KR20110089306A - 혈전성 혈소판감소성 자반증의 모델 및 그의 이용 방법 - Google Patents

혈전성 혈소판감소성 자반증의 모델 및 그의 이용 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 응고 질환의 치료에서 다양한 물질을 시험하기 위한 동물 모델의 개발에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)의 마우스 모델을 개발하기 위해 TTP-유사 증상을 유도하기 위해 다양한 마우스 주에서 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor; VWF)의 초고분자량 다량체를 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 동물 질병 모델을 생성하는 방법 및 TTP의 치료에 효과적인 생물학적 활성 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

혈전성 혈소판감소성 자반증의 모델 및 그의 이용 방법{MODELS OF THROMBOTIC THROMBOCYTOPENIC PURPURA AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원
본원은 각각 그 전문이 본원에 참고로 포함되는, 2008년 10월 27일 출원된 미국 특허 가출원 61/108,781 및 2009년 3월 2일 출원된 미국 특허 가출원 61/156,768을 기초로 한 우선권을 주장한다.
본 발명은 일반적으로 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP) 마우스 모델의 개발에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 TTP의 마우스 모델의 개발을 위해 TTP-유사 증상을 유도하기 위해 다양한 마우스 주에서 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor; VWF)의 초고분자량 다량체를 사용하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 동물 질병 모델을 생성하는 방법 및 TTP의 치료에 효과적인 생물학적 활성 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다.
혈전성 혈소판감소성 자반증 ("TTP" 또는 모쉬코위츠 (Moschcowitz) 병)은 광범한 미시적인 혈전 (clot)을 신체 전체에서 작은 혈관 내에 형성시키는, 혈액-응고 시스템의 중증 희귀 질환이다. 대부분의 TTP 사례는 효소 ADAMTS13 (트롬보스폰딘 타입 1 도메인 13을 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테아제)의 결핍 또는 억제로 인해 야기된다. ADAMTS13은 폰 빌레브란트 인자 (VWF)의 큰 다량체를 절단하는 것을 담당하는 단백질 분해 효소이고, 또한 VWF 절단 프로테아제로서 알려져 있다. 따라서, ADAMTS13의 생물학적 기능 및 VWF의 초고분자량 다량체의 존재 및 TTP 또는 TTP-유사 임상 증상 사이에 특정 관계가 존재한다. TTP는 또한 암, 화학요법, HIV 감염, 호르몬 대체 요법 및 에스트로겐, 및 많은 일반적으로 사용되는 의약 (티클로피딘, 클로피도그렐 및 시클로스포린 A 포함)과 관련될 수 있다.
낮은 수준의 ADAMTS13은 혈액 내의 응고 물질 (혈소판)을 응괴시킨다. 혈소판들이 함께 응괴할 때, 혈류 내에 이용가능한 혈소판이 보다 적어진다. 상기 응괴 또는 응집은 피부 아래에 출혈 및 자반증으로 불리는 보라색 반점을 생성시킬 수 있다. 이는 또한 미시적인 혈소판 혈괴를 통과할 때 전단 응력 (shear stress)을 받으므로 적혈구를 부순다 (용혈을 겪는다). 따라서, 적혈구는 조기에 파괴된다. 감소된 혈류 및 세포성 손상이 말단 장기 손상을 일으킨다. 현재의 치료법은 ADAMTS13에 대한 순환 항체를 감소시키고 ADAMTS13의 혈액 수준을 보충하기 위한 지지 및 혈장 분리 교환술에 기초한다.
단백질 치료제에 대한 항체의 발생은 TTP 및 혈우병과 같은 질환의 치료를 위해 생물약품이 사용될 때 끊임없이 발생하는 문제이다. 이들 항체는 종종 단백질 치료제의 활성을 억제하여, 치료의 효능을 감소시키거나 치료 수준을 유지하기 위한 약물의 용량 증가를 필요로 한다. 이들 혈액 질환은 종종 평생 지속하는 병태이므로, 치료적 혈액 응고 인자에 특이적인 항체의 출현은 특히 치료를 받는 환자에게 시련을 주고 이들 환자를 치료하는 의사에게 해결책을 요구한다.
