KR20110109063A - Floury endosperm gene, flo(a), molecular marker and fine mapping of flo(a) in rice - Google Patents

Floury endosperm gene, flo(a), molecular marker and fine mapping of flo(a) in rice Download PDF

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Abstract

본 발명은 쌀의 분질배유 형질을 결정하는 FLO(a) 단백질 및 유전자, FLO(a)좌를 포함하는 벼의 정밀유전자지도, 벼의 분질배유 돌연변이체 flo(a)와 밀양23간의 교잡으로 생산된 F2 집단, 분질배유 형질을 결정하는 FLO(a)좌를 동정하는 방법, 벼의 분질배유 돌연변이체 flo(a), 분질배유 형질을 결정하는 FLO(a)좌를 동정하기 위한 분자마커, FLO(a)좌 동정용 프라이머 쌍 및 flo(a) 대립인자의 dCAPS 분석용 프라이머 쌍에 관한 것이다.The present invention is produced by FLO (a) protein and genes for determining the milk powder trait of rice, precision gene map of rice including the FLO (a) locus, hybridization between the rice milk mutant flo (a) and Miryang 23 the F 2 population, FLO determining a bunjil endosperm traits (a) method for identifying the left and bunjil endosperm mutants of rice plant body flo (a), bunjil molecular markers for identifying a FLO (a) left to determine the endosperm traits, A pair of primers for FLO (a) left identification and a pair of primers for dCAPS analysis of the flo (a) allele.

Description

벼의 분질배유 유전자 ＦＬＯ（ａ）와 분자마커 및 유전자 부위 정밀유전자지도{Floury Endosperm Gene, FLO(a), molecular marker and fine mapping of FLO(a) in Rice}FLOry Endosperm Gene, FLO (a), molecular marker and fine mapping of FLO (a) in Rice}

본 발명은 쌀의 분질배유 형질을 결정하는 FLO (a) 단백질 및 유전자, FLO (a)좌를 포함하는 벼의 정밀유전자지도, 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a)와 밀양23간의 교잡으로 생산된 F2 집단, 분질배유 형질을 결정하는 FLO (a)좌를 동정하는 방법, 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a), 분질배유 형질을 결정하는 FLO (a)좌를 동정하기 위한 분자마커, FLO (a)좌 동정용 프라이머 쌍 및 flo (a) 대립인자의 dCAPS 분석용 프라이머 쌍에 관한 것이다.The present invention is produced by the hybridization between FLO (a) protein and gene, rice FLO (a) locus, including the FLO (a) locus, rice flour mutant flo (a) and wheat sheep 23 Populations of F 2 populations, methods for identifying FLO (a) loci for determining endosperm traits, milk mutant flo (a) for rice , molecular markers for identifying FLO (a) loci for determining endosperm traits, A pair of primers for FLO (a) left identification and a pair of primers for dCAPS analysis of the flo (a) allele.

곡류작물은 에너지 비축을 위해 종자의 배유에 전분을 축적하며, 곡물은 사람 및 가축의 식이에서 일차적인 탄수화물원이다. 더욱이, 전분은 산업적으로 많은 응용이 가능하다. 고등식물에서 현행 전분 생합성의 방식은 전분의 주 구성요소인 아밀로펙틴의 합성으로 개시되며, 아밀로펙틴은 AGPase (ADP glucose pyrophosphorylase), SS (soluble starch synthases), BE (starch-branching enzymes), 및 DBE (starch-debranching enzymes)의 작용으로 생성된다 (Smith 등 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 67-87). 또한, 불균형효소(disproportionating enzyme) (Ball 및 Morell 2003 Annu. Rev. Plant Biol. 54, 207-233) 및 알파-글루칸 포스포릴라아제(α-glucan phosphorylase) (Dauvillee 등 2006 Plant J. 48, 274-285)가 상기 과정에 관여된다는 증거가 있다. 쌀에서, 전분이 곡물 건량의 ~90%를 이루며, 칼로리의 80%까지를 제공한다. 특히 식미(eating) 및 조리(cooking)의 질에 관한 쌀 질의 다양한 양상은 전분의 특성에 의해 결정된다 (Hannah 등 2008 Curr. Opin. Biotechnol. 19, 160-165). Grain crops accumulate starch in the seed's drainage for energy storage, and grain is the primary source of carbohydrates in human and livestock diets. Moreover, starch has many industrial applications. Current methods of starch biosynthesis in higher plants are initiated by the synthesis of amylopectin, a major component of starch, which is known as AGPase (ADP glucose pyrophosphorylase), SS (soluble starch synthases), starch-branching enzymes (BE), and DBE (starch). -debranching enzymes) (Smith et al. 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 67-87). In addition, disproportionating enzymes (Ball and Morell 2003 Annu. Rev. Plant Biol. 54 , 207-233) and alpha-glucan phosphorylase (Dauvillee et al. 2006 Plant J. 48 , 274 There is evidence that -285) is involved in this process. In rice, starch makes up ~ 90% of the dry grain and provides up to 80% of calories. Various aspects of rice quality, in particular regarding the quality of eating and cooking, are determined by the properties of the starch (Hannah et al. 2008 Curr. Opin. Biotechnol. 19 , 160-165).

낱알(grain) 충전 중에 다량의 전분이 침착되는 배유는 발달 초기 단계의 배(embryo)에 양분을 공급한다. 배유 전분은 선상 (아밀로오스) 및 분지상 (아밀로펙틴)으로 구성된다. 배유의 외양 및 물리화학적 특성에 근거하여, 돌연변이주가 동정되었으며, ae ( amylase extender ), bt ( brittle ), du ( dull ), flo ( floury ), glu (glutinous), sh ( shrunken ), su1 ( sugary 1), 및 wc ( white - core ) 변종으로 나누어졌다 (Nelson 및 Pan 1995 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46, 475-496). 상기 돌연변이주들은 낱알(grain) 충전 중에 전분의 저장에 관련된 대사과정 규명을 위한 소중한 유전재료를 제공한다 (Nelson 및 Pan 1995 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46, 475-496). 또한 상기 돌연변이주들은 전분의 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 동정을 용이하게 한다 (Hunter 등 2002 Plant Cell 14, 2591-2612). 상기 돌연변이주들 중의 일부는 상기 곡물이 식품산업에 이용되게 하는 형질을 생산할 수 있다. 예를 들면, 배유의 중앙부 세포에 전분립이 엉성하게 축적된 전분립 복합체를 가진 불투명한 배유는 막걸리 생산에 유용하다 (Hoshikawa 1989 The Growing Rice Plant, An Anatomical Monograph. Tokyo, Japan, Nobunkyo).An embryo in which a large amount of starch is deposited during grain filling feeds the embryo at an early stage of development. The endosperm starch consists of glandular (amylose) and branched (amylopectin). Based on the appearance and physicochemical properties of the endosperm, mutants were identified and ae ( amylase extender ), bt ( brittle ), du ( dull ), flo ( floury ), glu (glutinous), sh ( shrunken ), su1 ( sugary 1), and wc ( white - core ) variants (Nelson and Pan 1995 Annu. Rev. Plant Physiol.Plant Mol. Biol. 46 , 475-496). The mutants provide valuable genetic material for identifying metabolic processes involved in the storage of starch during grain filling (Nelson and Pan 1995 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46 , 475-496). The mutants also facilitate the identification of genes encoding starch biosynthetic enzymes (Hunter et al. 2002 Plant Cell 14 , 2591-2612). Some of the mutants may produce traits that allow the grain to be used in the food industry. For example, opaque embryos with starch complexes with poorly accumulated starch granules in the central cells of the embryo are useful for producing rice wine (Hoshikawa 1989 The Growing Rice Plant, An Anatomical Monograph. Tokyo, Japan, Nobunkyo).

경제적인 중요성 때문에, 옥수수의 불투명한 배유 돌연변이체의 원인 유전자 중의 일부가 동정되었다. 상기 유전자는 GBSSI (granule-bound starch synthase I)을 암호화하는 wx ( waxy ) (Klosgen 등 1986 Mol. Gen. Genet. 203, 237-244), 전분-분지 효소 IIb를 암호화하는 ae ( amylase extender ) (Fisher 등 1993 Plant Physiol. 102, 1045- 1046), 서당합성효소1 (sucrose synthase1)을 암호화하는 shrunken1 (sh1), ADP-포도당 피로포스포릴아제(ADP-glucose pyrophosphorylase)의 큰(large) 및 작은(small) 서브유닛(subunits) 각각을 암호화하는 sh2 ( shrunken2 ) 및 bt2 (brittle2) (Bhave 등 1990 Plant Cell 2, 581-588), 아데닐레이트 트랜스로케이터(adenylate translocator)를 암호화하는 bt1 ( brittle1 ) (Cao 및 Shannon 1997 Physiol. Plant 100, 400-406), 전분-탈분지 효소를 암호화하는 su1 ( sugary1 ) (James 등 1995 Plant Cell 7, 417-429), 및 전분 신타아제(starch synthase)를 암호화하는 du1 ( dull1 ) (Gao 등 1998 Plant Cell 10, 399-412)을 포함한다.Because of economic importance, some of the causative genes for the opaque embryonic mutants of maize have been identified. The gene is wx ( waxy ) encoding granule-bound starch synthase I (GBSSI ) (Klosgen et al. 1986 Mol. Gen. Genet. 203 , 237-244), and ae ( amylase encoding starch-branched enzyme IIb). extender ) (Fisher et al. 1993 Plant Physiol. 102 , 1045-1046), shrunken1 ( sh1 ) encoding sucrose synthase1, large of ADP-glucose pyrophosphorylase (ADP-glucose pyrophosphorylase) and small (small) bt1 encoding the subunits (subunits) sh2 (shrunken2) and bt2 (brittle2) (Bhave, etc. 1990 Plant Cell 2, 581-588), adenylate trans locator (adenylate translocator) coding for each of ( brittle1 ) (Cao and Shannon 1997 Physiol.Plant 100 , 400-406), su1 ( sugary1 ) encoding starch-debranching enzyme (James et al. 1995 Plant Cell 7 , 417-429), and starch synthase Du1 ( dull1 ) (Gao et al. 1998 Plant Cell 10 , 399-412) that encodes to the virus.

또한 쌀의 비정상적인 배유 돌연변이체를 조절하는 유전자의 특성을 밝히고 동정하기 위한 많은 연구가 수행되어 왔다. 예를 들면, Du1은 Prp1 (pre-mRNA processing) 패밀리 중의 하나를 암호화하며, Wxb의 스플라이싱(splicing) 및 쌀 전분 생합성 경로에 관여하는 다른 유전자의 발현을 촉진함으로써 전분 생합성의 조절자의 기능을 한다 (Zeng 등 2007 Plant Mol. Biol. 65, 501-509). Du3은 CBP20 (cap-binding protein 20 kD subunit)의 벼 상동체를 암호화하며, pre-mRNA 스플라이싱(splicing), 핵에서 세포질로의 RNA 이동 및 넌센스-매개된 붕괴(nonsense-mediated decay)에 역할을 하는 헤테로다이메릭 핵(heterodimeric nuclear) CBC (cap-binding complex)의 구성인자이다 (Isshiki 등 2008 Plant Biotechnol. J. 25, 483-487). PHO1는 쌀 배유에서의 전분 생합성에 결정적인 역할을 하며, Pho1 (phosphorylase mutant)은 변형된 아밀로펙틴 구조의 축적을 초래하는 작은 전분립을 보인다 (Satoh 등 2008 Plant Cell 20, 1833-1849). OGR1은 PPRDYW (pentatricopeptide repeat DYW) 단백질을 암호화하며, 미토콘드리아에서 RNA editing에 필수적이다 (Kim 등 2009 Plant J. 59, 738-749). 더욱이, 6 개 분질배유 돌연변이체 (flo (a), flo1 ~ flo5)의 좌위는 각각 염색체 4, 5, 4, 4, 3, 및 8에서 형태적 마커 및 T-DNA tagging pool 분석 (http://www.gramene.org/)에 의해 동정되었다. flo (a)좌는 염색체 4의 형태적 마커인 lg ( liguleless )에 연관되어 있다 (Kim 등 1993 Korean J. Crop Sci. 38, 264-274). flo1 돌연변이체는 둥글고 느슨하게 채워진 전분립을 함유하는 분질성의 흰 배유를 생성하는 것으로 알려져 있다 (Satoh 및 Omura 1981 Jap. J. Breed. 31, 316-326). flo2 돌연변이체는 높은 라이신(lysine) 함량 및 증가된 수준의 히스티딘(histidine)을 가진 배유를 가진다 (Kumamaru 등 1997 Plant Breed. 116, 245-249). flo3 주(strain)는 쌀에서 일차적인 알레르기 유발 항원(allergen)인 16-kDa 글로불린(globulin)을 낮은 수준으로 가진 분질배유 돌연변이체이다 (Nishio 및 Iida 1993 Theor. Appl. Genet. 86, 317-321). 최근에, 느슨하게 채워진 전분립으로 이루어진 비정상적인 배유를 가진 2 개의 T-DNA 삽입 돌연변이체인 flo4 및 flo5이 알려졌다. flo4 주는 PPDK (pyruvate orthophosphate dikinase)를 암호화하는 유전자에 돌연변이가 생긴 것으로 보인다 (Kang 등 2005 Plant J 42, 901-911). flo5 돌연변이체는 긴 전분쇄를 만들며, 배유에서의 전분 합성 중에 다른 SS 이성질형(isoforms)의 활성의 조정에 중요한 역할을 하는 SSIII (starch synthase III) 유전자에 결함이 있다 (Ryoo 등 2007 Plant Cell Rep. 26, 1083-1095). In addition, many studies have been conducted to characterize and identify genes that control abnormal endosperm mutants in rice. For example, Du1 is by encrypting one of Prp1 (pre-mRNA processing) family, promote splicing (splicing), and the expression of other genes involved in the rice starch biosynthetic pathway of Wxb the control's features in starch biosynthesis (Zeng et al. 2007 Plant Mol. Biol. 65 , 501-509). Du3 is It encodes a rice homologue of CBP20 (cap-binding protein 20 kD subunit) and plays a role in pre-mRNA splicing, RNA transfer from nucleus to cytoplasm, and nonsense-mediated decay. It is a constituent of the heterodimeric nuclear cap-binding complex (CBC) (Isshiki et al. 2008 Plant Biotechnol. J. 25 , 483-487). PHO1 plays a decisive role in starch biosynthesis in rice endosperm and Pho1 (phosphorylase mutant) shows small starch granules leading to the accumulation of modified amylopectin structures (Satoh et al. 2008 Plant Cell 20, 1833-1849). OGR1 encodes PPRDYW (pentatricopeptide repeat DYW) protein and is essential for RNA editing in mitochondria (Kim et al. 2009 Plant J. 59 , 738-749). Furthermore, the locus of the six milking mutants ( flo (a), flo1 to flo5 ) was analyzed for morphological markers and T-DNA tagging pool analysis on chromosomes 4, 5, 4, 4, 3, and 8 (http: / /www.gramene.org/). The flo (a) locus is associated with lg ( liguleless ) , a morphological marker of chromosome 4 (Kim et al. 1993 Korean J. Crop Sci. 38, 264-274). The flo1 mutant is known to produce a powdery white embryo containing round, loosely filled starch granules (Satoh and Omura 1981 Jap. J. Breed. 31 , 316-326). The flo2 mutant has endosperm with high lysine content and increased levels of histidine (Kumamaru et al. 1997 Plant Breed. 116 , 245-249). flo3 The strain is a milking mutant with low levels of 16-kDa globulin, the primary allergen in rice (Nishio and Iida 1993 Theor. Appl. Genet. 86 , 317-321). . Recently, two T-DNA insertion mutants, flo4 and flo5 , with abnormal endosperm consisting of loosely filled starches have been known. The flo4 strain appears to be mutated in a gene encoding PPDK (pyruvate orthophosphate dikinase) (Kang et al. 2005 Plant J 42 , 901-911). The flo5 mutant produces long starch chains and is defective in starch synthase III (SSIII) genes, which play an important role in modulating the activity of other SS isoforms during starch synthesis in embryos (Ryoo et al. 2007 Plant Cell Rep) 26 , 1083-1095).

