KR20110111266A - 면역글로불린 단편을 이용한 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 난포자극 호르몬 (human follicle stimulating hormone), 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결된 인간 난포자극 호르몬 결합체를 포함하는 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제는 인간 난포자극 호르몬의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되는 효과가 있다.

Description

면역글로불린 단편을 이용한 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제 {Long-acting human follicle-stimulating hormone formulation using immunoglobulin fragment}
본 발명은 인간 난포자극 호르몬, 비펩타이드성 중합체 및 면역글로불린 Fc 영역이 상호 공유결합에 의해 연결된 인간 난포자극 호르몬 결합체를 포함하는 생체 내 지속성 및 안정성이 향상된 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제는 인간 난포자극 호르몬의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되는 효과가 있다.
불임이란 일반적으로 결혼 후 원만한 부부관계를 가져도 일정기간이 지나도록 임신을 못하는 상태로 이 일정기간을 보통은 1년으로 보지만 의사들에 따라서는 2~3년으로 보는 경우도 있다. 일반적인 경우 결혼 후 1년 내에 85% 정도가 임신을 하게 되며 임신 가능성은 결혼 1개월 내에 25%, 6개월 내에 70%, 1년 내에 85%정도로 조사되고 있다. 남녀의 임신능력은 남녀 모두 24세에 최고가 되고 이후 매 5년마다 임신에는 2배의 기간이 더 필요하게 되며 35세 이후의 임신능력은 급격히 저하된다고 알려져 있다.
불임은 남녀 모두에게 또는 남자나 여자 쪽에 원인이 있는 경우로 분류되며 남자 쪽에 불임의 원인이 있을 때를 남성 불임증, 여자 쪽에 불임의 원인이 있는 경우를 여성 불임증이라 명한다. 통계적으로 남성불임증 또는 여성 불임증이 합하여 70%, 남성, 여성 불임이 복합하여 20% 가량이고 그밖에 원인불명 요인이 10~15% 정도 되는 것으로 알려져 있다.
불임치료제 시장은 전 세계적으로 2006년에 10억불을 넘어섰고, 매년 6% 대의 성장률을 나타내며 2011년에는 12억불을 초과 할 것으로 예상되고 있다. 국내 시장의 경우 2006년 90억에서 2007년 120억으로 가파른 성장세를 나타내고 있으며, 향후 5년 동안 괄목할 만한 성장 가능성이 내포되어 있는 것으로 예상되고 있다.
불임치료제는 일명 배란유도제를 말하며, 대표적인 배란 유도제는 인간 난포자극 호르몬 (human follicle stimulating hormone)으로 뇌하수체에서 생산되어 내분비계에 분비되는 호르몬으로 각각 92개와 111개의 아미노산으로 구성된 알파와 베타 서브유니트가 비공유결합에 의해 연결되어 있으며, 각 서브유니트는 2개씩의 아스파라긴에 의해 연결되는 당쇄를 갖고 있는 당단백질 호르몬이다 (Mol Hum Reprod, 1996; 2(5): 371-382). 여성의 경우 난포자극 호르몬의 생산, 또는 분비정도가 불충분한 경우 배란 유도가 정상적으로 이루어지지 않아 불임을 초래하게 되며, 남성의 경우 정상적인 충분한 수의 정자 형성이 제한되어 불임의 원인이 된다. 따라서 이러한 환자들의 치료를 위해 난포자극 호르몬이 사용되게 되었으며, 처음에는 여성의 뇨료부터 난포자극 호르몬을 분리, 정제하여 사용하였으나, 다른 대부분의 단백질 제제와 마찬가지로 특히 안전성이 문제가 대두되면서 현재는 시장의 80％ 이상이 재조합 제품으로 대치되어 있다. 대표적인 제품으로 머크세로노 (MSD)의 ‘고날에프 (Gonal-F)’와 오가논 (Organon)의 ‘퓨레곤 (Puregon)’ 등이 있다.
여성 불임의 원인은 크게 배란 장애와 난관 폐색이 각각 35%를 차지하며, 자궁내막증이 20%, 그리고 정확한 원인이 파악되지 않는 경우가 10%인 것으로 알려져 있다. 여성 불임의 치료를 위해 사용되는 보조생식술에는 체외수정 (IVF-ET), 생식체 나팔관내 주입법 (GIFT), 접합자 나팔관내 주입법 (ZIFT), 그리고, 세포질내 정자주입법 (ICSI)등이 있으며, 이러한 프로그램의 진행을 위해서는 배란 유도가 필요하며, 이 때 사용되는 것이 인간 난포자극 호르몬이다. 또한 무배란증을 겪는 여성에게도 이 호르몬은 사용되고 있다. 남성 불임의 원인은 크게 정자 이상인 경우와 해부학적인 요인에 의한 이상으로 나누어지며, 정자 이상인 경우 인간 난포자극 호르몬이 치료를 위해 사용되어 질 수 있다.
여성 불임을 위한 치료에 FSH가 사용되는 경우, 우선 보조생식 프로그램에 있어서는 배란주기 시작 후, 2~3일 째부터 매일 150 IU~225 IU 단위로 투여하기 시작하여 최대 매일 450 IU까지 투여가능하며, 적절한 난포 발달 때까지 적게는 5일에서 최대 20일 정도까지 투여하게 된다. 무배란증에 적용할 때에는 75~150 IU 단위로 시작하여 필요에 따라서 7일 또는 14일 간격으로 37.5 IU 또는 75 IU 단위로 최대 일일 225 IU까지 투여하게 되며, 최장 4주까지 투여하게 된다. 남성 불임에 FSH이 사용되는 경우에는 주에 3회 간격으로 150 IU 단위로 최대 300 IU까지 투여하게 되며, 최장 18 개월까지 투여하게 된다.
현재 사용 중인 재조합 인간 난포자극 호르몬은 과거의 뇨유래 인간 난포자극 호르몬에 비하여 제조 시의 낮은 정제 수율과 공급의 불안정성 및 특히, 안전성의 측면에 있어서 뚜렷이 개선되었으나, 아직도 환자의 편의성 측면에서는 치료기간 동안 10회 이상 매일 투여 받아야만 하는 불편함이 있으며, 남자 환자의 경우 최장 18개월까지 치료를 받아야하기 때문에 많은 투여량에 따른 경제적 부담이 단점으로 대두되고 있다. 이러한 불임 치료는 여성, 남성 모두에게서 1회에 완료되는 것이 아니라, 임신에 성공할 때까지 지속적으로 이루어져야하기 때문에 특히, 투여 횟수는 줄어들면 줄어들수록 환자의 편의성이 증대될 것이며, 비용적인 측면에서도 적은 용량으로 적게 투여 받을수록 유리할 것으로 기대되어 다른 단백질 제품들의 개발 전략과 마찬가지로 지속형 제품이 절실히 요구되고 있다.
