KR20110129297A

KR20110129297A - 양친매성 갈롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균제조성물

Info

Publication number: KR20110129297A
Application number: KR1020100048853A
Authority: KR
Inventors: 문제학; 박근영; 정종훈; 조정용; 박근형
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2010-05-25
Filing date: 2010-05-25
Publication date: 2011-12-01
Also published as: KR101198106B1

Abstract

본 발명은 갈롤 (gallol, pyrogallol) 유도체들의 항균활성에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 갈롤을 기본 골격으로 유지하면서 그 갈롤의 4위에 다양한 길이의 측쇄탄화수소를 결합시킴으로써 양친매성을 갖도록 하여 저자극성이고 세포막 내에서 우수한 항산화활성을 나타내고 식품부패균과 병원균에 대한 항균활성을 갖는 양친매성 갈롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균제조성물에 관한 것이다.

Description

양친매성 갈롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균제조성물 {Antimicrobial composition comprising synthesized gallol derivatives with effects of antioxidant and inhibition of lipid peroxidation}

카테콜(catechol, pyrocatechol, 1,2-dihydroxybenzene)의 3위 탄소에 포화 또는 불포화 측쇄 탄소수소가 결합된 우루시올 (urushiol) 유도체들이 강한 항균활성이 있음이 보고된 바 있다(박근영, 전남대학교, 석사학위논문, 2010).

그러나 이 우루시올 유도체들은 피부염을 유발하는 부작용이 있어 실용화에 어려움이 있다. 그래서 본 발명자들은 측쇄탄화수소의 길이를 달리한 우루시올 유도체들을 유기합성법에 의해 확보하여 쥐를 이용한 알러지 유발성 실험을 통해 알러지 비유발성 합성 우루시올 유도체들을 선별(김진영, 전남대학교, 석사학위논문, 2008)할 수 있었으며, 그들이 우수한 항균활성을 발휘함을 이미 확인한 바 있다(박근영, 전남대학교, 석사학위논문, 2010).

한편, 플라보노이드의 B 환(B ring)에 갈롤 구조를 가진 화합물들은 카테콜 구조를 가진 화합물들에 비해 자유 라디칼 소거 (free radical-scavenging) 속도가 더 빠르다고 알려져 있다. 즉, 인접한 수산기가 3개인 갈롤이 인접한 수산기가 2개인 카테콜보다 라디칼 소거 (radical-scavenging) 측면에서 보다 우수하다는 것을 알 수 있다. 갈롤은 이처럼 강력한 환원력을 기초로 한 항산화활성 이외에도 폐암이나 위암을 일으키는 세포의 생장을 억제시키는 항암작용에도 효과가 있음이 보고되고 있다.

따라서, 이러한 다수의 연구 결과들을 기초로 우루시올 유도체들(카테콜 유도체들)보다 더 우수한 생리활성, 특히 우수한 항균활성을 발휘할 수 있는 새로운 화합물을 유효성분으로 포함하는 항균제조성물에 대한 개발 필요성이 있었다.

본 발명자는 상기와 같은 종래 기술의 제반 단점과 문제점을 해결하기 위해 노력한 결과 양친매성을 갖는 갈롤 유도체를 개발하게 되어 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 강한 항산화 활성 위치(active site)인 갈롤 (gallol) 구조와 혈중 localization에 영향을 미칠 가능성이 높은 장쇄탄화수소(long hydrocarbon side chain)를 동일 분자 내에 가지고 있는 구조적 기본골격을 가진 양친매성 갈롤 유도체의 생리적 활성을 밝히고, 특히 양친매성 갈롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균제조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 식품부패균의 방제 및 예방에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 병원균 감염질환의 치료 및 예방에 사용할 수 있는 양친매성 갈롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균제조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 병원성 세균이나 독소를 생성시키는 곰팡이의 생성 및 성장을 억제하기 위한 용도로, 세정제, 약제, 식품첨가제, 방향제, 화장제, 도료로 사용 가능한 항균제조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 구조식 1을 갖는 1,2,3-트리하이드록시-4-알킬벤젠 (1,2,3-trihydroxy-4-alkylbenzene: T-OH4R) 유도체로서,

[구조식 1]

R은 C_nH_2n+1인 일반식을 갖는 양친매성 갈롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균제조성물을 제공한다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 R은 n이 1 내지 20인 사슬형 포화탄화수소이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 양친매성 갈롤 유도체는 4-펜틸갈롤(4-pentylgallol, 4-pentyl-1,2,3-benzenetriol, PG), 4-펜타데실갈롤(4-pentadecylgallol, 4-pentadecyl-1,2,3-benzenetriol, PDG), 4-에이코실갈롤(4-eicosylgallol, 4-eicosyl-1,2,3-benzenetriol, EG) 중 어느 하나 이상이다.