flo (a) 돌연변이체의 물리화학적 특성의 일부가 보고된 바 있다 (Kim 등 1993 Korean J. Crop Sci. 38, 264-274). flo (a) 돌연변이체는 야생형에 비해 훨씬 낮은 아밀로오스 함량, 온전한 단백질 함량, 호응집성(gel consistency), 점도, 과립경도 및 밀도를 가진다. flo (a) 돌연변이체는 또한 야생형에 비해 보다 큰 부피의 떡, 보다 큰 Brix 감소 및 증가된 양의 알코올을 생산한다. flo (a) 배유 돌연변이체의 전분 생합성에 관해 완전히 알려지지 않았다.Some of the physicochemical properties of flo (a ) mutants have been reported (Kim et al. 1993 Korean J. Crop Sci. 38, 264-274). The flo (a) mutants have much lower amylose content, intact protein content, gel consistency, viscosity, granular hardness and density compared to wild type. The flo (a) mutant also produces larger volumes of rice cake, larger Brix reductions and increased amounts of alcohol compared to wild type. The starch biosynthesis of flo (a) embryonic mutants is not fully known.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 분질배유 돌연변이체의 표현형을 밝히고, 쌀의 분질배유 형질의 결정에 관여하는 유전자좌가 포함된 정밀유전자지도를 작성하고, 상기 정밀유전자지도에 기반을 둔(map-based) 클로닝 전략을 사용하여 FLO (a) 유전자를 분리하였다. The present invention has been made in accordance with the above-described demands, and in the present invention, the phenotype of the milk powder mutant is revealed, and a precision gene map including a locus involved in the determination of the milk powder trait of rice is prepared. FLO (a) gene was isolated using a map-based cloning strategy.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 쌀의 분질배유 형질을 결정하는 벼 유래의 FLO (a) 단백질을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a rice-derived FLO (a) protein to determine the milk powder trait of rice.

또한, 본 발명은 FLO (a) 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다.The present invention also provides a gene encoding the FLO (a) protein.

또한, 본 발명은 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a) 및 밀양23간의 교잡으로 생산된 F2 집단을 대상으로 유전자 연관분석을 실시하여 작성된 분질배유 형질을 결정하는 FLO(a)좌가 포함된 벼의 정밀유전자지도를 제공한다.In addition, the present invention includes a FLO (a) locus for determining the milk powder traits generated by genetic association analysis of the F 2 population produced by the hybridization between the milk mutant flo (a) and wheat sheep 23 of rice. Provide a precise genetic map of rice.

또한, 본 발명은 상기 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a) 및 밀양23간의 교잡으로 생산된 F2 집단를 제공한다.In addition, the present invention provides a population of F 2 produced by the hybridization between the rice endosperm mutant flo (a) and wheat sheep 23.

또한, 본 발명은 STS(Sequence Tagged Site) 및 SSR(Simple Sequence Repeat) 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 분자마커를 이용하여 분질배유 형질을 결정하는 FLO(a)좌를 동정하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for identifying the FLO (a) locus to determine the milking trait using a molecular marker selected from the group consisting of Sequence Tagged Site (STS) and Simple Sequence Repeat (SSR) marker.

또한, 본 발명은 분질성의 불투명한 배유 표현형을 나타내는 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a)를 제공한다.The present invention also provides a powdered milk mutant flo (a) of rice, which exhibits a milky, opaque oiled phenotype.

또한, 본 발명은 분질배유 형질을 결정하는 FLO (a)좌를 동정하기 위한 분자마커를 제공한다.The present invention also provides a molecular marker for identifying the FLO (a) locus, which determines the milking trait.

또한, 본 발명은 FLO (a)좌 동정용 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 제공한다.The present invention also provides oligonucleotide primer pairs for FLO (a) left identification.

또한, 본 발명은 flo (a) 대립인자의 dCAPS 분석용 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 제공한다.The present invention also provides oligonucleotide primer pairs for dCAPS analysis of the flo (a) allele.

본 발명의 정밀유전자지도는, 쌀의 분질배유 형질의 결정에 관여하는 FLO (a)좌를 확인함으로써, 쌀 분질배유 형질의 유전적 배경에 대한 직접적인 정보를 제공할 수 있다. flo (a) 배유 돌연변이체 쌀은 발효 시 알코올 생산성이 높으므로 쌀 곡주 제조 및 석유를 대체할 수 있는 친환경 에너지 대체물로서의 활용도가 높으며, 분질성 배유를 가진 쌀 생산을 위한 육종재료로서도 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.The precision gene map of the present invention can provide direct information on the genetic background of rice milk powder traits by identifying the FLO (a) locus involved in the determination of the milk powder traits of rice. flo (a) As the mutant rice has high alcohol productivity during fermentation, it can be used as an eco-friendly energy substitute to manufacture rice grains and to replace petroleum, and it can be useful as a breeding material for rice with powdered endosperm. It is expected to be able.

도 1은 flo (a) 돌연변이체 및 야생형 식물의 낱알(grain) 및 종자 배유의 형태를 보여준다. A 및 D는 성숙한 flo (a) (A) 및 야생형 (D) 식물의 낱알. B 및 E는 flo(a) (B) 및 야생형 (E) 식물의 거피 종자. C 및 F는 flo (a) 돌연변이체 (C) 및 야생형 (F)의 도정된 종자 배유의 종단면 및 횡단면. 배유의 내부 분질성은 flo (a) 돌연변이체에서 뚜렷하다.
도 2는 flo (a) 돌연변이체 및 야생형 대조구의 절단 배유 및 정제된 전분립의 주사전자현미경 분석을 보여준다. flo (a) 돌연변이체 (A, C) 및 야생형 (B, D)의 종자 배유의 절단면. flo (a) 돌연변이체의 배유는 야생형에 비해 불규칙적인 형태의 전분립으로 느슨하게 채워져 있다. flo (a)돌연변이체 (E)의 전분립은 크기가 다양하며 야생형 (F)에 비해 둥글다. 바(Bars)는 500 ㎛ (상부), 10 ㎛ (중간) 또는 5 ㎛ (아래)를 나타낸다.
도 3은 flo (a) 돌연변이체 및 야생형 품종인 화청의 성숙한 배유의 정제된 전분립의 X-선 회절 패턴을 보여준다. flo (a) 전분의 상대적 결정도는 야생형에 비해 낮다.
도 4는 FLO (a) 유전자의 위치추적 클로닝(Positional cloning)을 보여준다. (A) FLO (a)좌는 염색체 4의 마커 S04107 및 S04114 사이에 맵핑되었다. (B) 게놈 서열에 근거한 마커로 FLO (a) 유전자의 정밀지도 작성. 숫자는 1571 개체의 F2 식물체에서 동정된 재조합 수(recombination number)를 나타낸다. FLO (a)좌는 마커 P18 및 P22 사이의 게놈 DNA의 80 kb 구간으로 좁혀졌다. (C) FLO (a)의 구조는 flo (a)의 돌연변이 부위를 보여준다. 박스로 표시된 부분은 코딩 서열을 나타내며, 박스간의 선은 인트론을 나타낸다. (D) 서열분석 크로마토그램(chromatograms)은 flo (a)에서 돌연변이 표적 부위를 함유하는 RT-PCR 산물을 서열분석한 것이다. (E) 서열분석 크로마토그램은 flo (a)-2 유전자의 14th 엑손의 미스센스 (missense) 돌연변이를 보여준다. (F) flo (a)-3 유전자의 14th 인트론의 5'-스플라이싱(splicing) 연결부에서 첫 번째 뉴클레오티드에 해당하는 서열분석 크로마토그램. PCR 산물이 클로닝되어 개개 콜로니가 서열분석되었다. FLO (a) 유전자의 3 개의 돌연변이체 대립인자는 조기 정지코돈 (flo (a) 및 flo (a)-2) 및 변형된 스플라이싱(splicing) 부위 (flo (a)-3) (닫힌 직사각형)가 생성되게 하는 뉴클레오티드 치환을 포함한다.
도 5는 SSR 및 dCAPS 마커를 사용하여 동시분리(co-segregation) 및 점돌연변이의 예를 보여준다. (A) 마커 RM8217로는 재조합이 검출되지 않으며, 마커 RM8217은 F2 집단에서 분질성 표현형과 함께 분리(co-segregation)된다. (B) flo (a) 돌연변이체 및 22 개의 정상적인 벼 품종의 PCR 증폭산물의 크기 분석에 의한 flo (a) 돌연변이체에서 스프라이스(splice) 변이의 확인. 레인 1, flo (a) 돌연변이체; 레인 2~23, 정상적인 벼 변종 (표 3). (C) flo (a) 돌연변이체 표현형을 갖는 스플라이싱 오류(splicing-error) 돌연변이의 co-segregation이 F2 집단의 PCR 증폭산물의 크기 비교로 분석되었다. P1, M.23; P2, flo (a) 돌연변이체; M, 분자 마커.1 shows the morphology of grain and seed endosperms of flo (a) mutants and wild-type plants. A and D are grains of mature flo (a) (A) and wild type (D) plants. B and E are peeled seeds of flo (a) (B) and wild type (E) plants. C and F are longitudinal and cross-sectional views of the seed seeding of flo (a) mutants (C) and wild type (F). Internal divergence of the embryo is evident in the flo (a) mutant.
FIG. 2 shows scanning electron microscopy analysis of cleaved embryos and purified starch granules of flo (a) mutants and wild-type controls. Cleavage of seed endosperm of flo (a) mutants (A, C) and wild type (B, D). Drainage of the flo (a) mutant is more loosely packed with irregularly shaped starch granules than the wild type. Starch granules of the flo (a) mutant (E) vary in size and are rounder than wild type (F). Bars represent 500 μm (top), 10 μm (middle) or 5 μm (bottom).
3, flo (a) shows the X-ray diffraction pattern of purified starch granules of mature embryo of Hwacheong, a mutant and wild type variety. The relative crystallinity of flo (a) starch is lower than that of wild type.
4 is FLO (a) shows positional cloning of genes. (A) The FLO (a) locus was mapped between markers S04107 and S04114 of chromosome 4. (B) Precise mapping of the FLO (a) gene with markers based on genomic sequence. The numbers represent the recombination numbers identified in the F 2 plants of 1571 individuals. The FLO (a) locus was narrowed to 80 kb sections of genomic DNA between markers P18 and P22. (C) The structure of FLO (a) shows the site of mutation of flo (a) . The boxed portions represent coding sequences and the lines between boxes represent introns. (D) Sequencing Chromatograms are the sequencing of RT-PCR products containing mutant target sites in flo (a) . (E) Sequencing chromatogram shows missense mutation of 14 th exon of flo (a) -2 gene. (F) Sequencing chromatogram corresponding to the first nucleotide at the 5'-splicing linkage of the 14 th intron of the flo (a) -3 gene. PCR products were cloned and individual colonies sequenced. The three mutant alleles of the FLO (a) gene are premature stop codons ( flo (a) and flo (a) -2 ) and modified splicing sites ( flo (a) -3 ) (closed rectangles). ) To generate nucleotide substitutions.
5 is SSR and dCAPS markers are used to show examples of co-segregation and point mutations. (A) Recombination is not detected with marker RM8217, and marker RM8217 co-segregates with the heterologous phenotype in the F 2 population. (B) flo (a) identification of the extra (splice) mutations in flo (a) mutants by size analysis of the PCR amplification product of the mutant and normal 22 rice varieties. Lane 1, flo (a) mutant; Lanes 2-23, normal rice varieties (Table 3). (C) co-segregation of splicing-error mutants with flo (a) mutant phenotypes was analyzed by comparison of the size of PCR amplification products of the F 2 population. P1, M.23; P2, flo (a) mutant; M, molecular marker.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 쌀의 분질배유 형질을 결정하는 벼 유래의 FLO (a) 단백질을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a rice-derived FLO (a) protein for determining the milk powder trait of rice.

본 발명에 따른 FLO (a) 단백질의 범위는 벼(Oryza sativa)부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.The range of FLO (a) protein according to the present invention is rice ( Oryza) sativa ) includes a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a functional equivalent of the protein. "Functional equivalent" means at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90%, even more preferably at least 70% of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a result of the addition, substitution, or deletion of the amino acid Is 95% or more of sequence homology, and refers to a protein that exhibits substantially homogeneous physiological activity with the protein represented by SEQ ID NO: 2.

또한, 본 발명은 상기 FLO (a) 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 FLO (a) 단백질을 암호화하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.The present invention also provides a gene encoding the FLO (a) protein. Genes of the invention include both genomic DNA and cDNA encoding the FLO (a) protein. Preferably, the gene of the present invention may include the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. In addition, variants of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention. Specifically, the gene has a base sequence having a sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, respectively. It may include. The "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).

또한, 본 발명은 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a) 및 밀양23간의 교잡으로 생산된 F2 집단을 대상으로 유전자 연관분석을 실시하여 작성된 분질배유 형질을 결정하는 FLO (a)좌를 포함하는 벼의 정밀유전자지도를 제공한다. 본 발명에 사용되는 분질성의 불투명한 배유 표현형을 나타내는 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a)는 바람직하게는 야포니카(japonica) 벼 유래일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 야포니카(japonica) 품종 (cv.) 화청(Hwacheong) 유래일 수 있다. In addition, the present invention includes a FLO (a) locus for determining the milk powder traits produced by genetic association analysis of the F 2 population produced by the hybridization between the milk mutant flo (a) and wheat sheep 23 of rice. Provide a precise genetic map of rice. Flour mutant flo (a) of rice exhibiting a opaque opaque endosperm phenotype used in the present invention may preferably be derived from japonica rice, more preferably japonica varieties (cv) .) It may be from Hwacheong.