전임상 모델이 약물 효능의 평가 및 선도 화합물의 최적화에서 하는 역할은 제약 회사에서 필수적인 것이다. 인간 질병의 강건한 의존가능한 동물 모델이 없다면, 보다 우수한 분자의 설계는 힘든 과제가 된다. 이러한 목적을 위해, 트랜스제닉 (transgenic) 및 낙아웃 (knockout) 마우스 및 래트 모델이 매우 유망하지만, 여전히 제약업계에서 충분히 이용되지 않는다. 상기 모델의 제한된 사용은 아마도 부분적으로 현재의 많은 트랜스제닉 및 낙아웃 모델이 전임상 스크리닝 모델의 필수적인 품질; 타당도, 신뢰도 및 효용도를 나타내지 않기 때문이다.
TTP 및 치료법에 대한 가능성을 보다 잘 이해하기 위한 노력에서, 질환에 대한 동물 모델이 탐색되었다. 초기 시도는 예를 들어, 뱀독 인자 보트로세틴 또는 2-부톡시에탄올 (BE)를 사용하는 화학적 유도에 의존된 TTP 모델을 재창조하는 것이다. 보트로세틴은 VWF에 결합하여 이를 다량체화하여, 혈소판 응집을 일으킴으로써 작용한다. 상기 인자로 처리된 동물은 일시적인 혈소판감소증을 보이지만, 모든 증상이 TTP와 연관되지는 않는다 ([Sanders et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 15:793-800, 2005]; [Brinkhous et al., Mayo Clin. Proc. 66:733-42, 1991]). 이와 유사하게, BE-처리된 동물은 용혈 및 혈전증을 포함한 TTP의 몇몇 증상을 발병하였다 (Ezov et al., Cardiovasc. Toxicol. 2:181-93, 2002). 그러나, 상기 모델은 TTP의 지표 증상을 모두 나타내지 않는다. 후기 시도는 ADAMTS13 결핍 마우스의 생성을 포함한다. 그러나, 대부분의 유전자 배경에서, 이 표현형은 최소이고, 이것은 ADAMTS13 결핍증이 TTP를 일으키기에 충분하지 않음을 나타낸다 ([Banno et al., Blood 107:3161-66, 2006]; [Desch et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 27:1901-08, 2007]).
현재, TTP의 치료를 위한 치료법을 시험하기 위해 타당한 동물 모델은 이용가능하지 않다. 치료법은 제한되고, 혈장 처리, 혈장 교환 및 비장절제술과 같은 절차를 포함한다. 따라서, 그러한 모델을 개발하고 인간 환자에 대해 연구하지 않으면서 생체 내에서 다양한 TTP 치료법의 효과를 연구하기 위한 방법을 개발하는 것이 당업계에서 필요하다. 환자에 외인성 치료 단백질을 투여하면 생체 내에서 단백질 활성을 억제하는 항원-특이적 항체의 생산을 일으킬 것인지 결정하는 것도 또한 당업계에서 여전히 필요하다.
발명의 개요
본 발명은, 초고분자량 및 고분자량 다량체를 함유하는 재조합 인간 VWF가 TTP의 임상 증상을 유도하기 위해 마우스에게 투여되고 혈소판감소증 및 미세혈전증과 연관되는 다양한 동물 모델을 제공함으로써 혈액 응고 질환의 치료에 관련한 당업계의 하나 이상의 필요성을 해결한다.
하나의 측면에서, 본 발명은 정상 마우스, VWF가 결핍인 마우스, 및 ADAMTS13 낙아웃 마우스를 포함한다. 따라서, 본 발명은 TTP를 치료하기 위한 약물의 생체내 효능을 시험하기 위해 사용될 수 있는 다양한 동물 모델을 제공한다. 본 발명은 관심있는 물질을 정제된 또는 재조합 ADAMTS13을 함유하는 제제 (이로 제한되지 않음)와 같은 화합물과 함께 투여함으로써 조합 치료법이 사용되는 것을 고려한다.
