JP5930279B2 - セルトリ細胞のマイクロカプセル化方法、得られるマイクロカプセルおよび１型糖尿病の予防および治療のためのその用途 - Google Patents

Description

この発明は、ヒドロゲルをベースとするマイクロカプセルに封入されたセルトリ細胞（ＳＣ）を１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）の予防および／または治療に用いること、および、好ましくはミクロ球体として成形されるマイクロカプセルの製造方法に関する。本発明の製品対象は、糖尿病理によって破壊されたベータ細胞の再生、および、Ｔ１ＤＭにおける該破壊の原因となる同様の自己免疫プロセスの「カットオフ」を誘発することができる。

マイクロカプセル化されたＳＣを用いた治療は、ヘキソーゲン膵島（ランゲルハンス島、ヒトまたは動物のいずれであっても）の移植に頼らずにＴ１ＤＭの予防および治療を可能にする。ＳＣマイクロカプセル封入から得られる製品は従来の薬剤と完全に対比できるものであることを理解すべきである。

１型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）の全世界における現在の発病率は、１年当たりにして約３０，０００件に匹敵する。限定的ではないが主として若年層やティーンエージャーを襲う1型ＤＭ発病の基本は、自己免疫メカニズムによって多くのインスリン分泌膵ベータ細胞が破壊されることにある。要約すれば、インスリン分泌を担う膵ベータ細胞に対する免疫寛容が失われ、自己抗体の生成に関連する免疫反応、主として細胞性の免疫反応が誘発されるために、ベータ細胞の自己破壊が引き起こされる。

ヘキソーゲンインスリンの投与を基本とする現在のＴ１ＤＭ治療は、糖質ホメオスタシス（glucide homeostasis）を可能な限り生理的条件におけるレベルに近付けるように回復させることに向けられている。しかしながら、インスリン治療は、分泌促進物質刺激に呼応する通常の膵ベータ細胞のインスリン分泌の脈動リズムを再生させることができない。

生理学的および安定的な膵内分泌機能の回復は、したがって、パソロジーの根本的解決のための最終ゴールを表す。この目的のために新しい戦略が提案されており、たとえば膵臓の全移植であり、ヒトドナーの膵臓から分離した膵島の移植である。

現在使用されているヘキソーゲンインスリン治療は、いかなる手法によってもＴ１ＤＭ治療のための最終的な治療法を与えない。この問題を解決するために、膵臓器の全移植や、ヒトまたは動物のドナーの膵臓から分離した膵島の移植を見据えたアプローチがこれまで長い期間に亘って提案されてきた。

膵島の移植は、全膵臓移植に比べると侵襲性が低いものの、同様の問題を有している。特に下記。
１．死体ドナーからのヒト膵臓は有用性が低く、したがってその膵島もまた同様である。
２．レシピエントを長期間に亘って薬物による免疫抑制レジメにかける必要がある。移植組織の免疫拒絶を防止するために用いられるこの治療オプションは、しかしながら、今日においても依然としてほとんど知られていないが潜在的には非常に深刻であり得る副作用を負っている。
３．非相同的な島の移植に対する拒絶、なぜならば、現在用いられている免疫抑制剤のいずれもがこれを有効に防止する能力を持っていないことが分かっている。
４．移植島細胞の経時生存率が低いこと。

セルトリ細胞（ＳＣ）は最近になってその機能が再評価されており、単なる精細管の構造サポートから、無数の栄養・免疫作用を伴う真のバイオケミカルラボラトリへと進化してきている。特に、ＳＣ培養が、ＢおよびＴリンパ球の増殖を抑制することが判明した（１）。さらに、その免疫調整作用を増大させるために、ＳＣがＴおよびＢ細胞のアポトーシスを促し、そのＦＡＳリガンドを通じて目的細胞によって示されるＦＡＳと結合する（２）。

ＳＣがその免疫調整的役割を果たすことを通じて実行されるもうひとつのメカニズムは、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の産生によって示される（３）。この分子は、ＣＤ４陽性Ｔリンパ球の分化フェノタイプに作用して、Ｔｈ１（非防御免疫）よりもＴｈ２（防御免疫）を好む。全体として、ベータ細胞は主としてＴｈ１リンパ球（ＩＮＦガンマ陽性）からなる湿潤物によって破壊されるので、セルトリ活性はＴ１ＤＭにおいて直接的な臨床上の重要性を有する。

さらに、ＳＣの免疫調整効果はある種の増殖因子、たとえばトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−□）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、幹細胞因子（ｃＫｉｔリガンド）、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド（Ｆａｓ−Ｌ）、アクチビンＡおよび最後にＢＣＬ−ｗなどの分化抗アポトーシスの産生に関連する（４）。

最も近い従来技術（ビブリオグラフィックＮｏ．５）には、ＳＣを高純度アルギン酸塩マイクロカプセルに導入して、平均外径５２０±１４μｍのマイクロカプセルを得ることが記載されている。

この文献の時点において、国際的レベルとして、マイクロカプセルは約５００μｍ径で５％を超えない「ｔａｉｌ／テール」率を有するものが好適であるとされていた。カプセル径およびテールの存在はいずれも非常に重要なパラメータである。前者は可能な限り小さくすることが望まれ、代謝産物（メタボライト）のより効果的な交換を許容する。後者については、５％未満の率であっても、細胞性抗原が存在し得る「抵抗減弱部」（loci
minoris resistentiae）の産生に起因して重大な炎症性疾患（phlogosis）を誘引する可能性があることが近年判明した。

