KR20120005497A - 유방내 유두 밀봉 제제 및 이를 사용하여 숙성된 치즈에서 시각적 결함을 감소 또는 제거시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유방내 유두 밀봉제, 및 인간이 아닌 동물의 건유기 동안 유방 질환의 예방적 치료를 위해 상기 동물의 유두관에 물리적 장벽을 형성하는데 상응하는 방법을 기재한다. 상기 방법은 글리세리드-함유 겔 베이스 중 금속염을 비롯한 유두 밀봉 제제를 상기 동물의 유두관에 주입하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 이렇게 처리된 동물의 밀크로 제조된 유제품, 특히 체다 치즈에서 검은색 반점 결함의 형성을 예방한다.

Description

유방내 유두 밀봉 제제 및 이를 사용하여 숙성된 치즈에서 시각적 결함을 감소 또는 제거시키는 방법 {INTRA-MAMMARY TEAT SEALANT FORMULATION AND METHOD OF USING SAME TO REDUCE OR ELIMINATE VISUAL DEFECTS IN AGED CHEESES}

스콧(Scott) A. 랑킨(Rankin), Ph.D.

관련 출원에 대한 상호 참조

2009년 4월 8일 출원한 가출원 제61/207,879호를 우선권으로 주장하며, 그의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 본원은 또한 본원에 참고로 포함된 공동-계류중인 출원 제11/869,966호(출원일: 2007년 10월 10일)에 관한 것이다.

본 발명은 건유우(dry cows)에서 유선염을 예방하기 위한, 금속-함유 유방내 유두 밀봉제에 관한 것이다. 상기 유방내 유두 밀봉제는 처리된 동물의 밀크(milk)로 제조된 유제품 (특히 치즈)에서 시각적 결함을 야기하지 않는다. 본 발명은 또한 치즈에서 "검은색 반점 결함" (BSD)을 예방하는 방법에 관한 것이다.

낙농 가축에서 유선염은 낙농업자들이 직면하게 되는 비용이 가장 많이 들고 어려운 질병 중 하나이다. 임상적 유선염의 치유를 목적으로 하는 통상적인 치료법은 유방내 항미생물 치료법을 포함한다. 수많은 유방내 항미생물 제품이 시판되고 있음에도 불구하고, 임상적 유선염의 치유율은 당혹스럽게도 스트렙토코커스 종(Streptococcus spp .)에 대해서는 46％, 스타필로코커스 종(Staphylococcus spp.)에 대해서는 21％, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유선염에 대해서는 단지 9％로서 여전히 낮다. 문헌 [Wilson et al. (1996) National Mastitis Council Proceedings 164-165], 및 [Crandall et al. (2005) NMC Annual Meeting Proceedings 215-216]을 참고한다. 따라서, 낙농업자들은 종종 그들의 가축 무리로부터 유선염에 걸리기 쉬운 동물을 선별해 냄으로써 상기 질환을 단순하게 처리하고 있다.

유선염의 치료가 어렵기 때문에, 낙농 산업에서는 새로운 유방내 감염의 예방에 중점을 두고 있다. 새로운 감염의 비율은 수유기에 비해 건유기 동안에 상당이 더 높다 (예를 들어, 한 연구 결과, 새로운 모든 그람-음성 유방내 감염의 61％가 건유기 동안에 발생하였음, 문헌 [Todhunter et al. (1995) J. Dairy Sci. 78:2366] 참고). 건유기 직후 3주 및 분만전 2주는 새로운 감염에 특히 걸리기 쉬운 시기이다. 따라서, 최근 수년동안, 낙농업자들은 소의 건유기 동안 "예방적 유지"를 위해 상당한 노력을 집중하였다.

2003년 4월, 건유우에 사용하기 위한 내부(또는 "유방내") 유두 밀봉제 (ITS)가 미국 시장에 도입되었다. 미국에서 상표명 "오베실(ORBESEAL)" (미국 상표 등록 번호 제2,772,198호 및 제3,120,693호)로 시판된 상기 제품은 뉴질랜드에서 개발되었다. 미국 시장에 도입된 "오베실" 브랜드의 ITS는 점성 페이스트 중에 분산된 65％ w/w 비스무트 서브-니트레이트를 함유한다. 상기 ITS 제품은 어떠한 항생제도, 어떠한 활성 항미생물제도 함유하지 않는다. 상기 ITS는 건유우 항생제를 적용하는 것과 동일한 방식으로 관형 적용 시린지를 사용하여 유두 끝에 주사된다. 상기 ITS 제품은 유두관의 열구 및 주름부에 충진되어, 병원균에 대한 물리적 장벽을 생성한다. 2001년 7월 3일 허여된 미국 특허 제6,254,881호를 참조하며, 상기 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

뉴질랜드의 "오베실" 브랜드 제품의 최초 연구는, 분만시 새로운 유방내 감염을 예방하고 수유한지 처음 5개월 동안 유선염의 임상적 출현을 예방하는데 있어서, 광범위하게 장기간 작용하는 유방내 항생제로도 기능하는 것으로 결론 내려졌다. 문헌 [Woolford et al. (1998) New Zealand Veterinary Journal 46:1]을 참고한다. 또한, 미국에서의 더 최근 연구 결과, 상기 ITS 제품이 클록사실린 벤자틴이 이미 주입된 소의 유방 건강을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 문헌 [Godden et al. (2003) J. Dairy Sci. 86:3899-3911]을 참고한다. 따라서, "오베실" 브랜드 ITS는 건유기 동안 낙농우에서 새로운 유선염 발생의 회수를 감소시키는데 효과적인 수단인 것으로 증명되었다. "오베실" 브랜드 제품이 미국 시장에 비교적 최근에 도입되었음에도, 상기 제품은 시장에 널리 보급되어 미국 낙농 가축에게 광범위하게 사용되었다. 간략히, "오베실" 브랜드 제품은 유선염 예방이라는 의도된 목적에 있어 매우 양호하다.

미국에 "오베실" 브랜드 ITS 제품이 도입된 후에, 숙성된 유제품, 가장 주목할만하게는 숙성된 체다 치즈에서 시각적 결함이 나타나기 시작하였다. 상기 시각적 결함은 숙성된 치즈에 걸쳐 나타나는 작은 검은색 반점의 형태 (대략 직경 0.5 내지 5 mm)를 띄었다. 상기 반점은 순전히 미학적인 시각적 결함으로서, 이러한 문제를 가진 치즈의 품질 등급 (즉, 시장 가치)을 저하시킨다. 상기 반점은 치즈에서의 어떠한 관능적(organoleptic) 결함에 의해 수반되는 것이 아니다. 검은색 반점이 있는 치즈는 판매 가능하지만, 그렇지 않은 치즈에 비해 낮은 등급을 갖는다. 상기 결함은 "검은색 반점 결함" (BSD)이라고 명명된다.

