KR20120021853A

KR20120021853A - 세포치료제의 생체 내 이동 및 생착을 증진시키는 펩타이드의 신규한 용도

Info

Publication number: KR20120021853A
Application number: KR1020100080447A
Authority: KR
Inventors: 이학모; 박경수; 정혜승
Original assignee: 서울대학교병원
Priority date: 2010-08-19
Filing date: 2010-08-19
Publication date: 2012-03-09

Abstract

본 발명은 세포치료제의 생체 내 생착을 증가시키는 펩타이드에 관한 것으로, 더 구체적으로 상기 펩타이드는 생착 증진용 양이온성 항균 펩타이드인 것을 특징으로 한다. 본 발명의 양이온성 항균 펩타이드는 치료용 세포 (세포치료제)의 생착 관련 수용체 및 부착분자의 기능을 향상시킬 수 있기 때문에, 이러한 펩타이드를 이용할 경우 임플란트되거나 이식된 세포치료제가 목표장기 (골수, 손상조직, 림프절, 종양조직 등)에 생착되는 비율을 현저히 증가시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 펩타이드는 생체 내 생착 기능을 증가시키는 신규용도로 세포치료제를 사용하여 치료되는 다양한 질병의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포치료제의 생체 내 이동 및 생착을 증진시키는 펩타이드의 신규한 용도{Novel application of peptides in the field of cell therapy}

본 발명은 세포치료제의 생체 내 생착 증진의 용도로 사용하기 위한 펩타이드에 관한 것이다.

세포치료제란 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic), 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식?선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 말한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다.

이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 “줄기세포 치료제”이며, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 “면역세포 치료제”로 분류할 수 있다.

줄기세포이식은 최근 장기손상의 치료를 위한 분야에서 조직재생을 위한 방법으로 제시되고 있다. 그 구체적인 예로 조혈모세포의 이식은 골수의 기능을 정상화시킬 수 있는 유일한 치료수단으로 인식되고 있다. 조혈모세포의 경우 생체 내에서 골수 내 생착에 필요한 수용체 (예, CXCR4)와 다양한 부착분자 (예, integrins, selectins)를 발현하고 있으며, 생체에 이식된 조혈모세포는 병적인 골수가 제거된 환자의 골수에서 발현이 증가되는 케모카인 (SDF-1)에 반응하여 골수에 생착하는 것으로 알려져 있다.

줄기세포의 생체 내 순환에는 다양한 종류의 수용체 및 부착분자가 관여하는 것으로 알려져 있다. 줄기세포에서 생체 내 생착과 관련되어 대표적으로 연구된 수용체인 CXCR4는 seven- transmembrane domain 구조를 하고 있으며, G-단백질과 결합되어 있다. CXCR4는 손상된 조직 또는 골수 내 기질세포에서 발현되는 SDF-1에 반응하는 수용체로 대부분의 줄기세포에서 발현되고 있으며 이 수용체의 발현이 억제되거나 단백분해 효소 (protease)에 의하여 파괴되었을 때 혈중으로 유리되는 것으로 알려져 있다.

따라서 줄기세포 치료제의 이식을 통한 손상조직의 재생 및 기능회복을 촉진하기 위해서는, 줄기세포에서 발현되는 생착 관련 수용체 및 부착분자의 기능을 강화시킴으로써 생체 내에 안정적으로 생착을 유도하여야 한다.

면역세포는 전신을 순환하며 생체의 면역반응을 조절하는 세포로 이들 면역세포들은 생체를 순환하며 일련의 세포성 면역반응을 매개함으로써 면역반응의 억제 또는 항진을 조절하여 생체의 항상성 유지에 관여한다. 일련의 세포성 면역반응이 일어나기 위해서는 말초 림프절에서 특정 항원을 T 세포에 인식시키는 과정 (antigen presentation process, 항원 제시 과정)을 거치게 되는데, 이 과정은 수지상 세포 (dendritic cells, DC)가 주요하게 관여한다. 말초 조직에 존재하는 미성숙 수지상 세포는 외부의 항원을 만나면 그 항원과 결합하여 활성화된 후 말초 림프절로 이동함으로써 미성숙 림프구 (naive T cell)에 인식시키는 역할을 한다. 정상 상태에서 항원에 의하여 감작된 수지상 세포는 수입 림프관을 통해 말초 림프절로 이동하고, 이 과정 중에 MHC (major histocompatibility complex) 클래스 2 및 공동 자극 분자 (co-stimulatory molecules)의 발현이 상향조절 (up-regulation)된다. 또한 인터루킨-12 (IL-12)와 같은 염증성 사이토카인 (inflammatory cytokine)을 분비하는 잠재적인 항원 제시 세포 (antigen presenting cells (potent APC))가 되어, 말초 림프절에서 미성숙 T 세포(naive T cell) 및 B 세포를 감작시킨다. 따라서 생체 외에서 특정 항원을 탑재하도록 조작된 활성화된 수지상 세포를 이용한 감염의 치료, 백신, 종양의 치료에 대한 면역세포 치료제 연구 및 자연살해 T 세포 (NK T cells)세포와 같은 면역세포 치료제를 이용한 종양의 치료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

다른 한 편 특정 항원을 탑재하고 있는 미성숙 수지상 세포의 경우 MHC 클래스 2, 및 공동 자극분자의 발현이 면역세포를 감작시키기에 충분하지 못해 면역세포의 활성화를 유도하지 못하고 항원에 대한 면역반응을 억제하는 세포 (regulatory T cell)를 유도하게 된다. 이러한 미성숙 수지상 세포는 자가면역질환 및 장기이식분야에서 면역반응을 억제 및 조절하는 면역세포 치료제로 활발히 연구되고 있다. 그러나 면역세포 치료제의 경우도 줄기세포 치료제와 마찬가지로 이식량에 따라 연구 성과가 일관되지 못하기 때문에 그 효과가 만족스럽지 못하다.

