KR20110095544A

KR20110095544A - 무등 단백질에 대한 안티센스 또는 작은 간섭 ｒｎａ 및 그 응용

Info

Publication number: KR20110095544A
Application number: KR1020100015074A
Authority: KR
Inventors: 오재욱
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-02-19
Filing date: 2010-02-19
Publication date: 2011-08-25

Abstract

본 발명은 무등 단백질에 대한 안티센스 또는 작은 간섭 RNA 및 그 응용에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 인체무등(MUDENG) 단백질을 코딩하는 폴리뉴크레오타이드에 대한 안티센스 또는 작은 간섭 RNA 및 그 RNA를 포함하는 암 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

Description

무등 단백질에 대한 안티센스 또는 작은 간섭 ＲＮＡ 및 그 응용 {An antisense or small interfering RNA and An application thereof}

본 발명은 무등 단백질에 대한 안티센스 또는 작은 간섭 RNA 및 그 응용에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 인체 무등 (MUDENG) 단백질을 코딩하는 폴리뉴크레오타이드에 대한 안티센스 또는 작은 간섭 RNA 및 그 RNA를 포함하는 암 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

암의 치료법은 수술, 방사선치료법, 항암화학요법으로 크게 나눌 수 있다.

한편 중추신경계의 암은 성상교세포 (astrocyte)와 희소돌기세포 (oligodendrocyte) 같은 신경교(glia)를 포함한 다른 세포 계열로부터 발생한다. 성상교세포종 (astrocytic tumor, astrocytomas)은 인접한 미세 환경과 어떻게 상호작용을 하는가에 따라 미만성 성상교세포종 (diffuse astrocytoma)와 국소성 성상교세포종 (localized astrocytoma)으로 나눌 수 있다. 국소성 성상교세포종은 주위의 미세 환경과 경계가 뚜렷한 증식과 제한적인 침윤 잠재성을 가지는 반면에 종양 등급(tumor grade)과는 상관없이 미만성 성상교세포종은 peritumoral margin과 주된 종양 형성부위로부터 먼 곳에서 세포침윤의 특성을 가지고 있다. 미만성 성상교세포종 (diffuse astrocytoma)은 astrocytoma (World Health Organization[WHO] grade), anaplastic astrocytoma (WHO grade), glioblastoma multiform (GBM, WHO grade)의 세 가지로 분류된다. 세 가지 등급의 미만성 성상교세포종은 침윤 특성을 가지고 있으며 특히 GBM (신경교종)은 더 높은 증식률, 괴사와 저산소증, 혈관형성, 뇌의 지지구조에 높은 침윤 및 암 재발율이 높은 특성을 가지고 있고, 다른 조직으로의 전이가 용이하기 때문에 이들의 암 치료능을 높이기 위한 다양한 시도가 이루어져 왔다.

동물 발생과정, 노화에서 통상적인 양상으로 일어나는 에팝토시스 (apoptosis) (Glucksmann, A., Biol. Rev. Cambridge Philos. Soc. 26: 59-86 (1951); Glucksmann, A., Archives de Biologie 76: 419-437 (1965); Ellis, etal., Dev.112 :591-603 (1991); Vaux, et al., Cell 76: 777-779 (1994))는 세포 수를 조절하고, 형태 형성을 용이하게 하며, 유해 세포 또는 비정상적인 세포를 제거하는 역할을 한다. 에팝토시스는 에팝토시스를 유발하는 내부 신호 또는 외부 신호를 받으면 암호화된 자살 프로그램이 활성화되면서 유도된다. 아폽토시스가 일어난 세포는 이웃하는 세포 또는 거식세포에 의해 인식되고 제거된다. 이와 같은 제거 기작으로 인해, 다수의 세포가 제거됨에도 불구하고 염증을 수반하지 않는다 (Orrenius,S., J Internal Medicine 237: 529-536 (1995)).

이러한 에팝토시스과정에 카스파제가 중요하게 작용한다 (Thornberry, Chemistry and Biology 5:R97-R103 (1998);Thornberry, British Med. Bull. 53: 478-490 (1996)). 현재까지 발견된 모든 카스파제는 프로카스파제 형태로 생성된 후 프로세싱되어 활성화된다. 카스파제는 카스파제 활성이 없는 전구체 폴리펩티드 (프로카스파제)로서 세포에 존재한다.

카스파제의 활성화는 프로카스파제의 단백질 분해에 의하여 일어난다. 예를 들면, 카스파제 3은 32 kDa 폴리펩티드 전구체인 프로카스파제 3의 단백질 분해에 의하여 형성된, 약 17 - 20 kDa과 11 kDa 폴리펩티드를 각각 2개씩 가지는 헤테로 테트라머이다. 프로카스파제 3의 절단은 상위 단계에서 활성화된 개시자 (initiator) 카스파제에 의해 2 단계로 일어난다. 제1 단계 절단은 여전히 프로도메인 (prodomain)을 포함하는 부분적으로 가공된 큰 서브유니트 (22-24 kDa), 및 약 11 kDa의 더 작은, 완전히 가공된 서브유니트를 생산한다. 제2 단계 절단에서 상기 프로도메인은 상기 부분적으로 가공된 큰 서브유니트로부터 절단되어 상기 활성 프로카스파제 3 효소의 17-20 kDa의 성숙하고 완전하게 가공된 큰 서브유니트를 생성한다. 현재, 시스테인 프로테아제의 카스파제 훼밀리는 14개의 상이한 구성원을 포함하며 공지된 모든 카스파제는 활성 효소를 형성하기 이전에 아스파르틸 잔기에서 절단이 요구되는 프로카스파제 형태로 합성된다.

여러 종류의 세포사멸에서 카스파제가 관여한다는 것이 카스파제 펩타이드 저해제 (z-YVAD-FMK, z-DEVD-FMK), 또는 바이러스 단백질 (crmA)을 이용하여 확인되었다. 크로마틴의 핵막 부착과 관련되는 라민 B가 카스파제에 의하여 분해되면, 아폽토시스와 연관된 크로마틴의 붕괴가 일어난다. DNA 단편화 인자 (DFF-45)의 45 kDa 서브유니트가 카스파제에 의하여 분해되면, 게놈 DNA가 뉴클레오좀 단편으로 단편화되도록 하는 경로가 활성화된다. PARP (poly (ADPribose)polymerase)가 카스파제에 의하여 분해되면, DNA 손상을 복구하는 PARP의 능력이 방해되어, 아폽토시스와 연관된 형태적 변화가 일어난다.

활성화된 카스파제는 에팝토시스를 유발함으로써 암 세포를 제거할 수 있는 반면 카스파제가 활성화되지 못하여 에팝토시스가 유발되지 않는 것이 암의 발생에 결정적 역할을 하는 것으로 알려졌다. 일부 항암제는 불활성 상태의 카스파제 캐스케이드를 활성화시킴으로써 암세포의 아폽토시스를 유발할 수 있다 (Los, et al., Blood 90:3118-3129, 1997); Friesen,et al., Nat. Med 2:574, 1996). 즉, 카스파제 캐스케이드를 활성화시키고 아폽토시스를 유도하는 것은 효과적인 암 치료를 위하여 매우 중요하다.

포유동물에서, 카스파제의 활성화는 별개의 개시자 카스파제에 의하여 개시되지만, 공통적인 "작용자 (excutioner)" 카스파제를 활성화시키는 적어도 2개 이상의 기작을 통하여 이루어진다. Fas 수용체에 결합하는 Fas 리간드에 의하여 개시되는 에팝토시스는 외생적 에팝토시스 (extrinsic pathway)로서 잘 알려진 세포사 경로이다. 리간드가 Fas에 결합하면 Fas의 세포내 사멸 도메인 (death domain)에 MORT1 (FADD) 단백질이 자체가 가진 죽음 도메인을 통해서 결합하고, MORT1 (FADD) 단백질의 사멸 효과 도메인 (death effector domain)에 프로카스파제 자체가 가진 죽음 효과 도메인을 통해서 결합하여 죽음 유발 신호전달 복합체 (Death inducing signaling complex, DISC)가 형성되면 개시자 카스파제의 하나인 프로카스파제 8이 활성화되어 카스파제 8이 형성되어 하위 단계의 카스파제들을 차례로 활성화시킨다.