발명의 개요

본 발명의 제1 양태는 인간이 아닌 동물의 건유기 동안 유방 질환을 예방적으로 치료하고, 동시에 상기 동물의 밀크로 제조된 유제품에서 BSD를 예방하기 위해, 상기 동물의 유두관에 물리적 장벽을 형성하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 동물의 유두관에 유두 밀봉 제제를 주입하는 것을 포함한다. 유두 밀봉 제제는 비스무트를 함유하거나 또는 비스무트-무함유일 수 있다. 상기 제제는 유두로의 미생물 진입에 대한 물리적 장벽을 형성하기에 충분한 양으로 투여되며, 상기 동물의 밀크로 제조된 유제품에서 검은색 반점 결함을 야기하지 않는다. 바람직하게는, 상기 유두 밀봉제는 항감염제를 함유하지 않는다 (즉, 바람직하게는 상기 유두 밀봉제는 항생제나 다른 항감염 활성제를 함유하지 않는다). 상기 방법은 무독성 금속염을 바람직하게는 약 30 중량％ 이상, 더욱 바람직하게는 무독성 금속염을 약 50 중량％ 내지 약 75 중량％, 보다 더 바람직하게는 무독성 금속염을 약 65 중량％ 포함하는 유두 밀봉 제제를 주입하는 것을 포함한다. 상기 염의 주요 목적은 ITS가 유두관에 "정착"하도록 조성물에 충분한 밀도를 부여하는 것이다.

상기 방법의 한 양태에서, 무독성 금속염은 비스무트 염, 티타늄 염, 아연 염, 바륨 염, 및 이들 염의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 염은 비스무트 서브-니트레이트, 티타늄 디옥시드, 아연 옥시드, 바륨 술페이트 및 이들 염의 조합물이다. 이들 금속의 다른 무독성 염, 예를 들면 할라이드, 술페이트, 포스페이트, 카르보네이트, 니트레이트, 술파메이트, 아세테이트, 시트레이트, 락테이트, 타르트레이트, 말로네이트, 옥살레이트, 살리실레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 푸마레이트, 말레에이트는 본 발명의 범주 내에 명백하게 포함된다.

상기 겔 베이스는 임의의 적합한 겔 제제일 수 있으며, 대부분 제약 분야에 공지되어 있다. 바람직한 겔 베이스로는 대단히 개선된 세정능력을 제공하는 모노-, 디-, 및/또는 트리글리세리드가 포함된다. 상기 글리세리드는 포화 또는 불포화 지방산에서 유도될 수 있는 동일한 측쇄 또는 상이한 측쇄를 함유할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, 모노-, 디-, 및/또는 트리글리세리드는 데칸산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 펜타데칸산, 스테아르산, 아라킨산 산, 베헨산, 리그노세르산, 마르가르산, 미리스트올레산, 팔미톨레산, 올레산, 가돌레산, 에루크산, 리시놀산, 리놀레산, 리놀렌산, 리카닌산, 마가롤레산, 아라키돈산, 클루파나돈산, 에이코사펜타에노산, 도코사헥사에노산 등으로부터 유도된 측쇄를 포함할 수 있다. 더 길거나 더 짧은 측쇄를 갖는 글리세리드도 사용될 수 있다. 글리세리드는 천연 동물 또는 식물성 오일 또는 지방, 예컨대 동물 지방, 카놀라 오일, 코코넛 오일, 옥수수 오일, 목화씨 오일, 아마씨 오일, 야자 오일, 야자 알맹이 오일, 유채씨 오일, 대두 오일, 해바라기 오일, 피쉬 오일, 해조류 오일 등 (이들로 한정되지는 않음)을 포함하거나 유도될 수 있다. 특히 바람직한 겔 베이스는 카놀라 오일, 옥수수 오일, 및/또는 목화씨 오일이다. 다수의 글리세리드의 상업적 공급업체, 예컨대 오하이오주 콜럼버스 소재의 아비텍 코포레이션(ABITEC Corporation)사가 존재한다. 아비텍사의 제품 "캅텍스(CAPTEX) 355," 목록 번호 65381-09-1 및 73398-61-5, 카프릴산 트리글리세리드는 본 발명에서 매우 잘 작용한다.

따라서, 유방내 유두 밀봉 제제는 그의 가장 바람직한 형태에 있어서, 글리세리드를 포함하는 겔 베이스; 및 겔 베이스 중 분산된 무독성 금속염을 함께 포함한다. 따라서 바람직한 상응하는 방법은 동물의 유두관으로 소정량의 유두 밀봉 제제의 주입을 포함한다. 유두 밀봉 제제는 글리세리드를 포함하는 겔 중 분산된 무독성 금속염을 포함하는데, 여기서 주입된 유두 밀봉 제제의 양은 유두관으로의 미생물의 진입에 대해 물리적 장벽을 형성하기에 충분하다. 유두 밀봉 제제는 또한 동물의 밀크로 제조된 유제품에서 검은색 반점 결함을 야기하지 않는다.

본 발명의 또다른 양태는 모노-, 디-, 및/또는 트리글리세리드를 비롯한 겔 베이스, 및 상기 겔 베이스에 분산된 무독성 금속염으로 본질적으로 이루어지는 유방내 유두 밀봉제에 관한 것이고, 여기서 금속염은 비스무트 서브-니트레이트이다. 상기 언급한 바와 같이, 유두 밀봉제는 바람직하게는 상기 금속염을 약 30 중량％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 50 중량％ 내지 약 75 중량％, 보다 더 바람직하게는 약 65 중량％ 포함한다.

본 발명의 또다른 양태는 유방내 유두 밀봉제의 개선에 관한 것이다. 구체적으로, 인간이 아닌 동물의 유두관에 항감염제 없이 밀봉 제제를 주입하는 단계를 포함하는, 인간이 아닌 동물의 건유기 동안 유방 질환을 예방적으로 치료하기 위해 상기 동물의 유두관에 물리적 장벽을 형성하는 방법에 있어서, 본 발명의 개선점은 글리세리드-함유 겔 베이스 중에 무독성 금속염(들)을 포함하는 유두 밀봉 제제를 주입하는 것을 포함한다. 상기 개선점은 처리된 동물의 밀크로 제조된 유제품에서 검은색 반점 결함의 형성을 예방한다.

본원에 사용된 수치 범위는 명확하게 개시되어 있든 아니든, 그 범위 내에 함유된 모든 수 및 그러한 수의 하위집단을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 상기 수치 범위는 그 범위 내의 임의의 수 또는 그의 하위세트에 관한 청구항에 대한 지지를 제공하는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들면, 1 내지 10의 개시는 2 내지 8의 범위, 3 내지 7의 범위, 5, 6, 1 내지 9의 범위, 3.6 내지 4.6의 범위, 3.5 내지 9.9의 범위 등을 지지하는 것으로서 해석되어야 한다.

언급된 문맥에 의해 달리 기술되지 않거나 또는 명백하게 암시되지 않는다면 본 발명의 단수형 특징 또는 제한에 대한 모든 참조는 상응하는 복수형 특징 또는 제한을 포함할 것이며, 그의 반대 또한 그러하다.

언급된 조합이 이루어지는 문맥에 의해 달리 기술되지 않거나 또는 명백하게 암시되지 않는다면 본원에 사용된 바와 같은 방법 또는 공정 단계의 모든 조합은 임의의 순서로 수행될 수 있다.

