KR20110104067A - 세르톨리 세포의 마이크로캡슐화 과정, 얻어진 마이크로캡슐, 및 제1형 당뇨병의 예방 및 치유를 위한 그것의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제1형 당뇨병(T1DM)의 예방 및/또는 치료를 위한 하이드로겔계 마이크로캡슐 안에 마이크로캡슐화된 세르톨리 세포(SC)의 용도, 및 마이크로캡슐의 제조 방법, 바람직하게는 마이크로스피어로 가공하는 방법에 관한 것이다.

Description

세르톨리 세포의 마이크로캡슐화 과정, 얻어진 마이크로캡슐, 및 제1형 당뇨병의 예방 및 치유를 위한 그것의 용도{A MICROENCAPSULATION PROCESS OF SERTOLI CELLS, MICROCAPSULES OBTAINED AND THEIR USE FOR PREVENTION AND CURE OF TYPE 1 DIABETES MELLITUS}

본 발명은 제1형 당뇨병(T1DM)의 예방 및/또는 치료를 위한 하이드로겔계 마이크로캡슐 안에 마이크로캡슐화된 세르톨리 세포(SC: Sertoli cell)의 용도 및 마이크로캡슐을 제조하는 방법, 바람직하게는 마이크로스피어로 가공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 대상 제품은 당뇨병의 병상에 의해서 파괴된 베타-세포의 재생과 T1DM에서 이러한 파괴현상을 초래하는 동일한 자가면역 과정의 "차단"을 유도할 수 있다.

마이크로캡슐화된 SC를 사용한 치료에 의해서 헥소겐 췌장섬을 이식하지 않고도 T1DM의 예방과 치료를 달성할 수 있다(사람이나 동물에서). SC 마이크로캡슐화에 의해 얻어진 제품은 "종래의" 약물과 충분히 필적할 만하다는 점에 주목하여야 한다.

현재 제1형 당뇨병(T1DM)의 세계적 발병률은 매년 약 30,000건의 새로운 증례가 발생하는 것과 맞먹는다. 제1형 당뇨병에 있어서, 그 발병기전은 자가면역 메커니즘에 의해 인슐린을 생산하는 췌장 베타-세포들이 대부분 파괴되는 것이며, 이것은 어린 아이들과 십대들에게 주로 영향을 미친다. 간단히 말해서, 유기체가 인슐린 생산을 담당하는 췌장 베타-세포에 대한 면역 관용성을 잃게 되고, 자가항체 생산과 관련된, 주로 세포 매개되는 면역반응이 유도되어 베타-세포를 스스로 파괴하게 된다.

헥소겐 인슐린 투여에 기반한 현재 T1DM 치료법의 경향은 생리학적 조건에서 관찰된 것과 가능한 가깝게 당분 항상성을 회복시키는 것이다. 그러나, 인슐린 요법은 분비촉진제 자극에 반응하여 정상 베타-췌장 세포에 특유하게 나타나는 인슐린 분비의 맥동성 리듬을 재현할 수 없다.

따라서, 안정된 생리학적 내분비-췌장 기능의 회복이 이 병상의 근본적인 해결을 위한 최종 목표가 된다. 이를 위해서, 사람 공여자의 전체 췌장을 이식하거나 췌장으로부터 분리된 췌장섬을 이식하는 것과 같은 새로운 방법들이 제안되었다.

현재 사용되고 있는 헥소겐 인슐린 요법은 어찌 됐든 T1DM 치료를 위한 최종적인 요법은 될 수 없다. 이 문제를 극복하기 위해서, 사람 또는 동물 공여자의 전체 췌장 장기 이식이나 췌장으로부터 분리된 췌장섬의 이식을 고려하는 접근법들이 오랫동안 제안되었었다. 전체 췌장의 이식에 비해서 췌장섬의 이식은 덜 침습적이기는 하지만 유사한 문제들을 나타내는데, 특히 다음과 같은 문제들이 나타난다.

1. 사망한 사람 공여자로부터의 췌장 활용성이 감소되며, 결과적으로 섬 활용성도 감소된다.

2. 수여자는 일평생 약물에 의한 면역억제 섭생을 지켜야 한다. 그러나, 이식된 조직의 면역거부를 예방하고자 사용되는 이러한 치료 옵션은 현재까지도 거의 밝혀지지 않은 부작용의 위험이 있으며, 잠재적으로 매우 위험하다.

3. 이종성 섬 이식편의 거부. 현재 사용되는 면역억제 약물 중 어느 것도 이 문제를 효과적으로 예방할 수 있다고 증명되지 않았다.

4. 이식된 섬 조직의 경시적 생존능 불량.

세르톨리 세포(SC)의 기능이 최근 재평가되어, 고환 정세관을 단순히 구조적으로 뒷받침하는 데서부터 실제 생화학 실험실에서 무수한 영양적 기능과 면역학적 기능을 사용하는 데까지 이르게 되었다. 특히, SC 배양물이 B 및 T 림프구의 증식을 억제하는 분자를 생산한다는 것이 판명되었다(1). 더욱이, 면역조절 기능을 강화하기 위해서, SC는 표적 세포에 의해 발현된 FAS에 리간드 FAS를 통해 연결된, T, B 세포 및 자연살해 세포들의 아폽토시스를 유도할 수 있다(2).

SC가 면역조절 역할을 수행하게 되는 또 다른 메커니즘은 형질전환 성장인자-β(TGF-β)의 생산이다(3). 이 분자는 T CD4+ 림프구의 분화 표현형에 영향을 미치는데, Th1 타입(비-방어적 면역)에 비해 Th2 타입(방어적 면역)을 선호한다. 베타-세포는 림프구 Th1(INF-감마 양성)으로 주로 구성된 침윤물에 의해서 파괴됨으로, 세르톨리 활성은 T1DM에서 직접적인 임상적 중요성을 가질 수 있다.