이러한 요구에 따라, 지속형 제품에 대한 연구가 시작되어 hyperglycosylated FSH (MerckSerono사) 또는 CTP (carboxy terminal peptide)를 포함하는 FSH-CTP (Schering-plough사) 제형이 임상 시험을 진행 중에 있다. 이 중 hyperglycosylated FSH는 천연형 FSH의 짧은 반감기를 극복하기 위해 아미노산 일부를 치환하여 고당쇄 FSH를 개발 (WO-2005020934)하여 임상 2상을 진행 중이나 증가된 반감기가 천연형에 비해 2배가 되지 않아 FSH-CTP (corifollitropin alfa)보다 반감기가 짧은 것으로 보고되고 있으며, 아미노산의 변형에 의해 면역학적 문제를 일으킬 가능성이 있다. FSH-CTP (US5585345)는 FSH와 같은 성선자극호르몬의 하나인 융모성선자극 호르몬 (human corionic gonadotropin)의 베타 서브유니트의 carboxy terminal peptide를 FSH의 베타 서브유니트에 아미노말단에 연결한 것이다. CTP는 구성 아미노산 중 4개의 serin 잔기에 당쇄화가 되어 있어서 FSH에 비하여 hCG의 혈중 반감기를 현저히 증가시킨다고 알려져 있다 (Hum Reprod, 2002; 17(8): 1987-1993). 현재 쉐링-푸라우 (schering-plough)에 의해 임상 3상 시험이 수행 중에 있으며, 여성 환자의 보조생식 프로그램에 대해 시험한 결과 효능은 기존의 FSH와 비슷하며, 약을 투여 받은 여성이 임신될 확률은 기존 제품과 지속형 제품 모두 38% 정도였고, 일주일 제형까지만 가능하다고 보고되었다. 그러나 상기에 기술한 바와 같이 특히 보조생식 프로그램에서 난포가 적절히 발달하는 평균 환자마다 차이는 있으나 평균 기간이 10일 정도로 알려져 있어서 일주일 제형 제품을 사용하는 경우 추가적으로 몇 차례의 천연형 FSH의 투여가 필요로 하는 경우가 발생할 수 있다. 또한 FSH-CTP는 초기 투여량이 천연형 FSH의 일주일 총 양보다 높아 과난소자극 증후군 등의 부작용을 일으킬 가능성이 높다.
이에, 본 발명자들은 인간 난포자극 호르몬의 혈중반감기 증가 및 생체 내 활성유지를 동시에 극대화할 수 있는 방법으로 면역글로불린 Fc 영역, 두 말단 또는 세 말단의 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체 및 난포자극 호르몬을 공유결합에 의해 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 부위 선택적으로 또는 N-말단에 상호 연결시키는 제조방법을 사용하여 결합체의 생체 내 효력 지속효과가 획기적으로 증가됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 난포자극 호르몬의 생체 내 활성을 유지하면서 혈중 반감기를 연장시켜 월등히 우수한 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제, 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 인간 난포자극 호르몬 및 면역글로불린 Fc 영역이 두 말단 또는 세 말단에 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 통하여 상호 공유결합에 의해 연결된 인간 난포자극 호르몬 결합체를 포함하는, 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 인간 난포자극 호르몬은 뇌하수체에서 생산되어 내분비계에서 분비되는 당단백질 호르몬으로서 난소에서 난포의 생산, 발달 및 성숙을 자극하는 기능을 보유하고 있으며, 알파 서브유니트와 베타 서브유니트의 아미노산 서열은 아래와 같다 :
알파 서브유니트
APDVQDCPECTLQENPFFSQPGAPILQCMGCCFSRAYPTPLRSKKTMLVQKNVTSESTCCVAKSYNRVTVMGGFKVENHTACHCSTCYYHKS (서열번호 1)
베타 서브유니트
NSCELTNITIAIEKEECRFCISINTTWCAGYCYTRDLVYKDPARPKIQKTCTFKELVYETVRVPGCAHHADSLYTYPVATQCHCGKCDSDSTDCTVRGLGPSYCSFGEMKE (서열번호 2)
구체적인 일 양태로서 본 발명에서 사용한 인간 난포자극 호르몬은 동물세포를 이용한 재조합 단백질 생산 방법으로 생산 가능하다.
또한, 본 발명에서 인간 난포자극 호르몬은 다양한 부위에서 비펩타이드성 중합체와 결합될 수 있다. 예를 들어, 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와도 공유결합을 형성할 수 있다. 반응 pH를 달리하며 페길화(PEGylation) 반응을 진행한 후, 이온교환 컬럼을 사용하여 반응 혼합물로부터 위치이성질체를 분리할 수 있다.
N-말단 이외의 위치에 커플링 할 경우, 천연형 아미노산 서열에서 수식하고자 하는 아미노산 잔기 위치에 반응성 티올 그룹을 도입하여 비펩타이드성 중합체의 말레이미드 링커를 사용하여 공유결합을 형성할 수 있다.
비펩타이드성 중합체에 알데히드 링커를 사용하면 N-말단과 라이신 잔기에 있는 아민 그룹과 반응하며, 선택적으로 반응 수율을 향상시키기 위해 변형된 형태의 인간 난포자극 호르몬을 사용할 수 있다. 예를 들어, N-말단을 블러킹하는 방법, 라이신 잔기 치환 방법, 카르복시 말단에 아민 그룹을 도입하는 방법 등을 사용하여 반응할 수 있는 아민 그룹을 원하는 위치에 하나만 유지할 수 있고, 페길화 및 커플링 수율을 향상시킬 수 있다. N-말단의 보호방법은 디메틸화 (dimethylation) 외에 메틸화 (methylation), 탈아미노화 (deamination) 또는 아세틸화 (acetylation) 방법으로도 가능하며, 이러한 알킬화 (alkylation) 방법에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 본 발명의 인간 난포자극 호르몬 결합체는 난포자극 호르몬의 N-말단에 특이적으로 면역글로불린 Fc 영역이 결합 된 인간 난포자극 호르몬 결합체이다. 인간 난포자극 호르몬의 알파 서브유닛과 베타 서브 유닛의 N-말단은 수용체와의 결합에 관여하지 않으므로, 본 발명은 인간 난포자극 호르몬의 N-말단에 특이적으로 Fc 영역이 결합시킴으로써 인간 난포자극 호르몬의 활성을 유지하면서도 생체 내 반감기가 증가되는 효과의 우수성을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "활성"이란 인간 난포자극 호르몬이 인간 난포자극 호르몬 수용체에 결합하여 인간 난포자극 호르몬의 작용을 할 수 있는 것을 의미한다.
상기와 같은 N-말단 특이적 결합체의 제조는 pH 조절에 의해서 일어나며, 바람직한 pH 범위는 4.5 내지 7.0이다.
본 발명에서 용어, "N-말단"은 "N-말단 영역"과 혼용될 수 있다.