바람직한 실시예에 있어서, 상기 항균제조성물은 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis를 포함하는 그람양성균, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis를 포함하는 그람음성균 및 효모를 포함하는 식품부패균 및 Salmonella typhimurium, Streptococcus mutans, Vibrio vulnificus, Candida albicans, Helicobacter pylori 를 포함하는 병원균 중 어느 하나 이상이 균주에 대하여 항균활성을 갖는다.

본 발명은 다음과 같은 우수한 효과를 갖는다.

먼저, 본 발명은 강한 항산화 활성 위치(active site)인 갈롤 (gallol) 구조와 혈중 localization에 영향을 미칠 가능성이 높은 장쇄탄화수소(long hydrocarbon side chain)를 동일 분자 내에 가지고 있는 구조적 기본골격을 가진 양친매성 갈롤 유도체의 생리적 활성, 특히 우수한 항균활성을 밝힘으로써 양친매성 갈롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균제조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 항균제조성물은 식품부패균의 방제 및 예방에 사용할 수 있을 뿐만 아니라 병원균 감염질환의 치료 및 예방에 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 항균제조성물은 병원성 세균이나 독소를 생성시키는 곰팡이의 생성 및 성장을 억제하기 위한 용도로, 세정제, 약제, 식품첨가제, 방향제, 화장제, 도료로 사용 가능하다.

도 1은 본 발명에 의한 항균제조성물에 유효성분으로 포함되는 장쇄탄화수소의 측쇄의 길이가 다른 양친매성 갈롤 유도체들의 합성방법을 도식화한 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 의한 항균제조성물 1에 유효성분으로 포함되는 합성 갈롤 유도체 PG의 구조식과 그 화합물명을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 의한 항균제조성물 2에 유효성분으로 포함되는 합성 갈롤 유도체 PDG의 구조식과 그 화합물명을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 의한 항균제조성물 3에 유효성분으로 포함되는 합성 갈롤 유도체 EG의 구조식과 그 화합물명을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 실시예들에 의한 항균제조성물 1 내지 3의 Staphylococcus aureus에 대한 저지원을 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 실시예들에 의한 항균제조성물 1 내지 3의 Staphylococcus epidermidis에 대한 저지원을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 실시예들에 의한 항균제조성물 1 내지 3의 Pseudomonas aeruginosa에 대한 저지원을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예들에 의한 항균제조성물 1 내지 3의 Escherichia coli에 대한 저지원을 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 실시예들에 의한 항균제조성물 1 내지 3의 Bacillus subtilis에 대한 저지원을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 실시예들에 의한 항균제조성물 1 내지 3의 Salmonella enterica에 대한 저지원을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 실시예들에 의한 항균제조성물 1 내지 3의 Streptococcus mutans에 대한 저지원을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 실시예들에 의한 항균제조성물 1 내지 3의 Vibrio vulnificus에 대한 저지원을 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 실시예들에 의한 항균제조성물 1 내지 3의 Candida albicans에 대한 저지원을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 실시예들에 의한 항균제조성물 1 내지 3의 Helicobacter pylori에 대한 저지원을 나타낸 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어는 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어를 선택하였으나, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있는데, 이 경우에는 단순한 용어의 명칭이 아닌 발명의 상세한 설명 부분에 기재되거나 사용된 의미를 고려하여 그 의미가 파악되어야 할 것이다.

이하, 첨부한 도면에 도시된 바람직한 실시예를 참조하여 본 발명의 기술적 구성을 상세하게 설명한다.

그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수도 있다. 명세서 전체에 걸쳐 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.

본 발명의 기술적 특징은 1,2,3-트리하이드록시-4-알킬벤젠 (1,2,3-trihydroxy-4-alkylbenzene) 유도체로서 하기 구조식 1에 도시된 바와 같이 강한 항산화 활성 위치(active site)인 갈롤 (gallol) 구조와 혈중 localization에 영향을 미칠 가능성이 높은 장쇄탄화수소(long hydrocarbon side chain)를 동일 분자 내에 가지고 있는 양친매성 화합물인 갈롤 유도체가 우수한 항균활성을 갖는 것에 있다.

[구조식 1]

이 때, R은 C_nH_2n+1인 일반식을 갖는데, 특히 n이 1 내지 20인 사슬형 포화탄화수소인 것이 바람직하다. 특히 4-펜틸갈롤(4-pentylgallol, 4-pentyl-1,2,3- benzenetriol, PG), 4-펜타데실갈롤(4-pentadecylgallol, 4-pentadecyl-1,2,3 -benzenetriol, PDG), 4-에이코실갈롤(4-eicosylgallol, 4-eicosyl-1,2,3- benzenetriol, EG) 중 어느 하나 이상인 것이 보다 바람직하다.