TRAIL (TNF related apoptosis-inducing ligand)로 알려진 단백질은 TNF과 리간드의 일원이다 (Wiley et. al.,Immunity, 3, 673-682, 1995). TRAIL은 정상세포에서는 아폽토시스를 유발하지 않고 형질 전환된 암 세포 (transformed cancer cell)에서만 아폽토시스를 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다. 미국특허 제6,642,358호에는 TRAIL이 결합하는 TRAIL 수용체가 개시되어 있다. TRAIL에 의하여 에팝토시스가 유도될 수 있는 세포의 예에는 여러 형태의 암세포가 포함된다. TRAIL은 암세포에서는 에팝토시스를 유도하지만, 대부분의 정상 세포는 TRAIL에 대하여 저항성의 성질을 가진다는 점에서 항암치료제로서 매우 유용하다. 그러나 실제로는 많은 암세포가 TRAIL-저항성을 획득하고 있다는 점에서 치료제로서의 많은 제약이 있다 (Kim et. al., Clin Cancer Res, 6, 335-346,1995. Zhang et. al., Cancer Res 59, 2747-2753, 1999).

한편, 단백질 합성 저해제인 시클로헥시미드 (CHX: cycloheximide)는 TRAIL 매개된 아폽토시스에 대한 민감도를 증가시키기 위하여 널리 사용되어 왔다 (Beyaert and Fiers, FEBS Lett 340, 9-16, 1994). CHX 처리가 TRAIL 매개 아폽토시스에 대하여 세포를 민감화시키는 기작에 대한 연구가 있었다. 예를 들면, CHX는 c-FLIP의 생합성을 저해함으로써 세포를 TRAIL에 대하여 민감화시키는 것으로 예측된 바 있다 (Fulda et. al., Cancer Res 60, 3947-56, 2000).

한편, RNA 간섭 (RNA interferance, 이하 「RNAi」라 칭한다)은 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA와 이것과 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA로 구성되는 이중사슬 RNA (이하, 「dsRNA」라 칭한다)를 세포 등에 도입하는 것에 의하여 표적유전자 mRNA의 분해를 유도하고 표적유전자의 발현을 억제할 수 있는 현상이다. 이와 같이 RNAi는 표적유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 종래의 지루하고 비효율적인 상동재조합에 의한 유전자 파괴방법을 대신하는 간단한 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자치료 (gene therapy)의 방법으로서 상당한 관심을 모으고 있다. 상기 RNAi는 처음에 선충 (nematode)에서 발견되었지만 (Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811, 1998), 현재는 식물, 선형동물, 초파리 (Drosophila) 및 원생동물 등의 각종 생물에서도 관찰되고 있다 (Fire, A. RNA-triggered gene silencing. Trends Genet. 15, 358-363, 1999, Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 2001, Hammond, S. M., Caudy, A. A. amp; Hannon, G. J. Post-transcriptional gene silencing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-1119, 2001, Zamore, P. D. RNA interference: listening to the sound of silence. Nat Struct Biol. 8, 746-750, 2001).

이들 생물에서는 실제로 외래의 dsRNA를 도입함으로써 표적유전자의 발현이 억제되는 것이 확인되었고, 나아가 이 기술은 넉다운 개체를 생산하는 방법으로 이용되고 있다.

한편, 인체 세포 내에 존재하는 신규 단백질인 인간 MUDENG 단백질은 Fas-매개 에팝토시스에서 헤머헤드 리보자임을 사용한 스크리닝 방법에 의하여 제시된 신규 유전자이다 (Kawasaki, H. and Taira, K. (2002). Nucleic Acids Res 30, 3609-14). 그것은 clathrin-매개된 엔도사이토시스에서 APs의 μ2 서브유니트에서 동정된 어댑틴 도메인을 포함하는 490개의 아미노산으로 이루어져 있다 (Boehm, M. and Bonifacino, J.S. (2002). Gene 286, 175-86; Edeling, M.A., Smith, C. and Owen, D. (2006). Nat Rev Mol Cell Biol 7, 32-44). 인간 MUDENG 유전자의 호모로그들이 마우스, 랫트, 소, 개 및 조류에서도 동정되었다 (Lee, M.R. et al. (2008). Biochem Biophys Res Commun 370, 504-8).

T 세포에서 MUDENG의 이소성 발현은 그 자체로 현저한 세포사멸을 유도한다 (Lee, M.R. et al. (2008). Biochem Biophys Res Commun 370, 504-8). 에팝토틱 세포 사멸은 발생 동안 및 항상성의 보호에서 중요한 역학을 한다. 그 사멸 수용체에 리간드 결합은 수용체 응집 및 어댑터 분자의 모집을 유도하고, 그것은 단백질분해 경로를 시작한다. 사멸 수용체에 의해 매개되는 에팝토시스를 겪는 세포들을 핵 응집, 막 돌출 및 핵 절편화등을 가진다 (Cryns, V. and Yuan, J. (1998). Proteases to die for. Genes Dev 12, 1551-70).

현재까지 본 발명자들이 찾아낸 무등 (MUDENG)에 대한 정보는 무등 (MUDENG)이 세포내 세포질에 존재하는 단백질이라는 것과, 이러한 단백질의 기능으로서는 암세포에서 인위적인 과다발현을 시킬 때 암세포의 세포사를 유발시킨다는 것이고, 피부, 신장, 폐, 갑상샘, 가슴샘, 간 등 정상조직과, 또한 중추신경계 (대뇌, 소뇌, 뇌간, 척수)의 정상세포와 인체 뇌암유래 세포주에서도 무등 (MUDENG)이 발현된다는 점이다. 특히, 정상인의 뇌와 뇌질환 환자들에게서 무등 (MUDENG) 단백질의 발현에 차이가 있을 수 있다는 사실은 무등 (MUDENG) 단백질을 검출하는 것이 다양한 인체 질환, 즉 암 혹은 뇌질환을 진단 및 치료하는데 하나의 핵심 역할을 할 수 있을 것으로 생각된다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 무등(MUDENG) 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 안티센스 또는 작은 간섭 RNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 RNA를 이용한 암 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1에 기재된 무등(MUDENG) 단백질을 코딩하는 폴리뉴크레오타이드에 대한 안티센스 (antisense) 폴리뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA (small interfering RNA)를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴크레오타이드는 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 가지는 것이 바람직하나 유전자 코드 디제러시 등을 고려하여 무등 단백질의 활성을 나타내는 서열번호 2의 변이체도 본 발명의 폴리뉴크레오타이드에 포함된다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 폴리뉴크레오타이드 또는 작은 간섭 RNA의 센스 가닥은 서열번호 3 내지 서열번호 7에 기재된 뉴크레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 분자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 센스 가닥이 서열번호: 3 내지 서열번호: 7로 구성된 군으로부터 선택된 표적 서열에 상응하는 리보뉴클레오티드 서열이고, 안티센스 가닥이 상기 센스 가닥에 상보적이며, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 서로 혼성화하여 상기 이중 가닥 분자 (double-stranded molecule)를 형성하며, 상기 이중 가닥 분자를 무등 (MUDENG) 유전자를 발현하는 세포에 도입할 때 상기 유전자의 발현이 억제되는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 분자를 제공한다.

또한 본 발명은 유효성분으로서 약학적으로 유효한 양의 (a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; (b) 서열번호: 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 (carrier)를 포함하는 암 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 암은 뇌암, 자궁경부암, 유방암, 방광암, 간암, 전립선암 및 신경아세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고 뇌암인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에서 뇌암은 뇌에 생기는 암 조직을 총칭하는 의미이며, 뇌종양을 포함하는 개념이다.