본 발명의 방법은 본원에 기재된 방법 및 생성물의 필수 요소 및 제한 및 임의의 추가의 성분 또는 본원에 기재되거나 또는 그 외의 합성 유기 화학에 유용한 임의의 성분, 성분들, 또는 제한을 포함하거나, 그러한 것으로 이루어지거나, 또는 그러한 것으로 본질적으로 이루어질 수 있다.

도 1a 및 1b는 숙성된 백색 체다 치즈 18 kg 블록에 있는 전형적인 검은색 반점 결함의 사진이다. 도 1a는 검은색 반점 결함이 쉽게 눈에 띄는 블록의 표면을 도시한다. 도 1b는 상기 결함의 치수를 도시하는 확대도 (자가 위에 겹쳐져 있음)이다. 이러한 반점은 상기 치즈에 걸쳐 동등하게 분포된다.
도 2는 비스무트 (III) 술파이드 나노로드(nanorod)의 특징적인 모발형 또는 막대형 구조를 나타내는 검은색 반점 결함의 전자 현미경 사진이다. 이러한 구조체는 시험한 임의의 비-BSD 치즈 또는 비-BSD 치즈 영역에서는 발견되지 않았다. 도 2에 도시된 막대는 직경이 37.09 nm 내지 129.33 nm이었다.
도 3은 검은색 반점 결함 영역으로부터의 단일 막대형 구조체의 전자 현미경 사진이다. 상기 막대는 직경이 130.88 nm이었고, 막대의 길이를 양분하는 선을 나타낸다.
도 4A 및 4B는 실험실에서 유도된 검은색 반점 결함의 이미지이다. 도 4A에서는, "오베실" 브랜드 유방내 유두 밀봉제 (ITS)의 다양한 성분들을 치즈와 블렌딩하고, 즉시 각 반점들을 사진 촬영하였다. 도 4B는 숙성된 체다 치즈의 휘발성분 또는 황화수소 가스에 노출후 사진 촬영한 동일한 반점들을 도시한다. 지점 4 및 5는 각각 비스무트 서브니트레이트 및 그대로의 "오베실" 브랜드 ITS 제제를 함유한다.
도 5는 다양한 유형의 ITS의 세정능력을 도시하는 막대그래프이다.
도 6은 상이한 온도에서 ITS 제제의 점도를 도시하는 그래프이다. X-축은 ℃로 온도를 도시하고, Y-축은 점도를 도시한다.
발명의 상세한 설명
2003년 말부터, 치즈 제조업자들이 숙성된 치즈, 특히 숙성된 체다 치즈에서 새로운 "검은색 반점 결함"의 발생에 대한 정보를 얻기 위해 위스콘신-매디슨 대학의 식품공학부 및 낙농 연구 센터 (CDR)에 다수의 문의를 의뢰해 왔다. 역사적으로, 치즈에서 회색 내지 검은색의 변색은 특정 미생물 (예를 들어, 특정한 환경적 프로피온산균 또는 곰팡이)의 성장이나 식품 등급 윤활제 파편에 의한 치즈 오염을 비롯한 여러가지 상이한 원인에 의해 발생하였다. 그러나, 치즈 제조업자들이 주목한 특정한 BSD는 박테리아 오염 또는 다른 손상 유기체의 특성에도 부합되지 않았고, 밀크 스트림으로 침투한 윤활제 파편 또는 치즈 제조 공정 동안 도입되는 다른 파편으로 인한 것으로 여겨지지도 않았다.
따라서, 첫번째 단계는 상기 검은색 반점 결함의 화학 구조를 결정하는 것이었다. 초기에 BSD 치즈의 문제 영역을 추출하기 위해 수많은 노력이 이루어졌다. 치즈 매트릭스로부터 임의 유형의 유기 색소 물질을 단리하는 수단으로서 다양한 극성, 소수성 등을 가진 광범위한 유기 용매를 사용하여 추출하고자 노력하였으나 성과는 없었다. 유기 용매를 이용한 BSD의 추출 노력이 성공적이지는 않았지만, 이러한 추출 노력으로부터 유용한 데이타가 얻어졌다. 주목할만하게는, 상기 색소가 상기 용매들에 용해 또는 확산되지 않았기 때문에, 검은색 반점 색소가 마찬가지로 치즈 매트릭스 자체내에서 용해 또는 확산되지 않을 것이라고 (매우 높은 가능성으로) 결론내릴 수 있었다.
상기 결함을 나타내는 수많은 치즈 샘플 (치즈 제조업자들로부터 축적된 샘플)에 대한 시각적 조사 결과, 검은색 반점 색소가 잘 함유되어 있고, 치즈 매트릭스에 확산되는 것으로 여겨지지 않는다는 상기 결론이 확고해졌다. BSD가 발생한 숙성된 백색 체다 치즈의 전형적인 18 kg 블록의 사진인 도 1a 및 1b를 참고한다. 도 1a는 상기 치즈 블록의 외부 표면의 사진이다. 도 1b는 단일 검은색 반점의 확대도이며, 상기 반점의 치수를 나타내기 위해 자가 겹쳐져 있다. 도 1a 및 1b에 나타낸 것과 같은 반점들은 전형적으로 상기 치즈 블록 전반에 동등하게 분포되어 있고, 직경이 < 1 mm 내지 약 5 mm이다. 주어진 임의의 18 kg 치즈 블록 내에서 상기 반점의 빈도는 블록당 10개 미만에서 100개 초과까지 광범위하였다.
특정한 숙성 및 저장 방법은 반점들이 더이상 눈에 띄지 않을 때까지 상기 반점들을 용해 또는 확산시키는 것을 보조할 수 있다는 몇몇 사례가 치즈 제조업자들로부터 입수되었다. (상기 결함이 임의의 관능적 결함에 의해 수반되는 것이 아니기 때문에, 상기 반점의 "옅어짐"은 상태를 개선시킬 것이다.) 그러나, 이러한 노력은 추출 방법에 사용된 유기 용매에 대한 상기 색소의 안정성을 제공하지 못할 가능성이 매우 높다. 간략히, 본 발명자들에 의해 수행된 추출 실험에서는 유지방과 유사한 소수성을 갖는 용매들을 사용하였다. 검은색 반점 색소가 치즈 매트릭스 자체에 (숙성 또는 저장 프로토콜을 통해) 용해 또는 확산된 경우, 상기 색소는 마찬가지로 유지방과 유사한 물리적 특성을 갖는 유기 용매에 쉽게 용해 또는 확산된다. 이러한 결과가 실험실에서는 나타나지 않았다. 더욱이, 치즈의 전형적인 pH/산성 환경, 및 가장 숙성된 체다 유형 치즈와 관련된 전형적인 숙성/저장 기간 (0.5 내지 2년)을 고려할 때, 상기 결함이 숙성 또는 저장 프로토콜에 의해 개선될 수 있다는 증거 사례는 가치가 없었다.
그러나, 한 실험 결과, 검은색 반점 색소가 질산에 쉽게 용해된다는 것이 확실하게 입증되었다. 이는 상기 색소가 무기 염이었음을 강력히 시사하였다. 상기 결함의 첫 출현 시기와 맞물려, ITS가 BSD의 원인 물질 (또는 적어도 그와 관련된 물질)이라는 가설이 설정되었다. 검은색 반점 색소가 산에 쉽게 용해된다는 발견은, 상기 색소가 비스무트 III 술파이드로 이루어질 수 있다는 추가의 가설을 뒷받침하였다. 따라서, 비스무트-함유 염을 65 중량％ 함유하는 미국의 "오베실" 브랜드 제품이 밀크 스트림으로 부주의하게 도입되었을 가능성이 높다는 결론에 이르렀다. 상기 언급한 바와 같이, "오베실" 브랜드 제품은 유두관으로의 병원균의 진입에 대한 강력한 물리적 장벽을 형성하기 때문에 상업적으로 성공적이었다. 그러나, 처리된 동물로부터 상기 제품을 제거하기 위해서는 동물의 유두를 스트립핑할 필요가 있었다. 스트립핑 후 일부 ITS가 유두에 남아서 치즈 밀크로 침투한 것으로 여겨졌다.
연구의 다음 국면은 비스무트 III 술파이드가 실제로 BSD의 원인 물질이라는 가설에 따라 이루어졌다. 비스무트 서브-니트레이트 자체는 백색이며 비교적 화학적으로 불활성이다. 따라서, 액상 밀크, 모짜렐라 치즈, 및 요거트에 미량으로 존재하는 것은 눈에 쉽게 띄지 않는다. 그러나, 향미가 풍부한 숙성된 치즈에서는 검은색 반점 결함이 현저하게 나타난다. 따라서, 비스무트 III 술파이드 (검은색의 비교적 불용성인 염)가 (ITS로부터의) 비스무트 서브-니트레이트와 (숙성 미생물총, 효소, 및 치즈의 단백질/아미노산 성분에 대해 작용하는 특정 보조인자의 작용에 의해 숙성된 치즈 내에서 발생하는) 황화수소 사이의 반응 생성물이라는 가설이 설정되었다.
간략히, 상기 가설은 착유전에 ITS의 불완전한 제거로 인해 비스무트 서브-니트레이트가 밀크 스트림에 침투하였다는 것이다. 그 후, 하기 반응식에 따라 비스무트 서브니트레이트가 황화수소와 반응하여 비스무트 III 술파이드를 형성하였다.
<반응식 1>
4BiNO₃(OH)₂BiO(OH) + H₂S → Bi₂S₃ (불용성, 검은색)
생성물인 비스무트 III 술파이드 (또는 간단히 비스무트 술파이드)는 비교적 불용성의 검은색 염이다.
비스무트를 특이적 원소 표적으로 한 것뿐 아니라, 치즈 매트릭스 내에 존재하는 상태 또는 화학적 환경하에 Bi₂S₃ 분자가 문헌에서 나노로드 또는 나노휘스커(nanowhisker)라고 지칭되는 결정 구조체를 형성한다는 가설이 설정되었다. 문헌 [W. Zhang et al. (2001) Sol. State Comm. 119:143-146] 및 [B. Zhang et al. (2006) J. Phys. Chem. 110:8978-8985]를 참고한다. 따라서, 이들 비스무트-함유 나노로드는 검은색 반점 결함에서 발견되는 회색 내지 검은색 색상을 부여할 수 있는 빛-회절 입자를 구성한다.
그 후, 1) 검은색 반점 결함 중 비스무트의 원소적 존재, 및 2) 검은색 반점 결함 내의 비스무트 III 술파이드 나노로드 구조체의 물리적 존재를 확인하기 위한 노력들이 집중적으로 이루어졌다.