本発明者らは、驚くべきことに、ＳＣの活性や機能性を損なうこと維持しながら、これをマイクロカプセル封入させることができる方法であって、テール構造が存在せず且つより小さな寸法を有する均一なマイクロカプセルを製造可能な方法を見出した。

上記考察において、本発明は第一に、ヘキソーゲン膵島細胞が何ら存在しない条件下において、ヒドロゲルをベースとするマイクロカプセルに封入されたＳＣを移植することによってＴ１ＤＮを予防および／または治療することの可能性を提案する。

したがって、本発明の目的は、請求項１に基づき、ヒドロゲルをベースとするセルトリ細胞（ＳＣ）含有マイクロカプセルの製造方法を提供することである。

豚ＳＣのミクロ写真。Ａ：プリパレーションを抗ミュラー抑制因子（ＭＩＳ）抗体でインキュベートして得た免疫細胞化学を示し、Ｂ：プリパレーションを抗ビメンチン（anti-vimentin）抗体でインキュベートして得た免疫細胞化学を示す。Ｃ−Ｄ：ライディッヒ（Leydig）細胞および管周細胞の貧存在を証明するため、プリパレーションを組織化学技術で処理することによりファストレッド（fast-red）で発色するアルカリフォスファターゼ（alkalinephosphatase、管周細胞の典型）の存在を評価し（Ｃ）、また、ニトロブルー・テトラゾリウムで発色する３−ベータ−ヒドロキシ−ステロイドデヒドロゲナーゼ活性（ライディッヒ細胞の典型）の存在を評価した（Ｄ）。 「エア・モノジェット（air monojet）」を通じて、アルギン酸塩をベースとするヒドロゲルにマイクロカプセル封入されたＳＣを製造するための装置（パネルＡ）。パネルＢはこの装置システムの最重要コンポーネントを示す。 ゲル化剤としてＢａＣｌ_２（Ａ−Ｃ）およびＣａＣｌ_２＋ポリオルニチン（Ｂ−Ｄ）を用いてシステム「エア・モノジェット」をアトマイズすることによって得られた、アルギン酸塩をベースとするミクロ粒子のミクロ写真。 移植後４ヶ月のＮＯＤマウスの腹膜腔から回収した後にバリウム（Ａ）およびカルシウム（Ｂ）イオンに架橋結合させたポリサッカライドミクロ粒子の鮮明フィールドのミクロ写真。パネルＣは，ＥＢ／ＦＤＡで二重染色した後にアルギン酸バリウム中でマイクロカプセル化したＳＣの蛍光顕微鏡によるミクロ写真を示す。 空のマイクロカプセルで処置した「ナイーブ」な（未処置）参照グループの前糖尿病性動物によるもの（Ｂ）との対比のため、ＮＯＤマウスの供給業者（Taconic）によって宣誓されたＴ１ＤＭの自然発生的発病率（８５％）を示す（Ａ）。一方、パネルＣは、カプセル化ＳＣで処置した前糖尿病性動物のＴ１ＤＭ発病率が９％近くにまで大幅に低下したこと（予防的効果）を示す。 マイクロカプセル化ＳＣで処置した明白な自然発症性糖尿病と共に、ＮＯＤマウス（グループＥ）の移植後の平均血糖値を示す（治療的効果）。 マイクロカプセル化ＳＣで処置した動物の脾細胞でのＲＴ−ＰＣＲ分析。この結果は、グループＣおよびＥ（セクションＶＩＩ参照）からの動物において、ＳＣによる処置によって生体内のＦｏｘｐ３陽性細胞数を増加させ得ることを示している。この結果は、制御機能すなわち免疫応答に含まれるある種の細胞の活性化および増殖を制御することができる特徴を有するＴ細胞の重要な増大を示す。 前糖尿病性のＮＯＤマウス（Ａ）および自然発症性糖尿病を罹患するマウス（Ｂ）の膵島の組織学的分析。イメージ画像は、該島の周辺および膵内のいずれにおいてもインスリン炎湿潤（pre-and intrainsular insulitic infiltrate）が全く見られないことを示している。パネルＣおよびＤは、いずれも空のカプセルで処置した前糖尿病性「ナイーブ」ＮＯＤマウスおよび自然発症性糖尿病罹患（Ｄ）の島の組織学的分析を示す。 本発明による装置レイアウト。