따라서, 본 발명의 항균제조성물은 양친매성 갈롤 유도체들 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하고, 약제학적 담체를 포함하여 병원균 감염질환의 치료 및 예방과 식품부패균의 방제 및 예방에 사용할 수 있다.

즉, 본 발명의 항균제조성물은 Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis를 포함하는 그람양성균, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis를 포함하는 그람음성균 및 효모를 포함하는 식품부패균 및 Salmonella typhimurium, Streptococcus mutans, Vibrio vulnificus, Candida albicans, Helicobacter pylori 를 포함하는 병원균 중 어느 하나 이상이 균주에 대하여 항균활성을 갖기 때문이다.

또한, 본 발명의 항균 조성물은 갈롤 유도체 화합물을 단독으로 또는 0.001 내지 99 중량%와 사용 목적에 따라 첨가제로서 적절히 선택된 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명은 이들 첨가제의 선택 사용 및 함량에 대해 특별히 제한을 두지 않으며, 해당업계에 종사하는 전문가 수준에서 사용방법 및 제형에 따라 적절히 조절이 가능하다. 즉, 본 발명의 첨가제는 통상의 항균제에 포함되는 물질의 예를 들면, 부형제 또는 희석제일 수 있고, 그 예로는 식염수, 완충용액, 덱스트로스, 이소파라핀, 물, 글리세롤, 에탄올이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 결코 아니다.

항균제의 제형은 사용방법 및 용도에 따라 적절히 조절할 수 있으며, 예컨대 액제, 현탁제, 과립제, 방향수제, 산제, 시럽제, 에어로졸제, 엑스제, 연고제, 유도엑스제, 유제, 전제, 점안제, 주사제, 주정제, 캅셀제, 크림제, 환제일 수 있다.

한편, 본 발명의 항균제 조성물은 병원성 세균이나 독소를 생성시키는 곰팡이의 생성 및 성장을 억제하기 위한 용도로, 세정제, 약제, 식품첨가제, 방향제, 화장제, 도료로 사용 가능하다.

약제로 사용하는 경우 소독제, 치료제, 예방제 등으로 사용 가능하다. 식품 첨가제로 사용하는 경우, 항균제조성물은 식품의 종류 및 사용방법에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다.

실시예 1

도 1에 도시된 개략적인 방법에 따라 도 2와 같은 화학식을 갖는 4-펜틸갈롤(4-pentylgallol, 4-pentyl-1,2,3-benzenetriol, PG, 화합물 2)을 합성한 후, PG를 유효성분으로 하는 항균제조성물 1을 제조하였는데, 구체적인 방법은 다음과 같다.

1-1. 1,2,3-Trimethoxy-4-pentylbenzene (화합물 1)의 합성

건조한 수기에 무수 테트라히드로퓨란 (tetrahydrofuran, THF) 50 mL와 1,2,3-트리메톡시벤젠 (1,2,3-trimethoxybenzene) 4 g (24 mmol)을 첨가한 후, 0℃에서 30분간 교반(stirring)하였다. 이 용액에 부틸리튬 (n-butyllithium) 45 mL (n-BuLi, 헥산 용액 중에 1.6 M, 72 mmol)를 서서히 적가 한 후, 0℃에서 1시간, 그리고 실온에서 3시간 순차적으로 반응시켜 리튬이온화(lithiation)를 행하였다. 다시 이 용액에 1-브로모펜탄 (1-bromopentane) 5.94 mL (48 mmol)를 서서히 적가 한 후, 실온에서 20시간 반응시켜 알킬화(alkylation)를 행하였다. 합성과정 중 TLC 분석을 행하여 반응이 종결되었다고 판단되면, 실온에서 냉각하여 포화 암모늄클로라이드(ammonium chloride, NH₄Cl; 50 mL × 3회)용액으로 중화하고, 에틸아세테이트(ethylacetate, EtOAc; 50 mL × 3회)로 분획하였다. 분획된 EtOAc층은 염수(brine; 50 mL × 3회)로 불순물을 제거하였다. 얻어진 반응 혼합물은 냉각흡입기(cooling aspirator; CCA-1110, Eyela, Tyoko, Japan)가 장착된 진공농축기(vacuum evaporator; A-3S, Eyela, Tyoko, Japan)를 사용하여 35℃에서 감압 농축한 후, 실리카겔 흡착 컬럼크로마토그라피(silica gel adsorption column chromatography)를 행하였다. 실리카겔(silica gel; 140 g, Kieselgel 60, 70-230 mesh, Darmstadt, Germany)을 헥산/에틸아세테이트(n-hexane/EtOAc)=18:1 (v/v) 용매계로 반죽상(slurry)을 만들어 컬럼(2.8 × 59 cm)에 충진시킨 후, 반응 혼합물 7.14 g을 컬럼에 주입(charge)하였으며, 헥산/에틸아세테이트(n-hexane/EtOAc)=18:1 (v/v)을 이동상으로 하여 용출ㆍ분획하였다. 분획된 각 획분은 박층크로마토그라피(TLC, Thin Layer Chromatography)의 판(plate; silica gel 60 F₂₅₄, 0.2 mm, Merck, Germany)에 스파팅(spotting)하고, 헥산/에틸아세테이트(n-hexane/EtOAc)=18:1 (v/v)을 전개용매로 하여 전개시킨 후, 요오드 기체 (I₂gas) 중에서 발색시켜 이동값 (R _f value) 0.33에 스팟(spot)을 보인 획분들(3.6 g, 수율 62.94%, 무색 oil상)을 모아 1,2,3-trimethoxy-4-pentylbenzene (화합물 1)을 얻었다.