하나의 실시양태에서, 본 발명은 혈액 응고 질환의 치료에서 치료제의 효능을 시험하기 위한 동물 모델을 포함한다. 상기 동물 모델은 일반적으로 재조합 VWF 폴리펩티드 분해 불능(inability to breakdown)을 포함한다. 상기 응고 질환은 일반적으로 상기 동물 모델(들)에서 하나 이상의 혈괴의 존재를 특징으로 한다. 하나의 측면에서, 질환은 혈전성 혈소판감소성 자반증이다. 다른 측면에서, 재조합 VWF 폴리펩티드는 인간의 것이다. 추가의 측면에서, 모델은 마우스이다. 추가의 측면에서, 마우스는 ADAMTS13 폴리펩티드가 결핍된다. 또다른 측면에서, 마우스는 VWF 폴리펩티드가 결핍된다. 또다른 측면에서, 마우스 모델은 C57BL/6J 주의 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 폰 빌레브란트 인자를 사망을 일으키기에 효과적인 양으로 투여한 포유동물에서 혈액 응고를 감소시키는 그의 능력에 대해 물질을 시험하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 일반적으로 시험 물질의 존재 및 부재 하에 동물 모델에서 사망률을 비교하는 것을 포함하고, 여기서 시험 물질의 존재 하에 감소된 사망률은 시험 물질이 혈액 응고를 감소시키는 능력을 가짐을 나타낸다. 하나의 측면에서, 동물 모델은 ADAMTS13 폴리펩티드가 결핍된다. 다양한 측면에서, 재조합 VWF의 양은 1000 RCoU/kg 초과, 2000 RCoU/kg 초과, 또는 4000 RCoU/kg 초과이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 재조합 VWF 폴리펩티드를 병리 상태를 일으키기에 효과적인 양으로 투여한 포유동물에서 혈액 응고를 감소시키는 그의 능력에 대해 물질을 시험하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 일반적으로 시험 물질의 존재 및 부재 하에 동물 모델에서 병리 상태를 비교하는 것을 포함하고, 여기서 시험 물질의 존재 하에 병리 상태의 감소된 발병률 또는 중증도는 시험 물질이 혈액 응고를 감소시키는 능력을 가짐을 나타낸다. 다양한 측면에서, 본 발명의 방법은 시험 물질을 다양한 범위의 투여량에 걸쳐 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 재조합 VWF 폴리펩티드는 인간의 것이다. 다양한 측면에서, 재조합 VWF 폴리펩티드의 양은 250 RCoU/kg 초과, 500 RCoU/kg 초과, 1000 RCoU/kg 초과, 2000 RCoU/kg 초과, 또는 4000 RCoU/kg 초과이다. 다양한 측면에서, 동물 모델은 ADAMTS13 폴리펩티드 또는 VWF 폴리펩티드가 결핍된다. 일부 측면에서, 동물 모델은 마우스이다. 추가의 측면에서, 마우스는 C57BL/6J 주의 것이다.
다양한 측면에서, 병리 상태는 임상, 조직학, 또는 행동 병리 상태이다. 상기 임상 병리 상태는 소변 내의 락테이트 데히드로게나제 수준, 크레아티닌 키나제 수준, 적혈구 용적률 (hematocrit), 헤모글로불린 농도, 적혈구 계수, 망상적혈구 계수, 총 백혈구 계수, 감별 (differential) 백혈구 계수, 혈액 형태 이상, 혈소판 계수, 평균 세포 부피, 평균 세포 헤모글로불린 농도, 또는 혈액 세포 수준의 하나 이상의 변화에 의해 분명해질 수 있다. 다른 측면에서, 병리 상태는 조직학적 병리 상태이다. 상기 조직학적 병리 상태는 예를 들어 비제한적으로 미세혈전, 심근 괴사, 증가된 관상 혈관주위염, 심근 변성, 심근 경색, 심근 보상 (reparation), 아교 세포 병소 (foci), 피질 괴사, 출혈, 미세혈전의 증가된 발병률 또는 평균 중증도, 파종성 혈관내 응고병증 (DIC), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 허혈성 심장병, 혈전색전성 변화, 반응성 관상 혈관주위염, 염증, 섬유증, 괴사, 헤모시데린 축적, 석회화, 신 경색증, 또는 체질량 감소 중의 하나 이상의 소견에 의해 분명해질 수 있다. 상기 행동 병리 상태는 예를 들어 비제한적으로 행동 저하, 엎드린 자세, 모로 누운 자세, 이상 자세, 호흡곤란, 운동실조증, 부동성 (immobility), 발작 (convulsion), 경련 (cramp), 또는 털세움 중의 하나 이상의 소견에 의해 분명해질 수 있다.
