KR20110111462A

KR20110111462A - 암 바이오마커

Info

Publication number: KR20110111462A
Application number: KR1020117018169A
Authority: KR
Inventors: 스티브 스톤; 알렉산더 구틴; 주잔네 바그너; 줄리아 레이드
Original assignee: 미리어드 제네틱스, 인크.
Priority date: 2009-01-07
Filing date: 2010-01-07
Publication date: 2011-10-11
Also published as: EP3524697A1; AU2010203542B2; EP4328589A2; AU2010203542A1; EP4328589A3; EP3118328A1; DK2382331T3; AU2017203453A1; NZ594003A; AU2019210509B2; WO2010080933A1; CN102482711A; JP2012514474A; AU2022200945A1; EP2382331A4; BRPI1006075A2; ES2595410T3; EP2382331B1; CA2749103A1; AU2019210509A1

Abstract

환자의 암의 재발 위험을 예측하기 위한 바이오마커 및 상기 바이오마커의 사용 방법이 제공된다.

Description

암 바이오마커{Cancer biomarkers}

관련 출원에 대한 상호참조

본 출원은 미국 임시 출원 제61/143,077호 (2009.1.7), 제61/179,650호 (2009.5.19.), 제61/185,901호 (2009.6.10), 제61/241,748호 (2009.9.11), 제61/256,443호 (2009.10.30)에 대해 우선권의 이익을 주장하며 각 문헌은 전문이 본원에 참고인용된다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 질병의 분자적 분류, 특히 암의 분자 마커 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.

암은 미국에서 전체 사망률의 약 25%를 차지하는 대중의 주요 건강 문제이다. 다양한 암의 많은 치료법이 고안되었지만, 이 치료법들의 부작용 정도는 종종 다르다. 따라서, 임상의는 암을 얼마나 공격적으로 치료할지를 결정하기 위해 환자의 암이 얼마나 공격적인지를 아는 것이 유용하다.

예를 들어, 초기 단계의 무증후성 전립선암에 걸린 많은 환자들은 근본적인 전립선절제술 또는 방사선요법, 및 경우에 따라 보강제 요법(예컨대, 호르몬 또는 화학요법)으로 치료받고, 이들은 모두 심각한 부작용이 있다. 하지만, 이 환자들 중 대부분의 환자들에게는 이 환자들의 암이 공격적이지 않기 때문에(즉, 천천히 성장하고 환자의 생애 동안 사망률 또는 유의적인 이환률을 유발할 가능성이 없다) 상기 치료법과 이의 관련 부작용 및 비용이 불필요하다. 다른 환자들에서 이 암은 병독성(즉, 재발 가능성이 높다)이어서 환자의 생명을 구하기 위해 공격적인 치료가 필요하다.

환자가 공격적인 치료를 필요로 하는지 아닌지를 결정하는 의사를 돕기 위해 몇몇 도구가 고안되었다. 사실, 몇몇 임상 파라미터는 다양한 여러 암에서 이러한 목적에 현재 사용되고 있다. 전립선암의 경우, 예컨대 이러한 임상 파라미터로는 혈청 전립선-특이적 항원(PSA), 글리슨(Gleason) 등급, 병리학적 단계 및 수술 절제면을 포함한다. 최근, 임상 파라미터들은 암 진행/재발이 일어날 환자의 확률을 계산하는 연속 다변량 수술후 노모그램(nomogram)에 산입되어 더 많은 도움이 되었다[예컨대, Kattan et al., J. Clin. Oncol.(1999) 17: 1499-1507; Stephenson et al., J. Clin. Oncol.(2005) 23: 7005-7012]. 이러한 진보에도 불구하고, 많은 환자들은 부적당한 암 치료를 받고 있어, 암 재발의 예측을 위해 새롭고 개선된 도구를 절실히 필요로 한다.

본 발명은 부분적으로, 세포 주기를 근접 추적하는 발현을 가진 유전자("세포-주기 유전자" 또는 "CCG")가 특히 특정 암 분류에 강력한 유전자라는 측정을 기반으로 한다. 사실상, 본 발명자들은 CCG가 많은 예후적 징후들 중에서 전부는 아니지만 대부분의 예측력을 제공한다는 것을 발견했다. 예를 들어, CCG 패널은 본원에서 전립선, 방광, 뇌, 유방 및 폐암의 공격성을 예측할 수 있는 것으로 밝혀진다.

따라서, 본 발명의 1가지 관점은 적어도 2개의 CCG를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 것을 포함하여 암을 분류하는 방법으로서, 비정상적 상태가 특정 암 분류를 시사하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 측정되는 상태는 유전자 발현 수준이다. 일부 양태에서, 비정상적 상태는 암이 공격성임을 시사하고, 이는 불량한 예후, 재발 또는 진행의 가능성 증가 등을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명은 적어도 2개의 CCG를 포함하는 유전자 패널의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하여 환자 암의 예후를 측정하는 방법으로서, 발현 상승은 암의 재발 또는 진행의 가능성 증가 또는 공격적 치료의 필요성을 시사하는 방법을 제공한다.

분석되는 CCG의 수는 예컨대 기술적 제약, 비용 문제, 수행되는 분류, 검사되는 암, 원하는 예측력 수준 등에 따라 달라질 수 있다. 하지만, 임의의 최소 수의 CCG가 확고하고 유의적으로 향상된 예측을 제공하는 것으로 측정되었다. 따라서, 본 발명의 일부 양태에 따르면, 적어도 5개의 CCG를 포함하는 패널의 상태가 측정된다. 일부 양태에서, 패널은 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 CCG를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 적어도 10, 15, 20개 또는 그 이상의 CCG를 포함한다.

일부 양태에서, CCG는 적어도 유전자 패널의 특정 비율을 구성한다. 따라서, 일부 양태에서, 이 패널은 적어도 25%, 30%, 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 가장 바람직하게는 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% CCG를 포함한다.

일부 양태에서, CCG는 표 1 및 패널 A 내지 G의 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 양태에서, 패널은 표 1에 열거된 또는 패널 A 내지 G 중 어느 하나에 열거된 유전자를 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120개 또는 그 이상 포함한다.

CCG는 특히 특정 암에서 예측성인 것으로 발견되었다. 예컨대, CCG 패널은 전립선암의 재발을 예측하는데 있어서 정확한 것으로 측정되었다. 또한, CCG는 방광, 뇌, 유방 및 폐암의 예후를 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 적어도 2개의 CCG를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 것을 포함하고, 비정상적 상태가 불량한 예후를 시사하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 패널은 패널 A 내지 G 중 적어도 하나에 속하는 유전자 그룹 중에서 선택되는 적어도 2개의 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 패널 A 내지 G 중 적어도 하나에 속하는 유전자 그룹 중에서 선택되는 적어도 10개의 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 패널 A 내지 G 중 적어도 하나에 속하는 유전자 그룹 중에서 선택되는 적어도 15개의 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 패널 A 내지 G 중 적어도 하나에 속하는 유전자 전부를 포함한다. 또한, 본 발명은 적어도 2개의 CCG(예컨대, 패널 B, C 및 F 중 임의의 패널에 속하는 적어도 2개의 유전자)를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 비정상적 상태가 불량한 예후를 시사하는, 방광암의 예후를 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 2개의 CCG(예컨대, 패널 B, C 및 F 중 임의의 패널에 속하는 적어도 2개의 유전자)를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 비정상적 상태가 불량한 예후를 시사하는, 뇌암의 예후를 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 2개의 CCG(예컨대, 패널 B, C 및 F 중 임의의 패널에 속하는 적어도 2개의 유전자)를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 비정상적 상태가 불량한 예후를 시사하는, 유방암의 예후를 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 2개의 CCG(예컨대, 패널 B, C 및 F 중 임의의 패널에 속하는 적어도 2개의 유전자)를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 비정상적 상태가 불량한 예후를 시사하는, 폐암의 예후를 측정하는 방법을 제공한다.

또한, CCG 상태가 암의 예후를 측정하는데 있어서 임상 파라미터(예: 임상 노모그램)에 상승적으로 추가 작용을 한다는 것을 발견했다. 전립선암의 경우에, 패널 A 내지 F 중 어느 하나에 속하는 유전자 중 어느 한 유전자의 다량의 발현은, 재발 또는 진행의 비교적 저위험을 시사하는 임상 노모그램 점수를 가진 환자에서 암 재발 또는 진행의 위험률 증가와 관련이 있는 것으로 발견되었다. 예를 들어, 실시예 3 및 5를 참조한다. 뇌암의 경우에는 패널 B, C 또는 F 중 어느 하나에 속하는 유전자 중 어느 한 유전자의 다량의 발현이 종양 등급에 상관없이 암 재발 또는 진행의 위험률 증가와 관련이 있는 것으로 발견되었다. 폐암의 경우에는, 패널 B, C 또는 F 중 어느 하나에 속하는 유전자 중 어느 한 유전자의 다량의 발현이 종양 병기에 상관없이 암 재발 또는 진행의 위험률 증가와 관련이 있는 것으로 발견되었다. 유방암의 경우에는 패널 B, C 또는 F 중 어느 하나에 속하는 유전자 중 어느 한 유전자의 다량의 발현이 노팅엄 예후 지수(Nottingham Prognostic Index: NPI) 노모그램 점수에 상관없이 암 재발 또는 진행의 위험률 증가와 관련이 있는 것으로 발견되었다. 따라서, CCG 발현 수준의 평가는 임상 파라미터만으로 검출되지 않는 위험률 증가를 검출할 수 있기 때문에, 본 발명은 일반적으로 적어도 하나의 임상 파라미터의 평가와 적어도 하나의 CCG 상태의 평가를 조합한 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 한 관점은 암 환자의 적어도 하나의 임상 파라미터를 측정하는 단계 및 암 환자로부터 수득한 샘플에서 적어도 하나의 CCG의 상태를 측정하는 단계를 포함하는 시험관내 진단 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 다수의 CCG(예: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50개 또는 그 이상)의 상태가 측정된다. 일부 양태에서, 비정상적 상태는 재발 또는 진행의 가능성 증가를 시사한다. 일부 양태에서, 환자는 전립선암 환자이다. 일부 양태에서, 환자는 폐암 환자이다. 종종 임상 파라미터는 적어도 다소 독립적인 재발 또는 진행 예측성이고, CCG 상태의 추가가 예측력을 향상시킨다. CCG의 예로는 패널 A 내지 G에 제시된 것을 포함한다. 일부 양태에서는 적어도 하나의 CCG의 발현 수준과 함께 하나보다 많은 임상 파라미터가 평가된다. 일부 양태에서는 하나보다 많은 임상 파라미터가 평가되고, 적어도 하나의 CCG의 발현 수준과 함께 파라미터의 조합이 암 재발 또는 진행의 가능성을 예측한다.

임상 파라미터는 종종 조합되고 암 재발 또는 진행의 위험률을 예측하는 노모그램에 포함된다. 따라서, 본 발명의 다른 관점은 암 환자의 임상 노모그램 점수를 측정하는 단계 및 환자로부터 수득한 샘플에서 적어도 하나의 CCG의 상태를 측정하는 단계를 포함하는, 시험관내 진단 방법을 제공한다. 종종 임상 노모그램은 높은 점수가 재발 위험률 증가와 상관성이 있도록 설계된다. 이와 마찬가지로, 상승된 CCG 상태(예컨대, 발현 또는 활성의 증가)는 위험률 증가와 상관성이 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명은 환자의 임상 노모그램 점수를 측정하는 단계 및 환자로부터 수득한 샘플에서 적어도 하나의 CCG의 상태를 측정하는 단계를 포함하여 암 환자가 재발 또는 진행의 가능성이 증가된 환자인지를 측정하는 방법으로서, 높은 노모그램 점수 및/또는 상승된 CCG 상태가 환자의 재발 또는 진행의 가능성 증가를 시사하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 암은 전립선암이다. 일부 양태에서, 암은 유방암이다.

한 관점으로서, 본 발명은 환자의 적어도 하나의 임상 파라미터(또는 노모그램 점수)를 측정하는 단계 및 CCG 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하는, 시험관내 진단 방법을 제공한다. 분석되는 CCG의 수는, 예컨대 기술적 제약, 비용 문제, 이루어지는 분류, 검사되는 암, 원하는 예측력 수준 등에 따라 달라질 수 있다. 한 예로서, 본 발명은 환자의 노모그램 점수를 측정하는 단계 및 표 1에 열거된 또는 패널 A 내지 G에 열거된 2종 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 시험관내 진단 방법을 제공한다. CCG의 임의의 조합(예컨대, 표 1에 열거된 또는 패널 A 내지 G에 열거된 임의의 CCG)이 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. 한 양태에서는 표 1에 열거된 또는 패널 A 내지 G에 열거된 모든 CCG가 분석된다.

또한, PTEN 상태가 공격적인 전립선암을 예측하는 것으로 발견되었다. PTEN 상태는 임상 파라미터와 CCG 모두에 추가된다. CCG 상태와 조합된 PTEN 상태는 임상 전립선 노모그램보다 양호한 예측인자이다. PTEN 상태의 평가는 임상 파라미터(예컨대, 임상 노모그램) 또는 CCG 발현 수준만을 사용하여 또는 이의 조합에 의해 검출되지 않은 위험률의 증가를 검출할 수 있기 때문에, 본 발명의 일부 관점은 임상 파라미터 또는 CCG 발현 수준을 PTEN 상태의 평가와 조합하는 방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 한 관점은 PTEN 상태를 측정하는 단계 및 환자로부터 수득한 샘플에 존재하는 CCG 패널의 상태를 측정하는 단계(및 경우에 따라 환자에 대한 하나 이상의 임상 파라미터, 예컨대 임상 노모그램을 측정하는 단계)를 포함하는 시험관내 진단 방법을 제공한다. 여러 기술의 조합은 다양한 마커의 상태를 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에 따르면, PTEN 상태는 면역조직화학(IHC)에 의해 측정되는 반면, 다수의 CCG 상태는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR™), 예컨대 TaqMan™에 의해 측정된다.

PTEN 및 CCG 상태는 전립선암 재발 또는 진행의 위험률과 독럽적으로 상관성이 있는 것으로 밝혀져 있기 때문에, 일부 양태는 환자로부터 수득한 샘플에서 PTEN 상태를 측정하는 단계를 포함하되, 낮거나 음성의 PTEN 상태가 환자의 증가된 재발 가능성을 나타내는, 전립선암 환자의 재발 가능성을 측정하는 방법을 제공한다. PTEN 및 CCG 상태는 또한 전립선암 재발 또는 진행의 위험률을 예측하는데 부가적인 것이기 때문에, 일부 양태는 환자로부터 수득한 샘플에서 PTEN 상태를 측정하는 단계 및 환자로부터 수득한 샘플에서 다수의 CCG의 상태를 측정하는 단계를 포함하되, 낮거나 음성인 PTEN 상태 및/또는 상승된 CCG 상태가 환자의 증가된 재발 가능성을 시사하는, 전립선암 환자의 재발 가능성을 측정하는 방법을 제공한다.

PTEN 상태는 전립선암 재발을 예측하는데 있어서 임상 파라미터에 예측값을 추가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 관점은 PTEN 상태를 측정하는 단계 및 전립선암 환자의 적어도 하나의 임상 파라미터를 측정하는 단계를 포함하는 시험관내 진단 방법을 제공한다. 종종 임상 파라미터는 적어도 다소 독립적으로 재발 예측성이고, PTEN 상태의 추가는 예측력을 향상시킨다. 일부 양태에서, 본 발명은 암 환자로부터 수득한 샘플에서 PTEN 상태를 측정하는 단계 및 환자의 임상 노모그램 점수를 측정하는 단계를 포함하되, 낮거나 음성인 PTEN 상태 및 높은 노모그램 점수가 증가된 재발 가능성을 나타내어, 암 환자의 재발 가능성 증가 여부를 측정하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 발명은 환자로부터 수득한 샘플에서 PTEN 상태를 측정하는 단계, 환자의 임상 노모그램 점수를 측정하는 단계 및 환자로부터 수득한 샘플에서 적어도 하나의 CCG의 상태를 측정하는 단계를 포함하되, 낮거나 음성인 PTEN 상태, 높은 노모그램 점수 및 상승된 CCG 상태가 환자의 재발 가능성 증가를 시사하는, 암 환자의 재발 가능성 증가 여부를 측정하는 방법을 제공한다.

이하 실시예에서는 3가지 마커가 모두 조합되어 더욱더 큰 예측력을 제공할 수 있다는 것을 예시하고 있다. 따라서, 일부 양태는 PTEN 상태를 측정하는 단계, 적어도 하나의 CCG 상태를 측정하는 단계 및 적어도 하나의 임상 파라미터를 측정하는 단계를 포함하는 시험관내 방법을 제공한다.

유전자 상태는 이 유전자의 임의의 물리적, 화학적 또는 유전적 특징을 포함한다. 예컨대, 발현 수준, 활성 수준, 돌연변이, 카피수 등을 포함한다. 재발 또는 진행의 위험률을 예측하는 CCG의 상황에서, 발현 수준 및 활성 수준은 종종 CCG 상태를 측정하는데 있어서 평가하는데 가장 도움이 되는 특징이다. 일부 양태에서, 유전자(예: CCG 또는 PTEN)의 발현 수준의 측정은 다음 중 적어도 하나를 포함한다:

(a) 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드 양의 측정;

(b) 유전자에 의해 암호화된 RNA 양의 측정; 또는

(c) 유전자를 조절하는 임의의 miRNA의 발현 및/또는 활성 수준의 측정.

일부 양태에서, 활성 수준의 측정은 예컨대 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 효소 활성의 수준 측정; 폴리펩타이드와 결합 파트너 간에 상호작용 수준의 측정 등을 포함할 수 있다.

한 관점에서, 본 발명은 상기 방법들에 사용되는 조성물, 마이크로어레이 및 키트를 제공한다. 이러한 조성물은 PTEN 또는 CCG에 하이브리드화하는 핵산 프로브(또는 이에 의해 암호화된 임의의 핵산 또는 이에 상보적인 임의의 핵산); PTEN 또는 CCG 전부 또는 일부를 증폭시키는데 적합한 핵산 프라이머 및 프라이머 쌍, 또는 이에 의해 암호화된 CCG 또는 임의의 핵산; PTEN 또는 CCG에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 면역학적으로 결합하는 항체; 상기 핵산 프로브, 핵산 프라이머, 항체 및/또는 폴리펩타이드를 다수 포함하는 프로브 세트; 이들 중 임의의 것을 포함하는 마이크로어레이; 이들 중 임의의 것을 포함하는 키트 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 일부 관점에서, 본 발명은 상기 방법들에 사용되는 컴퓨터 방법, 시스템, 소프트웨어 및/또는 모듈을 제공한다.

다른 정의가 없는 한, 본원에 사용된 모든 기술적, 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 같은 의미를 나타낸다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료는 본 발명의 수행 또는 검사에 사용될 수 있지만, 적합한 방법과 재료는 이하에 기술한다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 조정할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시적일 뿐인 것으로, 제한하려는 것이 아니다.

본 발명의 다른 특징과 장점은 이하 상세한 설명과 특허청구범위로부터 분명해질 것이다.

