JP5773983B2 - 乳房内乳頭シール剤及びその熟成チーズの外観上の欠陥を減少又は除去のための使用 - Google Patents

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関連する出願の相互参照：本出願は、その内容全体を参照によって本明細書に援用する２００９年４月８日に出願した米国特許仮出願第６１／２０７８７９号明細書の優先権を主張するものである。本出願はまた継続中の２００７年１０月１０日に出願した米国出願番号第１１／８６９９６６号と関連する。すなわち、本発明は、乾乳期における乳房炎を防止するための金属含有、乳房内乳頭シール剤に関する。本乳房内乳頭シール剤は、処置された動物の乳から作られた乳製品（特にチーズ）での外観上の欠陥を生じない。本発明はさらに、チーズの「黒点欠陥」（ＢＳＤ）を防止する方法に関する。

乳牛の乳房炎は乳製品生産者が遭遇する、最も費用のかかる、かつ困難な病気のひとつである。臨床乳房炎を治癒するための従来の治療方法は、乳房内抗生物質治療を含む。多くの乳房内抗生物質製品が利用可能であるが、臨床乳房炎治癒率は低く困惑させるものである：連鎖球菌で４６％、ブドウ球菌で２１％及び黄色ブドウ球菌で９％にすぎない。Ｗｉｌｓｏｎ等（１９９６） Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｓｔｉｔｉｓ Ｃｏｕｎｃｉｌ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ １６４−１６５，及びＣｒａｎｄａｌｌ等（２００５）ＮＭＣ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ２１５−２１６を参照。従って、乳製品生産者は該病気に対して、しばしば、乳房炎を起こし易い乳牛を選抜して単純に除去することで対応してきた。

乳房炎治療の難しさのため、新たな乳房内感染の予防が乳製品産業で主に焦点となっている。新たな感染率は、泌乳期間での新たな感染に比較して乾乳期間での感染が非常に高い（例えば、ひとつの研究で、全ての新たなグラム陰性乳房内感染の６１％が乾乳期間に生じることが示される。Ｔｏｄｈｕｎｔｅｒ等（１９９５）Ｊ．ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ． ７８：２３６６参照）。乾乳期の初期３週間及び分娩期前２週間は、特に新たな感染を生じる傾向がある。従って最近の乳製品生産者は、これらの乾乳期間での乳牛の「予防維持」に多大な努力を集中してきている。

２００３年４月に、乾乳期乳牛に使用される乳頭内（又は「乳房内」）シール剤（ＩＴＳ）が、アメリカ合衆国市場に導入された。商品名「オルベシール」（ＯＲＢＥＳＥＡＬ、アメリカ合衆国商標登録番号Ｎｏｓ．２，７７２，１９８及び３，１２０，６９３）としてアメリカ合衆国で市販され、ニュージーランドで開発されたものである。「オルベシール」ＩＴＳとしてアメリカ合衆国へ導入されたものは、６５ｗ／ｗ％の次硝酸ビスマスが粘性ペースト内に分散されている。前記ＩＴＳ製品は抗生物質を全く含んでいない。さらの該製品は抗微生物剤をも含んでいない。該ＩＴＳは、チューブ状のシリンジを用いて乳頭端部に注入される。これは乾乳期間の乳牛に抗生物質を注入する方法と同じである。該ＩＴＳ製品は亀裂部分及び乳頭管に充填され、従って感染源に対する物理的バリアを提供する。例えばアメリカ特許Ｎｏ．６，２５４，８８１（７月３日，２００１発行）を参照すること。該内容は参照されて本明細書の一部となる。

ニュージーランドでの「オルベシール」名の製品の初期の研究は、次ように結論した。該製品は、広いスペクトルを持ち長期間乳房内抗生物質として作用し、受胎時期での新たな乳房内感染を防止し、最初の５ヶ月の泌乳期間を通じて臨床的外観を予防する、ということである。例えばＷｏｏｌｆｏｒｄ等の（１９９８）Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ４６：１を参照。アメリカ合衆国でのより最近の研究ではまた、このＩＴＳ製品は、クロキサシリンベンザチンを既に浸み込ませた乳房の健康を改善することが結論されている。Ｇｏｄｄｅｎ等の（２００３）Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．８６：３８９９−３９１１を参照。従って、「オルベシール」名ＩＴＳは、乾乳期間における乳牛の新たな乳房炎の数を減少させる効果的剤として証明されてきた。アメリカ合衆国内へ比較的最近導入されたにもかかわらず、「オルベシール」名製品は広く市場に受け入れられ、アメリカ合衆国内で乳牛に対し広く使用されている。まとめると、「オルベシール」名ＩＴＳ製品は、乳房感染防止目的で非常に優れたものであるということである。

「オルベシール」名ＩＴＳ製品をアメリカ合衆国内に導入したことにより、熟成された乳製品、もっとも目立つのはチェダーチーズであるが、に外観上の欠陥が現れ始めた。該外観上の欠陥は、小さな黒点（約０．５から５ｍｍの直径）であり、熟成チーズのいたるところに現れる。該点はチーズのいかなる官能検査的欠陥を伴うものではない。黒点を持つチーズは販売可能であり、黒点のないチーズよりも低級製品とされている。該欠陥は「黒点欠陥」（ＢＳＤ）と名づけされている。

本発明の第一は、動物の乾乳期間における乳房疾患の予防処置のための非ヒト動物の乳頭管内に物理的バリアを形成する方法に関し、同時に、該動物の乳を用いる乳製品中のＢＳＤを防止する方法に関する。該方法は、乳頭シール剤を動物の乳頭管内に注入することを含む。乳頭シール剤はビスマスを含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。該剤は、乳頭内に微生物が入らないように物理的バリアを形成するために十分な量が投与される。しかし、当該動物の乳を用いて作られた乳製品に黒点欠陥を生じることはない。好ましくは、乳頭シール剤は抗炎症剤を含まない（即ち、前記乳頭シール剤は好ましくは、抗生物質又は他の抗感染活性物質を含まない）。好ましくは、前記方法は、少なくとも約３０重量％の非毒性金属塩、より好ましくは約５０重量％から７５重量％の非毒性金属塩、最も好ましくは約６５重量％の非毒性金属塩を含むシール剤を注入することを含む。前記塩の目的は主に前記組成物に十分な密度を持たせ、従ってＩＴＳが乳頭内に安定させるためである。