또한 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 작은 간섭 RNA는 서열번호: 3 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에서 '작은 간섭(si) RNA'는 포유동물 세포 내에서 독성을 나타내지 않는 범위의 짧은 사슬로 구성되는 이중사슬 RNA를 의미하고, 예를 들어, 1549 bp, 바람직하게는 1535 bp일 수 있다. 혹은, 발현되는 siRNA가 전사되어 최종적인 이중사슬 RNA부분의 길이가 예를 들어, 15∼49 bp, 바람직하게는 15∼35 bp,더욱 바람직하게는 21∼30 bp로 할 수 있다. siRNA에 있어 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치 (대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지 (일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함되어 있어도 좋다. 쌍을 이루지 않는 부분은 siRNA 형성을 방해하지 않는 범위에서 포함될 수 있다.

본 발명에서 상기 '벌지(bulge)'는, 바람직하게는 1 내지 2 염기의 쌍을 이루지 않는 염기로 구성되고 siRNA에 있어 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 영역 내에서 바람직하게는 1 내지 7 개, 보다 바람직하게는 1 내지 5 개 포함된다.

또한, 본 발명에서 상기 '미스매치'는 siRNA에 있어 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 영역 내에서 바람직하게는 1 내지 7 개, 보다 바람직하게는 1 내지 5 개 포함된다. 바람직하게는 일방의 염기가 구아닌이고 타방이 우라실인 것과 같은 미스매치를 들 수 있다. 바람직하게는, 센스 RNA를 코드하는 DNA에 있어서, C로부터 T로의 변이, 혹은 G로부터 A로의 변이 혹은 이들의 변이가 혼재한 변이이지만, 특히 이들의 변이에 제한되지 않는다. 나아가, 본 발명에 있어서는, siRNA에 있어 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 영역 내에서 벌지 및 미스매치의 양방이 포함되어도 좋고, RNA나선이 짝을 이루는 siRNA의 이중사슬 RNA 영역 내에서 벌지 및 미스매치를 바람직하게는, 합하여 1 내지 7 개 , 보다 바람직하게는 합하여 1 내지 5 개 포함할 수 있다.

siRNA 말단 구조는 표적유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활 (blunt) 말단 혹은 점착 (cohesive) (돌출) 말단의 어느 것이어도 좋다. 또한, 돌출하는 염기 수는 이미 보고된 2, 3 염기에 한정되지 않고, RNAi 효과를 유도할 수 있는 염기 수로 할 수 있다. 예를 들어, 이러한 염기의 수로서는 18 염기 , 바람직하게는 24 염기로 할 수 있다. 즉, 본 명세서에 있어서, 점착 말단 구조를 가지는 siRNA의 전장은, 중앙의 이중사슬 부분의 길이와 양 말단의 단일사슬 돌출을 구성하는 길이의 합으로 표시할 수 있다. 예를 들어, 중앙이 19 염기이고 양 말단에 4 염기가 돌출하는 경우에는 전장은 23 염기로 표시하는 것으로 한다. 또한, 이 돌출하고 있는 서열부분은 표적유전자와의 특이성이 낮기 때문에 표적유전자의 서열과 상보적 (안티센스) 서열 혹은 같은 (센스) 서열일 필요가 반드시 있는 것은 아니다. 또한, siRNA에 의한 표적유전자의 발현 억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA (예를 들어, tRNA, rRNA 또는 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 구비하여도 좋다.

또한, 상기 'siRNA'의 말단구조는 상술한 바와 같이 양측이 절단구조를 가지고 있을 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조여도 좋다. 이 이중사슬 RNA부분 (스템 부분)의 길이는 상술한 바와 같이, 예를 들어, 15∼49 bp, 바람직하게는 15∼35 bp, 더욱 바람직하게는 21∼30 bp로 할 수 있다. 혹은, 발현되는 siRNA가 전사되어 최종적인 이중사슬 RNA부분의 길이가 예를 들어, 15∼49 bp, 바람직하게는 15∼35 bp, 더욱 바람직하게는 21∼30 bp로 할 수 있다. 또한, 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이이면 특히 한정되지 않는다. 예를 들어, 스템의 짝짓기 (pairing)의 안정화 및 스템 부분을 코드하고 있는 DNA 사이에서의 재조합을 억제하기 위해서는 링커 부분에 클로버 잎 tRNA구조를 사용해도 좋다. 또한, 링커의 길이가 스템의 짝짓기 (pairing)에 지장을 주는 길이여도 예를 들어, 링커 부분에 인트론을 포함시켜 전구 RNA로부터 성숙 RNA로 프로세싱 되는 때 인트론이 잘라내어져 스템 부분이 짝을 이루도록 구성할 수도 있다. 또한, 스템 루프형의 siRNA의 경우에는 루프를 갖지 않는 RNA의 어느 말단 (머리 혹은 꼬리)에 저분자 RNA를 가져도 좋다. 이 저분자 RNA는 상술한 것처럼, tRNA, rRNA 또는 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA 분자여도 되고 또는, 인공의 RNA 분자여도 좋다.

본 발명에서 '표적유전자'는 그 유전자의 발현이 본 시스템에 의하여 발현되는 siRNA에 의하여 억제되는 유전자로서 임의로 선택할 수 있다. 이 표적유전자는 예를 들어, 서열은 판명되었지만 어떠한 기능을 가지는지 해명하기를 원하는 유전자와, 그 발현이 질환의 원인이라고 생각되는 유전자 등을 바람직하게 선택할 수 있다. 표적 유전자는 그 mRNA 서열의 일부, 즉, siRNA의 일방의 사슬 (안티센스 RNA 사슬)과 결합할 수 있는 길이인 적어도 15 염기 이상이 판명된 것이라면, 게놈 서열까지 판명되지 않은 유전자도 선택가능하다. 따라서, EST (Expressed Sequence Tag) 등의 mRNA의 일부는 판명되어 있지만, 전장이 판명되지 않은 유전자 등도 '표적유전자'로서 선택할 수 있으며, 본 발명의 일 구체예에서는 무등 단백질을 코딩하는 유전자가 이에 해당된다.

본 발명에서 '안티센스 RNA'는 표적유전자의 mRNA와 상보적인 서열로 구성되는 사슬로 이 안티센스 RNA가 표적유전자의 mRNA와 결합하여 RNAi를 유도한다고 생각되고 있다. '센스 RNA'는 상기 안티센스 RNA와 상보적인 서열을 가지며 상보적인 안티센스 RNA와 어닐링 (anealing)하여 siRNA를 생성한다. 이들 안티센스 RNA와 센스 RNA는 RNA 합성기에 의하여 합성할 수도 있고, 이들 RNA는 각각 siRNA 발현시스템 중의 안티센스 RNA를 코드한 DNA (안티센스 코드 DNA), 센스 RNA를 코드한 DNA (센스 코드 DNA)에 의하여 세포 내에서 발현될 수도 있다.

본 발명의 상기 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "암 치료용"은 암세포의 증식을 억제하거나 사멸하는 작용 및 암세포의 전이를 억제하거나 차단하는 작용을 의미하는 것으로, 암의 예방 및 치료 모두를 의미한다. 본원에 있어서, "예방"이란 조성물의 투여로 암 형성을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.

한편, 본 발명의 항암 조성물 내 RNA 핵산 분자는 세포 내 발현을 위한 벡터에 포함되어 제공될 수 있다.

본 발명의 RNA 핵산 분자는 DNA 및 DEAE-덱스트란의 복합체, DNA 및 핵 단백질의 복합체, DNA 및 지질의 복합체 등의 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 상기 RNA 핵산 분자는 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다.

상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 벡터 (viral vector)로서 예를 들면, 렌티바이러스 (lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스 (herpes virus) 및 아비폭스바이러스 (avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 일종으로 핵공 (nucleopore)이나 완전한 핵막으로의 능동 도입을 가능하게 하는 사전-통합 복합체 (바이러스 "쉘(shell)")의 친핵성으로 인해 분열세포 뿐만 아니라 미분열 세포도 감염시킬 수 있는 특징이 있다.

