KR20120013915A

KR20120013915A - 대장암 진단 및 치료제로서의 신데칸-2 펩티드 단편

Info

Publication number: KR20120013915A
Application number: KR1020110078791A
Authority: KR
Inventors: 오억수
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2010-08-06
Filing date: 2011-08-08
Publication date: 2012-02-15
Also published as: KR101309910B1

Abstract

본 발명은 신데칸 단백질 단편을 포함하는 대장암 진단 마커, 치료 및 그 응용에 관한 발명이다.

Description

대장암 진단 및 치료제로서의 신데칸-2 펩티드 단편{Syndecan-2 peptide fragment as a marker for diagnosing colorectal cancer and as a therapeutic agent thereof}

대장암은 병리학적으로는 대부분이 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 구분된다. 부위별 발생 빈도는 하부 대장, 즉 직장에서 발생하는 경우가 약 50%로 가장 높다. 최근의 연구 결과에 의하면, 식이 습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발생률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있으며, 대장암의 발생률은 1995년 이후 2002년까지 420% 증가하여 암 중 발생률 1위를 나타내고 있다(2003 건강보험통계연보, 국민건강보험공단 발간). 또한 미국 및 유럽에서는 암 관련 사망의 두 번째 요인으로 작용한다(American Cancer Society statics for 2009).

대장암의 발병 원인은 아직 불분명하지만 유전적 요인, 고지방 및 저섬유 음식의 섭취와 관련된 식이습관 및 염증성 장질환 등이 고려되고 있다. 대장암은 모든 연령층에서 발생할 수 있으나, 연령이 증가함에 따라 발생빈도가 높아지며 50~60대에서 자주 발생한다. 남녀의 발생 비는 결장암은 여자, 직장암은 남자에서 다소 높게 나타난다.

대장암의 치료는 외과적 절제술을 근간으로 항암화학요법 및 방사선요법이 병행된다. 수술적 요법, 항암화학요법 및 방사선요법 등의 진보에도 불구하고 특정한 증상이 없이 진행되는 대장암의 특성으로 인해 다른 장기로 전이된 후 진단되어 수술시점을 놓친 경우에는 사망률이 높은 것으로 알려져 있다. 5년 평균생존율은 1기의 경우 90% 이상, 2기의 경우 70% 이상, 3기의 경우 50% 이상이고 4기의 경우에는 5% 이하로 나타나지만(2004 암정보, 국립암센터 발간), 대장암을 조기에 발견하고 치료할수록 생존율이 현저히 증가하는 것을 알 수 있다. 따라서 대장암의 조기 진단 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

대장암의 진단은 대장과 관련된 증세를 보이는 환자에게 직장 수지검사(rectal digital examination), 분변 잠혈검사(fecal occult blood test) 및 대장조영술에 의해 수행되고 있으며, 필요에 따라 결장경검사를 통한 조직검사가 행해진다. 현재 이용 가능한 가장 조기의 검출방법은 분변혈에 대한 시험 또는 내시경 과정을 수반한다.

그러나, 분변 혈이 검출되기 전까지 전형적으로는 상당한 종양 크기가 존재해야만 한다. 잠혈 기준(guaiacbased)의 분변 검사의 감수성은 26%로 이는 악성 병변이 있는 74%의 환자가 검출되지 않은 채로 있게 됨을 의미한다(Ahlquist et al., Gastroenterol. Clin. North Am. 26: 41-55, 1997). 전암성 및 암성 병변의 시각화는 조기 검출에 대한 최선의 접근법이지만, 결장내시경은 상당한 비용 뿐만 아니라 환자에게 고통과 위험을 초래할 수 있다는 문제점이 있다(Silvis et al., JAMA 235: 928-930, 1976; Geenen et al., Am. J. Dig. Dis. 20:231-235, 1975; Anderson et al., J. Natl. Cancer Institute 94: 1126-1133, 2002).

상기와 같은 종래의 방법들은 진단의 정확도가 낮을 뿐만 아니라, 대장암이 발병하기 이전의 환자들에 대한 조기 진단이 불가능하며, 피검체들에게 불편을 주는 문제점이 있다. 이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위한 방법으로 환자의 혈장에서 종양 표지자(marker)의 농도를 측정하여 대장암을 진단하려는 시도가 있었다(Clinton et al., Biomed. Sci. Instrum. 39: 408-414, 2003; Rui et al., Proteomics 3: 433-439, 2003;Soletormos et al., Dan. Med. Bull. 48: 229-255, 2001).

현재, 태아성암항원(CEA), 종양-연관 당단백질을 근거로 한 진단적 혈장 시험만이 대장암 분야에서의 진단 보조에 이용가능하다. CEA는 대장암, 위암, 췌장암 및 대다수의 유방 암종, 폐 암종 및 두경부 암종을 가진 환자로부터 수득된 조직의 95%에서 증가한다(Goldenberg et al., J. Natl. Cancer Inst.(Bethesda) 57: 11-22,1976). 상승된 CEA 수준은 또한 비-악성 질환을 가진 환자에서도 보고되었으며, 대장암이 있는 대다수 환자가 혈청에서, 특히 질환의 조기 단계 동안에는 정상적인 CEA 수준을 나타내었다(Carriquiry et al., Dis. Colon Rectum 42: 921-929, 1999; Herrera et al., Ann. Surg. 183: 5-9, 1976; Wanebo et al., N. Engl. J. Med.299: 48-451, 1978). 검출 재발에서의 혈청 또는 혈장으로부터 측정된 CEA의 이용은 보고 상 논란의 여지가 있으며, 아직 널리 적용되지 못하고 있다(Martell et al., Int. J. Biol. Markers 13: 145-149, 1998; Moertelet al., JAMA 270: 943-947, 1993).

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 대장암의 조기 진단을 위한 마커를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편이 대장암 환자의 혈청 등의 시료에서 검출되는 것을 확인하는 동시에 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편이 대장암 활성을 촉진하는 것을 규명하여 신데칸(Syndecan)-2 단편을 이용한 대장암 진단 가능성을 확인하였으며, 또한 대장암 환자 혈액에서 신데칸(Syndecan)-2 단편을 제거한 경우 대장암 환자 혈액의 암활성 촉진 효과가 없음을 확인하여, 이를 활용하면 대장암 치료효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 대장암 마커인 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 대장암 진단을 위한 정보의 제공을 위하여, 대장암 마커 신데칸-2 펩티드 단편을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 대장암 마커 신데칸-2 펩티드 단편을 이용하여 대장암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신데칸-2 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 대장암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대장암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 대장암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 대장암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 대장암 진단 마커는 정상 대장 조직의 세포에 비하여, 대장암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편이다.

본 발명에서 용어, "신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편"은 이에 제한되지 않으나, 정상 개체와 대장암 개체를 구분할 수 있는 신데칸(Syndecan)-2 단백질의 일부 단편이다. 신데칸(Syndecan)-2는 세포 표면에 존재하는 세포결합 수용체로, 막횡단 헤파란-설페이트 프로테오글리칸이다(Carey, D.J. (1997). Syndecans: multifunctional cell-surface co-receptors. Biochem. J. Pt 1, 1-16). 그 유전자 및 단백질 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 에 등록되어 있다(NM_002998, NP_002989). 본 발명자들은 MMP-7이 신데칸-2의 세포외 도메인을 절단하여 대장암에서 신데칸-2 펩티드 단편이 혈청 내에 다수 존재하여 대장암을 특이적으로 진단할 수 있음을 확인하였다. 아울러, 잘려진 신데칸-2인 신데칸-2 펩티드 단편이 대장암의 이동에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다.

바람직하게 상기 신데칸-2 펩티드 단편은 서열번호 1 또는 3에 기재된 아미노산 서열일 수 있다. 본 발명자들은 서열번호 2의 인간 신데칸-2 단백질의 N-말단의 세포외 도메인의 139번째 아미노산 또는 랫트 신데칸-2 단백질의 N-말단의 세포외 도메인의 149번째 아미노산인 루이신이 MMP-7의 절단 위치임을 최초로 규명하였으며, 상기 단편을 혈청에서 측정할 경우 비침습적인 방법으로 신속하게 대장암을 진단할 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 신데칸-2의 대장암 마커로 사용될 수 있는 부분을 도 11에 나타냈다.

본 발명에서 용어, "신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편의 발현수준을 측정하는 제제"란 상기와 같이 대장암 세포에서 발현이 증가하는 마커인 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 말한다. 더 바람직하게는 항체일 수 있다. 이는 대장암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 대장암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 신데칸-2 펩티드 단편에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝 하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 대장암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 대장암 진단용 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 대장암 진단 마커인 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 대장암 진단 마커의 발현 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

상기 키트는 i) SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법, 또는 ii) 항체에 부착된 형광표지에 의한 형광을 검출함으로써 양이 측정되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

상기 항체는 본 발명의 에피토프를 대상으로 당업자에게 알려진 항체 제조방법에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명의 키트는 암을 가진 개체와 정상 개체에서 발현에 차이가 있는 단백질 마커인 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편을 측정하는데 사용될 수 있다. 상기 키트는 개체가 암인지 아닌지를 구별하여 진료 행위자가 진단 및 스크리닝하는 것을 가능하게 할 뿐 아니라, 치료에 대한 개체의 반응을 모니터하여 그 결과에 따라 치료를 변경하는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 키트는 상기 단백질 마커에 결합하는 1차 획득 시약(capture reagent) 및 1차 획득시약에 결합하지 않는 2차 획득 시약을 포함할 수 있다.

상기 1차 획득시약은 항체 또는 금속킬레이트, 바람직하게는 항체이고, 2차 획득시약은 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드로 표지한 접합체(conjugate)로 2차 항체이다. 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)(예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase))일 수 있고 형광물질인 경우, 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일,디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸이 가능하다.