더욱이, SC의 면역조절 효과는 형질전환 성장인자(TGF-β), 신경교세포-유도 신경영양인자(GDNF), 인터류킨-1(IL-1), 줄기세포인자(cKit-리간드), Fas/Fas 리간드(Fas-L), 액티빈 A 및 BCL-w와 같은 몇 가지 분화 중인 항-아폽토시스 성장인자들의 생산과 관련된다(4).

가장 밀접하게 관련된 선행기술(5)에 따르면, SC를 초순수 알기네이트 마이크로캡슐에 도입하여 520±14μm의 평균 장 직경을 가진 마이크로캡슐을 얻는 것을 설명한다.

이 논문이 개재된 시점에서는, 국제적 수준에서 마이크로캡슐의 직경이 약 500μm이고, "미부(tail)"가 5%를 초과하지 않으면 만족스럽다고 고려되었다. 캡슐의 직경과 미부의 존재는 매우 중요한 변수이다. 캡슐 직경이 가능한 많이 감소될 수 있다면, 대사산물들의 더욱 효과적인 교환이 가능해질 것이다. 미부와 관련해서는, 미부가 5% 미만인 경우에도 세포 항원이 노출될 수 있는 "저항감소부"의 생성으로 인해 주요 염증이 촉발될 수 있다는 것이 최근에 발견되었다.

1. DeCesaris P, Filippini A, Cervelli C, Riccioloi, A.; Muci, S.; Starace, G.; Stefanini, M.; Ziparo, E. Immunosuppressive molecules produced by Sertoli cells cultured in vitro: Biological effects on lymphocytes. Biochem. Biophys Res. Commun. 1992, 186: 1639-1646. 2. Lynch DH, Ramsdell F, Alderson MR. Fas and FasL in the homeostatic regulation of immune responses. Immunol. Today 1995, 16: 569-574. 3. Suarez-Pinzon W, Korbutt G S, Power R, Hooten J, Rajotte R V, Rabinovitch A. Testicular Sertoli cells protect islet B-cells from autoimmune destruction by a transforming growth factor-βl-dependent mechanism. Diabetes 2000, 49:1810- 1818. 4. Emerich, D. F., Hemendinger, R., and Halberstadt, CR. The Testicular-Derived Sertoli Cell: Cellular lmmunoscience to Enable Transplantation. Cell Transplantation 12, 335, 2003. 5. Luca, G., Calvitti, M., Nastruzzi, C, Bilancetti, L., Becchetti, E., Mancuso, F., Calafiore R. Encapsulation, in Vitro Characterization and in Vivo Biocompatibility of Sertoli's Cells in Alginate Based Microcapsules. Tissue Eng. 2007, 13:641-648.

본 발명은 제1형 당뇨병(T1DM)의 예방 및/또는 치료를 위한 하이드로겔계 마이크로캡슐 안에 마이크로캡슐화된 세르톨리 세포(SC)의 용도, 및 마이크로캡슐의 제조 방법, 바람직하게는 마이크로스피어로 가공하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 발명자들은 SC의 생육성과 기능성을 그대로 유지하면서 SC를 캡슐화할 수 있는, 미부 구조가 존재하지 않고 직경은 더욱 작아진 균질한 마이크로캡슐들을 제조할 수 있는 획기적인 방법을 발견했다.

상기 내용을 고려하여, 본 발명은 헥소겐 섬 조직 없이, 하이드로겔계 마이크로스피어 내로 마이크로캡슐화된 SC를 이식함으로써 T1DM을 예방 및/또는 치료할 수 있는 가능성을 최초로 제안한다.

따라서, 본 발명의 목적은, 청구항 1에 따른 세르톨리 세포(SC)를 함유하는 하이드로겔계 마이크로캡슐의 제조 방법이다.

본 명세서에는 9개의 도면이 첨부된다.
도 1은 돼지 SC의 현미경사진이다. A: 항-뮬러관 억제인자(MIS) 항체와 함께 제제를 인큐베이션하여 얻어진 면역세포화학. B: 항-비멘틴 항체와 함께 제제를 인큐베이션하여 얻어진 면역세포화학. C~D: 레이디히 세포(Leydig cell)와 세관주위 세포가 거의 존재하지 않음을 증명하기 위해서, 조직화학 기술에 의해 제제를 평가한 결과로서, 알칼리성 포스파타제가 존재하면 Fast-Red(세관주위 세포 특유)로 착색되고(C), 3-β-히드록시-스테로이도데히드로게나제 활성이 존재하면 니트로-블루 테트라졸륨(레이디히 특유)로 착색된다(D).
도 2는 "에어-모노젯"을 통해 알기네이트계 하이드로겔 내로 마이크로캡슐화된 SC를 제조하기 위한 장치이다(패널 A). 패널 B는 고안된 시스템의 가장 중요한 구성요소를 나타낸다.
도 3은 겔화제로서 BaCl₂(A-C) 및 CaCl₂ + 폴리오르니틴(B-D)를 사용하여 "에어 모노젯" 분무 시스템에 의해 얻어진 알기네이트계 마이크로입자의 현미경사진이다.
도 4는 이식 4개월 후에 NOD 래트의 복강에서 회수되어 바륨(A) 및 칼슘(B) 이온과 가교된 다당류 마이크로입자의 클리어 필드에서의 현미경사진이다. 패널 C는 바륨 알기네이트에 마이크로캡슐화된 SC를 EB/FDA로 이중 착색한 후 형광현미경으로 관찰하여 얻은 현미경사진이다.
도 5는 NOD 래트의 공급자(Taconic)에 의해 확인된 T1DM의 자발 발병 퍼센트로서(85%)(A), 이것은 빈 마이크로캡슐로 치료된 "나이브" 대조군에 속한 예비-당뇨병 동물들에서 나타난 퍼센트(B)와 비슷하다. 한편, 패널 C는 캡슐화된 SC로 치료된 예비-당뇨병 동물들에서 T1DM 발병 퍼센트가 거의 9%까지 상당히 감소한 것을 나타낸다(예방 효과).
도 6은 NOD 래트(E 그룹)에서의 이식 후 평균 혈당값으로서, 마이크로캡슐화된 SC로 자발 당뇨병이 치료된 것이 명백하다(치료 효과).
도 7은 마이크로캡슐화된 SC로 치료된 동물의 비장세포에 대한 RT-PCR 분석이다. 이 결과는 C 그룹과 E 그룹에 속한 동물들의 경우(VII 절 참조), SC 치료에 의해서 생체내 양성 Foxp3 세포의 수가 증가할 수 있다는 것을 나타낸다. 이런 결과는 조절 특징을 가진, 즉 면역반응에 관련된 몇 가지 세포의 활성화와 증식을 조절할 수 있는 T 세포의 상당한 증가를 나타낸다.
도 8은 예비-당뇨병 NOD 래트(A)와 자발 당뇨병 래트(B)의 췌장섬에 대한 조직학적 분석을 나타낸다. 이 이미지는 췌장섬 주위와 내부에 침윤물이 전혀 없음을 나타낸다. 패널 C와 D는 빈 캡슐로 치료된 예비-당뇨병 "나이브" NOD 래트(C)와 자발 당뇨병 래트(D)의 췌장섬에 대한 조직학적 분석을 나타낸다.
도 9는 본 발명에 따른 장치의 레이아웃이다.