本発明方法のひとつは、前記非毒性金属塩は、ビスマス塩、チタン塩、亜鉛塩、バリウム塩及びこれらの塩の組み合わせから選択される。最も好ましい塩は次硝酸ビスマス、二酸化チタン、酸化亜鉛、硫酸バリウム及びこれらの塩の組み合わせが挙げられる。これらの金属の他の非毒性塩は、ハロゲン化物、硫酸塩、リン酸塩、炭酸塩、硝酸塩、スルファメート、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マロン酸塩、シュウ酸塩、サリチル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩などが、明示的に本発明の範囲に含まれる。

ゲル基剤は、全ての適切なゲル剤が可能であり、薬学分野で既知のホストが可能である。好ましいゲル基剤は、モノ、ジ及び／又はトリグリセリドであり、広く改善された洗浄性を有する。前記グリセリドは、飽和又は不飽和脂肪酸から誘導される同じ側鎖又は異なる側鎖を含むことができる。従って、限定的でない例で示すと、モノ、ジ／又はトリグリセリドは、デカン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ペンタデカン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、マルガリン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、リシノール酸、リノール酸、リノレン酸、リカン酸、マルガロレイン酸、アラキドン酸、クルパナドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などから誘導される側鎖を含むことができる。より長い又は短い側鎖を持つグリセリドもまた使用され得る。前記グリセリドは、天然の動物又は植物油又は脂肪を含み又は誘導されることができる。天然の動物又は植物油又は脂肪には、制限されるものではないが、動物脂肪、カノーラ油、ココナッツ油、コーン油、綿実油、亜麻油、パーム油、パーム核油、菜種油、大豆油、ひまわり油、魚油、藻油などが挙げられる。特に好ましいゲル基剤は、カノーラ油、コーン油及び／又は綿実油である。前記グリセリドの市販販売業者には、ＡＢＩＴＥＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，コロンバス、オハイオが上げられ、その製品「ＣＡＰＴＥＸ ３５５」カタログ番号６５３８１−０９−１及び７３３９８−６１−５は本発明において非常に良好に作用する。

従って最も好ましい形において、前記乳房内乳頭シール剤は、グリセリドを含むゲル基剤；及び前記ゲル基剤に分散された非毒性金属塩の組み合わせである。従って対応する好ましい方法は、適切量の乳頭シール剤を動物の乳頭管内に注入することを含む。前記乳頭シール剤は、グリセリドを含むゲル相中に分散された非毒性金属塩を含み、注入される乳頭シール剤の量は、前記乳頭管内に微生物の侵入に対する物理的バリアを形成するために十分な量である。前記乳頭シール剤はまた、該動物からの乳で作られた乳製品に黒点欠陥を生じることはない。

本発明のさらなるひとつは、乳房内乳頭シール剤であって、モノ、ジ及び／又はトリグリセリドを含むゲル基剤を、前記ゲル基剤に分散させた非毒性金属塩との組み合わせから本質的になり、前記金属塩は次硝酸ビスマスである乳房内乳頭シール剤に関する。既に記載の通り、乳頭シール剤は好ましくは、少なくとも３０重量％、より好ましくは約５０重量％から約７５重量％及びさらに好ましくは約６５重量％の前記金属塩を含む。

本発明のさらなるひとつは、乳房内乳頭シール剤の改良に関する。特に動物の乾乳期間での乳房疾患の予防措置のための非ヒト動物の乳頭管内に物理的バリアを形成する方法においては、本方法は動物の乳頭管内へ抗感染剤を含まないシール剤を注入するステップを含むものであり、本発明の改良は、グリセリドを含むゲル基剤中に非毒性金属塩を含む乳頭シール剤を注入することを含むことである。該改良により、処理された動物の乳を用いて作った乳製品には黒点欠陥の形成が防止される。

ここで使用される数値範囲は、具体的に開示されていてもいなくても、全ての数値を含みかつ該範囲内に含まれる数値の副次的範囲を含むものである。さらにこれらの数値範囲は、前記範囲のすべての数値及びその範囲の副次的範囲に向けられた請求項についてサポートを提供するものとして解釈されるべきである。例えば、１から１０が開示される場合に、２から８、３から７，５，６、１から９、３．６から４．６、３．５から９．９等々の範囲をサポートするものとして希釈されるべきである。

記載中に明確に規定されていない限り、本発明のすべての単数の用語又は限定には、複数の用語又は限定が含まれる。その逆もまたそうである。

記載中に明確に規定されていない限り、ここで使用される方法及びプロセス（又は工程）ステップの全ての組み合わせが、すべての順で実施され得る。

本発明の方法は、本質的要素及びここで記載される方法の限定及び製品を、ここで記載されるか又は他の合成有機化学において有用な全ての追加又は選択可能な成分、コンポーネントと同様に、含み、からなり又は本質的にからなる。