상기 유전자 지도는 구체적으로는 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a) 및 밀양23간의 교잡으로 생산된 1571 개체로 구성된 F2 집단을 대상으로 STS 마커를 이용한 RCA (recessive class analysis)와 STS 및 SST 마커를 이용한 유전자 연관분석을 수행하여 작성된 도 4에 표시된 정밀유전자지도일 수 있다. Specifically, the genetic map of the F 2 population composed of 1571 individuals produced by the hybridization between the flour mutant flo (a) and Miryang 23 of rice , and the RCA (recessive class analysis) using the STS marker and the STS and SST marker It may be a precise gene map shown in Figure 4 prepared by performing a gene association analysis.

상기 FLO (a)좌는 벼의 4번 염색체상에 위치할 수 있으며, 구체적으로는 벼의 4번 염색체상의 STS 마커인 S04107 및 S04114 사이에 위치할 수 있으며, 더욱 구체적으로는 벼의 4번 염색체상의 STS 마커인 P18 및 P22 사이의 ~81 kb 구간에 위치할 수 있다. The FLO (a) locus may be located on chromosome 4 of rice, and specifically, may be located between S04107 and S04114, which are STS markers on chromosome 4 of rice, and more specifically, chromosome 4 of rice. It may be located in the ~ 81 kb interval between the PTS and P22 STS markers on the image.

또한 상기 FLO (a)좌는 SSR 마커인 RM8217과 함께 분리(co-segregation)될 수 있다. In addition, the FLO (a) left may be co-segregated with the SSR marker RM8217.

바람직하게는 상기 STS 마커인 P18 및 P22는 벼 니폰베어(Nipponbare) 품종의 BAC (bacterial artificial chromosome) 클론인 AL606454 및 AL606445에 각각 앵커될(anchored) 수 있다. Preferably, the STS markers P18 and P22 may be anchored to AL606454 and AL606445, which are bacterial artificial chromosome (BAC) clones of rice Nipponbare varieties, respectively.

더욱 바람직하게는 상기 FLO (a)좌는 ORF (open reading frames) Os04g55230를 포함할 수 있으며, 상기 ORF Os04g55230는 TPR(tetratricopeptide repeat) 도메인-함유 단백질인 OsTPR을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. More preferably, the FLO (a) locus may include open reading frames (ORF) Os04g55230, and the ORF Os04g55230 may include nucleotides encoding OsTPR, which is a tetratricopeptide repeat (TPR) domain-containing protein.

또한, 본 발명은 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a) 및 밀양23간의 교잡으로 생산된 F2 집단을 제공한다. 구체적으로는 상기 F2 집단은 벼의 분질배유 돌연변이체 flo(a) 및 밀양23간의 교잡으로 생산된 1571 개체로 구성된 F2 집단일 수 있다. The present invention also provides a population of F 2 produced by hybridization between the milk mutant flo (a) and wheat sheep 23 of rice. Specifically, the F 2 population may be an F 2 population consisting of 1571 individuals produced by hybridization between rice endosperm mutant flo (a) and Miryang 23.

또한, 본 발명은 표 1에 제시된 STS 및 SSR 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 분자마커를 이용하여 유전자 연관 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 분질배유 형질을 결정하는 FLO (a)좌를 동정하는 방법을 제공한다. In addition, the present invention provides a method for identifying a FLO (a) locus for determining endosperm traits, comprising performing genetic association analysis using a molecular marker selected from the group consisting of the STS and SSR markers shown in Table 1. to provide.

또한, 본 발명은 분질성의 불투명한 배유 표현형을 나타내는 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a)를 제공한다. 상기 분질배유 돌연변이체 flo (a)는 벼에 돌연변이유발원을 처리하여 유도될 수 있다. 상기 "돌연변이유발원"은 물리적 돌연변이유발원과 화학적 돌연변이유발원을 모두 포함하는 의미이다. 일반적으로 돌연변이 식물체의 제작에는60Co, X선, γ선, β선(32P, 35S 등), 중성자 빔과 같은 물리적 돌연변이유발원 및 EMS(Ethyl Methane Sulfonate), EES(ethyl ethane sulfonate), EO(Ethylene oxide), NMC(Nitroso-Methyl Urea) 등과 같은 화학적 돌연변이유발원이 주로 사용된다. 상기 돌연변이유발원의 처리는 돌연변이유발원의 종류에 따라 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 이루어질 수 있다. 통상적으로는 물리적 돌연변이유발원의 처리는 조사(irradiation)에 의해, 화학적 돌연변이유발원의 처리는 처리 대상 식물체의 기관 등을 화학적 돌연변이유발원의 용액에 침지시킴에 의해 이루어질 수 있다. 바람직하게는 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a)는 야포니카(japonica) 품종 화청(Hwacheong) 벼에 MNU (N-methyl-N-nitrosourea)를 처리하여 유도될 수 있다. The present invention also provides a powdered milk mutant flo (a) of rice, which exhibits a milky, opaque oiled phenotype. The milking mutant flo (a) can be induced by treating the rice mutagenesis. The term “mutagenic” is meant to include both physical and chemical mutagens. In general, the production of mutant plants involves physical mutagens such as 60 Co, X-rays, γ-rays, β-rays ( 32 P, 35 S, etc.), neutron beams, ethyl ethane sulfonate (EMS), ethyl ethane sulfonate (EES), Chemical mutagens such as ethylene oxide (EO) and nitroso-methyl urea (NCC) are mainly used. Treatment of the mutagen can be made according to any method known in the art depending on the type of mutagen. Typically, the treatment of physical mutagenesis can be done by irradiation, and the treatment of chemical mutagenesis can be done by immersing the organs of the plant to be treated in the solution of the chemical mutagenesis. Preferably, the endosperm mutant flo (a) of the rice may be induced by treating MNU (N-methyl-N-nitrosourea) with japonica varieties Hwacheong rice.

바람직하게는 상기 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a)는 Os04g55230의 첫 번째 엑손의 뉴클레오티드 73 위치에 단일 뉴클레오티드 치환 (AAG에서 TAG로)으로 리신(lysine)이 정지코돈으로 변화되어 TPR(tetratricopeptide repeat) 도메인-함유 단백질인 OsTPR의 발현이 중단된 것일 수 있다. 또한, 상기 벼의 분질배유 돌연변이체 flo(a)는 Os04g55230의 14th 엑손의 뉴클레오티드 2490 위치에서 단일 뉴클레오티드 치환 (TGG에서 TGA로)으로 조기 정지코돈(premature stop codon)이 생성되게 한 SNP (single nucleotide polymorphis)를 가진 것일 수 있다. 또한, 상기 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a)는 Os04g55230의 14th 엑손 및 14th 인트론 사이에 변형된 스플라이싱(splicing) 부위 (GT에서 AT로) (도 4의 C~F)를 가진 것일 수 있다. Preferably, the rice mutant flo (a) is a single nucleotide substitution (AAG to TAG) at position nucleotide 73 of the first exon of Os04g55230, and the lysine is changed to a stop codon, thereby resulting in a tetratricopeptide repeat (TPR). The expression of OsTPR , a domain-containing protein, may be stopped. In addition, the rice mutant flo (a) is a single nucleotide substitution (TGG to TGA) at the nucleotide 2490 position of the 14 th exon of Os04g55230 to generate a premature stop codon (SNP). polymorphis). In addition, the endosperm mutant flo (a) of rice has a modified splicing site (GT to AT) (C-F in Fig. 4) between the 14 th exon and 14 th intron of Os04g55230. It may be.

또한 본 발명은 분질배유 형질을 결정하는 FLO (a)좌를 동정하기 위한 분자마커를 제공한다. 바람직하게는 상기 분자마커는 표 1에 제시된 STS 및 SSR 마커 중에서 선택된 분자마커일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 상기 분자마커는 STS 마커인 S04107, P07, S04109, P05, P12, P14, P18, P22, P02, S04114, 및 SSR 마커인 RM8217, RM1153 중에서 선택된 분자마커일 수 있다. 상기 STS 마커는 바람직하게는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (인디카에 대해) 및 http://www.rgp.dna.affrc.go.jp/ (야 포니카에 대해)에서 얻은 정보로부터 인디카 및 야포니카 벼간의 DNA 서열 차이에 근거하여 프라이머를 제작하여 개발될 수 있다. The present invention also provides a molecular marker for identifying the FLO (a) locus for determining the milking trait. Preferably the molecular marker may be a molecular marker selected from the STS and SSR markers shown in Table 1, more preferably the molecular marker is S04107, P07, S04109, P05, P12, P14, P18, P22, It may be a molecular marker selected from P02, S04114, and the SSR markers RM8217 and RM1153. The STS markers are preferably at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (for indica) and (for the pony's car) http://www.rgp.dna.affrc.go.jp/ Information obtained from Indica and Yaponica Based on the DNA sequence difference between rice can be developed by producing a primer.

바람직하게는, 상기 STS 마커 P12는 FLO (a)좌로부터 상부(upstream)로 재조합수 18에 위치하며, 서열번호 11 및 12로 구성되는 프라이머 쌍에 의해 인식될 수 있다. 상기 STS 마커 P14는 FLO (a)좌로부터 상부로 재조합수 22에 위치하며, 서열번호 13 및 14로 구성되는 프라이머 쌍에 의해 인식될 수 있다. 상기 STS 마커 P05는 FLO(a)좌로부터 상부로 재조합수 30에 위치하며, 서열번호 9 및 10으로 구성되는 프라이머 쌍에 의해 인식될 수 있다. 상기 STS 마커 S04109는 FLO (a)좌로부터 상부로 재조합수 38에 위치하며, 서열번호 7 및 9로 구성되는 프라이머 쌍에 의해 인식될 수 있다. 상기 STS 마커 P07DMS는 FLO (a)좌로부터 상부로 재조합수 50에 위치하며, 서열번호 5 및 6으로 구성되는 프라이머 쌍에 의해 인식될 수 있다. 상기 STS 마커 S04109는 FLO (a)좌로부터 상부로 재조합수 66에 위치하며 서열번호 7 및 8로 구성되는 프라이머 쌍에 의해 인식될 수 있다. 상기 SSR 마커 RM1153은 FLO (a)좌로부터 하부로 재조합수 9에 위치하며 서열번호 21 및 22로 구성되는 프라이머 쌍에 의해 인식될 수 있다. 상기 STS 마커 P02는 FLO (a)좌로부터 하부(downstream)로 재조합수 15에 위치하며 서열번호 23 및 24로 구성되는 프라이머 쌍에 의해 인식될 수 있다. 상기 STS 마커 S04114는 FLO (a)좌로부터 하부로 재조합수 28에 위치하며 서열번호 25 및 26으로 구성되는 프라이머 쌍에 의해 인식될 수 있다. 상기 SSR 마커 RM8217은 FLO(a)좌로부터 재조합수 0에 위치하며 서열번호 17 및 18로 구성되는 프라이머 쌍에 의해 인식될 수 있다. 상기 STS 마커 P18은 FLO (a)좌를 상부에서 플랭킹(flanking)하는 서열번호 15 및 16으로 구성되는 프라이머 쌍에 의해 인식될 수 있다. 상기 STS 마커 P22는 FLO (a)좌를 하부에서 플랭킹(flanking)하는 서열번호 19 및 20으로 구성되는 프라이머 쌍에 의해 인식될 수 있다. Preferably, the STS marker P12 is located in Recombinant Number 18 upstream from the FLO (a) locus and may be recognized by a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 11 and 12. The STS marker P14 is located in recombinant number 22 from the top of the FLO (a) locus and may be recognized by a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 13 and 14. The STS marker P05 is located in recombinant number 30 from the top of the FLO (a) locus and may be recognized by a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 9 and 10. The STS marker S04109 is located in recombinant number 38 from the top of the FLO (a) locus and can be recognized by a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 7 and 9. The STS marker P07DMS is located in recombinant number 50 from the top of the FLO (a) locus and can be recognized by a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 5 and 6. The STS marker S04109 can be recognized by a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 7 and 8 located in recombinant number 66 from the top of the FLO (a) locus. The SSR marker RM1153 can be recognized by a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 21 and 22, located in recombinant number 9 from the bottom of the FLO (a) locus. The STS marker P02 can be recognized by a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 23 and 24 located in recombinant water 15 downstream from the FLO (a) locus. The STS marker S04114 may be recognized by a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 25 and 26 located in recombinant number 28 from the bottom of the FLO (a) locus. The SSR marker RM8217 may be recognized by a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 17 and 18, located in recombinant number 0 from the FLO (a) locus. The STS marker P18 can be recognized by a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 15 and 16 flanking the FLO (a) locus at the top. The STS marker P22 can be recognized by a primer pair consisting of SEQ ID NOs: 19 and 20 flanking the FLO (a) locus at the bottom.

본 발명에서 빈번히 사용된 용어 “마커(marker)”는 유전적으로 불특정 연관된 유전자좌를 동정할 때 참고 점으로 사용되는 염기서열을 말한다. 이 용어는 또한 마커 서열을 증폭할 수 있는 프라이머 쌍으로 사용되는 핵산과 같은 마커 서열에 상보적인 핵산 서열에도 적용된다. 분자마커(molecular marker)의 유전자지도상의 위치는 유전자좌(genetic locus)로 일컬어진다. The term "marker" frequently used in the present invention refers to a nucleotide sequence used as a reference point when identifying a genetically unspecified associated locus. The term also applies to nucleic acid sequences that are complementary to marker sequences, such as nucleic acids that are used as primer pairs that can amplify the marker sequence. The location of the molecular markers on the genetic map is called the genetic locus.

또한 본 발명은 FLO (a)좌 동정용 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 제공한다. 바람직하게는 상기 프라이머 쌍은 표 1에 제시된 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 및 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍으로 구성되는 군으로부터 선택된 FLO (a)좌 동정용 프라이머 쌍일 수 있다. The present invention also provides oligonucleotide primer pairs for FLO (a) left identification. Preferably the primer pair is an oligonucleotide primer pair of SEQ ID NOs: 3 and 4 shown in Table 1; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 5 and 6; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 7 and 8; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 9 and 10; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 11 and 12; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 13 and 14; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 15 and 16; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 17 and 18; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 19 and 20; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 21 and 22; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 23 and 24; And a pair of FLO (a) left identification primers selected from the group consisting of oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 25 and 26.

상기 서열번호 3 내지 26으로 표시된 12 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍은 각각 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이루어져 있으며, 홀수로 표시된 서열번호가 정방향 프라이머이며, 짝수로 표시된 서열번호가 역방향 프라이머이다. 12 pairs of oligonucleotide primer pairs represented by SEQ ID NOS: 3 to 26 are each composed of a forward primer and a reverse primer, an odd sequence number is a forward primer, and an even number sequence is a reverse primer.

