고용으로 인용되어 있는 것이다. 푸린은 후기 골지체에 존재하며, 분비 전에 단백질 전구체를 가공하는, 편재 발현형 프로테아제이다. 푸린은 자체의 공통 인지 서열, Arg-X-Lys-Arg 또는 Arg-X-Arg-Arg, (Lys/Arg)-Arg-X-(Lys/Arg)-Arg 및 Arg-X-X-Arg 예를 들어, Arg-Gln-Lys-Arg의 COOH-말단을 절단한다. 이와 같은 아미노산 서열은 프로테아제 푸린에 의한 전구체 절단 신호이다. 그러므로, 이종 신호 서열은 또한 신호 서열로부터 편집된 공통 서열[예를 들어, 신호 펩티다제에 의해 절단된 분비형 단백질로부터 편집된 공통 서열]로부터 합성에 의해 유래할 수도 있다.

본원에 정의된 조절 서열에 더하여, 본원에 정의된 자기 복제 벡터는 통상적으로 복제 원을 포함한다. 적당한 복제 원으로서는 예를 들어, 복제 원 ColE1, pSC101, SV40, pMPI(ori pMPI) 및 M13 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

바람직하게 본원에 정의된 벡터로서, 상기 정의한 펩티드 예를 들어, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자의 발현에 적당한 벡터는 추가로 자살 유전자(suicide gene)를 함유(하도록 조작)할 수도 있다. 본 발명의 내용에 있어서, "자살 유전자"는 바람직하게, 특이 물질을 투여할 때 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 함유된 자살 유전자 보유 세포를 사멸시킴으로써, 본원에 사용된 (구형) 마이크로캡슐을 사용하는 치료법을 중단할 수 있는 것이 바람직하다. 다시 말해서, 본 발명에 적당한 자살 유전자는, 통상적으로 사람이나 동물의 체 내에서 생성되지 않는 외인성 활성 인자를 투여함으로써 활성화될 수 있다. 이러한 경우, 자살 유전자는 통상적으로, 세포가 세포 고사 현상을 수행하도록 만드는 캐스케이드를 개시한다. 대안적으로, 본 발명에 적당한 자살 유전자는 통상적으로, 사람이나 동물의 체 내에 생성되지 않는 무독성 전구 약물로서 외부로부터 투여된 전구 약물을 대사할 수 있다. 외인 무독성 전구 약물의 대사를 통하여, 전구 약물을 세포 독소로 만들 수 있다. 상기 자살 유전자는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 암호화하는 동일한 벡터 상에 포함될 수 있거나, 제2의 벡터 상에 포함될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 자살 유전자는 임의의 종류의 제어 및 조절 요소 예를 들어, 발현 벡터의 구성 요소로서 본원에 언급된 제어 및 조절 요소 예를 들어, 프로모터 및 인핸서 등, 또는 자체의 천연 생성 제어 및 조절 요소에 의해 조절될 수 있다. 바람직하게 본 발명에 의하면, 상기 제어 기작 중 임의의 기작을 수행할 수 있는 자살 유전자가 선택되는데 예를 들어, 테트라사이클린을 첨가함으로써 유도할 수 있는 시토신 디아미나제(CD), 우라실 포스포리보실 트랜스퍼라제(UPRTase), HSV 티미딘 키나제(HSV-Tk) 자살 유전자 예를 들어, 박테리아 Tet 억제 유전자 단백질(TetR) 자살 유전자 등으로부터 선택된다. 특정 구체예로서, 시토신 디아미나제(CD)를 사용할 수 있다. 시토신 디아미나제(CD)는 통상적으로 다양한 유기체 내에서 생성되며, 일반적인 화학 요법 제제인 5-플루오로시토신(5-FC)을 5-플루오로우라실(5-FU)로 변형할 수 있다. 5-플루오로우라실(5-FU)은 유기체에 대하여 독성이 매우 강한 반면에, 이것의 전구 약물인 5-플루오로시토신(5-FC)은 세포에 무독성이다. 5-플루오로우라실(5-FU)은 추후, 세포성 키나제에 의해 인산화되어 세포의 RNA 합성을 방해할 수 있다. 그러므로, 전구 약물 5-플루오로시토신(5-FC)은 특정 세포의 자살을 유도하는 훌륭한 도구가 된다. 더욱이, 5-플루오로-dUMP는 항엽산제로서 작용을 하며, 데옥시리보뉴클레오티드의 신생 합성 경로에서 dUMP가 dTMP로 메틸화되는 것을 촉진하는 효소인 티미딜레이트 합성 효소를 억제한다. 이로써, 세포 내 DNA 합성을 억제할 수 있다. 뿐만 아니라, 바람직하게는 HSV-1 티미딘 키나제(ATP: 티미딘-5-포스포트랜스퍼라제(HSV1tk) 및 이의 상응하는 전구 약물인 갠시클로버(GCV)도 사용할 수 있다. 구아노신 유사체 GCV는 특이적으로 인산화되어 DNA 합성에 있어서 연장 과정을 억제하므로, 세포의 자살을 유도한다. 이와 같은 내용 중, HSV-1 티미딘 티나제는 세포 내에서 무독성 전구 약물인 갠시클로버를 독성 산물로 전환하여, 예상치 못한 세포 증식의 경우 형질 감염된 세포를 파괴할 수 있다. 그러므로, 퇴화 세포를 함유하는 GLP-1 셀비즈(CellBeads)？로 처리된 환자에 갠시클로버를 전신 투여하면, 이식된 세포가 파괴된다.

본원에 정의된 벡터, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자를 암호화하는 나출 핵산을, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 제조에 사용되는 적당한 세포에 형질 감염하는 것은 당 업자에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다[예를 들어, 문헌(Maniatis외 다수 (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) 참조]. 만일 벡터가 본원에 정의된 적당한 세포에 형질 감염되면, 이 벡터는 GLP-1 펩티드 암호화 핵산을 운반하는 플라스미드 DNA의 형태로 존재하는 것이 바람직하다. 이 플라스미드 DNA는 환형 플라스미드 DNA인 것이 바람직하다. 적당한 형질 감염법으로서는 예를 들어, 전기 천공 기술 예를 들어, 변형 전기 천공 기술(예를 들어, 뉴클레오펙션(nucleofection)), 칼슘 인산염 기술 예를 들어, 칼슘 인산염 공 침전법(calcium phosphate co-precipitation), DEAE-덱스트란 방법, 리포펙션 방법(lipofection method) 예를 들어, 전달-매개 리포펙션 방법(transferring-mediated lipofection method) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게 트랜스펙션은 변형 전기 천공 기술(예를 들어, 뉴클레오펙션)을 이용하여, 본원에 정의된 플라스미드 DNA 운반 벡터로 수행된다.

본원에 정의된 벡터, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자를 암호화하는 핵산도 또한 예를 들어, 형질 감염하기 위해 하나 이상의 합성 중합체 또는 천연 중합체 예를 들어, 폴리 아미노산과 복합체를 형성할 수 있거나, 또는 이 중합체에 접합될 수 있다. 하나 이상의 중합체 성분은 본원에 정의된 벡터, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체를 암호화하는 핵산에 공유 결합으로 커플링될 수 있다. 본 발명의 내용 중 "접합된"이란 용어는, "화학적으로 커플링된"이라는 의미이다. "화학적으로 커플링된"이란, 공유 결합이나 비공유 결합을 통하여 커플링된 경우를 의미한다. 공유 결합이 사용될 수도 있지만, 형질 감염용으로서는 비공유 결합이 바람직하다. 그러므로, 중합체 성분은 공유 결합 없이도 복합체화를 통하여(예를 들어, 수소 결합 또는 정전기적 상호 작용 또는 소수성 상호 작용 등을 통하여) 융합 펩티드에 결합할 수 있다.

본원에 정의된 벡터, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 (형질 감염에 사용되는) 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체를 암호화하는 핵산을 커플링하는데 사용된 중합체는, 수용액 또는 수성 현탁액 중에 가용성이며, 융합 펩티드를 약학적으로 유효량만큼 투여하였을 때, 포유동물에 부정적인 영향 예를 들어, 부작용을 미치지 않는 중합체를 포함하는, 생리학적으로 허용 가능한 중합체일 수 있다. 본 발명에 의하여 사용되는 생리학적 허용 가능 중합체에 대해 특별한 제한 사항은 없다. 중합체는 합성된 것이거나, 아니면 천연 생성 중합체(예를 들어, 단백질)일 수 있다.

더욱 일반적으로, 본원에 정의된 벡터, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질을 암호화하는 핵산, 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체와 함께 사용된 합성 중합체는 알킬렌 글리콜 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올, 폴리올레핀 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리하이드록시알킬 메타크릴아미드, 폴리하이드록시알킬 메타크릴레이트 예를 들어, 폴리하이드록시에틸렌 메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 다당류, 폴리([알파]-하이드록시산), 폴리비닐 알콜, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모폴린), 폴리비닐에틸 에테르, 폴리비닐아세탈, 폴리락트 글리콜산, 폴리락트산, 지질 중합체, 키틴, 히알루론산, 폴리우레틴, 폴리시알산, 셀룰로스 트리아세테이트, 셀룰로스 니트레이트 및 상기한 것들 중 임의의 것들의 조합체로부터 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명은 또한, 본 발명에 의하여 사용되는 (구형) 마이크로캡슐을 제조하는 방법을 제공하기도 한다. 이와 같은 (구형) 마이크로캡슐은 2단계 이상으로 이루어진 방법에 따라서 제조되는 것이 바람직하다. 상기 방법의 제1 단계에 의하면, 코어는 상기한 바와 같이 제조된다. 상기 방법의 제2 단계에 의하면, 상기 방법의 제1 단계에 의해 제조된 코어는 하나 이상의 표면 코팅층(들)에 의하여 코팅된다. 추가의 표면 코팅층을 제조하기 위한 임의의 추가 단계는 방법의 제2 단계를 반복하는 과정을 포함할 수 있다. 바람직하게 방법의 제2 단계와 동일한 단계는 이와 같은 추가의 표면 코팅층 각각에 대해 수행된다. 임의의 추가 단계로서는 구형 마이크로캡슐을 제조한 다음에 행해지는 세정 단계를 포함할 수 있다.

통상적으로, 상기 개시된 코어는 본 발명에 따라서 사용되는 (구형) 마이크로캡슐을 제조하는 방법의 제1 단계에 따라서 제조된다. 이와 같은 코어는 가교 중합체와, 상기 개시된 방법에 따라서 형질 감염된 세포로서, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 그리고 임의로는 본원에 정의된 바와 같은 부가의 인자를 암호화 및 분비하는 세포로 이루어져 있다. 상기 방법의 제1 단계에 의하면, 중합체의 가용 형 예를 들어, 알기네이트의 가용 형(예를 들어, 생리적 염 용액 중 칼륨 또는 나트륨 알기네이트)과 상기 정의된 세포의 혼합물(현탁액)은 통상적으로, 본원에 (구형) 코어에 대해서 정의된 농도 예를 들어, 중합체 용액 1㎖당 1×10⁵?6×10⁷개의 세포로 제조된다.

통상의 기술로서, 공통 중심 주위에 3개의 동심원 고리가 동심 형태로 배열된 3개의 채널 즉, 내부 채널, 중간 채널 및 외부 채널(공기 고리)로 이루어진 공기 주입 스프레이 노즐을 통해, 균일한 세포/중합체 현탁액(예를 들어, 세포/알기네이트 현탁액)을 가압할 수 있다. 바람직하게 내부 지름이 50?2,000㎛인 내부 채널용 바늘로서는 속이 빈 바늘을 사용하는 것이 바람직하다. 중간 채널의 내부 지름은 통상적으로 60?4,000㎛이며, 외부 채널(공기 고리)의 내부 지름은 100?5,000㎛인 것이 바람직하다. 오로지 내부 채널 및 외부 채널(공기 고리)만이 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 코어를 제조하는 방법의 제1 단계에 사용된다. 그러므로, 오로지 2개의 채널(내부 채널 및 외부 채널)로만 이루어진 스프레이 노즐 역시 상기 방법의 제1 단계에서 사용될 수 있다. 통상적으로, 만일 3개의 채널을 가지는 공기 주입 스프레이 노즐이 사용되면, 어떠한 물질도 중간 채널을 통과하여 흐르지 않게 된다. 세포/중합체 용액의 현탁액은 통상적으로, 채널의 출구로 액적을 보내는 내부 채널을 통해 10㎕/분 ? 5㎖/분의 속도로 가압되는데, 이 경우, 상기 액적은 통상적으로 0.5?10ℓ/분의 속도로 외부 채널(공기 고리)에 의해 공급되는 기류로 인해 배출된다. 세포와 비 가교 중합체 용액을 함유하는 액적은 통상적으로, 공기 주입 스프레이 노즐의 출구 아래로 약 4?약 60㎝ 떨어져 있는 곳에 위치하는 가교제 함유 용액(침전조)으로 떨어진다. 이와 같이 떨어지는 동안 상기 액적은 회전하게 되는데, 이로써 실질적으로 구형의 기하학적 형태를 가지게 되는 것이다. 가교제에 의해서 중합체가 이온성 가교 결합을 수행하게 되고, 상기 (구형) 코어에 대해 본원에 정의된 바와 같은 지름을 가지는 구형 (수 불용성) 마이크로캡슐의 코어가 처음에 형성된다. (구형) 마이크로캡슐 코어의 지름은 상기 방법의 제1 단계에서 사용된 선택 채널의 크기와 형상에 따라서 달라진다. 만일 알기네이트가 중합체로서 사용되면, 가교제 함유 용액(침전 조)은 2가 양이온 예를 들어, 칼슘 또는 바륨 이온(5?100mM)이나, 기타 2가 또는 다가 양이온으로 이루어진 것이 바람직하다. 뿐만 아니라, 침전 조는 완충 물질(예를 들어, 1?10mM의 히스티딘) 및 염화나트륨(예를 들어, 290±50mOsmol)을 함유하는 것이 바람직하다. 만일 알기네이트 이외의 기타 중합체가 사용된다면, 기타 당 업계에 공지된 것으로서 적당한 가교제 및 완충액을 본원에 사용할 수 있다.

상기 방법의 제1 단계는 본원에 정의된 가교 중합체 및 세포로 이루어진 (구형) 마이크로캡슐의 코어를 제공한다. 상기 방법의 제1 단계를 수행한 후, 이 방법의 임의의 단계(들)에 세정 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 코어는 예를 들어, 생리적 염 용액이나 기타 임의의 적당한 세정 용액으로 세정되며, 가능하다면, 상기 코어는 황산 나트륨 용액, 바람직하게는 미국 특허 제6,592,886호(본 특허에 개시된 내용은 본원에 참고용으로 인용됨)에 의한 황산나트륨 용액 중에서 항온 처리된다. 본 발명에 의하여 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 코어를 침전 조 및/또는 세정 조로부터 분리하는 것은 통상적으로, 원심 분리나 기타 임의의 적당한 방법을 사용하여 수행된다.

상기 방법의 제2 단계에 의하면, 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 코어(상기 방법의 제1 단계에 의해 제조됨)는 실질적으로 가교된 중합체로 이루어진 표면 코팅층으로 코팅된다. 그러므로, 제1 단계에 의해 제조된 (구형) 마이크로캡슐의 코어는 상기 개시된 바와 같이 세포를 포함하지 않는 비 가교 중합체 함유 중합체 용액에 첨가된다. 바람직하게 상기 중합체는 본원에 정의된 농도로 비-가교형으로서 제공된다. 통상적으로, 중합체 용액과 (구형) 마이크로캡슐의 코어를 함유하는 혼합물은 전술한 공기 주입 스프레이 노즐의 내부 채널을 통과하면서 예를 들어, 15㎕/분?2㎖/분, 바람직하게는 10㎕/분?5㎖/분의 속도로 가압된다. 이와 동시에, 세포를 포함하지 않는 순수한 비 가교 중합체 용액, 바람직하게는 약 0.1?약 4%(w/v)의 중합체를 포함하는 용액 예를 들어, 어떠한 세포도 포함하지 않는 알기네이트 용액은, 통상적으로 15㎕/분?2㎖/분, 바람직하게는 10㎕/분?5㎖/분의 속도로 중간 채널을 통과하면서 가압된다. 그러므로, 액적은 중합되지 않은 중합체의 표면과 코어를 함유하는 중간 채널의 말단부에 형성된다. 이와 같은 액적은 통상적으로, 0.5?10ℓ/분의 속도로 외부 채널(공기 고리)을 통해 제공되는 기류로 인해 배출된다. (구형) 마이크로캡슐 코어의 중합체 농도 즉, (구형) 마이크로캡슐의 코어에 첨가되는 중합체 용액의 중합체 농도, 그리고 표면 코팅층의 중합체 농도는 상이할 수 있다(상기 참조). (상기 방법의 제2 단계에 의하여 제조된) (구형) 마이크로캡슐의 코어를 함유하는 액적은 본원에 정의된 가교제를 함유하는 용액(침전조)으로 떨어진다. 이와 같이 액적이 떨어질 때, 이 액적은 회전하여 거의 구형인 기학학적 형태가 되는 것이 바람직하다. 가교제는 상기 방법의 제1 단계와 유사하게 중합체의 이온 가교 결합에 영향을 미친다. 그러므로, (구형) 마이크로캡슐의 지름이 본원에 정의된 바와 같고, 더욱 바람직하게는 이 (구형) 마이크로캡슐의 총 지름(입자 크기)이 약 100?약 200㎛, 더욱 바람직하게는 총 지름이 약 115?약 185㎛, 더더욱 바람직하게는 총 지름이 약 130?약 170㎛이며, 가장 바람직하게는 총 지름이 약 145?약 155㎛ 예를 들어, 약 150㎛인 수 불용성 (구형) 마이크로캡슐이 형성된다. 상기 방법의 제2 단계에 의해 생성될 수 있는 (구형) 마이크로캡슐의 총 지름은 본원에 사용된 선택 채널의 크기와 형상에 따라서 달라진다. 본원에 정의된 것으로서, 하나 이상의 표면 코팅층을 포함하는 (구형) 마이크로캡슐 즉, 본원에 정의된 코어와, 2, 3, 4, 5, 5?10개 이상의 표면 코팅층을 함유하는 (구형) 마이크로캡슐을 제조하기 위하여, 상기 방법의 제2 단계를 필요한 만큼 자주 반복 실시할 수 있다. 이와 같이 추가의 표면 코팅층들은 상기 지름 범위 내에서 한정된다.

상기 방법의 제2 단계를 수행한 후, 본원에 정의된 임의의 세정 단계를 1회 이상 실시할 수 있다.

또 다른 측면에 의하면, 본 발명은 동물 바람직하게는 포유동물에 있어서 안 질병을 치료하는 방법을 제공하기도 한다. 그러므로, 이와 같은 치료 방법은 사람을 대상으로 하는 의학 분야나 수의학 분야에서 사용될 수 있다. 본 발명의 내용에 있어서, 포유동물이란 용어에는 통상적으로, 임의의 동물 및 사람, 바람직하게는 사람과 (포유동물)(사람을 제외한) 동물 예를 들어, 돼지(pig), 염소, 소(cattle), 돼지(swine), 개, 고양이, 당나귀, 원숭이, 유인원 또는 설치류 예를 들어, 마우스, 햄스터 및 토끼, 소(cow), 토끼, 양, 사자, 재규어, 표범, 래트, 돼지, 버팔로, 개, 늘보 원숭이, 햄스터, 기니아 피그, 다마 사슴, 말, 고양이, 마우스, 오셀롯 및 서벌(serval) 등(이에 한정되는 것은 아님)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 동물 및 사람을 포함한다. 이와 같은 치료 방법은 통상적으로 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 특히, 본원에 정의된 세포로서, 본 발명에 사용될 수 있으며, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, GLP-1 융합 펩티드 등, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포, 또는 기타 임의의 세포(유형)를, 이것의 투여를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 수행되는데, 여기서, 상기 세포는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화되어, 치료 대상인 환자의 면역 시스템이 반응하는 것을 막아준다. 이와 같은 치료 방법은 또한 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐을 포함하는 (약학) 조성물 특히, 본원에 정의된 것으로서 본 발명에서 사용될 수 있으며, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, GLP-1 융합 펩티드 등, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포, 또는 기타 임의의 세포(유형)를 투여함으로써 수행될 수 있는데, 여기서, 상기 세포는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화되어, 치료 대상인 환자의 면역 시스템이 반응하는 것을 막아준다. 바람직하게 본 발명의 방법에 사용된 (구형) 마이크로캡슐과 이의 모든 성분 예를 들어, 코어의 중합체 매트릭스 또는 표면 코팅층 등을 이루는 중합체는 본원에 정의된 바와 같다. 뿐만 아니라, 이와 같은 치료 방법은 또한, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 GLP-1 융합 펩티드(모두 본원에 정의된 바와 같음)를 직접 투여함으로써 수행될 수 있다. 본 발명에 의한 상기 치료 방법은 사람을 대상으로도 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 수의학적 목적으로도 수행할 수 있다.