まず最初に、ＳＣの均質なポリサッカライド懸濁液を調製する。溶液は細胞組成において９０％超の純度を有し、濃度１〜５％ｗ／ｖ、好ましくは１〜３％の超純度アルギン酸ナトリウムの食塩溶液中で得られる。用いるアルギン酸塩は、２０ＥＵ／ｇを超えないエンドトキシン含量と、０．４％未満のプロテイン含量を示すような高純度である。流体としては好ましくは空気が用いられる。均質な細胞懸濁液を得るために、ＳＣはトリプシンおよびＥＤＴＡで予備処理される（２分間）。これを評価するために以下のものを用いた。
・免疫細胞化学技術：プリパレーションをミュラー管抑制因子（ＭＩＳ）およびフルオレシン抗ビメンチン抗体でインキュベートすると、ＭＩＳおよびビメンチンの分子がいずれもＳＣのみによって発現する。
・管周細胞の典型であるアルカリフォスファターゼ（ファストレッドに発色）およびライディッヒ細胞の典型である３−ベータ−ヒドロキシ−ステロイドデヒドロゲナーゼ酵素（ニトロブルー・テトラゾリウムに発色）の両方の存在を評価する細胞化学技術
まず最初に、ＳＣの均質なポリサッカライド懸濁液を調製する。溶液は細胞組成において９０％の純度を有し、濃度１〜５％ｗ／ｖ、好ましくは１〜３％の超純度アルギン酸ナトリウムの食塩溶液中で得られる。用いるアルギン酸塩は、２０ＥＵ／ｇを超えないエンドトキシン含量と、０．４％未満のプロテイン含量を示すような高純度である。流体としては好ましくは空気が用いられる。均質な細胞懸濁液を得るために、ＳＣはトリプシンおよびＥＤＴＡで予備処理される（２分間）。これを評価するために以下のものを用いた。・免疫細胞化学技術：プリパレーションをミュラー管抑制因子（ＭＩＳ）およびフルオレシン抗ビメンチン抗体でインキュベートすると、ＭＩＳおよびビメンチンの分子がいずれもＳＣのみによって発現する。・管周細胞の典型であるアルカリフォスファターゼ（ファストレッドに発色）およびライディッヒ細胞の典型である３−ベータ−ヒドロキシ−ステロイドデヒドロゲナーゼ酵素（ニトロブルー・テトラゾリウムに発色）の両方の存在を評価する細胞化学技術

上記組織化学技術アッセイによって得られた結果から、５−８％の管周細胞およびライディッヒ細胞の存在が証明された。これらの細胞集団は、さらに、（これらの割合で存在するときに）ＳＣの適正な機能性のために好適な分子クロストークを確実に実現させるために有用である。

この懸濁液を、好ましくは空気である流体を用い、制御された圧力の下で吸引と排出を１０−６０ｍｌ／分の速度で行うことにより、均一の寸法を有するミクロ液滴の連続流が得られる。これをニードルタイプエレメントに導入して、高度に均一なミクロ液滴に分割する。好ましくは、ニードルタイプエレメントはその側面にボタンホール開口を示し、そこに流体を３−７リットル／分の速度で導入して均一サイズのミクロ液滴の連続流を得る。流体はジェネレータから得られ、その使用前に、フロー／ノンフロートランジェント（flow-nonflow transient）において０．３バール未満の圧力低下をもたらすように減圧処理され、該フロー／ノンフロートランジェントにおいて高度の再現性が得られ且つ回転数と分散流との間に直線的関係が得られるように制御され、更に出力流が０−１０ＮＬ／分となるように調整制御される。

ミクロ液滴は４０μｍ未満の標準偏差において３００−７００μｍの平均径を有するものであって良い。得られたミクロ液滴を水溶液、好ましくは二価カチオンまたはポリカチオンの物質を含有して前記マイクロカプセルに所望のゲル化を与えるように注射用に調合された滅菌水を用いてなる水溶液に導入する。

本発明の更なる対象は、Ｔ１ＤＭの予防および根治療のための単独の治療薬としてのセルトリ細胞である。

好ましくは、本発明のプロセスによれば、ぜん動ポンプにより１０−１６ｍｌ／分の流速で連続的に吸引され、３−７リットル／分の好ましくは空気である流体を用いた「エア・モノジェット」システムを通じて排出される。このプロセスにおいて、方法全体の特徴的要素であるところの前記空気流の正確なキャリブレーション（exact
calibration）は下記システムコンポーネントによって確認できる。これらのシステムコンポーネントは、従来法（最近似従来技術に用いられる方法を含む）では存在していない。前記ステージｂ）の懸濁液と接触する前に、前記空気流は下記装置により下記操作される。
・メンブレン減圧装置Swagelok（商標、製品番号KPR1JRF411A20000）、これは出力圧力を高度に再現可能であり、流体の圧力低下が極めて小さく、フロー／ノンフロートランジェントにおける圧力低下が０．３Ｂａｒ未満であるようにするために、エクストルーダに送られる空気流を再現可能に安定化および形成する。
・マイクロメータバルブSwagelok（商標、製品番号SS-SS6MM）による制御。圧力レギュレータへの出力において、出力空気流を非常に厳密に制御（０−１０ＮＬ／分）することができ、且つ、フロー／ノンフロートランジェントにおける高度の再現性を有すると共に、回転数と分散フローとの間の直線性を維持する。
・Precision Fluid社（RAGK41-TOSS-SSNNN-M741A-TTCGN^*A）から提供される回転フロート式流量計（ROTAMETRO）Yokogawa。マイクロメータバルブの下流に設置され、出力流（０−１０ＮＬ／分）を正確且つ迅速に読み取ることができ、これによりマイクロメータバルブを通じてその調整を可能にする。

本発明の更なる対象は、本発明プロセスによって得られるＳＣ含有マイクロカプセルであり、その一つの特徴は、マイクロカプセル化されていないあるいは「遊離」しているＳＣと同等のＩＧＦ−１分泌を示すことである。

本発明の更なる対象は、好ましくは本発明プロセスによりマイクロカプセル化されたセルトリ細胞を、Ｔ１ＤＭの予防および根治療用薬剤の製造のための単独の治療薬として使用することの用途である。