구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 인간 난포자극 호르몬의 N-말단에 선택적으로 커플링하기 위한 방법으로, 두 말단의 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하는 경우 천연형 인간 난포자극 호르몬에 PEG를 결합시킬 때 pH 6.0으로 반응시켜 N-말단의 페길화 반응을 유도하였으며, 다른 방법으로 세 말단의 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하는 경우에는 인간 난포자극 호르몬에 PEG를 결합시킬 때 몰 비를 다르게 하여 pH 6.0에서 반응을 유도하였다. 세 말단을 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하는 경우 PEG의 사용 양이 양 말단을 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하는 경우보다 줄어들 수 있기 때문에 수율이 증가될 수 있다.
면역글로불린 Fc 영역은 생체 내에서 대사되는 생분해성의 폴리펩타이드이기 때문에, 약물의 캐리어로 사용하기에 안전하다. 또한, 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린 전체 분자에 비해 상대적으로 분자량이 적기 때문에 결합체의 제조, 정제 및 수율 면에서 유리할 뿐만 아니라, 아미노산 서열이 항체마다 다르기 때문에 높은 비균질성을 나타내는 Fab 부분이 제거되기 때문에 물질의 동질성이 크게 증가되고 혈중 항원성의 유발 가능성도 낮아지게 되는 효과도 기대할 수 있다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역, 중쇄 불변영역 1(CH1)과 경쇄 불변영역(CL1)을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 의미하며, 중쇄 불변영역에 힌지(hinge)부분을 포함하기도 한다. 또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH 3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수 도 있다. 즉, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 (1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, (2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, (3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, (4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, (5) 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, (6) 중쇄 불변영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체(mutant)를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다. 예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다. 또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York,197 9). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식 (modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동일한 생물학적 활성을 나타내나 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 유도체다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간 및 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체 일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 얻을 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다.
바람직하게는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, "비당쇄화(Aglycosylation)"는 원핵동물, 바람직하게는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 바람직하게는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 가장 바람직하게는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다.
본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 Fc 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 바람직하게는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 바람직하게는 보체 의존적 독성(CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다. 즉, 가장 바람직한 본 발명의 약물의 캐리어용 면역글로불린 Fc 영역은, 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역 이다. 인간 유래의 Fc 영역은 인간 생체에서 항원으로 작용하여 이에 대한 새로운 항체를 생성하는 등의 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 수 있는 비-인간 유래의 Fc 영역에 비하여 바람직하다.
본 발명에서 "비펩타이드성 중합체"는 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다.
본 발명에 사용가능한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리옥시 에틸화 폴리올, 폴리비닐 알콜, 폴리사카라이드, 덱스트, 폴리비닐 에틸에테르, PLA(폴리락트산, polylactic acid) 및 PLGA(폴리락틱-글리콜산, polylactic-glycolic acid)와 같은 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜이다. 당해 분야에 이미 알려진 이들의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
기존 인프레임 퓨전(inframe fusion) 방법으로 제조된 융합단백질에서 사용된 펩타이드성 링커의 단점은 생체 내에서 단백질분해효소에 의해 쉽게 절단되어 캐리어에 의한 활성약물의 혈중반감기 증가 효과를 기대만큼 얻을 수 없다는 것이다. 그러나, 본 발명에서는 단백질분해효소에 저항성있는 중합체를 사용하여 캐리어와 유사하게 펩타이드의 혈중반감기를 유지할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용될 수 있는 비펩타이드성 중합체는 상기와 같은 역할, 즉 생체 내 단백질분해효소에 저항성 있는 중합체이면 제한없이 사용될 수 있다. 비펩타이드성 중합체의 분자량은 1 내지 100 kDa 범위, 바람직하게는 1 내지 20 kDa 범위이다. 또한, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 중합체는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 비펩타이드성 중합체는 면역글로불린 Fc 영역 및 단백질 약물과 결합될 수 있는 반응기를 가진다.
상기 비펩타이드성 중합체의 양 말단 반응기는 반응 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹 및 석시니미드(succinimide) 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 프로피오네이트, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있다. 특히, 상기 비펩타이드성 중합체가 두 개의 양 말단 또는 세 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 경우, 비특이적 반응을 최소화하고, 비펩타이드성 중합체의 양 말단에서 생리활성 폴리펩타이드 및 면역글로불린과 각각 결합하는데 효과적이다. 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
상기 비펩타이드성 중합체의 두 말단 반응기 또는 세 말단 반응기는 서로 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 한쪽 말단에는 말레이미드 그룹을, 다른 쪽 말단에는 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 또는 부틸 알데히드 그룹을 가질 수 있다. 양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 비펩타이드성 중합체로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 본 발명의 인간 난포자극 호르몬 결합체를 제조할 수 있다.
이러한 본 발명의 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제는 여성에서는 난포의 생성, 발달 및 성숙을 촉진하며, 남성에서는 정자형성을 유도하는 것과 같은 인간 난포자극 호르몬의 생체 내 활성이 유지될 뿐만 아니라 인간 난포자극 호르몬의 혈중 반감기 및 이로 인한 인간 난포자극 호르몬의 생체 내 효력 지속 효과가 획기적으로 증가하게 하므로, 불임 치료를 위한 보조생식술인 체외수정 (IVF-ET), 생식체 나팔관내 주입법 (GIFT), 접합자 나팔관내 주입법 (ZIFT), 그리고, 세포질내 정자주입법 (ICSI) 또는 시험관아기기술과 무배란증, 저성선자극 호르몬 성선저하증 및 다낭성 난소 증후군 치료에 유용하다.
본 발명의 지속성 제제는 생체 내 지속성 및 안정성을 유지시키는데 우수한 효과가 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제는 천연형 인간 난포자극 호르몬에 비하여 반감기가 약 10배 가까이 증가하였다 (표 2).
본 발명의 지속성 제제는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 지속성 제제는 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있다.
제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 지속성 제제는 불임 치료를 위한 보조생식술인 체외수정 (IVF-ET), 생식체 나팔관내 주입법 (GIFT), 접합자 나팔관내 주입법 (ZIFT), 그리고, 세포질내 정자주입법 (ICSI) 또는 시험관아기기술과 무배란증, 저성선자극 호르몬 성선저하증 및 다낭성 난소 증후군 (Polycystic ovary syndrome) 치료에 유용한바, 이를 포함하는 지속성 제제를 투여함으로써, 상기 질환의 치료를 도모할 수 있다.
본 발명에서 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 지속성 제제의 투여 경로는 제제가 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여시, 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다.
바람직하게는 주사제 형태로 투여될 수 있다. 또한, 지속성 제제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명의 지속성 제제는는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하므로, 본 발명의 약제학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은
(1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드, 또는 석시니미드 유도체 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 사용하여 인간 난포자극 호르몬의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합으로 연결하는 단계;
(2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 N-말단 이외의 위치에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 인간 난포자극 호르몬을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
(3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인간 난포자극 호르몬과 결합된 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "연결체"란 비펩타이드성 중합체와 인간 난포자극 호르몬만이 공유결합으로 연결된 중간체로서, 이후 이 연결체에 있는 비펩타이드성 중합체의 인간 난포자극 호르몬이 연결되지 않은 다른 쪽 말단에 면역 글로불린 Fc 영역을 결합시키게 된다.