면역세포의 생체 내 순환에는 50여종 이상의 케모카인 수용체 및 부착분자가 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 케모카인 수용체는 seven- transmembrane domain 구조를 하고 있으며, G-단백질과 결합되어 있고 IP3/DAG 경로를 통하여 신호를 전달한다. 케모카인 수용체 7 (Chemokine receptor 7; 이하, CCR7 이라 함)은 림프조직으로의 단핵세포의 귀환 (homing)과 관련이 있다 (Sallusto F. et al., Immunol Rev. 177:134-40, 2000). CCR7은 B 및 T 림프구와 성숙 수지상 세포에서 발현된다 (D’Ambrosio D et al., J Immunol Methods 273:3-13, 2003). CCR7은 케모카인 C 리간드(CCL) 19 및 CCL21의 두 종류의 리간드를 가지고 있다 (Richmond A. Nat Rev Immunol 2:664-74, 2002). 상기 리간드는 정맥의 내피세포, 수입림프관 및 림프절에서 높게 발현된다 (Baekkevold ES. et al., J Exp Med 193:1105-12, 2001; GunnMD et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:258-63, 1998).

따라서 면역세포 치료제의 이식을 통한 면역반응 조절의 극대화를 위해서는 생체내로 주입된 면역세포 치료제가 목표 장기 (예, 말초 림프절, 종양조직 등)에 도달하고 머물도록 함으로써 가능하다. 즉, 면역세포 치료제의 생체 내 생착에 관여하는 수용체 (CCR7) 및 부착분자의 기능을 향상시킴으로써 가능하다.

이와 같이 세포치료제의 임상적용에 있어 대두되고 있는 문제는 무엇보다도 면역학적으로 적합한 줄기세포 또는 면역세포를 충분한 양만큼 확보하여 수혜자에게 투여하는 것이다. 하지만 세포치료제의 생체 외 증식, 분화에 대한 연구에도 불구하고 아직까지 충분한 양의 세포치료제를 확보하는 것은 매우 어려우며 충분한 양의 세포치료제를 확보하였더라도 과도한 양의 세포치료제가 생체 내에서 유발할 수 있는 부작용, 합병증 등 안전성에 대한 문제로 세포치료제에 의한 질병의 예방 치료효과를 기대하기 어려운 상황이다.

따라서 세포치료제의 효과를 극대화하기 위해서는 세포치료제의 이식 후 수혜자의 생체 내 목표장기에 효과적으로 전달, 생착시키는 것이 필요하다. 이를 위해서는 각각의 목표장기 (손상된 조직, 림프절, 종양조직) 혹은 목표장기 주변의 기질에서 발현되는 특정 리간드에 대한 세포의 반응성을 향상시킴으로써 세포치료제의 효과를 극대화 할 수 있다.

한편 지질 래프트 (Lipid raft)는 콜레스테롤 (cholesterol)과 스핑고리피드 (sphingolipid)를 주성분으로 하는 세포막 상의 마이크로도메인 (microdomain)으로 다양한 신호 전달물질이 모이게 되는 신호전달 플랫폼 (signaling platform)의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 최근의 연구들은 G단백질 연결 수용체 (G-proteein coupled receptor) 및 부착분자들이 세포에 존재하는 지질 래프트에 위치함으로써 그 기능이 향상될 수 있음을 보여주었다 (Leitinger B et al. J Cell Sci. 2002;115:963-72).

이에 본 발명자들은 세포치료제의 생체 내 생착과 관련하여 세포에 존재하는 수용체 및 부착분자들을 지질 래프트에 위치하도록 촉진하는 물질이, 세포치료제의 생체 내 생착을 향상시킬 수 있다는 점에 착안하여 연구를 수행한 결과, 본 발명의 펩타이드가 줄기세포 및 면역세포의 생착에 관여하는 수용체 및 부착분자의 기능을 향상시켜, 세포치료제의 생체 내 주입 후 목표장기로의 귀환 및 생착을 증진시킬 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 세포치료제의 생체 내 생착을 증가시키는 생착 증진용 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은

생착 기능이 증가된 세포치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은

양이온성 항균 펩타이드를 용매에 용해시키는 단계;

상기 용액에 세포치료제를 침지시키는 단계를 포함하는 생착 기능이 증가된 세포치료제 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세포치료제의 생체 내 생착 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 펩타이드, 더 구체적으로는 양이온성 항균 펩타이드는 치료용 세포 (세포치료제)의 생착 관련 수용체 및 부착분자의 기능을 향상시킬 수 있기 때문에, 이러한 양이온성 항균 펩타이드를 이용할 경우 임플란트되거나 이식된 세포치료제의 목표장기 (골수, 손상조직, 림프절, 종양조직 등)에 생착되는 비율을 현저히 증가시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 양이온성 항균 펩타이드는 생체 내 생착 기능을 증가시키는 신규 용도로 세포치료제를 사용하여 치료되는 다양한 질병의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 생착 기능이 증가된 세포치료제는, 일반 세포치료제와 비교하여 목표장기에 생착되는 비율이 현저히 높기 때문에 적은 양의 세포치료제로도 치료 효과를 극대화시킬 수 있다.

또한 본 발명의 세포치료제 제조방법은 양이온성 항균 펩타이드로 처리하는 과정만을 통하여 세포치료제의 생착 기능을 증가시키기 때문에 세포치료제의 생체 외 조작을 최소화할 수 있다.

또한 본 발명의 세포치료제의 생체 내 생착 증진용 조성물은 세포치료제의 생체 내 생착을 증가시킬 수 있으므로, 이를 이용할 경우 소량의 유효세포만을 이식에 사용하도록 함으로써 다량의 세포치료제 이식에 의한 부작용을 최소화할 수 있다.