図１Ａは、熟成白チェダーチーズの１８ｋｇブロックの典型的な黒点欠陥の写真である。図１Ａは、前記ブロックの表面を示し、黒点欠陥が容易に視認される。 図１Ｂは、熟成白チェダーチーズの１８ｋｇブロックの典型的な黒点欠陥の写真である。図１Ｂは、前記欠陥の寸法を示す拡大図（定規を重ねてある）である。このような点はこのチーズの全体に均等に分布されている。 図２は、ビスマス（ＩＩＩ）硫化物ナノロッドの特徴的毛状又は棒状構造を現す黒点欠陥の電子顕微鏡写真である。このような構造は、全ての非ＢＳＤチーズ中に又は試験した非ＢＳＤチーズ領域には現れなかった。図２で示される棒構造は、３７．０９から１２９．３３ｎｍの範囲の直径を有している。 図３は、黒点欠陥領域からの単一の棒状構造の電子顕微鏡写真である。棒構造の直径１３０．８８ｎｍで示され、前記棒構造の長さを二等分して示される。 図４Ａは、実験室で再現させた黒点欠陥のイメージである。図４Ａで、「オルベシール」名乳房内乳頭シール剤（ＩＴＳ）の種々の成分をチーズに混合した直後の点を写真撮影した。 図４Ｂは、実験室で再現させた黒点欠陥のイメージである。熟成チェダーチーズからの揮発成分又は硫化水素ガスのいずれかに暴露させた後撮影された同じ点を示す。場所４及び５は次硝酸ビスマス及び「オルベシール」名ＩＴＳ剤そのものをそれぞれ含む。 図５は、種々のタイプのＩＴＳの洗浄性を示す棒グラフである。 図６は、異なる温度でのＩＴＳ剤の粘度を示すグラフである。ｘ軸は温度を℃で示し、横軸は粘度を示す。

２００３年後半に、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＲ）に、チーズ生産者からいくつかの問い合わせがされ、熟成チーズ、特に熟成チェダーチーズに、新規な「黒点欠陥」が現れることに関する情報を求めてくるようになった。歴史的には、チーズの灰色から黒色への脱色は、いくつかの別々の原因の結果であり、該原因には、特定の微生物（例えばある種の環境プロピオニバクテリウム菌又はカビ）又はチーズへの食品グレード潤滑剤部分などが含まれていた。チーズ生産者により指摘された具体的なＢＳＤは、しかしながら、微生物汚染又は他の腐敗微生物のプロフィルには合致せず、また潤滑剤部分にも合致しなかった。前記潤滑剤部分は、チーズ製造プロセス中に乳流中又は他の部分に混入されることで見出される。

従って、第一ステップは、黒点欠陥の化学構造を決定することであった。多くの努力がＢＳＤチーズの影響を受けた領域を抽出することに最初費やされた。広い範囲の有機溶媒（種々の極性、疎水性など）を用いる抽出の努力の結果、チーズマトリックスからはいかなるタイプの有機系色素体を単離する試みはうまくいかなかった。有機溶媒によるＢＳＤ抽出はうまくいかなかったが、前記抽出努力から有用なデータが得られた。注目すべきことに、前記色素は有機溶媒には溶解も拡散もしなかったが、黒点色素はチーズ自体にも溶解も拡散もしなかったという結論である（高い確率で）。

増え続ける前記欠陥を表すチーズサンプル（商業チーズ生産者から集められたサンプル）の目視検査により、黒点色素は十分に維持され、チーズ中には拡散していかない、という結論が確認された。図１Ａ及び１Ｂは、ＢＳＤで影響を受けた熟成白チェダーチーズの典型的な１８ｋｇの写真である。図１Ａは該チーズの外側表面の写真である。図１Ｂは単一の黒点の拡大図であり、黒点の寸法を示すために定規を重ねてある。図１Ａ及び１Ｂで示される点は通常チーズ全体にわたって均一に分布しており、サイズは＜１ｍｍから５ｍｍ直径である。すべての与えられた１８ｋｇチーズブロック内の点の頻度は広く変化し、＜１０個／ブロックから１００以上である。

チーズ生産者から受け取った事例報告がある。特定の熟成及び貯蔵をすることで前記黒点はもはや視認できない程度に溶解して拡散させ得る、という報告であった（というのは、黒点は有機物感受性欠陥を全く伴うものではなく、該点を「薄れさせて」この状態を緩和するものである）。かかる努力は、しかし、該色素が抽出努力で適用した有機溶媒に対して持つ安定性を考慮すると非常にあり得ないものである。要するに、本発明により実施された抽出実験では疎水性が乳脂肪に類似する溶媒が用いられた。もし黒点色素がチーズ自体に溶解したり拡散したりするならば（熟成マトリックス貯蔵プロセスで）、前記色素は乳脂肪と類似の物理性質を持つ有機溶媒中に容易に溶解又は拡散されると考えられる。このことは実験室では起こらなかった。さらに、最も熟成されたチェダータイプのチーズに伴う、チーズの通常のｐＨ／酸性環境及び通常の熟成／棚期間を考慮すると、前記欠陥が熟成マトリックス貯蔵プロセスを介して解消されるという話は実際的ではない。

ひとつの実験が、しかし、最も重要な事実を明らかにした。黒点色素は硝酸に容易に溶解するということであり、このことは、前記色素が無機塩であることを強く示唆した。前記欠陥が最初に現れたタイミングに合わせて作業仮説を立てた。即ちＩＴＳはＢＳＤの原因物質（又は少なくとも関連する）であるということであった。黒点色素が酸に容易に溶けるという発見はさらに、該システム基礎はビスマス（ＩＩＩ）硫化物であり得る、という仮説を支持した。従って、「オルベシール」名製品（アメリカ合衆国では、ビスマス含有塩が６５重量％含まれる）が、乳流中に不都合に混入された恐れがあった。上で留意したように、「オルベシール」名製品は商業的に成功している。というのは乳頭管への病原菌の侵入を防ぐために強い物理的バリアを形成するものだからである。しかし、前記製品を処置された動物から除去するためには動物の乳頭を引き剥がさなければならない。これは、該引き剥がしの後ＩＴＳが乳頭内に残留し、乳流中に混入するように思われた。