개체로부터 수득된 시료를 1차 획득시약, 바람직하게는 마커에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 경우, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있고 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형상에 고정될 수 있다. 고형상은 유리나 플라스틱 예를 들어 미세역가 플레이트 (microtiter plate), 막대, 비드(bead) 또는 미세비드(microbead) 등이 될 수 있다. 항체는 또한 프로브 기질이나 단백질 칩에 결합될 수 있다. 시료를 항체와 정온배치한 후 세척하여 항체-마커 복합체를 측정할 수 있다. 이는 세척된 혼합물을 2차 획득시약, 바람직하게는 2차 항체와 정온 배치하여 수행된다. 항체-마커 복합체의 양 측정이나 존재 검출은 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다. 상기 방법 외에도 시료 내의 단백질 마커는 간접적인 분석방법 예를 들어, 단백질 마커의 다른 에피토프에 결합하는 모노클론 항체와 경쟁 또는 억제 반응 분석을 실시하여 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 상기 단백질 마커에 결합하는 항체를 처리한 후 결합한 항체의 양을 탐색함으로써 대장암을 진단 및 스크리닝 할 수 있다.

상기 결합한 항체의 양을 탐색하는 방법으로는 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템을 이용하는 것이 바람직하고, 여기에는 형광 표지에 의한 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법, 형광물질의 표지없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 형광법은 형광 스캐너 프로그램을 이용하여 상기 단백질 마커에 특이적 항체에 결합하는 항체를 형광물질로 라벨링한 후 스포팅하여 신호를 확인하는 방법으로, 이 방법을 적용하여 결합 정도를 확인할 수 있다. 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein

isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트 (rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 SPR 시스템은 형광법과는 달리 시료를 형광물질로 표지할 필요가 없이 항체의 결합 정도를 실시간으로 분석하는 것이 가능하다. SPRI의 경우에는 미세정렬 방법을 이용하여 동시다발적인 시료 분석이 가능하다.

또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다. 분석을 위해 사용되는 시료는 혈청, 뇨, 눈물 타액 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 질환 특이적 폴리펩타이드를 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장으로부터 측정될 수 있다. 시료는 단백질 마커의 탐지감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데 예를 들어 환자로부터 수득한 혈청 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전 처리될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대장암이 의심되는 개체의 시료로부터 신데칸-2 (syndecan-2) 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 마커인 신데칸-2 펩티드 단편을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 개체의 시료란 대장암 마커인 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 혈액, 혈청 또는 혈청일 수 있다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 신데칸-2 펩티드 단편 발현 수준을 대장암 의심 개체에서의 발현 수준과 비교함으로써 대장암 의심 개체의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다. 즉, 대장암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 대장암으로 추정되는 세포 유래에서 더 많이 발현되면 대장암으로 추정되는 세포를 대장암으로 예측할 수 있는 것이다.

신데칸-2 펩티드 단편 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 대장암 의심 개체에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 대장암 마커 유전자에서 신데칸-2 펩티드 단편으로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 대장암 의심 환자의 실제 대장암 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 대장암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성 량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄ W(CN)₈ , [Os(bpy) ₃ ] ²⁺ ,[RU(bpy) ₃] ²⁺, [MO(CN) ₈ ] ^4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I , ¹⁸⁶Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소 적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소 적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 대장암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현 량과 대장암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현 량을 조사하는 방법으로 이루어진다. 펩티드 단편의 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 대장암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.

구체적인 일례로서, 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준의 측정은 전기영동(Electrophoresis), MALDI-TOF MS(Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 또는 SELDI-TOF MS(surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 방법을 이용하여 측정되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 대장암 치료용 후보물질 처리 후, 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

구체적으로, 대장암 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 신데칸-2 펩티드 단편의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 대장암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 신데칸-2 펩티드 단편의 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 대장암의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에 대장암 세포에서의 본 발명의 마커 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하고, 또한 대장암 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 대장암 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 대장암 치료 후보 물질의 부재 하에서의 마커 발현 수준보다 감소시키는 물질을 대장암의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.

바람직하게는 MMP-7의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명자들은 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준이 대장암에서 특이적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 이는 MMP-7에 의한 것임을 확인하였다. 따라서, MMP-7의 발현 수준이 감소하면 대장암 치료제임을 알 수 있다.

또한 본 발명자들은 신데칸-2의 서열번호 4의 세포외 도메인의 149번째 아미노산인 루이신을 이소루이신으로 돌연변이시키면 MMP-7에 의해 신데칸-2가 절단이 되지 않음을 최초로 규명하였다. 아울러, 서열번호 2의 세포외 도메인의 139번째 아미노산인 루이신을 이소루이신으로 돌연변이시키면 MMP-7에 의해 신데칸-2가 절단이 되지 않음을 최초로 규명하였다.

이에 근거하여, 상기 치료제는 서열번호 4의 신데칸-2 세포외 도메인의 149번째 잔기인 루이신을 이소루이신으로 돌연변이시키는 것일 수 있다. 또는 서열번호 4의 신데칸-2 세포외 도메인의 149번째 잔기를 MMP-7이 절단하지 못하도록 보호하는 역할을 하는 항체일 수 있다. 또는 상기 치료제는 서열번호 2의 신데칸-2 세포외 도메인의 139번째 잔기인 루이신을 이소루이신으로 돌연변이시키는 것일 수 있다. 또는 서열번호 2의 신데칸-2 세포외 도메인의 139번째 잔기를 MMP-7이 절단하지 못하도록 보호하는 역할을 하는 항체일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 신데칸-2 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 대장암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

이러한 항체는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함하며, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 상기 항체는 신데칸-2 펩티드 단편을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 상기 대장암 치료용 약제학적 조성물은 신데칸-2 펩티드 단편 특이적인 항체를 이용하여, 대장암 환자의 혈청 내에서 암의 이동을 증가시키는 활성을 가지는 신데칸-2 펩티드 단편을 제거하는 방법에 이용되어, 대장암을 치료할 수 있다. 본 발명자들은 혈청에 함유된 신데칸-2 펩티드 단편을 항체를 이용해 제거하였을 경우 대장암 세포의 이동 증가 효과가 사라지는 것을 확인하여 신데칸-2 펩티드 단편이 대장암 치료의 타겟이 될 수 있음을 규명하였다.

이와 같은 대장암 치료용 조성물은 신데칸-2 펩티드 단편에 특이적으로 결합하여 신데칸-2 펩티드 단편에 의한 암 활성 촉진할 수 있는 물질은 제한없이 포함하나, 그 예로서 단백질, 앱타머, 펩티드, 탄수화물, 화합물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로 사용할 수 있지만, 치료 효율을 증가시키기 위해 방사선 요법 또는 화학요법(세포 성장 정지 또는 세포 독성 물질, 항생 물질형 물질, 알킬화제, 항대사성 물질, 호르몬제, 면역제, 인터페론형 물질, 사이클로옥시게나제 억제제, 메탈로매트릭스프로테아제 억제제, 텔로머라제 억제제, 티로신 키나제 억제제, 항성장인자 수용체 물질, 항-HER 물질, 항-EGFR 물질, 항-혈관생성 물질, 파르네실 트랜스퍼라제 억제제, ras-raf 시그날 전도 경로 억제제, 세포 주기 억제제, 기타 cdk 억제제, 튜불린 결합체, 토포이소머라제Ⅰ 억제제, 토포이소머라제 Ⅱ 억제제 등)과 같은 다른 항암 치료법과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있고, 경구 투여시에는 결합체, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물의 유효 투여량의 범위는 성별, 체표면적, 질환의 종류 및 중증도, 연령, 약물에 대한 민감도, 투여경로 및 배출비율, 투여시간, 치료기간, 표적세포, 발현 수준 등 기타 의학 분야에 잘 알려진 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 잘려진 신데칸-2 단편이 대장암 세포 이동 조절에 중요한 역할을 하고, 대장암 환자의 혈청에서 검출되고 있으므로 이것을 진단 마커로 사용할 수 있다. 아울러, 대장암 환자의 혈액에서 암활성을 촉진하는 잘려진 신데칸-2 단편을 제거하거나 활성을 억제하는 물질을 통해, 새로운 대장암 치료제의 개발에 사용될 수 있다.