검은색 반점 내 비스무트 존재의 확인은 유도 결합 플라즈마 질량 분석법 (ICPMS)을 이용하여 조사하였다. AOAC (Association of Analytical Communities) 국제 방법 993.14를 이용하였다. 첫번째 노력은 BSD에 기여할 수 있는 여러 원소의 존재에 대해 여러 검은색 반점을 스크리닝하는 것이었다. 초기 실험들은 밀크 및 치즈의 취급/운반 장비에서 전형적으로 발견되는 금속 염/산화물, 및 식품 등급 공정에 존재하는 다른 잔류 금속 유도체에 중점을 두었다. 대조의 척도로서, 치즈 조성 분석을 수행하였다. 구체적으로, 단백질, 회분 및 수분을 각각 AOAC 제17 개정판 (저작권 2000, ISBN: 0935584-67-6)의 공식 분석 방법 2001.14, 935.42, 및 926.08을 이용하여 측정하였다. 지방은 AOAC 제17 개정판의 공식 분석 방법에 기재된 방법에 따라 측정하였다.
투과 전자 현미경 (TEM) 연구는 다음과 같이 수행하였다: 대략 100 ㎕의 2차 증류수를 샘플에 첨가하고, 유리 막대를 이용하여 혼합물을 현탁액으로 분쇄하였다. 현탁된 샘플의 대략 5 ㎕ 분취액을 폴리비닐 알코올-포름알데히드 아세탈 코팅된 300 메쉬 구리 TEM 격자 (테드 펠라, 인크.(Ted Pella, Inc.), 캘리포니아주 레딩 소재) 상에 침착시켰다. 잉여 샘플은 작은 여과지 단편에 흡수시키고, 나머지 샘플은 실온에서 격자 표면으로 건조시켰다. 일부 경우, 나노-더블유(NANO-W) 브랜드 TEM 음성 염색제 (Nanoprobes, Incorporated, 뉴욕주 얍행크 소재)를 건조된 샘플 위에 도포하여 콘트라스트 및 가시성을 향상시켰다. 시편들을 필립스(Philips) CM 120 전자 현미경으로 관찰하고, 이미지들을 메가뷰(MegaView) 3 디지털 카메라 (에스아이에스(SIS), 뉴져지주 린고스 소재)로 수집하였다. 길이를 알고 있는 참조 샘플로 보정한 SIS 브랜드 분석 소프트웨어 (뉴저지주 린고스 소재)를 이용하여 측정값들을 취하였다.
ICPMS 결과, BSD 영역에서 크롬, 구리, 철, 니켈 및 비스무트 원소의 존재가 입증되었다. 크롬, 구리, 철 및 니켈 원소의 증가가 관찰되었지만, BSD 영역에서의 비스무트 농도는 비-BSD 영역에서 분석된 동일한 치즈보다 보통 3배 넘게 더 높았다. 이들 결과는 비스무트가 색소 발생 반응에 참여하는데 충분한 양으로 존재하는 유일한 원소임을 나타낸다.
치즈 샘플의 BSD 영역의 수백개의 TEM 이미지들을 캡쳐하였고, 이들은 일관된 하나의 결론을 제공하였다. 상기 인용된 문헌에서 보고된 전형적인 나노로드는 BSD 치즈 영역에서만 특징적으로 존재하였다. 이러한 이미지의 예를 도 2에 도시한다. 도 2에 도시된 나노로드 구조체는 너무 작아서 광학 현미경으로 용이하게 검출될 수 없었다. 도 2에 도시된 나노로드는 직경이 약 69 nm 내지 약 130 nm이다. 상기 나노로드는 잠재적으로 혹사될 수도 있는 TEM 조건에 대해 매우 안정하였다. 상기 나노로드는 약간 얼룩진 표면을 갖는 것으로 보였고, 이는 나노로드의 길이를 따라 특징적인 선을 나타내었다. 단일 나노로드의 확대도인 도 3을 참고한다. 이러한 구조체의 존재는 치즈 매트릭스에 존재하는 조건하에 형성된 비스무트 술파이드 나노로드의 존재와 일치한다.
비스무트 III 술파이드 나노로드의 형성에 있어서 반응물로서 비스무트 서브-니트레이트의 반응성을 확인하기 위해, 실험실에서 BSD가 목적에 맞게 재생성될 수 있는지를 알아보는 추가 분석을 수행하였다. 간략히, 공지된 양의 ITS 성분들을 이용하여 치즈를 제조하고, 치즈를 치즈 숙성에 의해 생성되는 실제 휘발성 가스로 처리하거나, 가정된 비스무트 서브-니트레이트의 공반응물인 황화수소 가스에 직접 노출시켰다. 두 경우 모두, 반응이 일정하게 동일하였다: 비스무트 서브-니트레이트 또는 완전한 ITS 제제를 함유하는 치즈 샘플을 실제 치즈 휘발성분 또는 "화학적 표준" 등급의 H₂S 가스에 노출시켰을 때, 각각 수반된 나노로드 구조체가 존재하는 동일한 검은색 색소 침착이 나타났고, 이로써 비스무트 서브-니트레이트가 BSD의 원인 물질임을 추가로 확인하였다. 결과는 도 4에 도시하였다. 다른 ITS 성분들은 이렇게 노출되었을 때 검은색 반점을 전혀 형성하지 않았다. 더욱이, 실제 치즈 휘발성분 또는 황화수소 가스에 노출시 해당 부위에서 동일하게 검은색 색소 침착이 나타났고, 따라서 황화수소 가스가 영향을 미치는 공반응물이었음을 확인하였다.
치즈 제조 및 숙성 또는 노화의 견지에서, BSD를 조절하는 수단으로서 황화수소 가스 생성의 감소를 표적으로 하는 것은 합당하지 않다. 황화수소는 매우 방향족인 활성 화합물로서, 미생물, 효소, 및 시스테인과 같은 황-함유 아미노산에 대해 작용하는 보조인자의 생성물이다. 문헌 [Arfi et al., (2002) Appl. Microbiol. Biotechnol. 58:503-510]을 참고한다. 황화수소 가스가 전형적인 숙성된 체다 치즈 향미에 필수적이고/거나 가치있는 성분임을 뒷받침하는 연구가 충분히 있다. 문헌 [Burbank & Qian (2005) J. Chrom. 1066:149-157]을 참고한다. (수십 가지 복잡한 대사 경로를 방해함으로써) 황화수소의 생산을 감소시키는 방법을 고안하였더라도, 생성된 최종 생성물은 치즈 선별자 및 소비자에게 허용되지 않은 향미 특성을 가질 위험을 안고 있다.
실시예
하기 실시예는 단지 본원에 개시되고 청구된 본 발명을 더 충분히 기술하기 위해 포함된다. 실시예는 어떠한 방법으로도 본 발명을 제한하지 않는다.
실시예 1:
금속염으로서 아연 옥시드 및 티타늄 옥시드의 조합물을 사용하는 시험 ITS를 제제화하였다. 시험 ITS는 임의의 비스무트 또는 비스무트-함유 염을 함유하지 않는 것을 제외하고는 "오베실"-브랜드 제제와 동일하였다. 시험 ITS는 아연 옥시드, 티타늄 디옥시드, 광유 (30-40%) 및 알루미늄 스테아레이트를 포함하였다.
ITS의 배치를 제조하기 위해, 액체 파라핀 (예를 들면, 광유)을 혼합기가 장착된 적합한 용기로 옮겼다. 알루미늄 스테아레이트를 첨가하고, 혼합물을 교반하고, 균질해질 때까지 (약 2 시간) 약 160℃로 가열하였다.
그 후, 목적하는 양의 금속 염이 첨가될 때까지 교반하면서 무독성 비스무트-무함유 염을 일부씩 나누어 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 균질해질 때까지 교반하였다. 이어서 생성물을 유두내 투여를 위해 통상적인 주입 튜브로 옮겼다.
실시예 2:
이 실시예의 목적은 비-수유중인 낙농우의 유두 내에서 비스무트 서브-니트레이트를 포함하지 않는 ITS의 잔류를 "오베실" 브랜드 제품과 비교하는 것이다.
본 연구는 위스콘신주 알링턴에 소재하는 위스콘신-매디슨 대학 (UW)의 블레인 데어리(Blaine Dairy)에서 수행하였다. 16 마리의 젖소 (n = 64 개의 유두)를 건유한 날에 등록하였다. 모든 등록된 젖소들은 4개의 기능적 구획(quater)을 가질 필요가 있었고, 유선염의 가시적인 징후가 전혀 없었다. 모든 젖소들을 건유시키고, 표준 UW 낙농 가축 프로토콜에 따라 유방내 항생제 건유우 치료제 (DCT)를 제공하였다. 출산 경력 및 밀크 생산량 (건유시)을 각 젖소에 대해 기록하였다. 초기 등록시, 유두의 형태, 길이, 직경, 및 유두끝 과각화증의 정도에 대해 점수를 매겼다. 각 젖소 마다 2 개의 유두에는 "오베실" 브랜드 ITS를 제공하고, 2 개의 유두에는 시험 ITS를 제공하도록 할당하였다. 투여 프로토콜은 각 제품이 유두 위치에 따라 균일하게 투여되도록 보장하여, 각 위치 (우후방, 우전방, 좌후방, 좌전방)마다 8 개의 유두에 각 제품이 투여되었다. 투여 전후에 밀봉제 튜브를 칭량하여 투여된 순 부피를 측정하였다. DCT 및 내부 유두 밀봉제를 제공하기 전에, 유두끝을 단일 70％ 이소프로판올 알코올 와이프로 세정하고, 부분 삽입 기술을 이용하여 유두 피부 병원균의 도입 가능성을 감소시켰다. 내부 밀봉제를 투여한 후, 유두를 외부 유두 소독제로 적셨다.
유두를 제1일, 제2일, 제3일, 제4일, 제5일, 제6일, 제7일, 제14일, 제28일, 제42일 및 분만시에 시험하여, 홍반, 팽창 및/또는 밀봉제 누출을 검출하였다. 제14일, 제28일, 제42일 및 분만시에, 각 젖소의 유두 하나로부터 손으로 스트립핑하여 밀봉제를 제거하였다 (제거하는 날마다 각 밀봉제 당 8개의 유두). 제거된 밀봉제를 초유와 함께 눈금이 있는 50 ml 플라스틱 바이알에 수집하였다. 바이알을 원심분리 (3000 rpm x 5-7 분)하고, 상청액을 세정하고, 회수된 밀봉제를 칭량하였다. 회수된 밀봉제의 양을 각 시기별로 시험 ITS-처리된 유두 및 "오베실" 브랜드 ITS-처리된 유두에서 비교하였다. 동일한 절차를 이용하여 분만후 1일째에 후속 샘플을 수집하였다. 모든 샘플링시에는 밀봉제를 제거한 후 유두를 외부 유두 소독제로 적셨다. 분만후, 구획 밀크 샘플을 모든 구획으로부터 무균적으로 수집하고, 유방내 감염을 확인하기 위해 배양하였다.
그룹 특징분석 - 유두 길이 및 부피:
총 64 개의 유두를 위해 전체 16 마리의 젖소를 등록하였다; 32 개의 유두에는 시험 ITS를 제공하였고, 32 개의 유두에는 "오베실" 브랜드 ITS를 제공하였다. 시험 집단에 대한 유두 길이 및 부피를 표 1에 나타내었다.
<표 1>