도 1은 여러 크기의 CCG 패널에 대한 노모그램 대비 예측력을 예시한 것이다.
도 2는 재발에 걸리는 시간을 예측하는 CCG를 예시한 것이다.
도 3은 재발에 걸리는 시간을 예측하는 노모그램을 예시한 것이다.
도 4는 노모그램과 CCG 시그니처(signature)에 의해 예측된, 중복되지 않는 재발을 예시한 것이다.
도 5는 노모그램 및/또는 CCG 상태에 의해 정의된 여러 환자 집단의 재발에 걸리는 시간을 예시한 것이다.
도 6은 본 발명의 특정 관점 및 양태들에 유용한 시스템의 한 예를 예시한 것이다.
도 7은 본 발명의 컴퓨터 기반 방법의 한 예를 예시한 순서도이다.
도 8은 실시예 5에서 재발의 예측인자로서 임상 파라미터와 CCG 점수를 비교한 산포도이다.
도 9는 실시예 5로부터 훈련 코호트의 분석으로부터 유래된 CCG 역치 대 확인 데이터 세트를 예시한 것으로, 여기서 CCG 시그니처 점수는 임상 파라미터를 사용해 위험률이 낮은 것으로 확인된 환자를 재발률이 매우 낮은 환자와 재발률이 높은 환자로 효과적으로 나눈 것이다.
도 10은 실시예 5의 확인 코호트에서 측정된 환자의 CCG 점수 대비 재발 예측률을 도시한 것이다.
도 11은 실시예 5의 확인 코호트에서 측정된 환자의 CCG 점수 대비 재발 예측률을 도시한 것이다.
도 12는 실시예 5에서 연구된 443명 환자들의 임상 위험률 점수의 분포를 도시한 것이다. 진한 수직선은 위험률이 낮은 환자와 높은 환자를 나누기 위해 KM 평균에 의해 선택되고 본 연구 전반에 사용된 역치를 나타낸다.

본 발명은 세포 주기를 근접 추적하는 발현을 가진 유전자("세포 주기 유전자" 또는 "CCG")가 특정 암을 분류하는데 특히 강력한 유전자라는 발견을 부분적인 기반으로 한다.

본원에서, "세포 주기 유전자" 및 "CCG"는 그 발현 수준이 세포 주기를 통한 세포의 진행을 근접 추적하는 유전자를 의미한다[예컨대, Whitfield et al., Mol. Biol. Cell(2002) 13: 1977-2000]. 더 상세하게는, CCG는 세포 주기의 특정 단계와 일치하는 발현의 주기적인 증가 및 감소를 나타낸다. 예컨대 STK15와 PLK는 G2/M에서 피크 발현을 나타낸다(상기 동일 문헌 참고). 종종, CCG는 예컨대 DNA 합성 또는 수복, 염색체 응축, 세포 분열 등에서, 분명하게 인지된 세포 주기 관련 기능을 한다. 하지만, 일부 CCG는 세포 주기에서 분명한 직접적인 역할 없이, 세포 주기를 추적하는 발현 수준을 나타낸다. 예컨대 UBE2S는 유비퀴틴-접합 효소를 암호화하지만, 그 발현은 세포 주기를 근접 추적한다. 따라서, 본 발명에 따른 CCG는 세포 주기에서 인지된 역할을 하지 않아도 된다. CCG의 예는 표 1, 2, 3 및 4에 열거된 것이다.

특정 유전자가 CCG인지는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 문헌[Whitfield et al., Mol. Biol. Cell(2002) 13: 1977-2000]에 교시된 방법 등으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 세포 샘플, 예컨대 HeLa 세포는 여러 세포 주기 단계를 통해 모두 동시에 진행하도록 동조화될 수 있다. 일반적으로, 이것은 세포를 각 단계에서 정지시켜 수행하며, 예컨대 세포는 이중 티미딘 블록을 사용하여 S기에서 정지시키거나, 또는 티미딘-노코다졸 블록을 사용하여 유사분열 단계에서 정지시킬 수 있다[참조: Whitfield et al., Mol. Cell. Biol.(2000) 20: 4188-4198]. RNA는 각 단계에서 정지 후 세포로부터 추출하고, 유전자 발현은 임의의 적당한 기술, 예컨대 발현 마이크로어레이(게놈-전반(genome-wide) 또는 당해의 특정 유전자), 실시간 정량적 PCR™(RTQ-PCR)을 이용하여 정량분석한다. 마지막으로, 통계 분석(예: 푸리에 변환)은 특정 세포 주기 단계 동안 피크 발현을 나타내는 유전자를 측정하는데 사용한다. 유전자는 유전자 발현이 얼마나 근접하게 세포 주기를 추적하는지를 나타내는 주기성 점수에 따라 등급을 매길 수 있고, 예컨대 높은 점수는 세포 주기를 매우 근접하게 추적하는 유전자라는 것을 나타낸다. 마지막으로, 주기성 점수가 일정한 역치 수준을 초과하는 유전자(참조: Whitfield et al., Mol.Biol.Cell(2002) 13: 1977-2000)는 CCG라고 지칭할 수 있다. CCG와 관련된 다수의 핵산 목록(예컨대, 유전자, EST, cDNA 클론 등)은 표 1에 제시했지만, 이에 국한되는 것은 아니다(Whitfield et al., Mol. Biol. Cell(2002) 13: 1977-2000 참고). 이하 표 2에 제시된 모든 CCG는 본 발명의 방법에 유용한 CCG 패널("패널 A")을 구성한다.

^* 본 발명에 유용한 CCG의 124개 유전자 서브세트 ("패널 B"). ABI 분석 ID는 특정 유전자에 대한 Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA)로부터 시판되는 유전자 발현 분석을 위한 카탈로그 ID 번호를 의미한다.

어떤 이론으로 한정하려는 것은 아니지만, 급속 증식 세포를 비교적 고농도로 함유하는 조직 샘플이 응집체에서 비교적 높은 CCG 발현을 나타내는 것으로 생각된다. 이것은 세포 증식 동안(즉, 세포 주기의 특정 단계 동안) 상향조절되는 일부 CCG 때문인 것으로 생각된다. 결국, 급속 증식 세포를 고농도로 함유하는 종양은 더욱 공격성인 경향이 있고, 이러한 종양이 있는 환자는 더욱 불량한 예후를 나타내는 경향이 있다. 실제, 본 발명자들은 CCG가 대부분의 예후적 암 징후들에서 전부는 아니지만 대부분의 예측력을 제공한다는 것을 측정했다. 예를 들어, CCG를 보유한 패널은 전립선암, 뇌암, 유방암 및 폐암의 공격성을 예측할 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 관점은 환자의 조직 또는 세포 샘플, 특히 종양 샘플에서 적어도 2개의 CCG를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 비정상적 상태가 음성 암 분류를 시사하는, 암 분류 방법을 제공한다. 본원에 사용되는, 유전자의 "상태를 측정하는"이란 그 유전자의 존재, 부재 또는 일부 물리적, 화학적 또는 유전적 특징의 정도/수준, 또는 이의 발현 산물(들)을 측정하는 것을 의미한다. 이러한 특징으로는, 발현 수준, 활성 수준, 돌연변이, 카피수, 메틸화 상태 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

암 재발 또는 진행의 위험률 또는 공격적 치료의 필요성을 측정하는데 사용되는 CCG의 상황에서, 특히 유용한 특징으로는 발현 수준(예컨대, mRNA 또는 단백질 수준) 및 활성 수준을 포함한다. 특징들은 직접 분석하거나(예컨대, CCG 발현 수준을 분석하여) 또는 간접 측정할 수 있다(예컨대, 발현 수준이 CCG의 발현 수준과 상관성이 있는 유전자 또는 유전자들의 수준을 분석하여). 따라서, 본 발명의 일부 양태는 종양 샘플에서 적어도 2개의 CCG를 포함하는 유전자 패널의 발현 수준, 특히 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 상승된 발현이 음성 암 분류, 또는 암 재발 또는 진행의 위험률 증가, 또는 공격적 치료의 필요성을 시사하는, 암 분류 방법을 제공한다.

당업자는 조직 또는 세포 샘플에서 유전자 또는 단백질의 상태를 측정하는 다양한 기술, 예컨대 비제한적으로 마이크로어레이 분석(예컨대, mRNA 또는 마이크로RNA 발현, 카피수 등의 분석), 정량적 실시간 PCR™("qRT-PCR™", 예컨대 TaqMan™), 면역분석(예: ELISA, 면역조직화학) 등을 잘 알고 있다. 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 활성 수준은 유전자 또는 폴리펩타이드의 발현 수준과 매우 같은 방식으로 사용될 수 있다. 종종 높은 활성 수준은 높은 발현 수준을 나타내고, 반면 낮은 활성 수준은 낮은 발현 수준을 나타낸다. 따라서, 일부 양태에 따르면, 본 발명은 CCG에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 활성 수준이 CCG의 발현 수준에 부가적으로 측정되거나 또는 대신 측정되는, 전술한 임의의 방법을 제공한다. 당업자는 표 1, 2, 3 및 4에 열거한 유전자들에 의해 암호화된 단백질을 비롯하여 이러한 다양한 단백질의 활성을 측정하는 기술을 잘 알고 있다. 본 발명의 방법은 사용된 특정 기술에 상관없이 수행될 수 있다.

"비정상적 상태"는 특정 샘플의 마커 상태가 평균 샘플(예컨대, 건강한 샘플 또는 평균 질병 샘플)에서 일반적으로 발견되는 상태와 다른 것을 의미한다. 그 예로는 돌연변이된, 상승된, 감소된, 존재, 부재 등의 상태를 포함한다. "상승된 상태"는 상기 특징들 중 하나 이상(예: 발현 또는 mRNA 수준)이 정상 수준보다 높은 것을 의미한다. 일반적으로, 이것은 특징(예컨대, 발현 또는 mRNA 수준)이 지표 값에 비해 증가한 것을 의미한다. 이와 반대로, "낮은 상태"는 상기 특징들 중 하나 이상(예: 유전자 발현 또는 mRNA 수준)이 정상 수준보다 낮은 것을 의미한다. 일반적으로, 이것은 지표 값에 비해 특징(예: 발현)의 감소를 의미한다. 이러한 상황에서, "음성 상태"는 일반적으로 특징이 존재하지 않는 것 또는 검출할 수 없는 것을 의미한다. 예를 들어, PTEN 상태는 PTEN 핵산 및/또는 단백질이 샘플에 존재하지 않거나 검출할 수 없다면 음성이다. 하지만, 음성 PTEN 상태는 PTEN의 돌연변이 또는 카피수 감소를 포함하기도 한다.

당업자는 본 발명의 방법에서 지표 값을 수득하고 사용하는 방식을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 지표 값은 당해의 환자로부터 수득한 정상 샘플에서 발견되는 유전자 발현 수준을 나타낼 수도 있고, 이 경우에 이 지표값보다 훨씬 높은 종양 샘플에서의 발현 수준은, 예컨대 불량한 예후 또는 암 재발 가능성의 증가 또는 공격적 치료의 필요성을 시사할 것이다.

대안적으로, 지표 값은 다양한 암 집단 또는 이 집단의 서브세트 유래의 개체 세트의 평균 발현 수준을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 암 환자(예컨대, 전립선암, 방광암, 뇌암, 유방암 또는 폐암)의 무작위 샘플링에서 유전자 또는 유전자 패널의 평균 발현 수준을 측정할 수 있다. 이러한 평균 발현 수준은 "역치 지표 값"이라 부를 수도 있고, 이 값보다 높은 CCG 발현을 나타내는 환자는 이 값보다 낮은 발현을 나타내는 환자보다 더 불량한 예후를 보유하는 것으로 예측된다.

대안적으로, 지표 값은, 임상 데이터와 후속 데이터가 이용가능하고 환자를 질병 결과, 예컨대 재발 또는 예후로 정의하고 분류하기에 충분한 유사 결과를 가진, 다수의 훈련받은 환자(예: 전립선암 환자)에서 특정 유전자 마커의 평균 발현 수준을 나타낼 수 있다(예컨대, 이하 실시예 참고). 예를 들어, "양호한 예후 지수 값"은 "양호한 결과"를 가진 것으로 특징지어진 다수의 훈련받은 암 환자, 예컨대 초기 치료 후 5년(또는 10년 이상) 동안 암이 재발하지 않은 환자, 또는 초기 진단 후 5년(또는 10년 이상) 동안 암이 진행되지 않은 환자로부터 수득할 수 있다. "불량한 예후 지표 값"은 "불량한 결과"를 가진 것으로 정의된 다수의 훈련받은 암환자, 예컨대 초기 치료 후 5년(또는 10년 등)내에 암이 재발한 환자, 또는 초기 진단 후 5년(또는 10년 등) 내에 암이 진행한 환자로부터 수득할 수 있다. 따라서, 특정 유전자의 양호한 예후 지표 값은 "양호한 결과"를 보유한 환자가 나타내는 특정 유전자의 평균 발현 수준을 나타낼 수 있는 반면, 특정 유전자의 불량한 예후 지표 값은 "불량한 결과"를 보유한 환자가 나타내는 특정 유전자의 평균 발현 수준을 나타낸다.

일부 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 CCG의 발현을 측정하는 단계를 포함하고, 이 발현이 "증가되면" 환자는 불량한 예후를 보유한다. 본 발명의 상황에서, CCG의 "증가된" 발현은 환자의 발현 수준이 정상 지표 값 또는 역치 값(예컨대, 적어도 약간의 역치 양)보다 상승하거나, 또는 "양호한 예후 지표 값"에 비해 "불량한 예후 지표 값"에 더 가까운 것을 의미한다.

따라서, 관련 유전자 마커의 측정된 발현 수준이 그 유전자의 불량한 예후 지표 값보다 양호한 예후 지표 값에 더 가깝다면, 환자는 양호한 예후를 보유할 가능성이 크다(즉, 암 재발의 가능성이 낮다(또는 증가되지 않는다))고 결론지을 수 있다. 다른 한편, 관련 유전자 마커의 측정된 발현 수준이 그 유전자의 양호한 예후 지표 값보다 불량한 예후 지표 값에 더 가깝다면, 환자는 불량한 예후를 보유할 가능성이 크다(즉, 암 재발 가능성의 증가)고 결론지을 수 있다.

대안적으로, 지표 값은 다음과 같이 측정될 수 있다: 환자를 위험군으로 지정하기 위해 역치 값이 세포 주기 평균으로 정해질 것이다. 최적의 역치 값은 감도 대 (1-특이성)을 플로팅한 수신기 작동 특성(ROC) 곡선을 기반으로 하여 선택한다. 세포 주기 평균의 각 증분에 대해, 이 값을 역치로 사용하여 검사의 감도와 특이성을 계산한다. 실제 역치는 당업자의 필요(예컨대, 원하는 감도 또는 특이성의 정도 등)에 따라 상기 성과지표(metrics)를 최적화하는 값일 것이다. 실시예 5는 측정되고 실험적으로 확인된 역치 값의 측정을 증명해보인다.

일부 양태에서, 특정 유전자(특히, CCG)의 발현 수준은 특정 종양 조직 샘플 또는 세포에서 mRNA의 절대 카피수로서 수득한다. 다른 양태에서, 특정 유전자(특히 CCG)의 발현 수준은 당해의 특정 유전자의 발현 산물의 양을 표준화 유전자(예: 하나 이상의 하우스키핑 유전자)의 발현 양에 대하여 표준화하여 수득한다. 표준화는 지표 값을 수득하기 위해 수행하거나, 또는 단순히 당해 유전자의 발현 수준을 측정할 때 배경 노이즈의 감소를 돕기 위해 수행할 수 있다. 한 양태에서, 예컨대 본 발명에 따라 관련 유전자의 발현 수준을 측정하는데 있어서, 유전자의 발현 산물(예: mRNA, cDNA, 단백질)의 양은 하나 이상의 세포, 특히 종양 세포 내에서 측정하고, 동일한 하나 이상의 세포 내에서 표준화 유전자, 또는 표준화 유전자 세트의 발현 산물(들)의 양에 대하여 표준화하여 관련 마커 유전자의 발현 수준을 수득한다. 예를 들어, 단일 유전자가 표준화 유전자로서 사용될 때, 하우스키핑 유전자는 전립선암 결과/예후에 상관없이 발현이 측정되거나 또는 정상 전립선세포 또는 암성 전립선 세포 간에 발현이 달라지지 않는 하우스키핑 유전자를 사용할 수 있다. 이러한 하우스키핑 유전자는 세트로서 유전자 발현 분석에 사용되어 복합 표준화 유전자 세트를 제공할 수도 있다. 하우스키핑 유전자는 당업계에 공지되어 있고, 그 예는 GUSB(글루쿠로니다제 베타), HMBS(하이드록시메틸빌란 신타제), SDHA(석시네이트 데하이드로게나제 복합체, 서브유닛 A, 플라보단백질), UBC(유비퀴틴 C) 및 YWHAZ(티로신 3-모노옥시게나제/트립토판 5-모노옥시게나제 활성화 단백질, 제타 폴리펩타이드)를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 복합 표준화 유전자 세트가 표준화에 사용될 때, 이러한 표준화 유전자의 유전자 발현 양은 직접 가산하거나 또는 일정한 알고리듬에 의해 평균을 내고 함께 조합할 수 있다. 또한, 하우스키핑 유전자 외에 다른 유전자도 표준화 유전자로서 사용할 수 있다. 본 발명의 방법과 조성물에 사용하기에 특히 유용한 하우스키퍼 유전자의 다른 예로는 이하 표 A에 열거된 것을 포함한다.

[표 A]

^* 예컨대, 실시예 5에 사용된 하우스키핑 유전자의 서브세트

CCG의 패널(예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 CCG)은 실시예 3에 제시된 바와 같이 예후를 정확하게 예측할 수 있다. 당업자는 유전자 패널(즉, 다수의 유전자)의 발현을 측정하는 다양한 방법을 잘 알고 있다. 1가지 방법으로, 특정 환자로부터 수득한 샘플(샘플 전체 또는 샘플 유래의 세포 서브세트 또는 단세포)에서 모든 패널 유전자의 평균 발현 수준(표준화된 수준 또는 절대 수준)을 측정하여 유전자 패널의 발현을 측정할 수 있다. 이러한 상황에서 증가된 발현은 평균 발현이, 정상 환자에서 이들 유전자의 평균 발현 수준보다 높다(또는 동일한 암환자와 같은 참고 집단에서 평균 발현 수준을 나타내기 위해 측정한 일부 지표 값보다 높다)는 것을 의미한다. 대안적으로, 패널 중의 적어도 특정 수(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30개 또는 그 이상) 또는 적어도 특정 비율(예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%)의 유전자들의 평균 발현 수준을 측정하여 유전자 패널의 발현을 측정할 수 있다. 대안적으로, 패널 내의 모든 유전자의 mRNA(또는 단백질)의 절대 카피 수를 측정하고, 이 유전자들을 따라 총합을 내거나 평균을 내어 유전자 패널의 발현을 측정할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 "암을 분류하는" 및 "암 분류"는 암의 하나 이상의 임상-관련 특색을 측정하고/하거나 이 암을 보유한 환자의 특정 예후를 측정하는 것을 의미한다. 따라서, "암을 분류하는"은 (i) 전이 잠재능, 특정 기관으로 전이하는 잠재능, 재발 위험 및/또는 종양의 과정을 평가하는 것; (ii) 종양 병기를 평가하는 것; (iii) 암 치료의 부재 하에 환자의 예후를 측정하는 것; (iv) 치료(예: 화학요법, 방사능요법, 종양을 절제하는 수술 등)에 대한 환자 반응(예: 종양 수축 또는 무진행 생존)의 예후를 측정하는 것; (v) 현재 및/또는 과거 치료에 대한 실제 환자 반응을 진단하는 것; (vi) 환자의 바람직한 치료 과정을 측정하는 것; (vii) 치료(일반적인 치료 또는 일부 특별 치료) 후 환자 재발에 대한 예후; (viii) 환자 여명의 예후(예컨대, 총 생존율에 대한 예후) 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

따라서, "음성 분류"는 암의 바람직하지 않은 임상 특색(예: 불량한 예후)을 의미한다. 예컨대, (i) 증가된 전이 잠재능, 특정 기관으로 전이하는 잠재능, 및/또는 재발 위험률; (ii) 진행된 종양 병기; (iii) 암 치료의 부재 하에 불량한 환자의 예후; (iv) 특정 치료(예: 화학요법, 방사능요법, 종양을 절제하는 수술 등)에 대한 환자 반응(예: 종양 수축 또는 무진행 생존)의 불량한 예후; (v) 치료(일반적인 치료 또는 일부 특별 치료) 후 환자 재발에 대한 불량한 예후; (vi) 환자 여명의 불량한 예후(예컨대, 총 생존율에 대한 예후) 등을 포함한다. 일부 양태에서, 재발-관련 임상 파라미터(또는 높은 노모그램 점수) 및 증가된 CCG 발현은 암의 음성 분류(예컨대, 증가된 재발 또는 진행 가능성)를 시사한다.