또한 본 발명은 flo (a) 대립인자의 dCAPS 분석용 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 제공한다. 바람직하게는 상기 프라이머 쌍은 서열번호 27 및 28로 표시된 flo(a) 대립인자의 dCAPS 분석용 프라이머 쌍일 수 있다. The present invention also provides oligonucleotide primer pairs for the dCAPS analysis of the flo (a) allele. Preferably, the primer pair may be a primer pair for dCAPS analysis of flo (a) alleles represented by SEQ ID NOs: 27 and 28.

상기 올리고뉴클레오티드는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 각 서열 내의 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 14개 이상, 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있으며, 서열번호 3의 프라이머 (21개 뉴클레오티드)는 서열번호 3의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.The oligonucleotide may be at least 10, at least 11, at least 12, at least 13, at least 14, at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, and at least 11, at least 11, at least 12, at least 16, at least 16, at least 16, at least 16, at least 16, at least 16, at least 17, at least 18, It may be an oligonucleotide consisting of segments of at least 19, at least 20, at least 21, at least 22, at least 23, at least 24 consecutive nucleotides, wherein the primer of SEQ ID NO: 3 (21 nucleotides) is Oligonucleotides consisting of segments of at least 15, at least 16, at least 17, at least 18, at least 19, at least 20 contiguous nucleotides in the sequence.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.In the present invention, "primer" refers to a single stranded oligonucleotide sequence that is complementary to the nucleic acid strand to be copied and may serve as a starting point for the synthesis of the primer extension product. The length and sequence of the primer should allow to start the synthesis of the extension product. The specific length and sequence of the primers will depend on the primer utilization conditions such as temperature and ionic strength as well as the complexity of the DNA or RNA target required.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
As used herein, oligonucleotides used as primers may also include nucleotide analogues, such as phosphorothioate, alkylphosphothioate or peptide nucleic acid, or It may comprise an intercalating agent.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, and the contents of the present invention are not limited to the following examples.

재료 및 방법Materials and methods

1.식물 재료 및 표현형 평가1. Plant material and phenotypic evaluation

flo (a) 돌연변이체는 벼 야포니카(japonica) 품종 (cv.) 화청(Hwacheong) (elite 한국 야포니카 품종)에 MNU (N-methyl-N-nitrosourea)를 처리하여 유도되었으며, 서울대학교 (서울, 한국) 식물학과의 벼유전자은행에 보존하였다. 양친 및 F1, F2 자손은 서울대학교의 실험농장에서 전통적인 방식에 따라 키웠다. 분질배유 표현형을 찾기 위해, F1 또는 F2 식물체의 모든 종자를 거피하여 조명기기를 사용하거나 또는 육안으로 관찰하였다. 추가적으로, 화학적 돌연변이처리로 별도로 유도되었으며, 동일한 표현형을 가진 2 개의 독립적인 flo (a) 돌연변이체를 대립성 검정(allelism test) 및 flo (a) 유전자의 서열 분석에 사용하였다.
 The flo (a) mutant was induced by treatment of rice japonica varieties (cv.) Hwacheong (elite Korean yaponica varieties) with MNU (N-methyl-N-nitrosourea). , Korea) preserved in the rice gene bank of the Department of Botany. Parents and F 1 and F 2 offspring were raised in a traditional manner on experimental farms at Seoul National University. To find the endosperm phenotype, all seeds of the F 1 or F 2 plants were peeled off and observed using a luminaire or visually. In addition, two independent flo (a) mutants with the same phenotype, separately induced by chemical mutagenesis, were used for the allelism test and sequencing of the flo (a) gene.

2. 쌀 2. Rice 배유로부터From oil 전분의 준비 Preparation of starch

flo (a) 돌연변이체 전체 건종자의 외종피를 벗기고, 종자 외층의 9.1%를 정백기(Kett, Tokyo, 일본)를 사용하여 제거하였다. 도정된 쌀은 유발에서 분말화하여 150㎛ 메쉬(mesh) 체로 걸렀다. 분말 (~1.0 g)에 메탄올 10 ㎖를 첨가하여 10분 끓였다. 균질 현탁액을 2,500×g, 10분간, 20℃에서 원심분리하여, 침전물을 90% (v/v) 메탄올 5 ㎖로 2 회 수세하였다. 건조시킨 침전물을 증류수 15 ㎖에 재현탁하여 상온에서 20분간 천천히 저었다. 현탁물을 600×g, 20분간, 20℃에서 원심분리하여, 침전물을 물 15 ㎖에 용해하여 원심분리하였다. 상기 침전물을 증류수 15 ㎖로 수세하여, 20분간 상온에서 저은 후, 원심분리하였다. 전분인 상기 침전물을 메탄올로 수세하여, 감압하에서 건조시켰다. 상기와 같이 준비한 전분을 SEM(주사전자현미경) 관찰 및 X-선 회절 분석에 사용하였다.
 flo (a) mutant All the seedlings of the dry seedlings were removed, and 9.1% of the seed outer layers were removed using a white flag (Kett, Tokyo, Japan). The milled rice was pulverized in jugi and filtered through a 150 μm mesh sieve. To the powder (˜1.0 g) was added 10 ml of methanol and boiled for 10 minutes. The homogeneous suspension was centrifuged at 2,500 × g for 10 minutes at 20 ° C., and the precipitate was washed twice with 5 ml of 90% (v / v) methanol. The dried precipitate was resuspended in 15 ml of distilled water and stirred slowly at room temperature for 20 minutes. The suspension was centrifuged at 600 x g for 20 minutes at 20 DEG C, and the precipitate was dissolved in 15 mL of water and centrifuged. The precipitate was washed with 15 ml of distilled water, stirred at room temperature for 20 minutes, and then centrifuged. The precipitate, which was starch, was washed with methanol and dried under reduced pressure. The starch prepared as above was used for SEM (scanning electron microscope) observation and X-ray diffraction analysis.

3. 주사전자현미경 분석3. Scanning electron microscope analysis

주사전자현미경 (SEM) 분석은 Ryoo 등 (2007 Plant Cell Rep. 26, 1083-1095)에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 전분 시료에 금피막을 입혀 10-20 kV의 가속전압에서 Stereoscan Leica Model 440 Scanning Electron Microscope (Leica Cambridge, UK; http://www.leica-microsystems.com)로 관찰하였다.
Scanning electron microscopy (SEM) analysis was performed according to the method described in Ryoo et al. (2007 Plant Cell Rep. 26, 1083-1095). Starch samples were coated with gold and observed with a Stereoscan Leica Model 440 Scanning Electron Microscope (Leica Cambridge, UK; http://www.leica-microsystems.com) at an acceleration voltage of 10-20 kV.

4. 전분의 X-선 4. X-ray of starch 회절diffraction

전분으로 생성된 X-선 회절 패턴은 Kubo 등 (2005 Plant Physiol. 137, 43-56)의 기재에 따라 분석하였다. 상기 방법으로 분리된 불용성 글루칸(glucans)을 100% 상대습도실에서 상온에서 24시간 동안 평형화(equilibrated)하였다. 전분의 X-선 회절 패턴은 RINT2000 X-ray diffractometer (Rigaku, Tokyo, 일본)를 사용하여 40 kV 및 40 mA에서 구리, 니켈 foil-filtered Kα radiation으로 얻었다. 2θ (two-theta angle)의 스캔 구간은 1 deg/min의 스캔속도로 4.0에서 40.0°이었다.
X-ray diffraction patterns generated with starch were analyzed according to the description of Kubo et al. (2005 Plant Physiol. 137, 43-56). Insoluble glucans isolated in this way were equilibrated for 24 hours at room temperature in a 100% relative humidity room. X-ray diffraction patterns of starch were obtained with copper and nickel foil-filtered Kα radiation at 40 kV and 40 mA using a RINT2000 X-ray diffractometer (Rigaku, Tokyo, Japan). The scan interval of 2θ (two-theta angle) ranged from 4.0 to 40.0 ° with a scan rate of 1 deg / min.

5. 5. DNADNA 추출 및  Extraction and PCRPCR 분석 analysis

벼의 총 게놈 DNA를 Causse 등 (1994 Genetics 138, 1251-1274)에 기재된 과정에 따라 밭에서 키운 F2 및 양친 식물의 잎에서 추출하였다. PCR 조건은 프라이머의 어닐링(annealing) 온도를 제외하고는 Qiao 등 (2008 Mol. Cells 25, 417-427)에 기재된 방법을 따랐다.
Total genomic DNA of rice was extracted from the leaves of F 2 and parent plants grown in the field according to the procedure described in Causse et al. (1994 Genetics 138, 1251-1274). PCR conditions followed the method described in Qiao et al. (2008 Mol. Cells 25, 417-427) except for the annealing temperature of the primers.

6. 지도작성(6. Mapping mappingmapping ))

F2 지도작성 집단으로는 flo (a) 및 M.23(밀양23)간의 교잡으로 총 1571 개체의 F2 식물체를 얻었다. flo (a) 유전자의 기초 지도작성을 위해, 서울대학교 작물분자육종실험실에서 디자인한 STS 마커 (미발표)를 사용하여 RCA (recessive class analysis) (Zhang 등 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8675-8679)를 수행하였다. 연관분석은 MAPMAKER version 3.0 소프트웨어를 사용하여 수행하였다 (Lander 등 1987 Genomics 1, 174-181). 유전자지도 거리는 코삼비(Kosambi) 방정식 (Kosambi 1944 Ann. Eugen. 12, 172-175)으로 평가하였다. flo (a)좌 구간의 물리지도 작성을 위해, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (인디카에 대해) 및 http://www.rgp.dna.affrc.go.jp/ (야포니카에 대해)에서 얻은 정보로부터 인디카 및 야포니카 벼간의 DNA 서열 차이에 근거하여 프라이머를 제작하여 새로운 STS 마커를 개발하였다. 본 발명에서 사용한 프라이머 서열 및 DNA 마커의 증폭길이는 표 1에 제시되어 있다. F 2 mapping population with the flo (a) and M.23 (Milyang 23) by hybridization between the F 2 plants were obtained for a total of 1571 individual. flo (a) Recessive class analysis (RCA) (Shang et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, using STS markers (unpublished) designed by Seoul National University's Crop Molecular Breeding Laboratory ) for basic mapping of the flo (a) gene. 8675-8679). Association analysis was performed using MAPMAKER version 3.0 software (Lander et al. 1987 Genomics 1, 174-181). Genetic map distances were evaluated using the Kosambi equation (Kosambi 1944 Ann. Eugen. 12, 172-175). For the physical map of the left section of flo (a ), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (for Indica ) and http://www.rgp.dna.affrc.go.jp/ ( A new STS marker was developed by constructing a primer based on the DNA sequence difference between Indica and Yaponica rice from the information obtained for Yaponica ). The amplification lengths of the primer sequences and DNA markers used in the present invention are shown in Table 1.

정밀지도 작성을 위해 디자인 및 사용된, PCR에 근거한 분자 마커PCR based molecular markers designed and used for precision mapping 마커Marker 마커형Marker type 크기 (bp)Size (bp) 정방향 프라이머 서열Forward primer sequence 서열 번호Sequence number 역방향 프라이머 서열Reverse primer sequence 서열 번호Sequence number S04107S04107 STSSTS 211211 5'-tgttcagacctgggtcacttt-3’5'-tgttcagacctgggtcacttt-3 ’ 33 5'-atcaactcgcctgctgttct-3’5'-atcaactcgcctgctgttct-3 ’ 44 P07P07 STSSTS 257257 5'-CCTGACCAAAAATGGGCTAA-3’5'-CCTGACCAAAAATGGGCTAA-3 ' 55 5'-GCAAGAAACGGAAACGAAAC-3’5'-GCAAGAAACGGAAACGAAAC-3 ' 66 S04109S04109 STSSTS 167167 5'-ggctgaagcatttggagaag-3’5'-ggctgaagcatttggagaag-3 ’ 77 5'-aagtataccttggcttcaagtgg-3’5'-aagtataccttggcttcaagtgg-3 ’ 88 P05P05 STSSTS 289289 5'-TCTCCAGATTTTCCTTCGTGA-3’5'-TCTCCAGATTTTCCTTCGTGA-3 ' 99 5'-GAATTCTGAAGGGGTTGTGG-3’5'-GAATTCTGAAGGGGTTGTGG-3 ' 1010 P12P12 STSSTS 231231 5'-ATCGAGGGACGACGTTGTAG-3’5'-ATCGAGGGACGACGTTGTAG-3 ’ 1111 5'-GCGTAGGAGCGTTTTTAAGG-3’5'-GCGTAGGAGCGTTTTTAAGG-3 ’ 1212 P14P14 STSSTS 239239 5'-TATCCGCAGCAATGCTTTAG-3’5'-TATCCGCAGCAATGCTTTAG-3 ’ 1313 5'-TAGCTCATATTGGCGTGGTG-3’5'-TAGCTCATATTGGCGTGGTG-3 ' 1414 P18P18 STSSTS 159159 5'-GGTCGAATGGTGGTGATAGG-3’5'-GGTCGAATGGTGGTGATAGG-3 ’ 1515 5'-GCGTATCGATCTGGGTTAGC-3’5'-GCGTATCGATCTGGGTTAGC-3 ’ 1616 RM8217RM8217 SSRSSR 178178 5'-ACTAGCGATGTCTGAGTTGAC-3’5'-ACTAGCGATGTCTGAGTTGAC-3 ’ 1717 5'-TATTCACATGCTTGCTCATC-3’5'-TATTCACATGCTTGCTCATC-3 ' 1818 P22P22 STSSTS 183183 5'-AGCCCAACATATGGCAGAAG-3’5'-AGCCCAACATATGGCAGAAG-3 ' 1919 5'-TCCTTTCGAGGGAGGAATTT-3’5'-TCCTTTCGAGGGAGGAATTT-3 ’ 2020 RM1153RM1153 SSRSSR 126126 5'-ACCAACGCCAAAAGCTACTG-3’5'-ACCAACGCCAAAAGCTACTG-3 ' 2121 5'-TACTCGCCCTGCATGAGC-3’5'-TACTCGCCCTGCATGAGC-3 ’ 2222 P02P02 STSSTS 284284 5'-GGATGGTGAGGTGAGGTGTT-3’5'-GGATGGTGAGGTGAGGTGTT-3 ' 2323 5'-CGCCGTCAGAGAGGTAAAAG-3’5'-CGCCGTCAGAGAGGTAAAAG-3 ' 2424 S04114S04114 STSSTS 169169 5'-TGCATGCAAAATCTATCTACGTG-3’5'-TGCATGCAAAATCTATCTACGTG-3 ' 2525 5'-AGTCCGTTTCGCATGTGTTT-3’5'-AGTCCGTTTCGCATGTGTTT-3 ' 2626

상기 STS 마커는 니폰베어(Nipponbare) 품종의 해당 BAC (bacterial artificial chromosome) 또는 PAC (P1-derived artificial chromosome) 클론에 앵커(anchored)되었으며, 상기 BAC 또는 PAC 클론은 소프트웨어 tool, BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 거쳐 IRGSP에 의해 방출되어 있다. 최종적으로, 상기 BAC 또는 PAC 클론은 Pairwise BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html)를 사용하여 alignment 분석에 의해 contig로 어셈블(assembled)되었다.
The STS markers were anchored to the corresponding bacterial artificial chromosome (BAC) or P1-derived artificial chromosome (PAC) clones of the Nipponbare cultivar, and the BAC or PAC clone was a software tool, BLAST (http: // It is released by IRGSP via www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Finally, the BAC or PAC clones were assembled into contig by alignment analysis using Pairwise BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html).