도 1은 MMP-7이 신데칸-2의 세포외 도메인의 절단을 조절한다는 것을 나타내는 도이다. (A) 표시된 대장암 세포로부터 얻은 조건화된 배지 (CM)를 모노클론-(#197) 또는 폴리클론 (M-140) 항-신데칸-2 항체를 이용하여 슬롯 블롯팅을 수행하였다. 무혈청 배지 (SFM)를 음성 대조군을 사용하였다. (B) HT-29 세포의 조건화된 배지 내의 수용성 신데칸-2를 DEAE-Sepharose 컬럼 크로마토그래피로 분리하였다. 각 DEAE 분획을 슬롯 블롯팅 (왼쪽 패널)에 사용하였다. proteoglycan 포함 용출 분획을 heparinase로 절단하고 항-신데칸-2 항체로 웨스턴 블롯팅을 수행하였다 (오른쪽 패널). (C) HT-29 세포에 표시된 시간 동안 APMA (1 mM)를 처리하고, 조건화된 배지를 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅을 수행하였다. APMA-활성화된 (+) 및 비-활성화된 (-) 재조합-pro-MMP-7를 SDS-PAGE 겔로 분리하고, PVDF 막에 옮긴 후, MMP-7의 latent 형태 (28kDa)또는 활성화 형태 (19 KDa)를 인식할 수 있는 항-MMP-7 항체로 표지하였다. (D) HCT116 세포를 1.5㎍의 대조군(VEC) 또는 MMP-7 코딩 발현 벡터로 트랜스펙션하고 (왼쪽 패널), pSuper-only (VEC) 또는 MMP-7 shRNA 플라스미드로 트랜스펙션하였다 (오른쪽 패널). MMP-7의 발현 수준은 RT-PCR (윗쪽 패널) 및 웨스턴 블롯팅 (중간 패널)으로 측정하였다. HCT116 세포로부터 얻은 조건화된 배지를 표시된 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅을 수행하였다. Ponceau S 염색을 loading 대조군으로 사용하였다 (아래쪽 패널). (E) HT-29 세포를 표시된 시간 및 농도로 pro-MMP-7을 처리하였다. 조건화된 배지를 표시된 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅을 수행하였다. (F) HT-29 세포를 표시된 pro-MMPs (1 mg/ml)로 처리하였다. 조건화된 배지를 표시된 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅을 수행하였다.
도 2는 MMP-7이 신데칸-2의 세포외 도메인 내의 N-말단 Leu 잔기를 절단하는 것을 나타낸 도이다. (A) 정제된 GST-신데칸-2 (GST-SDC2)를 37℃에서 1시간 동안 표시된 양의 pro-MMP-7과 배양하고, 8 % SDS-PAGE로 분리한 후, CBB R-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250)으로 염색하였고 (왼쪽 패널), 항-신데칸-2 항체로 면역블롯팅을 하였다 (오른쪽 패널). 화살표는 신데칸-2의 이량체 (D) 및 단량체(M)를 나타내며, 화살표 머리는 신데칸-2의 잘린 단편을 나타낸다(S). (B) 동량의 GST-SDC2 및 신데칸-4(SDC4)를 pro-MMP-7과 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 항-GST 항체로 면역블롯팅을 수행하였다. (C) 동량의 정제된 GST 또는 GST-SDC2를 정제된 pro-MMP-7과 37℃에서 1시간 동안 배양하고, SDS-PAGE로 분리하여 은으로 염색하거나 항-신데칸-2 항체로 면역블롯팅하였다. (D) 잘린 SDC2 폴리펩티드를 은-염색 겔에서 분리하고, 단백질이 없는 겔 plug를 절단 대조군으로 사용하였다. 트립신 자가 단백질 가수분해 생성물을 MassLynx^Tm (Waters Co., UK)을 이용한 MS spectra의 calibration을 위한 내부 표준으로 사용하였다.
도 3은 MMP-7이 신데칸-2의 내인성 당쇄화 세포외 도메인을 절단하는 것을 나타낸 도이다. (A) 신데칸-2의 세포외 도메인을 인간 IgG₁의 Fc 영역에 연결하여 S2E-Fc를 제조하였다(위쪽 패널). HEK293T 세포를 VEC 또는 S2E-Fc cDNA로 트랜스펙션시키고, 신데칸-2의 mRNA 발현을 표시된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석하였다: β-액틴을 대조군으로 증폭하였다. 조건화된 배지로 항-신데칸-2 또는 HRP 컨쥬케이티드 항-인간 IgG 항체와 슬롯 블롯팅을 수행하였다(위쪽 패널). (B) S2E-Fc로 트랜스펙션시킨 HEK293T 세포를 표시된 시간동안 37℃에서 pro-MMP-7와 배양하였다. 반응 혼합물을 protein A-Sepharose와 배양한 후, 결합된 물질을 15 % SDS-PAGE로 분리 후, 겔을 은-염색 또는 HRP 컨쥬케이티드 항-인간 IgG 항체와 면역 블롯팅으로 수행하였다. (C) VEC 또는 S2E-Fc 트랜스펙션된 HEK293T 세포로부터 얻은 조건화 된 배지를 37℃에서 1시간 동안 GM6001의 존재 또는 부존재하에서 pro-MMP-7과 배양하였다. 배양액을 protein A-Sepharose와 반응시킨 후, 결합한 물질을 15 % SDS-PAGE로 분리한 뒤 PVDF막에 이동시켰다. PVDF막 상의 단백질은 CBB R-250로 염색하였다. (D) CBB R-250으로 염색 된 PVDF막 상의 단백질을 Tufts Core Facility (미국)에 보내어 N-말단 단백질 시퀀싱 분석 (3 사이클) 의뢰를 맡겼다.
도 4는 MMP-7에 의해 절단되는 신데칸-2 세포외 도메인의 돌연변이체의 저항성을 나타내는 도이다. (A) 야생형 신데칸-2 (SDC2-WT, GenBank accession number NM_013082.3)의 세포외 도메인의 대표적인 개략도 및 다음의 SDC2 돌연변이체를 나타낸다: Leucine (L¹⁴⁹)→Serine(S) (SDC2-NS), Asparagine (N¹⁴⁸)/Leucine (L¹⁴⁹)→Serine(S) (SDC2-SS), 및 Leucine (L¹⁴⁹)→Isoleucine (I) (SDC2-NI). 절단 부위를 화살표 머리로 나타냈다 (위쪽 패널). 동량의 정제된 GST-SDC2-WT, -SDC2-NS, SDC2-SS, 및 -SDC2-NI을 정제된 pro-MMP-7와 37℃에서 1시간 동안 배양하고, SDS-PAGE로 분리하고, CBB R-250로 염색하였다 (아래 패널). (B) HCT116 세포를 SDC2-WT 또는 표시된 SDC2 돌연변이체로 트랜스펙션시켰다. 신데칸-2의 mRNA 발현을 표시된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석하였다: β-액틴을 대조군으로 증폭하였다(위쪽 패널). 조건화된 배지를 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅 하였다 (아래쪽 패널). (C) HT-29 (왼쪽 패널) 및 HCT116 (오른쪽 패널) 세포를 1.5㎍의VEC, SDC2-WT 또는 SDC2-NI 돌연변이체 (N148/L149I; NI)로 트랜스펙션하고, 신데칸-2의 mRNA 발현을 표시된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석하였다: β-액틴을 대조군으로 증폭하였다(위쪽 패널). 표시된 세포로부터 분리한 조건화된 배지를 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅 하였다. Ponceau S 염색을 loading 대조군으로 사용하였다 (아래쪽 패널).
도 5는 잘려진 신데칸-2가 암세포의 이동에 중요함을 나타낸 도이다. (A) HT-29 및 HCT116 대장암 세포를 0.2 ㎍/ml의 정제된 잘려진 신데칸-2를 처리하고, 트랜스웰 이동분석을 실시예의 방법으로 수행한 것이다. 오차 막대 = 95% 신뢰구간 (HT-29, P = .05, HCT116, P < .01 versus 대조군). (B) HT-29 (왼쪽 패널) 및 HCT116 (오른쪽 패널)세포를 1.5 ㎍의 VEC, SDC2-WT 또는 SDC2-NI 돌연변이체 (N148/L149I; NI)로 트랜스펙션하고, 트랜스펙션된 세포 (1 x 10⁶)를 (A)에 개시된 바에 따라 이동시켰다. 실험은 3회 수행하였다. 오차 막대 = 95 % 신뢰구간 (HT-29, SDC2-WT: P < .01; SDC2-NI 돌연변이체: P < .05, HCT116, SDC2-WT 또는 -NI 돌연변이체: P < .01 versus VEC 대조군). (C) B16F10 흑색종 세포를 1 ㎍의 벡터 대조군 (VEC), SDC2-WT, 또는 SDC2-NI 돌연변이체 (N148/L149I; NI)로 트랜스펙션시키고, 신데칸-2의 mRNA 발현을 표시된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석하였다: β-액틴을 대조군으로 증폭하였다(왼쪽, 위쪽 패널). 조건화된 배지를 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅하였다(왼쪽, 중간 패널). 트랜스펙션된 세포(1 x 10⁵)를 젤라텐-코팅된 Transwell apparatus에서 이동시켰다 (왼쪽, 아래쪽 패널, SDC-2 WT, -NI 돌연변이체, P < .01 versus VEC 대조군). 실험은 3회 수행하였다. 오차 막대 = 95 % 신뢰구간. B16F10 세포를 225 pmol의 마우스 신데칸-2를 표적하는 siRNA 혼자, 또는 표시된 1 ㎍의 렛트 신데칸-2 구조체와 함께 트랜스펙션하고, C57BL/6 마우스 (n = 10)에 주입하였다. 2주 후, 마우스를 희생하고 폐를 적출하여 조사하였다. 두 번의 독립적인 실험을 수행하였다 (그룹당 n = 3 마우스). 각 폐의 앞 및 뒷면을 사진촬영하였다. 막대 그래프는 폐 전이 결절의 수를 나타낸다 (오른쪽 패널). 막대는 ㅍ폐 전이 결절의 중앙값을 나타낸다 (n = 3). 오차 막대 = 95 % 신뢰구간.