앞에서 논한 바와 같이, 상승된 CCG 발현은 급속 증식성(이에 따라 더욱 공격성인) 암 세포를 동반하는 것으로 생각된다. 환자의 이러한 암은 종종 환자의 치료 후 재발 가능성이 증가되었음을 의미할 것이다(예컨대, 치료에 의해 사멸 또는 제거되지 않은 암세포가 빠르게 다시 성장할 것이다). 이러한 암은 또한 환자가 암 진행이 더욱 급속 진행으로 될 증가된 가능성이 있는 환자임을 의미할 수 있다(예컨대, 급속 증식성 세포는 임의의 종양이 빠르게 성장하고, 독성을 얻고/얻거나 전이할 수 있게 할 것이다). 이러한 암은 또한 환자가 비교적 더욱 공격적인 치료를 필요로 할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명은 적어도 2개의 CCG를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 비정상적 상태가 재발 또는 진행의 증가된 가능성을 시사하는, 암 분류 방법을 제공한다. 앞에서 논한 바와 같이, 일부 양태에서, 측정되어야 하는 상태는 유전자 발현 수준이다. 이에, 일부 양태에서, 본 발명은 적어도 2개의 CCG를 포함하는 유전자 패널의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 상승된 발현은 암 재발 또는 진행의 증가된 가능성을 시사하는, 환자의 암 예후를 측정하는 방법을 제공한다.

"재발" 및 "진행"은 당업계에 공지된 용어이며, 이의 공지된 의미에 따라서 본 발명에 사용된다. 한 예로서, "진행"의 의미는 암 종류에 의존적일 수 있고, 폐암의 진행은 전립선암의 진행과 약간 다른 것을 의미한다. 하지만, 각 암 종류 및 아형 내에서 "진행"은 당업자라면 분명히 이해하는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 특색 또는 결과를 보유한 환자의 확률이 일부 참고 확률 또는 값을 초과한다면, 환자는 일부 임상 특색 또는 결과(예: 재발 또는 진행)의 "증가된 가능성"을 보유하는 것이다. 참고 확률은 일반적인 관련 환자 집단 전체의 특색 또는 결과의 확률일 수 있다. 예를 들어, 일반적인 전립선암 집단의 재발 확률이 X%이고, 특정 환자가 본 발명의 방법에 따라 측정해서 재발 확률이 Y%여서, Y>X이면, 환자는 재발의 "증가된 가능성"을 보유하고 있다. 대안적으로, 앞에서 논한 바와 같이, 역치 또는 참고 값을 측정할 수 있고, 특정 환자의 재발 확률을 이 역치 또는 참고 값과 비교할 수 있다. 재발 예측 및 진행 예측은 예후적 시도이기 때문에, "예후 예측"은 종종 이 중 어느 하나 또는 둘 모두를 의미하기도 한다. 이러한 경우에, "불량한 예후"는 일반적으로 재발, 진행 또는 이 둘 모두의 증가된 가능성을 의미할 것이다.

실시예 3에 예시된 것처럼, 개개인의 CCG는 매우 잘 예후를 예측할 수 있다. 따라서, 본 발명은 표 1에 열거된 또는 패널 A 내지 G에 열거된 적어도 하나의 CCG의 발현을 측정하는 단계를 포함하여, 예후를 예측하는 방법을 제공한다.

또한, 실시예 3은 CCG의 패널(예컨대, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CCG)이 예후를 정확하게 예측할 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 일부 관점에서, 본 발명은 다수의 CCG를 포함하는 유전자의 패널(즉, 다수)의 상태를 측정하는 단계를 포함하여, 암을 분류하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 유전자 패널의 증가된 발현은 특정 환자의 모든 패널 유전자의 평균 발현 수준이 정상 환자 중의 상기 유전자의 평균 발현 수준보다 높다(또는 정상 평균 발현 수준을 나타내는 것으로 측정된 일부 지표 값보다 높다)는 것을 의미할 수 있다. 대안적으로, 유전자 패널의 증가된 발현은 평균 정상 발현 수준과 비교했을 때 패널 중 유전자들의 적어도 특정 수(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30개 또는 그 이상) 또는 적어도 특정 비율(예컨대, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100%)의 증가된 발현을 의미할 수 있다.

일부 양태에서, 패널은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 70, 80, 90, 100, 200개 또는 그 이상의 CCG를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 적어도 10, 15, 20개 또는 그 이상의 CCG를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 5 내지 100개 사이의 CCG, 7 내지 40개의 CCG, 5 내지 25개의 CCG, 10 내지 20개의 CCG 또는 10 내지 15개의 CCG를 포함한다. 일부 양태에서, CCG는 패널의 적어도 특정 비율을 구성한다. 따라서, 일부 양태에서, 패널은 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% CCG를 포함한다. 일부 바람직한 양태에서, 패널은 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 70, 80, 90, 100, 200개 또는 그 이상의 CCG를 포함하고, 이러한 CCG는 패널 내 총 유전자 수의 적어도 50%, 60%, 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상을 구성한다. 일부 양태에서, CCG는 표 1 및 패널 A 내지 G의 유전자들로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 양태에서, 패널은 임의의 표 1 및 패널 A 내지 G에 열거된 유전자들 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30개 또는 그 이상을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 패널 A 내지 G의 CCG 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 비정상 상태가 불량한 예후를 시사하는, 예후를 예측하는 방법을 제공한다.

이러한 양태들 중 일부에서, 상승된 발현은 재발 또는 진행의 증가된 가능성을 시사한다. 따라서, 바람직한 양태에서 본 발명은 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하여 환자의 암 재발 또는 진행의 위험을 예측하는 방법으로, 약 10 내지 약 15개의 CCG를 포함하고 이 CCG가 패널의 적어도 90%를 구성하고, CCG의 상승된 상태가 재발 또는 진행의 증가된 가능성을 시사하는 방법을 제공한다.

여러 다른 암에서 예후를 예측하는 능력을 평가하기 위해 여러 CCG 패널(상기 표 2 및 이하 표 3과 4 참조)을 조사했다. 이 연구의 결과는 이하 실시예 1 내지 6에 기술된다.

^* 이 유전자들은 실시예 2에 기술된 실험의 확인 부문에서 26-유전자 서브세트 패널("패널 D")로서 사용되었다.

^* 이 유전자들은 실시예 5에 기술된 실험에서 31-유전자 서브세트 패널("패널 F")로서 사용되었다.

패널의 개별 CCG의 선택은 종종 임의적일 수 있는 것으로 측정되었다. 환언하면, 대부분의 CCG는 서로 매우 좋은 대리자인 것으로 발견되었다. 특정 CCG가 본 발명의 방법과 조성물에서 잘 작용할 수 있는지를 평가하는 1가지 방법은 CCG의 평균 발현(예컨대, 공지된 모든 CCG, CCG의 특정 세트 등)과의 상관성을 평가하는 것이다. 평균과 특별한 상관성이 있는 CCG는 본 발명의 분석을 잘 수행할 것으로 생각되는데, 그 이유는 예컨대 이러한 CCG가 분석에서 노이즈를 줄일 수 있기 때문이다. 이와 같이 평균 CCG 발현과의 상관성에 따라 선택한 CCG의 순위는 표 23에 제시했다.

CCG 시그니처에서, 분석되는 특정 CCG는 종종 CCG의 전체 개수만큼 중요하지는 않다. 분석되는 CCG의 수는 많은 인자, 예컨대 기술적 제약, 비용 문제, 이루어지는 분류, 검사되는 암, 원하는 예측력 수준 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 패널에서 분석된 CCG 수의 증가는 일반적으로 분석되는 mRNA의 더 큰 풀(pool)은 분리물에 의해 유발되는 더 적은 "노이즈" 및 검사의 전반적인 예측력을 벗어난 분석 오류의 더 적은 기회를 의미하기 때문에 유익하다. 하지만, 비용과 다른 문제들은 일반적으로 CCG 수를 제한할 것이므로, 시그니처를 위한 최적의 CCG 수에 대한 조사결과가 필요하다.

CCG 시그니처의 예측력은 종종 CCG의 특정 수를 넘으면 크게 증가하지 않는 것으로 발견되었다(도 1; 실시예 1 참조). 더 구체적으로, 시그니처에서 CCG의 최적 수(n₀)는 다음이 참인 경우 발견될 수 있다:

(P_n ₊₁ - P_n) < C₀

여기서, P는 예측력이고(즉, P_n은 n개의 유전자를 가진 시그니처의 예측력이고 P_n ₊₁은 n+1개의 유전자를 가진 시그니처의 예측력이다), C₀은 약간의 최적화 상수이다. 예측력은 당업자에게 공지된 많은 방식으로 정의될 수 있으며, 그 예로는 시그니처의 p값이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. C₀은 숙련자의 제약에 기초하여 숙련자가 선택할 수 있다. 예를 들어, 비용이 중요한 문제가 아니고 매우 높은 감소와 특이성 수준이 필요하다면, C₀은 예측력의 미미한 증가는 무시하도록 매우 낮게 정할 수 있다. 반면에, 비용이 중요하고 감도와 특이성의 적당한 수준이 허용된다면, C₀은 예측력의 유의적인 증가만이 시그니처의 유전자 수 증가를 보증하도록 높게 정할 수 있다.

대안적으로, 유전자 수의 함수로서 예측력의 그래프는 플로팅할 수 있고(도 1), 이 플롯의 2차 도함수를 구한다. 2차 도함수가 약간의 소정 값(C₀')으로 감소하는 지점이 이 시그니처의 유전자의 최적 수일 수 있다.

실시예 1 및 3과 도 1은 본 발명의 CCG 패널에서 실험적으로 측정된 CCG의 최적 수를 예시한 것이다. 표 3에 열거된 31개 CCG의 무작위 선택된 서브세트를 상이한 CCG 시그니처로서 검사하고 각각 예측력(즉, p값)을 측정했다. 도 1이 보여주는 바와 같이, p값은 약 10 내지 약 15개의 CCG 사이에서 유의적으로 향상되지 않았고, 이로써 예후 패널에서 CCG의 최적 수는 약 10 내지 약 15개임을 시사한다. 따라서, 본 발명의 일부 양태는 약 10 내지 약 15개의 CCG를 포함하고 CCG의 상승된 상태가 불량한 예후를 시사하는, 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하는 전립선암이 있는 환자의 예후를 예측하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 패널은 약 10 내지 약 15개의 CCG를 포함하고, CCG는 패널의 적어도 90%를 구성한다. 다른 양태에서, 패널은 CCG 및 패널의 예측력을 유의적으로 증가시키는(즉, 패널이 CCG만으로 구성된 것보다 예측력을 유의적으로 더 좋게 만드는) 하나 이상의 부가 마커를 포함한다. CCG의 임의의 다른 조합(표 1에 열거된 또는 패널 A 내지 G에 열거된 임의의 CCG를 포함해서)도 본 발명을 수행하는데 사용할 수 있다.

CCG는 특정 암에서 특히 예측성인 것으로 발견되었다. 예를 들어, CCG 패널은 전립선암의 재발을 예측하는데 있어서 정확한 것으로 측정되었다(실시예 1 내지 5). 또한, CCG는 실시예 6과 이하 표 21 및 22에 정리된 바와 같이 방광, 뇌, 유방 및 폐암의 예후를 측정할 수 있다.

따라서, 본 발명은 적어도 2개의 CCG를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 비정상적 상태가 불량한 예후를 나타내는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 패널은 패널 A 내지 G 중 적어도 하나에 속하는 유전자 그룹 중에서 선택되는 적어도 2개의 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 패널 A 내지 G 중 적어도 하나에 속하는 유전자 그룹 중에서 선택되는 적어도 10개의 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 패널 A 내지 G 중 적어도 하나에 속하는 유전자 그룹 중에서 선택되는 적어도 15개의 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 패널 A 내지 G 중 적어도 하나에 속하는 모든 유전자를 포함한다. 또한, 본 발명은 적어도 2개의 CCG(예컨대, 패널 B, C 및 F 중 임의의 패널에 속하는 적어도 2개의 유전자)를 함유하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 비정상적 상태가 불량한 예후를 시사하는, 방광암의 예후를 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 2개의 CCG(예컨대, 패널 B, C 및 F 중 임의의 패널에 속하는 적어도 2개의 유전자)를 함유하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 비정상적 상태가 불량한 예후를 시사하는, 뇌암의 예후를 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 2개의 CCG(예컨대, 패널 B, C 및 F 중 임의의 패널에 속하는 적어도 2개의 유전자)를 함유하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 비정상적 상태가 불량한 예후를 시사하는, 유방암의 예후를 측정하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 2개의 CCG(예컨대, 패널 B, C 및 F 중 임의의 패널에 속하는 적어도 2개의 유전자)를 함유하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 비정상적 상태가 불량한 예후를 시사하는, 폐암의 예후를 측정하는 방법을 제공한다.

일부 양태에서, 패널은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 또는 그 이상의 CCG를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 5 내지 100개 사이의 CCG, 7 내지 40개 사이의 CCG, 5 내지 25개 사이의 CCG, 10 내지 20개 사이의 CCG, 또는 10 내지 15개 사이의 CCG를 포함한다. 일부 양태에서, CCG는 패널의 적어도 특정 비율을 구성한다. 따라서, 일부 양태에서, 패널은 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% CCG를 포함한다. 일부 양태에서, CCG는 표 1과 패널 A 내지 G에 열거된 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 일부 양태에서, 패널은 임의의 패널 A 내지 G에 속하는 유전자 그룹 중에서 선택되는 적어도 2개의 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 패널 A 내지 G 중 임의의 패널에 속하는 유전자 그룹 중에서 선택되는 적어도 10개의 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 패널 A 내지 G 중 임의의 패널에 속하는 유전자 그룹 중에서 선택되는 적어도 15개의 유전자를 포함한다. 일부 양태에서, 패널은 패널 A 내지 G 중 임의의 패널에 속하는 유전자 전부를 포함한다.

또한, CCG 상태는 암을 예측하는데 있어서 임상 파라미터에 부가적인 상승효과를 나타내는 것으로 발견되었다. 전립선암의 경우, 예컨대 패널 C 내지 F에 속하는 유전자 중 어느 하나의 높은 수준의 유전자 발현이, 임상 노모그램 점수가 재발이나 진행의 비교적 저위험률을 나타내는 환자에서 전립선암 재발 또는 진행의 증가된 위험과 관련이 있는 것으로 발견되었다. 이와 같이 CCG 발현 수준의 평가가 임상 파라미터만에 의해 검출되지 않은 증가된 위험을 검출할 수 있기 때문에, 본 발명은 일반적으로 적어도 하나의 CCG 상태의 평가와 함께 적어도 하나의 임상 파라미터의 평가를 조합한 방법을 제공한다.

실시예 3이 보여주는 바와 같이, 개별 CCG도 암 재발을 예측하는데 있어서 임상 파라미터에 부가한다. 따라서, 본 발명의 한 관점은 암 환자에 대한 적어도 하나의 임상 파라미터를 측정하는 단계 및 이 환자로부터 수득한 샘플에서 적어도 하나의 CCG의 상태를 측정하는 단계를 포함하는 시험관내 진단 방법을 제공한다. 하지만, 다수의 CCG 상태의 평가가 예측력을 더욱더 향상시킨다(역시 실시예 1에 제시됨). 따라서, 일부 양태에 따라 다수의 CCG(예: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50개 또는 그 이상)의 상태가 측정된다. 일부 양태에 따르면, 비정상적 상태는 재발 또는 진행의 증가된 가능성을 시사한다. 일부 양태에서, 환자는 전립선암 환자이다. 일부 양태에서, 환자는 폐암 환자이다. 종종 임상 파라미터는 재발 또는 진행의 예측성이 적어도 다소 독립적인 것으로, CCG 상태의 부가는 예측력을 향상시킨다. 본 명세서에 사용되는 "임상 파라미터" 및 "임상 척도"는 질환 과정을 평가하고/하거나 결과를 예측하는데 적용되는 질환 또는 환자의 특징을 의미한다. 예컨대, 암에서는 일반적으로 종양 병기, 종양 등급, 림프절 상태, 조직학, 수행 상태, 수술 종류, 수술 절제면, 치료 종류 및 발병 연령을 포함한다. 전립선암 임상의는 종종 수술전 혈액 PSA 수준, 병기(종양 크기 및 전이 증거에 의해 정해짐) 및 글리슨(Gleason) 점수(등급 개념과 유사)를 사용한다. 수술 중재 후, 전립선암의 중요한 임상 파라미터는 경계와 림프절 상태를 포함한다. 유방암 임상의는 종종 지표 병변 크기(cm), 침습, 관련 결절의 수 및 등급을 이용한다.

종종, 특정 임상 파라미터는 특정 질환 특성과 상관성이 있다. 예를 들어, 일반적으로 암에서 뿐 아니라 특정 암에서, 특정 임상 파라미터는 예컨대 재발 또는 전이 가능성, 특정 시간 동안 생존 예후, 일반적 치료 또는 특정 치료에 대한 반응 가능성 등과 상관성이 있다. 전립선암에서, 일부 임상 파라미터(존재, 부재, 수준 등)는 재발의 증가된 가능성과 관련이 있다. 이러한 재발-관련 파라미터(전부는 아니지만 일부가 전립선암에 특이적이다)의 예로는 높은 PSA 수준(예: 4ng/ml 이상), 높은 글리슨 점수, 큰 종양 크기, 전이 증거, 진행된 종양 병기, 핵 등급, 림프절 연관, 발병 초기 연령을 포함한다. 다른 종류의 암은 재발 또는 진행의 가능성과 상관성이 있는 여러 파라미터를 보유할 수 있고, CCG 상태는 증식 활성의 척도로서, 상기 암들의 예후를 예측하는데 있어서 상기 파라미터에 부가 작용을 한다. 본 명세서에 사용되는 "재발-관련 임상 파라미터"는 각 특정 암에 대한 통상적인 의미를 나타내는 것으로, 당업자라면 잘 알고 있는 것이다. 사실상, 당업자는 본원에 열거된 것 이상으로 다양한 재발-관련 임상 파라미터를 잘 알고 있다.