1-2. 4-Pentylgallol (PG, 화합물 2)의 합성

1,2,3-Trimethoxy-4-pentylbenzene의 합성 과정을 2회 반복수행하여 얻어진 순수한 합성 화합물 5.7 g (22.5 mmol)을 수기에 취한 후, 무수 메틸렌클로라이드 (methylene chloride, CH₂Cl₂) 60 mL를 첨가하여 용해 및 교반(stirring; 0℃, 1시간)을 행하였다. 이 용액에 1.0 M BBr₃용액 (in dichloromethane) 45 mL (45 mmol)에 무수 CH₂Cl₂ 23 mL를 가한 용액(68 mL)을 서서히 적가한 후, 0℃에서 1시간, 그리고 실온에서 20시간 순차적으로 교반(stirring)하여 탈메톡실화(demethoxylation)를 행하였다. 합성과정 중 TLC 분석을 행하여 반응이 종결되었다고 판단되면 서서히 냉각하여 증류수 100 mL를 첨가하여 물층과 메틸렌클로라이드층으로 분획하였다. 다시 물층은 메틸렌클로라이드(50 mL × 2회)를 첨가하여 분획하였고, 분획된 메틸렌클로라이드층은 합하여 염수(brine; 100 mL × 2회)로 불순물을 제거하였다. 이 반응 혼합물은 냉각흡입기(cooling aspirator; CCA-1110, Eyela, Tyoko, Japan)가 장착된 진공농축기(vacuum evaporator; A-3S, Eyela, Tyoko, Japan)를 사용하여 35℃에서 감압 농축 후, 실리카겔 흡착 컬럼크로마토그라피(silica gel adsorption column chromatography)를 행하였다. 실리카겔(silica gel; 120 g, Kieselgel 60, 70-230 mesh, Darmstadt, Germany)을 n-hexane/ether=1:1.5 (v/v) 용매계로 반죽상(slurry)을 만들어 컬럼(2.9 × 56 cm)에 충진시킨 후, 반응 혼합물 6 g을 컬럼에 주입(charge)하였고, 이동상은 헥산/에테르(n-hexane/ether)=1:1.5 (v/v)를 이용하여 용출ㆍ분획하였다. 분획된 각 획분을 TLC 판(plate; silica gel 60 F₂₅₄, 0.2 mm, Merck, Germany)에 스파팅(spotting)하고, 헥산/에테르(n-hexane/ether)=1:1.5 (v/v)를 전개용매로 하여 전개시킨 후, 요오드 기체 (I₂gas) 중에서 발색시켜 이동값 (R _f value) 0.47에 스팟(spot)을 보인 획분들(5 g, 수율 95.88%, 옅은 황색 분말)을 모아서 양친매성 갈롤 유도체인 4-pentylgallol (PG, 화합물 2)을 얻었다.

1-3. 항균제조성물 1의 제조

합성된 4-pentylgallol (PG) 5 μmol을 에탄올 15 μL에 용해시켜 액상의 항균제조성물 1을 제조하였다.

실시예 2

도 1에 도시된 개략적인 방법에 따라 도 3과 같은 화학식을 갖는 4-펜타데실갈롤(4-pentadecylgallol, 4-pentadecyl-1,2,3-benzenetriol, PDG, 화합물 6)을 합성한 후, PDG를 유효성분으로 하는 항균제조성물 2를 제조하였는데, 구체적인 방법은 다음과 같다.