研究の次の段階は、ビスマスＩＩＩ硫化物が実際にＢＳＤの原因物質であるという仮説を実証するために向けられた。次硝酸ビスマス自体は白色及び比較的化学的に安定である。従って、痕跡量が液状乳、モッツァレラチーズ及びヨーグルトに存在することは目にはほとんど見えない。しかし、強い匂いを持つ熟成チーズ中では黒点欠陥が目立って表れる。従って、ビスマスＩＩＩ硫化物（黒、比較的難溶性）が、次硝酸ビスマス（ＴＩＳから）及び硫化水素（熟成チーズ中で、培養された微生物相、酵素及び、チーズのタンパク質／アミノ酸成分に作用する因子などにより発生する）との反応生成物であるとの仮説がなされた。

要するに、前記仮説は、ＩＴＳが不完全に除去された結果次硝酸ビスマスが乳流中に混入したということである。次硝酸ビスマスはその後硫化水素と反応しビスマスＩＩＩ硫化物を生成する（次の式１による）。
４ＢｉＮＯ_３（ＯＨ）_２ＢｉＯ（ＯＨ）＋Ｈ_２Ｓ −＞Ｂｉ_２Ｓ_３（不溶性，黒色） （式１）
生成物であるビスマスＩＩＩ硫化物（又は簡単に硫化ビスマス）は比較的不溶性であり黒色である。

具体的な元素、ビスマスを見出したことに加えて、チーズ内での条件又は化学的環境下で、Ｂｉ_２Ｓ_３分子が結晶構造を形成することが仮説された。Ｗ．Ｚｈａｎｇ等の （２００１）Ｓｏｌ．Ｓｔａｔｅ Ｃｏｍｍ．１１９：１４３−１４６及びＢ．Ｚｈａｎｇ等の（２００６）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１１０：８９７８−８９８５を参照すること。これらのビスマス含有ナノロッドは、従って、光回折粒子を含み、これにより灰色を黒点欠陥に見られる黒色の色合いにする。

次に研究は、（１）黒点欠陥にビスマス元素が存在すること、及び（２）黒点欠陥内にビスマスＩＩＩ硫化物ナノロッド構造が存在すること、に向けられた。

黒点欠陥内にビスマスが存在することは、誘導カップルプラズマ質量スペクトル（ＩＣＰＭＳ）により行われた。ＡＯＡＣ国際法（分析化学協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ））９９３．１４が使用された。最初の努力は、ＢＳＤに寄与し得るいくつかの元素の存在を検出するために複数の黒点をスクリーニングすることであった。最初の実験は、金属塩／酸化物に焦点が向けられた。これらは通常ミルク及びチーズ処理／運搬装置で見出されるものであり、またその他食品グレードプロセスに存在する金属誘導体の残留物である。コントロールとしてチーズの成分分析がなされた。具体的には、タンパク質、灰分、及び水分が、Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＡＯＡＣ１７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１．１４の９３５．４２及び９２６．０８に基づきそれぞれ測定された（ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ２０００，ＩＳＢＮ：０９３５５８４−６７−６）。脂肪もまたＯｆｆｉｃｉａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ＡＯＡＣ１７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎに基づき測定された。

透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）研究が次のように実施された。約１００μｌの二回蒸留水をサンプルに加え、混合物をガラス棒で粉砕して分散物とした。約５μｌの分散サンプルを取り、ポリビニルアルコール−ホルムアルデヒドアセタールコート３００メッシュ銅ＴＥＭグリッド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）上に堆積させた。過剰のサンプルはろ紙の小片を用いて除き、残りのサンプルを室温で前記グリッド表面で乾燥させた。場合により、「ＮＡＮＯ−Ｗ」名のＴＥＭネガティブ染色（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｙａｐｈａｎｋ，ＮＹ）を前記乾燥サンプル上に適用し、コントラスト及び視認性を補強した。試験片をＰｈｉｌｉｐｓ社ＣＭ１２０電子顕微鏡で測定し、そのイメージをＭｅｇａＶｉｅｗ３Ｄｉｇｉｔａｌ ｃａｍｅｒａ（ｆｒｏｍ ＳＩＳ，Ｒｉｎｇｏｅｓ，ＮＪ）に記憶させた。測定はＳＩＳ名分析ソフトウェア（Ｒｉｎｇｏｅｓ，ＮＪ）で実行され、既知の長さの参照サンプルを用いて較正された。

ＩＣＰＭＳ結果は、ＢＳＤ領域にクロム、銅、鉄、ニッケル及びビスマスの存在を示した。クロム、銅、鉄及びニッケルの段階的な増加が見られたが、ＢＳＤ領域でのビスマスの濃度は、同じチーズの非ＢＳＤ領域で測定された値よりも、常に３桁以上多かった。これらの結果は、ビスマスが色素生成反応に関与する十分な量を持って存在する唯一の元素であることを示す。

チーズサンプルのＢＳＤ領域の数百枚のＴＥＭイメージからは、単一の整合性のある結論が得られた。上記引用された文献で報告されたこれらの典型的ナノロッド構造が、ＢＳＤチーズ領域に特異的に見出された。かかるイメージの一例が図２に示される。図２に示されるナノロッド構造は非常に小さく光学顕微鏡では視認が難しい。図２で示されるナノロッド構造は直径が約６９ｎｍから約１３０ｎｍの範囲である。前記ナノロッド構造はＴＥＭの潜在的な過酷な条件にも非常に安定である。前記ロッド構造はややまだらの表面であり、前記ナノロッド構造に長さ方向に特徴的に線が走っている。図３には、単一のナノロッドの拡大図が示される。かかる構造の存在は、チーズ自体の中の条件下で形成されるビスマス硫化物ナノロッド構造の存在と整合性がある。