먼저, SC의 균질한 다당류 현탁액이 제조된다. 이 용액은 세포 조성과 관련하여 90% 순도를 가지며, 1~5% w/v, 유리하게는 1~3% w/v의 농도로 초순수 나트륨 알기네이트 식염수 용액을 사용하여 얻어진다. 사용된 알기네이트는 20 EU/g 이하의 내독소 함량과 0.4% 미만의 단백질 함량을 가진 초순수 알기네이트이다. 유체로서는 공기를 사용하는 것이 유리하다. 균질한 세포 현탁액을 얻기 위해서 SC는 먼저 트립신과 EDTA로 처리된다(2분). 다음과 같이 SC를 평가하였다:

* 면역세포화학 기술, 항-뮬러관 억제인자(MIS) 및 플루오레세인 항-비멘틴 항체와 함께 제제를 인큐베이션한다. 각각은 MIS와 비멘틴 분자를 표시하며, 이들은 모두 SC에 의해서만 발현된다.

* 조직화학 기술, 세관주위 세포에 특유한 알칼리성 포스파타제(Fast-Red 착색)와 레이디히 세포에 특유한 3-β-히드록시-스테로이도데히드로게나제 효소(니트로-블루 착색)의 존재를 평가한다.

이러한 조직화학 분석에서 얻어진 결과에 의해 세관주위 세포와 레이디히 세포가 5~8% 존재함이 판명되었다. 또한, 이들 세포 집단은 SC의 정확한 기능에 유리한 분자 "크로스-톡(cross-talk)"을 확보하는데 유용하다(상기 비율로 존재할 때).

이 현탁액은 제어된 압력에서 유동성 유체, 유리하게는 공기를 사용하여 흡인과 압출을 통해서 이차원의 균질한 미세소적들의 연속 흐름으로써 10~60 mL/분의 속도로 분출된다. 이와 같이 분출된 현탁액은 니들형 요소에 도입되어 고도로 균질한 미세소적들로 분할된다. 유리하게, 니들형 요소는 그것의 측면에 단추구멍 모양의 개구를 가지며, 유동성 유체가 3~7 리터/분의 속도로 도입되어 균질한 크기의 미세소적들의 연속 흐름이 얻어진다. 유동성 유체는 발생장치로부터 나오며, 사용 전에, 유동-비유동 전이기의 압력 강하가 적어도 0.3 Bar가 되도록 압력이 감소되고, 유동-비유동 전이기의 높은 재현성 및 선회 수와 분배되는 유동성 유체 사이에 선형성이 얻어지도록 조절되고, 유출 흐름이 0~10 NL/분이 되도록 조절되고 통제된다.

미세소적은 300~700μm의 평균 직경을 가질 수 있고, 표준 편차는 40μm 이하이다. 얻어진 미세소적들은 유리하게는 2가 양이온 또는 폴리양이온성 물질을 함유하는 주사 제제용 멸균수, F.U를 이용하여 수성 용액에 도입되어, 상기 마이크로캡슐이 겔화되어 얻어진다.

본 발명의 다른 목적은 T1DM의 예방 및 근본적 치유를 위한 단독 치료제로서의 세르톨리 세포이다.

유리하게, 본 발명의 방법에 따라서, 흡입은 10~16 mL/분의 유속으로 튜브연동식 펌프에 의해 연속하여 일어나고, 상기 압출은 유동성 유체, 바람직하게는 공기를 사용하여 3~7 L/분의 속도로 "에어 모노젯" 시스템을 통해 일어난다. 이 과정에서, 전체 방법의 특징적인 요소인 상기 공기 흐름의 정확한 캘리브레이션이 상기 시스템의 하부 구성요소에 의해 확보되는데, 이것은 이전 방법들에는 존재하지 않았던 것이다("가장 밀접하게 관련된 선행기술"에 사용된 것을 포함해서). 상기 단계 b)에서 상기 현탁액과 접촉되기 전에, 상기 공기 흐름에는 하기 장치를 사용하여 다음과 같은 작업들이 수행된다:

* 멤브레인 압력 감소장치 Swagelok(KPR1JRF411A20000), 이것은 유출 압력의 높은 재현성을 확보할 수 있고, 0.3 Bar 이하의 매우 낮은 유동/비유동 전이기 압력 강하가 얻어질 수 있도록 재현성 있게 압출장치로 보내지는 공기 흐름을 안정화하는 작용을 한다;

* 마이크로미터 밸브 Swagelok(SS-SS6MM)를 통한 압력 조절장치로의 유출 조절, 이것은 유출 공기 유량(0~10 NL/분)을 매우 미세하게 조절할 수 있고, 유동/비유동 전이기의 재현성이 높으며, 선회 수와 분배되는 유량 사이에 선형성이 유지된다;

* 마이크로미터 밸브 하류에 위치되는, Precision Fluid에 의해 공급되는 회전형 부유 유량계(ROTAMETRO) Yokogawa(RAGK41-TOSS-SSNNN-M741A-TTCGN*A), 이것은 유출 유량(0~10 NL/분)의 정밀하고 신속한 판독이 가능하고, 따라서 마이크로미터 밸브를 통한 조정이 가능해진다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 따라서 얻을 수 있는 SC를 함유하는 마이크로캡슐로서, 이것의 특징 중 하나는 마이크로캡슐화된 SC가 마이크로캡슐화되지 않은 SC나 "프리" SC와 동일하게 IGF-1을 분비한다는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 T1DM의 예방 및 근본적 치유를 위한 의약 제조에 단독 치료제로서 세르톨리 세포, 유리하게는 본 발명의 방법에 따라서 마이크로캡슐화된 세르톨리 세포를 사용하는 것이다.