2-1. 1,2,3-Trimethoxy-4-pentadecylbenzene (화합물 5)의 합성

1,2,3-트리메톡시벤젠/부틸리튬/1-브로모펜타데칸(1,2,3-trimethoxybenzene /n-BuLi/1-bromopentadecane)의 몰(mol)비를 1:3:2로 반응시키기 위하여 1-브로모펜타데칸(1-bromopentadecane)은 13.84 mL (48 mmol)를 사용하였고, 그 이외의 시약 (1,2,3-trimethoxybenzene, n-BuLi) 사용량 및 방법은 상기 화합물 1과 3의 합성법과 동일하게 행하였다. 실리카겔 흡착 크로마토그라피(silica gel adsorption column chromatography)를 행하여 이동값 (R _f value) 0.34에 스팟(spot)을 보인 획분들(5.5 g, 수율 60.10%, 흰색 분말)을 모아 1,2,3-trimethoxy-4-pentadecyl-

benzene (화합물 5)을 얻었다.

2-2. 4-Pentadecylgallol (PDG, 화합물 6)의 합성

1,2,3-Trimethoxy-4-pentadecylbenzene의 합성과정을 2회 반복수행하여 합성한 4.3 g (11 mmol)의 순수한 화합물을 삼브롬화붕소(BBr₃; 22 mL, 22 mmol)와 1:2의 mol비로 반응시켜 얻은 반응 혼합물을 실리카겔 흡착 크로마토그라피를 행하였다. 실리카겔(silica gel; 120 g, Kieselgel 60, 70-230 mesh, Darmstadt, Germany)을 헥산/에테르(n-hexane/ether)=1:1.5 (v/v)의 용매계로 반죽상(slurry)을 만들어 컬럼(2.5 × 61 cm)에 충진시킨 후, 반응 혼합물 6 g을 컬럼에 주입(charge)하였다. 이동상은 헥산/에테르(n-hexane/ether)=1:1.5 (v/v)를 이용하였으며, 용출ㆍ분획된 각 획분은 실시예 1과 동일한 방법에 의해 TLC 분석을 행한 후, 이동값 (R _f value) 0.47에 스팟(spot)을 보인 획분들(3 g, 수율 81.05%, 옅은 황색 분말)끼리 모아 양친매성 갈롤 유도체인 4-pentadecylgallol (PDG, 화합물 6)을 얻었다.

2-3. 항균제조성물 2의 제조

합성된 4-pentadecylgallol (PDG) 5 μmol을 에탄올 15 μL에 용해시켜 액상의 항균제조성물 2를 제조하였다.

실시예 3

도 1에 도시된 개략적인 방법에 따라 도 4와 같은 화학식을 갖는 4-에이코실갈롤(4-eicosylgallol, 4-eicosyl-1,2,3-benzenetriol,EG, 화합물 8)을 합성한 후, EG를 유효성분으로 하는 항균제조성물 3을 제조하였는데, 구체적인 방법은 다음과 같다.

3-1. 1,2,3-Trimethoxy-4-eicosylbenzene (화합물 7)의 합성

건조된 수기에 분말상으로 존재하는 1-브로모에이코산 (1-bromoeicosane) 17.35 g (48 mmol)을 넣고 진공펌프(vacuum pump; Edwards, Newcastle, England)를 이용하여 충분히 건조 한 후, 무수 테트라히드로퓨란 20 mL에 용해시켜 다음 반응에 이용하였다.

1,2,3-트리메톡시벤젠(1,2,3-trimethoxybenzene; 4 g, 24 mmol)과 부틸리튬(n-BuLi; 45 mL, 72 mmol)의 혼합용액을 0℃에서 1시간, 그리고 실온에서 3시간 순차적으로 반응시킨 다음, 미리 준비된 1-브로모에이코산 테트라히드로퓨란 (1-bromoeicosane THF) 용액 40 mL를 서서히 적가하여, 실온에서 20시간 반응시켜 알킬화(alkylation)를 행하였다. 이후 화합물 1, 3 및 5와 동일한 방법으로 정제하여 TLC 분석을 행한 후, 이동값 (R _f value) 0.33에 스팟(spot)을 보인 획분들(6.5 g, 수율 60.49%, 흰색 분말)을 모아 1,2,3-trimethoxy-4-eicosylbenzene (화합물)을 얻었다.