그룹 A 또는 그룹 B에서 유두의 길이 또는 부피에 대한 유의한 차이는 없었다 (p > 0.36). 전체 유두 길이는 5.11 cm로서, 3.3 cm 내지 7.3 cm의 범위이었다. 평균 유두 길이는 그룹 A의 경우 5.12 cm 및 그룹 B의 5.11 cm로서, 그룹 A의 경우 3.3 cm 내지 7.3 cm의 범위 및 그룹 B의 경우 3.5 cm 내지 7.10 cm의 범위이었다. 2가지 처치 그룹에서 평균 유두 길이에 차이가 없다는 귀무가설을 시험하기 위해 2개 샘플 대응 t-시험을 수행하였다. 각 제품을 제공하기 위해 무작위로 선택된 유두들 사이에서 유두 길이의 유의한 차이는 없었다 (p = 0.95).
전체 유두 부피는 24.66 ㎤로서, 12.47 ㎤ 내지 54.34 ㎤의 범위 (표준 편차 9.17 ㎤)이었다. 그룹 A의 경우, 평균 유두 부피는 23.6 ㎤로서, 12.54 ㎤ 내지 54.34 ㎤의 범위 (표준 편차 8.60 ㎤)이었다. 그룹 B의 경우, 평균 유두 부피는 25.71 ㎤로서, 12.47 ㎤ 내지 48.25 ㎤의 범위 (표준 편차 9.73 ㎤)이었다. 2가지 처치 그룹에서 평균 유두 부피에 차이가 없다는 귀무가설을 시험하기 위해 2개 샘플 대응 t-시험을 수행하였다. 각 제품을 제공하기 위해 무작위로 선택된 유두들 사이에서 유두 부피의 유의한 차이는 없었다 (p = 0.95 및 p = 0.35; 로그 변형 분석).
과각화증: 하기 등급 이용하여 과각화증에 대해 유두 끝 건강에 대해 점수를 매겼다: 환이 아님 (N), 부드러운 환 (S), 거침 (R), 매우 거침 (VR). 유두 점수의 분포는 다음과 같다: N (n = 21; 32.8％), S (n = 31; 48.4％), R (n = 11; 17.2％) 및 VR (n = 1; 2％). X² 시험을 통해 과각화증 점수의 분포가 처치 그룹과는 관련이 없음을 확인하였다 (p = 0.13).
<표 2>