본 발명에 따라서, 얻어진 마이크로캡슐은 세척될 수 있고, 및/또는 더 나아가 천연 및/또는 인조 폴리머로 코팅될 수 있다.

선행기술과 비교하여, 본 발명의 방법은 a) 고정된 직경(300μm에서 시작)을 가지며, 완전히 균질하고, "미부" 구조가 없으며, 특히 마이크로캡슐화된 SC의 생육성(vitality)과 기능성이 손실되지 않는, 보다 작은 크기의 마이크로캡슐의 제조가 가능하고; b) 알기네이트 mL 당 마이크로캡슐화된 SC 개수가 알기네이트 mL 당 10⁶ SC 내지 20⁶ SC로 증가하고, 이것은 가능한 최소한의 폴리머 체적에 상당수의 SC를 이식할 수 있는 가능성을 내포하는 것이며; c) 마이크로캡슐화된 SC의 기능성, 특히 IGF-1의 생산과 관련된 기능성이 증가하는데, 그것의 분비는 50 ng/ml/20x10⁶ 세포 내지 80 ng/ml/20x10⁶ 세포로 변화하며, 이는 "프리" SC와 실질적으로 동등한 값이다.

본 발명과 관련하여, 다음 사항이 주지되어야 한다:

1. 먼저, 마이크로캡슐화된 SC는 최종적인 치료 접근법으로서 제안되며, 자가면역 과정에 의해 파괴된 환자의 베타-세포의 재생을 유도한다.

2. 평균 치수 감소, 다분산성 감소, 및 마이크로캡슐의 형태적 기형("미부" 및 유착)의 부재와 같은 개선된 특징을 가진 마이크로캡슐이 제조될 수 있는 마이크로캡슐화 과정의 최적화가 달성된다.

본 발명의 다른 목적은 T1DM의 예방 및 치료에 사용할 수 있는, 본 발명의 방법에 따라서 얻어질 수 있는 마이크로캡슐에 함유된 SC와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이다. 담체의 예는 복강내 투여를 위한 식염수를 포함한다. 이하, 본 발명의 상세한 양태를 설명한다.

폴리머의 정제

SC를 마이크로캡슐화하는데 사용될 수 있는 폴리머는 인체 이식과 같은 비경구 투여를 요하는 용도에 엄격히 요구되는 고도로 정제된 형태로는 시중에서 입수할 수 없다. 이러한 경우, 사실상 "품질 제어"에 관하여 엄격한 국제 승인 기준이 요구된다(미보건국 약전 가이드라인 참조).

대부분의 시판되는 제품들은 실제로 내독소 수준이 매우 높으며(일반적으로 30,000~60,000 EU/g), 이것은 이식 과정에 부적합하기 때문에, 내독소 수준을 100 EU/g 이하로 낮출 필요가 있다. 따라서, 마이크로입자의 제조에 사용되는 모든 폴리머에 대해 연속 정제 사이클을 적합하게 수행하여, 내독소를 충분히 감소시켜야 한다.

SC 의 분리

SC는 다양한 동물 공급원들로부터, 일반적으로 사춘기 전 객체로부터 분리되어 정제될 수 있다. 마취 후 동물에 양측성 고환절제술을 행한다. 부고환을 제거한 후, 고환을 다중효소로 침삭시킨다. 일단 침삭이 완료되면, 세관 조직을 여과한다. 이와 같이 얻어진 세관을 5% 이산화탄소 분위기에서 37℃에서 배양물에 넣는다. 인큐베이터에 넣고 48시간이 지난 후에, SC는 배양 플레이트에 부착되어 세포 단층을 형성하기 시작한다. 얻어진 SC의 순도, 생육성 및 기능성에 대해 분석한다. 세포 생육성 시험은 분리 직후, 배양 이틀째 그리고 마이크로캡슐화 과정 직전과 완료 후에 통상의 방식으로 수행한다.

마이크로캡슐화된 세르톨리 세포의 제조

SC는 단독으로 사용되거나 혼합하여 사용된 친수성 폴리머들로 구성된 다양한 하이드로겔로 구성된 마이크로캡슐 안에 고정될 수 있다. 마이크로캡슐화 과정의 첫 단계는 미세소적들의 보정된 연속 흐름을 얻는 것이다. 미세소적을 얻기 위하여 다음과 같은 다양한 과정들이 사용될 수 있다: (a) "에어-모노젯" 마이크로캡슐화기, (b) 자동 진동 캡슐화기, (c) 정전기 방식 마이크로캡슐화기, (d) 미세유동 랩-온-어-칩 시스템.

일단 제어된 균질한 치수의 미세소적들의 흐름이 얻어지면, 이들이 겔화 과정을 통해 고형 마이크로스피어로 변형된다. 예를 들어, SC가 모여 있는 단층을 처리하여 균질한 세포 현탁액을 얻은 후, SC를 다양한 초순수 폴리머 용액("폴리머의 정제" 절에 설명된 대로 하여 얻는다)에 재현탁하고, 마지막으로 겔화조 안의 얻어진 마이크로캡슐을 세척하고 분리한다. 제조된 마이크로캡슐은 그대로 사용될 수도 있고, 또는 다양한 천연, 반-합성 또는 합성 폴리머 층으로 코팅될 수도 있다. 따라서, 제안된 방법에 의해서, 형태적 결함(유착 또는 "미부")이 없는 고도로 균질한 치수를 가진 마이크로캡슐 안에 SC를 고정하는 것이 가능하며(도 3의 그림에 도시된 대로), 이로써 캡슐화된 세포의 생육성 및 기능성이 확실히 유지된다.