3-2. 4-Eicosylgallol (EG, 화합물 8)의 합성

1,2,3-Trimethoxy-4-eicosylbenzene의 합성과정을 2회 반복수행하여 합성한 8.6 g (18.9 mmol)의 순수한 화합물을 삼브롬화붕소(BBr₃;37.8 mL, 37.8 mmol)와 1:2의 몰비로 반응시켜 0℃에서 1시간, 그리고 실온에서 20시간 순차적으로 교반(stirring)하여 탈메톡실화(demethoxylation)를 행하여 얻은 반응 혼합물은 실리카겔 흡착 컬럼 크로마토그라피를 행하여 정제하였다. 실리카겔(240 g, Kieselgel 60, 70-230 mesh, Darmstadt, Germany)을 헥산/에테르(n-hexane/ether)=1:1.5 (v/v)로 반죽상을 만들어 컬럼(2.1 × 34 cm)에 충진시킨 후, 반응 혼합물 12 g을 컬럼에 주입하였다. 이동상은 헥산/에테르(n-hexane/ether)=1:1.5 (v/v)를 이용하였으며, 용출ㆍ분획된 각 획분은 실시예 1과 동일조건에서 박층크로마토그라피를 행한 후, 이동값 (R _f value) 0.47에 스팟(spot)을 보인 획분들(7.3 g, 수율 94.48%, 옅은 황색 분말)을 모아 양친매성 갈롤 유도체인 4-eicosylgallol (EG)을 얻었다.

3-3. 항균제조성물 3의 제조

합성된 4-eicosylgallol (EG) 5 μmol을 에탄올 15 μL에 용해시켜 액상의 항균제조성물 3을 제조하였다.

실험예 1

실시예 1 내지 실시예 3에서 얻어진 항균제조성물 1 (PG), 항균제조성물 2 (PDG) 및 항균제조성물 3 (EG)에 대한 항균활성을 다음과 같이 페이퍼 디스크법에 의해 평가하는 실험을 수행하였다.

항균활성을 조사하기 위해 시험균으로서 하기 표 1(항균활성 평가에 사용한 사용 균주와 배양조건 및 특성)에 나타낸 바와 같이 식품부패균 5종(Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis) 및 병원균 5종(Salmonella typhimurium, Streptococcus mutans, Vibrio vulnificus, Candida albicans, Helicobacter pylori)을 사용하였다.

항균활성은 페이퍼 디스크(paper disc)방법에 의해 평가하였고, 디스크 (disc) 당 5 μmol의 각 시료를 사용하였다. S. aureus, S. epidermidis, S. mutans, E. coli, P. aeruginosa 및 S. enterica는 37℃, B. subtilis와 V. vulnificus는 30℃, C. albicans는 25℃에서 12∼16시간 배양하여 나타난 생육저지원의 직경크기(mm)를 측정하였다. 9종의 균주에 대해서 대조구 화합물로는 benzoic acid (벤조산)와 합성 우루시올 유도체들 중 강한 항균활성을 보였던 3-펜틸카테콜(PC)[박근영, 전남대학교, 석사학위논문, 2010, Moon Jae Hak, Repub. Korean Kongkae Taeho Kongbo, KR 2009066135 A 20090623, 2009] 및 시판되는 피로갈롤(G)을 이용하였다. 그 결과를 하기 표 2( 식품부패균 및 병원성균에 대한 생육저지원의 크기) 및 도 5 내지 도 14에 나타내었다.

도 5 내지 도 14에 나타난 1, 2, 3은 각각 대조구로 사용한 벤조익 에시드 2.5 μmol, 5 μmol, 10 μmol 처리군을 나타낸 것이고, DG는 구체적인 실시예로 개시하지는 않았지만 양친매성 갈롤 유도체인 4-데실갈롤(4-decylgallol, 4-decyl- 1,2,3-benzenetriol, DG)을 합성하여 처리한 결과이다.

상기 실험결과로부터 얻어지는 흥미로운 현상으로써 갈롤 구조를 가지고 있더라도 그 4위 탄소에 결합된 측쇄탄화수소의 유무 및 그 길이에 따라 서로 활성에 현저한 차이가 있음이 관찰되었다. 그중에서도 갈롤 구조를 가지면서 측쇄에 -C₅H₁₁로 구성된 PG, 즉 PG를 유효성분으로 함유하는 항균제조성물 1이 가장 강한 항균활성을 보였다. PG는 또한 알러지 비유발성 합성 우루시올 유도체인 PC와 비슷하거나 그보다 우수한 항균활성을 보였다. 이 결과로써 항균활성에는 유리형의 갈롤 구조와 적합한 길이의 측쇄탄화수소 양자가 협동적으로 활성에 관여하는 것으로 해석된다. 즉 유리형의 갈롤 구조를 가지고 있지만 측쇄탄화수소가 없는 갈롤(pyrogallol, G)의 경우 매우 약한 항균활성을 보였으며, 또 갈롤 구조를 가지면서 측쇄에 -C₁₅H₃₁로 구성된 PDG 및 -C₂₀H₄₁로 구성된 EG의 경우에는 전혀 항균활성을 보이지 않았다. 그리고 갈롤 구조를 가지면서 측쇄 탄소수가 0∼5개인 화합물들이 활성을 보이고 있으며, 10개 이상인 화합물들이 활성을 보이지 않았음을 고려하였을 때, 그리고 본 페이퍼 디스크법에 의한 항균 활성 평가 결과만을 가지고 판단하였을 때, 활성을 강하게 발현시키기 위해서는 측쇄탄화수소의 탄소수가 10개 미만일 필요가 있을 것으로 판단되었다.