본원에 정의된 치료 방법으로서는 바람직하게, 안 질병 특히, 망막의 변성으로 인해 유발되는 안 질병 또는 안 질환 예를 들어, 망막 색소 변성증(RP), 황반 변성증(MD), 노인성 황반 변성증(AMD 또는 ARMD), 임의의 원인으로 인한 황반 부종, 망막 혈관 폐색증, 당뇨병성 망막 병증, 녹내장 및 기타 시신경 병증 등으로부터 선택되는 기타 망막 질병을 치료 또는 예방하는 것과, 상기 안 질병 또는 안 질환과 관련된 병태를 치료 또는 예방하는 것을 포함한다.

본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 상기 (구형) 마이크로캡슐이나 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드 등을 포함하는 (약학) 조성물을 사용하여 안 질병 또는 안 질환 또는 이것과 관련된 질병을 치료 또는 예방하는 것은, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 추가의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 GLP-1 융합 펩티드 등의 상기 유리한 효과를 바탕으로 한다. 예를 들어, GLP-1의 유리한 효과 관하여는 이미 알려져 있는데, 이와 같은 유리한 효과의 예로서는 예를 들어, 주입된 GLP-1 발현 동종 세포에 대해서 원치 않는 면역 반응이 발생할 위험성 및/또는 DPP-IV 프로테아제 안정성으로 인하여 GLP-1 펩티드(들)를 반복 투여할 필요 없이, 심장 조직의 잠재적인 사멸 및 산소 결핍 또는 허혈에 의해 유발되는 손상을 상당 수준 감소시키는 활성이 있다. 콜라겐 XVIII의 절단 산물인 엔도스타틴에 대하여 알려진 유리한 효과로서는 혈관 신생을 상당 수준 감소하는 활성을 포함한다. 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 중 세포, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, GLP-1 융합 펩티드 등, 또는 이의 단편이나 변이체의 "안전하고 유효한 양"은, 치료될 특정 안 질병 또는 안 질환, 그리고 처치 의사의 지식과 경험을 바탕으로 하여 치료될 환자의 연령과 신체 조건, 병태의 심각성, 치료 지속 기간, 병행 요법의 성질, 사용된 특정 약학적 허용 가능 담체의 성질, 그리고 처치 의사의 지식과 경험을 바탕으로 하는 유사 인자에 따라서 추가로 달라질 것이다.

본원에 정의된 바와 같이, 안 질병, 또는 이와 같은 안 질병과 관련된 임의의 질병이나 병태를 치료 또는 예방하는 방법은, 상기 정의된 바와 같은 (구형) 마이크로캡슐을 이것의 투여를 필요로 하는 환자에게 투여하거나, 또는 이러한 (구형) 마이크로캡슐을 함유하는 (약학) 조성물을 이것의 투여를 필요로 하는 환자에게 투여하거나, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드 등을 투여하는 것을 포함한다. "이것의 투여를 필요로 하는 환자"란 통상적으로, 동물 바람직하게는, 포유동물을 의미한다. 더욱 바람직하게 "이것의 투여를 필요로 하는 환자"는 사람과 동물 예를 들어, 돼지(pig), 염소, 소, 돼지(swine), 개, 고양이, 당나귀, 원숭이, 유인원 또는 설치류 예를 들어, 마우스, 햄스터 및 토끼로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 치료 방법 중 투여 과정은 통상적으로, 활성 제제 예를 들어, (구형) 마이크로캡슐 즉, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 세포로서,본원에 정의된 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, GLP-1 융합 펩티드 등, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드 등을 "안전하고 유효한 양"으로 투여함으로써 수행된다. 본원에 사용된 "안전하고 유효한 양"이란, 상기 정의된 활성 제제의 양으로서, 본원에 언급된 안 질병 또는 안 질환의 상태를 상당 수준 긍정적으로 개선시키는데 충분한 양을 의미한다. 그러나, 이와 동시에, "안전하고 유효한 양"은 심각한 부작용을 피하기에 충분히 적은 양, 다시 말해서, 이점과 위험성 사이를 합리적으로 관련지을 수 있는 양을 의미한다. 이와 같은 양의 한계를 결정하는 것은 통상적으로, 합리적인 의학적 판단의 범위 내에 있다. 본 발명의 내용에 있어서, "안전하고 유효한 양"이란 표현은 바람직하게는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드의 양, 또는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 세포로서, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, GLP-1 융합 펩티드 등, 또는 본원에 정의된 바와 같은 신경 보호 인자 및/또는 혈관 신생 억제 인자, 또는 이의 단편이나 변이체에 대해 알려진 유리한 효과를 수행하는데 적당한 단편이나 변이체의 양을 의미한다.

상기 내용 중, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐의 세포로서, 본원에 정의된 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, GLP-1 융합 펩티드 등, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포는 통상적으로, 본원에 정의된 바와 같은 물질 예를 들어, GLP-1 펩티드 및/또는 엔도스타틴을, (구형) 마이크로캡슐 1㎖ 당 약 0.2㎍의 농도로 매일 분비한다. 그러므로, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 분비형 생물 활성 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, GLP-1 펩티드 및/또는 엔도스타틴의 투여량 범위는 예를 들어, (다량 즉, 1?100㎎의 범위에 속하는 양을 고려한다고 하여도) 매일 약 0.01㎍?20㎎ 예를 들어, 매일 약 0.01㎍?10㎎, 바람직하게는 매일 0.01㎍?5㎎, 및 더욱 바람직하게는 매일 약 0.01㎍?1㎎, 그리고 가장 바람직하게는 매일 약 0.01?500㎍일 수 있다. 만약 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드가 세포의 매개 없이 직접 투여된다면, 상기와 같은 투여량 범위를 적용할 수도 있다.

상기 치료 방법에 있어서 투여 과정은, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화된 세포, 또는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 상기 (구형) 마이크로캡슐이나 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 함유하는 (약학) 조성물을, 치료될 환자의 특정 투여 위치에 제공함으로써 수행된다. 이와 같은 특정 투여 위치 예를 들어, 안구 내 투여 위치는 통상적으로 눈이고, 바람직하게는 치료될 환자의 눈의 발병 부위, 더욱 구체적으로는 특정 조직이나 부위 예를 들어, 망막, 홍채, 더욱 바람직하게는 홍채로부터 2?3㎜ 떨어진 부위 예를 들어, 결막과 공막이 눈의 유리체 강을 향해 약간 틀어진 부위의 뒷부분이다. 눈의 유리체 강이 안구 내 질병의 치료를 위한 약물 저장소로서 사용될 수 있다는 것을 알게된 것은 매우 중요한 일이다. 눈은 체적(body volume)의 10,000분의 1을 차지하므로, 만일 약물이 안구 내에 투여되지 않을 경우, 이 약물을 이것의 작용을 필요로 하는 위치 즉, 망막이나 기타 안구 내 구조에 이론적으로 동일한 농도로 투여하려면 10,000배 많은 투여량만큼 전신 투여해야 할 것이다. 이와 같은 경우, 전신 부작용이 발생할 위험이 매우 높아질 것이다. 예를 들어, 결정형 스테로이드(트리암시놀론)를 안구 내 투여할 때에는 비교적 적은 투여량인 25㎎만큼 투여하는데, 이 결정형 스테로이드를 전신 투여할 때에는 1㎏의 4분의 1만큼 투여해야 할 것이다. 이와 같은 투여량은 환자가 생존하도록 만들어준다. 뿐만 아니라, 상기 약물은 망막 혈관을 통해 운반될 수 있긴 하지만, 이 약물을 안구 내에 직접 투여하면 망막 조직 내 약물의 이용 가능성을 제한하는, 혈액 망막 장벽으로 인한 문제를 피하게 된다. 망막 혈관 벽 내에 존재하는 결합부는 비교적 꽉 조여진 상태이므로, 약물이 종종 혈관을 완전히 빠져나가지는 못하지만 망막 조직을 통과할 수는 있다. 이와 같은 경우, 지나치게 자주 반복 투여할 때 수정체와 망막에 의원성 병변이 발생할 위험이 증가할 수 있으며, 또한 감염의 위험도 증가할 수 있다. 그러므로, 본 발명에 따라서 수행될 필요가 있는 재투여 횟수를 눈에 띄게 줄인 방법 및 기술을 개발하는 것이 매우 바람직하다. 약물 생산 세포가 면역적으로 공격받지 않도록 만드는 구조로서, 이 세포가 자체의 "케이지(cage)"를 이탈하는 것을 막아줌과 동시에, 생산된 약물을 방출하기 위해 세포에 영양을 공급하는 물질을 교환할 수 있는 구조에 의해 덮인 약물 생산 세포를 눈에 이식하는 방법은, 약물 생산 패브릭(drug producing fabric)을 최소화하여 눈에 집어넣는 방법과 비교될 수 있다. 대안적으로, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화된 세포, 또는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 (구형) 마이크로캡슐, 또는 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 또는 이의 단편이나 변이체를 함유하는 (약학) 조성물은 눈의 전실 또는 후실 예를 들어, 수양액 또는 유리액에 투여될 수 있다. 대안적으로 예를 들어, 망막 뒤에 주사함으로써 망막 하 주사할 수 있다.

본 발명의 내용 중 투여 위치 예를 들어, 안구 내 투여 위치로서는 주사 또는 이식 처리될 수 있는 눈의 임의의 표면 또는 망막, 홍채 또는 이의 조직이나 주변 부위(이에 한정되는 것은 아님)를 추가로 포함한다. 대안적으로, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 암호화 및 분비하는 세포도 또한, 전실, 수정체 낭 주머니(예를 들어, 백내장 수술 후), 망막 하 공간 및 맥락 위 공간(suprachoroidal space)에 이식될 수 있다. 주사에 의하거나, 또는 공막 내부 전체 체적으로서 한정되는 눈의 내부 공간에 세포를 주입하는 임의의 기타 수술에 의한 방법 또는 수술에 의하지 않은 방법에 의해 세포를 이식할 수 있다.

투여 위치로서는 본원에 언급된 안 질병을 치료하는데 적당한 임의의 강(cavity)을 추가로 포함할 수도 있다.

본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐, 특히, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화된 세포로서, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, GLP-1 융합 펩티드 등, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포, 또는 이와 같은 (구형) 마이크로캡슐을 함유하는 (약학) 조성물을 본원에 정의된 특정 투여 위치에 투여하거나, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 투여하는 것은, 상이한 투여 방식을 이용하여 수행될 수 있다. 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화된 세포, 또는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐, 또는 이와 같은 (구형) 마이크로캡슐을 함유하는 (약학) 조성물, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드는 예를 들어, 전신 투여 또는 국소 투여될 수 있다. 일반적으로, 전신 투여 경로로서는 예를 들어, 경피 또는 비 경구 투여 경로 예를 들어, (예를 들어, 주위 정맥 주사를 통한) 정맥 내 투여 경로, 피하 및/또는 (예를 들어, 문맥을 통한 담관으로의) 동맥 내 주사, 또는 근육 내, 복막 내 또는 비강 내 투여 경로를 포함한다. 일반적으로, 국소 투여 경로로서는 예를 들어, 안구 내 투여 경로를 포함하지만, 국소, 경피, 근육 내, 피하, 심장 내, 심근 내 및/또는 심장 주위 주사도 포함한다. 더욱 바람직하게 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화된 세포, 또는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐, 또는 이와 같은 (구형) 마이크로캡슐 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 함유하는 (약학) 조성물은 피 내, 피하 또는 근육 내 경로로 투여될 수 있다. 주사용으로서, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화된 세포, 또는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐, 또는 이와 같은 (구형) 마이크로캡슐, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 함유하는 (약학) 조성물은 예를 들어, 적당한 약학 담체를 첨가하여, 액체 약학 조성물 또는 겔 등과 같이 적당한 형태로 제형화될 수 있다.

전술한 안 질병 또는 안 질환 중 임의의 것을 치료하는데 적당할 수 있는 기타 투여 방식으로서는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화된 세포, 또는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐, 또는 이와 같은 (구형) 마이크로캡슐을 함유하는 (약학) 조성물을 본원에 정의된 투여 위치(내)에 이식하는 것을 포함한다. 이식용으로서, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화된 세포, 또는 본원에 정의된 바와 같은 (구형) 마이크로캡슐, 또는 이와 같은 (구형) 마이크로캡슐을 함유하는 (약학) 조성물은 약학적으로 적당한 담체를 첨가하여, 적당한 형태 예를 들어, 겔, 캡슐 또는 정제 등의 형태로 제형화될 수 있다.

일반적으로 투여는, 1회 투여, 동일자 복수 회 투여, 수 주 또는 수 개월의 기간에 걸친 1회 투여, 또는 수 주 또는 수 개월의 기간에 걸친 복수 회 투여의 형태로서 수행될 수 있다.

본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화된 세포, 또는 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐, 또는 이와 같은 (구형) 마이크로캡슐, 또는 본원에 정의된 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 함유하는 (약학) 조성물은, 본원에 정의된 투여 위치에 개입 수단 예를 들어, 발병 부위를 찾아가는 카테터를 사용하여 직접 전달될 수 있으며, 또한 투여 위치에 주사하여 (구형) 마이크로캡슐을 이식함으로써 직접 전달될 수도 있다. 이식은 또한 통상의 외과적 방법 예를 들어, 올논(ornon) 수술 방법을 이용하여 수행될 수도 있다.

특히 바람직한 구체예에 의하면, (구형) 마이크로캡슐, 특히, 본원에 정의된 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, GLP-1 융합 펩티드 등, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포, 또는 이와 같은 (구형) 마이크로캡슐 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 포함하는 (약학) 조성물은 예를 들어, 이미 상기 정의한 바와 같은 주사를 통하여 투여될 수 있다. 이와 같은 주사는 적당한 주사 바늘 예를 들어, 크기가 12?26G, 더욱 바람직하게는 크기가 18?22G인 주사 바늘을 사용하여 수행되는 것이 특히 바람직하다. 특히 바람직한 또 다른 구체예에 따르면, (구형) 마이크로캡슐, 특히, 본원에 정의된 세포로서, 본원에 정의된 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, GLP-1 융합 펩티드 등, 또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포, 또는 이와 같은 (구형) 마이크로캡슐이나, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 포함하는 (약학) 조성물은 예를 들어, 이식을 통하여 투여될 수 있으며, 바람직하게는 외과적 장치 예를 들어, 메스 또는 주사 바늘을 사용하여 본원에 정의된 바와 같은 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질을 투여할 수 있다.

본 발명은 또한, 본원에 정의되었으며, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 암호화 및 분비하는 세포를 포함하는 (구형) 마이크로캡슐, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 포함하는 (구형) 마이크로캡슐을, 제품 예를 들어, (약학) 조성물 또는 키트를 제조하고, 안 질병이나 안 질환 또는 이와 관련된 질병이나 질환을 치료하기 위하여, 동물 바람직하게는 본원에 정의된 포유동물 예를 들어, 사람에 사용하는 것을 포함한다. 이와 같은 내용에 있어서, 본 발명의 약학 조성물은 사람을 대상으로 하는 의학 분야 또는 수의학 분야에서 사용될 수 있다. 본 발명은 또한, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의한 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 암호화하는 세포, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드의, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐, 바람직하게는 제품 예를 들어, (약학) 조성물이나 키트를 제조함에 있어서의 용도, 또는 동물, 바람직하게는 본원에 정의된 포유 동물 예를 들어, 사람에 있어서 안 질병이나 안 질환, 또는 이와 관련된 질병이나 질환을 치료함에 있어서의 용도를 추가로 포함한다. 만일 세포가 사용되면, 상기와 같은 목적으로 사용되는 세포는, 본원에 정의된 세포로서, 본 발명에 사용될 수 있으며, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의된 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 암호화 및 분비하는 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포 또는 간엽 간질 세포, 또는 기타 임의의 세포(유형)인 것이 바람직한데, 여기서, 상기 세포는 치료될 환자의 면역 시스템이 반응하는 것을 막기 위해서 (구형) 마이크로캡슐 내에 캡슐화된다.

본 발명의 다른 측면은 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 본원에 정의한 바와 같은 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 암호화 및 분비하는 세포를 포함하거나, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 포함하는, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐을 함유하는 (약학) 조성물에 관한 것이다. 이와 같은 (약학) 조성물은 상기 정의한 안 질병 또는 안 질환을 앓고 있는 환자, 바람직하게는 본원에 정의된 투여 위치에 본원에 정의된 방식으로 투여될 수 있다.

"활성 성분"으로서, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 암호화 및 분비하는 세포를 포함하거나, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 포함하는, 본원에 정의된 바와 같은 (구형) 마이크로캡슐을 함유하는 (약학) 조성물의 제조에 관하여는 일반적으로, 당 업계에 널리 공지되어 있다[예를 들어, 미국 특허 제4,608,251호; 동 제4,601,903호; 동 제4,599,231호; 동 제4,599,230호; 동 제4,596,792호; 및 동 제4,578,770호(이 문헌들은 모두 본원에 참고용으로 인용됨)].

통상적으로, (약학) 조성물은 바람직하게는 물을 함유하는 액체 용액이나 현탁액과 같이 주사 가능한 형태(수성 제형)로서 제조되거나, 또는 유화될 수 있다. "수성 제형"이란 용어는, 물을 50%w/w 이상 포함하는 제형으로서 정의된다. 이와 유사하게, "수용액"이란 용어는, 물을 50%w/w 이상 포함하는 용액으로서 정의되며, "수성 현탁액"이란 용어는, 물을 50%w/w 이상 포함하는 현탁액으로서 정의된다.

본원에 정의된 투여 위치에 근육 내, 정맥 내, 피 내 또는 피하 주사하거나, 또는 기타 임의의 형태로 주사하기 위해서, 본원에 정의된 세포 또는 (구형) 마이크로캡슐, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드, 또는 상기 정의한 바와 같은 약학 조성물은, 발열 원을 포함하지 않으며, pH, 등장성 및 안정성이 적당한 비 경구 투여 가능 수용액의 형태를 가질 것이다. 액체 (약학) 조성물은 일반적으로 액체 비이클 예를 들어, 물을 포함한다. 바람직하게 액체 비이클은 생리적 염 용액, 덱스트로스 에탄올 또는 기타 당 용액 또는 글리콜 예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜, 또는 이것들의 조합물을 포함할 것이다. 추가 예로서는 기타 등장성 비이클 예를 들어, 생리적 염 용액 예를 들어, 링거 용액이나 락트산 염을 포함하는 링거 용액을 포함한다.

만일 본 발명의 (약학) 조성물이 본원에 정의된 세포나 (구형) 마이크로캡슐의 수용액, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드의 수용액을 포함하면 예를 들어, 완충액, 상기 (구형) 마이크로캡슐, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드는 통상적으로, (약학) 조성물 중에 0.1㎎/㎖ 이상의 농도로 존재하며, 상기 (약학) 조성물의 pH는 일반적으로, 약 2.0?약 10.0, 바람직하게는 약 7.0?약 8.5이다.

기타 성분들도 본 발명의 (약학) 조성물 중에 존재할 수 있다. 이와 같은 부가의 성분으로서는 습윤제, 유화제, 항산화제, 증량제, pH 완충제(예를 들어, 인산염, 시트르산염 또는 말레산염 완충액), 보존제, 계면 활성제, 안정화제, 긴장성 개선제, 킬레이트제, 금속 이온, 유질 비이클, 단백질(예를 들어, 사람 혈청 알부민, 젤라틴 또는 단백질) 및/또는 양쪽성 이온(예를 들어, 아미노산 예를 들어, 베타인, 타우린, 아르기닌, 글리신, 리신 및 히스티딘)을 포함할 수 있다. 이러한 성분들은 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립된 세포, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드에 대한 특별 요구 조건 즉, 이 성분들은 세포 독성이 없어야 하며, 세포의 자생력(viability)을 보장해야 한다는 조건에 따라서 당 업자에 의해 선택된다. 뿐만 아니라, 이와 같은 성분들은 본 발명에 의해서 사용되는 (구형) 마이크로캡슐의 (구형) 코어 내에 매립되어 있는 세포에 의해 암호화 및 분비될 수 있으며, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질 또는 단백질 유사 물질을 안정화할 수 있다.

완충액과 관련하여, 이 완충액은 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 시트르산염, 글리실글리신, 히스티딘, 글리신, 리신, 아르기닌, 인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨, 인산나트륨 및 트리스(하이드록시메틸)-아미노메탄, HEPES, 바이신, 트리신, 말산, 숙신산염, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 아스파르트산, 또는 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 이와 같은 특정 완충액 중 어느 하나는 본 발명의 대안적인 구체예를 이룬다.