캡슐화된 SC 의 생체내 생체적합성

마이크로입자의 생체적합성은 복부 절개를 통해 수행되는 복강내 이식을 통하여 평가된다. 각 수여자 동물의 체중이 생체내 연구의 전 기간 동안 모니터된다. 이식 후 상이한 시점들에서, 마이크로캡슐을 외식하여 캡슐화된 세포의 형태와 기능을 평가한다. 회수된 마이크로스피어의 일반적인 특징은 현미경 분석을 통해 결정되었으며, 이로써 캡슐의 형태와 캡슐 표면에 염증성 세포가 존재하는지를 평가한다. 또한, 마이크로캡슐화된 SC의 생육성을 EB/FDA에 의한 이중 착색 기술을 사용하여 평가했다.

마이크로캡슐화된 SC 의 생체내 활성 평가

식염수 중의 마이크로캡슐화된 SC의 복강내 이식에 의해서 NOD 래트와 같은 사람 T1DM의 "엄격한" 동물 모델에서 T1DM가 예방 및 치료될 수 있다는 것이 판명되었다. 본 발명에 따른 SC의 마이크로캡슐화로부터 얻어진 제품의 투여는 식염수에 담지된 제품을 복강내 투여하여 이루어지는 것이 유리하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법을 적용하는데 유리한 마이크로캡슐 제조 장치이다. 상기 장치 및 그것의 작동에 관해서 도 9를 참조하여 설명한다. 제 1 용기(2)가 유체 분배 수단(4), 유리하게는 체적계량 펌프와 협력하여 포집관(3)을 통해 니들형 요소(5)로 현탁액(1)을 송달한다. 니들형 요소(5)는 측벽에 있는 단추구멍 모양의 개구(6)와 유출 구멍(7)을 가진다. 조인트(8)가 가압 유동성 유체(10), 바람직하게는 공기를 발생장치(9)로부터 내보내고, 이것은 조정 수단(11)에 의해 조정되면서 내부 요소(5)로 진입한다. 유동성 유체(10)를 적합하게 조절함으로써, 현탁액 흐름을 중단시키고, 균질한 크기의 미세소적(13)을 얻는 것이 가능하며, 미세소적은 제 2 용기(12)에 담긴 2가 양이온을 함유하는 용액 중에서 겔을 형성한다. 상기 언급된 에어젯 장치와 설명된 조건들은 균질한 마이크로캡슐을 얻기 위해 적용된다.

멸균 조건 및 GLP에서 사용할 수 있는 마이크로캡슐화기 시제품의 개발.

실시예

알기네이트계 마이크로스피어 내로의 세르톨리 세포의 마이크로캡슐화와 생체내 생체적합성 및 기능성의 평가.

폴리머의 정제

연속 여과 과정을 통해 얻어진 나트륨 알기네이트를 마이크로캡슐 제조의 베이스 폴리머로서 사용했다. 이것은 일반적으로 1~6%(w/v) 용액에서 이용될 수 있으며, 4~6℃ 온도에서 빛이 차단된 장소에 보관하는 것이 적절하다. 상기 화합물은 약 5년 동안 안정하며, 20 EU/g 이하의 내독소 함량을 가지고, 단백질을 실질적으로 함유하지 않는다(0.4% 미만, 미국 약전 "생체가시성"의 또 다른 기준).

사춘기 전 아기 돼지로부터 SC 의 분리

아기 돼지 "라지-화이트"(7~15일령)의 고환에서 SC를 분리했다. 0.1mg/kg 아자페론(Stresnil® 40mg/ml, 일본, 브뤼셀, 벨기에)과 15mg/kg 케타민(Imalgene® 100 mg/ml, Gellini Farmaceutici)을 근육내 투여하여 마취한 후, 돼지에 양측 고환절제술을 수행했다. 부고환을 제거한 후, 고환의 백막을 벗기고, 작은 조직 단편으로 미세하게 잘라서(1~3㎣), HBSS(Sigma Chemical Co, 미국 세인트루이스)에 용해한 콜라게나제 P(Roche Diagnostics, S.p.A., 이탈리아 몬자)(2mg/mL)를 사용하여 즉시 제 1 효소 침삭을 수행한다. 정세관이 분리될 때까지 침삭을 계속한다. 이어서, 수집된 세관을 HBSS로 세척하고, 500 r.p.m.에서 원심분리한다. 세척 후, 세관을 트립신(2mg/mL)과 DNAse I(Sigma)를 함유하는 HBSS 용액과 함께 인큐베이션한다. 2차 침삭 완료 후, 트립신 용액을 Hank's + 20% FBS로 1:1로 희석하여 트립신의 효소 활성을 중단시킨다. HBSS로 더 세척한 후, 300 r.p.m.에서 가볍게 원심분리하여 세관주위 세포로부터 세관을 분리한다. 세관 조직을 함유하는 "펠릿"을 500μm 메시 구멍을 가진 스테인리스 스틸 필터로 적절하게 여과한다. 마지막으로, 제제를 오염시키는 세관주위 세포와 레이디히 세포를 제거하기 위해서, 세관을 함유하는 현탁액을 5분간 800 r.p.m.에서 더 원심분리하고, 얻어진 펠릿을 글리신 1M 용액과 pH 7.2의 HBSS에 용해된 EDTA 2mM로 7분간 처리한다.