또한, 바람직한 일 양태로서 본 발명은
(1) 양 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 인간 난포자극 호르몬의 라이신 잔기에 공유결합으로 연결시키는 단계;
(2) (1)의 반응 혼합물로부터 라이신잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 인간 난포자극 호르몬을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
(3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인간 난포자극 호르몬과 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함하는 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제의 제조방법을 제공한다. 더욱 바람직하게는 (1)의 비펩타이드성 중합체 및 인간 난포자극 호르몬의 라이신 잔기는 pH 7.5 이상에서 연결된다.
또한, 바람직한 일 양태로서 본 발명은
(1) 세 말단의 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체의 세 말단 반응기 중 두 말단 반응기를 면역글로불린 Fc의 N-말단 아미노기에 공유결합으로 연결하는 단계;
(2) (1)에서 제조된 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체와 연결된 면역글로불린 Fc를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
(3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 인간 난포자극 호르몬을 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제의 제조방법을 제공한다.
또한, 바람직한 일 양태로서 본 발명은 상기 인간 난포자극 호르몬의 지속성 제제를 생식 질환을 가진 개체에게 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 생식 질환의 치료 방법을 제공한다. 바람직하게, 상기 생식 질환은 불임일 수 있다.
또한, 바람직한 일 양태로서 본 발명은 상기 인간 난포자극 호르몬의 지속성 제제를 개체에 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 임신율을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"는 예를 들어, 인간, 비인간인 영장류, 말, 양, 고양이, 개, 소 또는 돼지인 포유동물일 수 있다.
본 발명의 인간 난포자극 호르몬 결합체는 당단백질의 생체 내 활성이 비교적 높게 유지되고, 혈중 반감기가 현저히 증가되는 효과가 있다.
도 1은 인간 난포자극 호르몬을 정제하기 위한 염료 친화 크로마토그래피 결과이다.
도 2은 인간 난포자극 호르몬을 정제하기 위한 소수성 크로마토그래피 결과이다.
도 3는 인간 난포자극 호르몬을 정제하기 위한 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 결과이다.
도 4는 인간 난포자극 호르몬을 정제하기 위한 음이온교환 크로마토그래피 결과이다.
도 5는 정제된 인간 난포자극 호르몬을 크기 배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 및 이소일렉트로포커싱 젤로 분석한 결과이다.
도 6은 양 말단을 갖는 비펩타이드성 중합체로 만든 인간 난포자극호르몬-3.4K PEG-면역글로불린 Fc 결합체를 젤로 분석한 결과이다.
도 7는 양 말단을 갖는 비펩타이드성 중합체로 만든 인간 난포자극호르몬-3.4K PEG-면역글로불린 Fc 결합체 순도를 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 8은 세 말단을 갖는 비펩타이드성 중합체로 만든 인간 난포자극호르몬-3.4K PEG-면역글로불린 Fc 결합체 순도를 크기 배제 크로마토그래피로 분석한 결과이다.
도 9은 지속형 및 천연형 인간 난포자극 호르몬의 인 비보 효력시험 비교 결과이다.
도 10는 지속형 인간 난포자극 호르몬과 CTP-퓨전 인간 난포자극 호르몬과의 인 비보 효력시험 비교 결과이다.
도 11은 양 말단을 갖는 중합체와 세 말단을 갖는 중합체를 사용하여 제작된 인간 난포자극 호르몬의 인 비보 효력시험 비교 결과이다.
도 12은 지속형 인간 난포자극 호르몬 제제의 인 비보 약물동태 확인 시험 결과이다.
도 13은 인간 난포자극 호르몬의 Beta chain에 80% 이상 페길화된 결과를 확인하기 위하여 역상 컬럼을 이용하여 분석한 결과이다.
도 14는 인간 난포자극 호르몬의 베타 서브 유닛에 결합된 것을 분석한 결과이다.
이하, 하기 실시 예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간 난포자극 호르몬의 생산
인간 난포자극 호르몬을 생산하기 위해 생산 세포주인 HMFS126 (기탁번호 KCTC11529BP) 세포주를 무혈청 배지를 사용하여 총 부피 7.5 L이고 실제 생산 부피 5 L인 동물 세포용 생물 반응기에서 배양하며 인간 난포자극 호르몬을 생산하였으며 생산 방법을 간략히 기술하면 다음과 같다. 우선 생물 반응기에서 배양을 시작하기 위해 필요한 세포수를 확보하기 위해 냉동 보관되어 있는 세포주를 해동하여 총 부피 250ml의 Erlenmeyer 플라스크에서 30ml의 무혈청 배지 (EX-CELL CHO medium, SAFC, Cat.# 63225C)를 사용하여 배양하기 시작하여 2일마다 계대배양하며 세포수를 확장한 후, 10 X 105 cells/ml의 농도가 되도록 생물 반응기에 접종하였다. 연속식 배양 방법을 사용하여 생물 반응기에서 무혈청 배지 (EX-CELL CHO medium, SAFC, Cat.# 63289C)를 사용하여 세포수가 100 X 105 cells/ml 이상이 되도록 37℃에서 배양한 후, 온도를 30.5℃로 내리고 1 mM 소듐 부티레이트(Sodium butyrate, Sigma, Cat# B-5887)를 첨가하여 약 20일동안 배양하며 인간 난포자극 호르몬을 생산하였다. 생산 기간 동안에는 지속적으로 무혈청 배지를 일정 속도로 첨가하며 첨가한 만큼 반응기로부터 빠져나오는 배양 상등액을 24시간마다 회수하여 원심분리한 후, 한외여과막 (SARTOCON Slice Cassette, PESU, Sartorius사, MWCO 10K)을 1L의 1N NaOH로 1시간 이상 세척하고 5L멸균수를 이용하여 최종 세척한 후, 인간 난포자극호르몬 발현 배양액을 주입하여 20배 농축하였다. 이 때 난포자극호르몬의 손실은 거의 없고, 농축된 난포자극호르몬의 최종 농도는 0.1 mg/ml로 유지되었다. 한 배치가 모두 끝날 때까지 농축된 발현 배양액은 -20℃에서 냉동상태로 보관하였으며, 배치가 끝나면 모두 모아서 정제를 실시하였다.
실시예 2. 염료 친화 크로마토그래피 단계
농축된 인간 난포자극 호르몬 배양액에 염료친화 크로마토그래피 단계를 위해 최종 농도가 50mM이 되도록 1M 글라이신-수산화나트륨 (pH 9.0) 버퍼를 첨가한 후, 최종 농도 0.2M이 되도록 3.5M 염화칼륨 용액을 차례로 첨가하였다. 각각의 용액이 첨가된 배양액은 0.45㎛ (Sartopore 2 300, Sterile Capsule, 0.8+0.45㎛) 여과 필터로 최종 여과하여 염료 친화 크로마토그래피에 부하하였다. 본 발명에서는 염료 친화 크로마토그래피로 블루 세파로즈 (Blue Sepharose Fast Flow, GE healthcare) 레진이 충진된 컬럼을 사용하였고, 부하된 시료는 평형 및 세척버퍼 A (50mM 글라이신-수산화나트륨 (pH 9.0)+0.2M 염화칼륨) 와 용출버퍼 B (50mM 글라이신-수산화나트륨 (pH 9.0)+ 2.5M 염화칼륨) 용액을 이용하여 등용매 용리 (isocratic elution)를 이용하여 단백질을 용출하였다 (도 1).