종종, 의사는 환자의 임상 파라미터를 1가지보다 많이 평가할 것이고, 당해 질병 특징에 대한 더욱 포괄적인 평가를 수행한다. 실시예 5는 전립선암의 재발 위험률을 측정하는데 사용된 임상 파라미터들의 1가지 특정 그룹화에 CCG 상태를 부가할 수 있는 방식을 보여준다. 실시예 5의 임상 파라미터는 기관-국한된 질환에 대한 2중 변수 및 6 이하의 글리슨 점수, 및 대수적 PSA의 연속 변수를 포함한다(표 14). 이 모델은 RP후 노모그램(즉, 카탄-스티븐슨 노모그램)에 포함된 모든 임상 파라미터를 포함하되, RP 년수 및 글리슨 점수의 2 성분은 제외된다. 따라서, 일부 양태에 따르면, 적어도 2가지 임상 파라미터(예컨대, 앞에 열거한 파라미터 중 2개)가 적어도 하나의 CCG의 발현 수준과 함께 평가된다.

단일, 하지만 더욱 종종 다수의 임상 파라미터를 의사가 이용하는 1가지 방식은 노모그램의 도움을 받아 이루어진다. 임상 환경에서, 노모그램은 하나 이상의 파라미터와 하나 이상의 환자 또는 질환 특성 간에 상관성을 나타내는 표상(종종 가시적)이다. 전립선암 환자의 재발 가능성을 측정하는데 사용되는 효과적인 임상 노모그램의 한 예는 문헌[Kattan et al., J. Clin. Oncol.(1999) 17: 1499-1507]에 기술되어 있고, 최신의 것은 문헌[Stephenson et al., J.Clin. Oncol.(2005) 23: 7005-7012("Kattan-Stephenson 노모그램")]에 기술되어 있다. 이 노모그램은 여러 임상 파라미터들(RP 년수, 수술 절제면, 관절낭외 연장, 정낭 침습, 림프절 연관, 1차 글리슨 점수, 2차 글리슨 점수 및 수술전 PSA 수준) 중 각각의 파라미터에 포인트 값을 지정하고, 이 포인트들을 환자마다 노모그램 점수에 합산하고, 그 다음 이 노모그램 점수에 기초하여 다양한 시점 간격(최고 10년)마다 재발하지 않을 환자의 가능성을 예측함으로써 환자를 평가한다. 유방암 환자의 생존 예후를 측정하는데 사용되는 효과적인 임상 노모그램의 한 에는 노팅엄 예후 지수(NPI)이다[예컨대, Galea et al., BREAST CANCER RES. & TREAT.(1992) 22:207-19].

전립선암 환자로부터 수득한 샘플에서 CCG 상태의 측정은 환자의 카탄-스티븐슨 노모그램 점수와 함께, 노모그램 점수 단독보다 10년 무재발 생존율에 대한 우수한 예측인자임이 밝혀졌다[예컨대, 이하 실시예 2 및 5 참조]. 구체적으로, 카탄-스티븐슨 노모그램에의 CCG 상태의 부가는 노모그램 단독에서 검출되지 않은 재발 위험률이 유의적인 증가된 환자를 검출한다. 상기 표 3은 전립선암 예후 시에 카탄-스티븐슨 노모그램과의 예측 상승작용을 나타내기 위해 실시예 2에서 측정된 31개 CCG의 예시적 패널(패널 C) 및 26개 CCG의 서브세트 패널(패널 D, ^*로 표시됨)을 제공한다. 또한, 유방암 환자로부터 수득한 샘플에서 CCG 상태의 측정은 환자의 NPI 점수와 함께, NPI 점수 단독보다 우수한 예후적 예측인자인 것으로 발견되었다. 예컨대 이하 실시예 6을 참조한다. 구체적으로, NPI 노모그램에 CCG 상태의 부가는 노모그램 단독에서 검출되지 않은 재발 위험률이 유의적으로 증가된 환자를 검출한다. 패널 B, C 및 D는 유방암 예후 시에 NPI 노모그램과 함께 예후 상승작용을 나타내는 것으로 실시예 2에서 측정되었다.

따라서, 본 발명의 다른 관점은 암 환자의 임상 노모그램 점수(예컨대, 카탄-스티븐슨 또는 NPI 노모그램 점수)를 검출하는 단계 및 환자로부터 수득한 샘플에서 적어도 하나의 CCG의 상태를 측정하는 단계를 포함하는 시험관내 방법을 제공한다. 실시예 3은 각 CCG 및 카탄-스티븐슨 노모그램에서보다 다양한 크기의 여러 CCG 패널의 예측력에 대한 실험적 측정을 예시한다. 표 3에 열거된 31개 CCG 중 무작위 선택된 서브세트를 상이한 CCG 시그니처로서 검사하고 각각의 예측력(즉, p값)을 측정했다. 도 1에 도시된 바와 같이, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25 및 26개 유전자의 CCG 시그니처는 각각 노모그램에 예측력을 부가한다. 따라서, 본 발명은 전립선암 환자가 증가된 재발 가능성을 보유하는지를 측정하는 방법으로서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이상의 CCG를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 CCG의 상승된 상태(즉, 증가된 발현)가 증가된 재발 가능성을 시사하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 방법은 추가로 환자의 임상 노모그램 점수를 측정하는 단계를 포함한다. 또한, 본 발명은 유방암 환자가 증가된 재발 가능성을 보유하는지를 측정하는 방법으로서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 10, 15, 20, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이상의 CCG를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 CCG의 상승된 상태(즉, 증가된 발현)가 증가된 재발 가능성을 시사하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 본 방법은 추가로 환자의 임상 노모그램 점수를 측정하는 단계를 포함한다.

종종 암의 임상 노모그램은 특정 값(예컨대, 높은 점수)이 증가된 재발 위험률과 상관성이 있도록 설계한다. 상승된 CCG 상태(예컨대, 증가된 발현 또는 활성)는 증가된 위험률과 상관성이 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명은 환자의 임상 노모그램 점수를 측정하는 단계 및 환자로부터 수득한 샘플에서 적어도 하나의 CCG의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 높은 노모그램 점수 및/또는 상승된 CCG 상태가 환자의 재발 또는 진행의 증가된 가능성을 나타내는, 암 환자의 재발 또는 진행 가능성의 증가 여부를 측정하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 암은 전립선암이다. 일부 양태에서, 암은 폐암이다.

일부 양태에서, 이 평가는 극단적인 전립선절제 전에 이루어지고(예컨대, 전립선 생검 샘플을 이용하여), 반면 일부 양태에서는 전립선절제 후에 이루어진다(예컨대, 절제된 전립선 샘플을 이용하여). 일부 양태에서, 하나 이상의 세포의 샘플은 본 발명에 따른 분석을 위해 치료 전 또는 후에 전립선암 환자로부터 수득된다. 당업계에서 현재 적용되는 전립선암 치료로는, 예컨대 전립선절제, 방사능요법, 호르몬요법(예컨대, GnRH 길항물질, GnRH 작용물질, 항안드로겐 이용), 화학요법 및 고강도 집중 초음파를 포함한다. 일부 양태에서, 전립선암 조직 유래의 하나 이상의 전립선 종양 세포는 생검 또는 전립선절제 동안 전립선암 환자로부터 수득되며 본 발명의 방법에서 분석에 사용된다.

또한, 본 발명은 PTEN 상태가 공격적인 전립선암을 예측한다는 발견을 기반으로 한다. PTEN 상태는 임상 파라미터(예컨대, 카탄-스티븐산 노모그램) 및 CCG(예: 표 1 또는 패널 A 내지 G의 유전자)에 부가된다. 이하 실시예 4에 더 상세히 설명되는 바와 같이, PTEN 상태는 동반 임상 이력 데이터 및 CCG 시그니처 데이터를 보유한 191개 전립선암 환자 샘플에서 측정되었다. 음성 PTEN 상태는 재발 위험률의 유의적인 예측인자인 것으로 밝혀졌다(p값 0.031). PTEN은 수술후 임상 파라미터와 표 3에 제시된 CCG 시그니처에 대해 조정한 후에도 유의적인 재발 예측인자를 유지했다(p값 0.026). 또한, 중요한 점으로, PTEN과 CCG 시그니처의 조합은 수술후 임상 파라미터들보다 우수한 재발 예측인자인 것으로 보인다(p값 0.0002).

PTEN은 전립선암 재발의 독립적인 예측인자이기 때문에, 본 발명의 한 관점은 환자 유래 샘플의 PTEN 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 낮은 또는 음성 PTEN 상태가 환자의 높은 재발 가능성을 시사하는, 환자의 전립선암 재발 가능성을 예측하는 방법을 제공한다. PTEN 상태는 당업계에 공지된 임의의 기술로 측정할 수 있으며, 예컨대 본 명세서에서 논한 것이 있지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

PTEN은 전립선암을 예측하는데 있어서 CCG 상태에 부가되기 때문에, 본 발명의 다른 관점은 PTEN 상태를 측정하는 단계 및 환자로부터 수득한 샘플에서 다수의 CCG의 상태를 측정하는 단계를 포함하는 시험관내 방법을 제공한다. 다양한 마커의 상태를 측정하기 위해 기술의 여러 조합이 사용될 수 있다. 예를 들어, 한 양태에 따르면 PTEN 상태는 면역조직화학(IHC)에 의해 측정되는 반면 다수의 CCG의 상태는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR™), 예컨대 TaqMan™에 의해 측정된다. 본 발명의 일부 양태는 환자로부터 수득한 샘플에서 PTEN 상태를 측정하는 단계, 환자로부터 수득한 샘플에서 다수의 CCG 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 낮거나 음성인 PTEN 상태 및/또는 상승된 CCG 상태가 환자의 재발 가능성의 증가를 시사하는, 전립선암 환자의 재발 가능성을 측정하는 방법을 제공한다.

PTEN 상태는 전립선암 재발을 예측하는데 있어서 임상 파라미터에 예측 값을 부가하기 때문에, 본 발명의 또 다른 관점은 PTEN 상태를 측정하는 단계 및 암 환자의 적어도 하나의 임상 파라미터를 측정하는 단계를 포함하는 시험관내 방법을 제공한다. 종종, 임상 파라미터는 적어도 다소 독립적으로 재발 예측성이고, PTEN 상태의 부가는 예측력을 향상시킨다. 일부 양태에서, 본 발명은 환자로부터 수득한 샘플에서 PTEN 상태를 측정하는 단계 및 환자의 임상 노모그램 점수를 측정하는 단계를 포함하고, 낮거나 음성인 PTEN 상태 및/또는 높은 노모그램 점수는 환자의 재발 가능성의 증가를 시사하는, 암환자의 재발 가능성의 증가 여부를 측정하는 방법을 제공한다.

이상 총 3가지 마커는 부가적이기 때문에, 본 발명의 일부 양태는 환자로부터 수득한 샘플에서 PTEN의 상태를 측정하는 단계, 환자의 임상 노모그램 점수를 측정하는 단계 및 환자로부터 수득한 샘플에서 적어도 하나의 CCG의 상태를 측정하는 단계를 포함하고, 낮거나 음성인 PTEN 상태, 높은 노모그램 점수 및 상승된 CCG 상태가 환자의 재발 가능성의 증가를 시사하는, 암환자의 재발 가능성의 증가 여부를 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 임의의 분석 결과는 종종 의사, 유전자 상담원 및/또는 환자(또는 다른 이해 관계자, 예컨대 연구자)에게 이러한 임의의 관계자들에게 전달하거나 소통할 수 있는 전달 형식으로 전해질 것이다. 이러한 형식은 다양할 수 있고 유형 또는 무형일 수 있다. 결과는 설명문, 다이아그램, 사진, 차트, 이미지 또는 임의의 다른 시각적 형식으로 구현될 수 있다. 예를 들어, 다양한 유전자들의 서열 변화 정보 또는 발현이나 활성 수준을 보여주는 그래프가 결과를 설명하는데 사용될 수 있다. 또한, 부가 표적 유전자(들)에 대한 상기 정보를 보여주는 다이아그램도 일부 검사 결과를 나타내는데 유용하다. 설명문과 가시적 형식은 종이, 컴퓨터 판독 매체, 예컨대 플로피 디스크, 컴팩트 디스크 등과 같은 유형 매체 또는 무형 매체, 예컨대 이메일 또는 인터넷 또는 인트라넷 상의 웹사이트 형식의 전자 매체로 기록될 수 있다. 또한, 결과는 음성 형식으로 기록될 수도 있고, 임의의 적당한 매체, 예컨대 아날로그 또는 디지털 케이블선, 광섬유 케이블 등을 통해 전화, 팩시밀리, 무선 이동 전화, 인터넷 전화 등을 거쳐 전송될 수 있다.

따라서, 검사 결과에 대한 정보와 데이터는 세계 어디서나 수득할 수 있고 다른 위치로 전송할 수 있다. 예시적 예로서, 발현 수준, 활성 수준 또는 서열분석(또는 유전자형별) 분석이 미국 외에서 수행될 때, 검사 결과에 대한 정보와 데이터는 수득한 뒤, 전술한 바와 같은 전송가능 형식으로 만든 다음, 미국 내로 유입될 수 있다. 따라서, 본 발명은 적어도 하나의 환자 샘플의 (a) 발현 수준 또는 (b) 활성 수준 중 적어도 하나에 대한 정보의 전송가능 형식을 생산하는 방법을 포함한다. 이 방법은 (1) 본 발명의 방법에 따라 상기 (a) 또는 (b) 중 적어도 하나를 측정하는 단계 및 (2) 측정 단계의 결과를 전송가능 형식으로 구현시키는 단계를 포함한다. 전송가능 형식은 이러한 방법의 산물이다.

이러한 발현, 활성 및/또는 서열 데이터(사실상, 본 발명에 따라 수득되는 모든 데이터)를 분석하는 기술은 종종 이러한 분석을 실시할 수 있는 하나 이상의 컴퓨터 시스템 또는 다른 프로세싱 시스템에서 하드웨어, 소프트웨어 또는 이의 조합을 사용해서 실행될 것이다.

컴퓨터-기반(computer-implemented) 분석 기능은 임의의 적합한 언어 및/또는 브라우저에서 실행될 수 있다. 예를 들어, C 언어로, 바람직하게는 객체-지향 고급 프로그래밍 언어, 예컨대 Visual Basic, SmallTalk, C++ 등을 이용해서 실행할 수 있다. 이러한 애플리케이션은 Microsoft Windows™ 환경, 예컨대 Windows™ 98, Windows™ 2000, Windows™ NT 등과 같은 환경에 맞도록 작성될 수 있다. 또한, 애플리케이션은 MacIntosh™, SUN™, UNIX 또는 LINUX 환경용으로 작성될 수도 있다. 또한, 기능적 단계는 유니버설 또는 플랫폼-독립적 프로그래밍 언어를 이용해 실행될 수도 있다. 이러한 멀티플랫폼 프로그래밍 언어의 예로는 하이퍼텍스트 마크업 언어(HTML), JAVA™, JavaScript™, 플래시 프로그래밍 언어, 커먼 게이트웨이 인터페이스/구조화 조회 언어(CGI/SQL), PERL(practical extraction report language), AppleScript™ 및 다른 시스템 스크립트 언어, 프로그래밍 언어/구조화 조회 언어(PL/SQL) 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. Java™- 또는 Javascript™-가능 브라우저, 예컨대 HotJava™, Microsoft™ Explorer™ 또는 Netscape™이 사용될 수 있다. 액티브 콘텐트 웹페이지가 사용될 때, Java™ 애플릿 또는 ActiveX™ 컨트롤 또는 다른 액티브 콘텐트 기술을 포함할 수 있다.

분석 기능은 또한 컴퓨터 프로그램 제품으로 구현되고, 전술한 시스템 또는 다른 컴퓨터 기반 또는 인터넷 기반 시스템에서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 관점은 프로세서가 유전자 상태 분석을 수행할 수 있도록 구현된 컴퓨터 판독가능 프로그램 코드 또는 명령을 보유한 컴퓨터-사용가능 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품에 관한 것이다. 이 컴퓨터 프로그램 명령은 컴퓨터 또는 다른 프로그램가능 장치에 로딩되어 장치를 생성하여, 컴퓨터 또는 다른 프로그램가능 장치에서 실행되는 명령이 전술한 기능 또는 단계를 실행하는 수단을 생성한다. 또한, 이 컴퓨터 프로그램 명령은 컴퓨터 또는 다른 프로그램가능 장치가 특정 방식으로 기능하도록 유도할 수 있는 컴퓨터-판독가능 메모리 또는 매체에 저장될 수 있어, 이 컴퓨터-판독가능 메모리 또는 매체에 저장된 명령은 분석을 실행하는 명령 수단을 포함하는 제조물품을 생산하게 된다. 컴퓨터 프로그램 명령은 또한 컴퓨터 또는 다른 프로그램가능 장치에 로딩되어 컴퓨터 또는 다른 프로그램가능 장치에서 일련의 작업 단계가 수행되도록 하여, 컴퓨터 또는 다른 프로그램가능 장치에서 실행되는 명령이 전술한 기능 또는 단계를 실행하는 단계를 제공하게 된다.

따라서, 본 발명의 한 관점은 환자의 재발 가능성 증가 여부를 측정하기 위한 시스템을 제공한다. 일반적으로 말하면, 시스템은 (1) 환자의 유전자 상태 데이터(예: 발현 수준, 활성 수준, 변이) 및 경우에 따라 임상 파라미터 데이터(예: 글리슨 점수, 노모그램 점수)를 수신, 저장 및/또는 검색하는 컴퓨터 수단; (2) 이 환자의 데이터를 조회하는 컴퓨터 수단; (3) 이 환자 데이터를 기반으로 한 재발 가능성의 증가 여부를 결정하기 위한 컴퓨터 수단; 및 (4) 이 결론을 출력/디스플레이하는 컴퓨터 수단을 포함한다. 일부 양태에서, 상기 결론을 출력하는 수단은 상기 결론을 의료 전문가에게 알리는 컴퓨터 수단을 포함할 수 있다.

이러한 시스템의 한 예는 도 6에 예시한 컴퓨터 시스템[600]이다. 컴퓨터 시스템[600]은 이 컴퓨터 시스템[600]에 환자의 데이터를 입력하기 위한 적어도 하나의 입력 모듈[630]을 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템[600]은 환자의 반응 가능성의 증가 또는 감소 여부를 시사하고/하거나 컴퓨터 시스템[600]에 의해 측정된 치료 제안을 시사하는 적어도 하나의 출력 모듈[624]을 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템[600]은 적어도 하나의 입력 모듈[630] 및 적어도 하나의 출력 모듈[624]과 연결된 적어도 하나의 메모리 모듈[606]을 포함할 수 있다.

적어도 하나의 메모리 모듈[606]은 예컨대 다양한 형태, 예컨대 자기 테이프 드라이브, 플로피 디스크 드라이브, VCD 드라이브, DVD 드라이브, 광학 디스크 드라이브 등, 이에 국한되지 않는 형태일 수 있는 이동식 저장 드라이브[608]를 포함할 수 있다. 이동식 저장 드라이브[608]는 이동식 저장 장치[610]와 상용성이어서, 이동식 저장 장치[610]로부터 읽고/읽거나 쓸 수 있다. 이동식 저장 장치[610]는 컴퓨터-판독가능 프로그램 코드 또는 명령 및/또는 컴퓨터 판독가능 데이터가 저장되어 있는 컴퓨터 사용가능 저장 매체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이동식 저장 장치[610]는 환자 데이터를 저장할 수 있다. 이동식 저장 장치[610]의 예는 당업계에 공지되어 있으며, 그 예로는 플로피 디스크, 자기 테이프, 광학 디스크 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 적어도 하나의 메모리 모듈[606]은 하드 디스크 드라이브[612]를 포함할 수 있고, 이는 컴퓨터 판독가능 프로그램 코드 또는 명령 및/또는 컴퓨터 판독가능 데이터를 저장하는데 사용될 수 있다.