도 1은 본 발명의 양이온성 항균 펩타이드의 작용기전을 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 양이온성 항균펩타이드를 처리한 세포치료제의 생착에 관여하는 CXCR4과 CCR7의 지질 래프트 (lipid raft) incorporation 촉진 평가를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 양이온성 항균 펩타이드에 의한 줄기세포 치료제의 SDF-1에 대한 유주성 항진평가를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 양이온성 항균 펩타이드에 의한 면역세포 치료제의 CCL21에 대한 유주성 항진평가를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 양이온성 항균 펩타이드에 의한 세포치료제의 부착 (adhesion) 항진평가를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 양이온성 항균 펩타이드로 처리된 골수유래 줄기세포 치료제의 생체 내 생착 증진 및 기능회복 향상효과에 대한 평가를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 양이온성 항균펩타이드로 처리된 면역세포 치료제에 의한 생체 내 면역반응 조절 증진효과에 대한 평가를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 양이온성 항균 펩타이드의 세포치료제에 대한 세포독성을 평가한 그래프이다.

상기 펩타이드는 양이온성 항균 펩타이드이며, 세포치료제의 생체 내 생착을 증가시키는 새로운 용도를 갖는다.

먼저, 양이온성 항균 펩타이드에 대해서 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

양이온성 항균 펩타이드는 생체방어 메커니즘에 의해 방출되는 4~5 kDa의 작은 분자량을 갖는 자연 단백질로 인체의 다양한 조직에서 발견되고 있으며 특히 과립구에서의 발현이 현저한 것으로 알려져 있다 (Chung et al. Infect Immun. 2004;72:352). 양이온성 항균 펩타이드는 세균 (bacteria), 진균 (fungi), 바이러스 (viruses)와 같은 원핵생물 (prokaryote)의 생체막을 파괴함으로써 국소적인 감염을 방어하는 물질로 알려져 있다 (Ganz T et al., Curr. Opin. Immunol. 1994;6:584-589). 양이온성 항균 펩타이드는 양친매성 구조를 가지는 데, 특히 양이온 부위가 원핵생물의 세포막이 가지고 있는 음이온성 인지질에 결합하는 원리에 의해 항균활성을 나타내지만 진핵생물 (eukaryotes)의 세포막에 미치는 영향에 대한 연구는 매우 미미하다.

양이온성 항균 펩타이드는 구조적인 특징에 따라 단일 또는 여러 이황화 결합을 포함하는 시스테인들을 포함하는 베타 병풍구조 (beta-sheet)를 형성하는 펩타이드, 알파 나선구조 (alpha-helices)를 형성하는 펩타이드, 특정 아미노산을 포함하는 펩타이드의 세 그룹으로 분류할 수 있다.

대표적인 양이온성 항균 펩타이드로는 디펜신 (defensin)과 카텔리시딘 (cathelicidin)이 있으며 최근에는 인간은 물론, 설치류, 해양생물 등으로부터 유사한 항균효과를 갖는 양이온성 펩타이드의 존재가 밝혀지고 있다. 더욱 최근에는 이러한 양이온성 항균 펩타이드의 발현감소로 인해 아토피성 피부염 환자의 피부에 포도상 구균(S. aureus)이 비정상적으로 증식한다는 것이 보고되었다 (Ong P. Y. et al., N. Engl. J. Med. 2002;347:1151-1160). 디펜신에는 α-디펜신과 β-디펜신이 있다. β-디펜신은 생체 내 과립세포 (PMNCs)는 물론 피부, 폐, 기관, 신장, 생식기 등의 점막 상피에서 발현, 분비되는 펩타이드로 현재까지 인간유래 β-디펜신으로 β-디펜신-1(hBD-1), hBD-2, hBD-3, hBD-4, hBD-5 및 hBD-6이 잘 알려져 있다 (Biochemistry and Molecular Biology News, 1-7, 2006).

본 발명의 양이온성 항균 펩타이드는 단일 또는 여러 이황화 결합을 포함하는 시스테인들을 포함하는 베타 병풍구조 (beta-sheet)를 형성하는 펩타이드, 알파 나선구조 (alpha-helices)를 형성하는 펩타이드, 특정 아미노산을 포함하는 펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 펩타이드일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 양이온성 항균 펩타이드는 인간유래 hBD-2이며, 이의 아미노산 서열은 서열번호 1로 나타낸다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 양이온성 항균 펩타이드는 인간 LL-37이며, 이의 아미노산 서열은 서열번호 2로 나타낸다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 양이온성 항균 펩타이드는 인간유래 hBD-2 및 인간 LL-37의 혼합물이다.

본 발명의 양이온성 항균 펩타이드는 세포치료제의 생체 내 생착을 증가시키는 기능 (용도)을 갖는다.

본 발명에서 ‘생착’이란 임플란트되거나 이식된 치료용 세포 (세포치료제)가 일정 시간이 경과한 후에도 목표장기 (골수, 손상된 장직, 말초림프절, 종양조직 등)에 머무르면서 치료용 세포의 수가 지속되거나 증식되는 현상을 의미한다.

상기 세포치료제는 치료용으로 사용될 수 있는 세포이면 이를 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 줄기세포 또는 면역세포일 수 있다.

본 발명에서 ‘줄기세포’란 특정 조건에서 다른 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 갖으며 장기부전, 장기기능 회복, 손상된 장기의 재생을 위하여 미분화상태 혹은 분화가 유도된 상태로 인체에 주입되는 세포로 배아줄기세포, 역분화 줄기세포, 핵치환 줄기세포, 성체유래 줄기세포를 포함하는 개념이다.

본 발명에서 ‘미분화 상태의 줄기세포’란 특정 리니지의 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 갖는 줄기세포로 생체 내 주입 후 생착된 주위환경의 영향을 받아 생체 내 분화를 목적으로 투여되는 줄기세포를 의미한다.

본 발명에서 ‘분화가 유도된 줄기세포’란 생체 내 투여 전 생체 외에서 특정한 처리를 통해 특정한 세포 (예, 혈관내피세포, 심근세포, 췌장 베타세포 등)로 분화된 세포를 의미한다.

본 발명에서 ‘성체유래 줄기세포’란 골수, 고환, 난소, 지방조직을 포함한 인체조직, 동원된 말초혈액으로부터 분리 배양된 세포로 바람직하게는 조혈모세포, 중간엽줄기세포, 혈관내피전구세포를 포함하며 내배엽 전구세포, 중배엽 전구세포, 외배엽 전구세포를 포함하는 개념이다.