또한, 상기 본 발명의 RNA 핵산 분자를 포함하는 벡터는 선별마커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 용어 "선별마커 (selection marker)"란 RNA 핵산 분자가 도입되어 형질전환된 세포의 선별을 용이하게 하기 위한 것이다. 본 발명의 벡터에서 사용할 수 있는 선별마커로는 벡터의 도입 여부를 용이하게 검출 또는 측정할 수 있는 유전자라면, 특별히 한정되지 않으나, 대표적으로 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들, 예를 들어 FP (녹색 형광 단백질), 퓨로마이신 (puromycin), 네오마이신 (Neomycin: Neo), 하이그로마이신 (hygromycin: Hyg), 히스티디놀 디하이드로게나제 (histidinol dehydrogenase gene: hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (guanine phosphosribosyltransferase: Gpt) 등이 있으며, 바람직하게는 GFP (녹색 형광 단백질) 및 퓨로마이신 마커를 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 항암 조성물 내 RNA 핵산 분자는 세포에 도입된 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에서 용어 "도입"은 형질감염 (transfection) 또는 형질도입 (transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염 (infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.

이러한 방법을 통해 본 발명의 RNA 핵산 분자가 도입된 세포는 RNA를 높은 수준으로 발현할 수 있게 되며, 이러한 세포를 암조직에 이식함으로써, 암의 침윤 및 전이를 억제시킬 수 있다. 그러므로, 본 발명의 RNA 핵산 분자가 도입된 세포를 포함하는 본 발명의 조성물은 암 치료를 위한 세포치료제로 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 RNA 핵산 분자를 포함하는 항암 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 RNA 핵산 분자 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 항암 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학적 제형은 구강 (oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical; 볼 및 혀 밑을 포함), 피하, 질 (vaginal) 또는 비경구 (parenteral; 근육내, 피하 및 정맥내를 포함) 투여에 적당한 것 또는 흡입 (inhalation) 또는 주입 (insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 경구 투여용 제형으로는, 예를 들어 정제, 트로키제, 로렌지, 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제로 제제화할 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제, 스테아르산 마스네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유를 포함할 수 있으며, 캡슐제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체를 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 유효성분으로 포함하는 비경구 투여용 제형으로는, 피하주사, 정맥주사 또는 근육 내 주사 등의 주사용 형태, 좌제 주입방식 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌약제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, RNA 핵산 분자의 바이러스성 또는 비바이러스성 기술에 의한 운반 또는 RNA를 발현하는 세포의 이식을 포함한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 암 조직에 국소 투여한다.

본 발명의 치료방법은 본 발명의 항암 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합 한 항암 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.

예를 들면, 증상에 따라 약간의 차이는 있지만 본 발명의 핵산 분자의 용량은, 정상적인 성인(체중 60 ㎏)에 대해서 경구투여하는 경우, 대략 0.1 ㎎ ~ 대략 100 ㎎/일, 바람직하게는 대략 1.0 ㎎~ 대략 50 ㎎/일, 더욱 바람직하게는 대략 1.0 ㎎ 대략 20 ㎎/일이다.

주사액의 형태로 정상적인 성인(체중 60 ㎏)에게 비경구적으로 투여하는 경우는, 환자, 표적 기관, 증상 및 투여 방법에 따라 약간의 차이는 있지만, 대략 0.01 ㎎ ~ 대략 30 ㎎/일, 바람직하게는 대략 0.1 ㎎/일~ 대략 20㎎/일, 보다 바람직하게는 대략 0.1 ㎎/일~ 대략 10 ㎎/일의 용량을 정맥내에 주사하는 것이 알맞다. 또한 다른 동물의 경우에서도, 체중 60 ㎏으로 환산한 양을 투여하는 것이 가능하다.

상기 물질은, 바람직하게는 경구 또는 주사 (정맥내 또는 피하)에 의해 투여되고, 대상으로 투여되는 엄밀한 양은 대상의 연령 및 성별, 치료되는 엄밀한 장해 및 그 중증도를 포함하는, 수많은 요인을 고려한 다음, 주치의의 책임 아래에서 결정된다고 생각된다. 또한, 투여 경로도 병상 및 그 중증도에 따라 결정될 수 있다.

또한, 경우에 따라, 본 발명의 항암 조성물과 함께 공지의 항암제를 병용 투여하여 항암 효과를 증대시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 암 치료 방법은 암이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

본 발명의 RNA 핵산 분자를 암세포에 처리하는 방법으로는 대개 RNA 핵산 분자를 세포에 도입시킬 수 있는 바이러스성 또는 비바이러스성 운반 기술을 이용할 수 있다. 바이러스 운반 메카니즘은 렌티바이러스 (lentivirus), 레트로바이러스 (retrovirus), 아데노바이러스 (adenovirus), 허피스바이러스 (herpes virus) 및 아비폭스바이러스 (avipox virus) 등을 포함하나, 이에만 제한되는 것은 아니다. 비바이러스성 운반 메카니즘은 지질 매개 트랜스펙션, 리포좀, 면역리포좀, 리포펙틴, 양이온성 표면 양친매물질 및 이의 조합물을 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 설명하다.

본 발명에서 본 발명자들은 siRNA를 사용한 무등의 C22B3 MAb 검출 및 caspase-3에 의한 무등 절단 가능성을 조사하였다. 본 발명의 결과는 C22B3 MAb에 의하여 인지된 무등은 MUDENG siRNA에 의해 넉-다운되고 또한 caspase-3에 의해 절단되지만, caspase-8 및 -9에 의해서는 절단되지 아니한다는 것을 나타내었다. 또한 MUDENG은 TRAIL, TNF-알파+CHX, 또는 sFas-L에 의한 사멸 수용체 활성화에 대해서 절단된다는 것을 알 수 있었다. 또한 본 발명자들은 caspase-3 절단된 MUDENG 절편들이 사멸 시그널에 대한 사멸 수용체의 흡수 (internalization)에서 중요한 역할을 할 가능성을 제기하였다.

본 발명자들은 54 Kda MUDENG 단백질의 N-말단 도메인 (1-40)을 인지하는 C22B3 MAb을 생성하였다.

caspase-3의 활성화 및 저해 관련한 본 발명은 명백하게 여하는 MUDENG 폴리펩타이드의 DAMDD-S 절단에 caspase-3가 관련된다; MUDENG의 caspase-3 절단이 각각 7.4 Kda and 46.5 Kda가 아니라 GFP의 N-말단에 융합된 31.8 Kda 및 22.1 Kda의 2 절편을 야기하기 때문에 DDKD-F는 아마 정확한 caspase-3에 의한 절단 부위가 아닐 수 있다 (도 3A).

또한 caspase-3 절단 부위는 인간 무등과 같이 마우스, 랫트에서도 보존된다. 세포 사멸의 MUDENG 조절은 세포-타입 특이적인 것으로 나타난다; 이소성 (ectopic) MUDENG 발현은 Jurkat T 세포 또는 Hela 세포 에서 부가적인 사멸신호 없이 세포사멸을 유도한다 (Lee, M.R. et al. (2008). Biochem Biophys Res Commun 370, 504-8), 반면에 U251-MG 인간 성상교세포종 (astroglioma) 세포에 대하여, MUDENG 발현은 세포 사멸을 유도하지 않는다.