밀봉제의 투여량, 회수량 및 손실량: 대응 t-시험을 이용한 통계 분석을 수행하여 밀봉제의 투여량, 회수량 또는 손실량 (회수되지 않은 양)이 처치 그룹에 따라 차이가 나지 않는지를 측정하였다.
<표 3>

각 튜브에 있는 4 g 중, 밀봉제의 전체 투여량은 3.62 g이었다. "오베실" 브랜드 ITS (3.46 g) 또는 시험 ITS (3.62 g)의 투여량의 경우에는 유의한 차이가 없었다 (P = 0.12).
밀봉제의 전체 회수량은 0.82 g이었고, 처치 그룹에 따라 유의한 차이가 없었다 (P = 0.89). 밀봉제의 전체 손실량은 2.88 g이었고, 처치 그룹에 따라 차이가 없었다 (P = 0.40). 밀봉제의 회수량은 회수 날짜와 연관이 있는 것으로 여겨졌고 (P = 0.08), 제14일의 밀봉제 회수량이 다른 회수 기간에 비해 더욱 많았다 (제14일 회수량 = 1.6 g; 제28일 회수량 = 0.68 g; 제42일 회수량 = 0.65 g; 분만시 회수량 = 0.33 g).
단순 선형 회귀 분석을 이용하여, 밀봉제 투여량과 유두 부피 사이에는 유의한 관계가 없음을 결정하였다 (p = 0.59, p = 0.53).
회수된 밀봉제의 경우, 밀봉제 회수량과 유두 부피 사이에 유의한 선형 관계가 없다는 귀무가설을 시험하기 위해 단순 선형 회귀 분석 시험을 수행하였다. 회수된 밀봉제의 6％만이 유두 부피와 관련이 있었다 (P = 0.05).
투여된 밀봉제의 비율은 유두 부피와 유의한 관계가 없는 반면, 회수된 밀봉제는 유두 부피와 유의한 관련이 있었지만, 매우 작은 비율 (6％)이었다.
일원 ANOVA을 이용하여 밀봉제 투여량 및 회수량과 유두 위치, 제품, 젖소 사이의 일변량 관계를 측정하였다.
<표 4>