도 6은 절단된 신데칸-2가 암세포 이동을 증가시키고, 증식 및 부착은 조절하지 않는다는 것을 나타낸다. (A) 신데칸-2 (Met¹- Asn¹⁴⁸)의 세포외 도메인을 인간 IgG₁의 Fc 영역을 연결하여 Fc 수용체-잘려진 신데칸-2 키메라 (sS2E-Fc)를 제조 한 대표적인 개략도이다 (위쪽 패널). HCT116 세포를 VEC 또는 sS2E-Fc로 트랜스펙션시키고, 신데칸-2의 mRNA 발현을 표시된 프라이머를 사용하여 RT-PCR로 분석하고, 표시된 트랜스펙션된 세포로부터 분리한 조건화된 배지를 수득하여 항-신데칸-2 항체로 슬롯 블롯팅을 하였다 (아래쪽, 왼쪽 패널). 그리고 이동 분석을 수행하였다 (아래쪽, 오른쪽 패널). HCT116 세포를 VEC- 및 sS2E-Fc로 트랜스펙션시킨 세포의 조건화된 배지로 처리하고, 이동을 분석하였다 (아래쪽, 오른쪽 패널). 실험을 3회 수행하였다. 오차 막대= 95 % 신뢰구간, P < .05 versus 대조군. (B) VEC- 및 sS2E-Fc-트랜스펙션된 세포의 조건화된 배지(최종 10% v/v)와 HCT116 세포 (1 x 10⁵ 세포/웰) 혼합물을 미리 굳힌 bottom agar에 첨가하고 콜로니를 2주 후에 계수하였다. Clonogenicity는 VEC 대조군에 대한 콜로니 형성으로 퍼센트를 계산하였다 (n = 3; p < 0.05). (C) HEK(Human embryonic kidney) 293T 세포를 VEC 또는 sS2E-Fc로 트랜스펙션하고, 표시된 트랜스펙션된 세포로부터 얻은 조건화된 배지로 항-신데칸-2 항체와 슬롯 블롯팅을 하였다. Ponceau S 염색을 loading 대조군으로 사용하였다. CI (Cell index)를 실시예의 방법으로 수행하였다 CI= slope*time + intercept. (D) HCT116 세포를 VEC- 및 sS2E-Fc-트랜스펙션된 HEK293 세포로부터 얻은 조건화된 배지 (최종 10% v/v)를 표시된 시간 동안 처리하고, 세포수를 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 분석으로 계수하였다. 실험은 3회 수행하였다. 오차 막대 = 95 % 신뢰구간. (E) 벡터 또는 sS2E-Fc 발현 조건화 된 배지(최종 10 % v/v)와 HCT116 세포 혼합물 (5 x 10⁴ 세포/웰)을 각 RTCA E-Plate wells(Roche Diagnostics GmbH)에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO₂, 6시간 동안 배양하고 RTCA 소프트웨어로 결과를 분석하였다.
도 7은 절단 된 신데칸-2의 암 활성 부위를 보여주는 도이다. (A) 신데칸-2 (Met¹- Asn¹⁴⁸)까지의 세포외 도메인을 부분적으로 제거한 뒤 인간 IgG₁의 Fc 영역을 연결하여 Fc 수용체-잘려진 신데칸-2 키메라 (sS2E-Fc-I, II, III, IV)를 제조 한 대표적인 개략도이다. (B) HEK293 세포에 각각의 VEC 또는 sS2E-Fc-I-IV를 트랜스펙션시키고, 표시된 트랜스펙션된 세포로부터 분리한 조건화된 배지를 수득하여 항-인간 IgG 항체로 슬롯 블롯팅 (왼쪽)과 항-신데칸-2 항체로 웨스턴 블롯팅을 하였다 (오른쪽). (C) (B)에서 얻은 조건화 된 배지(최종 10 % v/v)와 HCT116 세포 혼합물 (5 x 10⁴ 세포/웰)을 각 RTCA CIM-Plate wells(Roche Diagnostics GmbH)에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 5% CO₂, 20시간 동안 배양하고 RTCA 소프트웨어로 결과를 분석하였다. (D) (B)에서 얻은 조건화 된 배지(최종 10 % v/v)와 HCT116 세포 혼합물 (5 x 10⁴ 세포/웰)을 젤라텐-코팅된 Transwell apparatus에서 이동시켰다. 실험은 3회 수행하였다. 오차 막대 = 95 % 신뢰구간.
도 8은 대장암 환자의 혈청에서 잘려진 신데칸-2의 양이 증가하는 것을 보여주는 도이다. (A) 정상 공여자(n) 또는 표시된 암 환자(Ade: adenoma(선종), CIS: carcinoma in situ(암종), AC: advanced carcinoma(진행성 대장암))로부터 수득한 혈청 샘플을 신데칸-2 특이적인 항체를 이용하여 슬롯 블럿팅을 수행하였다. (B) 정상 공여자(n) 또는 진행성 암종 환자로부터 수득한 혈청 샘플을 PBS 버퍼가 함유된 protein A sepharose와 1시간 배양한 후, 1M NaCl를 포함하는 PBS 버퍼로 용출하였다. 용출된 샘플 및 결합 상등액 단백질을 신데칸-2 항체을 이용한 슬롯 블럿팅을 수행하였다. (C) 정상 공여자(n) 및 진행성 암 환자로부터 유래한 혈청 샘플을 아질산으로 전처리하거나 전처리하지 아니하고 상기 B와 같이 슬롯 블럿팅을 수행하였다. (D) 정상 공여자(n) 또는 표시된 암 환자로부터 수득한 혈청 샘플을 아질산으로 전처리하고 신데칸-2 특이적인 항체를 이용하여 슬롯 블럿팅을 수행하였다. (E) 아질산으로 전처리한 혈청 샘플을 SDS-PAGE로 분석하고 신데칸-2 특이적인 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. (F) 정상 공여자(n)와 대 장 혹은 위 진행성 암 환자로부터 수득한 혈청 샘플을 마우스 단클론(#197) 또는 토끼 다클론 (M-140) 신데칸-2 항체를 이용하여 슬럿 블럿팅을 수행하였다. (G) 정상 (N) 또는 Apc/Min 마우스로부터 유래한 혈청 샘플(각 40 ㎕)을 아질산으로 처리하고 신데칸-2 항체로 슬롯 블럿팅을 수행하였다. 진행성 암(AC) 환자로부터 유래한 혈청을 대조군으로 사용하였다. * 표시는 그 이미지가 더 긴 노출을 수행하였다는 것을 나타낸다.
도 9는 혈청 내의 잘려진 신데칸-2는 대장암의 동물 모델에서도 증가한다는 것을 나타내는 도이다. 정상 대장 점막 (대조군) 및 AOM 종양 마우스 모델 (실시예에 기재된 것과 같이 AOM-유도된)의 조직을 신데칸-2 항체로 면역 염색하였다.
도 10은 혈청에서 증가된 잘려진 신데칸-2의 레벨이 대장암 세포의 이동성 증가와 상관관계가 있다는 것을 나타내는 도이다. (A) 정상 공여자(n)와 잘려진 신데칸-2 단편이 많은 혈청(+)과 적은 혈청(-)의 선종 adenoma (Ade) 또는 진행성 암 (AC) 환자들로부터 수득한 혈청 샘플을 특이적인 신데칸-2 항체를 이용하여 슬롯 블럿팅을 수행하였다(위쪽 패널). 기재된 암 환자의 혈청을 사용하여 HCT116 세포의 Transwell 이동 분석을 수행하였다. 세포들을(1 X 10⁵) 젤라틴 코딩된 transwell 플레이트에서 20시간 동안 이동하게 하였다. 세포를 고정한 뒤 0.6 % hematoxylin 및 0.5 % eosin으로 염색한 후, 이동한 세포의 수를 계수하였다 (*, P < 0.05; **, P < 0.01 대비 대조군). (B) 잘려진 신데칸-2 단편이 많은 혈청(+)과 적은 혈청(-)의 진행성 암 (AC) 환자로부터 수득한 혈청 샘플을 상온에서 30분간 protein A 세파로스와 배양한 후, 비 결합된 물질을 IgG- 또는 신데칸-2 항체가 부착된 protein G 세파로스와 다시 배양하였다. 상등액을 나이트로셀루로스 막에 블롯팅하고 특이적인 신데칸-2 항체로 슬럿 블롯팅을 수행하였다 (위쪽 패널). 또한, 상등액을 A에 기재된 것과 같이 HCT116 세포를 이용하여 Transwell 이동 분석에 사용하였다(왼쪽 패널, P < 0.05 대비 대조군). 오차범위는 평균±표준편차(시행횟수 = 3)로 나타내었다. (C) 신데칸-2 단편이 많은 혈청(+)과 적은 혈청(-)의 진행성 암 (AC) 환자 혈청 샘플을 기재된 암 세포들에 처리한 뒤, 젤라틴 코팅(10㎍/ml)된 Transwell 플레이트 상에서 이동하게 하였다. 배양 후, 세포들을 A에 기재된 것과 같이 hematoxylin-eosin로 염색하고 계수하였다 (**, P < 0.01 대비 대조군). (D) 표시된 대장암 환자의 생검 조직으로부터 총 RNA를 추출하여서 MMP-7의 발현 수준을 RT-PCR로 평가하였다 (왼쪽, 위쪽 패널). 표시된 암 환자로부터 수득한 혈청 샘플을 특정 신데칸-2 항체로 슬럿 블럿팅을 수행하였다 (왼쪽, 아래쪽 패널). Transwell 이동 분석은 A에 기재된 것과 같이 표시된 혈청 샘플을 처리한 HCT116 세포에서 수행하였다 (오른쪽, 위쪽 패널)(*, P < 0.05, **, P < 0.01 대비 대조군). AC 환자로부터 얻은 혈청 샘플 (최종 10 % v/v)과 HCT116 세포 (1 x 10⁵ cells/well) 혼합물을 미리 굳힌 bottom agar에 첨가하고 2주 후 콜로니를 계수하였다. Clonogenicity를 VEC 대조군에 대한 콜로니 형성 퍼센트로 계산하였다 (오른쪽, 아래쪽 패널)(n = 3; p < 0.05).
도 11은 인간 및 랫트 각각의 신데칸-2 서열 및, 신데칸-2 펩티드 단편의 서열을 나타낸 도이다. 노란색으로 표시한 부분은 본 발명의 신데칸-2 펩티드 단편을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 세포 배양 및 트랜스펙션