ビスマスＩＩＩ硫化物ナノロッドを形成する反応物としてのビスマス硫化物の反応性を確認するために、ＢＳＤが実験室で意図的に生成させることができるかどうかを調べるために追加の試験が実施された。すなわち、チーズを既知のＩＴＳ成分量と共に製造し、熟成チーズにより生成される真正の揮発性ガスに暴露するか、又は次硝酸ビスマスと反応すると仮定される硫化水素に暴露させる。両方の場合において、応答はほとんど同じであった。次硝酸ビスマスを含むチーズサンプル又は完全なＩＴＳ剤を含むチーズサンプルが、真正チーズ揮発性ガス又は「化学標準」グレードのＨ_２Ｓガスに暴露させた場合、それぞれは同じ黒色素を形成し、それにはナノロッド構造の存在を伴っており、さらに、次硝酸ビスマスがＢＳＤの原因であることが確認された。

チーズ製造及びチーズ熟成の見地から、ＢＳＤ制御のために硫化水素ガス生成を除去することを目標とすることは合理的ではない。硫化水素は高い芳香性成分であり、微生物、酵素及びシステインなどの硫黄含有アミノ酸に対するコファクタ活性からの生成物である。Ａｒｆｉ等の（２００２）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５８：５０３−５１０を参照する。硫化水素は熟成チェダーチーズ風味に必要で及び／又は価値ある成分であることは、多くの研究から支持されている。Ｂｕｒｂａｎｋ及びＱｉａｎ等の（２００５）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．１０６６：１４９−１５７を参照する。たとえ硫化水素の生成を除去するように変更（数十の複雑な代謝経路に干渉して）したとして、得られる最終製品は、チーズ取引者及び消費者に受け入れ難い風味特性となる恐れがある。

以下の実施例は、ここで開示され請求される本発明をより完全に記載するためだけに提示される。これらの実施例は本発明をいかなるようにも限定するものではない。

実施例１：
金属塩として酸化亜鉛及び酸化チタンの組み合わせを用いてテストＩＴＳを処方した。テストＩＴＳは、ビスマス又はビスマス含有塩を含まないという点以外は「オルベシール」名剤と同一であった。テストＩＴＳは、酸化亜鉛、酸化チタン、ミネラルオイル（３０〜４０％）、及びステアリン酸アルミニウムを含む。

ＩＴＳバッチを調製するために、液体パラフィン（例えばミネラルオイル）を混合装置を持つ適切な容器に導入した。ステアリン酸アルミニウムを添加し、混合物を攪拌し、これを約１６０℃に加熱して均一とした。その後、非毒性、非ビスマス含有塩を前記混合物へ部分に分けて添加し、望ましい量の金属塩が添加されるまで攪拌した。混合物をその後均一になるまで攪拌した。生成物を、乳頭投与のための従来の注入チューブに移した。

実施例２：
本実施例の目的は、ＩＴＳの非泌乳期乳牛の乳頭内の保持性を比較するためであり、前記ＩＴＳは、「オルベシール」名製品との比較として、次硝酸ビスマスを含まない。

研究はＢｌａｉｎｅ Ｄａｉｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ− Ｍａｄｉｓｏｎ （ＵＷ），ｉｎ Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎで行われた。１６頭乳牛（ｎ＝６４乳頭）が乾乳期間に登録された。全ての登録乳牛は４つの機能的四肢を持ち、視認可能な乳腺炎はなかった。全ての乳牛は乾乳され、標準のＵＷ乳牛プロトコルに従って乳房内抗生物質乾乳治療（ＤＣＴ）を受けた。全ての牛の出産回数及び乳量（乾乳時期）が記録された。最初の登録において、乳頭は、形状、長さ、直径及び乳頭端の過角化の程度が記録された。それぞれの牛内で２つの乳頭が「オルベシール」名ＩＴＳを、そして他の２つの乳頭がテストＩＴＳを受けるように帰属させた。投与プロトコルは、それぞれの製品が均一に乳頭位置、８頭の乳頭につきそれぞれの位置（右後、右前、左後、左前）に投与されるように設計された。シール剤チューブを投与前後で秤量して真の投与量を求めた。ＤＣＴ及び乳頭内シール剤を受ける前に、乳頭が７０％イソプロピルアルコールワイプを用いて、また部分的に挿入技術を用いて皮膚病原菌が侵入する可能性を低減させるために清浄化された。乳頭内シール剤の投与後、乳頭は外部乳頭消毒剤に漬けた。

乳頭は、１，２，３，４，５，６，７，１４，２８，４２日目及び分娩の際に、赤化、膨張及び／又はシール剤の漏れを検出するため検査した。検査はひとつの乳頭（それぞれのシール剤につき除去日ごとに８つの乳頭）から手で引き剥がして除去した。除去されたシール剤は最初の乳と共に５０ｍｌプラスチックバイアルに集められた。バイアルは遠心分離され（３０００ｒｐｍｘ５〜７分間）、上澄みを濯いで回収シール剤を秤量した。回収シール剤の量は、テストＩＴＳ処理乳頭及び「オルベシール」名ＩＴＳ処置乳頭の間のそれぞれの期間で比較された。追跡サンプルを、分娩後一日目に同じ手順で集めた。全てのサンプリング期間で、前記シール剤を除去した後、乳頭は外部乳頭消毒液に漬けた。分娩後、クオータの乳を無菌で、全ての乳頭から集め、乳房内感染を同定するため培養した。

グループの特性−乳頭長さ及び容積：
全１６頭乳牛が登録されて全６４乳頭につき研究した。３２乳頭がテストＩＴＳを受け、３２乳頭が「オルベシール」名ＩＴＳを受けた。試験集団の乳頭長さ及び容積は表１にまとめられる。

グループＡ及びグループＢの間に乳頭の長さ及び容積について有意差は見られなかった（ｐ＞０．３６）。全体として乳頭長さは５．１１ｃｍ、範囲は３．３ｃｍから７．３ｃｍであった。平均乳頭長さはグループＡで５．１２ｃｍ、グループＢで５．１１ｃｍであり、範囲はグループＡで３．３ｃｍから７．３ｃｍ、グループＢで３．５ｃｍから７．１０ｃｍであった。これら２つのグループ間で平均乳頭長さには差がないという帰無仮説をテストするために２サンプルペアｔ−テストを実施した。この結果、どちらかの製品を受けるように無作為化された乳頭の長さには有意な差はない（ｐ＝０．９５）。