상기의 구성에서 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 무등 (MUDENG) 단백질을 코딩하는 폴리뉴크레오타이드에 대한 안티센스 (antisense) 폴리뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA (small interfering RNA)는 무등의 발현을 넉다운하여서 무등 단백질의 기능과 관련된 예를 들어 발암성 등을 억제하여 항암제 등으로 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 MUDENG 단백질 발현에 대한 항-MUDENG (C22B3) 항체의 에피토프 맵핑을 나타낸다. HCT116 세포 (7.5 x 105)을 pEGFP-C1 벡터 또는 pEGFP-C1 MUDENG 결손 돌연변이체 컨스트럭트 (1-490, 41-490, 81-490, 121-490)로 24시간 동안 트랜지언트하게 트랜스팩션하고, 라이시스하고, SDS-PAGE를 수행하였다. 그 후 C22B3 MAb를 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다. 그 블럿을 스트리핑하고, GFP 단백질에 대해서 재프로브하였다 (하단 패널).
도 2는 MUDENG 단백질의 Anti-hMUDENG 단클론 항체 (C22B3) 인지에 관한 것이다. 도 2a는 이소성 MUDENG 발현 세포에서 siRNA 매개된 MUDENG 넉다운을 나타낸다. 무등을 가지거나 가지지 아니하는 야생형 U251-MG 세포 또는 pEGFP-C1을 안정하게 발현하는 U251-MG를 각각 대조군 siRNA (100 nM) 또는 무등 타겟팅 MUDENG (100 nM)를 사용하여 24시간 동안 트랜스팩션시킨 후, 신선한 배지로 교환한 후 추가로 더 배양하였다. 세포 파쇄액을 얻은 후, SDS-PAGE를 수행하고, 그 다음에 C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다. 그 블럿을 스트리핑하고 GFP 및 액틴 단백질에 대해 재프로브하였다 (하단 패널).
도 2b는 여러 세포에서 siRNA 매개된 MUDENG 넉다운을 보여주는 사진이다. C6, HeLa 및 HCT116 세포를 각각 대조군 siRNA (100 nM) 또는 무등 타겟팅 MUDENG (100 nM)를 사용하여 24시간 동안 트랜스팩션시킨 후, 신선한 배지로 교환한 후 추가로 더 24시간 더 배양하였다. 세포 파쇄액을 얻은 후, SDS-PAGE를 수행하고, 그 다음에 C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다. 그 블럿을 스트리핑하고 액틴 단백질에 대해 재프로브하였다 (하단 패널).
도 2c는 내생적인 (endogenous) MUDENG 단백질의 동정에 관한 것이다. U251-MG, C6, 및 일차 랫트 성상세포 (astrocytes)로부터 유래한 세포 파쇄액을 제조하고, SDS-PAGE를 수행한 후, C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.
도 3은 무등 단백질이 인비트로에서 caspase-3에 의해 절단되지만, caspase 8 및 9에 의해서 절단되지는 아니한다는 것을 보여주는 그림이다.
A는 MUDENG 단백질의 개략적인 구조와 가설적인 caspase-3 절단 부위를 나타낸다. B는 재조합 MUDENG 단백질을 각각 18시간 동안 캐스퍼레이즈 분석 버퍼에서 재조합 활성 caspase-3, -8, -9 (0.5 U/tube)로 배양하고, C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의하여 분석하였다. C는 재조합 MUDENG 단백질을 caspase 저해제 z-VAD-fmk (2.5μM)를 처리 또는 처리하지 아니하고 재조합 활성 caspase-3 (0.5 U/tube)로 배양하였다. 화살표는 전장 MUDENG을 나타내고, 화살표헤드는 caspase-3에 의해 생성된 MUDENG 절편을 나타낸다.
도 4는 MUDENG 단백질이 TRAIL 자극에 대해 절단되는 것을 나타내는 그림이다. 도 4a는 HCT116 세포를 pEGFP-N1 또는 pEGFP-N1-MUDENG로 24시간 동안 트랜지언트하게 트랜스팩션한 후 신선한 배지로 교환한 후 추가로 24시간 더 배양하였다. 그 후 그 세포들을 표시된 시간 (0-6 h) 동안 재조합 TRAIL (200 ng/ml)로 처리하였다. 세포를 파쇄한 후, SDS-PAGE를 수행하고, 그 다음에 C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다. 그 블럿을 스트리핑하고 GFP 및 액틴 단백질에 대해 재프로브하였다 (하단 패널). 화살표는 전장 MUDENG을 나타내고, 화살표 헤드는 caspase-3에 의해 생성된 MUDENG 절편을 나타낸다.
도 4b는 트랜스팩션된 HCT116 세포를 caspase 저해제 z-VAD-fmk (2.5 μM) 존재 또는 부존재 상태에서 재조합 TRAIL (200 ng/ml)로 처리한 후, C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다. 그 블럿을 스트리핑하고 GFP, caspase-3 및 액틴 단백질에 대해 재프로브하였다 (하단 패널).
도 5는 MUDENG이 TRAIL, TNF-알파 또는 sFas-L에 의한 사멸 수용체 활성화에 대해 절단된다는 것을 보여주는 그림이다. pEGFP-N1-MUDENG에 의해 트랜스팩션된 HCT116 세포를 재조합 TRAIL (200 ng/ml), TNF-알파 plus CHX (50 ng/ml + 10 mg/ml), 또는 sFAS-L (100 ng/ml)로 표시된 시간 동안 (0-24 h)처리하였다. 세포 파쇄액을 얻은 후, C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다. 그 블럿을 스트리핑하고 GFP 및 액틴 단백질에 대해 재프로브하였다 (하단 패널). 전장 MUDENG-GFP는 화살표로 절단된 형태는 화살표헤드로 표시하였다.

이하 비한정적인 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시 예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시 예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

본 발명에 사용된 세포 등은 다음과 같다.

U251-MG 인간 성상교세포종 (astroglioma) 세포, C6 랫트 성상교세포종 (astrocytoma) 세포, 및 HeLa 세포 보충물을 가지고 5-10% 열 불활성화된 (HI) FBS를 포함하는 DMEM에서 성장하였다. HCT116 세포를 보충물을 가지고 10% 열 불활성화된(HI) FBS를 포함하는 McCoy's 5A 배지에서 배양하였다. 일차 신경교 (glial) 세포 배양은 전에 기재된 것과 같이 신생 랫트 대뇌 (neonatal rat cerebra)로부터 확립하였다 (Lee, S.J., 등,(2000). J Immunol 165, 4658-66). 세포를 2 mM glutamine, 0.1 mM 비필수 아미노산 혼합물,0.1% gentamicin, 2.5 ㎍/ml amphotericin B 및 6g/L의 최종농도의 포도당으로 공급된10% HI FBS를 포함하는 EMEM에서 배양하였다. 1차 배양 2 주 후, 희소돌기세포 (oligodendrocytes) 및 미세아교세포 (microglia)를 기계적인 디스로즈먼트 (dislodgment)로 제거하였다. 성상세포를 트립신처리하여 수집하고 면역형광에 의하여 순도를 모니터하였다. 성상세포 배양은 성상세포에 독특한 세포내 Ag, glial fibrillary acidicprotein (GFAP)에 대하여 통상적으로 >95% 포지티브이었다 (Bignami, A., 등. (1972). Brain Res 43, 429-35).

재조합 인간(rh) TRAIL, TNF-알파 및 sFas-L는 Peprotech (Rocky Hill, NJ)로부터 구입하였다. 마우스 항-Green Fluorescent Protein (GFP) Ab 및 염소 항-actin Ab는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)로부터 구입하였다. 토끼 항-GFAP은 Abcam (Cambridge science park, Cambridge, UK)로부터 구입하였다. zVAD-fmk, caspase-3, caspase-8, 및 caspase-9은 BioVision (Mountain View, CA)로부터 구입하였다. Cycloheximide는 Calbiochem (La Jolla, CA)으로부터 구입하였다. Horseradish peroxidase (HRP)-결합된 염소 항-마우스 IgG들은 Jackson ImmunoResearch Lab (West Groove, PA)으로부터 구입하였다.

인간 항-무등 단일클론 항체의 생산에 대해서는 본 발명자의 기 출원된 발명인 공개특허 10-2009-0108937에 잘 기재되어 있으며 본 발명은 상기 공개된 발명을 참고하여 본 발명의 단일클론 항체를 제조하였다.