이와 같이 얻어진 세관을 37℃, 5% CO₂ 분위기에서 레티노산 0.166nM(Sigma)과 5mL/500mL 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS)(Becton Dickinson #354352)으로 보충된 HAM F12(Euroclone) 중의 배양물에 넣는다. 48시간 배양 후, SC는 배양 플레이트에 부착되어 세포 단층을 형성하기 시작한다. 잔류 생식세포(이것은 알려진 바로는 복강에 이식될 경우 배세포종을 일으킬 수 있다)를 제거하기 위해서, SC 단층을 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 염산염(TRIS)(Sigma) 버퍼로 처리하여 삼투성 세포용해를 통해 생식세포를 제거한다. 마지막으로, SC를 일반적으로 75㎠ 플라스크에 넣어 상기 조건에서 성장시킨다.

얻어진 SC의 순도, 생육성 및 기능성에 대해 분석했다. SC 순도는 90%를 초과했으며, 이것은 항-뮬러관 억제인자(MIS) 및 플루오로세인 항-비멘킨 항체와 함께 제제를 인큐베이션하는 면역세포화학 기술에 의해 평가되었는데, 각 항체는 SC에 의해서만 발현되는 MIS와 비멘틴 분자를 표시한다(도 1A, B).

잠재적 오염물질인 레이디히 세포와 세관주위 세포가 감소했음을 증명하기 위해서, SC 제제에 대해 조직화학 평가를 수행했다. 이러한 시험에 의해서 세관주위 세포에 특유한 알칼리성 포스파타제(Fast-Red 착색)와 레이디히 세포에 특유한 3-β-히드록시-스테로이도데히드로게나제 효소(니트로-블루 테트라졸륨)의 존재를 평가할 수 있다(도 1C, D). 이러한 조직화학 분석에서 얻어진 결과는 세관주위 세포와 레이디히 세포가 5~8% 존재함을 입증한다. 또한, 이들 세포 집단은 고환 세포의 적절한 기능에 유리한 분자 "크로스-톡"을 확보하는데 유용하다(상기 비율로 존재할 때).

에티듐 브로마이드(EB)와 플루오레세인-디아세테이트(FDA)(Sigma)로 처리하여 SC의 생육성을 결정했다. 형광현미경에 의해 관찰된 세포는 모든 조건에서 95%를 초과하는 생육성을 나타냈다. 세포 생육성 시험은 분리 직후, 배양 이틀째, 그리고 마이크로캡슐화 과정 직전에 통상의 방식으로 수행된다.

C) 세르톨리 세포의 캡슐화를 위한 미세소적의 제조

SC는 단독으로 사용되거나 혼합하여 사용된 다양한 다당류 폴리머들로 구성된 마이크로캡슐 안에 고정될 수 있다. 선택된 폴리머는 실험실에서 고순도 정제된 나트륨 알기네이트였다. 마이크로캡슐화 과정의 첫 단계는 폴리머 농도가 1~5%(w/v)로 변하는 수성 다당류 현탁액 중의 SC 세포 현탁액으로부터 미세소적들의 보정된 연속 흐름을 얻는 것이다.

미세소적을 얻기 위하여 다음과 같은 다양한 과정들이 사용될 수 있다: (a) "에어-모노젯" 마이크로캡슐화기, (b) 자동 진동 캡슐화기, (c) 정전기 방식 마이크로캡슐화기, (d) 미세유동 랩-온-어-칩 시스템.

특히, 선택된 방법인 (a)는 반자동 멸균 수송형 컴팩트 마이크로캡슐화기(도 2A에 이 시스템의 개략적인 도면이 도시된다)를 사용하며, 어떤 명백한 형태적 결함(예컨대, 유착 또는 "미부" 구조의 존재)이 없고, 특히 마이크로캡슐화된 SC의 생육성과 기능성이 손실되지 않는, 고도로 균질한 치수(300~700μm 직경)의 SC를 함유하는 마이크로캡슐을 제조할 수 있다.

도 2의 패널 B는 "에어-모노젯"을 통한 마이크로캡슐화 과정의 순서를 도식적으로 나타낸다.

D) 고순도 알기네이트계 마이크로캡슐의 제조

일단 제어된 균질한 치수의 미세소적들의 흐름이 얻어지면, 이들이 겔화 과정을 통해 고형 마이크로스피어로 변형되며, 이것은 실험실에서 개발되어 검증된 방법에 따라서 2가 이온들과 이온 결합을 형성하는 것이라고 생각된다.

특히, SC가 모여 있는 단층을 0.05% 트립신/EDTA(Gibco, 미국 그랜드아일랜드)(2분)로 처리하여 균질한 세포 현탁액을 얻는다. 세척 후, 혈구계수 분석에 의해 SC를 계수하고, 생육성을 시험한다. 이어서, SC를 1.5~2%(w/v)의 AG의 가변적인 농도를 가진 다양한 초순수 폴리머 현탁액에 재현탁한다. "에어-모노젯" 시스템을 사용해서 마이크로캡슐을 제조하는 경우, SC 폴리머 현탁액을 10~16 mL/분의 유속으로 튜브연동형 펌프에 의해 연속적으로 분출시킨다. 그 후, 세포 현탁액을 "에어-모노젯" 시스템을 통해 압출하여 내보낸다(3~7 L/분의 유속으로). 전체 과정 동안, SC 현탁액을 가볍게 교반하여 세포 응집을 방지하고 SC가 비균질하게 분포된 마이크로캡슐이 형성될 가능성을 차단한다.

제조된 미세소적들은 Ca⁺² 또는 Ba⁺²(0.5~2.5% w/v)와 같은 2가 양이온을 함유하는 용액 중에서 겔화된다. 이 방식에서, 미세소적들은 겔 마이크로스피어로 즉시 변형된다. 이어서, 마이크로캡슐을 겔화조에 2~15분 정도 방치한다. 이 단계가 끝나면 마이크로캡슐을 식염수로 다시 세척한다.