본원에 정의된 (약학) 조성물에 상기 언급한 첨가제 모두를 특히, 첨가제 농도 범위 내의 농도로 사용하는 것에 관하여는 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 편의를 위해 레밍턴(Remington)의 문헌[The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, 1995]을 참조하였다.

본원에 정의된 바와 같은 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질을 암호화 및 분비하는, 본원에 정의된 세포를 포함하는 (구형) 마이크로캡슐을 함유하거나, 또는 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체 예를 들어, 엔도스타틴, GLP-1 펩티드, 또는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 함유하는, 본 발명의 (약학) 조성물은 치료 방법에 관하여 일반적으로 본원에 정의된 방식으로 투여되는 것이 바람직하다. 이와 같은 투여 방식은 투여 제형과 부합하는 것이 바람직하며, 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 활성 성분 예를 들어, 본원에 정의된 세포 또는 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질 또는 단백질-유사 물질, 또는 이의 단편이나 변이체를, 안전하고 유효한 양 즉, 안전하면서 치료학적으로 유효한 것으로 간주하는 양만큼 포함한다. 이와 같은 세포, 또는 본원에 정의된 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 기타 임의의 단백질이나 단백질 유사 물질이 본 발명의 (약학) 조성물과 함께 투여될 양(또는 필요하다면 단독 투여량)은, 치료될 개체와 질병 예를 들어, 환자의 질병의 심각성에 의존적이다. 적당한 투여량 범위는, 본원에 정의된 바와 같이 통상적으로, 매일 (본원에 정의된 바와 같은 신경 보호 인자 및/또는 혈관 신생 억제 인자 및/또는 임의의 적당한 추가 인자가) 1?수백 ㎍의 투여량으로 소정의 기간 동안, (본 발명의 (약학) 조성물 중에 함유된) (구형) 마이크로캡슐에 의해 직접 제공 또는 분비되며, 본원에 정의된 안 질병의 (안구 내) 치료 방법에 적당한, 생물 활성 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 또는 추가의 단백질이나 단백질 유사 물질의 양에 따라서 좌우된다.

본 발명은 달리 언급되지 않는 한, 전술한 구체예와 특징들을 조합하여 포함할 수도 있으며, 이와 같은 조합은 구체적으로 규정한 하나의 구체예에 한정되는 것은 아니다.

도면의 간단한 설명

본 발명은 이하 첨부된 도면을 통해서 더욱 자세히 기술된다. 그러나, 이하에 나타낸 도면의 내용에 본 발명의 범위를 한정하고자 해서는 안 될 것이다.

도 1: 도 1은 예시적인 구조물 a ? m의 비한정적인 개략도로서(실시예 1 참조), 본 발명에 따라서 사용된 (구형) 마이크로캡슐을 제조하는데 사용된 세포 내에 포함될 수 있는 구조물을 나타내는 것이다.

도 2: 도 2는 일시적 형질 감염 후 활성 GLP-1, 및 hTERT-MSC 및 HEK293 세포 내 상이한 GLP-1 구조물의 일시적인 발현 결과를 나타내는 것이다(실시예 2 참조). 단량체 GLP-1 구조물 #103?#317[GLP-1(7?37) 복사체를 단 하나만 보유]에서는 활성 GLP-1 수준이 한계치 정도에만 도달하였음을 알 수 있었다. hTERT-MSC 및 HEK293 세포 둘 다에서는 [성분 (I)과 성분 (III)으로서 GLP-1(7?37)을 2개 보유하는] 이량체 GLP-1 구조물 #217의 발현이 상당한 수준으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

도 3: 도 3은 GLP-1 분비 세포로부터 유래하는 세포 배양액의 상청액을 웨스턴 블럿 분석법으로 분석한 결과를 나타내는 것이다(실시예 3 참조). 레인 1: 모의 형질 감염된 hTERT-MSC 세포의 상청액 내에 용해된 합성 GLP-1(7?37) 100ng; 레인 2: 구조물 #217로부터 유래하는 이량체 GLP-1을 분비하는 hTERT-MSC 세포(클론 79TM217/13)의 상청액; 레인 3: 구조물 #217로부터 유래하는 이량체 GLP-1을 분비하는 AtT20 세포(클론 81-A-217/3)의 상청액; 레인 M: 예비 염색한 단백질 마커(kDa). 분석 결과를 통하여, 본원에 정의되어 있으며, GLP-1(7?37) 및 C-말단의 부가 부(도 3의 2 및 3)를 함유하는 펩티드는, 형질 감염된 세포로부터 분비되고, 또한 GLP-1(7?37)의 중간 분자량 에피토프와 결합하는 항-GLP-1 항체를 사용하여 검출할 수 있음을 알 수 있다.

도 4: 도 4는 본 발명에 따라서 사용된 GLP-1 펩티드를 이용하여 수행된 혈장 안정성 테스트(시험관 내 테스트) 결과를 나타내는 것이다. 그러므로, HEK293 세포는 다음과 같은 구조물 즉, (1) #103 GLP-1(7?37), (2) #317 GLP-1(7?37)-IP2-11개의 아미노산으로 이루어진 연장부, 및 (3) #217 GLP-1(7?37)-IP2-GLP-1(7?37)으로 일시 형질 감염시켰다. HEK293 세포는 유전자 구조물에 대하여 유효한 숙주이다(실시예 4 참조).

도 5: 도 5는 구조물 #217 GLP-1(7?37)-IP2-GLP-1(7?37)에 의해 생산된 GLP-1 펩티드 CM1과, 합성 GLP-1(7?37)(대조군)을 분비하는, 안정적으로 형질 감염된 hTERT-MSC 세포 클론 79TM217/18K5의 상청액을 대상으로 하여 (시험관 내) 분석한 혈장 안정성에 관한 동력학적 관계를 나타내는 것이다. 이 분석 결과는 독립적으로 3회 수행된 실험을 통하여 얻은 것이다. 활성 GLP-1은 GLP-1 (활성) ELISA(Linco)를 이용하여 측정하였다.

도 6: 도 6은 이하 나타낸 펩티드에 대한 웨스턴 블럿 수행 결과를 나타내는 것이다. 이하에 수치들을 제시하였다: 서열 번호 1(ID1 syn)은 GLP-1(7~37)(31 aa, 3.3kD)에 해당하고; 서열 번호 8(ID8 syn, CM3)은 GLP-1(7~37)-IP2(46 aa, 5.1kD)에 해당하며; 서열 번호 7(ID7rec, CM2)은 GLP-1(7~37)-IP2-RR-GLP2(83 aa, 9.4 kD)에 해당하고; 서열 번호 6(ID6syn, CM1)은 GLP-1(7?37)-IP2-RR-GLP1(7~37)(79 aa, 8.7kD)에 해당한다[실시예 5 참조].

도 7: 도 7은 생물 검정용 세포주 111CHO349/18 내에 GLP-1 수용체 매개 cAMP가 증가하였을 때의 투여량 반응 곡선을 나타내는 것이다. 구조물 #217 GLP-1(7?37)-IP2-GLP-1(7?37)에 의해 생산된 CM1을 분비하는 79TM217/18K5 세포의 연속 희석 컨디셔닝된 배지로 상기 세포주를 자극하였다. 부모 hMSC-TERT 세포주 내에서는 cAMP 반응이 확인되지 않았다. 이 그래프는 5회의 독립적인 실험을 통해 작성하였다. cAMP 생물 검정법에서 반 최대 효능(half maximal effect; ED50)을 나타내는 펩티드 투여량은 353pM인 것으로 측정되었다(실시예 6 참조).

도 8: 도 8은 일시적 및 안정적 유전자 발현에 사용되는 예시적인 벡터를 나타내는 것이다. 이 벡터는 2개의 별도 전사 단위 즉, 관심 있는 유전자에 대한 전사 단위(GOI)와, 자살 유전자 HSV 티미딘 키나제와 내성 유전자 블라스티시딘의 융합체에 대한 전사 단위로 이루어져 있다. 첫 번째 전사 단위에 있어서는 사람의 유비쿼틴 B 프로모터가 사용되었고, 두 번째 전사 단위에 있어서는 사람의 페리틴 프로모터가 사용되었다(실시예 9 참조).

도 9: 도 9는 세포를 미리 무한 증식 처리한 후, 본원에 정의된 (구형) 마이크로캡슐에 사용된 세포를 특성 규명한 결과를 나타내는 것이다. 도 9의 A)에서 볼 수 있는 바와 같이, 무한 증식된 세포(좌측)는 여전히 지방 세포, 골 세포 및 연골 세포(무한 증식 세포의 비-무한 증식 처리 짝 세포)(우측)로 분화할 수 있다. 무한 증식된 세포는 섬유 아세포의 형태를 가지며 예를 들어, 본원에 사용된 1차 세포의 특징을 이루는 CD44와 CD166 에피토프 마커를 사용하는 유동 세포 계수법에 의해 확인되는 유한 증식 MSC보다 크기와 입도 면에서 더욱 균일하다. 무한 증식된 세포는 자체의 비-무한 증식 짝 세포와 동일한 CD 마커를 발현한다(도 9의 B) 참조).

도 10: 도 10은 C-말단이 연장된 GLP-1 유사체인 CM1의 항 세포 고사 효능을 나타내는 것이다. 세포 고사는 단백질 생합성 억제제인 사이클로헥시미드(CHX)를 첨가하여(최종 농도 = 각각 10㎍/㎖ 및 100㎍/㎖) RIN-5F 세포 내에서 유도된다. 이.콜라이(E.Coli) 내에서 재조합 방법에 의해 생산된 이량체 GLP-1 융합 펩티드 CM1이 상이한 농도로 존재하면, 세포의 자생력이 상당 수준(p<0.01) 증가하는데, 이때 증가한 수준은 24시간 동안 항온 처리한 후에 정량한다.

도 11: 도 11은 안 질병 특히, 망막 변성증(MD) 치료 방법에 사용되는 GLP-1을 암호화 및 분비하는 (구형) 마이크로캡슐을 이용하여 본 발명의 개념을 개략적으로 나타낸 모식도이다. 세포 예를 들어, 간엽 줄기 세포, 간엽 간질 세포 또는 동종 세포는 GLP-1을 암호화 및 분비하는 (구형) 마이크로캡슐을 형성하는, 선택적 투과성인 얇은 알기네이트 매트릭스 내에 캡슐화된다. 알기네이트 매트릭스는 캡슐화된 세포를 양육하는 산소와 영양분, 그리고 이 세포에 의해 암호화 및 분비되는 GLP-1 또는 GLP-1 융합 펩티드에 대해 투과성이다. 다른 한편으로, 세포와 면역 시스템의 성분들과 세포들은 상기한 바와 같은 장벽을 통과하지 못한다. 좌측: GLP-1을 암호화 및 분비하는 (구형) 마이크로캡슐을 이용하여 본 발명의 개념을 개략적으로 나타낸 모식도. 코어 비드를 함유하는 세포(크림색으로 도시)는 순수한 알기네이트 층(회색)으로 둘러싸여 있다. 우측: GLP-1을 시험관 내에서 암호화 및 분비하는 (구형) 마이크로캡슐.

도 12: 도 12는 본 발명에 따라서 GLP-1과 엔도스타틴을 암호화 및 분비하는 마이크로캡슐(본원에서 GLP-1 및 엔도스타틴 셀비즈(CellBeads)라 칭함)이 이식된 토끼의 체중 변화를 나타내는 것이다.

도 13: 도 13은 제3일 경과시 오른쪽 눈에 체외 이식된 비드를 나타내는 것이다(CB-087 GLP-1 셀비즈).

도 14: 도 14는 제3일 경과시 왼쪽 눈에 체외 이식된 비드를 나타내는 것이다(CB-102 엔도스타틴 셀비즈).

도 15: 도 15는 제14일 경과시 오른쪽 눈에 체외 이식된 비드를 나타내는 것이다(CB-087 GLP-1 셀비즈).

도 16: 도 16은 제14일 경과시 왼쪽 눈에 체외 이식된 비드를 나타내는 것이다(CB-102 엔도스타틴 셀비즈).

도 17: 도 17은 제56일 경과시 오른쪽 눈에 체외 이식된 비드를 나타내는 것이다(CB-087 GLP-1 셀비즈)(PJ: 요드산 프로피듐).

도 18: 도 18은 제56일 경과시 왼쪽 눈에 체외 이식된 비드를 나타내는 것이다(CB-102 엔도스타틴 셀비즈)(PJ: 요드산 프로피듐).

도 19: 도 19는 제3일, 제14일 및 제56일 경과시 유리액 중 GLP-1 농도를 나타내는 것이다.

도 20: 도 20은 제56일에 이르기까지 수양액 중 GLP-1 농도를 나타내는 것이다.

도 21: 도 21은 제56일에 이르기까지 수양액 중 엔도스타틴의 농도를 나타내는 것이다.

도 22: 도 22는 제3일, 제14일 및 제56일 경과시 유리액 중 엔도스타틴의 농도를 나타내는 것이다.

도 23: 도 23은 GLP-1과 엔도스타틴 셀비드 처리된 토끼로부터 유래하는 망막을 TUNEL 염색한 결과를 나타내는 것이다.

도 24: 도 24는 GLP-1과 엔도스타틴 셀비드 처리된 토끼로부터 유래하는 망막을 TUNEL 염색한 결과를 나타내는 것이다.

도 25: 도 25는 GLP-1과 엔도스타틴 셀비드 처리된 토끼로부터 유래하는 망막을 TUNEL 염색한 결과를 나타내는 것이다.

도 26: 도 26은 GLP-1과 엔도스타틴 셀비즈 처리된 토끼로부터 유래하는 망막을 TUNEL 염색한 결과를 나타내는 것이다(중복 분석 결과).

도 27: 도 27은 GLP-1과 엔도스타틴 셀비즈 처리된 토끼로부터 유래하는 망막을 자기 형광 분석한 결과를 나타내는 것이다(중복 분석 결과).

실시예

본 발명은 이하 실시예를 통해서 더욱 자세히 기술된다. 그러나, 이하에 기술한 실시예의 내용에 의하여 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

유전자 구조물의 생성

도 1의 a에 도시한 HincII 및 EcoRI 위치를 포함하는 서열 내 GLP-1(7?37) cDNA에 대한 암호화 서열을 합성에 의해 합성하였다. 이와 별도로, 도 1의 b에 도시한 바와 같이, GLP-1의 암호화 서열(7?37), IP2 및 SfoI, EcoRI 및 XbaI에 대한 제한 위치를 포함하는 cDNA를 합성하였다. GLP-1을 분비 경로에 도입하기 위해서, 스트로멜리신 3의 이종 신호 서열(Acc. No. NM_005940)을 사용하였다. 그러므로, 스트로멜리신 신호 서열 및 리더 서열을 암호화하는 cDNA는 사람 RNA로부터 역 전사 효소 PCR 증폭되어, 도 1의 a 또는 b의 구조물과 함께 사용함으로써 도 1의 c와 d에 각각 도시한 구조물을 형성하였다.

도 1의 a에 도시한 구조물의 HincII/EcoRI 단편을 도 1의 d에 도시한 서열의 SfoI 위치에 클로닝하여, 도 1의 e에 도시한 구조물을 형성하였다. 이와 유사하게, 도 1의 d에도시한 EcoRI 단편을 진핵 생물 발현 플라스미드의 EcoRI 위치에 클로닝하여, 도 1의 f에 도시한 구조물을 형성하였다. 도 1의 g에 도시한 구조물을 형성하기 위해서, 도 1의 b에 도시한 구조물의 HincII/XbaI 단편을 각각, 도 1의 d에 도시한 구조물의 SfoI/XbaI 위치에 클로닝하였다. 도 1의 h는 단축 형태의 내인성 인트론 서열에 의해 중단된(interrupted) 스트로멜리신 리더 및 신호 서열을 암호화하는, 합성된 코돈 최적화 서열로서, 사람 GLP-1(7?37), IP2 및 GLP-2(1?35)를 암호화하는 서열에 융합된 서열을 나타내는 것이다. 도 1의 h에 도시한 구조물의 DNA 서열은 서열 번호 16의 서열인 반면에, 서열 번호 15의 서열은 번역된 펩티드의 서열을 나타낸다.

뿐만 아니라, 도 1의 i와 j에 도시한 서열도 합성하였다. 이후, 도 1의 j에 도시한 NaeI/BssHII 단편을 도 1의 h에 도시한 NaeI/BssHII 선형화 서열에 클로닝하여, 도 1의 k에 도시한 구조물을 형성하였다. 도 1의 k에 도시한 구조물의 DNA 서열은 서열 번호 14의 서열인 반면에, 서열 번호 13의 서열은 또한 번역된 펩티드의 서열을 나타내는 것이다. 상기 구조물을 BssHII로 분해하고, 도 1의 h에 도시한 서열을 다시 결찰하여 도 1의 l에 도시한 구조물을 생성하였다. 도 1의 l에 도시한 구조물의 DNA 서열은 서열 번호 18의 서열인 반면에, 서열 번호 17의 서열은 또한 번역된 펩티드의 서열을 나타내는 것이다. 도 1의 m에 도시한 구조물은 도 1의 i에 도시한 서열의 AfeI/BssHII 단편을 도 1의 h에 도시한 AfeI/BssHII 선형화 서열에 클로닝하여 생성하였다. 도 1의 m에 도시한 구조물의 DNA 서열은 서열 번호 20의 서열인 반면에, 서열 번호 19의 서열은 또한 번역된 펩티드의 서열을 나타내는 것이다.

상기 구조물은 통상의 기술을 이용하여 당 업자에 의해 제조될 수 있다.

실시예 2

포유동물 세포의 형질 감염, 클론 선별 및 GLP -1 발현

세포 공급원:

HEK293(사람 배아의 신장 세포주, #ACC 305, DSMZ 세포 배양 수집소, 독일), AtT20(마우스 LAF1 뇌하수체 종양 세포주, #87021902, 유럽 세포 배양 수집소, 영국) 및 hTERT-MSC 세포는, 덴마크 소재, 오덴스 대학 병원의 카셈(Kassem) 교수에 의해 제조 및 제공되었다.

10⁶개의 세포를 형질 감염하기 위해, 0.5?2㎍의 플라스미드 DNA를, 상이한 GLP-1 구조물과 함께 사용하였다. 이 구조물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 생산하였다. HEK293 세포를 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel외 다수 1994ff Harvard Medical School Vol2., Unit 9.1)]에 기술된 바와 같은 표준 안산칼슘 공 침전법으로 형질 감염하였다. 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et. al. 1994ff, Harvard Medical School Vol 2., Unit 9.4)]에 기술된 바와 같이, FuGene(로쉬(Roche))을 사용하여 AtT20 세포를 형질 감염하였다. 뉴클레오펙터 기술(아막사(Amaxa)) 즉, 전기적 매개 변수와 세포 유형 특이적 용액을 함께 사용하는 것을 바탕으로 하는 비-바이러스성 방법을 이용하여 hTERT-MSC 세포를 형질 감염하였다. 뉴클레오펙터 장치(프로그램 C17)와 뉴클레오펙터 용액 VPE-1001을 사용한 결과, 형질 감염 효능은 60%를 초과하였다. 형질 감염하고 나서 48시간 경과 후, 배양 배지에 선별 제제인 블라스티시딘(2㎍/㎖)을 첨가하여, DNA가 염색체에 안정하게 통합된 세포 클론을 선별하였다. 12?15일 경과 후, 안정하게 형질 감염된 세포 클론을 분리 및 증폭하여 특성 규명하였다.

hTERT-MSC 및 HEK293 세포 내에서 상이한 GLP-1 구조물을 일시적으로 발현시킨 결과를 측정하였다. hTERT-MSC 세포 및 HEK293 세포 둘 다에 있어서, (GLP-1(7?37) 복사체를 단 하나만 보유하는) 단량체 GLP-1 구조물 #103 및 #317에서는 활성 GLP-1이 한계치만큼의 수준으로만 발현되었던 반면에, (성분 (I)과 성분 (III)으로서 GLP-1(7?37)을 가지는) 이량체 GLP-1 구조물 #217에서는 상당한 수준으로 발현되었음을 알 수 있었다. 결과를 도 2에 요약하여 나타내었다. (성분 (II)로서 IP2 복사체를 4개 가지는) GLP-1 구조물 #159를 연장한 결과, 더 이상 발현이 증가하지 않았다(도시하지 않음). 상이한 구조물을 보유하는 hTERT-MSC 세포를 형질 감염한 후, GLP-1을 안정하게 발현하는 클론을 선별하였다. 발현 수준을 이하 표 1에 나타내었다.