全体として容積さは２４．６６ｃｍ^３、範囲は１２．４７ｃｍ^３から５４．３４ｃｍ^３であった（標準偏差９．１７ｃｍ^３）。平均容積はグループＡで２３．６ｃｍ^３、グループＢで２５．７１ｃｍ^３であり、範囲はグループＡで１２．５４ｃｍ^３から５４．３４ｃｍ^３、グループＢで１２．４７ｃｍ^３から４８．２５ｃｍ^３であった。これら２つのグループ間で平均容積には差がないという帰無仮説をテストするために２サンプルペアｔ−テストを実施した。この結果、どちらかの製品を受けるように無作為化された容積には有意な差はない（ｐ＝０．９５及びｐ＝０．３５、対数変換分析）。

過角化： 乳頭端状況は、次の尺度を用いて過角化をスコア化した：輪の数（Ｎ）、滑らかな輪（Ｓ）、粗い輪（Ｒ）、非常に粗い輪（ＶＲ）。乳頭スコアの分布は、Ｎ（ｎ＝２１；３２．８％）、Ｓ（ｎ＝３１；４８．４％）、Ｒ（ｎ＝１１；１７．２％）及びＶＲ（ｎ＝１；２％）であった。Ｘ^２テストはこの過角化スコア分布は、処置グループに伴うものではないことが確認された（ｐ＝０．１３）。

投与、回収及び損失シール剤量： 投与、回収及び損失（回収されない）シール剤量が、処置グループに基づいて変わらない、ということを決めるために、ペアｔ−テストを用いて統計解析を行った。

それぞれのチューブで４グラムから、投与されたシール剤全体としては３．６２ｇであった。「オルベシール」名ＩＴＳ（３．４６ｇ）又はテストＩＴＳ（３．６２ｇ）の量には有意差はなかった（ｐ＝０．１２）。

回収されたシール剤は全体として０．８２ｇであり、処置の間に有意差はなかった（ｐ＝０．８９）。損失シール剤の全体としては２．８８ｇであり、処置の間に有意差はなかった（ｐ＝０．４０）。回収されたシール剤は回収日に関連しており（ｐ＝０．０８）、１４日目に他の回収期間に比べてより多い（１４日目、回収＝１．６ｇ；２８日目回収＝０．６８ｇ、４２日目回収＝０．６５ｇ、分娩日回収＝０．３３ｇ）。

単純な直線回帰を用いて、投与されたシール剤の量と、乳頭容積間には有意差はないことを決定した（ｐ＝０．５９）。

回収されたシール剤及び乳頭容積間には有意差はないという帰無仮説をテストするために回収されたシール剤について単純な直線回帰テストを実施した。回収されたシール剤の６％のみが乳頭容積によるとされた（ｐ＝０．０５）。

投与されたシール剤の比率は、乳頭容積とは有意な関係はなかった。一方回収されたシール剤は乳頭容積と有意に関係していたが、その比率は小さい（６％）。

一方向ＡＮＯＶＡを用いて、投与シール剤量及び回収シール剤量及び乳頭位置、製品、乳牛との位置変数関係を決定した。

実施例３：
この実施例の目的は、改良された洗浄性を持つＩＴＳを開発することであった。この実施例で、実施例１で記載されたものと類似のＩＴＳが作成された（ただし、ミネラルオイルゲルをトリグリセリド系可動相と置換した）。これらのシール剤は、好ましく良好なバリア性を持ち、同時に、従来の乳頭洗浄プロトコルを用いて（ミネラルオイル系シール剤と比べて）改良された洗浄性特性を持つことが証明された。牛乳生産者は、従来のミネラルオイル系ＩＴＳ剤を、通常のその場洗浄手順（ＣＩＰ）を用いて乳との接触表面から残渣を取り除くことは非常に難しいということを経験している。従って、良好なバリア特性を持つＩＴＳはまた、乳との接触表面から容易に洗浄されるものであることが、市場から望まれている。

種々の原因により、多くの牛乳生産者は搾乳前に乳房からＩＴＳを適切に除去しない。これは訓練及び教育を通じて解消されることができる。さらに、多くの牛乳生産者は、推奨される温度及び洗浄の際の推奨洗浄成分濃度まで上げることはせず、取り扱い装置に従来のＩＴＳ剤からの残渣か蓄積され、事態を悪化させることとなる。乳製品生産者の洗浄実務は教育を通じて変えることはあり得ない。しかし残留ＩＴＳの洗浄性を改良する可能な方法は、ＩＴＳ製品自体の化学を変更することにある。

ＩＴＳの塩成分は、それが次硝酸ビスマス、酸化亜鉛又は他の塩であっても、標準の洗浄手順を用いても大きくは影響されず又は溶解されない。前記塩はそれ自体分散された粒子性物である。前記塩は連続ゲル相（従来技術ではミネラルオイル）にも、水溶性洗浄相にも溶解しない。さらには、ＩＴＳ製品のミネラルオイル成分（アルカンの粘性混合物）は本質的に洗浄化学物質（塩素化塩基性洗浄剤）とは反応性ではない。ミネラルオイルはまた、十分非極性であり、水溶性洗浄溶液に耐溶解性である。まとめると、ミネラルオイルゲル相を持つＩＴＳは乳との接触表面上に堆積させると、標準の洗浄手順を用いて除去することが非常に難しくなるということである。