본 발명에서 ‘동원된 말초혈액’이란 줄기세포를 말초혈액으로 동원시키기 위한 일련의 검증된 처치를 가한 뒤 순환하는 혈액을 의미하는 것으로 G-CSF, AMD3100, 혹은 이들의 혼합투여를 통해 동원이 가능하지만 바람직하게는 그 이외 골수유래 줄기세포를 말초혈액으로 유리시키는 모든 처치 이후 회수된 말초혈액을 포함하는 개념이다.

본 발명의 양이온성 항균 펩타이드는 줄기세포에서 발현되는 생착 관련 수용체 CXCR4와 부착분자의 기능을 향상시킴으로써 손상된 조직 (목표장기)에 줄기세포의 생착을 증가시킬 수 있으며, 이를 통해 손상된 조직의 재생을 극대화 할 수 있다.

본 발명에서 ‘면역세포’란 면역반응 조절 및 억제를 목표로 하는 특정 항원을 탑재한 미성숙 수지상 세포, 면역반응 항진을 목표로 특정 항원을 탑재한 성숙 수지상 세포와 자연살해세포를 포함하는 개념이다.

면역반응의 항진은 면역반응을 항진시키는 활성을 가지는 세포치료제 (예, 특정 항원이 탑재된 활성화된 수지상 세포, 자연살해 T 세포)는 세포 수용체 (CCR7, CXCR4) 및 부착분자 (integrin, selectin)에 의해 수입림프관, 림프절 혹은 종양조직으로 이동되어 항원제시과정을 항진하거나 직접적으로 세포의 사멸을 유도하는 기작에 의해 유발된다. 면역반응의 억제는 면역반응을 억제하는 활성을 가지는 세포치료제 (예, 특정항원을 탑재한 미성숙 수지상 세포)가 세포 수용체 (CCR7, CXCR4) 및 부착분자 (integrin, selectin)에 의해 수입림프관 및 림프절로 이동되어 항원제시과정을 억제하는 기작에 의해 유발된다.

상기 면역반응을 항진하는 활성을 가지는 세포치료제로는 특정 항원을 탑재한 성숙 수지상 세포, 자연살해 T 세포 등이 있으며, 상기 면역반응을 억제하는 활성을 가지는 세포치료제로는 특정 항원을 탑재한 미성숙 수지상 세포, 중간엽 줄기세포 등이 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

본 발명의 양이온성 항균 펩타이드는 세포성 면역반응 조절활성을 가진 세포 (면역세포)의 세포 수용체 CCR7과 부착분자의 기능을 향상시킴으로써 목표 장기 (림프관, 림프절 혹은 종양조직)에 면역세포의 이동 및 생착을 증가시킬 수 있어 면역반응 조절을 극대화할 수 있다.

본 발명은 또한 생착 기능이 증가된 세포치료제를 제공한다.

본 발명의 생착 기능이 증가된 세포치료제는 줄기세포 또는 면역세포와 같은 세포치료제에 양이온성 항균 펩타이드를 처리하는 과정을 통하여 제조할 수 있다.

본 발명은 또한

(a) 양이온성 항균 펩타이드를 용매에 용해시키는 단계;

(b) 상기 용액에 세포치료제를 침지시키는 단계를 포함하는 생착 기능이 증가된 세포치료제 제조방법을 제공한다.

상기 (a)단계에서, 양이온성 항균 펩타이드는 이를 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 LL-37, hBD-2 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

상기 (a)단계에서, 양이온성 항균 펩타이드를 용해시키는 용매는 양이온성 항균 펩타이드의 기능을 손상하지 않는 한 이를 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 식염수와 같은 등장성 수용액, 완충액 또는 현탁액일 수 있다.

상기 (b)단계에서, 세포치료제는 치료용으로 사용될 수 있는 세포이면 이를 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 줄기세포 또는 면역세포일 수 있다.

상기 (b)단계에서, 용액에 세포치료제는 침지시키는 시간은 바람직하게는 10 내지 60분일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 10 내지 30분이다.

또한 상기 (b)단계 이후 추가로 세정 과정을 더 포함할 수 있다.

상기 세정단계에서는 배지, 주사용 식염수, 버퍼 등과 같은 수용액을 사용하여 10 내지 30분간 세정할 수 있다.

다만 양이온성 항균 펩타이드가 생체에 무해한 만큼 본 과정은 필수단계가 아니므로 생략이 가능하다.

본 발명은 또한

상기 생착 증진용 조성물은 세포치료제와 혼합하여 생체 내 이식함으로써 세포치료제의 생체 내 생착을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 세포치료제 자체에 본 조성물을 처리한 후 생착 기능이 증가된 세포치료제를 생체 내 이식하는 방법으로도 사용될 수 있다.

상기 펩타이드는 바람직하게는 양이온성 항균 펩타이드이다.

상기 양이온성 항균 펩타이드는 이를 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 LL-37, hBD-2 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

본 발명에 따른 생착 증진용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. ‘약학적으로 허용되는’이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 생착 증진용 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 액상, 파우다, 젤 상태로 제조될 수 있다. 특별이 이를 한정하는 것은 아니나, 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하며 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 양이온성 항균 펩타이드를 식염수 또는 완충액에 용해시켜 제형화할 수 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 생착 증진용 조성물은 유효량으로 세포치료제의 이식 전 다양한 방법으로 세포치료제에 적용될 수 있다.

상기에서 ‘유효량’이란 세포에 처리함에 있어 생체 내 생착을 촉진하는 효과를 나타내는 생착 증진용 조성물의 사용량을 말한다. 본 발명에 따른 생착 증진용 조성물의 사용량은 세포치료제의 종류, 세포치료제의 상태, 세포치료제의 투여 경로, 수혜자의 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 생착 증진용 조성물은 질환의 정도에 따라 양이온성 항균 펩타이드의 함량을 달리할 수 있으나, 통상적으로 정상 적용 용량의 1/5 내지 4 배인 20nM 내지 2000nM의 농도로 10 내지 60분간 처리할 수 있다.