구조물	세포 클론	10⁶개 세포당 활성 GLP (1 시간 기준) [pmol]
#103 GLP-1_(7?37)	47TM113/13	0.4
#317 GLP-1_(7?37)-IP2-11aa	71TM169/1	0.6
#217 GLP-1_(7?37)-IP2-GLP-1_(7?37)	79TM217/13	2.7

실시예 3

포유동물 세포로부터 분비된 GLP -1 펩티드의 웨스턴 블럿 분석

GLP-1 분비 세포로부터 유래하는 세포 배양액의 상청액을 10?20% 구배의 SDS PAGE(120V, 90분)로 분리한 다음, 이를 반건조 블럿팅(2.0 mA/㎠, 60분)으로 PVDF 막[이모빌론(Immobilon)-P 막 0.45㎛ 밀리포어(Millipore) IPVH 00010]에 옮겼다. 메탄올 고정 및 블로킹[TBS 중 3%(w:v) BSA, 0.1%(v:v) Tween-20] 후, 1㎍/㎖의 항-GLP-1 항체[HYB 147-12, 안티바디샵(Antibodyshop)]로 상기 막을 면역 블럿팅하였다(4℃ o/n). 이를 세정하고 0.02㎍/㎖의 검출용 항체[HRP 접합된 항 마우스 IgG(Perkin Elmer PC 2855-1197)]와 함께 항온 처리한 후(RT, 4시간), 화학 발광 검출하여 단백질의 위치를 파악하였다.

웨스턴 블럿 분석 결과를 도 3에 도시하였다[1: 모의 형질 감염된 hTERT-MSC 세포의 상청액 중에 용해된 합성 GLP-1(7?37) 100ng, 2: 구조물 #217로부터 유래하는 이량체 GLP-1을 분비하는 hTERT-MSC 세포(클론 79TM217/13)의 상청액, 3: 구조물 #217로부터 유래하는 이량체 GLP-1을 분비하는 AtT20 세포(클론 81-A-217/3)의 상청액; M: 예비 염색한 단백질 마커[kDa]]. 그 결과를 통하여, GLP-1(7?37)과 C-말단 부가 부를 함유하는 펩티드(도 3의 2 및 3)가 형질 감염된 세포주로부터 분비되며, 또한 GLP-1(7?37)의 중간 분자량 에피토프와 결합하는 항-GLP-1 항체를 사용하여 검출될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4

사람 세포로부터 분비된 GLP -1 펩티드의 시험관 내 혈장 안정성

HEK293 및 hTERT-MSC 세포를, 다음과 같은 펩티드를 암호화하는 GLP-1 변이체와 결합하는, 이종 스트로멜리신 신호 서열을 암호화하는 구조물로 형질 감염시켰다:

1: GLP-1(7?37) (구조물 #103)

2: GLP-1(7-37)-IP2-11개의 아미노산으로 이루어진 연장부 (구조물 #317)

3: GLP1(7?37)-IP2-GLP1(7?37) (구조물 #217)

세포로부터 분비된 GLP-1 펩티드 또는 합성 GLP-1(7?37)(바켐(Bachem))을 함유하는 세포 배양액의 상청액을, 디펩티딜펩티다제 활성을 가지며 사람의 림프구가 풍부한 혈장과 함께 항온 처리하였다[37℃ 및 5% CO₂ 하, 3시간 또는 6시간 및 9시간]. 모의 형질 감염된 세포로부터 유래하는 상청액 중 합성 GLP-1(7?37)을 DPP-IV 활성에 대한 양성 대조군으로 사용하였는데, 이 경우, DPP-IV 활성은 DPP-IV 억제제(#DPP4, 바이오트렌드(Biotrend))를 첨가하였을 때, 억제되는 것으로 파악되었다. GLP-1(활성) ELlSA(#EGLP-35K, 바이오트렌드)와, DPP-IV 분해된 비활성 GLP-1(9?37) 펩티드가 구별되도록 만드는 GLP-1(7?37)의 N-말단 에피토프에 결합하는 항체를 사용하여 활성 GLP를 평가하였다.

그 결과를 도 4(HEK293 세포) 및 도 5(hTERT-MSC 세포)에 나타내었다. HEK293 및 hTERT-MSC 세포는 둘 다 유전자 구조물에 대해 유효한 숙주이다. 형질 감염된 세포에 대한 결과에 다음과 같이 번호를 메겼다: 1: 구조물 #103으로부터 유래하는 GLP-1(7?37)을 분비하는 세포의 상청액, 2: 구조물 #317로부터 유래하는 11개의 아미노산과 IP2에 의해 연장된 GLP-1을 분비하는 세포의 상청액, 3: 구조물 #217로부터 유래하는 이량체 GLP-1을 분비하는 세포의 상청액. 구조물 1은 합성 GLP-1의 경우와 유사한 방식으로 DPP-IV에 의해 비활성화된 야생형 GLP-1을 생산하는 반면에, C-말단이 연장된 GLP-1 형태(도 4의 2와 3, 도 5의 3)는 분해에 대한 내성이 더욱 강하였다. C-말단이 연장된 GLP-1 펩티드는 시험관 내 사람의 혈장 중에서 상당 수준 안정화되었다. 이량체 GLP-1 서열을 가지는 펩티드(3)는 시험관 내 DPP-IV 분해에 대해서 거의 완전히 안정화되었다.

실시예 5

cAMP 방출에 의해 측정되는 GLP -1 펩티드의 시험관 내 생체 활성

GLP-1(7?37)은, 7회 경막 확장된 G-단백질 커플링 GLP-1 수용체를 통해 생물학적 작용을 수행하였는데, 그 결과, 제2 메신저 환형 AMP를 통해 단백질 키나제 A 신호 전달 과정이 활성화되었다. CM1의 C 말단 연장이 GLP-1의 작용 방식을 방해하지 않도록 만들기 위해서, 상이한 농도의 펩티드와 함께 항온 처리하여 GLP-1 수용체 발현 세포주 내 cAMP의 증가 수준을 측정하는 시험관 내 생물 검정법을 통해 CM1 생물 활성을 정량하였다. 본 연구에 사용된 GLP-1 수용체 발현 세포주(클론 111CHO349/18)는 사람 GLP-1 수용체로 안정하게 형질 감염된 CHO(중국 햄스터 난소) 세포주이다. 펩티드의 생체 활성을 개략적으로 보여주는, 79TM217/18K5 세포 내 생산된 CM1에 대한 투여량 반응 곡선을 도 7에 도시하였다. cAMP 생물 검정법에서 반 최대 효능(ED50)을 나타내는 펩티드 투여량을 측정한 결과, 353pM였다.

실시예 6

GLP -1 ^CM 펩티드의 시험관 내 사람 혈장 안정성

합성 GLP-1 펩티드(서열 번호 1_syn, 서열 번호 6_syn, 서열 번호 7_rec, 서열 번호 8_syn)를, 농도 20ng/㎖가 될 때까지 사람 혈장과 함께 항온 처리하였다(37℃ 및 5% CO₂, 3시간). DPP-IV 억제제(#DPP4, 바이오트렌드)에 의하여 혈장의 디펩티딜펩티다제 활성이 억제되었다. GLP-1(활성) ELISA(#EGLP-35K, 바이오트렌드)를 사용하여 활성 GLP를 측정하였다.

천연 GLP-1_(7?37)(서열 번호 1)과는 대조적으로, C-말단이 연장된 GLP-1 펩티드 즉, 서열 번호 6, 서열 번호 7 및 서열 번호 8의 서열은 시험관 내 사람의 혈장 중에서 상당히 안정화된다(도 7). 대조 실험(우측)으로서, DPP-IV 억제제를 첨가한 실험을 통해 얻어진 결과를 도시하였다. 이와 같은 대조 실험에 있어서 GLP-1 활성은 완전히 유지되었다.

실시예 7

혈장 생성

유전자를 일시적이고 안정하게 발현시키기 위한 벡터는 2개의 별도 전사 단위로 이루어져 있는데, 하나는 관심 있는 유전자를 위한 전사 단위(GOI)이고, 다른 하나는 자살 유전자 HSV 티미딘 키나제와 내성 유전자 블라스티시딘의 융합체를 위한 전사 단위이다. 제1 전사 단위용으로는 사람의 유비쿼틴 B 프로모터를 사용하였으며, 제2 전사 단위용으로는 사람의 페리틴 프로모터를 사용하였다. 플라스미드는 7,919개의 염기쌍을 가지는 플라스미드 pCM4를 바탕으로 한다(도 8에 개략적으로 도시함).

도 8에 나타낸 바와 같이, 전사 단위 1은 다음과 같은 성분들을 포함한다:

CMVenh: 전 초기 인핸서 사람 사이토메갈로바이러스

ubiB 사람: 유비쿼틴 프로모터 B

Stro-GLP: GLP-1 구조물과 스트로멜리신의 신호 펩티드 및 리더 서열을 암호화하는 융합 유전자

ori pMBI: 이.콜라이 최소 복제 기원

Hygro: 하이그로마이신 B 내성 유전자.

전사 단위 2:

SV 40 enh: SV40 인핸서

FerH: 쥐과 동물 EFI 유전자의 5'UTR과 합하여진 사람 페리틴 H 프로모터

Tk-bla: 블라스티시딘 내성 유전자와 헤르페스 심플렉스 바이러스 제1형 티미딘 키나제를 암호화하는 융합 유전자.

일시 발현을 위해서, 환형 플라스미드를 사용하였다. 안정하게 발현하는 세포 클론을 선별하기 위해서, 플라스미드를 선형화한 다음 박테리아 서열(pMB1 기원 및 하이그로마이신 유전자)을 제거하였다.

실시예 8

간엽 줄기 세포주 또는 간엽 간질 세포주( MSC )의 생산

간엽 줄기 세포주는 다음과 같은 기준에 따라서, 덴마크 소재, 오덴스 대학 병원의 카셈 교수에 의해 제조되었다[문헌(Simonsen et al, 2002, Nature Biotechnology 20m, 592-596) 참조]:

기원

생산용 세포주는 건강한 남성 공여자(33세)의 골수 흡입물로부터 분리한 간엽 줄기 세포(MSC)로 이루어져 있다.

영구 증식화

텔로머라제 역 전사 효소의 암호화 서열을 도입하여 세포를 영구 증식 처리하였다. 전이 유전자(transgene)가 PG13 내 몰로니(Moloney) 쥣과 동물 백혈병 바이러스의 장 말단 반복 부에 의해 발현되는, GCsam 레트로바이러스 벡터를 팩키징하여 레트로바이러스 형질 도입을 수행하였다. 배양 제9일째 되는 날(PDL)에 형질 도입을 수행하였다. 집단 배가수(PDL)가 260이 될 때까지 세포주를 배양하였다.

형광 원위치 혼성화 및 서던 블럿팅에 의해서 삽입 위치를 테스트하였다. 5번 염색체상에는 반향 hTERT(ecotopic hTERT)의 삽입 위치(5q23-31)가 단 하나밖에 없다. PDL 186에서 분석을 수행하였다. 김사 밴딩(Giemsa banding) 및 비교용 게놈 혼성화를 수행한 결과, hMSC-TERT는 PDL 96에서 염색체의 수 이상 또는 구조 이상 현상이 일어나지 않았으며, 정상적인 2배체 웅성 핵형이 유지되었음을 알 수 있었다. 6개월 동안 피하 이식한 후 면역 결핍 마우스 내에서 종양의 발생 여부를 테스트한 결과, PDL 80에서는 종양이 발생하지 않았음을 알 수 있었다.

유동 세포 계수( FACS ) 분석법

합류 현상(confluence)이 80%가 될 때까지 세포를 표준적인 성장 배지 중에서 배양하였다. 세포를 트립신 처리한 다음, FACScan 유동 세포 계수기(Becton-Dickinson)를 사용하여 크기와 입도에 대해 분석하였다. 표면 마커 연구를 위해서, 형광 염료에 직접 접합된 항체[FITC-접합 마우스 항-사람 CD44 모노클로날 항체, #CBL154F, 심버스 바이오테크놀로지(Cymbus Biotechnology); 피코에리트린-접합 마우스 항-사람 CD166 모노클로날 항체, #559263, BD 파밍겐(BD Pharmingen)]로 상기 트립신 처리한 세포를 염색하였다(얼음 상, 30분). 샘플을 세정한 다음, FACScan(Becton-Dickinson)으로 분석할 때까지 파라포름알데히드 1%로 고정하였다.

특성 규명

무한 증식 처리된 세포는 여전히 지방 세포, 골 세포 및 연골 세포(무한 증식 세포의 비-무한 증식 처리 짝 세포)로 분화할 수 있다(도 9의 A). 무한 증식 처리된 세포는 또한 섬유 아세포의 형태를 가지며 예를 들어, 본원에 사용된 1차 세포의 특징을 이루는 CD44와 CD166 에피토프 마커를 사용하는 유동 세포 계수법에 의해 확인되는 유한 증식 MSC보다 크기와 입도 면에서 더욱 균일하였다. 무한 증식된 세포는 자체의 비-무한 증식 짝 세포와 동일한 CD 마커를 발현하였다(도 9의 B 참조).

배양

혈청 함유 배지:

7% 얼스(Earles) MEM

10% FCS

2mM L-글루타민

1 mM 피루브산 나트륨

100 U/㎖ 페니실린

0.1 ㎎/㎖ 스트렙토마이신

집단 배가 시간은 26 ? 30 시간이었다.

형질 감염 및 클론 선별

10⁶개의 세포를 형질 감염시키기 위해서, 상이한 GLP-1 구조물을 포함하는 플라스미드 DNA 0.5?2㎍을 사용하였다. 표준적인 인산칼슘 공 침전법에 의해서 HEK293 세포를 형질 감염시켰다. FuGene(로쉬)을 사용하여 AtT20 세포를 형질 감염시켰다.

비-바이러스성 방법으로서, 전기 매개 변수와 세포 유형 특이 용액을 조합하는 것을 바탕으로 하는 뉴클레오펙터 기술(아막사)을 통해서 hTERT-MSC 세포를 형질 감염시켰다. 뉴클레오펙터 장치(프로그램 C17)와 뉴클레오펙터 용액 VPE-1001을 사용한 결과, 형질 감염 효능이 60%를 초과하였다.

형질 감염 후 48시간 경과시, 배양 배지에 선별 제제인 블라스티시딘(2㎍/㎖)을 첨가하여, DNA가 염색체에 안정적으로 통합된 세포 클론을 선별하였다. 12?15일 경과 후, 안정한 형질 감염 세포 클론을 분리하고 증폭시켜, 특성 규명할 수 있었다.

발현

hTERT-MSC 및 HEK293 세포 내에서 상이한 GLP 구조물의 일시적 발현에 대해서 평가하였다. hTERT-MSC 및 HEK293 세포 둘 다에 있어서, 활성 GLP-1 수준을 단량체 GLPI 구조물 #103(Stro-GLP1_(7?37)) 및 #317(Stro-GLP1_(7?37)-IP2-11개의 아미노산으로 이루어진 연장부) 내에서 확인한 결과, 이량체 GLP-1 구조물 #217(Stro-GLP1_(7?37)-IP2-GLP1_(7?37)) 내에서는 발현 수준이 상당히 증가하였음을 알 수 있었다. 구조물 #317을 4량체 GLP-1 구조물 #159(Stro-GLP1_(7?37)-IP2 (4x)-11 aa)에 대해 연장한 결과, 활성이 유사하게 되었다(도 2 참조). hTERT-MSC 세포를 상이한 구조물로 형질 감염한 후, GLP-1을 안정적으로 발현하는 클론을 선별하였다[도 4와 도 5, 그리고 실시예 4 참조].

실시예 9

캡슐화

캡슐화되도록 배양된 세포를 PBS(PAA, 오스트리아)로 세정한 다음, 트립신/EDTA(PAA, 오스트리아)를 사용하여 배양 세포를 분리하였다. 배지(세포의 종류에 따라 다름; 예를 들어, RPMI, PAA, 오스트리아)를 사용하여 반응을 신속하게 중지한 다음, 세포 현탁액을 원심 분리하였다(8분, 1,200rpm). 펠릿을 PBS 중에 재현탁한 다음, 세포 개수를 측정하였다. 원하는 양만큼의 세포 즉, 4×10⁷개의 세포를 다시 원심 분리하였다(8분, 1,200rpm). 이후, 흡입에 의해 PBS를 완전히 제거한 다음, 5 mM I-히스티딘으로 완충된(pH7.4) 0.9% 염수 50㎕ 중에 공기 방울을 발생시키지 않고 펠릿 50㎕를 재현탁하였다. 이 세포 현탁액을 1.5?1.7%(w/v)의 알긴산 나트륨 용액 900㎕ 중에 취하였다[0.2%(w/v) 수용액의 점도가 약 5 mPa.s인 알기네이트(실온) 사용].

재현탁된 세포와 알기네이트 용액을 혼합하기 위하여, 용액을 1㎖들이 시린지(캐뉼러 장착)로 흡입하고, 흡입과 흡출을 천천히 반복하면서 세포와 상기 용액을 균일하게 혼합하였다. 세포 농도는 4×10⁷ 세포/㎖였다.

지름이 약 200㎛인 마이크로캡슐을 생산하기 위해서, 내부 지름이 120㎛인 캐뉼러를 공기-충전 스프레이 노즐에 사용하였다. 지름 2.0㎜의 유입구를 통해 공기 고리가 유입되어 캐뉼러의 내부를 따라서 빨려 올라갔다. 이 장치는 WO 00/09566에 개시된 장치의 변형된 형태의 것이다. 세포/알기네이트 용액의 균일한 혼합물을 상기 스프레이 노즐을 통해 떨어뜨렸다. 이러한 목적으로, 루어 연결 장치(luer connector)를 사용하여 상기 혼합물을 함유하는 1㎖들이 시린지를 캐뉼러와 연결시켰다. 세포/알기네이트 용액의 혼합물을 캐뉼러를 통해 속도 50㎕/분으로 가압하였다. 외부 공기 고리를 통하여 기류를 2.5ℓ/분의 속도로 이동시켰다. 생성된 마이크로캡슐을, 스프레이 노즐의 약 10㎝ 아래에 장착한 바륨 함유 침전 조[20mM BaCl, 5mM L-히스티딘, 124mM NaCl, pH 7.0 ± 0.1, 290mOsmol ± 3]에서 침전시켰다. 바륨 함유 침전 조 내에 5분 동안 체류한 후, 각각의 경우에 있어서 마이크로캡슐을 20㎖의 PBS로 5회 세정하였다.

이후, 단일 층 마이크로캡슐 500㎕을, 상기 코어 제조에 사용된 것과 동일한 알기네이트 용액 1.5?1.7%(w/v) 500㎕ 중에 취한 후, 균일하게 혼합하였다. 이 현탁액을 1㎖들이 시린지에 취한 다음, 이 시린지를 루어 연결 장치를 통해 스프레이 노즐의 내부 채널(내부 지름 = 200㎛)에 연결하여, 50㎕/분의 통과 속도로 가압하였다. 1.5?1.7%의 알기네이트 용액이 담긴 5㎖들이 시린지를 루어 연결 장치를 통해 제2의 내부 채널(내부 지름 = 700㎛)에 연결한 다음, 이를 250㎕/분의 속도로 통과시켜 가압하였다. 기류를 2.9ℓ/분의 속도로 외부 공기 고리를 통해 운반하였다. 생성된 마이크로캡슐을, 스프레이 노즐의 약 10㎝ 아래에 장착한 바륨-함유 침전 조[20mM BaCl, 5mM L-히스티딘, 124mM NaCl, pH 7.0 ± 0.1, 290mOsmol ± 3]에 침전시켰다. 바륨 함유 침전 조 내에 5분 동안 체류시킨 후, 각각의 경우에 있어서 이 마이크로캡슐을 20㎖의 PBS로 4회 그리고 배지로 1회 세정하였다. 이 과정에서 (알기네이트 층을 포함하여) 총 지름이 약 180?200㎛인 2층 마이크로캡슐이 생성되었는데, 이 경우, 세포 함유 코어의 내부 지름은 120?150㎛였다.

코어 내 세포의 농도는 알기네이트 1㎖ 당 약 4×10⁷개 세포였다. 이로써, 비드 부피가 0.002?0.004㎕인 (구형) 마이크로캡슐(셀비즈)로서 비드 1개당 약 100개의 세포를 함유하는 마이크로캡슐이 생성되었다. GLP-1을 암호화 및 분비하는 (구형) 마이크로캡슐은 시간당 평균 0.2fmol의 활성 GLP-1을 생산하였다.

코어 내에 캡슐화된 GLP-1 분비 hTERT-MSC 세포를 함유하는 셀비즈의 현미경 사진을 도 10에 나타내었다.