7. 후보 유전자 분석7. Candidate Gene Analysis

flo (a) 유전자의 물리지도에 근거하여, flo (a) 유전자 구간에서 니폰베어 품종의 해당 BAC 또는 PAC 서열을 TIGR 데이터베이스 (http://www.tigr.org)에서 다운로드하였다. ORFs (Open reading frames) 및 가능한 엑손/인트론 경계부는 Rice Genome Automated Annotation System (Rice GAAShttp://ricegaas.dna.affrc.go.jp/rgadb/)에 기재된 서열을 사용하여 예측하였다. 각각의 예측되는 유전자의 ORF 서열은 KOME (http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/) 및 Genbank에서 전장 cDNA 및 EST (expressed sequence tag) 검색에 사용하였다. 후보 유전자의 해독된 아미노산 서열은 기능 예측을 위해 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)를 통해 분석하였다. 후보 유전자의 전장 게놈 DNA 서열은 화청 및 flo (a) 돌연변이체의 게놈 DNA의 증폭에 사용할 특정 PCR 프라이머 제작을 위해 몇 개의 단편으로 나누었다. PCR 산물은 TA 클로닝 (iNtRON Biotechnology, INC, 한국)을 위해 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물을 pGEM-T Easy Vector (Promega, USA)에 도입하여, 대장균(E. coli ) 균주 DH5α로 형질전환하였다. 재조합 플라스미드는 ABI Prism 3730 XL DNA Analyzer (PE Applied Biosystems, USA)로 서열분석하여, BLAST network service (National Center for Biotechnology Information, NCBI)로 서열 정렬(alignment)을 수행하였다.
Based on the physical map of flo (a) gene, in flo (a) gene segment that BAC or PAC sequences of Nippon bare varieties were downloaded from TIGR database (http://www.tigr.org). Open reading frames (ORFs) and possible exon / intron boundaries were predicted using the sequences described in the Rice Genome Automated Annotation System (Rice GAAS http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/rgadb/). The ORF sequence of each predicted gene was used for full length cDNA and EST (expressed sequence tag) searches in KOME (http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/) and Genbank. The translated amino acid sequences of the candidate genes were analyzed via BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) to predict function. The full-length genomic DNA sequence of the candidate genes was divided into several fragments for the construction of specific PCR primers for use in amplification of genomic DNA of hwa and flo (a) mutants. PCR products were purified using a PCR purification kit for TA cloning (iNtRON Biotechnology, INC, Korea). The purified PCR product was introduced to the pGEM-T Easy Vector (Promega, USA), Escherichia coli (E. coli) strains It was transformed into DH5 α. Recombinant plasmids were sequenced with ABI Prism 3730 XL DNA Analyzer (PE Applied Biosystems, USA) and sequence alignment was performed with BLAST network service (National Center for Biotechnology Information, NCBI).

8. 8. dCAPSdCAPS 분석 analysis

flo (a) 대립인자의 dCAPS 분석을 위하여, 목적 SNP로부터 5' 방향에 두 염기의 미스매치(mismatches)에 근거한 프라이머 (미스매치된 정방향, 5'- CGGCGGCAAAGGCGACAAGAGGATT-3': 서열번호 27; 역방향, 5'-CAGCAGCAGCGAATTCAATGTTCGC-3': 서열번호 28)를 dCAPS Finder 2.0 program (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)을 사용하여 디자인하였다. 상기 프라이머로 flo (a)의 야생형 대립인자에 MseI 절단부위를 갖는 179 bp의 PCR 증폭산물이 생성되었다. 상기 PCR 증폭산물은 MseI으로 절단 후 검출되었으며, 3% 수평 아가로스 겔상에서 분리되어 UV광하에서 가시화되어 촬영되었다.
 flo (a) primers based on mismatches of two bases in the 5 'direction from the target SNP (mismatched forward, 5'- CGGCGGCAAAGGCGACAAGAGAGGATT-3': SEQ ID NO: 27; reverse, for dCAPS analysis of alleles) 5'-CAGCAGCAGCGAATTCAATGTTCGC-3 ': SEQ ID NO: 28) was designed using the dCAPS Finder 2.0 program (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html). The primers produced 179 bp PCR amplification products with Mse I cleavage sites in the wild type allele of flo (a) . The PCR amplification product was detected after cleavage with Mse I, separated on a 3% horizontal agarose gel and visualized under UV light.

실시예Example 1.  One. floflo (a)(a) 돌연변이체의  Mutant 표현형적Phenotypic 특성 characteristic

flo (a) 돌연변이체는 식물 생장기 중에는 야생형과 비교 시 가시적으로 비정상적인 표현형을 보이지 않았다. 성숙한 kernel 표현형은 야생형 벼 cv. 화청과 유사하였다 (도 1의 A, D). flo (a) 돌연변이체의 거피한 쌀은 쉽게 부서지는 배유이며 분질성인 불투명한 배유 표현형을 나타내었으며, 야생형 품종은 정상적인 투명한 배유로 보였다 (도 1의 B, E). 성숙한 돌연변이체 쌀의 단면을 보면 배유의 내부는 분질성이었으나, 외부는 정상적인 모양이었다 (도 1의 C, F). The flo (a) mutant showed no visible abnormal phenotype during plant growth compared to the wild type. Mature kernel phenotype is wild type rice cv. Similar to Hwacheong (A, D of Figure 1). Peeled rice of the flo (a) mutant showed an opaque embryonic phenotype that was easily broken and milky, and wild-type varieties appeared to be normal transparent endosperm (FIGS. 1B and E). In the cross section of the mature mutant rice, the inside of the endosperm was powdery, but the outside was normal (Fig. 1 C, F).

추가적으로, FLO (a) 돌연변이가 낱알(grain)의 모양 및 수확형질에 미치는 영향을 조사하였다 (표 2). flo (a) 돌연변이체 현미의 낱알 크기는 야생형보다 약간 작았다 (낱알 길이는 야생형의 95.4%; 낱알 너비는 야생형의 96.0%). flo (a)의 식물체 당 원추화서의 수는 또한 야생형에 비해 약간 적었다 (야생형의 94.6%). flo (a) 쌀의 천립중량은 야생형에 비해 상당히 가벼웠다 (야생형의 81.9%). 그러나, flo (a)의 원추화서 당 낱알의 수는 야생형에 비해 뚜렷하게 증가하였다 (112.4%). 돌연변이체의 낱알 수확량은 야생형보다 더 낮았다. 식물체 외형 및 출수일과 같은 농업적 형질에서는 차이가 보이지 않았다. In addition, the effects of FLO (a) mutations on grain shape and harvest traits were investigated (Table 2). The grain size of the flo (a) mutant brown rice was slightly smaller than the wild type (95.4% of the grain length; 96.0% of the grain width). The number of cone inflorescences per plant of flo (a) was also slightly lower than that of wild type (94.6% of wild type). The grain weight of flo (a) rice was significantly lighter than wild type (81.9% of wild type). However, the number of grains per cone of flo (a) was significantly increased (112.4%) compared to wild type. The grain yield of the mutants was lower than that of the wild type. There were no differences in agricultural traits such as plant appearance and date of release.

야생형 및 flo (a)간의 낱알 및 수확형질 비교Comparison of Grain and Harvest traits between wild type and flo (a) 길이
(mm)Length
(mm) 폭
(mm)width
(mm) 천립중량
(g)Weight
(g) 원추화서/
식물의 수Cone /
Number of plants 곡물/
원추화서의 수grain/
Number of inflorescences 낱알 수확
(g/10 식물)Grain harvest
(g / 10 plant) 야생형Wild type 4.79±0.184.79 ± 0.18 2.75±0.252.75 ± 0.25 18.4±0.818.4 ± 0.8 10.6±0.9710.6 ± 0.97 135.4±0.88135.4 ± 0.88 353.9±0.58353.9 ± 0.58 floflo (a)(a) 4.60±0.134.60 ± 0.13 2.64±0.162.64 ± 0.16 14.8±0.114.8 ± 0.1 11.2±0.7811.2 ± 0.78 150.2±0.68150.2 ± 0.68 324.5±0.42324.5 ± 0.42

실시예Example 2.  2. floflo (a)(a) 돌연변이는 쌀  Mutant Rice 배유의Endosperm 전분립의Starch 형태적 특성을 변화시킨다 Change morphological characteristics

도정된 쌀 낱알 단면의 SEM 관찰에서 flo (a) 돌연변이체가 아마 비정상적인 전분립 형태로 인하여 느슨하게 채워진 배유를 갖는 것으로 보였다 (도 2의 A, C). 대조적으로, 야생형 배유는 전분립이 빽빽하게 채워진 배유를 갖는 것으로 보였다 (도 2의 B, D). 야생형 품종의 전분립은 날카로운 모서리를 가진 불규칙적인 다면형이었으며, 한편 flo (a) 돌연변이체의 전분립은 야생형보다 약간 크고, 크기가 다양하며 불규칙적인 구면형이었다 (도 2의 E, F).SEM observations of inverted rice grain sections showed that the flo (a) mutant had a loosely filled endosperm, probably due to an abnormal starch morphology (FIGS. 2A and 2C). In contrast, wild-type udders appeared to have densely filled endosperm (Fig. 2 B, D). The starch granules of wild type varieties were irregular polyhedrons with sharp edges, while the starch granules of flo (a) mutants were slightly larger, varying in size, and irregular spherical than wild type (E, F in Fig. 2).

전분은 두 가지 일차적으로 다른 결정상 구조인 A-형 및 B-형에서 나타나는 무정형 및 결정성 구간 양자를 함유하는 반결정성의 생체고분자이다. 쌀 낱알의 배유 전분은 A-형 결정상 패턴 (Ryoo 등 2007 Plant Cell Rep. 26, 1083-1095)을 나타낸다. 야생형 및 flo (a) 돌연변이체 식물의 배유 전분을 사용하여 X-선 회절 분석을 수행하여 모두가 전형적인 A-형 결정상 패턴을 나타내는 것이 확인되었다 (도 3). flo (a) 돌연변이체의 전분립은 그러나, 야생형 화청에 비해 낮은 peak 강도를 나타내었다 (도 3). 따라서, X-선 회절 분석으로 FLO (a) 유전자 기능의 소실로 인하여 결함이 있는 전분 결정상 구조 및 보다 소량의 결정화가 이루어졌으나, 결정형의 변화는 없다는 것이 증명되었다.
Starch is a semicrystalline biopolymer containing both amorphous and crystalline segments present in two primarily different crystalline structures, A- and B-forms. The endosperm starch of rice grains shows an A-type crystal phase pattern (Ryoo et al. 2007 Plant Cell Rep. 26 , 1083-1095). X-ray diffraction analysis was performed using endosperm starches of wild type and flo (a) mutant plants to confirm that all exhibited a typical A-type crystal phase pattern (FIG. 3). Starch granules of the flo (a) mutant, however, exhibited a lower peak intensity compared to wild type sap (FIG. 3). Thus, X-ray diffraction analysis demonstrated that the defective starch crystal phase structure and smaller amounts of crystallization resulted from the loss of FLO (a) gene function, but no change in crystalline form.

실시예Example 3.  3. FLOFLO (a)(a) 유전자의 정밀지도작성( Genetic Mapping of Genes finefine mappingmapping ))

flo (a) 돌연변이체에 의해 정의된 유전자좌는 이전에 염색체 4상의 단일 형태적 마커, lg ( liguleless )에 연관되어 있었다 (Kim 등 1993 Korean J. Crop Sci. 38, 264-274). 지도에 근거한(map-based) 클로닝으로 FLO (a) 유전자를 더욱 정밀하게 맵핑하기 위해, flo (a) 및 M.23간의 교잡으로 유래된 1571 개체로 구성된 F2 집단을 만들었으며, 상기 집단에서 371 개체는 flo (a) 돌연변이체 표현형을, 1200 개체는 야생형 표현형을 나타내었다. 40 개 flo (a) 돌연변이체의 유전분석은 처음에는 FLO(a) 유전자를 두 STS 마커, S04107 및 S04114 사이의 게놈 단편에 두었다 (도 4의 A). 그러나 재조합체가 STS 마커인 S04109에 의해 검출되지 않았다는 것은 상기 마커가 돌연변이된 flo (a)와 함께 분리된다는 것을 나타낸다. FLO (a) 유전자의 위치를 정하기 위해, 상기 구간 내에서 12 개의 PCR에 근거한 분자 마커 (표 1)를 이용하여 F2 집단의 나머지 식물체를 사용하여 PCR을 수행하였다. 최종적으로, flo (a)좌는 마커 P18 및 P22에 의해 정의된 ~81 kb 구간으로 한정되었으며 두 BAC (bacterial artificial chromosome) 클론, AL606454 및 AL606445에 의해 플랭킹되어 있다 (도 4의 B). F2 지도작성 집단에서 RM8217에 대한 재조합체가 동정되지 않았다는 것은 (도 5의 A), 상기 마커가 FLO (a) 유전자에 인접하여 함께 분리된다는 것을 나타낸다.
 flo (a) the loci defined by the mutants single morphological markers on chromosome 4, previously, was associated to lg (liguleless) (Kim, such as 1993 Korean J. Crop Sci. 38, 264-274). In order to map FLO (a) genes more precisely by map-based cloning, we created an F 2 population consisting of 1571 individuals derived from the hybridization between flo (a) and M.23. 371 individuals had a flo (a) mutant phenotype and 1200 individuals had a wild type phenotype. Genetic analysis of 40 flo (a) mutants initially placed the FLO (a) gene in a genomic fragment between two STS markers, S04107 and S04114 (FIG. 4A). However, the fact that the recombinant was not detected by the STS marker S04109 indicates that the marker is isolated with the mutated flo (a) . In order to locate the FLO (a) gene, PCR was performed using the remaining plants of the F 2 population using molecular markers based on 12 PCRs (Table 1) within this interval. Finally, the flo (a) locus was confined to the ~ 81 kb interval defined by markers P18 and P22 and flanked by two bacterial artificial chromosome (BAC) clones, AL606454 and AL606445 (FIG. 4B). No recombinants identified for RM8217 in the F 2 mapping population (FIG. 5A ) indicate that the markers are isolated together adjacent to the FLO (a) gene.