본 발명은 또한 양이온성 항균 펩타이드 및 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 질환 치료용 조성물을 제공한다.

상기 생착 기능이 증가된 세포치료제는 치료용으로 사용되는 세포에 양이온성 항균 펩타이드를 처리하는 과정을 통하여 제조된 세포치료제를 의미한다.

상기 질환은 세포치료제로 치료 가능한 질환이면 이를 특별히 제한하지는 않는다.

예를 들어, 줄기세포 치료제를 적용할 수 있는 질환으로는 허혈성 장기손상, 허혈성 뇌손상, 장기기능 부전, 골수기능 부전, 백혈병, 조혈기능 부전, 물리적 장기손상, 신경손상, 제 1형 당뇨, 뇌졸증, 뇌성마비, 척추손상, 루게릭, 파킨슨병, 우울증, 간질, 다발성경화증, 조증, 근위축성 척수측색경화증, 알쯔하이머병, 선천성 대사성 신경계질환, 외상성 뇌손상, 관절연골 손상, 골관절염, 골다공증, 골연화증, 구루병, 섬유성 골염, 무형성 골질환, 대사성 골질환, 골용해, 백혈구 감소증, 뼈의 기형, 고칼슘혈증, 신경압박 증후군 등이 있다.

또한 면역세포 치료제를 적용할 수 있는 질환으로는 당뇨, 관절염, 탈모, 루프스, 건선, 피부염, 전신성공피증 및 경화증, 크론병, 궤양성 대장염, 호흡곤란증후군, 수막염, 뇌염, 포도막염, 대장염, 사구체신염, 알레르기, 습진, 천식, T 세포의 침윤에 관여하는 상태 및 만성 염증 반응, 죽상경화증, 백혈구 유착 결손, 전신성홍반성루푸스(SLE), 다발성 경화증, 라이노드 증후군, 자가면역 갑상선염, 알레르기성 뇌척수염, 쇼그렌 증후군, 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개된 급성 및 지연 과민성과 관련된 면역 반응, 결핵, 사르코이드증, 다발성근염, 육아종증, 맥관염, 악성 빈혈(애디슨병), 백혈구누출에 관여하는 질병, 중추신경계(CNS)염증장애, 다발성기관손상증후군, 용혈성빈혈, 중증근무력증, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항인지질 증후군, 알레르기성 신경염, 그레이브스병, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 수포성유천포창, 천포창, 자가면역 다내분비질환, 라이터병, 강직인간증후군, 베세트병, 거대세포동맥염, 면역복합체신염, IgA 신증, IgM 다발성신경장애, 면역혈소판감소성자반(ITP), 자가면역 혈소판감소증, 난소염, 자가면역질환, 골수 및 장기이식시 동반되는 면역거부반응, 종양 및 바이러스 또는 박테리아에 의한 감염증 등이 있다.

본 발명의 질환 치료용 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 유효성분인 양이온성 항균 펩타이드 및 세포치료제 외에 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 국소 투여용 제제 등이 포함된다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약제학적으로 허용할 수 있는 용매를 사용한 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 또한 약제학적으로 허용되는 담체 (멸균수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적당히 조합하여 일반적으로 인정되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화할 수 있다.

상기 제제는 통상의 방법에 따라 비경구적으로 투여될 수 있다. 상기 비경구 투여는 국부적 또는 전신적 투여를 포함한다. 상기 국부적 투여는, 직접적으로 병변 또는 그 주변에 투여하는 것, 예를 들면 병변 발생 주변 또는 그 반대쪽 부위에 직접 투여하는 것일 수 있다. 상기 전신적 투여는 척수액, 정맥 또는 동맥에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 질환 치료용 의약의 제조를 위한 상기 양이온성 항균 펩타이드 및 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 양이온성 항균 펩타이드 및 세포치료제를 유효 성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 치료상 유효량의 본 발명의 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하는 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 ‘포유동물’은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 ‘치료상 유효량’은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다.

본 발명의 치료방법에 있어서 본 발명의 세포치료제의 1일 투여량은 1×10²내지 1×10¹⁰세포/㎏일 수 있다. 투여 회수는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

실시예 1: 양이온성 항균 펩타이드에 의한 CXCR4 및 CCR7 의 지질 래프트 incorporation 항진평가

양이온성 항균 펩타이드의 처리에 의해 생착에 관여하는 대표적인 수용체인 CXCR4 와 CCR7의 지질 래프트 incorporation이 촉진되는지를 평가하였다.

양이온성 항균 펩타이드에 의한 줄기세포에서 발현되는 부착관련 수용체 CXCR4의 지질 래프트 incorporation 촉진 평가는 C57BL/6 마우스의 대퇴골로부터 분리한 Sca-1⁺ 세포를 이용하였다. 면역세포에서 발현되는 부착관련 수용체 CCR7의 지질 래프트 incorporation 촉진 평가는 C57BL/6 마우스의 비장 및 림프절로부터 분리된 림프구를 이용하였다. 각각의 세포는 기본배지 (10% FBS를 함유하고 있는 RPMI 1640)에 5x10⁷/㎖ 부유하였다. 부유된 세포는 1㎖씩 무처치 대조군, hBD-2 (최종농도 100 nM) 처리군, LL-37 처리군 (최종농도 500nM)의 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 10분간 배양한 뒤 1% Triton X-100, protease inhibitors (500μM PMSF, 5mM indoacetamide)를 함유하고 있는 MEB 버퍼 (150 mM NaCl, 20 mM MES, pH 6.5) 300㎕를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 lysis를 유도했다. 이후 300㎕의 80% 수크로오스를 첨가하여 혼합한 뒤 원심분리 튜브로 옮겼다. 이후 동일한 양의 30%, 5% 수크로오스를 차례로 조심스럽게 첨가하여 밀도경사를 형성시킨 뒤 100,000 ×g에서 17시간 원심분리하였다. 원심분리가 종료된 뒤 상층으로부터 11개의 fraction을 취하고 각각의 fraction에는 n-octylglucoside (최종 농도 60μM)를 첨가하여 지질 래프트를 용해시켰다. 이후 CXCR4 항체 (Serotec) 또는 CCR7 항체 (Abcam)를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.