지름이 약 600㎛인 마이크로캡슐을 생산하기 위해서, 내부 지름이 400㎛인 캐뉼러를, 공기가 충전된 3 채널 스프레이 노즐(내부 채널용)에 사용하였다. 이 캐뉼러를 내부 지름이 700㎛인 외부 노즐 내에 고정하였다. 1.5㎜의 유입구를 통해 공기 고리가 유입되어 캐뉼러(2개)의 내부를 따라서 빨려 올라갔다. 이 장치는 WO 00/09566에 개시된 장치의 변형된 형태의 것이다. 세포/알기네이트 용액의 균일한 혼합물을 상기 스프레이 노즐을 통해 떨어뜨렸다. 이러한 목적으로, 상기 혼합물을 함유하는 1㎖들이 시린지를 루어 연결 장치(luer connector)를 사용하여 캐뉼러와 연결시켰다. 세포/알기네이트 용액의 혼합물을 속도 300㎕/분으로 내부 채널에 통과시켜 가압하였다. 외부 공기 고리를 통하여 기류를 2.5ℓ/분의 속도로 이동시켰다. 생성된 마이크로캡슐을, 스프레이 노즐의 약 10㎝ 아래에 장착한 바륨 함유 침전 조[20mM BaCl, 5mM L-히스티딘, 124mM NaCl, pH 7.0 ± 0.1, 290mOsmol ± 3]에서 침전시켰다. 바륨 함유 침전 조 내에서 5분 동안 체류시킨 후, 각각의 경우에 있어서 마이크로캡슐을 20㎖의 PBS로 5회 세정하였다.

이후, 단일 층 마이크로캡슐 500㎕를, 상기 코어 제조에 사용된 것과 동일한 알기네이트 용액 0.8%(w/v) 500㎕ 중에 취한 후, 균일하게 혼합하였다. 이 현탁액을 1㎖들이 시린지에 취한 다음, 이 시린지를 루어 연결 장치를 통해 스프레이 노즐의 내부 채널(내부 지름 = 400㎛)에 연결하고나서, 여기를 50㎕/분의 속도로 통과시켜 가압하였다. 0.8%의 알기네이트 용액을 담고 있는 5㎖들이 시린지를 루어 연결 장치를 통해 제2의 내부 채널(내부 지름 = 700㎛)에 연결한 다음, 여기를 250㎕/분의 속도로 통과시켜 가압하였다. 기류를 2.9ℓ/분의 속도로 외부 공기 고리를 통과시켜 운반하였다. 생성된 마이크로캡슐을, 스프레이 노즐의 약 10㎝ 아래에 장착한 바륨-함유 침전 조[20mM BaCl, 5mM L-히스티딘, 124mM NaCl, pH 7.0 ± 0.1, 290mOsmol ± 3]에 침전시켰다. 바륨 함유 침전 조 내에 5분 동안 체류시킨 후, 각각의 경우에 있어서 이 마이크로캡슐을 20㎖의 PBS로 4회 그리고 배지로 1회 세정하였다. 이 과정에서 (알기네이트 층을 포함하여) 총 지름이 약 600±100㎛인 2층 마이크로캡슐이 생성되었는데, 이 경우, 세포 함유 코어의 내부 지름은 380±20㎛였다. 코어 내 세포의 농도는 알기네이트 1㎖ 당 약 2?3×10⁷개 세포였다. 이로써, 비드 부피가 0.065?0.180㎕인 구형 마이크로캡슐(셀비즈)로서 비드 1개당 약 1000개의 세포를 함유하는 마이크로캡슐이 생성되었다. GLP-1을 분비하는 세포를 포함하는 셀비즈는 시간당 평균 5fmol의 활성 GLP를 생산하였다.

실시예 10

C-말단이 연장된 GLP -1의 항 세포 고사 효능

래트의 인슐린종 세포주 Rin-5F를 사용하여, C-말단이 연장된 GLP-1 유사체 CM1의 세포 보호 효능을 시험관 내 테스트하였다. 96웰 당 40,000개의 Rin-5F 세포를 접종한 다음, 1% L-글루타민 및 10% 소 태아 혈청이 보충된 RPMI 중에서 2일 동안 배양하였다. 이.콜라이 내에서 재조합 방법으로 생산된 이량체 GLP-1 융합 펩티드 CM1이 상이한 농도로 존재할 때, 단백질 생합성 억제제인 사이클로헥시미드(CHX)를 첨가하여, 혈청을 포함하지 않는 조건(1% L-글루타민이 보충된 RPMI)으로 바꾸어주어 세포 고사를 유도하였다. 24시간 경과 후, 알라마블루(AlamarBlue)를 사용하여 세포의 자생력을 정량하였다. GLP-1 유사체인 CM1이 이미 1nM 존재할 때 항-세포 고사 효능은 상당한 것으로 관찰되었다(p<0.01). 그 결과를 도 10에 나타내었다.

실시예 11

GLP -1 생산 hTERT - MSC 세포주의 시토킨 프로필

GLP-1 독립 세포 보호 효과를 관찰하기 위해서, GLP-1 분비 세포주인 79TM217/18K5 세포주가 시토킨, 케모킨 및 성장 인자를 분비하는지 여부에 대해 관찰하였다.

세포주는 사람의 간질 세포로부터 기원하는 것으로서, 특징적인 프로필을 가지는 시토킨을 분비하였다. 멀티플렉스 검정 키트(바이오소스 시토킨 30-플렉스; Biosource Cytokine 30-plex)를 사용하여 가장 양이 많은 사람의 시토킨, 케모킨 및 성장 인자 30개를 동시에 측정하였다. 시토킨 IL-1RA, IL-1β, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL7, IL-10, IL-12(p40/p70), IL-13, IL-15, IL-17, IP-10, EGF, 에오탁신(Eotaxin), FGF-베이직, IFN-a, IFNγ, GM CSF, G-CSF, HGF, MIG, MIP-b, MIP-1α, RANTES 및 TNFα는 발현되지 않았음을 알 수 있었다[10⁵개의 세포당 각 분석물 20pg의 검출 한계(24시간)]. 검출 가능한 수준으로 발현된 시토킨을 이하 표 1에 요약하였다.

[표 1]

성장 인자, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 뉴로트로핀-3(NT-3), 신경 교세포주-유래 신경 영양 인자(GDNF) 및 시토킨 인터루킨 6(IL-6), 인터루킨 8(IL-8) 및 단핵구 주화성 단백질 1(MCP-1)의 발현 수준. VEGF ELISA(#ELH-VEGF-001; 레이바이오(RayBio)), NT-3 ELISA(#TB243, 프로메가(Promega)), GDNF ELISA(#TB221, 프로메가) 및 사람의 IL-6, IL-8 및 MCP-1 ELISA 키트(레이바이오)를 이용하여, CM1 분비 세포주인 79TM217/18K5의 세포 배양 상청액 중에서 상기 인자들을 정량하였다.

실시예 12

안 질병의 신규 세포계 요법에 있어서의 세포 비즈의 사용

I. 도입

처음에 논의한 바와 같이 예를 들어, 녹내장, 당뇨병성 망막 병증, 망막 색소 변성증에 의한 염증 및 신경 퇴행성 질환의 경우, 망막 신경절 세포와 망막 색소 상피 세포를 포함하는 망막 조직이 소실됨에 의해서 시력이 상실될 수 있다. 망막 세포의 상태가 더욱 악화되는 것을 막기 위해서, 신경 보호 제제 예를 들어, CNTF를 반복하여 주사하는 것이 유리할 것이다. 대뇌 내 방법에 있어서, 항 세포 고사 효능과 신경 보호 효능을 갖는 것으로 파악되는 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1)은 놀랍게도, 망막에 대해서 신경 보호 효능을 나타내는 탁월한 후보 물질인 것으로 파악하여 이를 본 실험에 사용하였다.

삼출성 노인성 황반 변성증(AMD)은, 눈 혈관이 비정상적으로 성장하는 것을 특징으로 한다. 이와 같이 결함이 있는 혈관은 유체와 혈액을 누출시켜, 결과적으로는 시력을 상실시킨다. 콜라겐 XVIII의 절단 산물인 엔도스타틴은 혈관 신생을 상당 수준 감소시키는 것으로 알려져 있기 때문에, AMD의 잠재적인 치료 수단이 될 수 있었다.

건조성 노인성 황반 변성증은, 망막 색소 상피 세포의 변성 및 위축과, 광 수용체 층의 2차적인 변화가 일어나는 것을 특징으로 한다. 건조성 노인성 황반 변성증은 시력 상실에서부터 시력 손상까지 유발하는 가장 일반적인 안 질환의 하나이므로, 이와 같은 세포들이 생존하는 것을 돕는 신경 보호 요법이 매우 바람직할 것이다. 만일 치료용 단백질을 연속적으로 생산 및 분비하는 유리체 강 내 세포 이식물을 사용할 수 있다면, 약물을 반복적으로 주사하여, 주입시 발생할 수 있는 감염의 위험을 줄일 수 있었다.

이하 실험에 있어서, 약 100개의 GLP-1 셀비즈와 약 100개의 엔도스타틴 셀비즈를 각각 토끼 9마리의 우측 및 좌측 안구 유리체 강에 이식하였다. 본 과정의 목적은 캡슐화된 세포의 자생력, 셀비즈의 무결성(integrity) 및 이식 후 수양액 중 전이 유전자의 생산 속도를 모니터하기 위한 것이었다. 이러한 실험을 통해, 유리체 내 셀비드 이식물이 망막 위축증 및 AMD, 그리고 다른 안 질병의 치료 수단으로서 사용될 때의 적합성에 대한 첫 번째 증거를 제공하였다.

이하 매개 변수는 관찰을 위해서 설정된 것이다:

ㆍ 유리체 강 내 이식 후 약 3일, 14일 및 56일 경과시, GLP-1 셀비즈와 엔도스타틴 셀비즈의 특성 규명

ㆍ 셀비즈의 무결성

ㆍ 캡슐화된 세포의 생명력(vitality)

ㆍ 외부 이식 후 GLP-1 융합 펩티드와 엔도스타틴 분비

ㆍ 이식 전과 제3일, 제7일, 제14일, 제21일, 제28일, 제35일, 제42일, 제49일 및 제56일 경과 시 수양액 중 셀비드 분비 인자(GLP-1 융합 펩티드, 엔도스타틴)의 정량

ㆍ 망막의 조직학적 평가(HE 염색, PAS[임의적])

ㆍ 망막의 세포 고사 염색(TUNEL)

2. 방법 및 재료

2.1 테스트 아이템

2.1.1. GLP -1 셀비즈

발효조 번호: CB-087

조성: 상기한 바와 같은 알긴산 나트륨 중 캡슐화된 GLP-1 융합 펩티드 분비 세포주 79TM217/18K5

안전 규정: 유전자 변형 유기체의 취급에 관한 통상의 위생 절차(생물 안전 레벨 1)

2.1.2 엔도스타틴 셀비즈

발효조 번호: CB-102

조성: GLP-1 셀비즈에 대해 상기한 바와 같은 방법에 따라서 알긴산 나트륨 중 캡슐화된 엔도스타틴 분비 세포주 58TM131/3K7

2.1.3. 비이클

공 셀비즈(empty CellBead)는 이식하지 않았다. 기타 눈은 각각 대조군으로 사용되었다.

2.2. 테스트 시스템

테스트 시스템: 뉴질랜드 화이트 토끼(New Zealand White Rabbit)

선택 이유: 상기 실험 동물의 크기 특히, 눈의 크기가 의도로 하는 테스트에 적당함.

그룹당 동물 할당수: 특정 시점(제3일, 제14일 및 제56일) 당 암컷 3마리

실험 동물의 총 수: 9

식별 방법: 개별 케이지 카드와 이에 상응하는 타투 번호

환경 순응: 건강 상태를 검사한 후 실험실 조건 하에 방치. 눈에 어떠한 질병의 징후도 보이지 않는 동물만을 연구의 목적으로 사용하였다. 환경 순응시 체중은 결과 섹션에 미처리 데이터로서 제시하였다.

2.3. 부가 재료

디펩티딜펩티다제 IV 억제제(링코 리서치; Linco Research)

GLP-1 활성 ELISA(링코 리서치)

엔도스타틴 ELISA(R&D)

노베신(Novesine) 0.4% 점안액(푸하임 소재, 옴니비젼 게엠베하(OmniVision GmbH))

PVP-Jod-AT 2.5%(NRF15.13)

리포바신 점안액(Merck)

살균용 요드화 폴비돈 용액

2.4. 축약어 목록

2.5. 처리

9 마리의 토끼의 오른쪽 안구 유리체 내 강에는 50?100개의 GLP-1 셀비즈를 이식하였으며, 왼쪽 안구 유리체 내 강에는 50?100개의 엔도스타틴 셀비즈를 이식하였다. 이식 전과 제3일, 제7일, 제14일, 제21일, 제28일, 제35일, 제42일, 제49일 및 제56일 경과시에 동물의 양쪽 눈으로부터 수양액 샘플을 채취하였다. 제3일, 제14일 및 제56일 경과시에 3마리의 실험 동물을 각각 안락사시키고, 이것에 셀비즈를 이식한 다음 망막을 관찰하였다.

2.5.1 테스트 아이템의 투여

2.5.1.1. 이식 전 테스트 아이템의 제조

본원에 정의된 바와 같은 GLP-1을 암호화 및 분비하는 세포와, 이 세포를 함유하는 (구형) 마이크로비드(GLP-1 셀비즈？)와, 혈관 신생 억제 인자인 엔도스타틴을 암호화 및 분비하는 세포, 그리고 이 세포를 함유하는 (구형) 마이크로비드(엔도스타틴 셀비즈？)(둘 다 안구 내 이식용임)를, 상기 실시예 1?11에 기술한 실험에 따라서 우수 의약품 제조 관리 기준(GMP)에 따라서 제조하였다. 알기네이트 내에 캡슐화되어 GLP-1 융합 펩티드를 분비하는 세포를 세포주 79TM217/18K5(GLP-1 분비 세포)로부터 생산하였거나 또는 세포주 58TM131/3K7(엔도스타틴 분비 세포)로부터 생산하였으며, 이를 약물로 규정하였다.

본 실험에서 GLP-1 셀비즈？에 의해 발현된 GLP-1 융합 펩티드는, 천연 프리프로글루카곤 유전자와 유사하게 배열된 이량체 GLP-1 구조물이다. 이는 분자량이 8.7kDa인 79 아미노산 이량체 GLP-1/개입 펩티드 2(IP-2)/GLP-1 단백질로서, 첨부된 서열 목록 중 서열 번호 10의 서열에 해당한다. C-말단이 연장된 GLP-1 융합 펩티드를 천연의 GLP-1과 비교하였을 때, 이 융합 펩티드의 이점은 발현 수준이 더욱 높다는 점과, 디펩티딜 펩티다제 IV에 의한 천연 발생 분해에 대하여 감수성이 줄어들었다는 점이다. 융합 단백질의 생물 활성은 유지된다. 안전상의 이유로, 본 실험에 사용된 플라스미드는 GLP-1 융합 펩티드와 자살 유전자를 동시에 발현시킬 수 있다. 상기 자살 유전자는 가장 널리 사용되는 헤르페스 심플렉스 바이러스 제1형 티미딘 키나제(HSV1tk)를 암호화한다. 이 효소는 세포 내에서 무독성 전구 약물인 갠시클로버를 독성 산물로 전환하여, 예상하지 못했던 세포 증식의 경우 형질 감염된 세포를 파괴할 수 있다. 그러므로, GLP-1 셀비즈？ 함유 퇴화 세포로 처리된 환자에 갠시클로버를 전신 투여하면, 이식된 세포를 파괴할 수 있다. 이하 논문에 제시된 바와 같이, ICH Q5B 권유 사항을 고려하여 세포주 79TM217/18K5을 대상으로 특성 규명하였다:

"r-DNA 유래 단백질 산물을 생산하는데 사용된 세포 내 발현 구조물의 분석(Analysis of the Expression Construct in Cells Used for Production of r-DNA Derived Protein Products)"; 및

"생물공학적 산물/생물학적 산물의 생산에 사용된 세포 기질의 특성 규명과 Q5D 유도체화(Q5D Derivations and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products)"; 그리고

"유전자 운반용 의학적 산물의 품질, 전 임상학적 측면 및 임상학적 측면에 대한 지침(Note for Guidance on the Quality, Preclinical and Clinical Aspects of Gene Transfer Medicinal Products)" (EMEA/273974/2005).

이와 같은 실험에서 엔도스타틴 셀비즈？에 의해 발현된 엔도스타틴은 콜라겐 XVIII의 절단 산물인데, 이는 혈관 신생을 상당 수준으로 감소시키는 것으로 알려져 있으므로, AMD의 잠재적 치료 수단이 될 수 있었다.

본 실험에서 사용된 GLP-1 셀비즈？와 엔도스타틴 셀비즈？는, 구형 알기네이트 매트릭스(지름 180?200㎛)에 매립된 사람의 간엽 간질 세포주로부터 유래하는 세포로 이루어져 있다. 세포는 본원에 정의된 바와 같은 GLP-1 융합 펩티드를 분비하도록 디자인되는데, 이 경우, 이 GLP-1 융합 펩티드는 항 세포 고사 효능을 가지거나, 또는 혈관 신생 억제 인자인 엔도스타틴인 것으로 파악된다. 세포를 포집하는 알기네이트 매트릭스는 본원에 기술된 제조 방법이 수행되는 동안 알기네이트과 바륨 이온을 가교함으로써 제조된다. 알기네이트 자체는 약리학적 효능을 가지지 않지만, 세포에 대한 물리적 스캐폴드를 제공하여, 이 세포가 환자의 면역 시스템에 의해 공격맏는 것을 막아준다[GLP-1을 도시한 도 11 참조]. 그러므로, 알기네이트는 부형제로서 간주한다. 환자의 관점에서 봤을 때, 알기네이트 매트릭스는 안전 성분으로서 간주하는데, 그 이유는 이 매트릭스가 세포를 투여 지점에 머무르게 붙잡아서 자유롭게 떠다니지 못하도록 막아주기 때문이다. 이러한 기능을 적당히 완수하도록, GLP-1 셀비즈？와 엔도스타틴 셀비즈？는 코어비드(corebead)를 포함하는데, 여기서, 코어비드란, GLP-1 융합 펩티드 분비 세포 또는 엔도스타틴 분비 세포를 담는 알기네이트 매트릭스를 말한다. 이와 같은 코어비드는 또한, 순수한 알기네이트으로 이루어진 외피에 의해 둘러싸여 있어서 모든 세포를 완전히 캡슐화할 수 있다.

세포는 사용할 때까지 냉동 보존하여 두었다. 이후, 냉동 보존된 셀비즈를 해동하고, 표준 작업 절차 "CM:P-142 Anlage 5"에 따라서 무균 조건 하에 링거 용액으로 세정하였다. 이 셀비즈를 실온에서 링거 용액 중에 보관하여 두었다. 약 4시간 경과시 이식 절차를 마쳤는데, 이 절차는 비드의 생명력을 보장하도록 세팅된 시간인 6시간보다 짧은 시간 안에 이루어졌다.

주사를 위해서 100개의 GLP-1 셀비즈 또는 100개의 엔도스타틴 셀비즈를 무균 조건 하에서 1㎖들이 멸균 시린지 내에 흡인하였다. 링거 용액을 빼내어 비드 펠릿을 시린지의 배출구에 위치하도록 만들었다.

2.5.1.2. 이식용 테스트 동물의 준비

셀비즈를 이식하기 전 날, 항생 점안액(리포바신, 머크)을 투여하였다. 수양액을 흡인하고, 셀비드를 주사하기 위하여, 페이스 마스크를 통해 이소플루란을 지속적으로 흡입시켜 실험 동물을 마취하였다. 무균 조건을 보장하기 위하여, 동물의 안구 주변 부위를 살균용 요드화폴리비돈 용액으로 집중 처리하였다. 또한, 동물을 멸균 천으로 덮었다. 아이 락(eye lock)을 채워 눈꺼풀이 떨어져 있도록 하였다. 필요하다면, 점안액(노베신 0.4%, 옴니비젼)을 투여하여 눈을 국부 마취시켰다(노출 시간 = 30초). PVP-Jod-AT 2.5% 점안액을 사용하여 살균하였다(노출 시간 = 2분).

2.5.1.3. 테스트 아이템의 투여

상기 제조된 셀비즈를 이식하기 위해서, 20G의 영구 정맥 카테터를 사용하였다. 결막과 공막을 약간 빗나가도록 만든 후, 홍채로부터 2?3㎜ 떨어진 부위에 바늘을 수직으로 하여 주사하였다. 카테터를 약 1㎝ 정도 깊이로 삽입한 후, 바늘을 잡아당겨 빼내서 유리체 강 내에 가요성 튜브가 남아있도록 하였다. 100개의 셀비즈를 함유하는 1㎖들이 시린지를 부착시키고, 유리액을 흡인하여 비드를 재현탁한 다음, 이를 유리체 내에 주사하였다. 결막을 고정한 후, 가요성 튜브를 조심스럽게 분리하였다. 주사한 부위에 나 있는 천공이 아물었는지 여부와 셀비드가 유출되었는지 여부를 검토하였다. 주사되지 않은 셀비드가 남아 있는지 확인하기 위해 시린지와 카테터를 검토하였다. 상기 비드의 수를 계수하여, 눈에 존재하는 비드의 실제 개수를 측정하였다.