실시예 3. 소수성 크로마토그래피 단계
염료 친화 크로마토그래피 단계에서 용출된 시료에 최종 100mM 이 되도록 1M 트리스 (pH 7.0) 버퍼를 첨가하여 시료의 pH를 약 8.0으로 보정한 후 소수성 크로마토그래피에 부하하였다. 본 발명에서는 소수성 크로마토그래피로 소스 15페닐 (Source 15 PHE, GE healthcare) 레진이 충진된 컬럼을 사용하였고, 부하된 시료는 용매 A (10mM 트리스 (pH 8.0) + 1M 황산암모늄)에서 용매 B (10mM 트리스 (pH 8.0) + 20% 이소프로판올) 에 이르도록 6 컬럼 용량으로 선형 농도구배를 이용하여 단백질을 용출하였다 (도 2).
실시예 4. 한외여과를 이용한 인간 난포자극 호르몬의 농축 및 정용여과 단계
한외여과막 (SARTOCON Slice Cassette, PESU, Sartorius사, MWCO 10K)을 1L의 1N NaOH와 5L멸균수를 이용하여 세척한 후 소수성 크로마토그래피 용출액을 희석 버퍼 (10mM 인사나트륨 (pH 8.0))를 이용하여 3배 희석한 후 농축 및 정용여과 하였다. 최종 정용여과 희석 배수는 1000배가 되었고, 농축된 인간 난포자극 호르몬의 최종 농도는 약 1 mg/ml이었으며, 한외여과막의 분리능 (MWCO)은 10K 크기가 사용되었다.
실시예 5. 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 단계
10mM 인산나트륨 (pH 8.0) 용액으로 정용여과되어 1 mg/ml 농도까지 농축된 시료를 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피에 부하하였다. 본 발명에서는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로 매크로-프렙 세라믹 하이드록시아파타이트 타입 1 (Ceramic hydroxyapatite Type 1 80㎛, Bio-Rad) 레진이 충진된 컬럼을 사용하였고, 농축된 시료는 용매 A (10mM 인산나트륨 (pH 8.0))로 평형화된 상태의 컬럼에 부하되었다. 시료 부하 후, 컬럼에 흡착하지 않고 용출되어 나오는 플로우-스루 분획에서 인간 난포자극 호르몬이 포함된 용출액을 회수하였으며 용매 B (500mM 인산나트륨 (pH 8.0))로 컬럼에 흡착된 인간 난포자극 호르몬 이외의 단백질을 용출, 제거하였다 (도 3).
실시예 6. 한외여과 및 에탄올 처리 단계
한외여과막 (Pellicon2 PLCCC, Millipore사, MWCO 5K)을 0.5L의 0.1N NaOH와 2L 멸균수를 이용하여 세척한 후, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로부터 얻어진 인간 난포자극 호르몬을 2 mg/ml 농도까지 농축하였다. 농축한 인간 난포자극 호르몬은 농축된 시료와 동일한 부피의 100% 에탄올 용액과 섞어 상온에서 항온처리 하였다. 항온처리 과정 중, 난포자극호르몬의 농도는 1 mg/ml 이었으며 에탄올의 농도는 50%가 되도록 하였고 상온에서 3시간동안 천천히 교반하면서 항온처리 하였다.
실시예 7. 음이온교환 크로마토그래피 단계
에탄올 처리 단계를 거친 인간 난포자극 호르몬은 크기 배제 크로마토그래피를 통해 10mM 트리스(pH7.5) 버퍼로 버퍼교환 하였으며 용매 A (10mM 트리스 (pH 7.5))로 평형화된 음이온교환 크로마토그래피에 부하되었다. 음이온교환 크로마토그래피로는 소스 15큐 (Source 15Q, GE healthcare) 레진이 충진된 컬럼이 사용되었고 부하된 시료는 용매 A와 용매 B (10mM 트리스 (pH 7.5) + 1M 염화나트륨)를 이용하여 용매 B의 농도가 40%에 이르도록 10 컬럼 용량으로 선형 농도구배를 이용하여 단백질을 용출하였다 (도 4).
실시예 8. 정제된 인간 난포자극 호르몬의 분석
4단계 컬럼 크로마토그래피를 거쳐 정제된 인간 난포자극 호르몬은 EP에 등재된 난포자극호르몬의 시험법에 따라 확인 및 순도확인 시험을 진행하였다. 인간 난포자극 호르몬의 순도는 크기배제 크로마토그래피(SEC, size exclusion chromatography), 폴리아크릴 아미드 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 통하여 분석하였고, 역상 크로마토그래피, 면역블럿팅, 질량 분석 시험 등을 통하여 난포자극호르몬 물질 확인시험을, 이소일렉트릭포커싱(IEF, Isoelectricfocusing)을 통하여 당쇄화의 정도를 측정하였고, 숙주유래 DNA 및 단백질 정량을 실시하였다 (도 5).
실시예 9. 인간 난포자극 호르몬 페길화 ( Pegylation )와 정제
3.4K PropionALD(2) PEG(프로피온알데히드기를 2개 가지고 있는 PEG, IDB Inc., 한국)를 실시예 7에서 얻어지고 실시예 8에서 확인된 인간 난포자극 호르몬의 Beta chain에 80% 이상 페길화시키기 위하여 인간 난포자극 호르몬과 PEG의 몰비를 1 : 15, 단백질의 농도를 1.5mg/ml로 하여 4℃에서 6시 30분간 반응하였다. 이 때 반응은 pH 6.0인 100mM 농도의 Potassium phosphate 완충액 내에서 이루어졌으며, 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다. 반응액은 SOURCE PHE (RESOURCE PHE 1ml, 아머샴 바이오사이언스)를 통하여 모노-페길화된(Monopegylated) 단백질을 정제하였다. SOURCE PHE (RESOURCE PHE 1ml, 아머샴 바이오사이언스)에 20mM Tris(pH7.5) 0.7M 황산암모늄을 이용하여 시료를 결합시킨 후 차츰 황산암모늄 농도를 낮추고 유기용매를 첨가하여 시료를 용출시켰다. HIC 컬럼에 결합력이 약한 인간 난포자극 호르몬이 먼저 용출되고 결합력이 강한 인간 난포자극 호르몬-3.4K PEG 시료가 뒤쪽으로 용출되었다. 용출된 피크의 모노-페길화는 SDS-PAGE gel 을 이용하여 확인하였다. 인간 난포자극 호르몬의 B chain에 80% 이상 페길화된 결과를 확인하기 위하여 역상 컬럼을 이용하여 분석한 결과를 도 13에 나타내었다.