실시예Example 4.  4. TRPTRP ( ( tetratricopeptidetetratricopeptide repeatrepeat ) 도메인 함유 단백질이 A) domain containing protein FLOFLO (a)(a) 유전자의 후보이다 Is a candidate for genes

정밀지도 작성 및 유용한 벼 게놈 annotation 데이터베이스 (http://www.tigr.org, http://www.gramene.org)로부터 얻은 자료에 근거하여, 총 15 개의 추정 ORF (putative Open Reading Frames)가 상기 81 kb 게놈 구간에서 동정되었다. flo (a) 돌연변이가 있는 것을 찾기 위해, 15 개의 추정 유전자의 게놈 DNA 서열을 PCR로 증폭하여 서열분석하였다. 화청 야생형 및 flo (a) 돌연변이체의 서열 비교는 flo (a) 대립인자가 Os04g55230의 첫 번째 엑손의 뉴클레오티드 73 위치에 단일 뉴클레오티드 치환 (AAG에서 TAG로)이 있음을 보여준다. 상기 치환으로 리신(lysine)이 정지코돈으로 되어 단백질 발현이 중단되었다. 상기 점돌연변이는 또한 RT-PCR 산물의 서열분석으로도 확인되었다 (도 4의 C, D). 추가적으로, 추정되는 다른 ORF를 서열분석하였다. 임의의 다른 ORF 구간의 DNA 서열에서는 차이가 검출되지 않았으므로, Os04g55230가 FLO (a)에 대한 강력한 후보이다 (도 4의 C). 상기 유전자는 23 개의 엑손 및 22 개의 인트론으로 구성되어 있다. 상기 유전자에 대한 상보적인 DNA는 단백질-단백질간의 상호작용에 작용하는 3 개의 TPR 모티프를 포함하여 5163 bp이며, 추정되는 단백질 서열은 1720 개의 아미노산으로 구성된다 (Blatch 및 Lassle 1999 Bioessays 21, 932-939).Based on data from precision mapping and useful rice genome annotation databases (http://www.tigr.org, http://www.gramene.org), a total of 15 putative open reading frames (ORFs) It was identified in 81 kb genome segment. To find the flo (a) mutation, the genomic DNA sequences of 15 putative genes were amplified by PCR and sequenced. Sequence comparisons of the whey wild type and flo (a) mutants show that the flo (a) allele has a single nucleotide substitution (from AAG to TAG) at position nucleotide 73 of the first exon of Os04g55230. This substitution caused lysine to be a stop codon, which stopped protein expression. The point mutation was also confirmed by sequencing of the RT-PCR product (C, D of Figure 4). In addition, other putative ORFs were sequenced. Os04g55230 is a strong candidate for FLO (a) since no difference was detected in the DNA sequence of any other ORF segment (FIG. 4C). The gene consists of 23 exons and 22 introns. The complementary DNA for the gene is 5163 bp, including three TPR motifs that act on protein-protein interactions, and the putative protein sequence consists of 1720 amino acids (Blatch and Lassle 1999 Bioessays 21 , 932-939 ).

FLO (a)의 첫 번째 엑손에 A에서 T로의 돌연변이가 다른 품종의 자연변이체로 존재하는지 찾기 위해, 22 개의 대표적인 인디카 및 야포니카 벼 품종의 dCAPS 분석을 수행하였다. 상기 22 개 주(strains) 모두에서 야생형 대립인자에 해당하는 절단된 단편이 나타났다 (도 5의 B, 표 3). 더욱이, 상기 dCAPS 마커와 연관된 유전자형은 F2 집단의 matching 표현형과 함께 분리되었다 (도 5의 C).DCAPS analysis of 22 representative indica and yaponica rice varieties was performed to find out whether the A to T mutation in the first exon of FLO (a) exists as a natural variant of another variety. Truncated fragments corresponding to wild-type alleles were seen in all 22 strains (FIG. 5B, Table 3). Moreover, genotypes associated with the dCAPS markers were separated along with the matching phenotype of the F 2 population (FIG. 5C).

dCAPS 분석에 사용된 벼 변종Rice Varieties Used in dCAPS Analysis No.No. 변종sport 기원origin 아미노산*amino acid* No.No. 변종sport 기원origin 아미노산*amino acid* 1One flo (a) 돌연변이체 flo (a) mutant 정지코돈Stop codon 1313 GopumbyeoGopumbyeo 한국Korea LysLys 22 화청벼Flower garden 한국Korea LysLys 1414 Milyang 23Milyang 23 한국Korea LysLys 33 동진벼Dongjin Rice 한국Korea LysLys 1515 DasanbyeoDasanbyeo 한국Korea LysLys 44 니폰베어Nippon Bear 일본Japan LysLys 1616 HabatakiHabataki 일본Japan LysLys 55 합천 1Hapcheon 1 한국Korea LysLys 1717 CheongcheongbyeoCheongcheongbyeo 한국Korea LysLys 66 CP-SLOCP-SLO 필리핀Philippines LysLys 1818 IR 36IR 36 필리핀Philippines LysLys 77 일품벼A la carte 한국Korea LysLys 1919 TadukanTadukan 필리핀Philippines LysLys 88 화청벼Flower garden 한국Korea LysLys 2020 Chinsurah Boro IIChinsurah Boro II 인도India LysLys 99 고시히까리Koshihikari 일본Japan LysLys 2121 IR 64IR 64 필리핀Philippines LysLys 1010 선농 27Sonong 27 중국China LysLys 2222 Diantun 502Diantun 502 중국China LysLys 1111 KunmingxiaobaiguKunmingxiaobaigu 중국China LysLys 2323 NampungbyeoNampungbyeo 한국Korea LysLys 1212 Dianxi 1Dianxi 1 중국China LysLys * FLO(a) 단백질의 25th 아미노산.25 th amino acid of FLO (a) protein.