요약하면, rhMUDENG 단백질을 pET23dw-His-MUDENG 벡터를 사용하여 E. coli BL21 (DE3)에서 발현한 후, His-bind resin (Novagen, San Diago, CA)을 사용하여 정제하였다 (Lee, M.R. et al. (2008). Biochem Biophys Res Commun 370, 504-8.). 그 정제된 rhMUDENG 단백질을 단클론 항체를 제조하기 위하여 사용하였다; 면역화, 세포 융합, 하이브리도마 클론의 선택, MAb의 생성 및 정제는 표준 방법에 따라 수행하였다 (Eshhar, Z. (1985) Monoclonal antibody strategy and techniques. In Hybridoma Technology in the Biosciences and Medicine ((ed), T.A.S., ed.^eds), pp. 3-41. Plenum Press, New York.).

실시예 1: MUDENG의 cDNA 클로닝과 안정한 세포주의 생성

pEGFP-C1-hMUDENG 및 pEGFP-N1-hMUDENG의 생성은 전에 기재한 것에 따라 수행하였다 (Lee, M.R. et al. (2008). Biochem Biophys Res Commun 370, 504-8). GFP-태그된 hMUDENG 결손 돌연변이체 (pEGFP-C1-hMUDENG 41-490 잔기, 81-490 잔기, 121-490 잔기)를 PCR에 의해 생성하였다. 모든 cDNA 컨스트럭트들을 DNA 시퀀싱에 의하여 확인하고, Lipofectamine2000^◎(Invitrogen, Gaithersburg, MD)을 사용한 트랜지언트 트랜스팩션에 의하여 HCT116 세포에서 발현하였다. pEGFP-C1 및 pEGFP-C1-MUDENG를 안정하게 발현하는 U251-MG 세포를 Lipofectamine 2000^◎을 사용한 트랜스팩션에 의해서 생성하고 200 ㎍/ml G418 sulfate (Invitrogen, Gaithersburg, MD)를 사용하여 선별하였다.

실시예 2:웨스턴 블럿

그 세포를 세척하고 스크래핑에 의해서 수확하였다. 그 후, 세포를 1 mM PMSF, 2 mg/ml aprotinin, 1 mg/ml leupeptin, 1 mg/ml pepstatin A, 2 mM sodium fluoride, 및; 1 mM sodium orthovanadate로 보충된 라이시스 버퍼 (M-PER^◎mammalian protein extraction reagent (Pierce, Rockfold, IL))에서 라이시스하였다. 수용성 라이세이트 (30 μg)를 SDS-PAGE를 수행하고, 나이트로셀루로스 막으로 트랜스퍼하였다. 그 후 그 막을 C22B3 하이브리도마 배양 상등액 또는 정제된 C22B3 MAb로 배양하고, HRP-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgGs Ab로 배양하고 enhanced chemoluminescence (ECL)로 디벨로프하였다.

실시예 3: Small interfering RNA 트랜스팩션

인간 MUDENG (siRNA #1 센스 가닥: 5'CACUUGGGCUCAUUUUAGA-3' (서열번호 3) siRNA #2 센스 가닥: GUAGAUAAUGUGCAAGAUA (서열번호 4); siRNA #3 센스 가닥: 5'GAGCAAGUUAUGUGCCUGU-3' (서열번호 5), 타겟팅 및 랫트 MUDENG (siRNA #1 센스 가닥: 5'CAGGAUAUAGCAGACACAU-3' (서열번호 6) siRNA #2 센스 가닥: 5'UGAUCUGUGAUUACGUAGU-3' (서열번호 7) 티겟팅하는 small interfering RNA (siRNA) 이중가닥을 Bioneer (Daejeon, Korea)로부터 구입하였다. 단 상기 무등 siRNA 제조 시에 3'말단에 'dTdT'를 부가하여 제조하였다. 트랜스팩션을 위해서 세포를 24웰 플레이트에서 5 x 10⁴ 세포의 밀도로 시드하였다. 다음 날에, 50 nM의 siRNA duplexes를 Lipofectamine 2000 Reagent를 사용하여 트랜스팩션하였다. 배지를 트랜스팩션 후에 24시간에 교환하고 24시간 동안 더 배양하였다. 세포 라이세이트를 제조하고, 타겟의 사일런싱을 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다.

실시예 4: In-vitro 절단 분석

상기 rhMUDENG 단백질을 활성 caspase-3, caspase-8, 및 caspase-9를 사용한 인 비트로 절단 분석에 사용하였다. 2백 나노그램의 rhMUDENG는 50 mM HEPES, pH 7.2, 50 mM NaCl, 0.1% Triton X-100, 10 mM EDTA, 5% Glycerol, 및 10 mM DTT를 포함하는 최종 부피 20 μl의 카스파제 분석 버퍼에서 z-VAD-fmk (2.5 μM)를 가지거나 또는 가지지 않은 각 재조합 카스파제 (0.5 Unit/ml)로 18시간 동안 배양하였다. 반응은 샘플 버퍼에서 가열하여 중지하고 10% SDS-PAGE를 수행하였다. rhMUDENG 단백질의 절단은 C22B3 MAb로 웨스턴 블럿에 의하여 분석하였다.

상기 실시예의 결과는 다음과 같다.

선택된 하이브리도마로부터 생성된 새로운 C22B3 MAb의 인지에 해당하는 에피토프 맵핑을 조사하기 위하여, pEGFP-C1-wild type (wt) hMUDENG (1-490) 및 그것의 결손 돌연변이체 (41-490, 81-490, 121-490)들을 트랜지언트 트랜스팩션에 의하여 HCT116 세포에서 발현하고 웨스턴 블럿팅에 의하여 분석하였다. GFP-wt hMUDENG (1-490) 및 그것의 결손 돌연변이체 융합 단백질들을 C22B3 MAb 또는 항-GFP Ab로 프로브하였다 (도 1A). 그 결과는 단지 GFP-wt hMUDENG (1-490)만이 C22B3 MAb에 의해서 인지되었으나(도 1A; lane 2), MUDENG (41-490), MUDENG (81-490), 또는 MUDENG (121-490)은 인지되지 않았고 (도 1A 상단; lane 3-5), 그것은 C22B3 MAb에 의해서 인지된 실질적인 에피토프는 1-40 잔기의 hMUDENG 폴리펩티드 사이에 걸쳐있다는 것을 암시한다. 해당 결과는 항-GFP Ab로 재프로브하였을 때 얻었다(도 1A 하단; lane 2-5).

MUDENG 유전자 발현이 siRNA 트랜스팩션에 의하여 영향을 받는지 조사하기 위하여, wt U251-MG 세포 및 wt hMUDENG (1-490)를 가지거나 가지지 않은 GFP tagged-pEGFP-C1를 안정하게 발현하는 U251-MG 세포를 대조군 siRNA 또는 MUDENG 특이적인 siRNA로 트랜스팩션하였다. 도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, GFP-MUDENG (1-490)은 C22B3 MAb를 프로브할 때 대조군 siRNA (상단; lane 7-8)와 비교할 때 MUDENG siRNA (상단; lane 9)에 의해서 다운-레귤레이션되었다. 더 구별되는 차이는 항-GFP Ab를 사용하였을 때 얻었다 (도 2a 하단; lane7-9). 흥미롭게, 내생적인 MUDENG 단백질일 밴드도 검출되고 MUDENG 특이적인 siRNA에 의해 다운-레귤레이션되었다 (도 2a 상단; lane 3, 6, 9). 추가적인 실험을 C6, HeLa, 또는 HCT116 세포에서 MUDENG 특이적인 siRNA로 수행하였다. 생각한 것과 같이, U251-MG 세포에서 관찰된 것과 같이 내생적인 MUDENG은 검출되고, 다운-레귤레이션되었다 (도 2b; lane 3, 6, 9). 다음, 본 발명자들은 C22B3 MAb가 내생적인 MUDENG 단백질을 검출할 수 있는지를 알기를 원하였다. 따라서 본 발명자들은 U251-MG, C6, 또는 랫트 성상세포로 웨스턴 블럿팅에 의해서 C22B3 MAb를 조사하였다. 본 발명자들은 테스트된 세포 모두로부터 유래한 내생적인 MUDENG 단백질이 각각 C22B3 MAb에 의해 인지된 것을 관찰할 수 있었다 (도 2c; lane1-3). 이 결과는 C22B3 MAb가 인간 및 랫트 세포 모두로부터 유래한 내생적인 MUDENG을 인지하는 것을 나타낸다.