본 발명은 초고분자량 및 고분자량 다량체를 포함하는 재조합 인간 VWF (rVWF)가 마우스에서 TTP의 임상 증상을 유도할 수 있다는 발견에 기초한다. rVWF의 투여는 마우스에서 혈소판감소증 및 미세혈전증을 일으키는 것으로 관찰되었다. 본원에서 설명되는 마우스 모델은 TTP에 대한 예방 및 개선 치료법을 설계하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 포유동물에게 재조합 인간 VWF (rVWF)를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 TTP의 증상을 유도하는 방법을 제공하고, 여기서 rVWF 조성물은 고분자량 다량체를 형성하고, 투여는 포유동물에서 TTP의 적어도 하나의 증상을 생성시킨다. 일부 실시양태에서, rVWF는 ADAMTS13에 의해 유의하게 절단되지 않는다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 마우스, 래트, 토끼, 설치류 및 비-인간 영장류로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, TTP의 증상은 감소된 혈소판 수준, 빈혈, 조직병리학적 효과, 증가된 혈액 크레아티닌 키나제 수준, 증가된 혈액 크레아티닌 수준, 증가된 미세혈전, 및 증가된 혈액 락테이트 데히드로게나제 수준으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 포유동물은 마우스 또는 다른 설치류이고, 정상적인 내인성 VWF 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 마우스 또는 다른 설치류는 결핍 수준의 내인성 VWF를 갖는다 (예를 들어, VWF 낙아웃 마우스). 일부 실시양태에서, 마우스 또는 다른 설치류는 결핍 수준의 내인성 ADAMTS13을 갖는다 (예를 들어, ADAMTS13 낙아웃 마우스). 일부 실시양태에서, 마우스 또는 다른 설치류에는 내인성 ADAMTS13 및 VWF 둘 모두가 결핍된다. 일부 실시양태에서, 마우스 또는 다른 설치류는 인간화된다. 일부 실시양태에서, 마우스 또는 다른 설치류는 면역결핍된다.
일부 실시양태에서, rVWF는 예를 들어 포유동물에서 급성 반응을 실행하기 위해 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, rVWF는 적어도 약 1000 RCoU/kg (포유동물 체중)의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 용량은 적어도 약 1500 RCoU/kg, 예를 들어, 2000, 2500, 3000, 4000 또는 5000 RCoU/kg (포유동물 체중)이다.
일부 실시양태에서, rVWF는 포유동물에서 보다 낮은 수준의 반응을 실행하기 위해 1회 초과로, 예를 들어, 만성적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, rVWF는 주기적으로, 예를 들어, 약 24, 48 또는 72시간마다 1회, 또는 매주 투여된다. 일부 실시양태에서, 주기적 투여는 적어도 1주, 1개월 동안 또는 2 또는 3개월 초과로 지속한다. 상기 실시양태에서, rVWF는 일반적으로 급성 모델에서보다 더 낮은 용량, 예를 들어, 적어도 약 250 RCoU/kg (체중)으로 투여된다. 일부 실시양태에서, rVWF는 약 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 1000 RCoU/kg (포유동물 체중)으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 재조합 인자 VIII (rFVIII)가 포유동물에게 추가로 투여된다. 일부 실시양태에서, rFVIII는 rVWF와 동시에, 예를 들어 단일 조성물로 투여된다. 일부 실시양태에서, rVWF 및 rFVIII는 따로, 예를 들어, 연속적으로 투여된다. 일부 실시양태에서, rVWF 및 rFVIII는 정상 혈장에서 발견되는 비율과 유사한 용량비로 투여된다. 일부 실시양태에서, rFVIII는 적어도 약 500 IU/kg (포유동물 체중), 예를 들어, 적어도 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 또는 5000 IU/kg (체중)의 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, rVWF는 정맥내 투여된다. 일부 실시양태에서, rVWF는 주사를 통해, 예를 들어, 피하, 복강내, 근육내 등으로 투여된다. 