9 마리의 실험 동물 각각의 오른쪽 눈 유리체 내 강에는 GLP-1 셀비즈를, 그리고 왼쪽 눈 유리체 내 강에는 엔도스타틴 셀비즈를 투여하였다. 잠재적으로 발생할 수 있는 염증을 예방하기 위해, 실험의 끝에 가서 항생 점안액(리포바신, 2?3 방울)을 결막에 점안하였다.

셀비즈 이식이 성공했는지 여부를 확인하기 위하여, 시린지/카테터 내에 발견되는 비드의 수와 기타 임의의 관찰 결과를 이하 섹션 3의 "외부 이식"편에 제시하였다.

실험 내내 토끼의 건강 상태를 지속적으로 모니터하였다. 최소한 이틀에 한 번씩 건강 상태를 모니터하였으며, 그 결과를 이하에 제시하였다. 체중은, 환경에 순응하기 시작하는 주를 시작으로 매주 한 번씩 측정하였으며, 실험의 마지막 단계에 가서는 측정 횟수를 줄였다.

2.5.2. 수양액 샘플 채취

100?200㎕의 수양액(최소 필요량 = 100㎕; 분석을 반복하기 위해서는 200㎕이 필요할 것으로 예상됨)을, 이식 전과 제3일, 제7일, 제14일, 제21일, 제28일, 제25일, 제42일, 제49일 및 제56일 경과시에 DPP-4 억제제 2㎕를 함유하는 반응 튜브 내에 직접 수집하였다. 30G 바늘이 장착된 시린지를 사용하여 이소플루란으로 마취된 실험 동물을 대상으로 샘플 채취를 수행하였다[실험 동물의 양쪽 눈을 대상으로, 3.5.1에 의한 무균 조건 하에서 수행함]. 샘플을 수집한 직후 -20℃의 온도에 이 샘플을 보관하였다.

GLP-1 활성 ELISA(링코 리서치) 및 엔도스타틴 ELISA를 사용하여 수양액 중 활성 GLP-1 및 엔도스타틴 농도에 대해 분석하였다. 그 결과를 분석용으로 마련한 실험 노트에 기록하였다.

2.5.3. 해부

3 마리의 동물을 각각 이식 후 제3일, 제14일 및 제56일 경과시에 안락사시켰다. 표준 작업 절차 PL:A-207에 부합하도록 실험 동물을 안락사시켰다[CO₂를 흡입하도록 하여 안락사시키기 전에 이소플루란을 흡입시켜 실험 동물을 마취함]. 다음과 같이 외부 이식 과정을 기록하였다. 간단히 말해서, 유리체를 개방하고, 셀비즈를 외부 이식한 다음, 망막을 포르말린 내에 보존하였다.

a) 외부 이식체의 특성 규명

외부 이식된 셀비즈를 따뜻한 배양 배지 중에서 3회 세정하고, 다음과 같은 매개 변수에 의해 특성 규명하였다:

i) 외부 이식된 셀비즈 전부의 현미경 사진을 촬영하여 셀비드의 무결성을 평가하였다. 이를 위해 마련한 실험 노트에 현미경 사진을 붙여놓았다.

ii) 외부 이식 후 전이 유전자 분비

외부 이식된 셀비즈를 표준 작업 절차 CM:Q-158/02에 따라서 배양 배지와 함께 항온 처리하였다. 배양 배지 부피를 셀비즈의 실제 개수에 대해 보정하였다[GLP-1 셀비드에 대해서는 100㎕, 그리고 엔도스타틴 셀비드에 대해서는 10㎕]. 그 결과를 기록하였다.

iii) 캡슐화된 세포의 생명력

캡슐화된 세포의 생명력을 평가하기 위하여, 셀비즈를, 표준 작업 절차 CM:Q-140/01에 따라서 SYBR 그린/요드화프로피듐으로 염색하였다. 모든 셀비즈를 대상으로 형광 현미경 사진을 촬영한 후 이를 기록하여 두었다.

b) 망막에 관한 고찰

망막을 4% 포르말린 중에 보존한 다음, HE 및 PAS 염색을 이용하는 병리 조직학적 평가를 위해 요나스 교수(만하임 대학)에게 보내기 전까지 보관하여 두었다. 더욱이, TUNEL 염색을 위해 망막의 일부를 사용하여 세포 고사가 일어났는지 여부를 관찰하였다. 양쪽 눈의 수양액 내 GLP-1과 엔도스타틴의 수준을 측정하고, 각각의 결과를 설명한 섹션에 제시한 MS 엑셀의 통계 기능에 의해 상이한 샘플 채취 시점 간 차이점을 평가하여, 통계학적 분석을 수행하였다. 테스트 아이템의 투여 방법, 동물의 사망률/자생력, 임상 징후, 체중 그리고 외부 이식 결과를 기록하였다.

3. 결과

본 실험 중 어떤 동물도 사멸하지 않았음을 알 수 있었다. 눈에 띄는 임상 징후로서는, 모든 동물의 주사 위치 및 결막의 염증 예를 들어, 부종 및 홍반이 있다. 일반적으로 이와 같은 증상은 1마리의 동물(이 동물의 경우에는 염증을 회복하는데 최소 3주가 소요되었음)을 제외하고는 수일 내에 사라졌다. 대부분, 증상이 오랜 시간 동안 나타나는 이유는 수양액을 반복해서 샘플 채취하였기 때문인 것으로 추측된다.

9번 동물을 제외하고, 체중 변화는 이식 방법에 의해 영향받지 않았다[상기 9번 동물은 이식 후 3일 이내에 체중의 약 10%가 감소함]. 그 결과를 도 12에 나타내었다[주의: 3마리의 동물로 이루어진 그룹 3개에 속하는 동물은 각각 제3일, 제14일 및 제56일 경과시에 안락사시킴].

3.1. 이식

37개의 엔도스타틴 비드 만이 투여된 1번 동물을 제외하고, 셀비즈를 유리체 내에 성공적으로 이식하였다[안구 하나당 최소 50개 이상의 비드를 주사하는 것을 목표로 함](이하 표 1 참조). 일반적으로, 이식 효율은, 평균적으로 78개 및 83개의 비드(GLP-1 및 엔도스타틴 비드)를 이식한 두 가지 유형의 셀비드 간에 거의 비슷하였다.

3.2. 외부 이식

이식 후 제3일, 제14일 및 제56일 경과시, 3마리의 동물을 각각 안락사시켜 이 동물의 안구로부터 비드를 추출하였다. 그 결과를 표 1과 표 2에 요약하였다. GLP-1 셀비즈의 회수율은, 회수율 약 50%이었던 제3일 및 제14일 경과시와 거의 비숫하였다. 제56일 경과시, 유리체로부터 상기 셀비즈 중 4.5%를 성공적으로 분리하였다. 엔도스타틴 셀비드는 이식된 상태가 지속 됨에 따라서 회수율이 증가하였다[이식 후 제3일, 제14일 및 제56일 경과시, 이식된 비드 중 58%, 72% 및 80%가 회수됨]. 이와 같은 관찰 결과에는 1주일마다 샘플 채취한 수양액을 분석한 결과가 반영되었다.

[표 1]

* 동물 1, 5 및 9는 제3일에 안락사하였으며, 동물 2, 7 및 8은 제14일에, 그리고 동물 3, 4 및 6은 제56일에 안락하였음.

** 기술적 문제로 인한 근사치임.

제3일, 제14일 및 제56일 경과시 이식 및 외부 이식 결과(평균치)
	GLP-1 비드 수(CB-087)			엔도스타틴 비드 수(CB-102)
경과 시점	이식된 비드	외부이식된 비드	회수율 (%)	이식된 비드	외부이식된 비드	회수율 (%)
제3일	77.6	35.6	49.8	70.0	34.6	58.4
제14일	80.0	40.6	51.6	87.0	62.6	72.2
제56일	74.5	3.6	4.5	93.0	75.0	80.4

3.3. 셀비즈의 자생력

외부 이식 후 제3일, 제14일 및 제56일 경과시 요드화프로피듐 및 SYBR 그린으로 염색하여 셀비즈의 자생력을 분석하였다. 뿐만 아니라, 외부 이식 후 수양액/유리액 중 GLP-1 및 엔도스타틴의 양과 배양 배지에 분비된 GLP-1 및 엔도스타틴의 양을 표준적인 방법에 따라서 각각의 경우에 대해 검토하였다[이하, 섹션 3.4 참조]. 수양액/유리액 및 배양 배지 중에서 발견되는 GLP-1 및 엔도스타틴의 양을 측정한 결과를 이하에 제시하였다.

3.3.1. 외부 이식 후 3일 경과시

외부 이식일: 2008년 7월 18일

두 가지 유형의 셀비즈는 테스트된 동물 3마리 모두에서 균일하게 자생력을 유지하였다. GLP-1에 대한 결과는 도 13에, 그리고 엔도스타틴에 대한 결과는 도 14에 요약하였다.

3.3.2. 외부 이식 후 14일 경과시

외부 이식일: 2008년 7월 29일

두 가지 유형의 셀비즈는 동물 7 및 8에서 균일하게 생명력을 유지하였다. 동물 2의 셀비즈는 생명력이 더욱 이질적이었는데 예를 들어, 엔도스타틴 셀비즈 중 30% 이하, 그리고 GLP-1 셀비즈 중 90% 이하는 대부분 사멸한 세포를 함유하였다. GLP-1 셀비즈의 회수율은 엔도스타틴 셀비즈의 회수율에 비하여 낮았다. GLP-1에 대한 결과는 도 15에, 그리고 엔도스타틴에 대한 결과는 도 16에 요약하였다.

3.3.3. 외부 이식 후 56일 경과시

외부 이식일: 2008년 9월 9일

GLP-1 셀비즈의 회수율은 제3일 및 제14일 경과시보다 작았다. 그러나, 제56일 경과시에도 GLP-1 셀비즈를 여전히 관찰할 수 있었다. 엔도스타틴 비드를 자주 회수하였다. 상기 동물 3마리 간 생명력은 서로 상이하였는데, 이 경우 동물 3의 생명력은 전체적으로 중간 정도에서 우수한 정도였다. 동물 4와 6으로부터 얻은 비드는 미약하게만 염색되었으며/염색되었거나 SBYR 그린으로 염색된 비드는 산재하였는데, 이는 곧, 생명력이 정상 수준보다 낮으며, 각각의 비드는 보다 진하게 염색된다는 것을 말해주는 것이다. GLP-1에 대한 결과는 도 17에, 그리고 엔도스타틴에 대한 결과는 도 18에 요약하였다.

3.3.4. 결론:

본 실험에 있어서, 자생력은 시간과 셀비드 유형에 따라서 상이하게 변했던 반면에, 엔도스타틴 비드는 연구가 끝나갈 때 즈음 생명력이 더욱 크게 유지되었다. GLP-1 셀비즈는 14일이 경과할 때까지 엔도스타틴 비드와 거의 유사한 양상을 보였는데, 제56일 경과시 관찰해 본 결과, 이후의 자생력/생명력은 감소하였음을 알 수 있었다. 비슷한 양이 성공적으로 이식되었다는 것과는 별도로, 엔도스타틴 셀비즈의 회수율은 일반적으로 GLP-1 셀비즈에 비하여 컸다. 제14일로부터 제56일에 이르기까지, 소실된 GLP-1 셀비즈의 운명은 명확하지 않았으며, 이후 추가 연구를 통해서만 규명할 수 있었다.

3.4. 수양액 및 유리액 중 발현 수준

3.4.1. GLP -1 수준

안락사시킬 때마다 셀비즈를 회수하면서 유리액을 수집하였다. GLP-1 함량은 엔도스타틴 셀비즈가 이식된 다른 안구들에 비하여 상당 수준 증가하였다[각 시점에서의 검출 수준 이하]. 이식 직후 GLP-1 함량의 수준은 가장 높았으며, 제3일로부터 제14일에 이르기까지는 40%까지 감소하였다. 제56일째 되는 날, GLP-1 농도는 이용된 ELISA 시스템의 검출 수준 이하인 것으로 관찰되었다. 제56일 경과시의 관찰 결과는, 이 시점에 셀비즈가 관찰되지 않았거나 사멸한 셀비즈만 관찰된다는 사실과 부합한다. 절대치는 약간 클 수도 있었으나, 분석 시스템의 유효 범위에 의해 한정되었다. 결과를 도 19에 요약하여 나타내었는데, 도 19는 제3일, 제14일 및 제56일 경과시 유리액 중 GLP-1의 농도를 나타내는 것이다[샘플은 안락사시킬 때마다 수집함; 수집 횟수는 시점당 3회].

제3일 경과시 수양액 샘플을 1회 채취하였으며, 제7일 경과시를 시작으로 하여 이후 1주일 간격으로 모든 동물을 대상으로 수양액 샘플을 채취하였다. 셀비즈를 이식한 후에는 GLP-1이 상당 수준 증가하는 것이 확인되었다. 농도는 제7일 경과시에 가장 높았으며(288 pmol), 이후로는 감소하였다. 제14일 경과시 GLP-1 수준은 최대 농도의 거의 절반에 해당하였으며(114 pmol), 제21일 경과시 농도는 검정 시스템의 기준 수준/유효 범위보다 약간 높이/약간 벗어날 때까지 감소하였다(도 20 참조). 샘플 채취 횟수는, 제0일, 제3일 및 제7일 경과시에는 9회, 제14일 경과시에는 6회, 그리고 제21일?제56일 사이에는 3회이었다. 모든 대조군 샘플의 GLP-1 수준은 검정 시스템의 검출 한계보다 낮았다. 얻어진 수치는, 성공적으로 이식된 셀비즈의 처음 개수에 대해 정규화하였다.

3.4.2. 엔도스타틴 수준

엔도스타틴-셀비즈를 토끼의 눈에 이식한 결과, 처음 샘플 채취 시점(제3일)을 기점으로 하여, 수양액(안구의 전실)과 유리액(안구의 후실) 중 엔도스타틴 농도가 증가하였다. 엔도스타틴은 원래, 대조군으로서 사용된 GLP-1 셀비드가 이식된 안구 내에서 발견되는 엔도스타틴 1㎖당 평균 4?6ng의 수준으로 존재한다. 처리된 안구와 대조군 안구의 수양액 중 엔도스타틴의 경시적 농도 변화를 도 21에 나타내었다. 엔도스타틴의 농도는 점차적으로 증가하여 제14일과 제21일 경과시에는 최고 수준에 도달하였던 반면에, 이후 일시적으로 감소하였다가 다시 제56일 경과시에는 최고 수준의 범위 내에 속하게 되었다(최종 농도). 데이터를 도 21과 표 3에 제시하였다.

셀비즈가 안구의 후실에 이식되었다는 사실을 바탕으로 하였을 때, 유리액 중 측정된 엔도스타틴 수준은 안구의 전실로부터 취한 샘플에 비하여 확실히 높았음을 알 수 있었다. 제3일 경과시에 측정된 농도는 대조군 샘플의 농도에 비하여 약간 높았다. 상대적 및 절대적 엔도스타틴 수준을 관찰한 결과 제14일 경과시에 가장 높았음을 알 수 있었다. 56일 경과 후, 엔도스타틴의 절대 농도는 제14일 경과시의 엔도스타틴 절대 농도보다 약간 낮았으나, 상대적 수치(대조군 수치 공제, 표 3의 [] 내에 표시)는 대조군 샘플 내 농도보다 훨씬 낮았는데, 이는 제14일 경과시 수치와 비교하였을 때, 그보다 훨씬 높은 것이었다. 결과를 도 22와 표 4에 요약하였다.

수양액 중 엔도스타틴 관련 데이터 요약
처리일	0	3	7	14	21	28	35	42	49	56
평균 처리량	4.50	7.43	6.67	11.36	11.67	9.81	8.48	8.72	9.71	11.05
처리량 SE	0.29	1.34	0.77	1.80	3.62	1.70	0.90	1.58	1.50	2.25
대조군 평균	4.71	4.36	4.80	5.31	3.98	4.09	5.25	6.42	5.64	5.53
대조군 SE	0.33	0.47	0.39	0.82	0.55	0.45	0.62	1.18	0.82	0.70
처리군/ 대조군	-0.21	3.07	1.87	6.05	7.69	5.72	3.23	2.30	4.07	5.52
p (양측T- 테스트)	0.664	0.047	0.061	0.013	0.105	0.033	0.051	0.342	0.087	0.084
n (그룹당)	9	9	6	6	3	3	3	3	3	3
농도 단위는 [pmol]임. SE: 표준 오차

유리액 중 엔도스타틴 관련 데이터 요약
처리일	3	14	56
평균 처리량	11.38	55.46	42.34
처리량 SE	2.13	4.93	6.35
대조군 평균	8.82	10.03	20.90
대조군 SE	2.70	2.60	7.72
처리군 / 대조군	2.55	45.43	21.44
p(양측 T-테스트)	0.577	0.0026	0.154
n(그룹당)	3	3	3
농도 단위는 ng/㎖임. SE: 표준 오차

3.5. 망막의 TUNEL 염색

처리된 동물의 망막을 대상으로 하여 세포 고사 효과 및 항 세포 고사 효과에 대해 각각 분석하였다[TUNEL 염색법 이용]. TUNEL 염색법을 이용한 결과, 세포 고사 효과는 핵의 염색 여부로 확인할 수 있었는데, 이 경우, 미처리 대조군 동물에 비하여 염색된 핵이 감소하였음은 곧, GLP-1 및/또는 엔도스타틴 셀비즈로 처리하였을 때 항 세포 고사 효과를 나타낼 수 있음을 말해주는 것이다.

MET080-01에 따라서 TUNEL 염색의 염색 절차를 수행하였으며, 추가의 보정(예를 들어, 밝기 및 콘트라스트)을 행하지 않은 동일한 조건 하에서 현미경 사진을 촬영하였다.

TUNEL 염색 결과를 도 23에 도시하였다. 양성 대조군(DNA 분해 효소 I로 예비 처리된 절편)의 경우에는, 망막 경계 내부에 핵이 존재한다는 사실을 확실히 알 수 있었다. 이와 같은 사실은 GLP-1 셀비즈 처리된 동물에서는 관찰되지 않았다. 엔도스타틴 셀비즈 처리된 동물의 경우에는 구조물이 미약하게 염색되었음을 알 수 있었지만, 이 구조물은 인공적인 것으로 간주할 수 있었는데, 그 이유는, 엔도스타틴이 세포 고사 유도 물질인 것으로는 알려져 있지 않기 때문이다. 망막 경계 외부는 진하게 염색되었는데, 이는 아마도 개별 구조물이 표지화되지 않아서 비특이적으로 염색되었기 때문인 것으로 추측된다. 그러므로, 이와 같은 망막의 추가 절편을 관찰하여, 상기 관찰 결과를 확실하게 입증하였다.

두 번째 TUNEL 염색 결과를 도 24와 도 25에 나타내었다. 양성 대조군에는 망막의 하부 절편에 TUNEL로 염색되는 개별 구조물이 존재하였다. GLP-1 처리된 동물에서는 상기와 같은 사실들이 관찰되지 않았는데, 이는 곧, GLP-1에 의해서는 세포 고사 과정이 유도되지는 않음을 나타내는 것이다. 엔도스타틴 처리된 동물로부터 유래하는 망막의 경우에는 망막 하부 지역에 존재하는 핵이 약하게/희미하게 염색되었으나, 염색의 진하기는 망막의 외부 층에서 볼 수 있는 비특이적 신호에 비하여 확실히 약하였음을 알 수 있었다. 음성 대조군에 있어서, 절편은, 동일하되 효소는 사용하지 않는 방법으로 처리하였으며, 망막의 하층의 경우에는 어느 정도 신호가 확인되었지만 명확한 구조물은 확인되지 않았다. 이와 같은 차이는 분석된 절편의 상이한/가변적인 두께로부터 기인하는 것으로서, 이 경우, 핵은 음성 대조군의 두꺼운 절편 내에서는 확인할 수 없었다. 뿐만 아니라, 이와 같은 사실은 또한, 현미경을 자기 형광 방식(적색 광 채널)으로 작동하여 초기에 세운 가설을 입증함으로써 확인할 수 있었다[참고: KM09_08 DL].

셀비드로 2개월 동안 처리한 망막(동일한 실험자에 의해 제조된 새 절편 사용)을 다시 분석할 때, 그 결과는 TUNEL 염색에 의해 더욱 정확히 관찰할 수 있었다. 각각의 결과를 도 26 및 도 27에 도시하였다.