제조된 마이크로캡슐은 그대로 사용될 수도 있고, 아니면 천연, 반합성 또는 합성 양이온성 폴리머를 함유하는 용액 중에서 연속 인큐베이션함으로써 더 코팅될 수도 있다. 예를 들어, 폴리-L-오르니틴(PLO) 0.12%(10분 동안)와 0.06%(6분 동안)이 사용되었다. 마지막으로, PLO로 코팅된 마이크로캡슐을 희석된 다당류 용액으로 더 처리하여 고도로 생체적합성인 최종 외부 코팅을 제공한다.

도 3은 상기 설명된 과정에 의해서 얻어진 알기네이트계 마이크로캡슐의 현미경사진으로서, 바륨 이온만을 사용한 것(A-C)과 칼슘/폴리오르니틴/폴리머 이온의 다중 코팅을 사용한 것(B-D)을 도시한다. 따라서, 제안된 방법은 유착 또는 "미부" 구조의 존재와 같은 형태적 결함이 없는 고도로 균질한 치수를 가진 마이크로캡슐 안에 SC를 고정하는 것을 가능하게 하며(도 3의 그림에 도시된 대로), 결과적으로 캡슐화된 세포의 생육성 및 기능성이 확실히 유지된다.

E) 캡슐화된 SC의 생체내 생체적합성

100mg/kg 케타민(Parke-Davis/Pfizer, 독일 카를루스에)과 15mg/kg 크실라진(Bayer, 독일 레버쿠젠)을 복강내 투여하여 유도되는 일반적인 마취 후, 암컷 NOD 래트(Harlan, 이탈리아, 체중 약 25g)의 복부를 약간 절개하여 복강에 알기네이트 마이크로입자를 삽입했다. 10⁶개의 마이크로캡슐화된 SC가 각 동물에 이식되었다. 각 수여자 래트의 체중을 생체내 연구 전 기간 동안 모니터했다.

이식 4개월 후, 마취한 후에 동물의 복강으로부터 마이크로캡슐을 외식하여 내용물의 형태와 기능을 평가했다. 마이크로캡슐은 식염수로 복막을 세척하여 회수했다. 회수된 마이크로스피어의 일반적인 특징은 현미경 분석을 통해 결정했으며, 캡슐의 형태와 캡슐 표면에 염증성 세포가 존재하는지를 평가했다. 또한, 마이크로캡슐화된 SC의 생육성을 EB/FDA에 의한 이중 착색 기술을 사용하여 평가했다.

도 4(A-B)의 현미경사진들은, 캡슐 표면에 존재하는 최소 수준의 염증 세포가 나타내고 있는 대로, 다당류 마이크로입자들이 높은 생체적합성 기준을 유지한다는 것을 나타낸다. 또한, 마이크로캡슐화된 SC는 바륨 알기네이트(도 4A)를 사용한 경우와 칼슘 알기네이트(도 4B)를 사용한 경우 모두, 이식 4개월 후에도 우수한 생육성 수준을 유지한다(도 4C).

E) 마이크로캡슐화된 SC의 생체내 및 시험관내 활성 평가

본 발명은, 예를 들어 T1DM의 예방 및 치료 분야와 같은 이식 생체기술 분야에 적용될 수 있다. 실제로, 우리는 실험실에서 바륨 알기네이트 마이크로스피어에 마이크로캡슐화된 SC의 복강내 이식(20⁶/래트)이 NOD 래트와 같은 사람 T1DM의 "엄격한" 동물 모델에서 T1DM을 예방할 뿐만 아니라 치료할 수도 있다는 것을 증명했다. 특히, 바륨 알기네이트(BaAG) 마이크로스피어에 마이크로캡슐화된 SC를 72시간 배양 후 예비-당뇨병 NOD 래트의 복강에 이식했으며, 이는 당뇨병의 발현에 영향을 미쳤다. 이식은 일반적인 마취하에 개복을 통해 수행되었다. 이 후, 이식된 동물에 대해서 식사 전후에 체중과 혈당을 매주 체크하여 모니터했다. 우리가 따른 실험 프로토콜은 하기 나타낸 바와 같으며, 동물 그룹별로 상이한 치료를 적용했다.

A 그룹: "나이브" 예비-당뇨병 대조군 동물(빈 마이크로캡슐로 치료)

B 그룹: 자발적 당뇨병을 가진 대조군 동물(빈 마이크로캡슐로 치료)

C 그룹: "나이브" 예비-당뇨병 동물, 마이크로캡슐화된 SC를 복강내 이식하여 치료

D 그룹: "나이브" 예비-당뇨병 동물, "프리" SC(20⁶/래트)를 복강내 이식하여 치료

E 그룹: 자발적 당뇨병을 가진 동물, 마이크로캡슐화된 SC를 복강내 이식하여 치료

생체내 연구 과정 동안, 일부 동물을 죽여서 비장, 췌장주위 림프절 및 췌장을 수거하여 말초 면역학적 레이아웃을 평가했고, 동시에 조직형태학 시험과 면역세포화학 시험도 수행했다.

NOD 래트에 대한 생체내 실험의 최종 분석은 자발적 당뇨병에 걸린 예비-당뇨병 동물에 이식된 마이크로캡슐화된 SC가 상당한 치료적 결과를 달성했다는 것을 증명했으며, 그 결과는 아래 나타낸 바와 같다:

(A) 마이크로캡슐화된 SC는 NOD 래트에서 T1DM의 발병을 예방할 수 있다. 이 획기적인 결과는 T1DM의 자발적 발병 퍼센트의 분석으로부터 얻어질 수 있다. 실제로, 이 병상은 A 그룹에 속한 동물의 85%에서 자발적으로 발생했다(도 5B). 이 결과는 NOD 래트의 공급자(Taconic)에 의해 공표된 T1DM의 발병 퍼센트와 완전히 일치한다(도 5A). 한편, C 그룹에 속한 동물들의 경우(캡슐화된 SC로 치료된 예비-당뇨병을 가진 동물들), T1DM의 발병 퍼센트가 단지 9%에 불과했다(도 5c). 마지막으로, D 그룹에 속한 동물들의 경우("프리" SC를 복강내 이식하여 치료된 예비-당뇨병을 가진 동물들), "나이브" 그룹과 비교해서는 T1DM의 발병 퍼센트가 상당히 감소했지만(19%), C 그룹의 동물보다는 높았다(도 5D).