Column : SOURCE PHE (RESOURCE PHE 1ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 1.0ml/분
구배 : B 100 →0% 100분 B (A: 20mM 트리스 pH8.0 + 0.7M 황산암모늄, B: 20mM 트리스 pH8.0 + 20% isopropanol)
실시예 10. 인간 난포자극호르몬-3.4K PEG -면역글로불린 Fc 결합체( HM12160A ) 제조
실시예 9의 방법을 이용하여 3.4K PropionALD(2) PEG를 여포자극호르몬과 반응시킨 후 모노-페길화 여포자극호르몬만을 정제하여 면역글로불린 Fc(한미, 한국)과 커플링시켰다. 여포자극호르몬-3.4K PEG와 면역글로불린 Fc 몰비를 1 : 8.5, 전체단백질농도를 40mg/ml로 하여 4℃에서 16시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다.
커플링 반응액은 두 개의 정제 컬럼을 거쳐 정제하였다. 먼저 커플링 반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로불린 Fc를 제거하기 위하여 Blue HP를(HiTrap 5ml, 아머샴 바이오사이언스)이용하였다. 면역글로불린 Fc는 20mM Tris(pH7.5)에서 Blue FF에 거의 결합하지 않고 용출되었다. 낮은 농도 salt와 높은 pH (0.2M KCl + 50mM Gly-NaOH pH 9.0)을 사용하여 남아있는 면역글로불린 Fc를 완전히 제거한 후 높은 농도 salt와 높은 pH(2.5M KCl + 50mM Gly-NaOH pH 9.0)를 이용하여 반응하지 않은 여포자극호르몬-3.4K PEG와 여포자극호르몬-PEG-면역글로불린 Fc를 용출시켰다.
일차 정제를 통하여 면역글로불린 Fc가 제거되지만 친화성 컬럼에서 여포자극호르몬-3.4K PEG와 여포자극호르몬-면역글로불린 Fc은 결합력 차이가 크지 않아 분리가 되지 않는다.
따라서 두 물질의 소수성(Hydrophobicity)을 이용하여 이차 정제를 하였다. SOURCE ISO(RESOURCE ISO 1ml, 아머샴 바이오사이언스)에 20mM Tris(pH7.5) 1.3M 황산암모늄을 이용하였다. HIC 컬럼에 결합력이 약한 여포자극호르몬-3.4K PEG는 20mM Tris(pH7.5) 1.3M 황산암모늄에서 SOURCE ISO에 결합하지 않고 용출되고 결합력이 강한 여포자극호르몬-면역글로불린 Fc 시료는 황산암모늄 농도를 낮춤에 따라 뒤쪽으로 용출되었다. 이들의 소수성 차이가 커 이온교환컬럼보다 훨씬 분리가 용이하였다 (도 6). HPLC 크기배재 크로마토그래피 분석결과 순도 97.66%를 나타내었다 (도 7).
Column : Blue HP (HiTrap 5ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 3.0ml/분
구배 :A0→100% 0분B → 100% 0분C (A:20mM트리스pH7.5,B: 50mM 글라이신-수산화나트륨 pH9.0 + 0.2M 염화칼륨, C:５0mM 글라이신-수산화나트륨 pH9.0 + ２.５M 염화칼륨)
Column : SOURCE ISO(RESOURCE ISO 1ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 1.0ml/분
구배 :B 100 →0% 100분 B (A: 20mM 트리스 pH7.5, B: A + 1.3M 황산암모늄)
실시예 11. 인간 난포자극 호르몬과 면역글로불린 Fc 의 페길화 ( Pegylation )와 정제
5K PropionALD(3) PEG(프로피온알데히드기를 3개 가지고 있는 PEG, NOF.,일본)를 면역글로불린 Fc(한미, 한국)의 두 개의 N-말단에 페길화시키기 위하여 단백질과 PEG의 몰비를 1:2, 단백질의 농도를 6mg/ml로 하여 4℃에서 4시 30분간 반응하였다.
이 때 반응은 pH 6.0인 100mM 농도의 Potassium phosphate 완충액 내에서 이루어졌으며, 환원제인 20mM SCB(NaCNBH3)를 첨가하여 반응시켰다.
반응액은 SOURCE Q(FineLINE 1000ml, 아머샴 바이오사이언스)를 통하여 모노-페길화된(Monopegylated) 단백질을 정제하였다. 용출된 피크의 모노-페길화는 SDS-PAGE gel 을 이용하여 확인하였다.
Column : SOURCE Q (FineLINE 1000ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 40.0ml/분
구배 : A 0 →4% 1분 B → 24% 80분 B (A: 20mM 트리스 pH7.5, B: A + 1M NaCl )
실시예 12. 인간 난포자극호르몬-5K PEG -면역글로불린 Fc 결합체( HM12160B ) 제조
실시예 11 의 방법을 이용하여 5K PropionALD(3) PEG를 면역글로불린 Fc의 두 개의 N-term과 반응시킨 후 모노-페길화 면역글로불린 Fc만을 정제하여 실시예 7에서 얻어어지고 실시예 8에서 확인된 인간 난포자극 호르몬과 커플링시켰다. 인간 난포자극 호르몬과 면역글로불린 Fc-5K PEG 몰비를 1 : 4.5, 전체단백질농도를 40mg/ml로 하여 4℃에서 16시간 반응하였다. 반응액은 100mM K-P pH6.0이며 환원제인 20mM SCB를 첨가하였다.
커플링 반응액은 두 개의 정제 컬럼을 거쳐 정제하였다. 먼저 커플링 반응에 참여하지 않은 다량의 면역글로불린 Fc -5K PEG를 제거하기 위하여 Blue FF를(Vantage L Laboratory Column 38ml, 밀리포어) 이용하였다. 면역글로불린 Fc -5K PEG는 20mM Tris(pH7.5)에서 Blue FF에 거의 결합하지 않고 용출되었다. 낮은 농도 salt와 높은 pH (0.2M KCl + 50mM Gly-NaOH pH 9.0)을 사용하여 남아있는 면역글로불린 Fc -5K PEG를 완전히 제거한 후 높은 농도 salt와 높은 pH(2.5M KCl + 50mM Gly-NaOH pH 9.0)를 이용하여 반응하지 않은 인간 난포자극호르몬과 인간 난포자극호르몬-PEG-면역글로불린 Fc를 용출시켰다.
일차 정제를 통하여 면역글로불린 Fc-5K　PEG가 제거되지만 친화성 컬럼에서 FSH와 FSH-면역글로불린 Fc은 결합력 차이가 크지 않아 분리가 되지 않는다.
따라서 두 물질의 소수성(Hydrophobicity)을 이용하여 이차 정제를 하였다. SOURCE PHE(XK 19ml,아머샴 바이오사이언스)에 20mM Tris(pH7.5) 1M 황산암모늄을 이용하여 일차 정제된 시료를 결합시킨 후 차츰 황산암모늄 농도를 낮추면서 시료를 용출시켰다. HIC 컬럼에 결합력이 약한 여포자극호르몬이 먼저 용출되고 결합력이 강한 여포자극호르몬-면역글로불린 Fc 시료가 뒤쪽으로 용출되었다. 이들의 소수성 차이가 커 이온교환컬럼보다 훨씬 분리가 용이하다. HPLC 크기배재 크로마토그래피 분석결과 순도 98.07%를 나타내었다 (도 8).