실험 결과를 통하여, 외부 수용층은 또한 확실히 진하게 비특이적으로 염색되었음을 알 수 있었는데, 이는 현미경을 자기 형광 방식으로 작동하였을 경우에도 알 수 있는 결과였다. GLP-1 처리 동물 또는 엔도스타틴 처리 동물 중 어느 하나의 망막에서는 특이적으로 TUNEL 염색된 세포가 확인되지 않았다. 세포 고사 세포/핵이 자주 출현하는 경우, 양성 대조군에 의하여 염색 방법의 유효성을 확인하였다.

결론적으로, GLP-1 처리 토끼 망막과 엔도스타틴 처리 토끼 망막 둘 다는, 처리 후 2개월 경과시 TUNEL로 염색되지 않았다. 그러므로, 망막 세포의 생명력에 대해 상기 두 단백질이 미치는 부정적인 효과는 관찰되지 않았다.

4. 고찰 및 결론

상기 실험을 통하여, 카테터를 안구 내에 삽입하여 셀비드를 토끼 눈의 유리체 내에 이식하면 긍정적인 결과를 얻을 수 있다는 것을 알 수 있었다. 노즐로부터 비드를 이동시키는 비선형 주사 채널과 연결된 루어 연결 장치를 포함하는 표준 기구를 사용함으로 인하여, 성공률은 가변적이었다. 비드 투여 후 미약하게 발생하는 염증으로 인한 몇 가지 증상 예를 들어, 홍조 및 부종 현상만이 관찰된 것으로 보아, 안구 조직이 셀비드를 잘 받아들였음을 알 수 있었다. GLP-1과 엔도스타틴 셀비즈 둘 다의 자생력은 제14일 경과시까지만 해도 우수하였다. 연구의 끝(제56일)에, GLP-1 셀비즈는 최소한으로 회수되었던 반면에, 엔도스타틴 셀비즈의 회수율과 자생률은 만족할만하였다.

셀비즈를 이식하였을 때, 수양액 및 유리액 중 GLP-1과 엔도스타틴의 수준은 많이 증가하였던 반면에, 이것들의 효능은 유리액(이식 부위) 중에서 더욱 뛰어났다. 수양액과 유리액 중 GLP-1의 최고 농도는 각각, 기준치보다 15배 및 100배 높았다(제7일 및 제3일). 수양액과 유리액에 대한 엔도스타틴의 도는 제21일과 제14일에 최고에 이르렀는데, 이때, 엔도스타틴의 최고 농도는 각각 기준치보다 3배 및 5.5배 높았다.

세포 고사 세포에 있어서, GLP-1과 엔도스타틴에 56일 동안 노출한 후 토끼 망막의 TUNEL 염색은 진해지지 않았다. 그러므로, 셀비즈 처리가 눈에 악영향을 미친다는 가정은 배제할 수 있겠다.

본 실험을 수행한 결과, 본원에 정의된 GLP-1과 엔도스타틴 셀비즈의, 유전자 변형 간엽 줄기 세포로부터 분비된 치료용 단백질/펩티드 전달에 대한 효능 및 안전성을 평가할 수 있었다. 실험용 토끼를 통해서 셀비즈를 눈의 유리체 강에 이식함에 있어서 기술적 경험이 확립되었다. 주요 과제는, 비드가 시린지 노즐에 축적되는 경향이 있어서 비드 운반이 어렵게 된, 루어 연결 장치가 장착되어 있는 표준 주사 기구를 사용하여 눈에 실제로 이식된, 비드의 수를 모니터하는 것이었다. 이와 같은 사실은, 본 방법에 적용할 수 있는 유체의 양이, 지나치게 많은 양의 유체를 셀비즈와 함께 주사할 때 안구에 압력이 가해지지 않도록 막는 것에 한정된다는 사실에 달려있을 수 있다[또는 달려있는 것이 거의 확실하다]. 대체적으로, 본 실험에 사용된 방법을 통하여 만족스러운 결과를 얻을 수 있었다. 본 실험의 주요 특징은, 시간이 경과 함에 따라서 유리액 중 GLP-1과 엔도스타틴 셀비즈의 자생력을 분석하는 것이었다. GLP-1 셀비즈의 자생력은 최소한 제14일이 경과 할 때까지는 만족스러웠다. 엔도스타틴 셀비즈의 회수율과 자생력은 실험의 마지막(제56일)에 이르기까지 모든 시점에서 우수하였으며, 엔도스타틴 셀비즈는 최소 56일 동안 합리적인 수만큼 생존하였다.

셀비즈의 자생력에는 유리액과 수양액 중 치료 펩티드에 대해 얻어진 농도 수준이 반영된다. GLP-1 펩티드의 농도는 이식 후 제7일 경과시에 최고에 이르렀으며, 그 후에는 감소하였다. GLP-1 펩티드의 농도는, 제14일 경과시에는 최대 농도의 거의 절반에 이르게 되었던 반면에, 제21일 경과시에는 기준 농도보다 약간 더 높았다. 제28일 경과시부터는 계속해서 수양액 및 유리액 중에 GLP-1가 거의 관찰되지 않았다(제56일). 각각의 시점에서 셀비드의 농도는 일률적으로 유리액 중에서가 더 높았는데, 이는 비드가 안구의 후방 강에 이식되었을 때에도 마찬가지인 것으로 예상되었다. 엔도스타틴 셀비즈의 자생력이 실질적으로 개선된 결과, 제56일 경과시까지, 수양액과 유리액 중 엔도스타틴의 수준은 상당히 증가하였다. 연구가 진행됨에 따라서 약간의 변화가 관찰되었다[제15일부터 제56일까지의 기간 동안 샘플/동물의 수가 감소함]. 대체적으로, 엔도스타틴 셀비즈의 자생력은 초기 시점에 비하여 약간 감소하긴 하였지만, 연구의 끝에서는 수양액 중 엔도스타틴 수준이 제14일 및 제21일 경과시의 최고 농도만큼 높았다.

망막의 생명력에 관한 치료용 펩티드의 안전성은, 세포의 세포 고사가 증가하였는지 여부를 확인하는 TUNEL 염색에 의해 검토되었다. 초기의 기술상 난점으로 인하여, 분석은 반복적으로 실시하였지만, 임의의 경우, GLP-1 및 엔도스타틴 셀비즈 처리된 안구로부터 유래하는 망막 절편에는 세포 고사된 세포가 존재하지 않았다.

결론적으로, 이식 방법을 수행하는 중 발생한 염증이 연구 도중 사라졌고, 장기간 수정체의 혼탁 현상도 관찰되지 않았던 것으로 보아, 본 실험에서 관찰된 두 가지 유형의 셀비즈는 토끼 눈에 의해 잘 받아들여졌음을 알 수 있었다. 뿐만 아니라, 조직학적 절편에서 세포 고사가 유도되지 않았던 것으로 보아, 망막 세포의 생명력은 GLP-1과 엔도스타틴에 의해 영향받지 않았음을 알 수 있었다.

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Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 50 55 60 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 65 70 75 <210> 11 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: SEQ ID No: 11 (N-GLP-1(7-37)-IP2(human)-RR-GLP-2-C), also designated human CM2 herein) <400> 11 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg 35 40 45 His Ala Asp Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn 50 55 60 Leu Ala Ala Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr 65 70 75 80 Asp Arg Lys <210> 12 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: SEQ ID No: 12, GLP-1(7-37) linked without any linker sequence via its C-terminus to human IP2 <400> 12 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly 35 40 45 <210> 13 <211> 815 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: (SEQ ID No:13) represents the translated peptide sequence of the construct according to Fig. 1k (SEQ ID No: 14) <220> <221> CDS <222> (11)..(118) <220> <221> CDS <222> (387)..(809) <400> 13 gatatccacc atg gcc ccc gcc gcc tgg ctg agg agc gcc gcc gcc agg 49 Met Ala Pro Ala Ala Trp Leu Arg Ser Ala Ala Ala Arg 1 5 10 gcc ctg ctg cca ccc atg ctg ctg ctg ctg ctg cag ccc cca cct ctg 97 Ala Leu Leu Pro Pro Met Leu Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Pro Leu 15 20 25 ctg gcc cgg gcc ctg ccc ccg gtgagtgccc gccactcgcc gtccgctcct 148 Leu Ala Arg Ala Leu Pro Pro 30 35 cgctgagggg gcgccgggca cgcgggctgg gcccagcggc gtatccggac gccaagaaac 208 cagagagcca gccagatgcc aaagggccct gccatgtgcc ggtgcccttt ccctctccat 268 ttgccctgcc acacagtggg ctggggttgc acgtgtgttt gctgacaggc cacatctcta 328 actgtgggcc atgtggacct taggcctgac cagaccctca tgtcttcctc cttcccag 386 gac gtg cac cac ctg cac gcc gag agg cgc ggc cct cag ccc tgg cac 434 Asp Val His His Leu His Ala Glu Arg Arg Gly Pro Gln Pro Trp His 40 45 50 gcc gcc ctg cca agc agc cct gcc cct gcc cca gcc acc cag gag gcc 482 Ala Ala Leu Pro Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Thr Gln Glu Ala 55 60 65 ccc agg cct gcc agc agc ctg agg cca ccc agg tgc ggc gtg cct gat 530 Pro Arg Pro Ala Ser Ser Leu Arg Pro Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp 70 75 80 ccc tcc gat ggc ctg agc gct cgg aat cgg cag aag agg cac gcc gag 578 Pro Ser Asp Gly Leu Ser Ala Arg Asn Arg Gln Lys Arg His Ala Glu 85 90 95 100 ggc acc ttc acc tcc gac gtg agc agc tac ctg gag ggc cag gcc gcc 626 Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala 105 110 115 aag gag ttc atc gcc tgg ctg gtg aag ggc agg ggc cgc agg gac ttc 674 Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg Arg Asp Phe 120 125 130 cct gag gag gtg gcc atc gtg gag gag ctg ggc cgg cga cac gcc gag 722 Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg His Ala Glu 135 140 145 ggc acc ttc acc tcc gac gtg agc agc tac ctg gag ggc cag gcc gcc 770 Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala 150 155 160 aag gag ttc atc gcc tgg ctg gtg aag ggc agg ggc tga gcgcgc 815 Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 165 170 175 <210> 14 <211> 815 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: DNA sequence of the construct according to Fig. 1k <400> 14 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc 60 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt 120 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc 180 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc 240 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac 300 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca 360 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc 420 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg 480 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg 540 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga 600 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg 660 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggccgg cgacacgccg 720 agggcacctt cacctccgac gtgagcagct acctggaggg ccaggccgcc aaggagttca 780 tcgcctggct ggtgaagggc aggggctgag cgcgc 815 <210> 15 <211> 834 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: DNA sequence and sequence of the translated peptide according to the construct Fig. 1h <220> <221> CDS <222> (11)..(118) <220> <221> CDS <222> (387)..(821) <400> 15 gatatccacc atg gcc ccc gcc gcc tgg ctg agg agc gcc gcc gcc agg 49 Met Ala Pro Ala Ala Trp Leu Arg Ser Ala Ala Ala Arg 1 5 10 gcc ctg ctg cca ccc atg ctg ctg ctg ctg ctg cag ccc cca cct ctg 97 Ala Leu Leu Pro Pro Met Leu Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Pro Leu 15 20 25 ctg gcc cgg gcc ctg ccc ccg gtgagtgccc gccactcgcc gtccgctcct 148 Leu Ala Arg Ala Leu Pro Pro 30 35 cgctgagggg gcgccgggca cgcgggctgg gcccagcggc gtatccggac gccaagaaac 208 cagagagcca gccagatgcc aaagggccct gccatgtgcc ggtgcccttt ccctctccat 268 ttgccctgcc acacagtggg ctggggttgc acgtgtgttt gctgacaggc cacatctcta 328 actgtgggcc atgtggacct taggcctgac cagaccctca tgtcttcctc cttcccag 386 gac gtg cac cac ctg cac gcc gag agg cgc ggc cct cag ccc tgg cac 434 Asp Val His His Leu His Ala Glu Arg Arg Gly Pro Gln Pro Trp His 40 45 50 gcc gcc ctg cca agc agc cct gcc cct gcc cca gcc acc cag gag gcc 482 Ala Ala Leu Pro Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Thr Gln Glu Ala 55 60 65 ccc agg cct gcc agc agc ctg agg cca ccc agg tgc ggc gtg cct gat 530 Pro Arg Pro Ala Ser Ser Leu Arg Pro Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp 70 75 80 ccc tcc gat ggc ctg agc gct cgg aat cgg cag aag agg cac gcc gag 578 Pro Ser Asp Gly Leu Ser Ala Arg Asn Arg Gln Lys Arg His Ala Glu 85 90 95 100 ggc acc ttc acc tcc gac gtg agc agc tac ctg gag ggc cag gcc gcc 626 Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala 105 110 115 aag gag ttc atc gcc tgg ctg gtg aag ggc agg ggc cgc agg gac ttc 674 Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg Arg Asp Phe 120 125 130 cct gag gag gtg gcc atc gtg gag gag ctg ggc cgg cga cac gcc gac 722 Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg His Ala Asp 135 140 145 ggc agc ttc agc gac gag atg aac acc atc ctg gac aac ctg gcc gcg 770 Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Ala 150 155 160 cgc gac ttc atc aac tgg ctg atc cag acc aag atc acc gat cgg aag 818 Arg Asp Phe Ile Asn Trp Leu Ile Gln Thr Lys Ile Thr Asp Arg Lys 165 170 175 180 tga gcgcgctgat atc 834 <210> 16 <211> 834 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: DNA sequence of the construct according to Fig. 1h <400> 16 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc 60 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt 120 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc 180 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc 240 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac 300 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca 360 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc 420 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg 480 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg 540 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga 600 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg 660 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggccgg cgacacgccg 720 acggcagctt cagcgacgag atgaacacca tcctggacaa cctggccgcg cgcgacttca 780 tcaactggct gatccagacc aagatcaccg atcggaagtg agcgcgctga tatc 834 <210> 17 <211> 780 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: DNA sequence sequence and translated peptide sequence of the construct according to Fig. 1l, <220> <221> CDS <222> (11)..(118) <220> <221> CDS <222> (387)..(776) <400> 17 gatatccacc atg gcc ccc gcc gcc tgg ctg agg agc gcc gcc gcc agg 49 Met Ala Pro Ala Ala Trp Leu Arg Ser Ala Ala Ala Arg 1 5 10 gcc ctg ctg cca ccc atg ctg ctg ctg ctg ctg cag ccc cca cct ctg 97 Ala Leu Leu Pro Pro Met Leu Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Pro Leu 15 20 25 ctg gcc cgg gcc ctg ccc ccg gtgagtgccc gccactcgcc gtccgctcct 148 Leu Ala Arg Ala Leu Pro Pro 30 35 cgctgagggg gcgccgggca cgcgggctgg gcccagcggc gtatccggac gccaagaaac 208 cagagagcca gccagatgcc aaagggccct gccatgtgcc ggtgcccttt ccctctccat 268 ttgccctgcc acacagtggg ctggggttgc acgtgtgttt gctgacaggc cacatctcta 328 actgtgggcc atgtggacct taggcctgac cagaccctca tgtcttcctc cttcccag 386 gac gtg cac cac ctg cac gcc gag agg cgc ggc cct cag ccc tgg cac 434 Asp Val His His Leu His Ala Glu Arg Arg Gly Pro Gln Pro Trp His 40 45 50 gcc gcc ctg cca agc agc cct gcc cct gcc cca gcc acc cag gag gcc 482 Ala Ala Leu Pro Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Thr Gln Glu Ala 55 60 65 ccc agg cct gcc agc agc ctg agg cca ccc agg tgc ggc gtg cct gat 530 Pro Arg Pro Ala Ser Ser Leu Arg Pro Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp 70 75 80 ccc tcc gat ggc ctg agc gct cgg aat cgg cag aag agg cac gcc gag 578 Pro Ser Asp Gly Leu Ser Ala Arg Asn Arg Gln Lys Arg His Ala Glu 85 90 95 100 ggc acc ttc acc tcc gac gtg agc agc tac ctg gag ggc cag gcc gcc 626 Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala 105 110 115 aag gag ttc atc gcc tgg ctg gtg aag ggc agg ggc cgc agg gac ttc 674 Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg Arg Asp Phe 120 125 130 cct gag gag gtg gcc atc gtg gag gag ctg ggc cgg cga cac gcc gac 722 Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg His Ala Asp 135 140 145 ggc agc ttc agc gac gag atg aac acc atc ctg gac aac ctg gcc gcg 770 Gly Ser Phe Ser Asp Glu Met Asn Thr Ile Leu Asp Asn Leu Ala Ala 150 155 160 cgc tga tatc 780 Arg 165 <210> 18 <211> 720 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: DNA sequence of the construct according to Fig. 1l <400> 18 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc 60 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt 120 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc 180 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc 240 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac 300 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca 360 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc 420 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg 480 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg 540 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga 600 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg 660 acggcagctt cagcgacgag atgaacacca tcctggacaa cctggccgcg cgctgatatc 720 <210> 19 <211> 716 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: DNA sequence and sequence of the translated peptide according to Fig. 1m <220> <221> CDS <222> (11)..(118) <220> <221> CDS <222> (387)..(710) <400> 19 gatatccacc atg gcc ccc gcc gcc tgg ctg agg agc gcc gcc gcc agg 49 Met Ala Pro Ala Ala Trp Leu Arg Ser Ala Ala Ala Arg 1 5 10 gcc ctg ctg cca ccc atg ctg ctg ctg ctg ctg cag ccc cca cct ctg 97 Ala Leu Leu Pro Pro Met Leu Leu Leu Leu Leu Gln Pro Pro Pro Leu 15 20 25 ctg gcc cgg gcc ctg ccc ccg gtgagtgccc gccactcgcc gtccgctcct 148 Leu Ala Arg Ala Leu Pro Pro 30 35 cgctgagggg gcgccgggca cgcgggctgg gcccagcggc gtatccggac gccaagaaac 208 cagagagcca gccagatgcc aaagggccct gccatgtgcc ggtgcccttt ccctctccat 268 ttgccctgcc acacagtggg ctggggttgc acgtgtgttt gctgacaggc cacatctcta 328 actgtgggcc atgtggacct taggcctgac cagaccctca tgtcttcctc cttcccag 386 gac gtg cac cac ctg cac gcc gag agg cgc ggc cct cag ccc tgg cac 434 Asp Val His His Leu His Ala Glu Arg Arg Gly Pro Gln Pro Trp His 40 45 50 gcc gcc ctg cca agc agc cct gcc cct gcc cca gcc acc cag gag gcc 482 Ala Ala Leu Pro Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Thr Gln Glu Ala 55 60 65 ccc agg cct gcc agc agc ctg agg cca ccc agg tgc ggc gtg cct gat 530 Pro Arg Pro Ala Ser Ser Leu Arg Pro Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp 70 75 80 ccc tcc gat ggc ctg agc gct cgg aat cgg cag aag agg cac gcc gag 578 Pro Ser Asp Gly Leu Ser Ala Arg Asn Arg Gln Lys Arg His Ala Glu 85 90 95 100 ggc acc ttc acc tcc gac gtg agc agc tac ctg gag ggc cag gcc gcc 626 Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala 105 110 115 aag gag ttc atc gcc tgg ctg gtg aag ggc agg ggc cgc agg gac ttc 674 Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg Arg Asp Phe 120 125 130 cct gag gag gtg gcc atc gtg gag gag ctg ggc tga gcgcgc 716 Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly 135 140 <210> 20 <211> 716 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: DNA sequence of the construct according to Fig. 1m <400> 20 gatatccacc atggcccccg ccgcctggct gaggagcgcc gccgccaggg ccctgctgcc 60 acccatgctg ctgctgctgc tgcagccccc acctctgctg gcccgggccc tgcccccggt 120 gagtgcccgc cactcgccgt ccgctcctcg ctgagggggc gccgggcacg cgggctgggc 180 ccagcggcgt atccggacgc caagaaacca gagagccagc cagatgccaa agggccctgc 240 catgtgccgg tgccctttcc ctctccattt gccctgccac acagtgggct ggggttgcac 300 gtgtgtttgc tgacaggcca catctctaac tgtgggccat gtggacctta ggcctgacca 360 gaccctcatg tcttcctcct tcccaggacg tgcaccacct gcacgccgag aggcgcggcc 420 ctcagccctg gcacgccgcc ctgccaagca gccctgcccc tgccccagcc acccaggagg 480 cccccaggcc tgccagcagc ctgaggccac ccaggtgcgg cgtgcctgat ccctccgatg 540 gcctgagcgc tcggaatcgg cagaagaggc acgccgaggg caccttcacc tccgacgtga 600 gcagctacct ggagggccag gccgccaagg agttcatcgc ctggctggtg aagggcaggg 660 gccgcaggga cttccctgag gaggtggcca tcgtggagga gctgggctga gcgcgc 716 <210> 21 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: artificial <400> 21 His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 20 25 30 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: sequence contained in component (II) of a GLP-1 fusion peptide <400> 22 Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile 1 5 10 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: sequence contained in component (II) of a GLP-1 fusion peptide <400> 23 Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: sequence contained in component (II) of a GLP-1 fusion peptide <400> 24 Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu 1 5 10 <210> 25 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: sequence according to formula (I) <220> <221> misc_feature <222> (31)..(31) <223> Xaa = NH2, when sequence is GLP-1(7-36) amide, or Xaa = Gly-OH, when sequence is GLP-1(7-37) amide, <400> 25 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa 20 25 30 <210> 26 <211> 584 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of sequence: GLP-1 fusion peptide corresponding to Figure 1 e #217 <220> <221> CDS <222> (31)..(561) <400> 26 aattcagata attcgatagc cccgggcacc atg gct ccc gct gca tgg ctg aga 54 Met Ala Pro Ala Ala Trp Leu Arg 1 5 tct gcg gcc gcg cgc gcc ctc ctg ccc ccg atg ctg ctg ctg ctg ctc 102 Ser Ala Ala Ala Arg Ala Leu Leu Pro Pro Met Leu Leu Leu Leu Leu 10 15 20 cag ccg ccg ccg ctg ctg gcc cgg gct ctg ccg ccg gac gtc cac cac 150 Gln Pro Pro Pro Leu Leu Ala Arg Ala Leu Pro Pro Asp Val His His 25 30 35 40 ctc cat gcc gag agg agg ggg cca cag ccc tgg cat gca gcc ctg ccc 198 Leu His Ala Glu Arg Arg Gly Pro Gln Pro Trp His Ala Ala Leu Pro 45 50 55 agt agc ccg gca cct gcc cct gcc acg cag gaa gcc ccc cgg cct gcc 246 Ser Ser Pro Ala Pro Ala Pro Ala Thr Gln Glu Ala Pro Arg Pro Ala 60 65 70 agc agc ctc agg cct ccc cgc tgt ggc gtg ccc gac cca tct gat ggg 294 Ser Ser Leu Arg Pro Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Pro Ser Asp Gly 75 80 85 ctg agt gcc cgc aac cga cag aag agg cat gcc gaa ggg acc ttt acc 342 Leu Ser Ala Arg Asn Arg Gln Lys Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr 90 95 100 agc gat gtg agc tct tat ctg gaa ggc cag gct gcc aag gag ttc att 390 Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile 105 110 115 120 gct tgg ctg gtg aaa ggc cgg gga agg cgg gat ttc cca gag gag gtg 438 Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val 125 130 135 gcc atc gtg gag gag ctg ggc cgg cga cat gcc gaa ggg acc ttt acc 486 Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly Arg Arg His Ala Glu Gly Thr Phe Thr 140 145 150 agc gat gtg agc tct tat ctg gaa ggc cag gct gcc aag gag ttc att 534 Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile 155 160 165 gct tgg ctg gtg aaa ggc cgg gga tga attgccaagg gcgaattatc agg 584 Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly 170 175 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: sequence contained in component (II) of a GLP-1 fusion peptide <400> 27 Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: sequence contained in component 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Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala 20 25 30 Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly 35 40 45 <210> 38 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: sequence of a GLP-1 fusion peptide <400> 38 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala 20 25 30 Ala Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly 35 40 45 <210> 39 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: sequence of a GLP-1 fusion peptide <400> 39 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Asp Phe Ala Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly 35 40 45 <210> 40 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: sequence of a GLP-1 fusion peptide <400> 40 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly 35 40 45 <210> 41 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: sequence of a GLP-1 fusion peptide <400> 41 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ala 20 25 30 Ala Asp Ala Ala Ala Ala Val Ala Ile Ala Ala Ala Leu Gly 35 40 45 <210> 42 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: sequence of a GLP-1 fusion peptide <400> 42 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Asp Phe Pro 35 <210> 43 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: sequence of a GLP-1 fusion peptide <400> 43 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala 35 40 <210> 44 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: sequence of a GLP-1 fusion peptide <400> 44 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Asp Phe Pro Glu Glu Val Ala Ile Ala Glu Glu Leu Gly Arg Arg 35 40 45 His Ala Cys 50 <210> 45 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: sequence of a GLP-1 fusion peptide <400> 45 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Arg 20 25 30 Arg Asp Phe Ala Glu Glu Val Ala Ile Val Glu Glu Leu Gly 35 40 45 <210> 46 <211> 46 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of sequence: sequence of a GLP-1 fusion 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Claims