本発明によれば、得られたマイクロカプセルを洗浄工程にかけ、および／または天然および／または合成ポリマーによるコーティングを施すことができる。

従来技術と比較すると、本発明プロセスは、ａ）「テール」構造の存在なしに、更にはとりわけマイクロカプセル化されたＳＣの活性や機能性を何ら損なうことなしに、より小さいサイズのマイクロカプセルを、固定された径（３００μｍ以上）で、しかも完全に均一に製造することが可能であり、ｂ）アルギン酸塩のｍｌによるマイクロカプセル化ＳＣの数を１０^６ＳＣｓからアルギン酸塩ｍｌで２０^６ＳＣに増大させ、このことは、最小限のポリマー容積においてより多数のＳＣをインプラントできる可能性を示唆しており、さらに、ｃ）特にＩＧＦ−１の産生に関連してマイクロカプセル化ＳＣの機能性を増大させ、その分泌を５０ｎｇ／ｍｌ／２０×１０^６細胞数から「遊離」ＳＣとほぼ同等である８０ｎｇ／ｍｌ／２０×１０^６細胞数へと増大させることができる。

本発明を参照して、次のことに注目すべきである。
１．まず、第一に、マイクロカプセル化ＳＣを最終的な治療アプローチとして提案し、自己免疫プロセスで破壊された患者のベータ細胞の新生（neogenesis）を誘発させる。
２．最適化されたマイクロカプセル化プロセスによれば、平均寸法の減少、多分散性の減少およびマイクロカプセル形態異常（「テール」や癒合）の不存在などの改善された特徴を備えたマイクロカプセルの製造が可能となる。

本発明の更なる対象は、Ｔ１ＤＭの予防および治療に用いられる生理学的に許容可能な媒体と共に、本発明プロセスによって得られるマイクロカプセル含有ＳＣを有してなる組成物である。媒体の一例は、腹腔内投与用の生理食塩水である。

＜ポリマーの精製＞
ＳＣをマイクロカプセル化するために使用可能なポリマーは、ヒト移植など非経口投与を必要とする調合に対して厳密に要求されるような高純度形態では市販されていない。このような場合、実際問題として、「品質管理」の厳密な国際認定基準が要求される（Ministry
of HealthおよびU.S. Pharmacopeiaのガイドラインを参照）。

多くの市販製品は、実際のところ、きわめて高いエンドトキシン濃度（概して３０，０００−６０，０００ＥＵ／ｇ）を有しており、このため、１００ＥＵ／ｇ未満のエンドトキシン濃度が要求される移植処置には全く不向きである。この結果として、ミクロ粒子生成に用いるすべてのポリマーを次に精製サイクルにかけて、エンドトキシンの存在を大幅に低減させる必要がある。

ＳＣは、一般に若齢の様々な動物ソースから分離・精製することができる。麻酔後、動物を両側去勢する。精巣上体の切除後、睾丸に多酵素消化（multienzymatic
digestion）を施す。消化完了後、管状組織を濾過する。得られた尿細管を５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で培地に接種する。インキュベータ内で４８時間後、ＳＣが培養皿に付着し始め、細胞モノレイヤーを形成する。得られたＳＣを純度、活性および機能性について分析する。細胞活性テストは、分離直後、培養２日目およびマイクロカプセル化プロセスの直前および直後にルーチン的に実行される。

＜マイクロカプセル化セルトリ細胞の製造＞
ＳＣは、単独または混合物内で用いられる親水性ポリマーからなる様々なヒドロゲルからなるマイクロカプセルに固定化することができる。マイクロカプセル化プロセスの最初の段階は、ミクロ液滴のキャリブレートされた連続流の獲得を目指すことである。ミクロ液滴を得るために様々な手法を用いることができ、たとえば（ａ）「エアモノジェット」マイクロカプセル化装置、（ｂ）自動振動マイクロカプセル化装置、（ｃ）静電マイクロカプセル化装置、（ｄ）ミクロ流体のlab-on-a-chipシステム、などである。

均一で制御された寸法を有するミクロ液滴流が得られたらすぐに、ゲル化方法を用いてこれを固体ミクロ球体に変える。一例として、ＳＣの凝集モノレイヤーを処理して均一細胞懸濁物を得、このＳＣを様々な超高純度ポリマー溶液（「ポリマーの精製」で記述したようにして得られたもの）に再懸濁させ、最後にゲル化槽に得られたマイクロカプセルを洗浄および分離する。このようにして製造されたマイクロカプセルはそのまま使用され、あるいはさらに様々な天然、準天然または人工合成のポリマー樹脂でコーティングされる。ここに提案した方法によれば、図３に示されるように、形態異常（癒合や「テール」構造の存在）なしに、ＳＣを高度に均一的な寸法を有するマイクロカプセルに固定することができ、カプセル封入された細胞の活性および機能的特徴を確実に保持する。

このミクロ粒子の生体適合性は、腹部切開を通じて実行される腹腔内移植によって評価される。各レシピエント動物の体重をすべての生体内研究に亘ってモニターする。移植後異なる時間経過において、マイクロカプセルを体外移植し、カプセル封入された細胞の形態および機能を評価する。回収されたミクロ球体の一般的な特徴を、顕微鏡による分析を通じて決定し、カプセル表面の形態および炎症細胞の存在を評価した。マイクロカプセル化ＳＣの活性を、ＥＢ／ＦＤＡによる二重染色技術を用いて評価した。

＜マイクロカプセル化ＳＣの生体内活性の評価＞
生理食塩水内においてマイクロカプセル化ＳＣを腹腔内移植することは、ヒトＴ１ＤＭの「適格な」動物モデル、たとえばＮＯＤマウスにおけるＴ１ＤＭの予防と治療の両方に有効であることが分かった。排他的ではないが好ましくは、本発明によるＳＣのマイクロカプセル化から得られた製品の投与は、生理食塩水に担持された製品として腹腔内投与によって行われる。