또한, 도 1에 제시된 바와 같이, 적어도 하나의 메모리 모듈[606]은 추가로 인터페이스[614] 및 인터페이스[614]와 상용성인 이동식 저장 장치[616]를 포함하여, 소프트웨어, 컴퓨터 판독가능 코드 또는 명령은 이동식 저장 장치[616]로부터 컴퓨터 시스템[600]으로 전달될 수 있다. 인터페이스[614] 및 이동식 저장 장치[616] 쌍의 예로는 예컨대 이동식 메모리 칩(예: EPROM 또는 PROM) 및 이와 결합된 소켓, 프로그램 카트리지 및 카트리지 인터페이스 등을 포함한다. 또한, 컴퓨터 시스템[600]은 제2 메모리 모듈[618], 예컨대 랜덤 액세스 메모리(RAM)를 포함할 수 있다.

컴퓨터 시스템[600]은 적어도 하나의 프로세서 모듈[602]을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 프로세서 모듈[602]은 임의의 수의 장치로 구성될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 적어도 하나의 프로세서 모듈[602]은 데이터 프로세싱 장치, 예컨대 마이크로프로세서 또는 마이크로컨트롤러 또는 중앙처리장치를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 프로세서 모듈[602]은 다른 로직 장치, 예컨대 DMA(Direct Memory Access) 프로세서, 통합 통신 프로세서 장치, 주문형 VLSI(Very Large Scale Integration) 장치 또는 ASIC(Application Specific Integrated Circuit) 장치를 포함할 수 있다. 또한, 적어도 하나의 프로세서 모듈[602]은 여기에 기술된 프로세싱 기능을 수행하도록 고안된 임의의 다른 종류의 아날로그 또는 디지털 회로를 포함할 수 있다.

도 6에 도시된 바와 같이, 컴퓨터 시스템[600]에서, 적어도 하나의 메모리 모듈[606], 적어도 하나의 프로세서 모듈[602] 및 2차 메모리 모듈[618]은 통신 버스, 시스템 보드, 크로스바 등일 수 있는 통신 인프라구조[620]를 통해 모두 함께 작동적으로 연결되어 있다. 통신 인프라구조[620]를 통해, 컴퓨터 프로그램 코드 또는 명령 또는 컴퓨터 판독가능한 데이터는 전송 및 교환될 수 있다. 입력 인터페이스[626]는 적어도 하나의 입력 모듈[626]을 통신 인프라구조[620]에 작동적으로 연결할 수 있다. 이와 마찬가지로, 출력 인터페이스[622]는 적어도 하나의 출력 모듈[624]을 통신 인프라구조[620]에 작동적으로 연결할 수 있다.

적어도 하나의 입력 모듈[630]은 예컨대 당업계에 공지된 키보드, 마우스, 터치 스크린, 스캐너 및 다른 입력 장치를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 출력 모듈[624]은 예컨대 디스플레이 스크린, 예컨대 컴퓨터 모니터, TV 모니터 또는 적어도 하나의 입력 모듈[630]의 터치 스크린; 프린터 및 오디오 스피커를 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템[600]은 또한 모뎀, 통신 포트, 네트워크 카드, 예컨대 이더넷 카드, 및 인트라넷 또는 인터넷에 접속하기 위해 새로 개발된 장치를 포함할 수 있다.

적어도 하나의 메모리 모듈[606]은 적어도 하나의 입력 모듈[630]을 통해 입력되고 적어도 하나의 프로세서 모듈[602]을 통해 처리된 환자의 데이터를 저장하도록 설정될 수 있다. 본 발명에 관련된 환자의 데이터는 PTEN 및/또는 CCG에 대한 발현 수준, 활성 수준, 카피수 및/또는 서열 정보를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 관련된 환자 데이터는 환자의 질병에 관련된 임상 파라미터를 포함할 수도 있다. 의사가 치료 결정/권고를 하는데 유용한 것을 알아낼 수 있는 임의의 다른 환자 데이터도 시스템에 입력할 수 있으며, 그 예로는 연령, 성별 및 인종/민족성 및 라이프사이클 데이터, 예컨대 식사 정보를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 환자 데이터의 다른 가능한 종류는 현재 또는 종래 경험했던 증상, 환자의 병력, 약물 및 의료 절차를 포함한다.

적어도 하나의 메모리 모듈[606]은 여기에 저장된 컴퓨터-기반 방법을 포함할 수 있다. 적어도 하나의 프로세서 모듈[602]은 컴퓨터 기반 방법의 소프트웨어 또는 컴퓨터 판독가능한 명령 코드를 실행하는데 사용될 수 있다. 컴퓨터-실행 방법은 환자의 데이터를 기반으로 하여, 임의의 특정 치료에 대한 환자의 재발, 진행 또는 반응의 가능성 증가 여부를 시사하고, 가능한 치료 목록 등을 생성하도록 설정될 수 있다.

특정 양태에서, 컴퓨터 기반 방법은 환자를 재발 또는 진행의 가능성이 증가된 환자 또는 증가되지 않은 환자로 확인하도록 설정될 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 기반 방법은 특정 환자가 재발의 증가된 가능성을 보유하고 있음을 의사에게 알리도록 설정될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 컴퓨터 기반 방법은 다양한 질문에 대한 대답 내지 결과를 기반으로 한 특정 치료 과정을 실질적으로 제안하도록 설정될 수 있다.

도 7은 본 발명의 컴퓨터 시스템[600]으로 실행될 수 있는 본 발명의 컴퓨터 기반 방법[700]의 한 양태를 예시한다. 이 방법[700]은 3가지 질문([710], [711], [712]) 중 하나로 순차적으로 또는 실질적으로 동시에 시작한다. 이러한 임의의 질문에 대한 대답 내지 결과가 "예"[720]이면, 그 방법은 환자가 증가된 재발 가능성을 보유하는 것으로 결론짓는다[730]. 이러한 질문 전부에 대한 대답 내지 결과가 "아니오"[721]이면, 그 방법은 환자가 증가된 재발 가능성을 보유하지 않는 것으로 결론짓는다[731]. 그 다음, 이 방법[700]은 더 많은 질문으로 진행하고 특정 치료를 권고([740], [741])하거나, 또는 간단히 종결할 수도 있다.

질문이 연속해서 수행될 때, 도 7에 제안된 순서로 이루어지거나 임의의 다른 순서로 이루어질 수 있다. 후속 질문이 이루어지는지의 여부는 또한 이전 질문의 결과/대답에 의존적일 수 있다. 도 7에 예시된 방법의 일부 양태에서, 예컨대 이 방법은 먼저 임상 파라미터[712]에 대해 묻고, 환자가 증가된 재발 위험성으로 환자를 확인하는 하나 이상의 임상 파라미터를 보유한다면, 이 방법은 그와 같이 결론을 내거나[730] 또는 경우에 따라 CCG 상태를 조회하여 확인하고, 반면 환자가 상기 임상 파라미터를 전혀 보유하지 않는다면, 당해 방법은 CCG 상태에 대해 질문하도록 진행한다[711]. 경우에 따라, CCG 상태가 상승하지 않는다면, 본 방법은 계속해서 PTEN 상태에 대해 질문할 수 있다[710]. 앞에서 언급한 바와 같이, 이전 질문의 순서가 수정될 수도 있다. 일부 양태에서, 한 질문(예컨대, [712])에 대한 "예"의 대답은 환자의 재발 위험성의 증가를 확인하기 위한 하나 이상의 나머지 질문을 촉발시킨다.

일부 양태에서, 본 발명의 컴퓨터 기반 방법[700]은 확장가능형이다. 환언하면, 도 7의 외견상 제1 단계[710, 711 및/또는 712]는 사실상 더 큰 방법의 일부를 형성하고, 이 더 큰 방법에서 반드시 제1 단계/질문일 필요는 없다. 또한, 앞에서 논한 핵심 방법에 부가 단계가 추가될 수도 있다. 이러한 부가 단계는 도달한 결론을 의료 전문가(또는 환자 자신)에게 알리는 단계; 예시된 방법[700]에 의해 도달한 결론을, 환자의 진단, 예후, 치료 등에 관한 다소 부가적이거나 개선된 결론에 이르기 위한 다른 사실 또는 결론과 조합하는 단계; 치료에 대해 권고하는 단계(예컨대, "환자는 발본적 전립선절제술을 받아야 한다/받지 않아야 한다"); 부가 바이오마커, 임상 파라미터 또는 다른 유용한 환자 정보에 대하여 부가 질문(예: 진단 시의 연령, 일반적인 환자 건강 등)하는 단계를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

상기 컴퓨터 기반 방법[700]과 관련하여, 질문에 대한 대답은 이 대답을 위한 환자 데이터의 연구를 개시하는 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들어, 각 질문[710, 711, 712]에 답을 구하기 위해, 환자 데이터는 PTEN 상태(예컨대, PTEN IHC 또는 돌연변이 선별), CCG 상태(예: CCG 발현 수준 데이터) 또는 임상 파라미터(예: 글리슨 점수, 노모그램 점수 등)에 대해 조사할 수 있다. 이러한 비교가 아직 수행된 적이 없다면, 본 방법은 이 데이터를 약간의 대조군과 비교하여 환자가 비정상적(예컨대, 상승된, 낮은, 음성) 상태를 보유하는지를 측정할 수 있다. 부가적으로, 또는 대안적으로, 본 방법은 컴퓨터 시스템[100]의 사용자(예컨대, 의사)에게 하나 이상의 질문[710, 711, 712]을 제공할 수 있다. 예를 들어, 질문[710, 711, 712]은 출력 모듈[624]을 통해 제공될 수 있다. 그 다음, 사용자는 입력 모듈[630]을 통해 "예" 또는 "아니오"로 답할 수 있다. 그 다음, 입력된 답을 기반으로 하여 본 방법을 진행할 수 있다. 이와 마찬가지로, 결론[730, 731]은 출력 모듈[624]을 통해 컴퓨터 기반 방법의 사용자에게 제공될 수 있다.

따라서, 일부 양태로, 본 방법은 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 환자의 CCG 상태, 임상 파라미터 및/또는 PTEN 상태에 대한 정보를 액세스하는 단계; 이 정보를 조회하여, 환자로부터 수득한 샘플이 적어도 하나의 CCG의 증가된 발현을 나타내는지, 환자가 재발-관련 임상 파라미터를 보유하는지 및/또는 환자가 낮은/음성 PTEN 상태를 보유하는지의 여부 중 적어도 하나를 측정하는 단계; 샘플의 CCG 발현 상태, 환자의 재발-관련 임상 파라미터 상태 및/또는 샘플의 PTEN 상태를 출력[또는 디스플레이]하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명의 컴퓨터-기반 양태의 상황에서 본원에 사용되는 "디스플레이하는"은 임의의 감지 수단으로 임의의 정보를 전달하는 것을 의미한다. 예컨대, 컴퓨터 명령 시 인쇄된 종이 시트, 또는 컴퓨터 스크린에서 볼 수 있는 비주얼 디스플레이, 및 청각 디스플레이, 예컨대 환자 유전자형에 대한 컴퓨터 발생 또는 기록된 청각 발현을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

앞에서 상세히 논한 바와 같이, 상승된 CCG 상태와 조합된 재발-관련 임상 파라미터 또는 PTEN 상태는 유의적으로 증가된 재발 가능성을 시사한다. 따라서, 일부 양태는 컴퓨터 판독가능한 매체에 저장된 환자의 PTEN 상태(예: 환자로부터 수득한 종양 샘플 유래) 또는 임상 파라미터 및 CCG 상태(예: 환자로부터 수득한 종양 샘플 유래)에 대한 정보를 액세스하는 단계; 이 정보를 조회하여, 환자로부터 수득한 샘플이 적어도 하나의 CCG의 증가된 발현을 나타내는지, 환자가 재발-관련 임상 파라미터를 보유하는지 및/또는 환자가 낮은/음성 PTEN 상태를 보유하는지의 여부 중 적어도 하나를 측정하는 단계; 환자가 낮은/음성 PTEN 상태 또는 재발-관련 임상 파라미터를 보유하고 샘플이 적어도 하나의 CCG의 증가된 발현을 나타낸다면 증가된 재발 가능성이 있다는 표시를 출력(또는 디스플레이)하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 양태는 또한 PTEN, 임상 파라미터(또는 이의 값) 및/또는 CCG 및 이들의 상태(예컨대, 발현 수준)를, 경우에 따라 PTEN 또는 CCG 상태 및/또는 임상 파라미터가 증가된 위험 가능성을 시사하는지의 여부에 대한 표시와 함께 디스플레이하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 실행은 통상적인 생물학 방법, 소프트웨어 및 시스템을 이용할 수 있다. 본 발명의 컴퓨터 소프트웨어 제품은 일반적으로 본 발명의 방법의 로직 단계를 수행하기 위한 컴퓨터-실행가능 명령을 보유한 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함한다. 적당한 컴퓨터 판독가능한 매체는 플로피 디스크, CD-ROM/DVD/DVD-ROM, 하드 디스크 드라이브, 플래시 메모리, ROM/RAM, 자기 테이프 등을 포함한다. 기본 전산 생물학 방법은 예컨대 문헌[Setubal et al ., Introduction to Computational Biology Methods (PWS Publishing Company, Boston, 1997); Salzberg et al . (Ed.), Computational Methods in Molecular Biology, (Elsevier, Amsterdam, 1998); Rashidi & Buehler, Bioinformatics Basics: Application in Biological Science and Medicine (CRC Press, London, 2000); 및 Ouelette & Bzevanis, Bioinformatics: A Practical Guide for Analysis of Gene and Proteins (Wiley & Sons, Inc., 2^nd ed., 2001); 또한, 미국 특허 6,420,108 참조]에 기술되어 있다.

또한, 본 발명은 다양한 목적, 예컨대 프로브 디자인, 데이터 관리, 분석 및 기구 조작을 위한 다양한 컴퓨터 프로그램 제품 및 소프트웨어를 이용할 수 있다. 미국 특허 5,593,839; 5,795,716; 5,733,729; 5,974,164; 6,066,454; 6,090,555; 6,185,561; 6,188,783; 6,223,127; 6,229,911 및 6,308,170 참조. 또한, 본 발명은 미국 특허 일련번호 10/197,621(미국 특허 공개번호 20030097222); 10/063,559 (미국 특허 공개번호 20020183936), 10/065,856(미국 특허 공개번호 20030100995); 10/065,868(미국 특허 공개번호 20030120432); 10/423,403(미국 특허 공개번호 20040049354)에 제시된 인터넷과 같은 네트워크 상에서 유전자 정보를 제공하는 방법을 포함하는 양태를 보유할 수 있다.

한 관점에서, 본 발명은 CCG 상태 정보(예컨대, 표 1 또는 패널 A 내지 G의 CCG)를 수득하는 단계 및 CCG 상태를 기반으로 한 암 환자의 치료를 권고, 처방 또는 처치하는 단계를 포함하는, 암 환자의 치료 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 이 방법은 추가로 임상 파라미터 정보를 수득하는 단계 및/또는 환자 유래의 샘플로부터 PTEN 상태 정보를 수득하는 단계 및 CCG 상태, 임상 파라미터 및/또는 PTEN 상태 정보를 기반으로 한 특정 치료로 환자를 치료하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명은

(1) 적어도 하나의 CCG 상태를 측정하는 단계;

(2) 적어도 하나의 임상 파라미터의 상태를 측정하는 단계;

(3) 환자로부터 수득한 샘플에서 PTEN 상태를 측정하는 단계;

(4) (a) 환자가 증가 발현된 CCG, 재발-관련된 임상 파라미터 또는 낮은/음성 PTEN 상태 중 적어도 하나를 나타낸다면 능동(예컨대, 공격적) 치료를, 또는

(b) 환자가 증가 발현된 CCG, 재발-관련된 임상 파라미터 또는 낮은/음성 PTEN 상태를 전혀 나타내지 않는다면 수동(또는 덜 공격적인) 치료를 권고, 처방 또는 처치하는 단계를 포함하는, 암 환자의 치료 방법을 제공한다.

치료가 공격적인지 아닌지의 여부는 일반적으로 암종류, 환자의 연령 등에 의존적일 수 있다. 예를 들어, 유방암에서 보조 화학요법은 수술 및 호르몬 요법의 덜 공격적인 기준을 보완하기 위해 제공되는 일반적인 공격적 치료이다. 당업자는 암의 각 종류에 대한 다양한 다른 공격적 및 덜 공격적인 치료법을 잘 알고 있다. 전립선암에서 "능동 치료법"은 당업자에게 잘 알려져 있고, 본원에 사용되는 당업계의 통상적인 의미를 나타낸다. 일반적으로 말하면, 전립선암의 능동 치료법은 "대기요법(watchful waiting)" 외에 다른 치료법이다. 전립선암 치료 분야에서 현재 적용되는 능동 치료법으로는, 예컨대 전립선절제술, 방사능요법, 호르몬요법(예컨대, GnRH 길항물질, GnRH 작용물질, 항안드로겐), 화학요법, 고강도 초점 초음파("HIFU") 등을 포함한다. 각 치료 옵션은 특정 위험성뿐 아니라 다양한 병도의 부작용, 예컨대 발기부전, 요실금 등을 수반한다. 따라서, 전립선암 진단을 받은 남성의 연령 및 일반적 건강에 따라 의사는 "대기요법"의 방법을 권고하는 것이 일반적이다.

"능동 감시"라고도 불리는 "대기요법"은 또한 당업계의 통상적인 의미를 나타내는 것이다. 이것은 일반적으로 침습 치료 없이 관찰과 규칙적인 모니터링을 의미한다. 대기요법은 때때로 사용되고, 예컨대 초기 단계인 저속-성장형 전립선암이 노인 남성에서 발견될 때 사용된다. 또한, 대기요법은 수술, 방사능요법 또는 호르몬요법의 위험이 가능한 유익을 능가할 때 제안될 수 있다. 증상이 발전하거나 또는 암 성장이 가속화되는 징후(예컨대, PSA의 급상승, 반복 생검에서 글리슨 점수의 증가 등)가 있다면 다른 치료가 개시될 수 있다.

대기요법을 선택한 남성은 수술 및 방사능의 위험을 피하지만, 대기요법은 이 자체의 위험, 예컨대 증가된 전이 위험성을 수반한다. 젊은 남성에 대한 능동 감시의 시도는 치료를 완전히 기피하는 것을 의미하는 것이 아니라, 능동 치료로 인한 생활 영향의 질을 피할 수 있는 수년 이상 동안 적당히 지연시킬 수 있게 한다. 지금까지 공개된 데이터는 신중히 선택된 남성이 이 시도에 의한 치유 호기를 놓치지는 않을 것이라는 것을 시사한다. 관찰 기간 동안 나이가 들어감에 따라 발생하는 추가 건강 문제도 수술과 방사능요법을 받기가 더욱 어렵게 할 수 있다. 따라서, 어떤 전립선암 환자가 대기요법의 양호한 후보이며 어떤 환자가 능동 치료를 받아야 하는지는 신중히 결정하는 것이 임상적으로 중요하다.