그 결과 하기 도 2에 나타낸 바와 같이, 무처치 대조군의 경우 CXCR4와 CCR7이 지질 래프트에서 관찰되지 않은 반면 hBD-2 혹은 LL-37을 처리한 실험군의 CXCR4 및 CCR7은 지질 래프트 fraction에서 관찰되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 hBD-2 혹은 LL-37을 처리가 세포치료제의 생착에 관여하는 수용체 및 부착분자를 지질 래프트에 incorporation 시킴으로써 그 기능을 향상시킬 수 있음을 의미한다.

실시예 2: 양이온성 항균 펩타이드에 의한 CXCR4 의 기능향상 평가

본 발명의 양이온성 항균 펩타이드를 처리한 줄기세포 치료제에서 생체 내 생착에 중요한 CXCR4 의 기능을 향상시키는지 평가하였다

양이온성 항균 펩타이드에 의한 CXCR4의 기능향상을 평가는 C57BL/6 마우스의 대퇴골로부터 분리한 Sca-1+ 세포의 유주실험 (chemotaxis)을 이용하였다. 무처치 대조군은 기본배지 (0.5% BSA를 함유하는 RPMI 1640), hBD-2 처리군은 100 nM의 hBD-2를 함유하고 있는 기본배지, LL-37 처리군은 500 nM의 LL-37을 함유하고 있는 기본배지에 에 1x10⁶ 세포/㎖로 부유하였다. 유주실험은 5㎛의 pore를 갖는 trans-well을 이용하여 하층 well에는 기본배지, 50ng/㎖의 SDF-1을 함유하는 기본배지, hBD-2 (100nM)을 함유하는 기본배지, LL-37 (500nM)을 함유하고 있는 기본배지를 각각 650㎕씩 넣고 상단의 trans-well에는 각각의 준비된 골수유래 세포 100㎕를 첨가하였다. 이후 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 3시간 배양한 뒤 trans-well을 제거하고 하층으로 이동한 세포는 colony forming unit-granulocytes/macrophage (CFU-GM) 분석을 수행하였다.

CFU-GM 분석은 granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF, 최종농도 25 ng/ml)와 인터루킨 3 (IL-3, 10 ng/㎖)을 포함하고 있는 methylcellulose media (R&D Systems, Inc.)에 재부유한 뒤 6 well culture plate에 2㎖/well로 seeding 하였다. 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 7일간 배양한 뒤 inverted microscope를 이용하여 형성된 콜로니 수를 세고 무처치 대조군과 비교하였다. 결과는 무처치 대조군에서 관찰된 CFU-GM colony에 대한 배율 (fold increase)로 표시하였다.

그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이 무처치 대조군과 비교하여 hBD-2 혹은 LL-37을 처리한 실험군에서 SDF-1에 대한 골수유래 줄기세포의 이동이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 hBD-2 혹은 LL-37을 처리함으로써 골수유래 줄기세포의 생착에 관여하는 CXCR4의 기능이 향상됨을 의미한다.

실시예 3: 양이온성 항균 펩타이드에 의한 CCR7 의 기능향상 평가

본 발명의 양이온성 항균 펩타이드를 처리한 면역세포 치료제에서 생체 내 생착에 중요한 CCR7의 기능을 향상시키는지 평가하였다.

양이온성 항균 펩타이드에 의한 CCR7의 기능향상을 평가는 C57BL/6 마우스의 비장과 림프절로부터 분리한 림프구의 유주실험 (chemotaxis)을 이용하였다. 무처치 대조군은 기본배지 (0.5% BSA를 함유하는 RPMI 1640), hBD-2 처리군은 100nM의 hBD-2를 함유하고 있는 기본배지, LL-37 처리군은 500nM의 LL-37을 함유하고 있는 기본배지에 에 1x10⁷세포/㎖로 부유하였다. 유주실험은 5㎛의 pore를 갖는 trans-well을 이용하여 하층 well에는 기본배지, 200ng/㎖의 CCL21 (Peprotech)을 함유하는 기본배지, hBD-2 (100nM)를 함유하는 기본배지, LL-37 (500nM)을 함유하고 있는 기본배지를 각각 650㎕씩 넣고 상단의 trans-well에는 각각의 준비된 골수유래 세포 100㎕를 첨가하였다. 이후 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 3시간 배양한 뒤 trans-well을 제거하고 하층으로 이동한 세포는 형광물질이 붙어있는 CD4 항체로 염색한 뒤 유세포 분석기 (BD Pharmingen) 및 CellQuest 프로그램을 이용하여 CD4 T 세포의 수를 분석하고 무처치 대조군과 비교하였다. 결과는 무처치 대조군에서 관찰된 CD4 T 세포의 수에 대한 배율 (fold)로 표시하였다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이 무처치 대조군과 비교하여 hBD-2 혹은 LL-37을 처리한 실험군에서 CCL21에 대한 CD4 T 면역세포의 이동이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 hBD-2 혹은 LL-37을 처리함으로써 면역세포의 생착에 관여하는 CCR7의 기능을 향상시킴을 의미한다.

실시예 4: 세포치료제의 기질제포에 대한 부착 ( adhesion ) 평가

본 발명의 양이온성 항균 펩타이드를 처리한 줄기세포 치료제가 기질세포에 대한 부착 (adhesion)이 증가되는지 여부를 평가하였다.