일부 실시양태에서, rVWF는 흡입에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 rVWF를 포함하는 조성물을 주사한 포유동물을 포함하는, TTP의 포유동물 모델을 제공하고, 여기서 rVWF 조성물은 고분자량 다량체를 형성하고, 투여는 포유동물에서 TTP의 적어도 하나의 증상을 생성시킨다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 마우스, 래트, 토끼, 설치류, 또는 비-인간 영장류로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, TTP의 증상은 감소된 혈소판 수준, 빈혈, 조직병리학적 효과, 증가된 혈액 크레아티닌 키나제 수준, 증가된 혈액 크레아티닌 수준, 증가된 미세혈전, 및 증가된 혈액 락테이트 데히드로게나제 수준의 군 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 트랜스제닉 포유동물을 포함하는 TTP의 포유동물 모델을 제공하고, 여기서 트랜스제닉 포유동물은 rVWF를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 도입유전자 (transgene)로부터 재조합 인간 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)를 발현하고, 상기 rVWF는 고분자량 다량체를 형성하고, 주사는 TTP의 적어도 하나의 증상을 형성시킨다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 마우스, 래트, 토끼, 설치류, 또는 비-인간 영장류로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, TTP의 증상은 감소된 혈소판 수준, 빈혈, 조직병리학적 효과, 증가된 혈액 크레아티닌 키나제 수준, 증가된 혈액 크레아티닌 수준, 증가된 미세혈전, 및 증가된 혈액 락테이트 데히드로게나제 수준으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 포유동물 모델은 급성 TTP에 대한 모델이다. 일부 실시양태에서, rVWF는 단지 1회 투여된다. 상기 실시양태에서, rVWF는 적어도 1000 RCoU/kg (포유동물 체중)의 용량으로 주사된다. 일부 실시양태에서, 용량은 적어도 1500 RCoU/kg, 예를 들어, 2000, 2500, 3000, 4000, 또는 5000 RCoU/kg (포유동물 체중)이다.
일부 실시양태에서, 포유동물 모델은 만성 TTP에 대한 모델이다. 일부 실시양태에서, rVWF는 1회 초과로 투여된다. 예를 들어, rVWF는 주기적으로, 예를 들어, 24, 48 또는 72시간마다 또는 매주 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, rVWF는 예를 들어, 적어도 250 RCoU/kg (체중)의 용량으로 투여된다. 일부 실시양태에서, rVWF는 300, 400, 500, 600, 700, 800, 또는 1000 RCoU/kg (포유동물 체중)의 용량으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 본 발명은
(a) 포유동물에게 rVWF를 포함하는 조성물을 투여하고 (여기서, rVWF는 고분자량 다량체를 형성하고, 투여는 TTP의 적어도 하나의 증상을 형성시킨다);
(b) 시험 조성물을 포유동물에게 투여하고;
(c) TTP의 적어도 하나의 증상에 대한 시험 조성물의 효과를 결정하는 단계
를 포함하는, TTP의 증상에 대한 시험 조성물의 효과를 평가하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 포유동물은 마우스, 래트, 토끼, 설치류 또는 비-인간 영장류로 이루어지는 군 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, TTP의 증상은 감소된 혈소판 수준, 빈혈, 조직병리학적 효과, 증가된 혈액 크레아티닌 키나제 수준, 증가된 혈액 크레아티닌 수준, 증가된 미세혈전, 및 증가된 혈액 락테이트 데히드로게나제 수준으로 이루어지는 군 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 시험 조성물의 효과는 TTP에 대한 급성 포유동물 모델에서 평가된다. 일부 실시양태에서, 시험 조성물의 효과는 TTP에 대한 만성 포유동물 모델에서 평가된다.
일부 실시양태에서, 시험 조성물 및 rVWF를 포함하는 조성물은 동시에 투여된다. 일부 실시양태에서, 시험 조성물은 예를 들어, TTP의 적어도 하나의 증상을 방지하거나, 그의 발생을 지연시키거나, 그의 중증도를 감소시키기 위해 rVWF를 포함하는 조성물 전에 투여된다.
일부 실시양태에서, 시험 조성물은 rVWF 조성물의 투여의 적어도 1시간 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 시험 조성물은 rVWF 조성물의 투여의 적어도 3시간 후에, 예를 들어, rVWF 조성물의 투여의 적어도 5, 6, 8, 12, 18, 24, 또는 48시간 후에 투여된다. 일부 실시양태에서, 시험 조성물은 rVWF 조성물의 투여의 적어도 1 또는 2주 후에 투여된다.