따라서, 본 발명은 전립선암 환자를 치료하거나 환자의 치료를 안내하는 방법을 제공한다. 이 방법에서, 적어도 하나의 CCG 상태(예: 표 1 또는 패널 A 내지 G에 기재된 것), 적어도 하나의 재발-관련된 임상 파라미터, 및/또는 PTEN의 상태가 측정되고, (a) 환자 유래의 샘플이 적어도 하나의 CCG에 대한 상승된 상태를 보유하고, 환자가 적어도 하나의 재발-관련된 임상 파라미터를 보유하고/하거나 낮은/음성 PTEN 상태를 보유한다면 능동 치료가 권고, 개시 또는 지속되고, 또는 (b) 환자가 적어도 하나의 CCG에 대한 상승된 상태, 재발-관련된 임상 파라미터, 또는 낮은/음성 PTEN 상태를 전혀 보유하지 않는다면 대기요법이 권고/개시/지속된다. 특정 양태에서, CCG 상태, 임상 파라미터(들) 및 PTEN 상태는 능동 치료가 권고되지는 않지만, 특정 능동 치료(예컨대, RP 및/또는 보조 요법과 같은 비교적 공격적인 치료)가 환자에게 바람직하다는 것을 시사할 수도 있다.

일반적으로, 보조 요법(예컨대, 전립선절제 또는 방사능요법 후의 화학요법, 방사능요법, HIFU, 호르몬 요법 등)은 전립선암의 치유 기준이 아니다. 하지만, 본 발명에 따르면 의사는 전립선암 환자가 특히 공격적인 질환을 보유하여 보조 요법을 받아야 하는지를 측정할 수 있다. 따라서, 한 양태로서, 본 발명은 적어도 하나의 CCG(예컨대, 표 1 또는 패널 A 내지 G)의 상태, 적어도 하나의 재발-관련 임상 파라미터의 상태 및/또는 PTEN의 상태를 측정하는 단계, 및 환자 유래의 샘플이 적어도 하나의 CCG에 대한 상승된 상태를 보유한다면, 환자가 적어도 하나의 재발-관련 임상 파라미터를 보유한다면 및/또는 환자가 낮은/음성 PTEN 상태를 보유한다면 전립선절제 또는 방사능요법 후 보조 요법을 개시하는 단계를 포함하는, 환자(예컨대, 전립선암 환자)의 치료 방법을 제공한다.

한 관점에서, 본 발명은 상기 방법들에 사용되는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 PTEN 또는 CCG에 하이브리드화하는 핵산 프로브(또는 이에 의해 암호화되거나 상보적인 임의의 핵산); PTEN 또는 CCG 전부 또는 일부 또는 이에 의해 암호화된 임의의 핵산을 증폭시키기에 적합한 핵산 프라이머 및 프라이머 쌍; PTEN 또는 CCG에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 면역학적으로 결합하는 항체; 다수의 상기 핵산 프로브, 핵산 프라이머, 항체 및/또는 폴리펩타이드를 함유하는 프로브 세트; 이들 중 어느 것을 함유하는 마이크로어레이; 이들 중 어느 것을 함유하는 키트 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 일부 관점에서, 본 발명은 상기 방법에 사용되는 컴퓨터 방법, 시스템, 소프트웨어 및/또는 모듈을 제공한다.

일부 양태에서, 본 발명은 PTEN 또는 표 1에 열거된 또는 패널 A 내지 G에 열거된 유전자 중 적어도 하나에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 분리된 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 프로브를 제공한다. "프로브" 및 "올리고뉴클레오타이드"(또한, "올리고")란 용어는 핵산의 상황에서 사용되었을 때, 비교적 짧은 핵산 단편 또는 서열을 호환가능하게 의미한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 유용한 프라이머도 제공한다. "프라이머"는 정확한 조건과 정확한 동반 시약 하에 표적 핵산(예: 표적 유전자)을 선택적으로 증폭시킬 수 있는 프로브이다. 핵산의 상황에서, 여기에 사용된 "프로브"는 "프라이머"를 포괄하는데, 이는 프라이머가 일반적으로 프로브로서 작용할 수 있기 때문이다.

프로브는 일반적으로 임의의 적당한 크기/길이일 수 있다. 일부 양태에서, 프로브는 길이가 약 8 내지 200, 15 내지 150, 15 내지 100, 15 내지 75, 15 내지 60, 또는 20 내지 55 염기이다. 프로브는 검출가능한 마커로 표지화될 수 있고, 임의의 적당한 검출 마커로는 방사능 동위원소, 플루오로포어, 비오틴, 효소(예: 알칼리성 포스파타제), 효소 기질, 리간드 및 항체 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다(Jablonski et al., Nucleic Acids Res.(1986) 14: 6115-6128; Nguyen et al., BIOTECHNIQUES(1992) 13: 116-123; Rigby et al., J.MOL.BIOL.(1977) 113: 237-251). 실제로, 프로브는 다양한 분자생물학적 응용에서 임의의 통상적인 방식으로 변형되기도 한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드 프로브를 생산하고 사용하는 기술은 당업계에 통상적인 것이다.

본 발명에 따른 프로브는 앞에서 논한 하이브리드화/증폭/검출 기술에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일부 양태는 PTEN 및/또는 다수의 CCG를 검출, 증폭 및/또는 정량분석하는데 있어서 마이크로어레이에 사용하기에 적합한 프로브 세트를 포함한다. 일부 양태에서, 프로브 세트는 CCG에 지향성인 일정 비율의 프로브를 보유하며, 예컨대 프로브 세트는 CCG에 특이적인 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 프로브로 이루어진다. 일부 양태에서, 프로브 세트는 표 1에 열거된 또는 패널 A 내지 G에 열거된 유전자 중 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700 또는 800개 이상의 유전자 또는 유전자 전부에 대해 지향성인 프로브를 포함한다. 이러한 프로브 세트는 5,000, 10,000, 20,000, 50,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 500,000, 600,000, 700,000, 800,000, 900,000 또는 1,000,000개 또는 그 이상의 다른 프로브를 함유하는 고밀도 어레이에 포함될 수 있다. 다른 양태에서, 프로브 세트는 표 1에 열거된 또는 패널 A 내지 G에 열거된 CCG 중 하나 이상 또는 PTEN의 적어도 일부를 함유하는 핵산을 증폭시키기 위한 프라이머(예컨대, 프라이머 쌍)를 포함한다.

본 발명의 다른 관점에서, 키트는 본 발명의 예측을 실행하기 위해 제공된다. 키트는 키트의 다양한 성분을 위한 캐리어를 포함할 수 있다. 캐리어는 예컨대 백, 박스, 튜브, 랙 등의 형태인 용기 또는 지지체일 수 있고, 경우에 따라 구획화되어 있다. 캐리어는 운송 및 저장 동안 안전성 목적으로 포위 구속을 한정할 수 있다. 키트는 전술한 검출 기술을 사용하여 하나 이상의 CCG의 상태 및 하나 이상의 하우스키핑 유전자 마커를 측정하는데 유용한 다양한 성분을 포함한다. 예를 들어, 키트는 표 1에 열거된 또는 패널 A 내지 G에 열거된 유전자의 mRNA 또는 cDNA에 높은 엄중도 하에 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 RT-PCR 반응 중의 PCR 프라이머, 또는 하이브리드화 프로브로서 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 키트는 유전자 패널의 발현 수준을 측정하는 시약(예컨대, 프로브, 프라이머 및/또는 항체)을 포함하고, 여기서 상기 패널은 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% CCG(예컨대, 표 1 또는 패널 A 내지 G의 CCG)를 포함한다. 일부 양태에서, 키트는 2500개 이하의 유전자의 발현 수준을 측정하는 시약(예컨대, 프로브, 프라이머 및/또는 항체)을 포함하고, 여기서 상기 유전자들 중 적어도 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 250개 또는 그 이상은 CCG(예컨대, 표 1 또는 패널 A 내지 G의 CCG)이다.

검출 키트의 올리고뉴클레오타이드는 임의의 적당한 검출 마커, 예컨대 방사능 동위원소, 플루오로포어, 비오틴, 효소(예컨대, 알칼리성 포스파타제), 효소 기질, 리간드 및 항체 등으로 표지될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, Jablonski et al., Nucleic Acids Res., 14: 6115-6128(1986); Nguyen et al., Biotechniques, 13: 116-123(1992); Rigby et al., J. Mol. Biol., 113: 237-251(1977) 참조. 대안적으로, 키트에 포함된 올리고뉴클레오타이드는 표지되지 않고, 대신에 하나 이상의 마커가 키트에 제공되어, 사용 시에 사용자가 올리고뉴클레오타이드를 표지화할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서, 검출 키트는 PTEN 또는 하나 이상의 CCG에 의해 암호화된 하나 이상의 단백질과 선택적으로 면역반응성인 하나 이상의 항체 또는 경우에 따라 임의의 추가 마커를 함유한다. 예컨대, 표 1에 열거된 또는 패널 A 내지 G에 열거된 유전자에 의해 암호화된 단백질 또는 PTEN에 면역학적으로 결합하는 항체를 포함한다. 이러한 항체를 생산 및 사용하는 방법은 앞에서 상세하게 설명했다.

또한, 본 발명의 검출 키트에는 검출 기술에 유용한 다양한 다른 성분이 포함될 수 있다. 이러한 성분의 예로는 Taq 폴리머라제, 데옥시리보뉴클레오타이드, 디데옥시리보뉴클레오타이드, 표적 DNA 서열의 증폭에 적합한 다른 프라이머, RNase A 등을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 검출 기트는 사람 샘플을 이용해 본 발명의 예후 방법을 실행하는 키트 사용에 대한 사용설명서를 포함한다.

구체적인 양태로서,

실시예 1

극단적 전립선절제술 이후 화학적 재발까지의 시간을 예측하기 위해 다음과 같은 세포 주기 유전자(CCG) 시그니처를 검사했다.

상기 31 CCG들의 평균 mRNA 발현은 440가지 전립선암 FFPE 샘플을 가지고 Splus 7.1의 Cox 비례 위험 모델(Insightful, Inc., Seattle WA)을 사용하여 검사했다. 우도비(likelihood ratio) 검사의 p값은 3.98x10^-5이었다.

CCG 발현의 평균은 측정 오차 및 유전자 간에 개체 변이에 강력하다. 시그니처를 위한 세포 주기 유전자의 최적 수를 측정하기 위해, 평균의 예측력을 상기 열거한 CCG 중 1개 내지 30개 중에서 무작위로 선택한 세트에 대해 검사했다. 이 모의실험은 유의적으로 향상된 예측력을 제공하는 패널에서 CCG의 역치 수가 존재한다는 것을 보여주었다.

실시예 2

일변량 분석에서 31 CCG 세트(표 3)가 전립선암 환자의 RP 후 생화학적 재발의 유의적인 예측인자인 것으로 확인되었다(p값 = 1.8 x 10^-9). 이 시그니처는 다시 전립선암 재발의 확립된 임상 노모그램(Kattan-Stephenson 노모그램)에 부가적인지를 측정하기 위해 평가했다. 요약하면, 이 노모그램은 재발의 매우 유의적인 예측인자(p값 1.6 x 10^-10)였고, 노모그램에 대해 조정한 후 CCG 시그니처는 생화학적 재발의 유의적인 예측인자였다(p값 4.8 x 10^-5, 표 6).

환자 및 방법

804명의 일련의 RP 환자는 평균 9.5년 동안 추적했다. 이 환자의 특징과 전체 코호트의 치료 결과는 이미 보고되어 있다(Swanson et al., Urol Oncol.(2007) 25: 110-114). 분석에 충분한 조직을 이용한 최종 병리학적 평가로부터의 조직 블록 및/또는 슬라이드는 430명의 환자들에서 이용가능했다. 코호트는 훈련을 위한 212명의 환자 및 확인 세트로서 199명의 환자 샘플로 무작위로 나누었다.

유전자 발현(통계학적 방법): 생화학적 재발과 CCG 발현 간의 연관성은 재발에 걸리는 시간에 대해 Cox PH 모델을 이용해 평가했다. 본 연구에서 보고된 모든 p값은 귀무 모델(null model)과 검사 변수를 포함하는 모델을 비교하는 우도비 검사에서 유래되었다. 31 CCG 세트(표 3, 상기 문헌 참조)는 무작위로 선택했다. 이 분석을 이용하여 훈련 세트 중의 212명 환자로부터 발현 데이터를 수득했다. 발현 데이터는 모두 3 반복으로 수득했다. 이 발현 데이터는 26 CCG의 평균 발현 수준을 계산하여 시그니처에 조합시켰다. 생화학적 재발과 CCG 발현 간에 연관성은 재발에 걸리는 시간에 대한 Cox PH 모델을 이용하여 평가했다.

샘플 제조 및 연구 디자인: RNA는 RP 치료를 받은 411명 전립선암 환자 유래의 FFPE 종양 절편으로부터 분리했다. RNA를 분리하기 위해 대표적인 10㎛ 두께의 종양 절편을 사용했다. 필요하면, 병리학자에 의한 샘플의 육안해부 또는 현미해부를 사용하여 RNA 분리 전에 종양 조직을 증량했다. 확인 코호트의 샘플은 현미해부하지 않았다. 분석 전에, 코호트는 시그니처의 초기 특성화를 위한 212명의 환자("훈련 세트")와 확인을 위한 199명의 환자로 분할했다. 훈련 및 확인 코호트의 임상 특징은 표 5에 나열했다.

결과

CCG 발현 시그니처(표 3, 상기 참조)는 일변량 분석에서 질병 재발을 예측했다(p값 = 1.8x10^-9, 표 6). 시그니처 점수의 분포는 높은 값(더 낮은 발현)쪽으로 기울어졌다. 시그니처 점수의 중간 값을 사용하여 훈련 코호트를 CCG 발현이 높은 샘플 또는 낮은 샘플을 포함하는 2 그룹으로 나누었다. 두 그룹의 생존율 대 시간은 도 2에 도시했다.

또한, 수술후 노모그램(카탄-스티븐슨 노모그램)에 일반적으로 포함된 임상 변수들을 확인한 후 CCG 시그니처의 예측력도 평가했다. 노모그램은 매우 유의적인 재발 예측인자였다(p값 1.6x10^-10). 노모그램에 대해 조정 후, CCG 시그니처는 발견 코호트(p값 0.03) 및 임상 확인 코호트(p값 4.8x10^-5)에서 생화학적 재발의 유의적인 예측인자였다(도 3).

^* 결측값 대치된 세포 주기 유전자 발현의 평균, Cox 비례 위험 모델의 우도비 검사

노모그램과 CCG 발현 시그니처 간의 상호작용의 이해를 돕기 위해, 이 예측인자들을 비교하는 산포도(도 4)를 구했다(밝은 회색 별은 암 재발 환자를 나타내고, 검은색 별은 암이 없는 환자를 나타낸다). KM에 의한 산포도의 분석은 샘플을 노모그램 점수만을 기반으로 하여 3 클러스터로 나눈 것을 의미한다. 그 후, 클러스터는 공지된 임상 파라미터를 기반으로 한다는 것을 발견했다. 점수가 가장 낮은 클러스터의 환자(116/117)는 기관-국한된 질환을 갖고 있었다. 점수가 중간인 클러스터의 환자(48/60)는 불량한 결과(즉, 피막 전반의 질환, 양성 림프절 질환 및/또는 양성 정낭 질환)와 연관이 있는 것으로 알려진 적어도 하나의 수술후 파라미터 및 낮은 수술전 PSA(<10ng/ml)를 갖고 있었다. 점수가 가장 높은 클러스터의 환자는 적어도 하나의 바람직하지 않은 수술후 파라미터와 높은 수술전 PSA를 보유했다. 그 다음, 점수가 낮거나 중간인 클러스터의 환자는 CCG 점수의 평균으로 나누었다. 최고 점수의 클러스터에 속한 환자의 결과는 노모그램에 의해 적당히 예측되어, 더 이상 나누지 않았다. 결과적으로, 산포도는 질병 재발률이 2%, 40%(2개의 그룹), 65% 및 80%인 5개의 환자 그룹을 정의한다(표 7). 총 5 그룹의 재발률 대 시간을 도 5에 제시했다.

도 4에 제시된 산포도는 CCG 시그니처와 수술후 노모그램 사이에 비선형 상호작용이 존재한다는 것을 시사한다. 즉, CCG 시그니처는 노모그램 점수가 낮은 환자에서 우수한 예측인자이다. 따라서, 본 연구는 다변량 모델에서 질병 재발을 예측하기 위한 상기 변수들 간에 상호작용의 통계학적 증거들에 대해 검사했다(표 8). 훈련 연구와 확인 연구 모두에서 유리한 상호작용에 대한 분명한 증거가 존재했다. 모델에 상호작용 항목의 혼입은 노모그램에 대해 조정한 후 CCG 시그니처의 예후적 유의성을 급증시켰다(p값은 훈련 코호트에서는 0.0015, 확인 코호트에서는 1.2x10^-8).

실시예 3

다음 연구는 시그니처에 포함하기에 최적인 CCG 수를 측정하는 것을 목표로 한다. 앞에서 언급한 바와 같이, CCG 발현 수준은 서로 상관성이 있어서, 적은 수의 유전자 측정이 질병 결과를 예측하는데 충분할 것이라는 것이 가능했다. 실제로, 표 3의 31 유전자 세트(패널 C)의 단일 CCG는 이하 표 9에 제시된 바와 같이 카탄-스티븐슨 노모그램에 유의적인 부가작용을 한다(노모그램 및 노모그램과 CCG 발현 간에 상호작용에 대해 조정한 후).

^* 완전(RP 후 노모그램 점수 + 세포 주기 발현 + 노모그램:세포 주기) 대 축소(RP후 노모그램 점수만) 재발에 걸리는 시간의 CoxPH 모델의 우도비 검사의 p값.

더 큰 CCG 세트의 얼마나 작은 서브세트(즉, 작은 CCG 패널)가 수행하는지를 평가하기 위해, 본 연구는 또한 시그니처가 이 시그니처에 포함된 CCG 수의 함수로서 얼마나 잘 결과를 예측하는지를 비교했다(도 1). 전립선 수술 후 화학적 재발에 걸리는 시간은 RP후 노모그램 점수에 의해 조정된 CCG 평균에 대해 회귀분석했다. 데이터는 199 FFPE 전립선암 샘플 및 26 CCG에 대한 델타CT로 표현되는 TLDA 분석으로 이루어지고, CoxPH 다변량 모델로 분석했다. p값은 완전 모델(노모그램 + 세포 주기 평균, 예컨대 상호작용) 대 축소 모델(노모그램만)의 우도비 검사의 p값이다. 이하 표 10과 도 1에 제시된 바와 같이, 작은 CCG 시그니처(예: 2, 3, 4, 5, 6 CCG 등)는 카탄-스티븐슨 노모그램에 유의적인 부가작용을 한다:

^*세포 주기 유전자의, 크기 1 내지 6의 1000개의 무작위 추출된 서브세트에 대해

실시예 4

본 실험의 목적은 극단적 전립선절제술 후 전립선암 환자의 PTEN 돌연변이와 생화학적 재발 사이의 연관성을 평가하는 것이다. PTEN의 체세포 돌연변이는 재발과 유의적인 연관성이 있는 것으로 발견되었고, 중요한 것으로, 전립선암 재발에 대해 확립된 임상 노모그램(카탄-스티븐슨 노모그램)과 CCG 시그니처 점수(상기 실시예 1 및 2에 기술됨) 이상으로 예후 정보를 부가했다.

환자 및 방법

804명의 일련의 RP 환자는 평균 9.5년 동안 추적했다. 이 환자의 특징과 전체 코호트의 치료 결과는 이미 보고되어 있다(Swanson et al., Urol Oncol.(2007) 25: 110-114). 분석에 충분한 조직을 이용한 최종 병리학적 평가로부터의 조직 블록 및/또는 슬라이드는 430명의 환자들에서 이용가능했다. 이 중 191명은 이용가능한 종양의 양을 기반으로 하여 PTEN 돌연변이 스크리닝을 위해 선발했다.