양이온성 항균 펩타이드에 의한 세포치료제의 기질세포에 대한 부착능 향상 평가는 Balb/c 마우스의 골수로부터 분리 배양한 기질세포 (stromal cell)와 Sca-1+ 세포를 이용하였다. 먼저 기질세포는 기본배지 (10% FBS를 포함하고 있는 RPMI 1640)에 부유하여 6 well culture plate에 5x10⁵ 세포를 seeding 한 뒤 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 배양하였다. 골수유래 Sca-1⁺ 세포의 경우 무처치 대조군은 기본배지, hBD-2 처리군은 100nM의 hBD-2를 함유하고 있는 기본배지, LL-37 처리군은 500nM의 LL-37을 함유하고 있는 기본배지에 1x10⁶ 세포/㎖로 부유하였다. 배양된 기질세포를 PBS로 2회 세정한 뒤 준비된 Sca-1⁺ 세포 부유물을 2㎖씩 첨하고고 37 CO2 인큐베이터에서 5분간 배양한 뒤 상층액을 버리고 PBS로 2회 세정하여 부착하지 않은 Sca-1+ 세포를 제거하였다. 이후 0.25% Trypsin-EDTA용액을 이용하여 기질세포 및 기질세포에 부착된 Sca-1⁺ 세포를 culture plate에서 회수하고 PBS로 2회 세정 하였다. 회수된 세포는 실시예 2에서와 동일한 방법으로 CFU-GM 분석을 수행하였다.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이 무처치 대조군과 비교하여 hBD-2 혹은 LL-37을 처리한 실험군의 더 많은 Sca-1⁺ 세포가 기질세포에 부착되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 hBD-2 혹은 LL-37을 처리함으로써 골수유래 줄기세포의 생착에 관여하는 수용체 및 부착분자의 기능이 향상되었음을 의미한다.

실시예 5: 줄기세포 치료제의 생체 내 생착 증진 평가

본 발명의 양이온성 항균 펩타이드를 처리한 줄기세포 치료제가 정상 줄기세포 치료제와 비교하여 생체 내 생착이 촉진될 수 있는지를 평가하였다.

양이온성 항균 펩타이드에 의한 줄기세포 치료제의 생체 내 생착 증진 평가는 C57BL/6 마우스의 골수로부터 분리한 Sca-1⁺ 세포를 이용하였다. 골수유래 세포의 이식 전 1일에 8 주령의 C57BL/6 마우스에 950 cGy의 방사선을 조사하여 정상적으로 존재하는 골수내의 줄기세포를 모두 파괴하였다. 이식 당일 건강한 C57BL/6 마우스로부터 분리한 Sca-1⁺ 세포는 각각 기본배지 (RPMI 1640)에 5x10⁶ 세포/㎖로 부유한 뒤 아무런 첨가를 하지 않은 무처치 대조군, hBD-2의 최종농도가 100nM이 되도록 한 hBD-2 처리군, LL-37의 최종농도가 500nM이 되도록 한 LL-37 처리군으로 나누어 20분간 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이후 각각의 준비된 세포는 방사선이 조사된 마우스의 미정맥을 통해 200㎕씩 주입하였다.

이식된 줄기세포의 생체 내 생착 정도를 평가하기 위해, 이식 후 11일에 골수에 생착 된 줄기세포를 실시예 3과 동일한 방법으로 CFU-GM 세포의 수를 분석하였으며 (도 6 상단 좌측 참조) 비장에 형성된 콜로니의 수를 세어 그래프로 나타내었다 (도 6 상단 우측 참조). 줄기세포 이식에 의한 골수기능 회복은 줄기세포 이식 후 5, 7, 11, 16, 21, 28일에 안와정맥총으로부터 100㎕의 혈액을 채혈하여 백혈구의 수를 분석하여 그래프로 나타내었다 (도 6 하단 좌우 참조).

그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 무처치 대조군과 비교하여 hBD-2 혹은 LL-37을 처리한 실험군의 Sca-1⁺ 세포를 이식받은 마우스에서 단기간 (11일)에 골수 및 비장에 생착된 세포가 현저히 증가되었음을 확인하였다. 또한 세포치료제 이식후 조혈기능의 회복에 대한 평가결과 무처치 대조군과 비교하여 hBD-2 혹은 LL-37을 처리한 세포치료제를 이식받은 마우스에서 조혈기능의 회복이 현저히 앞당겨 짐을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 hBD-2 혹은 LL-37을 처리함으로써 골수유래 줄기세포의 생착을 향상시킬 수 있음을 의미한다.

실시예 6: 면역세포 치료제의 생체 내 생착 증진 평가

본 발명의 양이온성 항균 펩타이드를 처리한 면역세포 치료제가 면역반응을 보다 효과적으로 조절하여 장기이식에 의한 거부반응을 감소시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 양이온성 항균 펩타이드를 처리한 미성숙 수지상 세포를 수혜 마우스에 주입하고 동종 피부이식에 의한 거부반응을 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다.

양이온성 항균 펩타이드에 의한 면역세포 치료제의 생체 내 생착 증진 평가는 Balb/c 마우스의 골수로부터 분리하여 유도된 면역조절세포 (Balb/c의 항원을 탑재한 미성숙 수지상 세포)의 주입이 마우스에서 동종 피부이식에 의한 거부반응을 억제할 수 있는지를 평가하였다.

준비된 Balb/c 유래의 면역조절 세포는 기본배지 (RPMI 1640)에 5x10⁶ 세포/㎖ 로 부유한 뒤 아무런 첨가를 하지 않은 무처치 미성숙 수지상 세포(immature DC, iDC) 투여군, hBD-2의 최종농도가 100nM이 되도록 한 hBD-2 처리 iDC 투여군, LL-37의 최종농도가 500nM이 되도록 한 LL-37 처리 iDC 투여군으로 나누어 20분간 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 이후 각 실험군별로 8 주령의 수혜 마우스(C57BL/6) 10 마리에 1개체 당 200㎕ (1×10⁶ 세포)씩의 면역세포 치료제를 미정맥을 통해 주입하였다. 무처치 대조군에는 기본 동일한 양의 기본배지를 미정맥을 통해 주입하였다. 7일 후 피부이식을 위하여, 7~8주령의 Balb/c 마우스를 경추탈골한 후 꼬리의 피부를 회수하여 차가운 PBS 용액에 담가두었다. 상기 수혜 마우스는 전신마취하여 등의 털을 깍고 5×5의㎜ 피부를 제거하였다. PBS에 담겨져 있는 Balb/c 마우스의 피부를 5×5㎜의 크기로 준비하여 수혜 마우스의 등에 얹고 5-0 실크 봉합사로 봉합한 다음 붕대로 감아주었다. 5일 후 붕대를 제거하고 매일 이식된 피부의 거부반응을 관찰하였으며, 50% 이상에서 염증, 괴사 등의 반응을 보일 때 거부반응으로 판정하였다.