인간 대장암 세포 HT-29(K30038), Caco-2(K30037.1), LoVo(K10229), 및 HCT116(K10247) 및 마우스 흑색종 세포 B16F10(K80008)는 한국세포 은행(http://cellbank.snu.ac.kr)으로부터 구입하였다. 상기 세포들을 37℃, 5% CO₂ 습도 환경에서 gentamycin (50 ㎍/ml, Sigma)과 10% (v/v) 혹은 20% (v/v) 우태혈청이 첨가 된 MEM (Caco-2), McCoy's 5a (HT-29, HCT116), RPMI (LoVo), DMEM (B16F10)로 배양하였다. LipofectAMINE LTX 시약(Invitrogen (Carlsbad, CA))을 사용하여 HT-29 세포에 트랜스펙션 또는 Effectene 시약(Qiagen (Hilden, Germany))을 사용하여 HCT116 및 B16F10에 제조회사의 프로토콜을 사용하여 수행하였다.

실시예 2: 슬롯 블럿팅

조건화된 배지 또는 환자의 혈청을 Bio-Rad 장치를 사용하여 나이트로셀룰로즈 막 위로 슬롯-블럿팅하고 PBS로 1회 세척하였다. 그 후 그 막을 5% 무지방유를 함유한 TBS (Tris-buffered saline: 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl), 5 % Tween-20 하에서 블록킹한 뒤, 세척하고 4℃에서 24시간 동안 적당한 1차 항체로 표지한 후, Amersham Life science (West Grove, Pennsylvania)로부터 구입한 종-특이적인 서양고추냉이 퍼옥시데이즈-결합된 2차 항체로 표지하였다. 그 신호들을 ECL (enhanced chemiluminescence; Anigen, Korea)에 의하여 검출하였다. 일부 실험에서, 마이크로튜브에 인간 혈청 40㎕에 30 ㎕(최종 43% v/v)의 0.5M H₂SO₄ 및 5.5M NaNO₂로 이루어진 아질산을 상온에서 10분 동안 처리하였다.

실시예 3: 수용성 신데칸 -2의 부분 정제

수용성 신데칸-2를 Koda, J.E., Rapraeger, A. and Bernfield, M. (1985). J. Biol. Chem. 13, 8157-8162에 기재된 방법의 변형을 통해서 HT-29 세포의 조건화된 배지로부터 분리하였다. HT-29 세포들을 24시간 동안 무혈청 배지에서 배양하고, 배양 배지를 수득하여, 원심분리 후 (1,000 rpm, 10분), 상등액을 buffer 1 [50 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 M Urea, 200 mM NaCl, 0.1% Tween-20, 10 mM NEM, 25 mM EDTA 및 2 mM PMSF]로 평형화된 DEAE-Sepharose 컬럼(Amersham Biosciences)에 적용하였다. 상기 컬럼을 10배 부피의 buffer 1로 세척한 후 buffer 2 [30mM Sodium acetate pH 4.0, 4M Urea, 200mM NaCl, 0.1% Tween-20, 10mM NEM, 25mM EDTA 및 2mM PMSF pH 4.0]를 적용하였다. 상기 컬럼을 세척한 후, 결합된 단백질을 buffer 3 [150mM Sodium acetate pH 4.0, 4M GuHCl, 0.1% Tween-20]으로 용출하였다.

실시예 4: Heparinase 처리

수용성 신데칸-2 세포외 도메인 (ectodomain)을 2 U/ml heparinase III 및 20 U/ml chondroitinase ABC의 혼합물과 heparinase 반응 버퍼(50 mM Hepes pH 6.5, 50 mM NaOAc, 150 mM NaCl, 및 5 mM CaCl₂)상에서 37℃에서 8시간 처리하였다.

실시예 5: 신데칸 -2의 부위 특이적 돌연변이체의 구축

신데칸-2 세포외 도메인의 단백질 가수분해 절단 부위의 부위-특이적 돌연변이는 Clontech (Palo Alto, CA)으로부터 구입한 QuikChange site-directed mutagenesis 키트를 사용하여 수행하였다. 신데칸-2 세포외 도메인의 Asn¹⁴⁸ 및 Leu¹⁴⁹ 잔기를 Ser 및/또는 Ile로 대체하였다. 그 프라이머 서열은 다음과 같다:

신데칸-2 NS forward 5'-GTACACCGAGAAACATTCAGACAATTCAAGCGGACGG-3'(서열번호 5)

신데칸-2 SS forward 5'-ACGTGTACACCGAGAAACATTCAGACTCGTCGTTCAAGCGG-3'(서열번호 6)

신데칸-2 NI forward 5'-ACGTGTACACCGAGAAACATTCAGACAATATCTTCAAGCGG-3'(서열번호 7) 및

reverse 5'-CCGTCCGCTTGAACGAATTGTCTGAATGTTTCTCGGTGTAC-3'(서열번호 8).

신데칸-2 부위-특이적 돌연변이 산물을 EcoRI/XhoI 클로닝 사이트를 이용하여 pcDNA 3 벡터에 삽입하였다.

실시예 6: GST -융합 단백질의 인 비트로 절단 및 질량 분석

Oh, E.S., Woods, A. and Couchman, J.R. (1997). J. Biol. Chem. 18, 11805-11811 에 기재된 방법과 같이 glutathione-sepharose 4B로 정제된 GST 융합 신데칸-2 (GST-SDC2) 및 -4 (GST-SDS4)를 1 mM APMA (Sigma, St. Louis, MO)가 존재 또는 부존재 조건하의 절단 버퍼(50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1mM CaCl₂)상에서 pro-MMP-7과 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 절단체를 SDS-PAGE에 의해서 분리하고, 은 염색을 수행하여 분석하였다. 펩타이드 및 절단 산물의 질량들은 이화여대 Center for Proteolytic Pathways의 Autoflex II 질량 분광기(Brucker Daltonics)를 사용한 MALDI-TOF MS (matrix-assisted laser-desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry)에 의해서 결정하였다.

실시예 7: 이동( Migration ) 분석

Corning costar (Cambridge, MA)로부터 구입한 트랜스웰 플레이트의 각 웰에 gelatin (10 ㎍/ml in PBS)을 첨가하고; 8-um 포어 사이즈, 그 막을 25에서 1시간 건조하였다. 그 트랜스웰을 24-웰 플레이트에 연결하고, 그 아래쪽 챔버를 10% FBS 및 100ng/ml bFGF(B16F10) 를 포함하는 DMEM 또는 10% FBS 및 0.1% BSA (HT29, HCT116)를 포함하는 Mccoy5A로 충진하였다. 세포들을 각 위쪽 챔버에 첨가하고 그 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 8 또는 20 시간 동안 배양하였다. 그 필터의 아래쪽 표면으로 이동한 세포들을 0.6 % hematoxylin 및 0.5 % eosin으로 염색하고 계수하였다.

실시예 8: 종양 전이 분석

인 비보 폐 전이 분석을 위해서, B16F10 흑색종 세포(1 X 10⁵ 세포/마우스)를 0일에 C57BL/6 마우스(n=10) 꼬리 정맥에 주사하였다. 13일째에, 폐를 절제하여 전이 결절의 계수를 위하여 촬영하였다.

실시예 9: SDC -2에 대한 항체 생산

신데칸-2 단클론 항체는 AdipoGen Inc.에 의뢰하여 제작하였다. 랫트 신데칸-2의 세포외 도메인을 PCR을 통하여 증폭시킨 후 인간 면역글로불린 중쇄인 일정 부위 (Fc)와 자연에 존재하는 리더 염기서열인 pAGCF 그리고 플라스미노젠 활성 저해-1 리더 펩타이드 pAGPCF2를 넣어 클로닝하였다. Fc 융합물을 HEK293 세포에 트랜스펙션 시킨 뒤, 세포가 꽉 찬 상태에서 무혈청 배지 조건에서 2일 배양하여 랫트 신데칸-2-Fc 융합 단백질이 함유된 세포 배지를 얻었다. 세포 배지를 모은 뒤 원심분리를 통하여 세포를 제거하고 1M Tris를 사용하여 pH를 8.0으로 적정하였다. 이 배지를 0.4-㎛ 필터를 이용하여 필터링한 뒤, Protein A column에 걸어주고 100 mM glycine, pH 3.0 조건에서 용출하였다. 그리고 즉시 1 M Tris, pH 8.0을 사용하여 중성화 시켰다. BALB/c mice 가 강한 면역 반응을 통해 다클론 sera를 함유할 수 있도록 S2E-Fc fusion protein으로 면역반응을 일으켰다. 마우스로부터 비장을 적출하고 마우스 골수종 Sp2/0 세포에 융합을 시킨 후, 스크리닝과 단일 세포 클로닝을 정해진 프로토콜에 따라 진행하였다. 면역반응이 일어나지 못하는 BALB/c mice로 부터 복수를 얻어낸 뒤, Protein G를 통한 면역글로불린 단편(fraction)을 얻어 내어 신데칸-2에 대한 단클론 항체를 분비하는 안정적인 하이브리도마 클론(clone 197) 을 제작하였다.

실시예 10: AOM -유도된 대장암 모델의 확립

4 주령 수컷 FVB/J 마우스를 6 주 동안 10 mg/kg AOM(azoxymethane)로 1 주일에 1회 복강 주사하였다. 마우스를 AOM 최종 주사 후 30주에 희생하였다. 모든 동물들을 수의과 대학(서울대학교, 대한민국)에 실험동물 시설의 SPF 장벽 지역에서 유지하였다. 모든 동물들은 제한된 습도(50±5%), 빛(12/12 h 명/암 주기) 및 온도(23±2℃) 하에서 플라스틱 케이지에서 사육하였다. 모든 과정은 서울대학교의 실험동물 사육 관리 위원회에 따라 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인을 받았다.

실시예 11: Fc 수용체-수용성 신데칸-2 키메라 제조

세포외 도메인 (Met¹- Asn^148,서열번호 3) 및 절단 (sS2E-Fc-I, II, III) 수용성 신데칸-2 키메라 (sS2E-Fc)를 인간 IgG₁의 Fc 영역에 연결하였다. 444개 염기의 FcR-SDC2 cDNA를 Fc 영역을 포함하는 pcDNA 3.1 발현 벡터의 EcoRI/XhoI 효소 부위를 절단하여 삽입하였다.