(B) 마이크로캡슐화된 SC는 이식 후 단지 7~15일 만에 당뇨병이 자발적으로 발생했던 E 그룹에 속한 래트(N = 30)의 60% 이상에서 혈당값(200 mg/dl 이하의 혈당에 도달)을 정상으로 회복시킬 수 있다(도 6A). 한편, B 그룹의 동물들(빈 캡슐로 치료된 당뇨병을 가진 동물들)은 높은 수준의 혈당이 계속 유지되었고 1~2주 안에 빠르게 사망했다. 마지막으로, F 그룹(N = 30)의 동물들("프리프리를 복강내 이식하여 치료된 당뇨병을 가진 동물들)은 약 40% 정도의 낮은 퍼센트에서만 혈당값이 정상으로 회복될 수 있었다.

(C) 림프절, 췌장 및 비장에 대해 수행된 연구에서는 SC가 C 그룹과 E 그룹에 속한 동물들의 면역시스템을 "재교육"하고, 질환을 초래하는 자가면역 공격을 "차단"할 수 있다고 증명되었으며, 이 결과는 치료된 동물의 비장세포에 대한 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR) 결과를 나타낸 도 7에서 볼 수 있다. 특히, 이러한 결과는 SC 치료의 주요 효과 중 하나가 생체내 Foxp3+ 세포를 유도할 수 있는 능력이라는 것을 나타낸다. Foxp3는 조절 특성을 가진, 즉 면역반응에 관련된 몇 가지 세포들의 활성화와 증식을 조절할 수 있는 T 세포의 선택적 마커로서, NOD 래트 모델에서는 이것의 수가 감소된다.

(D) 연구된 모든 동물 그룹에 대해 수행된 조직화학 분석은 SC 치료가 대조군(A 및 B)과 비교하여 C 그룹과 E 그룹에 속한 동물들에서 췌장 수준에서 췌장섬의 단핵 침윤물을 제거할 수 있다는 것을 증명한다(도 8). 또한, 이러한 효과는 새로운 β-세포를 생성할 수 있는 췌장 간엽줄기세포의 활성화를 유발했으며, 그 결과 SC로 치료된 동물들의 경우 더 이상 자가면역 공격을 받지 않게 되므로 혈당이 정상으로 회복될 수 있다. SC 치료 후 면역반응의 재조정은 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO) 효소의 면역조절 경로의 활성화에 의해서 매개되며, 이것의 동형 역시 SC에서 발현되어 기능한다.

Claims (13)

1. a. 1~5% w/v 범위 농도의 초순수 나트륨 알기네이트 식염수 용액을 사용하여 세포 조성에 관해 90%를 초과하는 순도를 가진 SC의 균질한 현탁액을 제조하는 단계;
   b. 상기 현탁액을 10~60 mL/분의 속도로 흡입하여, 니들형 요소에 도입하는 단계;
   c. 3~7 L/분으로 유체 스트림(stream)을 방출하여 상기 니들형 요소 안의 상기 현탁액을 압출하여 내보냄으로써, 균질한 치수를 나타내는 미세소적들의 연속 흐름을 얻는 단계;
   d. 상기 흐름의 상기 미세소적들을 2가 양이온 또는 폴리양이온성 물질을 함유하는 수성 용액으로 도입하여 겔화함으로써, 상기 마이크로캡슐을 얻는 단계
   를 포함하는 세르톨리 세포(SC)를 함유하는 하이드로겔계 마이크로캡슐의 제조 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 니들형 요소는 측벽에 단추구멍 모양의 개구를 가지며, 상기 유체 스트림이 상기 개구를 통해 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 마이크로캡슐은 1~3% w/v 농도의 나트륨 알기네이트로 제조되며, 내독소 함량은 20EU/g를 초과하지 않고, 단백질 함량은 0.4% 미만인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유체 스트림은 발생장치로부터 얻어지고, 상기 단계 c)에서 사용되기 전에, 다음 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 방법.
   a. 유동/비유동 전이기의 압력 강하가 0.3 Bar 미만이 되도록 압력을 감소시키는 단계;
   b. 유동/비유동 전이기의 높은 재현성, 및 경로 수와 생성되는 유체 스트림 사이에 선형 관계가 얻어지도록 조절하는 단계;
   c. 유출 스트림을 0 내지 10 NL/분으로 조절하고 조율하는 단계
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 d)에서 얻어진 마이크로캡슐을 세척하고, 및/또는 이어서 천연 및/또는 인조 폴리머로 더 코팅하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 방법에 따라서 얻을 수 있는 SC 함유 마이크로캡슐.
7. 제 6 항에 있어서, 적어도 20 x 10⁶ 개의 SC를 함유하는 것을 특징으로 하는 마이크로캡슐.
8. T1DM의 예방 및 치료를 위한 단독 치료제로서의 SC.
9. T1DM의 예방 및 치료에 사용하기 위한, 제 6 항 또는 제 7 항의 마이크로캡슐과 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
10. a. 현탁액용 용기;
    b. 니들형 요소를 통해 상기 현탁액의 흐름을 송달하는 수단;
    c. 마이크로캡슐이 제조되도록 상기 니들형 요소와 협력하여 상기 흐름을 중단시키는 수단
    을 포함하며, 상기 흐름을 중단시키는 수단이 제어된 압력하에 상기 니들형 요소 안에서 유체 스트림을 방출하는 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다당류 현탁액으로부터 마이크로캡슐을 제조하기 위한 장치.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 유체 스트림을 방출하는 시스템이 제어된 압력하에 상기 유체를 방출하기 위하여 상기 니들형 요소의 측벽에 존재하는 단추구멍 모양의 개구를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 송달 수단이 포집관, 체적계량 펌프 및 니들형 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
13. 제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방출 시스템이 연결 요소, 유체 발생장치, 바람직하게는 공기, 및 압력 조절 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.

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