실험 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 아무런 처치를 가하지 않은 마우스의 경우 6일부터 거부반응으로 인해 이식된 피부조직의 괴사가 관찰되었으며 이식된 피부조직은 최대 7일까지 생존한 것으로 나타났다. 무처치 iDC 투여군에서는 이식 후 8일부터 거부반응으로 인해 이식된 피부조직의 괴사가 관찰되었으며 이식된 피부조직은 최대 11일까지 생존한 것으로 나타났다. 이에 반해 hBD-2 처리 iDC 투여군과 LL-37 처리 iDC 투여군의 경우 이식 후 10일부터 거부반응을 보였으나 최대 생존기간은 각각 14일과 15일로 정상 iDC를 투여한 실험군과 비교하여 면역반응 조절 효과가 현저히 증가된 것을 확일 할 수 있었다.

이러한 결과는 hBD-2 혹은 LL-37을 처리함으로써 면역세포 치료제의 생체 내 (말초 림프절) 이동 및 생착을 향상시킬 수 있으며 그 결과 면역반응 조절효과를 극대화 할 수 있음을 의미한다.

실시예 7: 양이온성 항균 펩타이드의 안전성 평가

본 발명의 양이온성 항균 펩타이드가 세포치료제에 미치는 위해를 평가하였다. 이를 위해 마우스 유래의 골수유래 줄기세포 및 인간 제대혈 세포를 양이온성 항균 펩타이드를 처리한 뒤 세포독성 및 분화능력에 대한 영향을 평가하였다.

양이온성 항균 펩타이드의 세포치료제에 대한 세포독성 평가는 C57BL/6 마우스의 골수로부터 분리된 Sca-1⁺ 세포와 인간 제대혈 세포를 이용하여 CFU-GM, erythroid burst-forming unit (BFU-E) 형성에 미치는 영향을 평가하였다. 이를 위해 마우스 골수유래 세포 및 인간 제대혈 세포는 기본배지 (RPMI 1640)에로 부유한 뒤 아무런 첨가를 하지 않은 무처치 군, hBD-2 의 최종농도가 100nM이 되도록 한 hBD-2 처리군, LL-37의 최종농도가 500nM이 되도록 한 LL-37 처리군으로 나누어 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 2시간 배양후 세포를 회수하여 CFU-GM과 BFU-E 형성을 평가하였다. CFU-GM, BFU-E 형성 평가는 실시예 3에서와 동일한 방법을 사용하였으며 특히 BFU-E 형성을 유도하는 성장인자로는 stem cell factor (최종농도 5ng/㎖)와 erythropoietin (최종농도 5 unit/㎖)을 이용하였다.

실험 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 hBD-2 혹은 LL-37을 처리한 군 모두 무처치 대조군과 비교하여 분화능력에 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 hBD-2 및 LL-37 모두 세포치료제에 대한 세포독성이 없으며 세포치료제의 분화에 미치는 영향이 없어 임상적용이 가능하다는 것을 의미한다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Novel application of peptides in the field of cell therapy <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gly Ile Gly Asp Pro Val Thr Cys Leu Lys Ser Gly Ala Ile Cys His 1 5 10 15 Pro Val Phe Cys Pro Arg Arg Tyr Lys Gln Ile Gly Thr Cys Gly Leu 20 25 30 Pro Gly Thr Lys Cys Cys Lys Lys Pro 35 40 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu 1 5 10 15 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val 20 25 30 Pro Arg Thr Glu Ser 35

Claims

세포치료제의 생체 내 생착을 증가시키는 생착 증진용 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 세포치료제로 사용되는 세포는 줄기세포 또는 면역세포인 것을 특징으로 하는 생착 증진용 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 펩타이드는 양이온성 항균 펩타이드인 것을 특징으로 하는 생착 증진용 펩타이드.
제3항에 있어서,
상기 양이온성 항균 펩타이드는 LL-37, hBD-2 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 생착 증진용 펩타이드.
제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드에 의한 생착 기능이 증가된 세포치료제.
양이온성 항균 펩타이드를 용매에 용해시키는 단계;
상기 용액에 세포치료제를 침지시키는 단계를 포함하는 생착 기능이 증가된 세포치료제 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 용매는 식염수 또는 완충액인 것을 특징으로 하는 생착 기능이 향상된 세포치료제 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 용액은 20nM 내지 2000nM의 농도인 것을 특징으로 하는 생착 기능이 향상된 세포치료제 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 세포치료제로 사용되는 세포는 줄기세포 또는 면역세포인 것을 특징으로 하는 생착 기능이 향상된 세포치료제 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 침지시키는 시간은 10 내지 60분인 것을 특징으로 하는 생착 기능이 향상된 세포치료제 제조방법.
제6항에 있어서,
상기 침지시키는 단계 이후에 추가로 세정 과정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생착 기능이 향상된 세포치료제 제조방법.
펩타이드를 유효성분으로 포함하는 세포치료제의 생체 내 생착 증진용 조성물.
제12항에 있어서,
상기 펩타이드는 양이온성 항균 펩타이드인 것을 특징으로 하는 세포치료제의 생체 내 생착 증진용 조성물.
제13항에 있어서,
상기 양이온성 항균 펩타이드는 LL-37, hBD-2 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 세포치료제의 생체 내 생착 증진용 조성물.