실시예 12: 신데칸 -2- Fc 수용체 키메라의 인 비트로 절단 및 N-말단 서열분석

HETK293T 세포를 벡터 또는 플라스미드 S2E-Fc로 트랜스펙션시키고 조건화된 배지를 절단 버퍼(50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1mM CaCl₂)상에서 pro-MMP-7과 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. protein A-Sepharose slurry를 첨가하고, 추가로 1시간동안 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 결합된 물질을 15% (w/v) SDS-PAGE에 가하고, PDVF 막 (GE Healthcare Life Sciences)으로 블롯팅하였다. 막-결합 단백질을 CBB R-250 (Coomassie Brilliant Blue R-250)으로 염색하고, 막 상의 절단된 S2E-Fc 단편을 N-말단 서열 분석을 Tufts Core Facility (Tufts University, MA, USA)에서 Edman 절단 방법으로 수행하였다.

실시예 13: 세포 증식 분석

HCT116 세포의 증식을 sS2E-Fc (최종 10 % v/v)를 포함하는 조건화된 배지 존재 하에서 Park, H., et al., (2002). J. Biol. Chem. 33, 29730-29736.에 기재된 방법에 따라 MTT (3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 방법으로 분석하였다.

실시예 14: 소프트 아가로스 ( soft agarose )상에서 부착-비의존성( Anchorage - independent ) 성장 분석

6웰 플레이트의 각 웰을 3ml의 bottom agar 혼합물(Mccoy's 5A/10%FBS/0.6% agar)로 코팅하였다. bottom agar 막이 굳어진 후, VEC(대조군) 또는 sS2E-Fc를 포함하는 조건화된 배지 혹은 정상 또는 암 환자 혈청을 HCT116 세포 및 Mccoy's 5A/10%FBS/0.3%과 섞어 top agar 혼합물을 만들어 각 웰에 첨가하고, 상기 배양물을 37℃, 5% CO₂ 에서 배양하였다. 콜로니 형성을 광현미경으로 매일 모니터하고, 콜로니를 14일 동안 배양 후 카메라로 촬영하였다.

결과

1. MMP -7은 세포외 신데칸 -2의 절단을 조절한다.

신데칸-2 절단 (syndecan-2 shedding) 메카니즘을 분석하기 위해, 본 발명자들은 우선 암세포 조건화된 배지 내의 신데칸-2 수용성 형태의 존재를 확인하였다.

그 결과, 신데칸-2의 수용성 형태는 HT-29, Caco-2, LOVO 및 HCT116 세포를 포함하는 다양한 인간 대장암 세포의 조건화된 배지에서 검출되었다 (도 1A). 수용성의 잘려진 신데칸-2는 슬롯 HT-29 세포의 배지에서 부분적으로 분리하여 슬롯 블롯팅 (도 1B 왼쪽) 또는 웨스턴 블롯팅 (도 1B 오른쪽)으로 존재를 확인하였다. 흥미롭게도, 잘려진 신데칸-2의 수준은 잘 알려진 MMP 활성제인 APMA(4-aminophenylmercuric acetate)로 처리한 후에 증가하였으며 (도 1C), 이는 MMP가 절단의 조절에 관여되어 있다는 것을 시사한다.

다음으로 본 발명자들은 신데칸-2 절단이 MMP-7에 의해 일어나는지 여부를 조사하였다.

그 결과, HCT116 세포에서 MMP-7의 과발현은 조건화된 배지에서 수용성 신데칸-2의 수준을 증가시키는 반면, pSuper-MMP-7 shRNA 플라스미드를 사용하여 MMP-7을 넉다운시키면 반대의 효과가 나타나는 것을 확인하였다 (도 1D). HT-29 세포에 pro-MMP-7을 전처리한 경우, MMP-7은 시간- 및 농도-의존적으로 신데칸-2 절단을 증가시켰다 (도 1E). 또한, MMP-7-매개 신데칸-2 절단은 MMP-2 또는 MMP-9 보다 더 효과적이었다 (도 1F).

상기와 같은 결과들은 신데칸-2 절단은 특히, MMP-7이 매개한다는 것을 뒷받침하는 것이다.

2. MMP -7은 신데칸 -2의 세포외 도메인의 N-말단 Leu 잔기를 절단한다.

신데칸-2의 절단 부위를 동정하기 위하여, GST-재조합 신데칸-2 (GST-SDC2)를 인 비트로에서 정제된 pro-MMP-7 효소와 배양하였다.

그 결과, 예상대로 MMP-7은 신데칸-2를 용량 의존적으로 절단하였다 (도 2A). 그러나, MMP-7은 신데칸-2와 가장 근접한 상동성을 갖는 재조합 신데칸-4는 효과적으로 절단하지는 못하였다 (도 2B).

신데칸-2의 절단 부위를 동정하기 위하여, 정제된 GST-SDC2를 인 비트로에서 MMP-7와 배양하고, SDS-PAGE로 분석하였다.

그 결과, MMP-7은 GST-재조합 신데칸-2를 절단해서, 약 45 kDa의 절단 산물을 생성하였다 (도 2C). MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석 결과, 신데칸-2가 세포외 도메인의 N-말단 Leu¹⁴⁹ 잔기에서 절단된다는 것을 확인하였다 (도 2D).

신데칸-2는 다수의 글리코스아미노글리칸 사슬(glycosaminoglycan chain)을 갖고 있어서, 코어 단백질이 단백질 가수분해 절단으로부터 보호를 받을 수 있다. 이와 같은 문제를 밝히기 위해, 본 발명자들은 신데칸-2 세포외 도메인 (Met¹- Glu¹⁵⁴)을 인간 IgG₁의 Fc 영역에 연결한 신데칸-2 세포외 도메인-Fc 수용체 키메라 (syndecan-2 extracellular domain-Fc receptor chimera, S2E-Fc) 구조체를 구축하고, 상기 구조체를 코딩하는 발현 벡터를 HEK293T 세포에 트랜스펙션하여, 내생적으로 당쇄화된 단백질 (endogenously glycosylated protein)을 수득하였다.

그 결과, S2E-Fc의 수용성 형태를 HEK293T 세포가 자란 조건화된 배지에서 확인하였다 (도 3A). 정제된 S2E-Fc은 SDS-PAGE 상에서 smear 되었으며, 이는 당쇄화의 일반적인 형태이다. MMP-7은 S2E-Fc를 절단하여 약 36kDa 크기의 절단 생성물을 수득하였고, 이는 신데칸-2의 세포외 도메인에서 절단이 일어난다는 것을 시사한다 (도 3B). 다양한 범위의 MMP 억제제인 GM6001은 완전히 S2E-Fc 절단을 막았다 (도 3C). N-말단 서열 분석 결과는 MMP-7은 당쇄화된 S2E-Fc의 N-말단의 Leu¹⁴⁹를 절단한다는 것을 나타냈다 (도 3D). 이와 같은 결과들은 MMP-7이 신데칸-2의 절단을 매개한다는 것을 뒷받침한다.

신데칸-2의 절단에 있어 MMP-7의 기능을 더 분석하기 위해서, 본 발명자들은 Asn¹⁴⁸ 및 Leu¹⁴⁹ 잔기가 Ser 또는 Ile로 대체된 다양한 신데칸-2 돌연변이체(절단 부위 돌연변이체)를 구축하였다(도 4A). 재조합 신데칸-2 및 신데칸-2 절단 부위 돌연변이체는 GST-재조합 단백질로서 발현되었고, glutathione-agarose 비드를 사용하여 정제하고, 인 비트로에서 MMP-7과 배양하였다. 0.05 unit의 MMP-7은 재조합 야생형 신데칸-2의 50 %를 절단한 반면, Leu¹⁴⁹를 Ile¹⁴⁹로 대체한 (Asn¹⁴⁸-Ile¹⁴⁹)은 절단이 5 배 정도 감소하였다. Asn¹⁴⁸-Leu¹⁴⁹ 를 Ser (Ser¹⁴⁸-Ser¹⁴⁹)로 대체한 돌연변이체는 MMP-7에 의한 절단이 크게 감소하였다. 반면, Ser¹⁴⁸-Ser¹⁴⁹ 돌연변이체는 MMP-7에 의한 절단에 대해서 5배 정도 더 저항성을 가졌다 (도 4A). 흥미롭게도, 신데칸-2 Asn¹⁴⁸-Ile¹⁴⁹ 돌연변이체의 아미노산 서열은 그것의 최고로 근접한 동족체인 신데칸-4와 유사하고, 이것은 pro-MMP-7에 의해서 효과적으로 절단되지 않는다는 개념을 지지한다 (도 4A).

예상한대로, 잘려진 신데칸-2의 수준은 대조군인 벡터로 트랜스펙션시킨 세포보다 야생형, Asn¹⁴⁸-Ser¹⁴⁹, Ser¹⁴⁸-Ser¹⁴⁹ 신데칸-2 돌연변이체를 발현하는 벡터로 트랜스펙션된 HCT116 세포에서 증가하였다. 그러나, Asn¹⁴⁸-Ile¹⁴⁹ 돌연변이체를 발현하는 벡터로 트랜스펙션된 세포에서는 그렇지 않았다 (도 4B). 유사한 결과를 HT-29세포에서도 얻었다 (도 4C).

다음으로 본 발명자들은 잘려진 신데칸-2 돌연변이체가 대장암 이동을 조절하는지를 조사하였다. 신데칸-2로 트랜스펙션된 HCT116 세포의 이동은 벡터가 트랜스펙션된 세포에 비하여 현저하게 증가하였다. 그러나 신데칸-2 절단 부위 돌연변이체에 의한 세포 이동은 모두에서 감소하였다(도 4B;P < 0.05). 특히 최소 절단을 보인 Ser¹⁴⁸-Ser¹⁴⁹ 돌연변이체가 대장암 세포의 이동을 최고로 감소(가장 효과적인 저해 결과) 시켰다. 이러한 효과는 HT-29 및 HCT116 세포 모두에서 유사하였다(도 4C;P < 0.05). 이들 결과들은 신데칸-2의 절단이 대장암 세포의 이동의 조절에 관여한다는 것을 나타낸다.

3. 잘려진 신데칸 -2 외부도메인( ectodomain )은 암 세포 이동을 촉진한다.