Caspase-3는 에팝토시스의 유도 동안 DXXD 서열에서 많은 구조 및 신호 단백질을 단백질분해한다 (Cryns, V. and Yuan, J. (1998). Genes Dev 12, 1551-70;Cohen, G.M. (1997). Biochem J 326 ( Pt 1), 1-16) 카스파제-3에 의해 선호된 두 DXXD 컨센서스 부위는 MUDENG 폴리펩타이드에서; DDKD-F 및 DAMDD-S로 동정되었다 (도 3A). 이것들이 caspase-3에 대한 특이적인 절단 부위인지를 조사하기 위해서, 본 발명자들은 인비트로에서 rhMUDENG에 대하여 카스파제-3, -8 및 -9를 처리한 후 C22B3 MAb로 웨스턴 블럿팅에 의해서 분석하였다. 도 3B에서 알 수 있는 바와 같이, rhMUDENG는 caspase-3에 의해 절단되었지만 (lane 2), caspase-8 및 -9에 의해서 절단되지 않았다 (lane 3, 4). 특이성을 분석하기 위해서, caspase 저해제 z-VAD-fmk를 각 튜브에 전 처리한 후 추가적인 반응을 수행하였다. 사실, rhMUDENG은 저해제의 특이성을 나타내면서 카스파제 저해에 대해 회복하였다 (도 3C; lane 3). MUDENG이 사멸 수용체 활성화 (death receptor activation)에 대하여 절단될 수 있는지 더 테스트하기 위해서, HCT116 세포를 GTP의 N-말단과 융합된 wt MUDENG (1-490) 컨스트럭트로 또는 없이 트랜스팩션하였다. 다음에 TRAIL을 지시된 시간 동안 (0-6h) 처리하고 웨스턴 블럿에 의해서 분석하였다. 도 4a에서 나타낸 바와 같이, C22B3 MAb에 의해서 검출된 일부 절단된 MUDENG 융합단백질(1-289)은 TRAIL 처리 3시간만에 증가되었고 6 시간에 피크였다 (상단; lane 5-6). 또한 GTP의 N-말단과 융합된 MUDENG 절편들 (290-490)은 3시간과 6시간에 GFP Ab에 의해서 검출되고 증가되었다 ( 하단; lane 5-6). 또한 caspase 저해제의 특이성을 테스트하기 위해서, 세포를 6시간 동안 200 ng/ml TRAIL 자극 전에 caspase 저해제 2.5 μM z-VAD-fmk로 전처리하였다. 도 4B에 나타낸 바와 같이, MUDENG 절단(1-289)은 z-VAD-fmk에 의해 저해되었다 (상단; lane 6). 절단된 MUDENG (290-490)-GFP의 밴드는 또한 GFP Ab에 의해서도 검출되었다 (중앙; lane 5).