또한, 헬리코박터 파일로리의 대조화합물로는 날리디식 에시드 (nalidixic acid), 에리스로마이신 (erythromycin), 테트라사이클린 (tetracycline) 및 엠피실린 (ampicillin)을 각각 사용하였다. 그리고 헬리코박터 파일로리는 CO₂ 배양기(37℃, 10% CO₂, 95%의 습도)에서 배양하여 나타난 생육저지원의 직경크기(mm)를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 3(헬리코박터 파일로리에 대한 생육저지원의 크기)에 나타내었다.

양친매성 갈롤 유도체들 중 G (0 mm), DG (7.0± 0 mm), PDG (0 mm) 및 EG (0 mm)는 정도의 차이는 있으나 생육 저지원이 관찰되지 않거나 매우 약하게 관찰되었다. 그러나 갈롤 4위 측쇄가 -C₅H₁₁인 PG의 생육저지원(26.7± 0.6 mm)은 우루시올 유도체인 3-펜틸카테콜(3-pentylcatechol, PC; 31.5± 0.5 mm)에는 미치지 못하지만, 헬리코박터 파일로리 감염환자의 치료제로 이용되고 있는 화합물들, 즉 날리디식 에시드 (11.0± 0.2 mm), 에리스로마이신(7.0± 0 mm), 테트라사이클린 (9.0± 0 mm) 및 앰피실린(7.0± 0 mm)보다 압도적으로 더 강한 활성을 보였다.

이 결과로부터 양친매성 갈롤 유도체들의 항균활성은 식품부패균 5종 및 병원성균 5종에 대한 결과와 유사한 경향을 보였고, 갈롤 골격 4위에 -C₅H₁₁의 측쇄탄화수소를 가지고 있으면서, 알러지 비유발성인 PG가 가장 강한 항균활성을 보였다. 특히 헬리코박터 파일로리 치료제로 기존에 활용되고 있는 화합물들의 항균활성을 압도적으로 능가한 결과가 관찰되었다.

이에 PG를 포함한 양친매성 측쇄탄화수소 결합형 갈롤 유도체들은 다양한 식품 부패균 및 병원균에 대한 항균제제로써의 활용이 매우 높을 것으로 판단되었다.

실험예 2

항균제조성물 1 (PG), 항균제조성물 2 (PDG), 항균제조성물 3 (EG)에 대한 항균 활성을 상기 표 1에 도시된 미생물들을 대상으로 최소저해농도법에 의해 실험하였다.

먼저 여러 개의 마개 있는 멸균시험관을 순차적으로 배열하여 각 균주에 해당되는 멸균 배지 5 mL를 무균적으로 시험관에 분주하였다. 항균제조성물 1 (PG), 항균제조성물 2 (PDG), 항균제조성물 3 (EG)과, DG, 시판품 G 및 대조구 벤조익 에시드, 그리고 우루시올 유도체 중 3-에이코실카테콜(3-eicosylcatechol, EC)을 각각 에탄올에 용해시켜 처음 시험관에 1000 μg/mL씩 가하고, 이하 시험관에 순차적으로 2배씩 희석(500, 250, 125∼4 μg/mL)하였다. 각각의 시험관에 미리 전배양한 배양액으로부터 최종농도가 10⁵∼10⁷ cfu/mL가 되도록 무균적으로 접종한 후, S. aureus, S. epidermidis, S. mutans, E. coli, P. aeruginosa 및 S. enterica는 37℃, B. subtilis와 V. vulnificus는 30℃, C. albicans는 25℃에서 각각 12∼16시간 배양하였다. H. pylori는 CO₂ 배양기(37℃, 10% CO₂, 95%의 습도)에서 18시간 배양하였다. 각 시험관으로부터 미생물 배양액 1 mL씩을 취하여 페트리 디쉬에 넣고, 미리 멸균하여 50℃로 유지된 아가 (agar) 약 10∼15 mL씩을 분주하여 잘 혼합시켜 넓게 펼친 다음, 응고시켜 각각의 배양 온도 조건 하에서 12∼18시간 배양한 후, 콜로니가 생성되지 않은 최소농도를 최소저해농도(minimum inhibition concentration, MIC)로 결정하였으며, 이를 하기 표 4(식품부패균 및 병원성균에 대한 최소저해농도값)와 표 5(헬리코박터 파일로리에 대한 최소저해농도값)에 나타내었다.