실시예 3:
이 실시예의 목적은 개선된 세정능력 특성을 갖는 ITS를 개발하는 것이다. 이 실시예에서, 실시예 1에 기재된 것과 유사하게 ITS를 제조하였고, 다만 광유 겔을 트리글리세리드-계 이동상으로 대체하였다. 바람직한 상기 밀봉제는 통상의 유두-세정 프로토콜 (광유-계 밀봉제에 비해)을 사용하여 우수한 장벽 특성 및 개선된 세정능력 특성을 갖는다고 입증되었다. 밀크 생산자는 표준 클린-인-플레이스(cleaned-in-place, CIP) 절차를 사용하여 밀크 접촉 표면으로부터 통상의, 광유-계 ITS 제제로부터 잔류물을 제거하는 것이 매우 어렵다는 것을 밝혀냈다. 따라서, 우수한 장벽 특성을 갖고, 또한 밀크와 접촉하는 표면으로부터 세정하기 쉬운 ITS가 시판용으로 매우 바람직하다.
다양한 인자로 인해, 많은 밀크 생산자는 착유 전 젖으로부터 ITS를 충분히 제거하지 않는다. 이 결과가 훈련 및 교육 노력를 통해 제거될 수 있을 것으로 보이지는 않는다. 게다가, 많은 밀크 생산자는 일상적으로 세정(clean up)하는 동안 권장 온도 및 세정 화합물 농도 필요량을 준수하지 않고, 따라서 착유 장비 상 통상의 ITS 제제로부터 잔류물의 빌드-업(build-up)이 악화된다. 유제품 생산자의 세정 습관(practice)은 교육 노력을 통해 변할것 같지는 않다. 그러나, 잔류 ITS의 세정능력을 개선하기 위한 실행가능한 접근은 ITS 생성물 그 자체의 화학을 대체하여 남아있다.
ITS의 염 성분 (비스무트 서브-니트레이트, 아연 옥시드 또는 일부 다른 염이든지 아니든지)은 영향을 받지 않거나 또는 표준 세정 프로토콜을 사용하여 임의의 우수한 정도로 가용화된다. 염 자체는 분산된 미립자 물질이다. 염은 연속 겔 상 (통상적으로 광유)에서도 수성 세정 상에서도 가용성이 아니다. 게다가, ITS 생성물의 광유 성분 (알칸의 점성 혼합물)은 표준 세정 화학제 (예를 들면 염소화 알칼리성 세정제)에 대해 본질적으로 비-반응성이다. 광유는 또한 수성 세정 용액에 의해 가용화에 저항하기에 충분하게 비-극성이다. 간략히, 광유 겔 상을 포함하는 ITS가 밀크 접촉 표면에 침착되는 경우, 표준 세정 프로토콜을 사용하여 ITS를 제거하는 것이 매우 어렵다.
ITS 제제에서의 광유의 역할은 불활성 연속 상 분산제이다. 본 발명자들은 상기 역할이 또한 물질, 예컨대 모노-, 디-, 및/또는 트리글리세리드 오일에 의해 수행될 수 있다는 것을 발견하였다. 광유를, 예컨대 트리글리세리드 물질로 대체하는 이점은 광유와 달리, 트리글리세리드는 가장 통상적인 밀크 장비 세정 작용제, 알칼리성 세정제 (즉, 수산화나트륨)에 대해 반응한다는 것이다. 글리세리드와 같이 에스테르화된 지방산은 높은 pH에서 수산화나트륨과 함께 그의 상응하는 나트륨 염, 예를 들면 나트륨 스테아레이트로 화학적으로 전환되고, 표면으로부터 쉽게 제거되고 세정 용액의 수성 상으로 분산된다. 트리글리세리드 오일, 예컨대 옥수수, 목화씨 또는 카놀라 오일은 쉽게 이용가능하고, 열 안정적이고 (멸균 목적), 상이한 안정성 및 용융 특성을 갖기 위해 변화될 수 있다.
글리세리드-계 ITS를 장벽 특성에 관하여 광유-계 ITS와 매우 우호적으로 비교하였다. 트리글리세리드-계 ITS는 또한 세정능력에 있어서 광유-계 ITS에 비해 10-배 이상의 개선을 나타냈다. 개선된 세정능력 때문에, 트리글리세리드-계 ITS는 염 성분으로써 비스무트-함유 염, 예컨대 비스무트 서브-니트레이트를 이용할 수 있다.
글리세리드 겔 베이스로부터 제조된 ITS를 시험하기 위해, 작은 클린-인-플레이스 (CIP) 루프를 구축하였다. CIP 루프는 11-갤런 탱크, 신축성있는 위생선, 원심 펌프, 교축 밸브, 및 디지털 유량계를 포함하였다. 표면을 시험하기 위해, 플라스틱 및 316 스테인리스 강의 2" x 2" 쿠폰을 사용하였다. 세정된 쿠폰을 칭량하였다. 이어서 ITS의 공지된 무게의 샘플을 각각의 쿠폰의 표면에 적용하고, 쿠폰을 다시 칭량하였다. 이어서 쿠폰을 CIP 루프에서 세척하였다. 각각의 쿠폰을 CIP 루프의 신축성있는 선 중 하나의 말단으로 삽입하고, 호스 클램프로 고정시켰다. 이어서 펌프를 키고, 유속을 교축 밸브로 조절하여 디지털 유량계에 나타난 바와 같이 목적하는 표적 유속을 달성하였다. 디지털 열전대를 사용하여 온도를 모니터링하였다. 쿠폰 및 ITS 처리를 적소에 배치하고, 시스템을 130℉에서 온수로 채우고, 펌프를 키고, 흐름을 조정하였다. CIP 루프에서 물 1 갤런 당 염소화 알칼리성 세정제 일(1) 온스(oz)를 첨가하고, 시스템을 10분 동안 작동하게 두었다. 쿠폰을 제거하고, 건조시키고 칭량하여 제거된 ITS의 양을 결정하였다.
겔 상으로써 둘 다 광유를 사용하는 실시예 1에 기재된 "오베실"-브랜드 ITS 및 아연-계 ITS 사이에 세정능력에 있어서 특별한 차이가 없다는 것을 결과가 입증한다. 도 5의 n=3에 나타난 표 5를 참고한다. 표 5는 스테인리스 강 및 플라스틱 쿠폰으로부터 ITS 처리의 중량% 제거를 도시한다. 약어(Key): ss=스테인리스 강 표면; pl=플라스틱 표면; orb="오베실"-브랜드 ITS; zmo=아연+광유; zcot=아연+목화씨 오일; zcan=아연+카놀라 오일.
대조적으로, ITS 제제는 광유보다는 겔 상으로서 트리글리세리드를 만들었고, 극적인 (예를 들면, 10-배) 증가도를 나타냈고, 잔류 토양은 제거되었다. 도 5를 참고한다. 특정 메카니즘에 대한 제한 없이, 개선된 세정능력은 비-반응성 광유에 비해 트리글리세리드의 증가된 화학적 반응성의 결과라고 알려져있다. 간략히, 트리글리세리드 물질의 에스테르 결합은 염기성 세정 작용제 (NaOH)에 의해 쉽게 가수분해 된다. 그 자체로, 토양은 상응하는 지방산의 나트륨 염으로서 수성 상으로 분산된다.
실시예 4 - 유제품 반응성:
유체 밀크 샘플 (2% 균질화됨, 비타민 D)을 각각의 ITS 처리의 0.05 중량%로 접종하고, 2주 동안 45℉에서 저장하였다. 그 후, 샘플을 엑스퍼트 패널(expert panel)(n=4)을 사용하는 관능(sensory) 방법을 사용하여 부패의 징후를 시각적으로 평가하였다. "오베실"-브랜드 ITS, Zn/광유, Zn/카놀라 오일, 및 대조군 샘플을 비롯한 4개의 ITS 처리를 평가하였다. 대조군 평가로부터 차이점을 사용하기 위하여 패널리스트(panelist)를 요청하였다. 간략히, 패널리스트는 대조군 샘플을 평가하기 위해 요청된 다음, 참고로써 대조군 밀크와의 향미 상에서 처리된 샘플을 평가하였다. 결과는 다음과 같다:
단백질 불안정성의 시각적 징후는 전혀 없었다. 처리된 밀크 샘플은 각각 대조군으로부처 구별하기 어렵게 나타났다. 향미 평가는 유의한 향미 결함이 없거나 또는 존재의 기능으로서의 특성 유발 또는 ITS 처리의 유형과 유사한 결과를 산출한다.
치즈 분석은 여전히 진행중이다. 갓 제조된 모짜렐라 및 체다 치즈 샘플을 제조하였고, 표면을 ITS로 처리하고, 진공 포장하고, 현재 숙성 프로그램 중에 있다. 지금까지, 유해한 징후 또는 발생 결함이 나타나지 않는다.
실시예 5 - 요거트 발효 및 관능 평가:
3가지 상이한 요거트 발효를 상기 발효 생성물의 최종 관능 특성에서 ZnO 밀봉제 또는 "오베실"-브랜드 ITS의 존재의 가능한 효과를 조사하기 위해서 수행하였다. 사전 실험에서, 상기 물질의 존재가 분명한 방법으로 생성물의 pH를 떨어뜨리지 않는다는 것이 결정되었다. 따라서, 하기 실험을 수행하였다: 50 mL의 저온살균된 밀크를 3개의 멸균 100 mL 플라스크에 배치하고, 락토바실러스 델브루케이 종 불가리쿠스 (Lactobacillus delbrukeii spp . bulgaricus) (엘리커(Elliker) 브로쓰(broth) 중 사전에 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션함)를 함유하는 0.5 mL의 현탁액을 접종하였다. 50 mg의 "오베실"-브랜드 ITS를 플라스크 중 한 개에 첨가하고, 50mg의 ZnO 밀봉제를 다른 (중 광유 중 65%) 플라스크에 첨가하고, 3번째 플라스크를 대조군 처리로써 사용하였다. 플라스크를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였고, 최종 pH 및 향미 및 아로마 프로파일의 차이를 평가하였다.
결과: 3개의 발효된 생성물의 최종 pH는 매우 유사하였고, 4.45 내지 4.5 사이의 범위였다. 최종 생성물을 맛보았을 시에, 세 가지 처리 사이에 검출된 향미 및 아로마 프로파일에서 차이가 없었다.
실시예 6 - ITS 제제의 밀도:
7개의 상이한 아연-계 ITS 제제의 밀도를 결정하고 "오베실"-브랜드 ITS와 비교하였다. 각각의 밀봉제 제조의 분취액 (400 μL)을 분석적인 척도를 사용하여 칭량하였다. 표 6은 각각의 샘플에 대해 수득한 결과를 요약하고 있다. 비교표(tabular) 항목은 표준 편차에 상응하는 10개 이상의 측정치의 평균과 일치하였다. 일반적으로, 더 높은 양의 ZnO를 사용하는 경우에 현탁액의 밀도가 증가하였다. 수행 표준(criterion)은 원조 "오베실"-브랜드 ITS의 밀도의 5-10%의 범위이다. 이것은 5% 수준에서 약 1.817 내지 약 2.009 g/mL 및 10% 수준에서 약 1.722 내지 약 2.104 g/mL의 범위였다. 모든 시험된 샘플은 5% 수준에서 60% ZnO 카놀라 오일 처리의 예외를 나타내는 상기 파라미터 내에서 속했다.
<표 6>