Column : Blue FF(Vantage L Laboratory Column 38ml, 밀리포어)
유속 : 5.0ml/분
구배 :A0→100% 0분B → 100% 0분C (A:20mM트리스pH7.5,B: 50mM 글라이신-수산화나트륨 pH9.0 + 0.2M 염화칼륨, C:５0mM 글라이신-수산화나트륨 pH9.0 + ２.５M 염화칼륨)
Column : SOURCE PHE(XK 19ml, 아머샴 바이오사이언스)
유속 : 2.0ml/분
구배 :B 100 →0% 150분 B (A: 20mM 트리스 pH7.5, B: A + 1M 황산암모늄)
실시예 13. 지속형 및 천연형 인간 난포자극 호르몬의 인 비보 효력시험 비교
인간 난포자극 호르몬 지속성 제제의 인 비보효력을 측정하기 위하여 미성숙 암컷 쥐를 이용하여 난소 무게 증가를 확인하였다. 21일 령의 미성숙 암컷 쥐에 3일 동안 지속성 제제를 0.5 또는 1.5 mcg/head (FSH 농도 기준)로 단회 투여하고 천연형 인간 난포자극 호르몬을 0.5 mcg/head 용량으로 매일 또는 1.5 mcg/head 용량으로 단회 투여하였다. 3일 간의 시험 기간 동안 인간 난포자극 호르몬 제제의 투여와 동시에 인간 성선자극 호르몬 (human chorionic gonadotropin)을 13.3 IU/head 용량으로 매일 병행 투여하였다. 이 때, 사용된 인간 난포자극 호르몬은 양 말단을 갖는 비펩타이드성 중합체로 연결된 지속성 제제였다. 최초 시험 물질을 투여한 후 72시간 경과 후에 시험 동물을 안락사 시킨 후 난소를 적출한 후 무게를 측정하였다. 단회 투여 된 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제는 동량 투여 된 천연형 인간 난포자극 호르몬에 비해 난소 무게가 26% 증가하였고, 1/3 용량에서 동등한 난소무게 증가 효과를 나타냈다 (도 9).
실시예 14. 지속형 인간 난포자극 호르몬과 CTP -퓨전 인간 난포자극 호르몬과의 인 비보 효력시험 비교
인간 난포자극 호르몬 지속성 제제의 인 비보 효력을 Organon 사에서 개발 중인 CTP-퓨전 인간 난포자극 호르몬 지속형제제와 비교시험하기 위해 Organon 사에서 수행한 효능시험법을 따라, 인간 난포자극 호르몬의 인 비보 효력 시험을 진행하였다. 구체적인 시험법은 다음과 같다. 21일 령의 미성숙 암컷 쥐에 3일 동안 지속성 제제를 1.4 또는 2.8 mcg/head (인간 난포자극 호르몬 농도 기준)로 단회 투여하고 천연형 인간 난포자극 호르몬을 2.8 mcg/head 용량으로 단회 투여하였다. 이 때, 사용된 인간 난포자극 호르몬은 양 말단을 갖는 비펩타이드성 중합체로 연결된 지속성 제제였다. 인간 성선자극 호르몬의 병용 투여는 진행하지 않았다. 최초 시험 물질을 투여한 후 72시간 경과 후에 시험 동물을 안락사 시킨 후 난소를 적출한 후 무게를 측정하였다. 지속성 제제 투여 군은 인간 난포자극 호르몬 투여 군에 비해 1/2 용량 투여 군에서는 38%, 동량 투여 군에서는 68%의 난소 무게 증가를 확인할 수 있었다. 본 시험과 동일한 시험법을 사용한 CTP-퓨전 인간 난포자극 호르몬의 인간 난포자극 호르몬의 효력 시험에서 CTP-퓨전 인간 난포자극 호르몬 투여 군은 천연형 인간 난포자극 호르몬 투여 군에 비해 동량 투여 시 29% 난소 무게 증가를 나타낸 결과로부터 (표 1), 본 발명의 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제의 인 비보 효력이 더 우수할 것으로 예측 되어진다 (도 10).
Parameters HM12160A FSH - CTP *
Dosage (mg/rat) 1.4 2.8 2.8
Increasing ratio of ovary weight (%) vs FSH 31 68 29
*: Hum Reprod, 2003; 18: 50 - 56
실시예 15. 양 말단을 갖는 중합체와 세 말단을 갖는 중합체를 사용하여 제작된 인간 난포자극 호르몬의 인 비보 효력시험 비교
말단이 두 개 또는 세 개인 각기 다른 비펩타이드성 중합체를 이용하여 제작된 각각의 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제의 인 비보 효력을 비교하기 위하여 미성숙 암컷 쥐를 이용하여 난소 무게 증가를 확인하였다. 21일 령의 미성숙 암컷 쥐에 3일 동안 양 말단을 갖는 중합체로 제작된 또는 세 말단을 갖는 비펩타이드성 중합체를 이용하여 제작된 인간 난포자극 호르몬을 0.3, 0.075, 또는 0.018 mcg/head (인간 난포자극 호르몬 농도 기준)로 단회 투여하였다. 3일 간의 시험 기간 동안 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제의 투여와 동시에 인간 성선자극 호르몬을 13.3 IU/head 용량으로 매일 병행 투여하였다. 최초 시험 물질을 투여한 후 72시간 경과 후에 시험 동물을 안락사 시킨 후 난소를 적출한 후 무게를 측정하였다. 단회 투여 된 두 종류의 지속성 제제 모두 농도 의존적인 난소 무게 증가 효과를 보였으며, 투여 물질 간, 투여 농도군 사이의 난소 무게 증가 차이는 나타나지 않았다. 위의 결과로부터 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제 제조 시 양 말단 또는 세 말단을 갖는 비펩타이드성 중합체의 차이에 따른 효력 차이는 없는 것으로 확인되었다 (도 11).
실시예 16. 지속형 인간 난포자극 호르몬 제제의 인 비보 약물동태 확인 시험
인간 난포자극 호르몬 지속성 제제의 생체 내 지속성을 확인하기 위해 미성숙 암컷 쥐를 이용하여 약물 동태를 확인하였다. 21일 령의 미성숙 암컷 쥐에 천연형 또는 지속형 인간 난포자극 호르몬을 80 g/kg (인간 난포자극 호르몬 기준)을 단회 피하 투여한 후, 효소면역측정 키트를 이용하여 시간에 따른 혈중 농도 변화를 측정하여 측정 된 농도 값으로 Winnolin 5.2 소프트웨어를 이용하여 약물동태 파라미터를 산출하였다 (표 2). 이 때, 사용된 인간 난포자극 호르몬은 세 말단을 갖는 비펩타이드성 중합체로 연결된 지속성 제제였다.인간 난포자극 호르몬의 반감기는 85.6 시간으로 천연형 인간 난포자극 호르몬에 비해 10배 정도 긴 지속성을 나타내는 것으로 확인되었다 (도 12).