PTEN의 돌연변이 스크리닝을 위해 QIAamp DNA FFPE 조직 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 키트 프로토콜에 따라 사용하여 FFPE 종양 샘플로부터 게놈 DNA를 분리했다. FFPE 슬라이드는 먼저 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 병리학자가 종양 부위를 확인했다. 탈파라핀화 후, 종양 조직을 레이저 블레이드로 슬라이드로부터 떼어냈다. 몇몇 샘플에서 해부는 종양 세포의 분산으로 인해 레이저 포획 검경법(LCM)의 도움을 받았다.

돌연변이는 PTEN 게놈 서열에 신호를 보내는 서열분석 프라이머를 고안하여 검출했다. 이 프라이머는 서열분석을 용이하게 하는 M13 정방향 및 역방향 테일을 함유했다. 증폭 후, DNA 서열은 문헌[Frank et al., J.Clin.Oncol. (2002) 20:1480-1490]에 기술된 바와 같이 Mega BASE 4500(GE healthcare)에서 염료-프라이머 화학을 이용하여 결정했다. FFPE 물질 유래의 DNA의 서열분석과 관련된 기술적 어려움으로 인해, 각 돌연변이는 최소한 2종의 독립적인 증폭 및 서열분석 반응을 통해 검출했다.

통계학적 방법: 다른 언급이 없는 한, 생화학적 재발과 PTEN 돌연변이 간의 연관성은 재발에 걸리는 시간에 대해 Cox PH 모델을 이용해 평가했다. 수득된 p값은 귀무 모델(null model)과 검사 변수를 함유하는 모델을 비교하는 우도비 검사에서 유도되었다. 이 실시예(실시예 4)에서, CCG 시그니처는 26개 CCG로부터 유래되었다(표 2의 패널 D, 상기 참조). 모든 발현 데이터는 3 반복으로 수득했다. 발현 데이터는 26 CCG에 대한 평균 발현 수준을 계산하여 시그니처에 조합시켰다. 임상 데이터는 카탄-스티븐슨 노모그램에 포함된 변수였다.

결과

PTEN 돌연변이는 13 개체(13/191)에서 발견되었다. 191명의 환자 중 이 서브세트에서, PTEN은 생화학적 재발의 유의적인 예측인자였다(p값 = 0.031). 돌연변이 운반자의 재발률은 비-돌연변이 환자의 36%(64/178) 대비 69%(9/13)였다. 재발률의 차이는 또한 피셔의 정확도 검정(p값 = 0.034)에서도 유의적이었다. 임상 파라미터 데이터, CCG 시그니처 점수 및 PTEN 돌연변이를 보유한 환자의 서브세트에서, PTEN 상태는 임상 파라미터와 CCG 시그니처에 대한 조정 후 생화학적 재발의 유의적인 예측인자였다(p값 0.024). 마지막으로, CCG 시그니처와 PTEN 돌연변이의 조합은 임상 파라미터에 대해 조정한 후 CCG 시그니처를 사용하는 경우보다 임상 파라미터에 대해 조정한 후 결과의 우수한 예측인자였다(p값은 CCG 단독의 경우 0.0028인데 비해 조합 시에 0.0002). 이러한 결과는, PTEN 돌연변이가 임상 파라미터 또는 CCG 시그니처와 상관성이 없는 재발 가능성에 대한 정보를 제공하고 재발 위험을 평가하는 3가지 파라미터 전부를 사용하여 종래 가능했던 것보다 더욱 정확한 재발 확률의 추정치를 제공한다는 것을 보여준다.

실시예 5

본 실시예는 본 발명의 CCG 시그니처 일부 양태를 확인 및 개선하는 추가 연구에 대해 설명한다.

환자 및 방법

804명의 일련의 극단적 전립선절제술 환자는 평균 9.5년 동안 추적조사했다. 평균 연령은 67세였다. 임상 단계는 T1 34%, T2 66% 및 T3 <1%였다. 수술전 PSA 중앙값은 6.6 ng/ml로, 72% <10ng/ml, 28% >10ng/ml였다. 표본을 정하고, 임상 파라미터를 양성 방광목 또는 요도 변연, 피막 내 침입, 피막 전반의 연장, 양성 변연 및 정낭 연관성에 대해 기록했다. 생화학적 재발은 PSA >0.3 ng/ml로 정의했다. 이 연구에서 본 발명자들은 690명 환자들의 임상 데이터에 액세스했다. 분석에 충분한 조직을 이용한 최종 병리학적 평가 유래의 조직 블록 및/또는 슬라이드는 442명의 환자들에서 입수했다. 코호트는 훈련 코호트 195명, 확인 코호트 247명의 환자로 분류했다.

유전자 선택

126개 CCG와 47개 HK(하우스키핑) 유전자의 분석은 96명의 시중에서 입수한 익명의 전립선암 FFPE 샘플에 대하여 결과 또는 다른 임상 데이터없이 진행했다. 작업 가설은 분석이 동일한 기본 현상(CCG의 경우 종양 내의 세포 주기 증식, 및 HK 유전자의 경우 샘플 농축)을 다양한 정확도로 측정할 수 있다는 것이다. 분석은 개별 유전자와 전체 후보 유전자 평균 간에 피어슨 상관 계수로 등급화했고, 이것은 생물학적 활성의 가장 입수용이한 추정치이다. 126개 CCG 각각과 평균의 상관성에 대한 결과는 표 23에 기록했다. 평균 발현이 낮은 CCG를 제외하거나, 또는 샘플 손상을 산출하는 분석을 제외하고, CCG의 대략 절반은 0.58 미만의 상관성을 나타냈고, HK 유전자의 1/4은 0.95 미만의 상관성을 나타냈다. 이 분석은 기본 현상을 반영하지 않는 것으로 해석되어 제거했고, 56개 CCG(패널 G) 및 36 HK 후보 유전자의 서브세트(표 11 및 12)를 남겼다. 이 서브세트에 대한 상관계수를 재계산하고, 최종 선택은 등급화된 목록으로부터 이루어졌다.

유전자 발현

전체 RNA는 대표적인 5 μM 두께의 FFPE 종양 절편으로부터 추출했다. 샘플은 자일렌 배쓰를 이용하여 탈파라핀화하고 이어서 등급별 연속 에탄올 배쓰에서 수화시켰다. 그 후, 종양 영역을 병리학자 지시에 따라 레이저 날을 이용해 슬라이드로부터 절개했다. 대안적으로, 종양 영역은 에펜도르프 튜브 내로 직접 절개해 넣고, 자일렌을 이용하여 파라핀을 제거한 뒤, 에탄올로 세척했다. 그 후, 샘플은 프로테이나제 K 분해로 55℃에서 밤새 처리했다. 총 RNA는 RNeasy FFPE 또는 miRNeasy(Qiagen)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 추출했다(유일한 예외는 전술한 연장된 프로테이나제 K 분해이다). 분리한 총 RNA를 cDNA 합성 전에 DNase I(Sigma)로 처리했다. 이어서, 본 발명자들은 총 RNA를 일본쇄 cDNA로 변환시키기 위해 고용량 cDNA Archive Kit(Applied Biosystems)를 제조업자가 기술한 바와 같이 이용했다. RT 반응에는 최소 200ng RNA가 필요했다.

발현 수준을 측정하기 전에, cDNA는 TaqMan™ 분석을 함유하는 수집된 반응을 이용하여 예비증폭시켰다. 예비증폭 반응 조건은 95℃ 15초 및 60℃ 4분의 14회 사이클. 1차 사이클은 95℃에서 10분 항온처리를 포함하도록 변형시켰다. 증폭 반응물은 유전자 발현을 측정하기 위해 TaqMan™ Low Density Arrays(TLDA, Applied Biosystems) 위에 적재하기 전에 1X TE 완충액으로 1:20으로 희석했다.

CCG 점수

CCG 점수는 15 하우스키퍼 유전자(HK)에 의해 표준화된 31 CCG(패널 F)의 RNA 발현으로부터 계산한다. CCG(31) 및 HK 유전자(15)의 상대적 수는 CCG 점수의 분산을 최소화하도록 최적화했다. CCG 점수는 CCG 발현에 대한 CT 값의 비가중 평균으로, HK 유전자의 비가중 평균으로 표준화했고, 여기서 높은 값은 높은 발현을 시사한다. 1 단위는 발현의 2배 변화와 동등하다. 누락 값은 품질이 양호한 샘플만을 이용한 훈련 세트에서 측정된 각 유전자의 평균 발현을 이용하여 입력했다. CCG 점수는 평균 값으로 중심을 맞추고 훈련 세트에서 다시 측정했다.

CCG 점수의 측정 오차(se=0.10) 및 누락 값의 효과를 추정하기 위해 4가지 시판 전립선 샘플에 대해 희석 실험을 수행했다. CCG 점수는 농도가 총 31개 CCG 중 5개 실패 점으로 감소했을 때 안정성을 유지하는 것으로 발견되었다. 이러한 결과를 기초로 할 때, 4개 이상의 누락 값을 가진 샘플은 CCG 점수를 배정받지 못했다.

저위험군을 결정하기 위한 CCG 점수 역치는 훈련 세트 중에서 가장 낮은 재발 CCG 점수를 기반으로 했다. 그 다음, 역치는 이 검사의 음성 예측 값을 최적화하기 위해 1 표준편차 하향 조정했다.

임상 위험 모델

Cox 비례 위험 모델은 이용가능한 임상 파라미터 데이터를 정리하고 각 환자마다 생화학적 재발의 종래 임상 위험률을 추정하는데 사용했다. 이 데이터 세트는 훈련 세트 유래의 195개 증례와 임상 파라미터 정보는 있으나 RNA 발현을 측정하기에는 불충분한 샘플을 보유한 248개 다른 증례로 구성되었다. 일변량 검사는 결과와 연관이 있는 것으로 알려진 임상 파라미터에 대해 수행했다(이하 표 13 참조). 무의미한 파라미터는 이 모델에서 배제했다. 침입이 수술 절제면, 피막외 연장 또는 임의의 정낭 연관성, 방광목/요도 변연 또는 림프절로서 정의되는 기관-국한된 질환에 대해 복합 변수를 만들었다. 기관-국한된 질환에 대한 복합 변수는 일부가 서로 상관성이 있거나 우세하지도 않은 5가지 구성요소 중 어떤 것보다도 상기 모델에서 훨씬 유의적인 것으로 입증되었다. 모델 피팅은 수술 후 공변량에 대해 AIC 기준을 이용하여 수행했다.

최종 모델(즉, 노모그램)은 기관-국한된 질환에 대한 이원 변수, 6 이하의 글리슨 점수 및 log PSA에 대한 연속 변수를 보유한다(표 14). 이 모델은 RP 년수 및 글리슨 점수의 2 구성요소를 제외한, RP후 노모그램(즉, 카탄-스티븐슨 노모그램)에 포함된 모든 임상 파라미터를 포함한다. 종래 임상 위험의 분포는 3가지 상이한 결절을 보여준다(도 8). 중심이 3개인 K-평균 클러스터링은 저위험 클러스터의 역치를 정하는데 사용했고, 이는 샘플의 약 50%를 차지한다.

통계학적 분석

임상 파라미터는 연속 파라미터에 대해 스튜던트 t-검정, 분류별 파라미터에 대해 피셔의 정확도 검정을 이용하여, 훈련 세트와 확인 세트간에 비교했다. 수술 후 생화학적 재발에 대한 환자들의 종래 임상 위험은 7가지 공변량을 정리한 RP후 노모그램 점수로 추정했다. 이 노모그램 점수의 K-평균 클러스터링은 환자를 낮은 또는 높은 종래 임상 위험률로 분류하는데 사용했다. 발현 데이터는 15개 하우스키퍼 유전자의 평균에 의해 표준화된 각 CCG의 CT(형광 강도가 소정의 역치를 초과하는 PCR 사이클)로서 나타냈다(상기 표 12).

불량한 질의 샘플은 CCG 발현이 낮은 샘플을 우연히 배제하여 시그니처의 완전성을 손상시킴이 없이 모호한 판독 값 또는 불량한 질의 샘플을 제거하기 위해 분석으로부터 배제했다. 따라서, 데이터 클리닝 또는 필터링을 위한 역치는 보수적으로 정했다. CCG의 발현 수준보다 높은 각 샘플의 HK 유전자의 평균 발현 수준은 불량한 질의 샘플을 확인하는데 사용했다. 증폭 효율의 기계적 계량 및 반복물의 지나치게 높은 표준편차는 믿을 수 없는 CT 측정을 확인하는데 이용했다. CCG는 3 반복물 중에서 1회 초과의 실패, HK 유전자는 어떠한 실패도 허용되지 않았다.

임상 파라미터에 의해 예상된 임상 위험에 대해 조정한 후 생화학적 재발과 CCG 발현 간의 연관성은 재발에 걸리는 시간에 대한 콕스 비례 위험 모델을 이용하여 평가했다. 시간 의존성 없이 비례 위험 추정은 상호작용 항목을 보유한 이원 임상 파라미터 점수와 CCG 시그니처의 전체 모델에 대해 검사했고, 임상 위험 서브세트에서는 CCG 시그니처에 대해서만 검사했다. 훈련 세트에서든지 확인 세트에서든지 유의적이지 않았고, 이는 시간-의존성의 증거가 없음을 시사한다. 보고된 모든 p값은 축소 모델 또는 귀무 모델(null model)과 검사 변수를 함유하는 모델을 비교하는 우도비 검사로부터 유래된다. 카플란-마이어 플롯은 서브세트 환자의 추정된 생존 확률을 나타내는데 사용되며; 하지만, p값은 변수의 연속 값에 대한 Cox 우도비 검사에서 유래된다. 모든 통계 분석은 리눅스용 S+ Version 8.1.1(TIBCO Spotfire) 또는 R 2.9.0(http://www.r-project.org)에서 수행했다.

결과

본 발명자들은 RP 치료를 받은 442명의 전립선암 환자 유래의 FFPE 종양 절편으로부터 RNA를 분리했다. 코호트는 시그니처의 초기 특성화를 위한 195명의 환자("훈련 세트")와 확인을 위한 247명의 환자로 나누었다. 훈련 및 확인 코호트의 임상 파라미터는 표 15에 열거했다. 여러 비교들에 대해 조정한 후 유의적인 차이는 없었다.

본 연구를 위한 CCG 시그니처를 분석하기 위해, 본 발명자들은 96가지 전립선 종양 유래의 RNA에 대해 126개의 CCG를 검사했다(표 11). 종양 샘플은 익명이며 임상 데이터와 연관되지 않았다. 이 세트의 유전자로부터 당해의 시그니처(표 16)에 포함시키기 위한 31가지 유전자(패널 F)를 선택했다. 이 유전자들은 기술적 성능, 및 96가지 익명의 샘플에서 각 유전자가 전체 CCG 세트의 평균 발현 수준과 어느 정도의 상관성이 있는지를 기초로 하여 선택했다.

CCG 시그니처의 예측 유용성을 평가하기 위해, 훈련 세트의 195명 환자들에 대한 발현 데이터를 만들었다. 개별 유전자 발현 수준은 상관성이 있기 때문에, 31개 유전자 전체 세트의 평균 발현을 계산하고(패널 F) 15개 하우스키퍼로 표준화하여(표 12) 시그니처 점수에 조합했다. CCG 점수 분포는 0에서 중심을 맞추고, 각 점수 단위는 발현 수준의 2배 변화에 해당한다. 불량한 질의 샘플은 하우스키핑 유전자의 낮은 발현 또는 허용할 수 없는 CCG 실패 수를 관찰하여 확인하고, 분석에서 배제시켰다. 이러한 배제 규칙을 적용한 후, 분석에 유용한 140개 샘플을 얻었다. 생화학적 재발과 CCG 발현 간에 연관성은 재발에 걸리는 시간에 대한 Cox PH 모델을 이용하여 평가했다. 높은 CCG 발현 값은 단변량 분석(p값 = 0.01, 표 17)에서 질병 재발의 전조가 되었다.

다음으로, RP후 재발과 연관이 있는 것으로 알려진 임상 파라미터를 이해한 후, CCG 시그니처의 예후적 유용성을 평가했다. 당해 분석에서 임상 척도를 이해하기 위해, 수술전 PSA, 글리슨 점수 및 전립선 외측에서 질환의 증거(즉, 전립선벽 침범, 또는 림프절, 경계, 방광목, 요도 경계 또는 정낭에 대한 수술후 양성 병리 중 어느 하나)를 포함하는 모델/노모그램을 만들었다. 이 모델은, 임상 데이터를 보유하지만 확인 세트에 없었던 모든 환자들을 포함한 443명의 환자들에서 최적화되었고(표 13 및 14), 훈련 코호트에서 매우 유의적인 재발 예측인자였다(p값 = 2.5 x 10^-11). 이 임상 모델로부터 점수 분포는 고위험 환자 그룹과 저위험 환자 그룹을 분리하는 여러 방식을 포함했다(도 8). 따라서, 점수는 이후에는 이원 변수(높은 또는 저위험)로서 사용했다. 저위험 클러스터는 임상 파라미터의 일정 세트와 상관성이 있었다. 구체적으로, 대다수(215/218)는 기관-국한된 질환과 글리슨 점수 <7을 보유했다. 또한, 80%는 낮은 수술전 PSA(<10 ng/ml)를 보유했다. 고위험 클러스터의 환자(N=225)는 더 불균일했지만, 불량한 결과와 연관이 있는 것으로 알려진 임상 특징을 보유하는 경향이 있었다(예: 글리슨 >6 및/또는 피막 전반의 질환).

당해의 이원 임상 모델을 포함한 훈련 세트의 다변량 분석은 발현 시그니처와 임상 파라미터 간에 비선형 상호작용에 대한 증거를 보여주었다(표 17). 이 상호작용의 본질에 대한 이해를 돕기 위해, 이 예측인자를 비교한 산포도를 만들었다(도 8). 이 도면으로부터 분명한 것처럼, CCG 점수는 임상 파라미터에 의해 저위험으로 정의된 환자들에서 재발 위험을 평가하는데 유용한 것으로 입증되었다. 실제, 저위험 환자들 내에서 임상 모델에 대해 조정한 후에도, CCG 시그니처는 생화학적 재발의 강한 예측인자였다(p값 = 0.0071).

본 발명자들은 CCG 시그니처에 대한 최적화된 역치 점수인 -0.16을 확립하기 위해 산포도에 당해의 훈련 데이터를 사용했다(평균 CCG 점수는 0이다). 도 12는 이 실시예에서 연구된 443명의 환자들에 적용된 이 역치를 보여준다. 40%의 저위험 환자들은 이 역치 이하에 속하여, RP 후 10년 동안 재발이 없도록 선택했다(즉, 음성 예측값(NPV)은 100%). 임상 모델과 CCG 점수 모두에 대한 역치 값을 확립한 결과, 산포도는 재발률이 저위험 환자들에서 0%(낮은 CCG) 및 26%(높은 CCG); 고위험 환자들에서 60%(낮은 CCG) 및 50%인 4개의 섹션으로 나뉘었다.