本発明の更なる対象は、本発明プロセスを適用するために好適なマイクロカプセルの製造装置である。この装置およびその動作について図９を参照して記述する。第一の容器２は、好ましくは容積型ポンプであるところの搬送手段４と協働して、懸濁液１をキャッチチューブ３を介してニードルタイプエレメント５に搬送する。ニードルタイプエレメント５はその側面にボタンホール開口６を有すると共に出口７を有する。ジョイント８は、好ましくは空気である圧力流１０をジェネレータ９から流入させ、圧力調整手段１１によって制御してエレメント５内に送り込む。流体１０を適切に制御することにより、懸濁流を遮断し、均一サイズのミクロ液滴１３を得る。これにより、第二の容器１２内の二価カチオン含有溶液中にゲルを形成する。上述したエアジェット装置および上述の条件は均一マイクロカプセルを得るために適用される。

＜無菌条件およびＧＬＰで用いられるマイクロカプセル化装置のプロトタイプの開発＞
以下に実施例を挙げて説明する。

＜アルギン酸塩をベースとするミクロ球体へのセルトリ細胞マイクロカプセル化およびその生体内での生体適合性と機能性の評価＞
＜ポリマーの精製＞
一連のろ過プロセスを経て得たアルギン酸ナトリウムをマイクロカプセル製造のための基本ポリマーとして用いた。このアルギン酸ナトリウムは、通常、１−６％（ｗ／ｖ）溶液内で得られ、好ましくは光保護場所において４−６℃で保管される。この化合物は約５年に亘って安定的であり、２０ＥＵ／ｇを超えないエンドトキシン含量を有し、プロテイン含量は実質的にゼロ（０．４％未満−ＵＳＦＤＡの「バイオインビジビリティ／bioinvisibility」の基準）である。

＜若齢豚からのＳＣ分離＞
生後間もない子豚（７−１５日齢）「Large-White」の睾丸からＳＣを分離した。０．１ｍｇ／ｋｇアザペロン（「Stresnil（商標）」４０ｍｇ／ｍｌ、Janssen,
Brusselle, Belgium）および１５ｍｇ／ｋｇケタミン（「Imalgene（商標）」１００ｍｇ／ｍｌ、Gellini Farmaceutici）の筋肉内投与で麻酔をかけた後、子豚を両側去勢した。精巣上体の切除後、白膜を除去し、小さな（１−３ｍｍ^３）細胞フラグメントに微細裁断し、直後にＨＢＳＳ（Sigma
Chemical Co., St.Louis, USA）においてコラゲナーゼＰ（Roche Diagnostics, S.p.A.,Monza, Italy）をベースとする１回目の酵素消化を投じた。細精管が分離するまで消化を連続する。回収された管をＨＢＳＳで洗浄し、５００ｒｐｍで遠心分離する。洗浄後、細管をトリプシン（２ｍｇ／ｍｌ）およびＤＮＡ分解酵素Ｉ(Sigma)を含有するＨＢＳＳ溶液でインキュベートする。２回目の消化後、トリプシン溶液をＨａｎｋ‘ｓ＋２０％ＦＢＳで１：１に希釈し、その酵素活性を停止させる。ＨＢＳＳでの更なる洗浄後、３００ｒｐｍでの軽い遠心分離を通じて管周細胞から細管を分離する。好ましくは、細管細胞を含有する「ペレット」を５００μｍメッシュ開口を有するステンレススチールフィルタで濾過する。最後に、プリパレーションに混入する管周細胞およびライディッヒ細胞を除去するために、細管含有懸濁液を更に８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られたペレットをｐＨ７．２においてＨＢＳＳ内でグリシン１Ｍ溶液とＥＤＴＡ２ｍＭで７分間処理する。

このようにして得られた細管を、５％ＣＯ２雰囲気において３７℃にて、レチノイン酸０．１６６ｎＭ（Sigma）および５ｍｌ／５００ｍｌインスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）（Becton
Dickinson #354352）を補充したＨＡＭ Ｆ１２（Euroclone）内培地に配置した。４８時間培養後、ＳＣが培養皿に付着し始め、細胞モノレイヤーを形成する。残留生殖細胞（公知のように、腹膜腔内に移植したときに未分化胚細胞腫を誘発させる恐れがある）を除去するために、浸透圧溶解を通じて残余生殖細胞を除去することを許容するような緩衝剤、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（Sigma）でＳＣモノレイヤーを処理する。

得られたＳＣを純度、活性および機能性について分析する。９０％超であったＳＣの純度は、免疫細胞化学技術によって評価した。すなわち、プリパレーションを抗ミュラー抑制因子（ＭＩＳ）抗体および抗ビメンチン抗体でインキュベートしたところ、いずれもＳＣのみによって発現されるＭＩＳおよびビメンチン分子を各々マークした（図１Ａ，Ｂ）。

潜在的汚染物としてのライディッヒ細胞および管周細胞の存在が減少されていることを証明するため、ＳＣプリパレーションを組織化学技術で処理した。これらのテストは、管周細胞の典型であるアルカリフォスファターゼ（ファストレッドで発色）と、ライディッヒ細胞の典型である３−ベータ−ヒドロキシ−ステロイドデヒドロゲナーゼ酵素（ニトロブルー・テトラゾリウムで発色）の両方の存在を評価することができる（図１Ｃ，Ｄ）。これらの組織化学アッセイにより得られた結果により、管周細胞およびライディッヒ細胞が５−８％存在することが証明された。さらに、これらの細胞集団は（このような割合で存在する場合において）精巣細胞のこれら集団の適正な機能性に対して好ましい分子「クロストーク」を確実にする上で有益である。