PK parameters FSH HM12160B
Dose
(/kg as FSH)		 80 80
T1/2(hr) 8.14±1.92 85.62±6.25
실시예 17. 난포자극호르몬-3.4K PEG - 면역글로블린 Fc 결합체 결합 부위 확인
난포자극호르몬과 3.4K PEG-면역글로블린 Fc의 결합 부위를 확인하기 위하여 HPLC 역상크로마토그래피를 사용하였다. 농도 1mg/ml의 20㎍ 난포자극호르몬을 낮은 pH에서 역상크로마토그래피를 이용한 결과, 알파 서브유닛과 베타 서브유닛이 분리됨을 확인하였다. 동일한 조건에서 난포자극호르몬-3.4K PEG-면역글로블린 Fc 결합체를 역상크로마토그래피한 결과 3.4K PEG-면역글로블린 Fc이 결합하지 않은 알파 서브유닛, 베타 서브유닛과 3.4K PEG-면역글로블린 Fc이 결합한 서브유닛이 분리되었다. 그 결과 난포자극호르몬-3.4K PEG-면역글로블린 Fc 결합체의 경우 여포자극호르몬에 비하여 베타서브유닛 피크가 현저히 줄어들었음을 확인할 수 있었다(도 14). 215nm 파장의 인테그레이션을 기준으로 베타서브유닛의 80%, 알파서브유닛의 20%가 3.4K PEG-면역글로블린 Fc와 결합하였음을 확인할 수 있었다.
<110> HANMI HOLDINGS CO., LTD. <120> Long-acting human follicle-stimulating hormone formulation using immunoglobulin fragment <130> PA110255/KKR <150> KR10-2010-0030574 <151> 2010-04-02 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro 1 5 10 15 Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys 20 25 30 Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu 35 40 45 Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser 50 55 60 Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr 65 70 75 80 Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser 85 90 <210> 2 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu 1 5 10 15 Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys 20 25 30 Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln 35 40 45 Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro 50 55 60 Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr 65 70 75 80 Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val 85 90 95 Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu 100 105 110

Claims (20)

  1. 인간 난포자극 호르몬 및 면역글로불린 Fc 영역이 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌글리콜 공중합체, 폴리옥시에틸화폴리올, 폴리비닐알콜, 폴리사카라이드, 덱스트란, 폴리비닐에틸에테르, 생분해성 고분자, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 중합체를 통해 연결된 인간 난포자극 호르몬 결합체를 포함하는, 생체 내 지속성 및 안정성이 증가된 인간 난포자극 호르몬의 지속성 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인간 난포자극 호르몬은 FSH (follicle stimulating hormone) 또는 이의 아고니스트(agonist), 유도체(derivative), 단편(fragment), 변이체(variant) 및 이들의 조합으로부터 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 지속성 제제.
  3. 제1항에 있어서, 반응기 말단이 두 개인 비펩타이드성 중합체의 양 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 난포자극 호르몬의 아민 그룹 또는 티올 그룹 (Thiol group)에 결합된 것인 지속성 제제.
  4. 제1항에 있어서, 반응기 말단이 세 개인 비펩타이드성 중합체의 두 말단이 면역글로불린 Fc 영역 및 인간 난포자극 호르몬의 아민 그룹 또는 티올 그룹 (Thiol group)에 결합된 것인 지속성 제제.
  5. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 비당쇄화됨을 특징으로 하는 지속성 제제.
  6. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인으로 이루어진 군으로부터 1개 내지 4개 선택되는 도메인으로 이루어진 것인 지속성 제제.
  7. 제6항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 힌지영역을 추가로 포함하는 것인 지속성 제제.
  8. 제1항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM로 구성되는 군로부터 선택되는 면역글로불린에서 유래된 Fc 영역인 지속성 제제.
  9. 제8항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역의 각각의 도메인이 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM로 이루어진 군에서 선택되는 면역글로불린에서 유래된 상이한 기원을 가진 도메인의 하이브리드인 지속성 제제.
  10. 제9항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린으로 구성된 이량체 또는 다량체인 지속성 제제.
  11. 제8항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 IgG4 Fc 영역인 지속성 제제.
  12. 제9항에 있어서, 면역글로불린 Fc 영역이 인간 비당쇄화 IgG4 Fc 영역인 지속성 제제.
  13. 제1항에 있어서, 비펩타이드성 중합체의 반응기가 알데히드 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 지속성 제제.
  14. 제13항에 있어서, 석시니미드 유도체가 석시니미딜 프로피오네이트, 석시니미딜 카르복시메틸, 히드록시 석시니미딜 및 석시니미딜 카보네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 지속성 제제.
  15. 제13항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 양 말단 또는 세 말단에 반응 알데히드 그룹의 반응기를 갖는 지속성 제제.
  16. 제1항에 있어서, 불임 치료용 보조생식술인 체외수정 (IVF-ET), 생식체 나팔관내 주입법 (GIFT), 접합자 나팔관내 주입법 (ZIFT), 세포질내 정자주입법 (ICSI) 또는 시험관아기기술에 사용하기 위한 지속성 제제.
  17. 제1항에 있어서, 저성선자극 호르몬 성선저하증 또는 다낭성 난소 증후군 (Polycystic ovary syndrome)치료용인 지속성 제제.
  18. (1) 양 말단에 알데히드, 말레이미드, 및 석시니미드 유도체 중에서 선택되는 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 인간 난포자극 호르몬의 아민 그룹 또는 티올 그룹에 공유결합 시키는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 N-말단 이외의 아미노산 잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 인간 난포자극 호르몬를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 난포자극 호르몬과 결합된 펩타이드 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항의 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제의 제조방법.
  19. (1) 양 말단에 알데히드 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체를 인간 난포자극 호르몬의 라이신 잔기에 pH 7.5 이상에서 공유결합하는 단계;
    (2) 상기 (1)의 반응 혼합물로부터 라이신 잔기에 비펩타이드성 중합체가 공유결합된 인간 난포자극 호르몬을 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 면역글로불린 Fc 영역을 공유결합으로 연결하여 비펩타이드성 중합체의 양쪽 말단이 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 난포자극 호르몬과 결합된 단백질 결합체를 생성하는 단계를 포함하는, 제1항의 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제의 제조방법.
  20. (1) 세 말단의 반응기를 갖는 비펩타이드성 중합체의 세 말단 반응기 중 두 말단 반응기를 면역글로불린 Fc의 N-말단 아미노기에 공유결합으로 연결하는 단계
    (2) (1)에서 제조된 반응 혼합물로부터 비펩타이드성 중합체와 연결된 면역글로불린 Fc를 포함하는 연결체를 분리하는 단계; 및
    (3) 분리된 연결체의 비펩타이드성 중합체의 다른 쪽 말단에 인간 난포자극 호르몬을 공유결합으로 연결하는 단계를 포함하는, 제1항의 인간 난포자극 호르몬 지속성 제제의 제조방법.

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