다음으로, 당해의 확인 코호트에서 247명의 환자들에 대한 CCG 발현 데이터를 수득했다. 32개 샘플은 훈련 코호트에서 개발된 배제 규칙에 따라 추가 분석에서 제외시켰다. 패널 F는 단변량 분석에서 생화학적 재발의 유의적인 예측인자였다(p값 = 5.8x10^-8, 표 17). 이원 임상 모델에 대해 조정한 후, CCG 시그니처는 확인 코호트에서 재발 예측성이 높았고(p값 8.3x10^-7), 훈련 세트에서와 같이 변수 간에 비선형 상호작용에 대한 유의적인 증거가 있었다. CCG 시그니처는 임상적으로 정의된 위험의 전체 스펙트럼에 걸쳐서 정보를 제공했다(표 17). 훈련 결과의 확인 측면에서, 저위험 환자들에서 재발과 CCG 시그니처 간에 연관성에 대한 p값은 1.9x10^-4이었다.

본 발명자들은 당해의 훈련 코호트의 분석 유래의 CCG 역치를 당해의 확인 데이터 세트에 적용했다(도 9). CCG 점수가 역치 이하인 저위험 환자는 10년 예상 재발률이 5%였다(확인된 NPV 0.95에 해당). 종합해보면, CCG 점수와 임상 파라미터의 조합은 코호트를 10년 예상 재발률이 5%, 22%, 36% 및 70%인 4 그룹으로 나누었다(표 18). 확인 코호트에서의 환자들의 예상 재발률 대 CCG 점수는 도 10 및 11에 제시했다.

본 발명자들은 확인된 역치 대 저위험 환자의 다양한 정의를 시험했다(표 19). 시그니처 점수는 다양한 저위험 임상 정의에서 유의적인 예후적 지시인자였고, 정의에 따라 0.05 내지 0.10의 10년 예상 재발률이 수득되었다.

논평

본 발명자들은 전립선암의 예후적 분자 시그니처를 개발 및 확인했다. 시그니처는 세포 주기 유전자(CCG)의 mRNA 발현 수준의 측정을 기반으로 한다. 정의상, CCG의 발현은 세포 주기 단계의 함수로서 조절된다. 즉, 이것은 활성적으로 성장하는 세포에서 휴지기 세포보다 높은 CCG 발현 수준을 나타내도록 특정 세포 주기 단계에서 가동된다. 아마도, 이 사실은 암 진행을 예측하는 시그니처 능력의 기초가 된다. 이론적으로 국한하려는 것은 아니고, CCG의 발현 수준을 측정함으로써, 궁극적으로 전립선절제 후 전립선암 재발의 가능성에 영향을 치미는 종양의 성장속도 및 고유의 공격성이 간접적으로 측정된다.

본 연구와 예후적 분자 시그니처를 제조를 시도했던 많은 다른 연구들 간에는 중요한 차이가 있다. 종종, 유사 연구들은 매우 많은 수의 후보 바이오마커(때로는 1000개가 넘는 유전자)로 시작하고 그 다음 당해의 임상 표현형과의 연관성에 대해 평가된다. 이 시도는 때로 유도된 시그니처의 유의성을 불확실하게 할 수 있는 고유의 여러 검사를 받을 수 있다. 본원에서, 본 발명자들은 단일 가설만을 검사했다: CCG는 전립선암 예측성일 것이다(실제로, 본 발명자들은 재발 연관성을 바탕으로 한 것이 아니라 CCG 발현과의 상관성을 바탕으로 유전자를 선택했다). 그리고, CCG 발현이 상관성이 있기 때문에, 본 발명자들은 시그니처에 있는 모든 유전자의 평균 발현 값을 측정하여 예측성 시그니처에 발현 데이터를 조합시켰다. 생물학적 및 전산적으로 이 시도의 간단성은, 본 연구의 중심 주장이 매우 강건한 것으로, 후속 연구들에서 복제될 가능성이 있다는 견해를 지지한다.

CCG 시그니처(패널 F)는 독립적으로 예측성이지만, 수술후 질병 재발을 예측하는데 일반적으로 이용되는 임상 파라미터의 예측력에 유의적인 부가 효과가 있다. 이것은 본 발명의 훈련 코호트와 확인 코호트 모두에서 사실이다.

시그니처는 저위험의 임상 파라미터를 보이는 환자의 위험을 정의하는데 직접적으로 유용하다. 본원에서, 본 발명자들은 본질적으로 저위험을 글리슨 <7, PSA <10 및 기관-국한된 질병으로 정의했다. CCG 시그니처 점수는 저위험 그룹을 매우 낮은 재발률 환자(5%) 및 이보다 높은 재발률 위험 환자(22%)로 효과적으로 세분한다(도 9 및 표 18). 이것은 분자 시그니처의 가장 극적인 효과로서, 임상 파라미터를 기반으로 하여 저위험군으로 정의되었던 환자의 위험을 정확하게 재정의한다. 주목할 점은 이러한 환자 아집단(즉, 임상 파라미터를 기반으로 한 저위험군으로 정의된 환자) 내에서 임상 파라미터는 특히 예후적이지 않다는 점이다(표 17 참조). 따라서, 진단 검사로서, 시그니처는 다수의 환자에게 유용할 수 있다. 본 연구에서, 코호트의 약 60%는 저위험군으로 규명되었고, 이 중 40%는 낮은 CCG 점수를 보유하는 것으로 예상된다. 따라서, CCG 시그니처는 고위험군으로 종래 확인되었던(따라서, 극단적 전립선절제의 후보로 확인되었던) 환자의 1/4에서 진행이 더딘 질병을 예측할 수 있다. 마지막으로, 확인 데이터는 특히 CCG 시그니처가 모든 환자들의 위험을 정의하는데 유용할 수 있다는 것을 시사한다. 구체적으로, 임상 파라미터에 따라 고위험군으로 정의되었던 환자를 재발률이 30% 및 70%인 환자로 분류하는 것을 도왔다(표 18).

임상 파라미터와 CCG 시그니처의 조합은 의사가 수술 실패의 위험을 더욱 정확하게 예측할 수 있게 하고, 이에 따라 치료 중재의 적당한 과정을 확인할 수 있게 한다. 제시한 바와 같이, 시그니처는 비공격적 질환의 일반적인 임상 파라미터를 보이는 환자들의 재발 예측을 극적으로 향상시킨다(표 19). 이러한 임상 서브그룹 내에서, 낮은 CCG 점수를 보유한 환자는 추가 치료가 전혀 시사되지 않는 절대적인 재보증으로부터 유익을 얻을 수 있다. 이에 반해, 높은 CCG 그룹은 즉각적인 중재를 정당화할 수 있다. 바람직하지 않은 수술후 임상 파라미터를 보유한 환자는 보조 방사능요법이 유익할 수 있다. 따라서, CCG 시그니처는 저위험의 임상 특징과 높은 CCG 점수를 보유한 환자에게 보조 방사능의 효능을 예측해주어야 한다. 확인 코호트에서, 높은 CCG 점수와 전립선 이상의 질환을 보유한 환자는 재발률이 70%로, 보조 방사능 치료의 바람직한 후보인 환자를 분명하게 확인해주어야 한다. 따라서, 임상 파라미터와 CCG 시그니처의 조합은 더욱 정확하게 정의된 환자 위험을 분명하게 지도하여 추가 치료의 필요성에 대한 더욱 이성적인 평가를 가능하게 해준다.

실시예 6

본 명세서에 기술된 CCG 패널의 일부는 추가 암을 예측하는 능력에 대해 다시 평가되었다. 패널 C, D 및 F는 방광암, 뇌암, 유방암 및 폐암에서 다양한 정도로 예측성인 것으로 밝혀졌다.

방법

유전자 발현 및 환자 데이터는 다음과 같은 공개 데이터세트에서 입수했다: GSE7390(Desmedt et al., Clin. Cancer Res. (2007) 13:3207-14; PMID 17545524); GSE11121 (Schmidt et al., Cancer Res. (2008) 68:5405-13 ; PMID 18593943); GSE8894 (Son et al.; 간행물 없음); Shedden (Shedden et al., Nature Med. (2008) 14:822; PMID 18641660); GSE4412 (Freije et al., Cancer Res. (2004) 64:6503-10; PMID 15374961); GSE4271 (Phillips et al., Cancer Cell (2006) 9:157-73; PMID 16530701); GSE5287 (Als et al., Clin. Cancer Res. (2007) 13:4407-14; PMID 17671123). 이 데이터세트들은 각각 발현 및 환자 데이터를 수집하는데 사용된 실험 절차의 연관된 상세한 설명을 보유한다. 각 데이터세트를 제작하는데 사용된 발현 마이크로어레이는 이하 표 20에 정리했다.

패널 C, D 및 F에 각 유전자들의 발현 데이터는 이 데이터세트로부터 수집했고, 각 패널의 평균 발현 수준은 임상 결과가 알려진(예: 재발, 진행, 무진행 생존, 절대 생존 등) 각 환자마다 측정했다. CCG 점수는 패널에 있는 유전자들의 평균 발현이다. 유전자가 어레이에서 1보다 많은 프로브 세트에 의해 표시된다면, 유전자 발현은 이 유전자를 표시하는 모든 프로브 세트의 평균 발현이다. CCG 점수와 생존 또는 질병 재발 간의 연관성은 단변량 및 다변량 Cox 비례 위험 모델을 사용하여 검사했다. 다변량 분석은 관련 임상 파라미터(뇌암 등급, 폐암 병기, 유방암 NPI)가 이용가능할 때 수행되었다.

결과

이하 표 21에 제시된 바와 같이, 단변량 분석에서 각 패널은 분석된 각 암의 예후적 인자였다.

이하 표 22에 제시된 바와 같이, 각 패널은 또한 적어도 하나의 임상 파라미터(또는 노모그램)과 조합되었을 때 다변량 분석에서 예측성이었다.

이하 표 23은 평균 CCG 발현과의 상관성에 따라 CCG를 선택하는 순위를 제공한다.

이하 표 1은 많은 CCG의 목록을 제공하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 명세서에 언급된 모든 공보와 특허원은 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련된 자의 수준을 나타낸다. 모든 공보와 특허원은 각 개별 공보 또는 특허원이 특별하고 개별적으로 참고 인용되는 것과 동일한 정도로 참고인용된다. 공보와 특허원의 단순한 언급은 이들이 본 발명에 대한 선행 기술이라는 것을 반드시 인정하는 것은 아니다.

이상의 발명은 이해를 명료하게 하기 위한 예시 및 실시예에 의해 약간 상세하게 설명했지만, 첨부된 특허청구범위 내에서 특정 변화 및 변형이 수행될 수 있음은 자명하다.

Claims

적어도 2종의 세포 주기 유전자를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정함을 포함하는 암 분류 방법으로서, 여기서 비정상적 세포 주기 유전자 상태는 불량한 예후를 시사하는, 암 분류 방법.
환자로부터 수득된 샘플에서 적어도 2종의 세포 주기 유전자를 포함하는 유전자 패널의 상태를 측정함을 포함하는, 시험관내 진단 방법.
암 환자의 적어도 하나의 임상 파라미터를 측정하고 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 적어도 하나의 세포 주기 유전자의 상태를 측정함을 포함하는, 시험관내 진단 방법.
제3항에 있어서, 상기 세포 주기 유전자가 표 1에 열거된 또는 패널 A 내지 G 중 임의의 패널에 열거된 유전자 중에서 선택되는, 방법.
암 환자의 적어도 하나의 임상 파라미터를 측정하고 상기 환자로부터 수득된 샘플에서 적어도 하나의 세포 주기 유전자의 상태를 측정함을 포함하는 암 분류 방법으로서, 여기서 재발-연관된 임상 파라미터 또는 비정상적 세포 주기 유전자 상태는 불량한 예후를 시사하는, 암 분류 방법.
제3항 또는 제5항에 있어서, 2종 이상의 임상 파라미터를 측정함을 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 2종 이상의 임상 파라미터가 노모그램을 형성하거나 노모그램의 일부인, 방법.
제7항에 있어서, 상기 노모그램이 카탄-스티븐슨(Kattan-Stephenson) 노모그램의 임상 파라미터 또는 노팅엄 예후 지수(Nottingham Prognostic Index)의 임상 파라미터를 포함하는, 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 환자로부터 수득한 샘플에서 PTEN의 상태를 측정함을 추가로 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자로부터 수득한 샘플에서 PTEN의 상태를 측정함을 추가로 포함하고, 여기서 비정상적 세포 주기 유전자 상태 또는 비정상적 PTEN 상태는 불량한 예후를 시사하는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 환자로부터 수득한 샘플에서 PTEN의 상태를 측정함을 추가로 포함하고, 여기서 비정상적 세포 주기 유전자 상태, 재발-연관된 임상 파라미터 또는 비정상적 PTEN 상태 중 어느 하나는 불량한 예후를 시사하는, 방법.
제1항, 제3항, 제5항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 전립선암, 방광암, 뇌암, 유방암 및 폐암으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 암이 전립선암이고, 상기 패널이 패널 A 내지 G 중 어느 한 패널에 속한 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 2종 이상의 유전자를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 암이 방광암, 뇌암, 유방암 및 폐암 중에서 선택되고, 상기 패널이 패널 B, C 및 F 중 어느 한 패널에 속한 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 2종 이상의 유전자를 포함하는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 암이 전립선암이고, 상기 노모그램이 카탄-스티븐슨 노모그램의 임상 파라미터를 포함하는, 방법.
제8항에 있어서, 상기 암이 유방암이고, 상기 노모그램이 노팅엄 예후 지수의 임상 파라미터를 포함하는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 임상 파라미터가 종양 병기, 종양 등급, 종양 크기, 림프절 상태, 조직학, 수행 상태, 수술 종류, 수술 절제면, 치료 종류, 발병 연령, PSA 수준 및 글리슨(Gleason) 점수로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
제1항, 제2항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 패널이 표 1에 또는 패널 A 내지 G 중 임의의 패널에 속한 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 2종의 유전자를 포함하는, 방법.
제1항, 제2항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 패널이 적어도 10개의 세포 주기 유전자를 포함하는, 방법.
제19항에 있어서, 상기 패널이 표 1에 또는 패널 A 내지 G 중 임의의 패널에 속한 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 10개의 유전자를 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 10개의 유전자가 상기 패널에 속한 유전자의 적어도 75%를 구성하는, 방법.
제1항, 제2항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 패널이 적어도 15개의 세포 주기 유전자를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 패널이 표 1에 또는 패널 A 내지 G 중 임의의 패널에 속한 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 15개의 유전자를 포함하는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 15개의 유전자가 상기 패널에 속한 유전자의 적어도 75%를 구성하는, 방법.
제1항, 제2항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 패널이 적어도 20개의 세포 주기 유전자를 포함하는, 방법.
제25항에 있어서, 상기 패널이 표 1에 또는 패널 A 내지 G 중 임의의 패널에 속한 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 적어도 20개의 유전자를 포함하는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 26개의 유전자가 상기 패널에 속한 유전자의 적어도 75%를 구성하는, 방법.
제1항, 제2항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 패널이 패널 A 내지 G로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
제1항, 제5항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포 주기 유전자의 상태를 측정하는 것이
(a) 상기 세포 주기 유전자에 의해 암호화된 핵산의 수준을 측정하는 것;
(b) 상기 세포 주기 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 수준을 측정하는 것;
(c) 상기 세포 주기 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 활성을 측정하는 것;
(d) 상기 세포 주기 유전자의 메틸화 상태를 측정하는 것; 또는
(e) 상기 세포 주기 유전자의 발현을 조절하는 miRNA의 발현 및/또는 활성의 수준을 측정하는 것
중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
제1항, 제5항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비정상적 세포 주기 유전자 상태가
(a) 상기 세포 주기 유전자에 의해 암호화된 핵산의 증가된 발현 수준;
(b) 상기 세포 주기 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 증가된 발현 수준; 또는
(c) 상기 세포 주기 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 증가된 활성
중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
전립선암 환자의 치료 방법으로서, 상기 환자의 적어도 하나의 임상 파라미터를 측정하고, 상기 환자로부터 수득한 샘플에서 적어도 하나의 세포 주기 유전자의 상태를 측정하고, (a) 상기 환자가 적어도 하나의 위험-연관된 임상 파라미터 및 상기 세포 주기 유전자의 상승된 상태를 보유한다면, 능동적인 치료를 권고, 처방 또는 개시하거나, (b) 상기 환자가 위험-연관된 임상 파라미터 및 상기 세포 주기 유전자의 상승된 상태를 보유하지 않는다면, 대기요법(watchful waiting)을 권고, 처방 또는 개시함을 포함하는, 전립선암 환자의 치료 방법.
제19항에 있어서, 상기 환자로부터 수득한 샘플에서 PTEN의 상태를 측정함을 추가로 포함하고, 여기서 적어도 하나의 위험-연관된 임상 파라미터의 존재, 상기 세포 주기 유전자의 상승된 상태 및/또는 낮은 또는 음성 PTEN 상태는 상기 환자의 증가된 재발 가능성을 시사하는, 방법.
(a) 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 환자의 CCG 상태, 임상 파라미터 및/또는 PTEN 상태에 대한 정보를 액세스하고;
(b) 상기 정보를 조회하여, 상기 환자로부터 수득한 샘플이 적어도 하나의 CCG의 증가된 발현을 나타내는지의 여부, 상기 환자의 재발-연관된 임상 파라미터의 보유 여부 및/또는 상기 환자의 낮은/음성 PTEN 상태의 보유 여부 중 적어도 하나를 측정하고;
(c) 상기 샘플의 CCG 발현 상태, 상기 환자의 재발-연관된 임상 파라미터 상태 및/또는 상기 샘플의 PTEN 상태를 출력함을 포함하는, 컴퓨터-기반(computer-implemented) 치료 방법.
환자의 증가된 재발 가능성 보유 여부를 측정하는 컴퓨터-기반 방법으로서,
(a) 컴퓨터 판독가능 매체에 저장된 환자의 PTEN 상태 또는 임상 파라미터 및 CCG 상태에 대한 정보를 액세스하고;
(b) 상기 정보를 조회하여, 상기 환자의 낮은/음성 PTEN 상태의 보유 여부 또는 상기 환자의 재발-연관된 임상 파라미터의 보유 여부 중 적어도 하나를 측정하고;
(c) 상기 정보를 조회하여, 상기 환자로부터 수득한 샘플이 적어도 하나의 CCG의 증가된 발현을 나타내는지의 여부를 측정하고;
(d) 상기 환자가 낮은/음성 PTEN 상태 또는 재발-연관된 임상 파라미터를 보유하고 상기 샘플이 적어도 하나의 CCG의 증가된 발현을 나타낸다면, 상기 환자가 증가된 재발 가능성을 보유한다는 표시를 출력함을 포함하는, 방법.
적어도 75%의 세포 주기 유전자를 포함하는 유전자 패널의 발현 수준을 측정하기 위한 다수의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트.
제35항에 있어서, 상기 세포 주기 유전자가 표 1에 또는 패널 A 내지 G 중 임의의 패널에 속한 유전자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 키트.
제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 유전자 패널이 적어도 6개의 세포 주기 유전자를 포함하는, 키트.
제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 유전자 패널이 10개 이상 2500개 이하의 세포 주기 유전자를 보유하는, 키트.
제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 주기 유전자가 상기 패널에 속한 유전자 전체 개수의 적어도 90%를 차지하는, 키트.
제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드가 PCR 프라이머 또는 하이브리드화 프로브인, 키트.
환자의 암의 예후 또는 재발 가능성을 측정하는데 유용한 진단 제품의 제조를 위한, 적어도 75%의 세포 주기 유전자를 포함하는 유전자 패널의 발현 수준을 측정하기 위한 다수의 올리고뉴클레오타이드의 용도.
제41항에 있어서, 상기 다수의 올리고뉴클레오타이드가 제35항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 것인, 용도.