ＳＣ活性は、臭化エチジウムおよびフルオレセイン二酢酸（Sigma）での処理によって決定した。蛍光顕微鏡により観察された細胞はいかなる条件下にあっても９５％超の活性を示した。細胞活性テストは、分離直後、培養２日目およびマイクロカプセル化プロセスの直前にルーチン的に行われる。

Ｃ）セルトリ細胞をカプセル封入するためのミクロ液滴の製造
ＳＣを単独または混合物として用いられる様々なポリサッカライドポリマーからなるマイクロカプセルに固定した。選択したポリマーは、我々のラボで超純度精製したアルギン酸ナトリウムである。マイクロカプセル化プロセスの最初の段階は、ミクロ液滴のキャリブレートされた連続流の獲得を目指すことであり、これは、１−５％（ｗ／ｖ）の間で変動し得るポリマー濃度を持つ水溶性ポリサッカライド懸濁液中のＳＣ懸濁分子からスタートする。

ミクロ液滴を得るために様々な手法を用いることができ、たとえば（ａ）「エアモノジェット」マイクロカプセル化装置、（ｂ）自動振動マイクロカプセル化装置、（ｃ）静電マイクロカプセル化装置、（ｄ）ミクロ流体のlab-on-a-chipシステム、などである。

特に、半自動、コンパクト、滅菌可能且つ輸送可能なマイクロカプセル化装置（図２Ａはこのシステムの全体図である）に基づく方法（ａ）を採用すると、何ら顕著な形態異常（たとえば癒合や「テール」構造の存在）を与えることなしに、更にはとりわけマイクロカプセル化されたＳＣの活性や機能性を損なうことなしに、高度に均一な寸法（３００−７００μｍ径）のＳＣ含有マイクロカプセルを製造することができる。

図２のパネルＢは、「エアモノジェット」によるマイクロカプセル化プロセスの手順を図式化したものである。

Ｄ）超純度精製アルギン酸ベースマイクロカプセルの調製
制御された均一な寸法を有するミクロ液滴流が得られた後、すぐにこれをゲル化処理を介して固体ミクロ球体に変形させる。このゲル化処理は、我々のラボで開発・検証した方法によって二価イオンとのイオン結合を形成させるものである。

特に、均一な分子懸濁液を得るために、ＳＣの収束（converging）モノレイヤーを０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco, Garndisland,
USA）で処理する（２分間）。洗浄後、血球計分析によって計数し、活性をテストする。その後、１．５−２％（ｗ／ｖ）ＡＧ濃度の様々な超純度ポリマー懸濁液に再懸濁させる。「エアモノジェット」システムを用いたマイクロカプセル製造のためには、ポリマー内のＳＣ懸濁液を１０〜１６ｍｌ／分の流速でぜん動ポンプにより連続的に吸引する。次いで、分子懸濁液を「エアモノジェット」システム（３−７リットル／分の空気流を用いる）により押し出す。全工程を通じて、ＳＣ懸濁液を軽い攪拌状態に維持して、分子凝集を防止すると共にその中でＳＣが不均一に分散された状態でマイクロカプセルが形成されることを防止する。

製造されたミクロ液滴をＣａ＋２またはＢａ＋２（０．５−２．５％、ｗ／ｖ）などの二価カチオン含有溶液でゲル化する。このようにして、ミクロ液滴は直ちにゲル状ミクロ球体に変形する。その後、マイクロカプセルをゲル化槽内で２〜１５分間放置する。このステップの最後に、マイクロカプセルを生理食塩水で繰り返し洗浄する。

製造されたマイクロカプセルはそのまま使用され、あるいはさらに天然、半合成または合成のカチオン性ポリマー樹脂を含有する溶液中での一連のインキュベーションを通じてコーティングされる。例えば、ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）を０．１２％（１０分間）および０．０６％（６分間）で用いた。最後に、ＰＬＯでコーティングされたマイクロカプセルを更にポリサッカライドの希釈溶液で処理して、高度の生体適合性を有する最外層被膜を形成した。

図３は、上述のプロセスにより、バリウムイオンのみ（Ａ−Ｃ）を用いた場合およびカルシウム／ポリオルニチン／ポリマーイオン（Ｂ−Ｄ）で複合的コーティングを行った場合に得られた、アルギン酸塩をベースとするマイクロカプセルのミクロ写真である。ここに提案した方法によれば、図３に示されるように、癒合や「テール」構造の存在などの形態異常を起こすことなく、ＳＣを高度に均一的な寸法を有するマイクロカプセルに固定することができ、最終的に、カプセル封入された細胞の活性および機能性の特徴を確実に保持する。

Ｅ）カプセル封入されたＳＣの生体内適合性
１００ｍｇ／ｋｇケタミン（Parke-Daves/Pfizer, Karisruhe, Germany）および１５ｍｇ／ｋｇキシラジン（Bayer,
Leverkusen, Germany）の腹腔内投与により全身麻酔後、メスのＮＯＤマウス（Herian, Italy, 体重約２５ｇ）を小さく開腹してその腹腔内にアルギン酸ミクロ粒子を注入した。１０６個のマイクロカプセル化ＳＣが各動物に移植された。各レシピエントマウスの体重を生体内研究を通じてモニターした。