실시예 7 - ITS 제제의 점도:
아연 옥시드, 알루미늄 스테아레이트, 및 카놀라 오일을 포함하는 신규 제조된 ITS의 점도를 여러 온도에서, S06 스핀들(Spindle)이 부착된 브룩스필드(Brookfield) 디지털 점도계 모델 DV-I 프라임(Prime) (브룩스필드, 매사추세츠주 미들보로 소재)를 사용하여 2.0 rpm에서 결정하였다. 상기 신규 ITS 제제의 점도에서 온도의 효과를 도 6에서 관찰할 수 있다. 더 낮은 온도 (-15℃)에서 데이터가 진행중이다.

Claims (23)

1. 글리세리드를 포함하는 겔 상에서 분산된 무독성 금속염을 포함하는 소정량의 유두 밀봉 제제를 인간이 아닌 동물의 유두관에 주입하는 것을 포함하며,
   여기서 주입된 유두 밀봉 제제의 양은 유두관으로의 미생물 진입에 대한 물리적 장벽을 형성하기에 충분하고, 유두 밀봉 제제는 상기 동물의 밀크로 제조된 유제품에서 검은색 반점 결함을 야기하지 않는 것인,
   인간이 아닌 동물의 건유기 동안 유방 질환의 예방적 치료를 위해 상기 동물의 유두관에 물리적 장벽을 형성하고, 동시에 상기 동물의 밀크로 제조된 유제품에서 검은색 반점 결함을 예방하기 위한 방법.
2. 제1항에 있어서, 항감염제를 함유하지 않는 유두 밀봉 제제를 주입하는 것을 포함하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 비스무트를 함유하지 않는 유두 밀봉 제제를 주입하는 것을 포함하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 항감염제를 함유하지 않고 비스무트를 함유하지 않는 유두 밀봉 제제를 주입하는 것을 포함하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 트리글리세리드를 포함하는 베이스 중 비스무트-무함유, 무독성 금속염을 포함하는 유두 밀봉 제제를 주입하는 것을 포함하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 약 30 중량% 이상의 무독성 금속염을 포함하는 유두 밀봉 제제를 주입하는 것을 포함하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 약 50 중량% 내지 약 75 중량%의 무독성 금속염을 포함하는 유두 밀봉 제제를 주입하는 것을 포함하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 약 65 중량%의 무독성 금속염을 포함하는 유두 밀봉 제제를 주입하는 것을 포함하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 무독성 금속염이 티타늄 염, 아연 염, 바륨 염, 및 그의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 무독성 금속염이 티타늄 디옥시드, 아연 옥시드, 바륨 술페이트, 및 그의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
11. 제1항에 있어서, 겔 베이스가 동물 지방, 카놀라 오일, 코코넛 오일, 옥수수 오일, 목화씨 오일, 아마씨 오일, 야자 오일, 야자 알맹이 오일, 유채씨 오일, 대두 오일, 해바라기 오일, 피쉬 오일, 해조류 오일, 및 그의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 오일을 포함하는 것인 방법.
12. 글리세리드를 포함하는 겔 베이스, 및 겔 베이스 중 분산된 무독성 금속염을 함께 포함하는 유방내 유두 밀봉제.
13. 제12항에 있어서, 겔 베이스가 트리글리세리드를 포함하는 것인 유두 밀봉제.
14. 제12항에 있어서, 겔 베이스가 동물 지방, 카놀라 오일, 코코넛 오일, 옥수수 오일, 목화씨 오일, 아마씨 오일, 야자 오일, 야자 알맹이 오일, 유채씨 오일, 대두 오일, 해바라기 오일, 피쉬 오일, 해조류 오일, 및 그의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된 오일을 포함하는 것인 유두 밀봉제.
15. 제12항에 있어서, 항감염제를 함유하지 않는 유두 밀봉제.
16. 제12항에 있어서, 비스무트를 함유하지 않는 유두 밀봉제.
17. 제12항에 있어서, 항감염제를 함유하지 않고 비스무트를 함유하지 않는 유두 밀봉제.
18. 제12항에 있어서, 약 30 중량% 이상의 무독성 금속염을 포함하는 유두 밀봉제.
19. 제12항에 있어서, 약 50 중량% 내지 약 75 중량%의 무독성 금속염을 포함하는 유두 밀봉제.
20. 제12항에 있어서, 약 65 중량%의 무독성 금속염을 포함하는 유두 밀봉제.
21. 제12항에 있어서, 무독성 금속염이 티타늄 염, 아연 염, 바륨 염, 및 그의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 유두 밀봉제.
22. 제12항에 있어서, 무독성 금속염이 티타늄 디옥시드, 아연 옥시드, 바륨 술페이트, 및 그의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 유두 밀봉제.
23. 인간이 아닌 동물의 유두관에 밀봉 제제를 주입하는 단계를 포함하며, 제12항에 인용된 바와 같은 유두 밀봉 제제의 주입을 포함함을 개선점으로 하는, 인간이 아닌 동물의 건유기 동안 유방 질환을 예방적으로 치료하기 위해 상기 동물의 유두관에 물리적 장벽을 형성하는 방법.

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