FLO (a) 유전자가 분질배유와 인과관계가 있는지 추가적으로 확인하기 위해, 대립인자의 상보성 시험(complementation test)을 3 개의 분질배유 돌연변이체인 flo(a), flo (a)-2, 및 flo (a)- 3간의 교잡으로 수행하였다. 3 개의 교잡으로 생성된 F1 식물체 모두는 "분질배유" 표현형을 보였으며, 이는 돌연변이체의 표현형이 동일한 유전자에 의해 조절된다는 것을 나타낸다. 더욱이, 서열 분석으로 flo (a) 돌연변이체의 다른 두 대립인자에 점돌연변이가 검출되었다 (도 4의 E, F). flo (a)-2 대립인자에는 Os04g55230의 14th 엑손의 뉴클레오티드 2490 (TGG에서 TGA로)에 조기 정지코돈(premature stop codon)이 생성되게 한 SNP (single nucleotide polymorphis)가 있다. flo (a)-3 대립인자에는 14th 엑손 및 14th 인트론 사이에 변형된 스플라이싱(splicing) 부위 (GT에서 AT로) (도 4의 C~F)가 있다. 상기 결과는 FLO (a) 유전자가 TPR(tetratricopeptide repeat) 도메인-함유 단백질인 OsTPR을 암호화한다는 것을 강력하게 나타낸다.To further confirm that the FLO (a) gene is causally related to the milking, a complementation test of alleles was performed on three milking mutants : flo (a), flo (a) -2, and A hybridization between flo (a) -3 was performed. All three hybridization-produced F 1 plants showed a "milking" phenotype, indicating that the phenotype of the mutant is regulated by the same gene. Moreover, sequencing detected point mutations in the other two alleles of the flo (a) mutant (E, F in FIG. 4). The flo (a) -2 allele contains a single nucleotide polymorphis (SNP) that causes premature stop codons to be generated at nucleotide 2490 (TGG to TGA) at 14 th exon of Os04g55230. The flo (a) -3 allele has a modified splicing site (GT to AT) (C-F in FIG. 4) between the 14 th exon and the 14 th intron. The results strongly indicate that the FLO (a) gene encodes OsTPR , a tetratricopeptide repeat (TPR) domain-containing protein.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Floury Endosperm Gene, FLO(a), molecular marker and fine mapping of FLO(a) in Rice <130> PN10028 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5163 <212> DNA <213> rice Flo(a) CDS <400> 1 atggccccca agggcgccgg ccgtggcaag ggcaggggcg gcggcggcgg cggcaaaggc 60 gacaagagga agaaggaaga gaaagttgtg ccgagtgcca tagacgtcac ggttgtcact 120 ccctatgaat cccaggttac actcaagggg atatctacgg accgtgttct ggacgtgagg 180 aagctgctgg gctcgaatgt ggagacgtgc cacctgacaa actactcgct ctcgcacgtg 240 acgcgagggc agcggctgga ggacggcgtg gaaatcgtgt cgctgaaacc atgctctctc 300 accatcgtgg aagaggagta cgcgacggag gcggcggcgg cggcgcaagt ccggcggctg 360 ctggacatcg tcgcctgcac caccgcgttc gtgaacaagc cccgcgacgg cgccaagcac 420 aagtcgtcca agcacgcgcg cccggcgacg ccgccgtcac cgcccgcgct cgccgcctcc 480 cccgacgccc atggcgccgg cgccgcccag gcgccgccga tatcggaggc gcacgacatg 540 gcggccatcc gtccgccgcc caggctgggc gagttctacg acttcctctc cttcgcccac 600 ctcaccccgc ccgtccactt tatcaggagg aaggagagca atggcgcttc tcaggaaggc 660 gactacttcg aaatcgaggt gaaagtttgc aatgggaagc tcctgcacat cgttgcttcc 720 gtcaagggct tctattcggc agggaagccg cacaccgtga gccactcctt ggtggatctg 780 ttgcaacagc tcagcagtgc atttgccaat gcatatgatg cactgatgaa agcttttctg 840 gatcacaaca agtttgggaa tctaccatac ggatttcgtg caaacacatg gcttattcct 900 cctatatact tggattctgc tacaaagtgc ccagcattac cagttgagga tgagaattgg 960 ggtggaaacg ggggtggcaa tgggcgagat ggaaagtatg acagaagacg atgggcaaaa 1020 gaattttcta ctttggctag aatgccatgc aaaactgagg aagggagggt gatcagagac 1080 cggaaggctt ttcttttaca caatctcttt gtagatacag caatttttag agctgcatca 1140 acaatacaga gactcattga tctgtctggg aactcaacta gtcaacaagc tggcctagat 1200 ggttctttag caatcgagga acgtgttggt gacttgctta taactgtaaa gagggatcag 1260 gctgatgcta gtttaaagct ggaggataaa gttgatggag ttgcactcta tcaaaccggt 1320 tctatggata tatcacaaag aaatcttcta aaaggtttaa cttctgatga aagtgtcgtt 1380 gttaaggaca cctcaatact cggagtggtt attgttaaac attgtggata tacagcaaca 1440 gtgaaggttt cagggcgcac aaaggacgga aatggtggca aacaaaccag tgatatctgt 1500 gatcatctcg atggaatttc gaatgttgat gtagatgatt tgccagatgg aggttctaat 1560 gccttgaaca ttaacagtct aagaatatca ctgccaaaaa ttgtcaactc agacatcgct 1620 agtactcagt gtcctactcc gcagtctcat gttgataatc atgcaaggaa actagtgcgc 1680 aaaatacttg aagatagctt gatgaagctg gagaacatgc ctgccaataa tcctagaacc 1740 atcagatggg aacttgggtc atcctggctg caaaacttgc agaaaaagga ttcgccggca 1800 tctgaggaca agaaaaatgc aggacatgtt gaaaaagaga caactatcaa aggtcttggt 1860 aagcactttg aacagctaaa gaaaattaaa aagaaagaat gccatgttga aggtgctatg 1920 tctgagaagg aagactctga cagtaactgc tctgtcataa atggcatgga agaatctgaa 1980 aacaccaagg agactgatat tagcaagctg atgtcagagg atgatttctg tcgccttaag 2040 gatctgggag ctggacttca tcaaaagtcc cttgaagagc tcactatgat ggcccataaa 2100 ttctatgatg atactgcgct tccaaagctg gtggctgatt ttgcttccct tgaactttct 2160 cctgtggatg gaagaaccat gaccgatttc atgcacacaa ggggtcttaa tatgtgctcc 2220 ttaggccgtg tggtagagct cgcggagaag cttccacata tccagtcaat ttgcatccat 2280 gaaatggtca ttaggtcctt taagcacatt gttcgagctg ttattgcagc tgttgatgac 2340 atgcaaaata tgtctgcagc tattgctgag actttaaaca ttttacttgg atgcccaaga 2400 cttgaaagtg gcactgaaac agatgcacat agtgaacata atttgagatt tagatgggta 2460 gagaggttcc tttctaaaag gtacaattgg aaattgaaag atgaatttgc acacttgcgg 2520 aaatttatca ttctgagagg tctttgcagt aaggttggac ttgagttggt tgcgagagat 2580 tatgatatga atagcccaaa tccatttgac aaatctgaca tagttaacat tattcctgta 2640 tgcaagcatg tggtgtactc ttctattgat ggtcgaaact tattagaatc atcaaagatg 2700 gctttggata aaggaaaact tgatgatgcc gtcaacttcg gaacaaaggc gttgtccaaa 2760 attgtagcag tttgtggtcc ataccatcgg ctgactgcta atgcgtacag tcttcttgct 2820 gtagttcttt accatactgg agattttaat caggcaacta tatatcagca gaaggcactt 2880 gatatcaatg aaagagagct aggtcttgac cacccagaaa ctatgaagag ttacggggat 2940 ttatctgtct tctactaccg tctccagcac atcgaaatgg ctctaaagta tgtcaaccgt 3000 gcactatatc tactccaatt ttcttgtggg ctttcacatc caaattcagc tgccacatac 3060 ataaatgtgg ctatgatgga agaaggtatg ggaaatgttc atgtcgctct caggtacttg 3120 catgaagcac tgaagtgcaa caagagactg ctaggagctg atcacattca gactgctgcg 3180 agctatcatg ccatagccat agccctctca atgatggatg catactcctt gagtgttcag 3240 catgaacaga ccaccttaca gatacttcag gagaaactag gacaagatga ccttcgaact 3300 caggatgctg ctgcatggct tgagtatttt gagtcaaaag cattagaaca acaagaggcc 3360 gcccgaaggg gcatcccaaa acctgactca tctattgcaa gcaaaggaca tcttagtgta 3420 tcagatctac ttgactacat aagcccggat caggaaagaa aagagaggga tacacaaaga 3480 aagggcaggc gtgcaaagaa taatatcaga gcccatcaag gtgaattagt tgaagaaaag 3540 gagagctttg agcacgacat aggatctcct catgaagcaa acaaagagga gtttcaacaa 3600 gtaaaatcga aggcacaccc tccagcaata tcagaagaaa attatgctat ccatgatgag 3660 ctgaagcaag ttgatccttt atcacctgaa gaatattctg atgaagggtg gcaagcagct 3720 aatttgcgtg gacgatctgc aaatgtacgg aagaaaagca gtcgcagaag gcccgctctc 3780 actaaattaa tggttgatcg cttggaagat ggccgcacag gttctgctta tagggctggt 3840 gtacaacaac acatgaaagg agataaagaa gatgttataa actcttctag ccagctctcc 3900 tttggcagct ttctaaaaac tgacaaggtg aatgggaatt ccagcaatat tgaaaataag 3960 gttttcaatg ctatatctaa accagaacga ggcataaagc tttcaggaat taacagacct 4020 gctactatag cttccaagtt ggtatcatac aaagatgtag cagtgtcacc ccctggcaca 4080 gtcttgaaac cgattttgga gcagaaggaa gcaaaggaga aggataatgc acaaaatact 4140 gatctaatag tgtcatctga ggaggaagat aagaagttaa cagatgaaga tgaagaaaag 4200 gaaaagccaa gtcatgacag cagcaaagag gttctttcaa gtgaaccaga ggaaatcggc 4260 aatgatgaaa aagctccgga cagcaacagt gatgaaagcc caactgaatc taagaaaaaa 4320 ggtggaagca agctttcagc ttcagcgcct ccattcaatc ctggatcact cttatcgatg 4380 tcgcaccctt acagtacagt ggcaatatat gatgctagcg tcgttcttca gccaatacca 4440 agtcaaccaa tggagattct ccctcacgcc attgatacta gggtaccccg tggtcctcgg 4500 tccacattgt actaccgtac tgggcatacc ttccaaagaa aacagggtta cgcacacagc 4560 cagagcacca ttctgagggg tagcaactcc cccccaacca tgaatcctca tgctgccgag 4620 tttgtgcctg gaaaaacttc gcaacaacct gatgtggcta acagagagcc tagtgcagat 4680 gtttctgtaa ctgattcagc agatcaactg ttggcaccac agacatcaga tgaagtaaag 4740 gctggtatgc ctgcagcaga acaagcaatt caaggtgaga gcaccagccc atgcaaagga 4800 aaggaaaaca gagcgaaaga tgccttgaga aactcatgca aaacagagct ggcaaggcag 4860 attttgttca gtttcatcgt caagtcagta catgatagct taggttccac tggagctgaa 4920 tcggacagaa aaccaagtgg accagacgaa tctggtaatg cacagagcag caacaacata 4980 aacaagagtc cgtcaggtcg caaagagctt gacaaacagc agaaggccac cgtggtacct 5040 aagagtgaga aggatacaga aggatttaca gtagtttcaa aacgtagaag aagcaagcag 5100 cactttgtgc atcccataca tggtctctat tcccagcagt caatttgcac ttctgtcagc 5160 taa 5163 <210> 2 <211> 1720 <212> PRT <213> rice Flo(a) protein sequence <400> 2 Met Ala Pro Lys Gly Ala Gly Arg Gly Lys Gly Arg Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Lys Gly Asp Lys Arg Lys Lys Glu Glu Lys Val Val Pro Ser 20 25 30 Ala Ile Asp Val Thr Val Val Thr Pro Tyr Glu Ser Gln Val Thr Leu 35 40 45 Lys Gly Ile Ser Thr Asp Arg Val Leu Asp Val Arg Lys Leu Leu Gly 50 55 60 Ser Asn Val Glu Thr Cys His Leu Thr Asn Tyr Ser Leu Ser His Val 65 70 75 80 Thr Arg Gly Gln Arg Leu Glu Asp Gly Val Glu Ile Val Ser Leu Lys 85 90 95 Pro Cys Ser Leu Thr Ile Val Glu Glu Glu Tyr Ala Thr Glu Ala Ala 100 105 110 Ala Ala Ala Gln Val Arg Arg Leu Leu Asp Ile Val Ala Cys Thr Thr 115 120 125 Ala Phe Val Asn Lys Pro Arg Asp Gly Ala Lys His Lys Ser Ser Lys 130 135 140 His Ala Arg Pro Ala Thr Pro Pro Ser Pro Pro Ala Leu Ala Ala Ser 145 150 155 160 Pro Asp Ala His Gly Ala Gly Ala Ala Gln Ala Pro Pro Ile Ser Glu 165 170 175 Ala His Asp Met Ala Ala Ile Arg Pro Pro Pro Arg Leu Gly Glu Phe 180 185 190 Tyr Asp Phe Leu Ser Phe Ala His Leu Thr Pro Pro Val His Phe Ile 195 200 205 Arg Arg Lys Glu Ser Asn Gly Ala Ser Gln Glu Gly Asp Tyr Phe Glu 210 215 220 Ile Glu Val Lys Val Cys Asn Gly Lys Leu Leu His Ile Val Ala Ser 225 230 235 240 Val Lys Gly Phe Tyr Ser Ala Gly Lys Pro His Thr Val Ser His Ser 245 250 255 Leu Val Asp Leu Leu Gln Gln Leu Ser Ser Ala Phe Ala Asn Ala Tyr 260 265 270 Asp Ala Leu Met Lys Ala Phe Leu Asp His Asn Lys Phe Gly Asn Leu 275 280 285 Pro Tyr Gly Phe Arg Ala Asn Thr Trp Leu Ile Pro Pro Ile Tyr Leu 290 295 300 Asp Ser Ala Thr Lys Cys Pro Ala Leu Pro Val Glu Asp Glu Asn Trp 305 310 315 320 Gly Gly Asn Gly Gly Gly Asn Gly Arg Asp Gly Lys Tyr Asp Arg Arg 325 330 335 Arg Trp Ala Lys Glu Phe Ser Thr Leu Ala Arg Met Pro Cys Lys Thr 340 345 350 Glu Glu Gly Arg Val Ile Arg Asp Arg Lys Ala Phe Leu Leu His Asn 355 360 365 Leu Phe Val Asp Thr Ala Ile Phe Arg Ala Ala Ser Thr Ile Gln Arg 370 375 380 Leu Ile Asp Leu Ser Gly Asn Ser Thr Ser Gln Gln Ala Gly Leu Asp 385 390 395 400 Gly Ser Leu Ala Ile Glu Glu Arg Val Gly Asp Leu Leu Ile Thr Val 405 410 415 Lys Arg Asp Gln Ala Asp Ala Ser Leu Lys Leu Glu Asp Lys Val Asp 420 425 430 Gly Val Ala Leu Tyr Gln Thr Gly Ser Met Asp Ile Ser Gln Arg Asn 435 440 445 Leu Leu Lys Gly Leu Thr Ser Asp Glu Ser Val Val Val Lys Asp Thr 450 455 460 Ser Ile Leu Gly Val Val Ile Val Lys His Cys Gly Tyr Thr Ala Thr 465 470 475 480 Val Lys Val Ser Gly Arg Thr Lys Asp Gly Asn Gly Gly Lys Gln Thr 485 490 495 Ser Asp Ile Cys Asp His Leu Asp Gly Ile Ser Asn Val Asp Val Asp 500 505 510 Asp Leu Pro Asp Gly Gly Ser Asn Ala Leu Asn Ile Asn Ser Leu Arg 515 520 525 Ile Ser Leu Pro Lys Ile Val Asn Ser Asp Ile Ala Ser Thr Gln Cys 530 535 540 Pro Thr Pro Gln Ser His Val Asp Asn His Ala Arg Lys Leu Val Arg 545 550 555 560 Lys Ile Leu Glu Asp Ser Leu Met Lys Leu Glu Asn Met Pro Ala Asn 565 570 575 Asn Pro Arg Thr Ile Arg Trp Glu Leu Gly Ser Ser Trp Leu Gln Asn 580 585 590 Leu Gln Lys Lys Asp Ser Pro Ala Ser Glu Asp Lys Lys Asn Ala Gly 595 600 605 His Val Glu Lys Glu Thr Thr Ile Lys Gly Leu Gly Lys His Phe Glu 610 615 620 Gln Leu Lys Lys Ile Lys Lys Lys Glu Cys His Val Glu Gly Ala Met 625 630 635 640 Ser Glu Lys Glu Asp Ser Asp Ser Asn Cys Ser Val Ile Asn Gly Met 645 650 655 Glu Glu Ser Glu Asn Thr Lys Glu Thr Asp Ile Ser Lys Leu Met Ser 660 665 670 Glu Asp Asp Phe Cys Arg Leu Lys Asp Leu Gly Ala Gly Leu His Gln 675 680 685 Lys Ser Leu Glu Glu Leu Thr Met Met Ala His Lys Phe Tyr Asp Asp 690 695 700 Thr Ala Leu Pro Lys Leu Val Ala Asp Phe Ala Ser Leu Glu Leu Ser 705 710 715 720 Pro Val Asp Gly Arg Thr Met Thr Asp Phe Met His Thr Arg Gly Leu 725 730 735 Asn Met Cys Ser Leu Gly Arg Val Val Glu Leu Ala Glu Lys Leu Pro 740 745 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agaaggccac cgtggtacct 5040 aagagtgaga aggatacaga aggatttaca gtagtttcaa aacgtagaag aagcaagcag 5100 cactttgtgc atcccataca tggtctctat tcccagcagt caatttgcac ttctgtcagc 5160 taa 5163 <210> 2 <211> 1720 <212> PRT Rice Flo (a) protein sequence <400> 2 Met Ala Pro Lys Gly Ala Gly Arg Gly Lys Gly Arg Gly Gly Gly Gly   1 5 10 15 Gly Gly Lys Gly Asp Lys Arg Lys Lys Glu Glu Lys Val Val Pro Ser              20 25 30 Ala Ile Asp Val Thr Val Val Thr Pro Tyr Glu Ser Gln Val Thr Leu          35 40 45 Lys Gly Ile Ser Thr Asp Arg Val Leu Asp Val Arg Lys Leu Leu Gly      50 55 60 Ser Asn Val Glu Thr Cys His Leu Thr Asn Tyr Ser Leu Ser His Val  65 70 75 80 Thr Arg Gly Gln Arg Leu Glu Asp Gly Val Glu Ile Val Ser Leu Lys                  85 90 95 Pro Cys Ser Leu Thr Ile Val Glu Glu Glu Tyr Ala Thr Glu Ala Ala             100 105 110 Ala Ala Ala Gln Val Arg Arg Leu Leu Asp Ile Val Ala Cys Thr Thr         115 120 125 Ala Phe Val Asn Lys Pro Arg Asp Gly Ala Lys His Lys Ser Ser Lys     130 135 140 His Ala Arg Pro Ala Thr Pro Pro Ser Pro Pro Ala Leu Ala Ala Ser 145 150 155 160 Pro Asp Ala His Gly Ala Gly Ala Ala Gln Ala Pro Pro Ile Ser Glu                 165 170 175 Ala His Asp Met Ala Ala Ile Arg Pro Pro Pro Arg Leu Gly Glu Phe             180 185 190 Tyr Asp Phe Leu Ser Phe Ala His Leu Thr Pro Pro Val His Phe Ile         195 200 205 Arg Arg Lys Glu Ser Asn Gly Ala Ser Gln Glu Gly Asp Tyr Phe Glu     210 215 220 Ile Glu Val Lys Val Cys Asn Gly Lys Leu Leu His Ile Val Ala Ser 225 230 235 240 Val Lys Gly Phe Tyr Ser Ala Gly Lys Pro His Thr Val Ser His Ser                 245 250 255 Leu Val Asp Leu Leu Gln Gln Leu Ser Ser Ala Phe Ala Asn Ala Tyr             260 265 270 Asp Ala Leu Met Lys Ala Phe Leu Asp His Asn Lys Phe Gly Asn Leu         275 280 285 Pro Tyr Gly Phe Arg Ala Asn Thr Trp Leu Ile Pro Pro Ile Tyr Leu     290 295 300 Asp Ser Ala Thr Lys Cys Pro Ala Leu Pro Val Glu Asp Glu Asn Trp 305 310 315 320 Gly Gly Asn Gly Gly Gly Asn Gly Arg Asp Gly Lys Tyr Asp Arg Arg                 325 330 335 Arg Trp Ala Lys Glu Phe Ser Thr Leu Ala Arg Met Pro Cys Lys Thr             340 345 350 Glu Glu Gly Arg Val Ile Arg Asp Arg Lys Ala Phe Leu Leu His Asn         355 360 365 Leu Phe Val Asp Thr Ala Ile Phe Arg Ala Ala Ser Thr Ile Gln Arg     370 375 380 Leu Ile Asp Leu Ser Gly Asn Ser Thr Ser Gln Gln Ala Gly Leu Asp 385 390 395 400 Gly Ser Leu Ala Ile Glu Glu Arg Val Gly Asp Leu Leu Ile Thr Val                 405 410 415 Lys Arg Asp Gln Ala Asp Ala Ser Leu Lys Leu Glu Asp Lys Val Asp             420 425 430 Gly Val Ala Leu Tyr Gln Thr Gly Ser Met Asp Ile Ser Gln Arg Asn         435 440 445 Leu Leu Lys Gly Leu Thr Ser Asp Glu Ser Val Val Val Lys Asp Thr     450 455 460 Ser Ile Leu Gly Val Val Ile Val Lys His Cys Gly Tyr Thr Ala Thr 465 470 475 480 Val Lys Val Ser Gly Arg Thr Lys Asp Gly Asn Gly Gly Lys Gln Thr                 485 490 495 Ser Asp Ile Cys Asp His Leu Asp Gly Ile Ser Asn Val Asp Val Asp             500 505 510 Asp Leu Pro Asp Gly Gly Ser Asn Ala Leu Asn Ile Asn Ser Leu Arg         515 520 525 Ile Ser Leu Pro Lys Ile Val Asn Ser Asp Ile Ala Ser Thr Gln Cys     530 535 540 Pro Thr Pro Gln Ser His Val Asp Asn His Ala Arg Lys Leu Val Arg 545 550 555 560 Lys Ile Leu Glu Asp Ser Leu Met Lys Leu Glu Asn Met Pro Ala Asn                 565 570 575 Asn Pro Arg Thr Ile Arg Trp Glu Leu Gly Ser Ser Trp Leu Gln Asn             580 585 590 Leu Gln Lys Lys Asp Ser Pro Ala Ser Glu Asp Lys Lys Asn Ala Gly         595 600 605 His Val Glu Lys Glu Thr Thr Ile Lys Gly Leu Gly Lys His Phe Glu     610 615 620 Gln Leu Lys Lys Ile Lys Lys Lys Glu Cys His Val Glu Gly Ala Met 625 630 635 640 Ser Glu Lys Glu Asp Ser Asp Ser Asn Cys Ser Val Ile Asn Gly Met                 645 650 655 Glu Glu Ser Glu Asn Thr Lys Glu Thr Asp Ile Ser Lys Leu Met Ser             660 665 670 Glu Asp Asp Phe Cys Arg Leu Lys Asp Leu Gly Ala Gly Leu His Gln         675 680 685 Lys Ser Leu Glu Glu Leu Thr Met Met Ala His Lys Phe Tyr Asp Asp     690 695 700 Thr Ala Leu Pro Lys Leu Val Ala Asp Phe Ala Ser Leu Glu Leu Ser 705 710 715 720 Pro Val Asp Gly Arg Thr Met Thr Asp Phe Met His Thr Arg Gly Leu                 725 730 735 Asn Met Cys Ser Leu Gly Arg Val Val Glu Leu Ala Glu Lys Leu Pro             740 745 750 His Ile Gln Ser Ile Cys Ile His Glu Met Val Ile Arg Ser Phe Lys         755 760 765 His Ile Val Arg Ala Val Ile Ala Ala Val Asp Asp Met Gln Asn Met     770 775 780 Ser Ala Ala Ile Ala Glu Thr Leu Asn Ile Leu Leu Gly Cys Pro Arg 785 790 795 800 Leu Glu Ser Gly Thr Glu Thr Asp Ala His Ser Glu His Asn Leu Arg                 805 810 815 Phe Arg Trp Val Glu Arg Phe Leu Ser Lys Arg Tyr Asn Trp Lys Leu             820 825 830 Lys Asp Glu Phe Ala His Leu Arg Lys Phe Ile Ile Leu Arg Gly Leu         835 840 845 Cys Ser Lys Val Gly Leu Glu Leu Val Ala Arg Asp Tyr Asp Met Asn     850 855 860 Ser Pro Asn Pro Phe Asp Lys Ser Asp Ile Val Asn Ile Ile Pro Val 865 870 875 880 Cys Lys His Val Val Tyr Ser Ser Ile Asp Gly Arg Asn Leu Leu Glu                 885 890 895 Ser Ser Lys Met Ala Leu Asp Lys Gly Lys Leu Asp Asp Ala Val Asn             900 905 910 Phe Gly Thr Lys Ala Leu Ser Lys Ile Val Ala Val Cys Gly Pro Tyr         915 920 925 His Arg Leu Thr Ala Asn Ala Tyr Ser Leu Leu Ala Val Val Leu Tyr     930 935 940 His Thr Gly Asp Phe Asn Gln Ala Thr Ile Tyr Gln Gln Lys Ala Leu 945 950 955 960 Asp Ile Asn Glu Arg Glu Leu Gly Leu Asp His Pro Glu Thr Met Lys                 965 970 975 Ser Tyr Gly Asp Leu Ser Val Phe Tyr Tyr Arg Leu Gln His Ile Glu             980 985 990 Met Ala Leu Lys Tyr Val Asn Arg Ala Leu Tyr Leu Leu Gln Phe Ser         995 1000 1005 Cys Gly Leu Ser His Pro Asn Ser Ala Ala Thr Tyr Ile Asn Val Ala    1010 1015 1020 Met Met Glu Glu Gly Met Gly Asn Val His Val Ala Leu Arg Tyr Leu 1025 1030 1035 1040 His Glu Ala Leu Lys Cys Asn Lys Arg Leu Leu Gly Ala Asp His Ile                1045 1050 1055 Gln Thr Ala Ala Ser Tyr His Ala Ile Ala Ile Ala Leu Ser Met Met            1060 1065 1070 Asp Ala Tyr Ser Leu Ser Val Gln His Glu Gln Thr Thr Leu Gln Ile        1075 1080 1085 Leu Gln Glu Lys Leu Gly Gln Asp Asp Leu Arg Thr Gln Asp Ala Ala    1090 1095 1100 Ala Trp Leu Glu Tyr Phe Glu Ser Lys Ala Leu Glu Gln Gln Glu Ala 1105 1110 1115 1120 Ala Arg Arg Gly Ile Pro Lys Pro Asp Ser Ser Ile Ala Ser Lys Gly                1125 1130 1135 His Leu Ser Val Ser Asp Leu Leu Asp Tyr Ile Ser Pro Asp Gln Glu            1140 1145 1150 Arg Lys Glu Arg Asp Thr Gln Arg Lys Gly Arg Arg Ala Lys Asn Asn        1155 1160 1165 Ile Arg Ala His Gln Gly Glu Leu Val Glu Glu Lys Glu Ser Phe Glu    1170 1175 1180 His Asp Ile Gly Ser Pro His Glu Ala Asn Lys Glu Glu Phe Gln Gln 1185 1190 1195 1200 Val Lys Ser Lys Ala His Pro Pro Ala Ile Ser Glu Glu Asn Tyr Ala                1205 1210 1215 Ile His Asp Glu Leu Lys Gln Val Asp Pro Leu Ser Pro Glu Glu Tyr            1220 1225 1230 Ser Asp Glu Gly Trp Gln Ala Ala Asn Leu Arg Gly Arg Ser Ala Asn        1235 1240 1245 Val Arg Lys Lys Ser Ser Arg Arg Arg Pro Ala Leu Thr Lys Leu Met    1250 1255 1260 Val Asp Arg Leu Glu Asp Gly Arg Thr Gly Ser Ala Tyr Arg Ala Gly 1265 1270 1275 1280 Val Gln Gln His Met Lys Gly Asp Lys Glu Asp Val Ile Asn Ser Ser                1285 1290 1295 Ser Gln Leu Ser Phe Gly Ser Phe Leu Lys Thr Asp Lys Val Asn Gly            1300 1305 1310 Asn Ser Ser Asn Ile Glu Asn Lys Val Phe Asn Ala Ile Ser Lys Pro        1315 1320 1325 Glu Arg Gly Ile Lys Leu Ser Gly Ile Asn Arg Pro Ala Thr Ile Ala    1330 1335 1340 Ser Lys Leu Val Ser Tyr Lys Asp Val Ala Val Ser Pro Pro Gly Thr 1345 1350 1355 1360 Val Leu Lys Pro Ile Leu Glu Gln Lys Glu Ala Lys Glu Lys Asp Asn                1365 1370 1375 Ala Gln Asn Thr Asp Leu Ile Val Ser Ser Glu Glu Glu Asp Lys Lys            1380 1385 1390 Leu Thr Asp Glu Asp Glu Glu Lys Glu Lys Pro Ser His Asp Ser Ser        1395 1400 1405 Lys Glu Val Leu Ser Ser Glu Pro Glu Glu Ile Gly Asn Asp Glu Lys    1410 1415 1420 Ala Pro Asp Ser Asn Ser Asp Glu Ser Pro Thr Glu Ser Lys Lys Lys 1425 1430 1435 1440 Gly Gly Ser Lys Leu Ser Ala Ser Ala Pro Pro Phe Asn Pro Gly Ser                1445 1450 1455 Leu Leu Ser Met Ser His Pro Tyr Ser Thr Val Ala Ile Tyr Asp Ala            1460 1465 1470 Ser Val Val Leu Gln Pro Ile Pro Ser Gln Pro Met Glu Ile Leu Pro        1475 1480 1485 His Ala Ile Asp Thr Arg Val Pro Arg Gly Pro Arg Ser Thr Leu Tyr    1490 1495 1500 Tyr Arg Thr Gly His Thr Phe Gln Arg Lys Gln Gly Tyr Ala His Ser 1505 1510 1515 1520 Gln Ser Thr Ile Leu Arg Gly Ser Asn Ser Pro Pro Thr Met Asn Pro                1525 1530 1535 His Ala Ala Glu Phe Val Pro Gly Lys Thr Ser Gln Gln Pro Asp Val            1540 1545 1550 Ala Asn Arg Glu Pro Ser Ala Asp Val Ser Val Thr Asp Ser Ala Asp        1555 1560 1565 Gln Leu Leu Ala Pro Gln Thr Ser Asp Glu Val Lys Ala Gly Met Pro    1570 1575 1580 Ala Ala Glu Gln Ala Ile Gln Gly Glu Ser Thr Ser Pro Cys Lys Gly 1585 1590 1595 1600 Lys Glu Asn Arg Ala Lys Asp Ala Leu Arg Asn Ser Cys Lys Thr Glu                1605 1610 1615 Leu Ala Arg Gln Ile Leu Phe Ser Phe Ile Val Lys Ser Val His Asp            1620 1625 1630 Ser Leu Gly Ser Thr Gly Ala Glu Ser Asp Arg Lys Pro Ser Gly Pro        1635 1640 1645 Asp Glu Ser Gly Asn Ala Gln Ser Ser Asn Asn Ile Asn Lys Ser Pro    1650 1655 1660 Ser Gly Arg Lys Glu Leu Asp Lys Gln Gln Lys Ala Thr Val Val Pro 1665 1670 1675 1680 Lys Ser Glu Lys Asp Thr Glu Gly Phe Thr Val Val Ser Lys Arg Arg                1685 1690 1695 Arg Ser Lys Gln His Phe Val His Pro Ile His Gly Leu Tyr Ser Gln            1700 1705 1710 Gln Ser Ile Cys Thr Ser Val Ser        1715 1720 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S04107 primer F <400> 3 tgttcagacc tgggtcactt t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S04107 primer R <400> 4 atcaactcgc ctgctgttct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer F <400> 5 cctgaccaaa aatgggctaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer R <400> 6 gcaagaaacg gaaacgaaac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S04109 primer F <400> 7 ggctgaagca tttggagaag 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S04109 prime R <400> 8 aagtatacct tggcttcaag tgg 23 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer F <400> 9 tctccagatt ttccttcgtg a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer R <400> 10 gaattctgaa ggggttgtgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer F <400> 11 atcgagggac gacgttgtag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer R <400> 12 gcgtaggagc gtttttaagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer F <400> 13 tatccgcagc aatgctttag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer R <400> 14 tagctcatat tggcgtggtg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer F <400> 15 ggtcgaatgg tggtgatagg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer R <400> 16 gcgtatcgat ctgggttagc 20 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM8217 primer F <400> 17 actagcgatg tctgagttga c 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM8217 primer R <400> 18 tattcacatg cttgctcatc 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer F <400> 19 agcccaacat atggcagaag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer R <400> 20 tcctttcgag ggaggaattt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM1153 primer F <400> 21 accaacgcca aaagctactg 20 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RM1153 primer R <400> 22 tactcgccct gcatgagc 18 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer F <400> 23 ggatggtgag gtgaggtgtt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223 primer R <400> 24 cgccgtcaga gaggtaaaag 20 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S04114 primer F <400> 25 tgcatgcaaa atctatctac gtg 23 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S04114 primer R <400> 26 agtccgtttc gcatgtgttt 20 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Flo (a) dCAPS primer F <400> 27 cggcggcaaa ggcgacaaga ggatt 25 <210> 28 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Flo (a) dCAPS primer R <400> 28 cagcagcagc gaattcaatg ttcgc 25