ＩＴＳ剤でのミネラルオイルの果たす役割は、不活性な連続相分散媒体である。本発明者は、この役割はまたモノ、ジ及び／又はトリグリセリド油などの材料によっても果たすことができることを見出した。ミネラルオイルと、例えばトリグリセリド材料とを置換する有利な点は、ミネラルオイルとは異なりトリグリセリドはほとんどの共通の乳装置洗浄剤、アルカリ洗浄剤（即ち水酸化ナトリウム）と反応するということである。脂肪酸がエステル化されたグリセリドは、高いｐＨで水酸化ナトリウムと反応して化学的に対応するナトリウム塩（例えばステアリン酸ナトリウム）へ変換され、表面から容易に除去され洗浄溶液の水性相に分散される。コーン油、綿実油、又はカノーラ油などのトリグリセリド油は容易に利用可能であり、熱に安定であり（殺菌目的のため）、異なる安定性及び溶融特性を変更することができる。

グリセリド系ＩＴＳは、ミネラルオイル系ＩＴＳに比べてバリア特性の点から非常に好ましい。トリグリセリド系ＩＴＳはまた、ミネラルオイル系ＩＴＳに比べてその洗浄性は約１０倍改良されている。洗浄性が改良されていることから、トリグリセリド系ＩＴＳは、塩成分として次硝酸ビスマスなどのビスマス含有塩を利用することができる。

グリセリドゲル系からのＩＴＳを試験するために、小型のクリーンインプレース（ＣＩＰ）ループを構成した。ＣＩＰループは１１ガロンのタンク、柔軟性清浄化ライン、渦巻きポンプ、スロットルバルブ及びデジタル流速計を含む。テスト表面として、３１６ステンレススチール及びプラスチックの２”ｘ２”試験片を用いた。洗浄された試験片は秤量された。既知量のＩＴＳサンプルをそれぞれの試験片に適用し、再度秤量した。その後試験片をＣＩＰループで洗浄した。それぞれの試験片はＣＩＰループの柔軟ラインの端部に挿入し、ホースクランプで固定された。ポンプのスイッチを入れて流速をスロットルバルブで望ましい目標速度へ調節した。該速度はデジタル流速計で表示された。デジタル温度計が温度をモニタするために用いられた。試験片及びＩＴＳ処理試験片を共に配置し、該システムを１３０°Ｆの熱水で満たし、ポンプのスイッチを入れて流速を調節した。１ガロンの水につき１オンスの塩素化塩基性洗浄剤をＣＩＰループに加え該システムを１０分間運転した。前記試験片を取り出し乾燥し、除去されたＩＴＳの量を決定するために秤量された。

その結果、実施例１で記載された「オーベシール」名ＩＴＳ及び酸化亜鉛系ＩＴＳ（これらは共にゲル相としてミネラルオイルを用いている）の間にはなんら特徴的な洗浄性の相違は見られなかった（表５を参照。図５で、ｎ＝３）。表５は、ステンレススチール及びプラスチックの試験片から除去されたＩＴＳの重量％が示されている。ここで、ｓｓ＝ステンレススチール表面、ｐｌ＝プラスチック表面、ｏｒｂ＝「オルベシール」名ＩＴＳ、ｚｍｏ＝亜鉛＋ミネラルオイル、ｚｃｏｔ＝亜鉛＋綿実油、ｚｃａｎ＝亜鉛＋カノーラ油を示す。

対照的に、ゲル相としてトリグリセリドＩＴＳを用いて作成したＩＴＳ剤は、ミネラルオイルとは異なり、残留物の除去性が劇的に増加した（約１０倍、図５を参照）。具体的なメカニズムに限定されることなく、かかる改良された洗浄性は、非反応性のミネラルオイルに比較してトリグリセリドの化学反応性が増加した結果であると、考えられる。まとめると、トリグリセリド材料のエステル結合が容易に塩基性洗浄剤（ＮａＯＨ）で加水分解される。従って、前記残留物は水性相へ対応する脂肪酸のナトリウム塩として分散されていく。

実施例４−乳製品反応性：
液状牛乳サンプル（２％ホモジナイズ化、ビタミンＤ）に０．０５重量％のそれぞれのＩＴＳで処置し、４５°Ｆで２週間保存した。その後、サンプルを目視で、専門家パネル（ｎ＝４）による感応試験を用いて変性の事象を評価した。４つのＩＴＳ処置が評価された（「オルベシール」名ＩＴＳ、Ｚｎ／ミネラルオイル、Ｚｎ／カノーラ油、及びコントロールサンプルを含む）。パネリストはコントロールからの相違を求められた。まとめると、パネリストはコントロールサンプルの評価を求められ、次に前記コントロール牛乳を参照として、処置されたサンプルの風味を評価した。結果は次にまとめる。

タンパク質の変性などの事象は全く視認できなかった。処置されたサンプルのそれぞれはコントロールから区別がつかなかった。風味の点においても同様の結果であり、風味上の欠陥又はＩＴＳ処置の存在又はタイプに基づく寄与は全くなかった。

チーズ分析は続行中である。新しく作ったモツアレラ及びチェダーチーズサンプルを製造し、表面をＩＴＳで処置し、真空包装し、現在熟成中である。これまで、変性の兆候や外見上の欠陥が全く見られない。

実施例５−ヨーグルト発酵及び感応評価：
３つの異なるヨーグルト発酵を実施して、ＺｎＯシール剤又は「オルベシール」名ＩＴＳの存在による、この発酵製品の最終感応特性への可能な影響を研究した。以前の実験で、かかる材料は目立つほどは製品のｐＨの低下をもたらさないことが見出されている。従って、次の実験が実行された。５０ｍｌの加熱処理された牛乳を３つの滅菌１００ｍＬフラスコに入れ、乳酸菌ｄｅｌｂｒｕｋｅｉｉ種ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓとインキュベートした（Ｅｌｌｉｋｅｒブロス、予め２４時間、３７℃でインキュベートしたもの）。５０ｍｇの「オルベシール」名ＩＴＳをフラスコのひとつに入れ、５０ｍｇのＺｎＯシール剤（６５％の重ミネラルオイル中）を他のフラスコに入れた。これらのフラスコを一夜３７℃でインキュベートし、最終ｐＨ同様、風味、芳香性プロフィルなどの相違を評価した。