본 발명자들은 잘려진 신데칸-2가 자가 분비를 통해 암세포 이동을 촉진하는지를 조사하였다.

도 5A에서 나타난 바와 같이, 배양액으로부터 정제된 잘려진 신데칸-2의 처리는 HT-29 및 HCT116 세포 모두에서 세포 이동을 촉진시켰다(*P < 0.05, **P < 0.01).

본 발명자들은 다음으로 신데칸-2 돌연변이체가 대장암 세포 이동을 조절할 수 있는지 조사하고자 하였다. 비록 세포 이동은 벡터-트랜스펙션된 세포보다 야생형 신데칸-2를 발현하는 벡터로 트랜스펙션시킨 HT29 및 HCT116 세포에서 현저하게 증가했지만, 이는 신데칸-2 Asn¹⁴⁸-Ile¹⁴⁹ 돌연변이체를 발현하는 세포에서 신데칸-2-매개 세포 이동이 현저하게 감소하는 것을 확인하였고, 이는 절단이 최소화된다는 것을 의미한다 (도 5B. HT-29, 벡터 =1.0배, 야생형 = 2.59배, Asn¹⁴⁸-Ile¹⁴⁹ =1.54-배, 차이, 벡터 vs. 야생형 = 1.59-배, 95% CI = 1.54- 내지 1.64-배, P < .01; 차이, 벡터 vs. Asn¹⁴⁸-Ile¹⁴⁹ =0.54-배, 95% CI = 0.53- 내지 0.56-배, P < .01; HCT116, 벡터 =1.0-배, 야생형 = 2.12-배, Asn¹⁴⁸-Ile¹⁴⁹ = 1.26-배, 차이, 벡터 vs. 야생형 = 1.12-배, 95% CI = 1.07- 내지 1.16-배, P < .01; 벡터 vs. Asn¹⁴⁸-Ile¹⁴⁹ = 0.26-배, 95% CI = 0.24- to 0.27-배, P < .01).

본 발명자들은 이전에 신데칸-2가 B16F10 마우스 흑색종 세포에서 전이 잠재성을 조절한다는 것을 보고한 바가 있다. 대장암 세포와 유사하게 본 발명자들은 야생형 신데칸-2를 발현하는 B16F10 세포로부터 조건화된 배지에서 잘려진 신데칸-2의 수준이 증가되지만 Asn¹⁴⁸-Ile¹⁴⁹ 돌연변이체에서는 그렇지 않다는 것을 확인하였다 (도 5C, 위). 유사하게, 신데칸-2가 과발현된 B16F10 세포는 세포 이동이 증가하지만 돌연변이체를 발현하는 세포에서는 이동 능력이 감소하였다 (도 5C, 아래, 벡터 = 1.0-배, 야생형 = 2.53-배, Asn¹⁴⁸-Ile¹⁴⁹ = 1.48-배).

잘려진 신데칸-2가 인 비보에서도 세포 이동을 유도할 수 있는 지를 분석하였다. B16F10 세포 내에서 마우스 신데칸-2 (mSDC2)를 마우스 특이적 siRNA로 넉다운시키고, 랫트 신데칸-2(rSDC2) cDNA (야생형 또는 절단 돌연변이체)를 코딩하는 벡터를 이용하여 재-발현시키고, 상기 B16F10 세포를 6주령의 C57BL/6 마우스 꼬리 정맥으로 주사하여 폐 전이 모델을 제작하였다.

그 결과, 돌연변이체로 트랜스펙션된 B16F10 세포가 주입된 마우스로부터 분리된 폐 샘플은 야생형이 트랜스펙션된 세포가 주입된 마우스에 비해 폐전이가 감소하였다 (도 5D). 이와 같은 데이터는 신데칸-2에 의해 유도되는 전이 활성이 세포외 도메인의 절단과 연관되어 있음을 뒷받침한다.

암 세포 이동에 대한 잘려진 신데칸-2의 효과를 더 테스트하기 위해서, 본 발명자들은 인간 IgG₁의 Fc 부분을 잘려진 신데칸-2의 세포외 도메인(아미노산 Met¹- Asn¹⁴⁸)에 연결하여서 Fc 수용체-신데칸-2 키메라(sS2E-Fc)를 구축하고 이 구축물을 코딩하는 벡터를 HCT116 세포에 트랜스펙션시켰다. 세포 이동은 벡터 트랜스펙션된 세포에 비하여 sS2E-Fc로 트랜스펙션된 HCT116 세포에서 크게 증가하였고(P < 0.05), sS2E-Fc를 발현하는 HCT116세포로부터 유래한 조건화된 배지는 HCT116 세포의 이동을 촉진하였다 (도 6A; P < 0.05).

유사하게, sS2E-Fc 과발현은 soft agar 상의 HCT116 세포의 접착-의존성 성장을 증가시켰다 (도 6B). xCELLigence system을 이용하여 sS2E-Fc가 HCT116 세포의 이동을 증가시킨다는 것을 뒷받침하였다(도 6C, 벡터=1.0-배, sS2E-Fc = 3.16-배). 그러나 sS2E-Fc는 세포 증식(도 6D) 또는 HCT116 세포의 접착(도 6E)에는 영향이 없었다. 이와 같은 결과들은 잘려진 신데칸-2가 대장암 세포의 이동 및 콜로니 형성을 촉진한다는 것을 나타낸다.

나아가, 잘려진 신데칸-2 조각의 암 활성 부위를 구명하기 위하여 인간 IgG₁의 Fc 부분을 잘려진 신데칸-2의 세포외 도메인을 부분적으로 제거 한 신데칸-2 세포외 도메인 (sS2E-Fc-I: Met¹- Asp⁵⁸ , sS2E-Fc-II: Met¹- Ser⁸⁸ , sS2E-Fc-III: Met¹- Asp¹¹⁸)에 연결하여서 다양한 Fc 수용체-신데칸-2 키메라를 구축하고 (도 7A), 이 구축물을 HEK293T 세포에 트랜스펙션시킨 뒤 배양액을 얻어 제대로 발현 되는 지 확인하였다 (도 7B). 이를 xCELLigence system (도 7C) 및 trasnewell (도 7D)을 이용하여 sS2E-Fc-II 부위에서(Asp⁵⁸ -Ser⁸⁸) HCT116 세포의 이동을 증가시킨다는 것을 뒷받침하였다. 이는 흥미롭게도 MMP-7이 결합할 것이라 예상되는 부위와 일치 한다.

4. 혈청 내 잘려진 신데칸 -2의 양은 대장암 환자에서 증가한다.

대장암에 대한 바이오마커로서의 신데칸-2의 기능을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 대장암 환자의 여러 단계로부터 혈청을 모아서 슬롯 블럿팅을 사용하여 혈청에서 잘려진 신데칸-2 레벨을 분석하였다. 잘려진 신데칸-2는 2/16 (12.5 %) 선종(Ade), 4/16 (25 %) 암종(carcinoma) in situ (CIS) 및 11/16 (69 %) 진행성(advanced) 대장암(AC) 환자에서 검출된 반면, 잘려진(shed) 신데칸-2는 정상 (N) 혈청에서는 검출되지 않았다(0/16, 도 8A), 이것은 대장암 환자는 잘려진 신데칸-2를 생성한다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도 잘려진 신데칸-2의 혈청 양은 대장암의 발달 동안에 증가한다(도 8A). 신데칸-2 항체들과 혈청 면역글로불린 사이의 비특이적인 상호작용을 회피하기 위하여, 대장암 환자 혈청을 protein A-비드와 미리 배양하였다. 혈청 면역글로불린의 사전 제거 후, 잘려진 신데칸-2 검출은 많이 개선되었고(도 8B), 이것은 혈청에서 떨어진 신데칸-2와 신데칸-2 항체 사이의 특이적 결합을 나타낸다. 혈청에서 잘려진 신데칸-2의 검출을 더 개선하기 위해서, 대장암 환자 혈청을 아질산(HNO₂)으로 처리하였다. 도 8C에서 알 수 있는 바와 같이, 혈청의 비특이적인 단백질의 제거는 잘려진 신데칸-2 검출을 더욱 향상시켰다. 떨어진 신데칸-2는 70 %의 선종, 80 %의 암종 in situ 및 90 %의 진행성 대장암 환자에서 검출되었다(도 8D). 유사한 결과들은 마우스 단클론 신데칸-2 항체를 사용한 웨스턴 블럿팅에서도 얻었다(도 8E). 한편 잘려진 신데칸-2는 또 다른 위장관암인 위암의 혈청에서는 검출되지 않았다(도 8F). 이들 데이터는 신데칸-2 잘려짐이 대장암 발달 동안에 일어나고 잘려진 신데칸-2는 대장암 발달과 상관관계가 있다는 것을 나타낸다.

이러한 것과 일치하게, 본 발명자들은 신데칸-2 발현이 AOM(azoxymethane)-유도된 마우스의 대장에서 증가하는 것을 발견하였다(도 9). AOM 주사 30주 후, 모든 AOM-주사된 FVB/J 마우스들은 현저한 대장암 병변을 보였다. 현저한 신데칸-2 발현이 이들 마우스의 대장 병변의 증식적인 상피에서 관찰되었으나 정상 대조군 FVB/J 마우스에서는 그러한 발병이 관찰되지 않았다. 또 다른 대장암 동물 모델인 가족성 선종성 용종증(familial adenomatous polyposis)의 Apc/min 마우스 모델에서도 잘려진 신데칸-2가 혈청에서 검출되었다(도 9). 이들 발견은 잘려진 신데칸-2가 인간 및 동물 모델 모두에서 대장암 발암현상 동안 혈청으로 분비된다는 것을 시사하는 것으로, 신데칸-2 펩티드 단편이 특이적인 대장암 진단 마커로 사용될 수 있음을 뒷받침하는 것이다.

5. 대장암 환자의 혈청에서 잘려진 신데칸 -2의 증가 정도는 대장암 세포의 이동성 증가와 상관관계가 있다.