신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하도록 조작된, 안 질병 또는 안 질환의 안구 내 치료 방법에 사용되는 세포로서, 상기 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하도록 조작된 세포는 구형 마이크로캡슐 내에 캡슐화된 것인 세포.
제1항에 있어서, 상기 신경 보호 인자는 GLP-1 펩티드 또는 GLP-1 융합 펩티드, 또는 이의 단편이나 변이체로부터 선택되며, 상기 혈관 신생 억제 인자는 엔도스타틴, 또는 이의 단편이나 변이체로부터 선택되는 것인 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 구형 마이크로캡슐은 구형 코어와 하나 이상의 표면 코팅층을 포함하고,
상기 구형 코어는 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자, 및/또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 세포와, 가교 중합체의 혼합물을 포함하거나 이 혼합물로 이루어져 있으며;
상기 하나 이상의 표면 코팅층은 가교 중합체를 포함하거나 가교 중합체로 이루어진 것인 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구형 마이크로캡슐의 총 지름은 약 120?약 800㎛, 약 120?약 700㎛, 약 150?약 650㎛, 또는 약 165?약 600㎛, 또는 심지어 약 120?약 300㎛, 약 150?약 250㎛, 약 165?약 225㎛, 또는 약 180, 185, 190 또는 200㎛를 포함하여 약 180?약 200㎛인 것인 세포.
제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포는 신경 보호 인자, 혈관 신생 억제 인자 및/또는 이의 단편이나 변이체를 암호화 및 분비하는 간엽 줄기 세포, 간엽 간질 세포, 사람의 간엽 줄기 세포, 사람의 간엽 줄기 세포로부터 유래하는 분화 세포, 동종 세포 또는 자가 조직 세포인 것인 세포.
제3항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 코어 및/또는 하나 이상의 표면 코팅층의 가교 중합체는 화학적으로 동일한 중합체를 동일하거나 상이한 농도로 포함하며, 상기 중합체는 또한 분자량이 상이할 수 있으며/있거나 상이하게 가교될 수도 있는 것인 세포.
제3항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 가교 중합체는 생체 중합체와 알기네이트를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 세포.
제3항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구형 마이크로캡슐은 1, 2, 3, 4 또는 5개 또는 그 이상의 표면 코팅층을 포함하는 것인 세포.
제3항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구형 마이크로캡슐은 다가 양이온으로 이루어진 추가의 외부 표면 코팅층을 포함하는 것인 세포.
제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 신경 보호 인자 및/또는 이의 단편이나 변이체는 다음과 같은 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 GLP-1 펩티드인 것인 세포:
a) GLP-1의 7?35번 아미노산을 포함하는 펩티드; 또는
b) GLP-1 또는 GLP-1(7?36) 아미드의 7?36번 아미노산을 포함하는 펩티드; 또는
c) GLP-1의 7?37번 아미노산을 포함하는 펩티드; 또는
d) 하기 화학식 II에 의한 서열을 포함하는 펩티드:
[화학식 II]
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37
[상기 식 중, Xaa7는 L-히스티딘이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile 또는 Lys이며; Xaa16은 Val 또는 Leu이고; Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이며; Xaa19는 Tyr 또는 Gln이고; Xaa20은 Leu 또는 Met이며; Xaa22는 Gly 또는 Glu이고; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이며; Xaa25는 Ala 또는 Val이고; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa27은 Glu 또는 Leu이고; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이며; Xaa33은 Val 또는 Lys이고; Xaa34는 Lys, Glu, Asn 또는 Arg이며; Xaa35는 Gly이고; Xaa36은 Arg, Gly, Lys 또는 아미드이거나, 존재하지 않으며; Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys 또는 아미드이거나, 존재하지 않음]
; 또는
e) 하기 화학식 III에 의한 서열을 포함하는 펩티드:
[화학식 III]
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37
[상기 식 중, Xaa7은 L-히스티딘이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile 또는 Lys이며; Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이고; Xaa22는 Gly 또는 Glu이며; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이고; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이고; Xaa34는 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa35는 Gly이고; Xaa36은 Arg, Lys 또는 아미드이거나 존재하지 않으며; Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Lys 또는 아미드이거나 존재하지 않음]; 또는
f) 상기 a)?e)에 의한 펩티드 중 임의의 것과의 동일성이 80% 이상인 펩티드.
제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 신경 보호 인자 및/또는 이의 단편이나 변이체는 성분 (I) 및 (II)를 포함하는 GLP-1 융합 펩티드 또는 이의 단편이나 변이체이고,
상기 성분 (I)의 N-말단은 다음과 같은 서열들을 포함하거나 이것으로 이루어진 펩티드 군으로부터 선택되고:
a) GLP-1(7?35, 7?36 또는 7?37) 서열, 또는
b) 서열 번호 1에 의한 서열; 또는
c) 하기 화학식 II에 의한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 펩티드:
[화학식 II]
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37
[상기 식 중, Xaa7는 L-히스티딘이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile 또는 Lys이며; Xaa16은 Val 또는 Leu이고; Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이며; Xaa19는 Tyr 또는 Gln이고; Xaa20은 Leu 또는 Met이며; Xaa22는 Gly 또는 Glu이고; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이며; Xaa25는 Ala 또는 Val이고; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa27은 Glu 또는 Leu이고; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이며; Xaa33은 Val 또는 Lys이고; Xaa34는 Lys, Glu, Asn 또는 Arg이며; Xaa35는 Gly이고; Xaa36은 Arg, Gly, Lys 또는 아미드이거나, 존재하지 않으며; Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys 또는 아미드이거나, 존재하지 않음]
; 또는
d) 하기 화학식 III에 의한 서열을 포함하거나 이것으로 이루어진 펩티드:
[화학식 III]
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37
[상기 식 중, Xaa7은 L-히스티딘이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile 또는 Lys이며; Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이고; Xaa22는 Gly 또는 Glu이며; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이고; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이고; Xaa34는 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa35는 Gly이고; Xaa36은 Arg, Lys 또는 아미드이거나 존재하지 않으며; Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Lys 또는 아미드이거나 존재하지 않음]; 또는
e) 상기 a)?d)에 의한 서열 중 임의의 것과의 서열 동일성이 80% 이상인 서열; 또한,
상기 성분 (II)의 C-말단은 9개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩티드 서열, 또는 이의 기능상 단편이나 변이체로부터 선택되는 것인 세포.
제11항에 있어서, 상기 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (II)는 다음과 같은 펩티드로부터 선택되는 것인 세포:
a) 서열 번호 22(RRDFPEEVAI), 서열 번호 27(DFPEEVAI), 서열 번호 28(RDFPEEVA), 또는 서열 번호 29(RRDFPEEV), 서열 번호 30(AADFPEEVAI), 서열 번호 31(ADFPEEVA), 또는 서열 번호 32(AADFPEEV)에 의한 서열, 또는 이 서열 번호 22, 27, 28, 29, 30, 31 또는 32에 의한 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 서열을 함유하는 펩티드 서열; 또는
b) 서열 번호 23(RRDFPEEVAIVEEL) 또는 서열 번호 24(RRDFPEEVAIAEEL), 또는 서열 번호 33(AADFPEEVAIVEEL) 또는 서열 번호 34(AADFPEEVAIAEEL)에 의한 서열, 또는 이 서열 번호 23, 24, 33 또는 34에 의한 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 서열을 함유하는 펩티드 서열; 또는
c) 서열 번호 2(RRDFPEEVAIVEELG), 서열 번호 3(RRDFPEEVAIAEELG), 서열 번호 35(AADFPEEVAIVEELG), 또는 서열 번호 36(AADFPEEVAIAEELG)에 의한 서열, 또는 상기 서열 번호 2, 3, 35 또는 36에 의한 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 서열을 함유하는 펩티드 서열.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 GLP-1 융합 펩티드의 성분 (I) 및 성분 (II)는 직접 결합하고 있거나, 링커 서열에 의해 결합하고 있는 것인 세포.
제11항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 GLP-1 융합 펩티드는 대안적으로나 부가적으로 성분 (I), (II) 및 (III)을 함유하고, 만일, 상기 성분 (I)과 (III)이 융합 단백질 내에 존재하면, 상기 성분 (III)은 상기 성분 (I)의 C-말단과 결합할 수 있고/있거나 성분 (I)의 N-말단과 결합할 수 있거나, 또는 만일, 상기 성분 (I), (II) 및 (III)이 융합 단백질 내에 존재하면, 상기 성분 (III)은 상기 성분 (II)의 C-말단과 결합할 수 있으며/있거나 상기 성분 (I)의 N-말단과 결합할 수 있는 것인 세포.
제14항에 있어서, 상기 성분 (III)은 4개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 10개 이상의 부가 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 20개 이상의 아미노산 잔기, 또는 가장 바람직하게는 30개 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나, 또는 상기 성분 (III)은 다음과 같은 서열 또는 펩티드 a)?e)의 부가 아미노산 잔기를 4개 이상, 바람직하게는 10개 이상, 더욱 바람직하게는 20개 이상 포함하고:
a) 프로글루카곤 내 GLP-2의 N-말단 서열, 또는
b) GLP-1(5?37, 6?37 또는 7?37) 서열; 또는
c) 하기 화학식 II에 의한 서열을 포함하는 펩티드:
[화학식 II]
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37
[상기 식 중, Xaa7는 L-히스티딘이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile 또는 Lys이며; Xaa16은 Val 또는 Leu이고; Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이며; Xaa19는 Tyr 또는 Gln이고; Xaa20은 Leu 또는 Met이며; Xaa22는 Gly 또는 Glu이고; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이며; Xaa25는 Ala 또는 Val이고; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa27은 Glu 또는 Leu이고; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이며; Xaa33은 Val 또는 Lys이고; Xaa34는 Lys, Glu, Asn 또는 Arg이며; Xaa35는 Gly이고; Xaa36은 Arg, Gly, Lys 또는 아미드이거나, 존재하지 않으며; Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Pro, Lys 또는 아미드이거나, 존재하지 않음]
; 또는
d) 하기 화학식 III에 의한 서열을 포함하는 펩티드:
[화학식 III]
Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37
[상기 식 중, Xaa7은 L-히스티딘이고; Xaa8은 Ala, Gly, Val, Leu, Ile 또는 Lys이며; Xaa18은 Ser, Lys 또는 Arg이고; Xaa22는 Gly 또는 Glu이며; Xaa23은 Gln, Glu, Lys 또는 Arg이고; Xaa26은 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa30은 Ala, Glu 또는 Arg이고; Xaa34는 Lys, Glu 또는 Arg이며; Xaa35는 Gly이고; Xaa36은 Arg, Lys 또는 아미드이거나 존재하지 않으며; Xaa37은 Gly, Ala, Glu, Lys 또는 아미드이거나 존재하지 않음]; 또는
e) 상기 a)?d)에 의한 서열 중 임의의 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 서열; 또는
상기 성분 (III)은 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 의한 서열, 또는 서열 번호 4 또는 서열 번호 5에 의한 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 서열을 함유하거나 포함하는 것인 세포.
제2항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 GLP-1 융합 펩티드는 성분 (IV)로서 담체 단백질 특히, 트랜스페린이나 알부민을 추가로 함유하거나 포함하는 것인 세포.
제2항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 GLP-1 융합 펩티드는 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 26, 서열 번호 37, 서열 번호 38, 서열 번호 39, 서열 번호 40, 서열 번호 41, 서열 번호 42, 서열 번호 43, 서열 번호 44, 서열 번호 45, 서열 번호 46, 서열 번호 47 또는 서열 번호 48에 의한 서열, 또는 이 서열 번호 6, 7, 8, 10, 11, 12, 26 또는 37?48에 의한 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 서열로부터 선택된 펩티드 서열을 포함하거나, 이것으로 이루어진 것인 세포.
제1항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구형 마이크로캡슐의 코어 내 세포는 항 세포 고사 인자, 성장 인자, VEGF 및 에리트로포이에틴(EPO), 항 혈소판 약물, 항 응고 인자 약물 및 항 혈소판 약물로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자를 추가로 분비하고/분비하거나, 캡슐을 통하여 치료학적 수준으로 방출되는 측분비 인자로서 VEGF, IL-6, IL-8, GDNF, NT3 및 MCP1으로부터 선택되는 내인성 단백질 또는 펩티드를 분비하도록 조작되었으며/조작되었거나, 자살 유전자(suicide gene)를 추가로 함유하도록 조작된 것인 세포.
제1항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, 안 질병 및 안 질환은 망막 색소 변성증(RP), 황반 변성증(MD), 노인성 황반 변성증(AMD 또는 ARMD), 망막 병증, 당뇨병성 망막 병증, 황반 부종, 혈관 내피 세포 및 주연 세포의 이상, 망막 혈관 폐색증, 녹내장(섬유주대 발생 녹내장 포함), 및 시신경 병증(섬유주대 변성증 포함), 및 각막 내피 세포의 이상 증상으로부터 선택되는 망막 질병을 포함하는, 망막 변성에 의해 유발되는 안 질병 및 안 질환, 안 내 혈관 신생, 맥락막 혈관 신생, 황반 변성증으로 인한 맥락막 혈관 신생, 영속성 및 재발성 맥락막 혈관 신생, 히스토플라스마증 및 병리적 근시로 인한 맥락막 혈관 신생, 혈관양선조, 전방 허혈성 시신경병증, 박테리아성 심내막염, 베스트병, 버드샷 망막 맥락막증(birdshot retinochoroidopathy), 맥락막 혈관종, 맥락막 모반, 맥락막 비관류, 맥락막 골종, 맥락막 파열, 맥락막 결여, 만성 망막 박리, 망막의 안검 홍채 맥락막의 선천적 결손, 결정체 생성, 내인성 칸디다 내 안구염, 망막 색소 상피 세포의 외부 유두형 과오종, 황반안저, 특발성 황반 홀(idiopathic macular hole), 악성 흑색종, 막성 증식성 사구체 신염(제II형), 금속성 안구 내 이물, 나팔꽃 디스크 증후군, 다발성 조락성 백반 증후군(MEWDS), 거상연, 수술 현미경 범(operating microscope bum), 시신경 헤드 핏(optic nerve head pit), 광 응고술, 천공 내 맥락막 병증, 풍진, 유육종증, 포행성 또는 지도형 맥락 망막 병증, 망막 하 액 배출(subretinal fluid drainage), 측만 디스크 증후군(tilted disc syndrome), 탁소플라스마 맥락 망막염, 결핵 또는 보그트-고야나기-하라다 증후군(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)으로 인한 맥락막 혈관 신생, 당뇨병성 망막 병증, 비 당뇨병성 망막병증, 분지 정맥 폐색증, 중심 망막 정맥 폐색증, 미성숙 유아의 망막 병증, 홍채 신생 혈관, 신생 혈관 녹내장, 중심와 주변 모세 혈관 확장증, 겸상 적혈구 망막 병증, 일스병(Eale's disease), 망막 혈관염, 본 힙펠 린도병(Von Hippel Lindau disease), 방사선 망막 병증, 망막 냉동 손상, 망막 색소 변성증, 맥락 망막성 안검 홍채 맥락막의 선천적 결손으로 인한 혈관 신생, 헤르페스 심플렉스 각막염, 각막 궤양, 각막 이식술, 프테리가이아(pterigyia) 또는 외상으로 인한 각막 혈관 신생으로 인한 안 질병을 포함하는 것인 세포.
제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 구형 마이크로캡슐은 치료 대상인 환자의 눈에 있는 투여 부위(눈의 조직이나 영역 포함(치료 대상인 환자의 눈에 있는 발병 영역 또는 조직 포함(망막, 홍채 또는 홍채로부터 2?3㎜ 떨어진 부위나 영역 포함(결막과 공막이 약간 틀어진 부위의 뒤에 있는 홍채로부터 2?3㎜ 떨어진 부위나 영역 포함)))), 눈의 유리체 강, 눈이나 망막의 임의의 표면, 홍채 또는 홍채 조직 또는 이의 주변 영역, 전실, 수정체 낭 주머니, 망막 하 공간(subretinal space), 맥락 위 공간(suprachoroidal space), 눈의 내부 또는 눈의 임의의 강(cavity)에 이식되거나 주사되는 것인 세포.