먼저 S. aureus의 최소저해농도 결과를 살펴보면, 갈롤 유도체들 모두는 대조구인 벤조익 에시드(0.25± 0 μmol/mL)보다 더 낮은 농도에서 항균활성을 나타냈다. 그리고 S. aureus 뿐만 아니라 9종의 모든 균주에서 비슷한 경향을 나타냄을 알 수 있었다. S. aureus 뿐만 아니라 9종 균주 대부분에서 벤조익 에시드보다 뛰어난 항균활성을 보였다. 그러나 페이퍼 디스크 법을 이용한 고체배지 상에서의 항균활성 결과들로부터 가장 우수한 항균활성을 보였던 갈롤 4위 측쇄가 -C₅H₁₁로써 알러지 비유발성 화합물로 확인되었던 PG는 최소저해농도 결과에 있어서 뛰어난 항균활성을 나타내지 않았다. 하지만 측쇄가 없는 G보다는 PG가 더 낮은 농도에서 활성을 보였다.

상기 표 5는 항균제조성물들의 헬리코박터 파일로리에 대한 최소저해농도값을 나타낸 것이다. 양친매성 갈롤 유도체들 중 측쇄탄화수소가 -C₂₀H₄₁로 구성된 EG즉, EG를 유효성분으로 포함하는 항균제조성물 3 (0.13± 0.04 μmol)이 낮은 농도에서 항균활성을 나타냈다. 그리고 DG (0.23± 0 μmol) > PDG (0.25± 0.10 μmol) > PG (0.64± 0 μmol) > G (1.98± 0 μmol) 순으로 항균활성을 보였다. 갈롤 골격 4위 측쇄가 -C₂₀H₄₁인 EG (0.13± 0.04 μmol)는 대조구 중 앰피실린(0.14± 0 μmol)보다 낮은 농도에서 항균활성을 나타냈고, 날리디식 에시드 (0.02± 0.01 μmol) 및 에리스로마이신(0.03± 0 μmol)과 비슷한 항균활성을 보였지만, 테트라사이클린 (0.002± 0 μmol)에는 미치지 못하는 항균활성을 나타냈다. 그러나 페이퍼 디스크법을 이용한 고체배지 상에서의 항균활성 결과로부터 가장 우수한 항균활성을 보였던 갈롤 4위 측쇄가 -C₅H₁₁인 PG의 최소저해농도 결과에서는 앰피실린(0.14± 0 μmol)이 더 뛰어난 항균활성을 나타냈다.

이처럼 측쇄의 유무 및 그 길이의 정도에 따라 항균활성에 차이가 있었으며, 페이퍼 디스크법에서 활성을 보이지 않았거나 매우 약한 활성을 보였던 화합물이 최소저해농도 측정법에 있어서는 높은 활성을 보이기도 하였다.

따라서, 본 발명에서 제시된 우수한 항균활성을 갖는 양친매성 측쇄 결합형 갈롤 유도체들은 사용하고자 하는 용도에 따라 측쇄의 길이를 선택하거나 측쇄의 길이가 다른 유도체들을 혼합하여 사용함으로써 그 유용성 및 활성을 향상시킬 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시 예에 한정되지 아니하며 본 발명의 정신을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.

Claims

하기 구조식1을 갖는 1,2,3-트리하이드록시-4-알킬벤젠 (1,2,3-trihydroxy- 4-alkylbenzene: T-OH4R) 유도체로서,
[구조식 1]

R은 C_nH_2n+1인 일반식을 갖는 양친매성 갈롤 유도체를 유효성분으로 포함하는 항균제조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 R은 n이 1 내지 20인 사슬형 포화탄화수소인 것을 특징으로 하는 항균제조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 양친매성 갈롤 유도체는 4-펜틸갈롤 (4-pentylgallol, 4-pentyl-1,2,3-benzenetriol, PG), 4-펜타데실갈롤 (4-pentadecylgallol, 4-pentadecyl-1,2,3-benzenetriol, PDG), 4-에이코실갈롤 (4-eicosylgallol, 4-eicosyl-1,2,3-benzenetriol, EG) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항균제조성물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis를 포함하는 그람양성균, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis를 포함하는 그람음성균 및 효모를 포함하는 식품부패균 및 Salmonella typhimurium, Streptococcus mutans, Vibrio vulnificus, Candida albicans, Helicobacter pylori를 포함하는 병원균 중 어느 하나 이상이 균주에 대하여 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균제조성물.