본 발명자들은 대장암 환자의 혈청에서 잘려진 신데칸-2가 대장암 활성과 관련이 있는지를 분석하였다. 신데칸-2의 잘려진 정도는 신데칸-2 항체를 사용한 슬롯 블럿팅을 사용하여 조사하였고, 대장암 환자의 각 혈청은 암 세포 이동 분석에 대한 화학 유인물질(chemoattractant)로 사용하였다. 선종, 진행성 암종으로부터 유래한 잘려진 신데칸-2를 많이 함유한 혈청은 상대적으로 적은 양의 잘려진 신데칸-2를 함유하고 있는 혈청을 처리한 세포와 비교해서 HCT116 대장암 세포의 세포 이동을 현저하게 촉진하였다(도 10A; *P < 0.05, **P < 0.01). 또한 혈청에 함유된 잘려진 신데칸-2를 제거하였을 경우, 이 혈청에 의한 대장암 세포의 이동 증가 효과는 사라졌다(도 10B; P < 0.05).

흥미롭게도, 진행성 암종으로부터 유래한 잘려진 신데칸-2-함유 혈청을 테스트한 결과 세포 증식은 변하지 않고(데이터 도시 안 함) 대부분의 대장암 세포의 이동성이 증가한 반면, 유방암, 위암, 간암 및 폐암과 같은 다른 암 세포에서는 효과가 없었다(도 10C). 이것은 대장암 세포의 이동에 특이성을 가진다는 것을 의미한다. 또한 조직의 MMP-7 발현이 높을 경우 혈청에 잘려진 신데칸-2 레벨 역시 높았으며, 이동도 증가하였다 (*P < 0.05, **P < 0.01). 아울러, 부착-의존성 콜로니 형성도 증가하였다 (도 10D).

이 모든 데이터들은 혈청에 존재하는 잘려진 신데칸-2가 대장암 세포의 이동성을 증가시킨다는 것을 강하게 의미한다.

<110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation <120> Syndecan-2 peptide fragment as a marker for diagnosing colorectal cancer and as a therapeutic agent thereof <130> PA110560/KR <150> KR10-2010-0075966 <151> 2010-08-06 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 138 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Arg Ala Trp Ile Leu Leu Thr Leu Gly Leu Val Ala Cys Val 1 5 10 15 Ser Ala Glu Ser Arg Ala Glu Leu Thr Ser Asp Lys Asp Met Tyr Leu 20 25 30 Asp Asn Ser Ser Ile Glu Glu Ala Ser Gly Val Tyr Pro Ile Asp Asp 35 40 45 Asp Asp Tyr Ala Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ala Asp Glu Asp Val Glu 50 55 60 Ser Pro Glu Leu Thr Thr Ser Arg Pro Leu Pro Lys Ile Leu Leu Thr 65 70 75 80 Ser Ala Ala Pro Lys Val Glu Thr Thr Thr Leu Asn Ile Gln Asn Lys 85 90 95 Ile Pro Ala Gln Thr Lys Ser Pro Glu Glu Thr Asp Lys Glu Lys Val 100 105 110 His Leu Ser Asp Ser Glu Arg Lys Met Asp Pro Ala Glu Glu Asp Thr 115 120 125 Asn Val Tyr Thr Glu Lys His Ser Asp Ser 130 135 <210> 2 <211> 201 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Arg Ala Trp Ile Leu Leu Thr Leu Gly Leu Val Ala Cys Val 1 5 10 15 Ser Ala Glu Ser Arg Ala Glu Leu Thr Ser Asp Lys Asp Met Tyr Leu 20 25 30 Asp Asn Ser Ser Ile Glu Glu Ala Ser Gly Val Tyr Pro Ile Asp Asp 35 40 45 Asp Asp Tyr Ala Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ala Asp Glu Asp Val Glu 50 55 60 Ser Pro Glu Leu Thr Thr Ser Arg Pro Leu Pro Lys Ile Leu Leu Thr 65 70 75 80 Ser Ala Ala Pro Lys Val Glu Thr Thr Thr Leu Asn Ile Gln Asn Lys 85 90 95 Ile Pro Ala Gln Thr Lys Ser Pro Glu Glu Thr Asp Lys Glu Lys Val 100 105 110 His Leu Ser Asp Ser Glu Arg Lys Met Asp Pro Ala Glu Glu Asp Thr 115 120 125 Asn Val Tyr Thr Glu Lys His Ser Asp Ser Leu Phe Lys Arg Thr Glu 130 135 140 Val Leu Ala Ala Val Ile Ala Gly Gly Val Ile Gly Phe Leu Phe Ala 145 150 155 160 Ile Phe Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Asp Glu 165 170 175 Gly Ser Tyr Asp Leu Gly Glu Arg Lys Pro Ser Ser Ala Ala Tyr Gln 180 185 190 Lys Ala Pro Thr Lys Glu Phe Tyr Ala 195 200 <210> 3 <211> 148 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 3 Met Arg Val Arg Ala Thr Ser Pro Gly Asn Met Gln Arg Ala Trp Ile 1 5 10 15 Leu Leu Thr Leu Gly Leu Met Ala Cys Val Ser Ala Glu Thr Arg Ala 20 25 30 Glu Leu Thr Ser Asp Lys Asp Met Tyr Leu Asp Ser Ser Ser Ile Glu 35 40 45 Glu Ala Ser Gly Leu Tyr Pro Ile Asp Asp Asp Asp Tyr Ser Ser Ala 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Tyr Glu Asp Lys Gly Ser Pro Asp Leu Thr Thr 65 70 75 80 Ser Gln Leu Ile Pro Arg Ile Ser Leu Thr Ser Ala Ala Pro Glu Val 85 90 95 Glu Thr Met Thr Leu Lys Thr Gln Ser Ile Thr Pro Thr Gln Thr Glu 100 105 110 Ser Pro Glu Glu Thr Asp Lys Lys Glu Phe Glu Ile Ser Glu Ala Glu 115 120 125 Glu Lys Gln Asp Pro Ala Val Lys Ser Thr Asp Val Tyr Thr Glu Lys 130 135 140 His Ser Asp Asn 145 <210> 4 <211> 211 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 4 Met Arg Val Arg Ala Thr Ser Pro Gly Asn Met Gln Arg Ala Trp Ile 1 5 10 15 Leu Leu Thr Leu Gly Leu Met Ala Cys Val Ser Ala Glu Thr Arg Ala 20 25 30 Glu Leu Thr Ser Asp Lys Asp Met Tyr Leu Asp Ser Ser Ser Ile Glu 35 40 45 Glu Ala Ser Gly Leu Tyr Pro Ile Asp Asp Asp Asp Tyr Ser Ser Ala 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Tyr Glu Asp Lys Gly Ser Pro Asp Leu Thr Thr 65 70 75 80 Ser Gln Leu Ile Pro Arg Ile Ser Leu Thr Ser Ala Ala Pro Glu Val 85 90 95 Glu Thr Met Thr Leu Lys Thr Gln Ser Ile Thr Pro Thr Gln Thr Glu 100 105 110 Ser Pro Glu Glu Thr Asp Lys Lys Glu Phe Glu Ile Ser Glu Ala Glu 115 120 125 Glu Lys Gln Asp Pro Ala Val Lys Ser Thr Asp Val Tyr Thr Glu Lys 130 135 140 His Ser Asp Asn Leu Phe Lys Arg Thr Glu Val Leu Ala Ala Val Ile 145 150 155 160 Ala Gly Gly Val Ile Gly Phe Leu Phe Ala Ile Phe Leu Ile Leu Leu 165 170 175 Leu Val Tyr Arg Met Arg Lys Lys Asp Glu Gly Ser Tyr Asp Leu Gly 180 185 190 Glu Arg Lys Pro Ser Ser Ala Ala Tyr Gln Lys Ala Pro Thr Lys Glu 195 200 205 Phe Tyr Ala 210 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gtacaccgag aaacattcag acaattcaag cggacgg 37 <210> 6 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acgtgtacac cgagaaacat tcagactcgt cgttcaagcg g 41 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 acgtgtacac cgagaaacat tcagacaata tcttcaagcg g 41 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccgtccgctt gaacgaattg tctgaatgtt tctcggtgta c 41

Claims

신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 펩티드 단편은 서열번호 1 또는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것인 대장암 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편에 특이적인 항체를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트.
제4항에 있어서, 상기 키트는 단백질 칩 키트인 것인 대장암 진단용 키트.
제4항에 있어서, 상기 키트는 i) SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법, 또는 ii) 항체에 부착된 형광표지에 의한 형광을 검출함으로써 양이 측정되는 것인 대장암 진단용 키트.
대장암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 대장암이 의심되는 개체의 시료로부터 신데칸-2 (syndecan-2) 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 신데칸-2 펩티드 단편의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 대장암 마커인 신데칸-2 펩티드 단편을 검출하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청 또는 혈장으로부터 선택되는 어느 하나인 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편은 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 기재되는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편의 발현 수준은 전기영동(Electrophoresis), MALDI-TOF MS(Matrix-assisted laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 또는 SELDI-TOF MS(surface-enhanced laser desorption and ionization time-of-flight mass spectrometry) 방법을 이용하여 측정되는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 펩티드 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편의 발현 수준은 신데칸-2 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것인 방법.
대장암 치료용 후보물질 처리 후, 신데칸(Syndecan)-2 펩티드 단편의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 대장암 치료제의 스크리닝 방법.
제12항에 있어서, MMP-7의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 치료제는 서열번호 2의 신데칸-2 세포외 도메인의 139번째 잔기인 루이신을 이소루이신으로 돌연변이시키거나, 서열번호 4의 신데칸-2 세포외 도메인의 149번째 잔기인 루이신을 이소루이신으로 돌연변이시키 것인 방법.
신데칸-2 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 대장암 치료용 약제학적 조성물.