移植４ヶ月後に麻酔をかけて、動物の腹腔からマイクロカプセルを外植して、そのコンテンツの形態および機能を評価した。食塩水を用いた腹腔洗浄によってマイクロカプセルを回収した。回収したマイクロカプセルの一般的特徴を顕微鏡分析により決定し、その形態およびカプセル表面における炎症細胞の存在を評価した。さらに、マイクロカプセル化ＳＣの活性をＥＢ／ＦＤＡによる二重染色技術を用いて評価した。

図４（Ａ−Ｂ）に示されるミクロ写真は、ポリサッカライドミクロ粒子が、カプセル表面に存在する炎症細胞がミニマムレベルであることによって示されるように、高度の生体適合性スタンダードを維持することを示している。更に、アルギン酸バリウム（図４Ａ）およびアルギン酸カルシウム（図４Ｂ）中のマイクロカプセル化ＳＣはいずれも、移植４ヶ月後も優れた活性レベルを維持している（図４Ｃ）。

Ｅ）マイクロカプセル化ＳＣの生体内および生体外活性の評価
本発明は、移植バイオテクノロジーの分野において例えばＴ１ＤＭの予防および治療などの用途を見出した。実際のところ、我々のラボにおいて我々は、アルギン酸バリウムのミクロ球体内にマイクロカプセル化されたＳＣを腹腔内移植（２０６個／マウス）したところ、ヒトＴ１ＤＭの「説得力のある」動物モデルであるＮＯＤマウスなどにおいてＴ１ＤＭの予防および治療の両方に効果があることを確認した。特に、アルギン酸バリウム（ＢａＡＧ）のミクロ球体にマイクロカプセル封入されたＳＣを７２時間培養後に前糖尿病性のＮＯＤマウスおよび明らかな糖尿病患者の腹腔に移植した。移植は全身麻酔の下で開腹して行った。移植された動物の食前後の体重および糖血症を一週間ごとにチェックして測定した。我々が行った実験プロトコルは、下記に示されるように異なる処置を施した動物群を対象とした。

グループＡ：「ナイーブ」な前糖尿病性対照動物（空のマイクロカプセルで処置）
グループＢ：自然発生糖尿病の対照動物（空のマイクロカプセルで処置）
グループＣ：マイクロカプセル化ＳＣの腹腔内移植で処置した「ナイーブ」な前糖尿病性動物
グループＤ：「遊離」ＳＣ（２０６個／マウス）の腹腔内移植で処置した「ナイーブ」な前糖尿病性動物
グループＥ：マイクロカプセル化ＳＣの腹腔内移植で処置した自然発生糖尿病動物

生体内研究の過程で、数匹の動物を犠牲にして脾臓、膵周囲リンパ腺および膵臓を採集し、同時に組織形態学的および免疫細胞化学的に実験することにより、末梢免疫レイアウト（peripheral
immunological layout）を評価した。

ＮＯＤマウスの生体内実験の詳細な分析の結果、自然発生糖尿病を患っている前糖尿病性動物に移植したマイクロカプセル化ＳＣが下記に示すような顕著な治療効果を得た。

−（Ａ）マイクロカプセル化ＳＣは、ＮＯＤマウスにおけるＴ１ＤＭ発症を予防することができる。このセンセーショナルな結果は、Ｔ１ＤＭの自然発生率の分析から得られる。実際のところ、この病理がグループＡの動物の８５％に自然発生した（図５Ｂ）。この結果は、ＮＯＤマウス供給者（Taconic）によって宣誓されたＴ１ＤＭ発生率（図５Ａ）と完全に合致している。

一方、グループＣの動物（カプセル封入されたＳＣで処置した前糖尿病性動物）のＴ１ＤＭ発症率はわずか９％であった（図５Ｃ）。最後に、グループＤの動物（「遊離」ＳＣ）の腹腔内移植で処置した前糖尿病性動物）では、Ｔ１ＤＭ発症率がグループＣの動物より高いものの、「ナイーブ」な動物のそれ（１９％）と比較して顕著に減少した。

−（Ｂ）マイクロカプセル化ＳＣは、移植後わずか７−１５日で、自然発生糖尿病が進行しているグループＥ（Ｎ＝３０）のマウスの６０％以上において血糖値を正常化させる（２００ｍｇ／ｄｌ未満の血糖値を実現させる）ことができる。一方、グループＢの動物（空のカプセルで治療した糖尿病）は常に高い血糖値を維持し、１−２週間ですぐに死亡した。最後に、グループＦの動物（Ｎ＝３０）（「遊離」ＳＣの腹腔内移植で処置した糖尿病）はより低い率ではあったが約４０％の血糖値を正常化させることができた。

−（Ｃ）リンパ腺、脾臓および膵臓について実行した研究の結果、治療動物の脾細胞におけるリアルタイムなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）結果に関する図７から見て取れるように、ＳＣがグループＣおよびＥの動物の免疫システムを「再教育（re-educating）」することができ、疾患に対する自己免疫攻撃を「ブロック」することが判明した。特に、この結果は、ＳＣによる治療の主要な効果の一つが、生体内にＦｏｘｐ３＋細胞を誘発する能力であることを示す。Ｆｏｘｐ３は、免疫反応に含まれるある種の細胞の活性化および増殖を制御し、ＮＯＤマウスモデル内の該細胞数を減少させる制御的特徴を持つＴ細胞マーカーの一つである。