結果：３つの発酵製品の最終ｐＨは非常に類似していた。範囲は４．４５及び４．５であった。最終製品を食べてみて、これらの３つの処置物の間に、風味、芳香性プロフィルに変化はなかった。

実施例６−ＩＴＳ剤の密度：
７つの異なる亜鉛形ＩＴＳ剤の密度が決定され、「オルベシール」名ＩＴＳと比較された。それぞれの調製されたシール剤の少量（４００μｌ）を化学分析天秤を用いて秤量した。表６には得られた結果をまとめてある。表は少なくとも１０回に測定の平均値を対応する標準偏差とともに記載されている。一般的に、前記分散物の密度はより高い酸化亜鉛を用いる場合に増加する。性能基準は、元の「オルベシール」名ＩＴＳの密度の５〜１０％の範囲であった。これは、５％レベルで約１．８１７から約２．００８ｇ／ｍＬ、１０％レベルで約１．７２２から約２．１０４ｇ／ｍＬである。試験された全てのサンプルは、これらのパラメータ内に入ったが、６０％ＺｎＯカノーラ油処置の５％レベルでは例外であった。

実施例７−ＩＴＳ剤の粘性
酸化亜鉛、ステアリン酸アルミニウム及びカノーラ油を含む新たに調製したＩＴＳの粘度を、いくつかの温度で、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＤＶ−Ｉ Ｐｒｉｍｅ（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ，Ｍｉｄｄｌｅｂｏｒｏ，ＭＡ）により、Ｓ０６スピンドルを用いて２．０ｒｐｍで測定した。これらの新たなＩＴＳ剤の粘度への温度の影響は図６から分かる。低温度（−１５℃）でのデータは現在進行中である。

Claims (22)

1. 非ヒト動物の乳頭管内に物理的バリアを形成して、前記動物の乾乳期間での乳房疾患の予防的処置を行い、同時に前記動物からの乳を用いて作られる乳製品中の黒点欠陥を防止する方法であり、当該方法は：
   前記動物の乳頭管内にある量の乳頭シール剤を注入するステップを含み、前記乳頭シール剤が、グリセリドを含むゲル相内に分散される非毒性金属塩を含み、
   注入される前記乳頭シール剤の量が、前記乳頭管内への微生物の侵入に対して物理的バリアを形成するために十分であり、前記乳頭シール剤が、前記動物からの乳を用いて作られる乳製品内に黒点欠陥を生じず、さらに、
   前記乳頭シール剤が抗感染剤を含まない、方法。
2. ビスマスを含まない乳頭シール剤を注入するステップを含む、請求項１に記載の方法。
3. トリグリセリドを含む基剤中にビスマスを含まず、非毒性金属塩を含む乳頭シール剤を注入するステップを含む、請求項１に記載の方法。
4. 少なくとも約３０重量％の前記非毒性金属塩を含む乳頭シール剤を注入するステップを含む、請求項１に記載の方法。
5. 約５０重量％から約７５重量％の前記非毒性金属塩を含む乳頭シール剤を注入するステップを含む、請求項１に記載の方法。
6. 約６５重量％の前記非毒性金属塩を含む乳頭シール剤を注入するステップを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記非毒性金属塩が、チタン塩、亜鉛塩、バリウム塩及びそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
8. 前記非毒性金属塩が、二酸化チタン、酸化亜鉛、硫酸バリウム、及びこれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
9. 前記ゲル基剤が、動物脂肪、カノーラ油、ココナッツ油、コーン油、綿実油、亜麻仁油、パーム油、パーム核油、菜種油、大豆油、ひまわり油、魚油、藻油及びこれらの組み合わせを含む群から選択される油を含む、請求項１に記載の方法。
10. 乳房内乳頭シール剤であり、
    グリセリドを含むゲル基剤；及び
    前記ゲル基剤中に分散される非毒性金属塩；
    を組み合わせて含み、
    抗感染剤を含まない乳頭シール剤。
11. 前記ゲル基剤がトリグリセリドを含む、請求項１０に記載の乳頭シール剤。
12. 前記ゲル基剤が、動物脂肪、カノーラ油、ココナッツ油、コーン油、綿実油、亜麻仁油、パーム油、パーム核油、菜種油、大豆油、ひまわり油、魚油、藻油及びこれらの組み合わせを含む群から選択される油を含む、請求項１０に記載の乳頭シール剤。
13. ビスマスを含まない、請求項１０に記載の乳頭シール剤。
14. 少なくとも約３０重量％の前記非毒性金属塩を含む、請求項１０に記載の乳頭シール剤。
15. 約５０重量％から約７５重量％の前記非毒性金属塩を含む、請求項１０に記載の乳頭シール剤。
16. 約６５重量％の前記非毒性金属塩を含む、請求項１０に記載の乳頭シール剤。
17. 前記非毒性金属塩が、チタン塩、亜鉛塩、バリウム塩及びそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１０に記載の乳頭シール剤。
18. 前記非毒性金属塩が、二酸化チタン、酸化亜鉛、硫酸バリウム、及びこれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１０に記載の乳頭シール剤。
19. 非ヒト動物の乳頭管内に物理的バリアを形成して、前記動物の乾乳期間での乳房疾患の予防的処置を行う方法であり、当該方法は、前記動物の乳頭管内にシール剤を注入するステップを含み、請求項１０に記載の乳頭シール剤を注入することを特徴とする、方法。
20. 前記乳頭シール剤がミネラルオイルを含まない、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
21. ミネラルオイルを含まない、請求項１０乃至１８のいずれか一項に記載の乳頭シール剤。
22. 前記乳頭シール剤がミネラルオイルを含まない、請求項１９に記載の方法。

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