Fas/CD95, TNF-receptor 1/2, 또는 death receptor 4/5를 포함하는 사멸 수용체는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼 훼밀리의 멤버이고, TRAIL, Fas-L, 또는 TNF-알파를 포함하는 그들의 코그네이트 리간드에 의하여 활성화되었다 (Guicciardi, M.E. and Gores, G.J. (2009).Faseb J 23, 1625-37). 본 발명자들은 MUDENG이 TRAIL, sFas-L, TNF-알파 자극에 대해 절단되는지를 아는 것이 궁금하였다. 이 질문에 답하기 위하여, HCT116 세포를 24시간 동안 pEGFP-N1-MUDENG으로 일시적으로 트랜스팩션하고 24시간 더 배양하고 그 후 재조합 TRAIL (200 ng/ml, 0-6 h), TNF-a plus CHX (50 ng/ml + 10 mg/ml, 0-6 h), 또는 sFAS-L (100 ng/ml, 0-24 h)로 처리한 후 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 사멸 수용체 자극에 대한 MUDENG (1-490)-GFP의 절단이 관찰되었고, 절단된 MUDENG (1-490)-GFP의 수준은 증가하고, 처리 후 6 시간에 피크가 되었다 (상단; lane 3, 5, 6). 이들 결과들은 caspase-3에 의한 MUDENG 절단은 사멸 수용체 활성화를 통하여 일어난다는 것을 나타낸다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> An antisense or small interfering RNA and An application thereof <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 490 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln Arg Ala Val Trp Leu Ile Ser His Glu Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Cys Gly Thr Val Arg Phe Ser Arg Arg Tyr Pro Thr Val Glu Lys 20 25 30 Arg Ala Arg Val Phe Asn Gly Ala Ser Tyr Val Pro Val Pro Glu Asp 35 40 45 Gly Pro Phe Leu Lys Ala Leu Leu Phe Glu Leu Arg Leu Leu Asp Asp 50 55 60 Asp Lys Asp Phe Val Glu Ser Arg Asp Ser Cys Ser Arg Ile Asn Lys 65 70 75 80 Thr Ser Ile Tyr Gly Leu Leu Ile Gly Gly Glu Glu Leu Trp Pro Val 85 90 95 Val Ala Phe Leu Lys Asn Asp Met Ile Tyr Ala Cys Val Pro Leu Val 100 105 110 Glu Gln Thr Leu Ser Pro Arg Pro Pro Leu Ile Ser Val Ser Gly Val 115 120 125 Ser Gln Gly Phe Glu Phe Leu Phe Gly Ile Gln Asp Phe Leu Tyr Ser 130 135 140 Gly Gln Lys Asn Asp Ser Glu Leu Asn Thr Lys Leu Ser Gln Leu Pro 145 150 155 160 Asp Leu Leu Leu Gln Ala Cys Pro Phe Gly Thr Leu Leu Asp Ala Asn 165 170 175 Leu Gln Asn Ser Leu Asp Asn Thr Asn Phe Ala Ser Val Thr Gln Pro 180 185 190 Gln Lys Gln Pro Ala Trp Lys Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Lys Pro Gln 195 200 205 Val Ser Ile Ser Ile Thr Glu Lys Val Lys Ser Met Gln Tyr Asp Lys 210 215 220 Gln Gly Ile Ala Asp Thr Trp Gln Val Val Gly Thr Val Thr Cys Lys 225 230 235 240 Cys Asp Leu Glu Gly Ile Met Pro Asn Val Thr Ile Ser Leu Ser Leu 245 250 255 Pro Thr Asn Gly Ser Pro Leu Gln Asp Ile Leu Val His Pro Cys Val 260 265 270 Thr Ser Leu Asp Ser Ala Ile Leu Thr Ser Ser Ser Ile Asp Ala Met 275 280 285 Asp Asp Ser Ala Phe Ser Gly Pro Tyr Lys Phe Pro Phe Thr Pro Pro 290 295 300 Leu Glu Ser Phe Asn Leu Cys Phe Tyr Thr Ser Gln Val Pro Val Pro 305 310 315 320 Pro Ile Leu Gly Phe Tyr Gln Met Lys Glu Glu Glu Val Gln Leu Arg 325 330 335 Ile Thr Ile Asn Leu Lys Leu His Glu Ser Val Lys Asn Asn Phe Glu 340 345 350 Phe Cys Glu Ala His Ile Pro Phe Tyr Asn Arg Gly Pro Ile Thr His 355 360 365 Leu Glu Tyr Lys Thr Ser Phe Gly Gln Leu Glu Val Phe Arg Glu Lys 370 375 380 Ser Leu Leu Ile Trp Ile Ile Gly Gln Lys Phe Pro Lys Ser Met Glu 385 390 395 400 Ile Ser Leu Ser Gly Thr Val Thr Phe Gly Ala Lys Ser His Glu Lys 405 410 415 Gln Pro Phe Asp Pro Ile Cys Thr Gly Glu Thr Ala Tyr Leu Lys Leu 420 425 430 His Phe Arg Ile Leu Asp Tyr Thr Leu Thr Gly Cys Tyr Ala Asp Gln 435 440 445 His Ser Val Gln Val Phe Ala Ser Gly Lys Pro Lys Ile Ser Ala His 450 455 460 Arg Lys Leu Ile Ser Ser Asp Tyr Tyr Ile Trp Asn Ser Lys Ala Pro 465 470 475 480 Ala Pro Val Thr Tyr Gly Ser Leu Leu Leu 485 490 <210> 2 <211> 3110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tacgccggaa gtggaactgc gcgcgccagg gaggttgtcg ggaggggccg gcgaataaaa 60 cgagcggcga aagaaccgaa aaaaggctcg acgctaccgt gtatgaggaa ctttgatcct 120 tgcgggccac cattccggaa gtagaattta gaggaagaaa ataccggagt tgcagggtat 180 aggtaaattt ctcaaggtta taggttgggg ttcttagaac tttttgtggt gtgtgttggc 240 ctagagcgac tcagaagcgt tagtgacttc acctaaaaaa gctaacctct ctgctgagcg 300 cgaccggtat gcggcgcagg atgagcctca gggcttctgt taagagtctg tctgagaaag 360 ccggtctgcg ctgttcctcg gtggcgacct taattatgag atgagctaat gctttactga 420 cttaaccatg gcgcagcggg cagtgtggct cataagccac gaaccgggaa ctccactttg 480 tggcaccgtg agattctcca gacggtatcc aactgttgaa aaacgagcca gagtcttcaa 540 tggagcaagt tatgtgcctg ttcctgaaga tggtcccttt cttaaagcac tgctctttga 600 acttagatta ttggatgatg ataaagactt cgttgagagt cgtgatagct gttcacgcat 660 caataaaaca tccatttatg gactcctgat aggaggtgaa gaactctggc cagttgttgc 720 ttttctgaag aatgacatga tatatgcttg tgttccacta gttgaacaaa ctctgtcccc 780 tcgtccgcca ctaattagtg tcagtggagt ttcacaaggc tttgaatttc tttttgggat 840 acaggatttt ctttattcag gtcaaaaaaa tgactctgag ctgaatacaa aattgagcca 900 gttgcctgac ttgcttctgc aggcttgtcc atttggtact ttattagatg ccaacttaca 960 gaattcatta gataatacca attttgcatc tgtgactcag ccacagaaac agccagcttg 1020 gaaaactggg acgtacaaag gaaaaccaca agtttctatt tctatcactg aaaaggtaaa 1080 atccatgcaa tatgataaac agggtatagc agatacatgg caagttgttg gaacagtgac 1140 ttgcaagtgt gatttggaag gaatcatgcc aaatgttacc atcagcttga gtctccccac 1200 caatggatct ccacttcagg atattctagt tcacccttgt gtaacttctc ttgactctgc 1260 aattctgact tctagtagta ttgatgcaat ggatgactct gcatttagtg ggccttacaa 1320 atttccattc actccacctt tagagtcatt caacttatgc ttctacactt cccaggtccc 1380 tgtcccacca attttgggtt tttatcaaat gaaggaggaa gaagtacaac taagaataac 1440 cattaattta aaacttcatg aaagtgtgaa aaataatttt gaattctgtg aagcccatat 1500 acctttttac aatagaggtc caattacaca tttggaatac aaaactagtt ttggccagct 1560 tgaagtattt cgagagaaaa gcttattgat ctggattatt ggccagaagt tcccaaaatc 1620 aatggaaatt agtctttctg gaactgtaac ttttggagcc aagagccatg agaagcagcc 1680 atttgaccca atttgtactg gagaaacagc atatttaaag cttcatttta ggatcttaga 1740 ttacacactt actggatgtt atgcagatca gcattcagtt caagtttttg catcaggaaa 1800 accaaaaata agtgcacacc ggaaactaat ttcttctgat tattacatct ggaattctaa 1860 agcccctgct ccagtaacat atggatcatt attattgtaa tagtctcatg tttaaatggg 1920 attatataat gataacagtt taaagaaaat cataatctta tatttttaat gtggatgcat 1980 ataacctgtg agtgaaaaat cactgaatga tttaattgta aaagtagtct tatgtggtgt 2040 ttgtagtctg atagagcttg aaaggacatt ttaaaagcta atgtctccaa ttttgttaac 2100 cttcgatttt atgccagtat aattcagaac atagaaaagt aatgattcac ttgggctcat 2160 tttagactgg tcctgggtca ccctgccaca cttgtttcct agtgtttctg tggcagacat 2220 tgctaatcaa ttacagccct tttctgtact gagccttgga taaagggtca ggctcctttt 2280 tagttcagag attcaggcag ccactcccag tgggttgtag ataatgtgca agataaaaac 2340 tattttctct tccaaatcta agtactaagc tcctagtata aggtgttgtt acagaatacc 2400 agagaccatg ttagagacaa ctacatctct tcaaaaaaca gccaacagag acaaaggaaa 2460 agtgtttaaa tagtaagctg ttcttcttaa tcagaactat cctattgact aataaataat 2520 ctgcataatt ctacttaagg tgtgtaatct ctgttctaga gttagttttt aagtaagctt 2580 gttaatctgc cactttgaca ttttgcttag gatgtcagta gccatattaa gatgtgtaga 2640 ataccttcag aagatgatca tagtgttttg taatcattta atgtctgcag ccaaattttt 2700 aaaggtaatt tagacctaat actgctcttg ctgtgtctta ttaagttaaa attaatgaat 2760 gaattctggt aaaaattcaa aaggcactct gtgagtagag agtatcattt aagcttattt 2820 tagtcacatg tagtatatat ctccttaaag ctgtcactct cactttctta ccattctctt 2880 gatttcttca gaaaccatct agtcatcatc tttatactct acctgcttct gcaattatat 2940 atcatattat gttttcagag cagttcattg tcaagttgga ctttaagtga ccattcaaga 3000 aaagatgaaa tctcacgaac ctcaaaactt cattcatgtc tttttacaaa tgagaaaaaa 3060 aaatgcatta aagattaata ctcaatttga ttataaaaaa aaaaaaaaaa 3110 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 3 cacuugggcu cauuuuaga 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 4 guagauaaug ugcaagaua 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 5 gagcaaguua ugugccugu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 6 caggauauag cagacacau 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 7 ugaucuguga uuacguagu 19

Claims

서열번호 1에 기재된 무등(MUDENG) 단백질을 코딩하는 폴리뉴크레오타이드에 대한 안티센스(antisense) 폴리뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA).
제 1항에 있어서, 상기 폴리뉴크레오타이드는 서열번호 2에 기재된 핵산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 앤티센스 유전자.
제 1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴크레오타이드 또는 작은 간섭 RNA의 센스 가닥은 서열번호 3 내지 서열번호 7에 기재된 뉴크레오타이드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 분자인 안티센스(antisense) 폴리뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA(small interfering RNA).
센스 가닥이 서열번호: 3 내지 서열번호:7로 구성된 군으로부터 선택된 표적 서열에 상응하는 리보뉴클레오티드 서열이고, 안티센스 가닥이 상기 센스 가닥에 상보적이며, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 서로 혼성화하여 상기 이중 가닥 분자(double-stranded molecule)를 형성하며, 상기 이중 가닥 분자를 무등(MUDENG) 유전자를 발현하는 세포에 도입할 때 상기 유전자의 발현이 억제되는, 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 분자.
유효성분으로서 약학적으로 유효한 양의
(a) 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드;
(b) 서열번호: 1의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호: 1의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드와 동등한 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 폴리뉴클레오티드 또는 작은 간섭 RNA, 및 약학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 포함하는 암 치료용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 암은 뇌암, 자궁경부암, 유방암, 방광암, 간암, 전립선암 및 신경아세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 작은 간섭 RNA는 서열번호: 3 내지 7로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 조성물.