−（Ｄ）研究対象のすべての動物グループについて実行された組織化学的アッセイによれば、ＳＣによる処置は、対照グループ（ＡおよびＢ）に比べてグループＣおよびＥの動物において血糖値レベルにおけるインスリン炎単核湿潤（insulitic
mononuclear infiltrate）を除去できることを示している（図８）。更には、この効果は、ベータ細胞を新生させる膵臓間葉幹細胞（pancreatic
mesenchymal stem cells）の活性化をもたらす。ベータ細胞は、自己免疫攻撃によってはもはや侵食されないので、ＳＣで処置された動物の血糖値を正常化させる能力を持つ。ＳＣによる処置後の免疫反応は、そのアイソフォームがＳＣ内で発現し機能するところのインドールアミン−２−３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）酵素の免疫調節パスウェイの活性化によって、再調整される。

＜参考文献＞
1.Decesaris P, Filippini A, Cervelli C, Riccioloi, A.; Muci, S.; Starace, G.;
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cells cultured in vitro: Biological effects on lymphocytes. Biochem. Biophys
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2.Lynch DH, Ramsdell F, Alderson MR. Fas and Fasi. In the homeostatic
regulation of immune responses. Immunol. Today 1995, 16: 569-574
3.Suarez-Pinzon W, Korbutt G S, Power R, Hooten J, Rajotte R V, Rabinovitch A.
Testiocular Sertoli cells protect islet B-cells from autoimmunie destruction by
a transforming growth facter β1:dependent mechanism. Diabetes 2000,
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4.Emerich, D.F., Hemendinger, R., and Halberstadt, C.R. The Testicular-Derived
Sertoli Cell: Cellular Immunoscience to Enable Transplantation. Cell
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5.Luca, G., Calvitti, M., Nastruzze, C., Bilancetti, L., Beccetti, E., Mancuso,
F., Calafiore R. Encapsulation, in Vitro Characetrization and in Vivo
Biocompatibility of Sertoli’s Cells in Alginate Based Microcapsules. Tissue
Eng. 2007, 13:641-648

Claims (9)

1. ａ．１−５％ｗ／ｖ濃度の超純度アルギン酸ナトリウムの食塩溶液中で、９０％を超える細胞組織純度のセルトリ細胞（ＳＣ）の均一な懸濁液を調製するステップと、
   ｂ．１０−６０ｍｌ／分の速度で前記懸濁液を吸引してニードルタイプエレメントに注入するステップと、
   ｃ．減圧処理により制御された圧力を有するものとされた流体を３−７リットル／分の速度で前記ニードルタイプエレメントに導入し、該流体で、前記ステップｂにより前記ニードルタイプエレメントに注入された前記懸濁液を遮断するステップと、
   ｄ．前記ニードルタイプエレメント内において前記懸濁液を前記流体で遮断することにより得られた、均一な寸法を示すミクロ液滴の連続流を、前記ニードルタイプエレメントから排出するステップと、
   ｅ．前記ミクロ液滴流を二価カチオンまたは多価カチオン物質を含有する水溶液に導入して、ゲル化したマイクロカプセルを取得するステップと、からなるヒドロゲルベースのＳＣ含有マイクロカプセルの製造方法。
2. 前記ニードルタイプエレメントがその側面にボタンホールを有しており、該ボタンホールから前記流体を導入する、請求項１記載の方法。
3. 前記マイクロカプセルが、濃度１−３％ｗ／ｖで、２０ＥＵ／ｇを超えないエンドトキシン含量と０．４％未満のプロテイン含量を有するアルギン酸ナトリウムで形成される、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記流体がジェネレータにより得られ、前記ステップｃにおいて、フロー／ノンフロートランジェントにおいて、０．３バール未満の圧力低下をもたらすように減圧するステップと、該フロー／ノンフロートランジェントにおいて高度の再現性が得られ且つ回転数と分散流との間に直線的関係が得られるように制御するステップと、出力流が０−１０ＮＬ／分となるように制御調整するステップと、を実行する、請求項１ないし３のいずれか一に記載の方法。
5. 前記ステップｅで取得される前記マイクロカプセルに、洗浄および／または天然および／または合成ポリマーによる更なるコーティングを施す、請求項１ないし４のいずれか一に記載の方法。
6. １−５％ｗ／ｖ濃度の超純度アルギン酸ナトリウムの食塩溶液中で調整して得た９０％を超える細胞組織純度のセルトリ細胞（ＳＣ）の均一な懸濁液を収容する第一の容器と、ニードルタイプエレメントと、１０−６０ｍｌ／分の速度で前記第一の容器内の前記懸濁液を吸引して前記ニードルタイプエレメントに注入する搬送手段と、減圧処理により制御された圧力を有するものとされた流体を３−７リットル／分の速度で前記ニードルタイプに導入して前記ニードルタイプエレメント内で前記懸濁液を遮断して均一寸法のミクロ液滴の連続流を得る流体インミッションシステムと、前記ニードルタイプエレメントから排出された前記ミクロ液滴の連続流を収容する第二の容器と、前記第二の容器内の前記ミクロ液滴流をゲル化してマイクロカプセル化する手段と、を有してなることを特徴とするＳＣ含有マイクロカプセルの製造装置。
7. 前記流体インミッションシステムは、前記流体を制御された圧力の下でインミッションさせるために前記ニードルタイプエレメントの側面に形成されたボタンホールを有する、請求項６記載の装置。
8. 前記搬送手段は、キャッチチューブ、容積型ポンプおよびニードルタイプエレメントを有する、請求項６または７のいずれか一に記載の装置。
9. 前記インミッションシステムは、連結エレメント、空気ジェネレータおよび圧力制御手段を有する、請求項６ないし８の少なくともいずれか一に記載の装置。