Claims (13)

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 쌀의 분질배유 형질을 결정하는 벼 유래의 FLO (a) (Floury (a)) 단백질. FLO (a) ( Floury (a) ) protein derived from rice, which determines the endosperm trait of rice, consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 . 제1항의 FLO (a) 단백질을 암호화하는 유전자.The gene encoding the FLO (a) protein of claim 1. 제2항에 있어서 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자. The gene according to claim 2, wherein the gene consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a) 및 밀양23간의 교잡으로 생산된 F2 집단을 대상으로 유전자 연관분석을 실시하여 작성된 분질배유 형질을 결정하는 FLO (a)좌를 포함하는 것을 특징으로 하는 도 4에 도시된 벼의 정밀유전자지도. Figure 2, characterized in that it comprises a FLO (a) locus for determining the milk powder traits generated by genetic association analysis of the F 2 population produced by the hybridization between the flour mutant flo (a) and wheat sheep 23 of rice. Precise gene map of rice shown in Fig. 4. 제4항에 있어서, 상기 FLO (a)좌는 SSR(Simple Sequence Repeat) 마커인 RM8217과 함께 분리(co-segregation)되는 것을 특징으로 하는 정밀유전자지도.The precision gene map of claim 4, wherein the FLO (a) locus is co-segregated with the RM8217, which is a simple sequence repeat (SSR) marker. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 FLO (a)좌는 TPR(tetratricopeptide repeat) 도메인-함유 단백질인 OsTPR을 암호화하는 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 정밀유전자지도.The precision gene map according to claim 4 or 5, wherein the FLO (a) locus comprises nucleotides encoding OsTPR, which is a tetratricopeptide repeat (TPR) domain-containing protein. 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a) 및 밀양23간의 교잡으로 생산된 F2 집단. F 2 population produced by hybridization between rice endosperm mutants flo (a) and wheat sheep 23. 표 1에 제시된 STS 및 SSR 마커로 이루어진 군으로부터 선택된 분자마커를 이용하여 유전자 연관 분석을 수행하는 단계를 포함하는, 분질배유 형질을 결정하는 FLO(a)좌를 동정하는 방법.A method for identifying a FLO (a) locus for determining a milk trait, comprising performing genetic association analysis using a molecular marker selected from the group consisting of STS and SSR markers as shown in Table 1. 분질성의 불투명한 배유 표현형을 나타내는 벼의 분질배유 돌연변이체 flo (a). Flour mutant flo (a) of rice, exhibiting a opaque opacity phenotype . 제9항에 있어서, 상기 분질배유 돌연변이체 flo (a)는 벼에 MNU (N-methyl-N-nitrosourea)를 처리하여 유도된 것을 특징으로 하는 돌연변이체 flo (a). 10. The method of claim 9, wherein bunjil endosperm mutants flo (a) is a mutant, characterized in that the induction process the MNU (N-methyl-N- nitrosourea) in rice body flo (a). 분질배유 형질을 결정하는 FLO (a)좌를 동정하기 위한, 표 1에 제시된 STS 및 SSR 마커 중에서 선택된 분자마커.Molecular markers selected from the STS and SSR markers shown in Table 1 for identifying FLO (a) loci for determining endosperm traits. 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍; 및 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍으로 구성되는 군으로부터 선택된 FLO (a)좌 동정용 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍.Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 3 and 4; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 5 and 6; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 7 and 8; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 9 and 10; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 11 and 12; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 13 and 14; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 15 and 16; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 17 and 18; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 19 and 20; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 21 and 22; Oligonucleotide primer pairs of SEQ ID NOs: 23 and 24; And SEQ ID NO: 25 and 26 oligonucleotide primer pairs FLO (a) Raise for LHS identified oligonucleotide primer pair selected from the group consisting of. 서열번호 27 및 28로 표시된, flo (a) 대립인자의 dCAPS 분석용 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍.Oligonucleotide primer pairs for the dCAPS analysis of the flo (a) allele, shown in SEQ ID NOs: 27 and 28.
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