일부 실시양태에서, 시험 조성물의 효과는 시험 조성물을 투여하지 않은 대조 포유동물, 및/또는 rVWF를 포함하는 조성물을 투여하지 않은 포유동물에 비교함으로써 평가된다. 일부 실시양태에서, 시험 조성물의 효과는 rVWF를 포함하는 조성물의 투여 전의 동일한 포유동물에 비교함으로써 평가된다.
일부 실시양태에서, 시험 조성물은 재조합 프로테아제, 예를 들어, 재조합 ADAMTS13이다. 다른 실시양태에서, 시험 조성물은 혈장 유래 생성물, 예를 들어, 새로 동결된 혈장 또는 혈장의 정제된 분획이다. 다른 실시양태에서, 시험 조성물은 비-단백질성 치료제이다. 일부 실시양태에서, 비-단백질성 치료제는 소분자 치료제이다. 이들 실시양태의 일부에서, 소분자는 당코르티코이드이고; 다른 실시양태에서, 항혈소판 의약 (예를 들어, 아스피린, 디피리다몰), 다른 실시양태에서, 아조티프린, 시클로포스파미드, 프로스타시클린 등이다.
본 발명의 다른 특징 및 잇점은 다음 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 구체적인 실시양태를 나타내지만, 단지 예시로서 제공됨을 이해해야 하고, 이것은 본 발명의 취지 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형이 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이기 때문이다.
도 1은 각각의 환경 내의 VWF 형태의 크기를 입증하는 다양한 공급원으로부터의 VWF의 겔 전기영동이다. 레인 1은 정상 인간 혈장이고; 레인 2는 C57BL/6J 마우스 혈장이고; 레인 5 및 6은 C57BL/6J 마우스로부터의 것이고; 레인 3 및 4는 ADAMTS13 결핍 마우스로부터의 것이다.
도 2-4는 C57BL/6J 마우스에 대한 연구 기간에 걸쳐 체질량의 변화를 도시한 것이다. 분석의 상세 내용은 실시예에서 보다 상세히 설명된다.
도 5-12는 C57BL/6J 마우스에 대한 연구 기간에 걸쳐 적혈구 용적률, 혈소판 계수, 크레아티닌 키나제 (CK), 및 락토스 데히드로게나제 (LDH)에 대한 데이타를 보여준다. 분석의 상세 내용은 실시예에서 보다 상세히 설명된다.
도 13-15는 VWF-결핍 마우스에 대한 연구 기간에 걸쳐 체질량의 변화를 도시한 것이다. 분석의 상세 내용은 실시예에서 보다 상세히 설명된다.
도 16-23은 VWF-결핍 마우스에 대한 연구 기간에 걸쳐 적혈구 용적률, 혈소판 계수, 크레아티닌 키나제 (CK), 및 락토스 데히드로게나제 (LDH)에 대한 데이타를 보여준다. 분석의 상세 내용은 실시예에서 보다 상세히 설명된다.
도 24-26은 ADAMTS13 결핍 마우스에 대한 연구 기간에 걸쳐 체질량의 변화를 도시한 것이다. 분석의 상세 내용은 실시예에서 보다 상세히 설명된다.
도 27-32는 ADAMTS13 결핍 마우스에 대한 연구 기간에 걸쳐 적혈구 용적률, 혈소판 계수, 및 락토스 데히드로게나제 (LDH)에 대한 데이타를 보여준다. 분석의 상세 내용은 실시예에서 보다 상세히 설명된다.
본 발명은 초고분자량 및 고분자량 다량체를 함유하는 재조합 인간 VWF ("rVWF"로서 칭함)가 TTP의 임상 증상을 유도할 수 있고, 마우스에게 투여될 때 혈소판감소증 및 미세혈전증과 연관된다는 발견에 기초하여 TTP의 모델을 제공한다. 이들 효과는 정상 마우스, VWF-결핍 마우스, 및 가장 현저하게 인간 ADAMTS13이 또한 결핍되는 ADAMTS13 결핍 마우스에서 나타난다. 대조 실험에서, 데이타는 인간 혈장으로부터 정제될 수 있는 바와 같이 초고분자량 다량체가 결핍되는 인간 VWF는 TTP-유사 증상을 유도할 수 없음을 입증하였다. 데이타는 또한 rVWF의 적용에 의해 유도된 TTP-유사 증상을 갖는 마우스를 ADAMTS13 처리하면, rVWF에 의해 유도되는 TTP-유사 증상의 발생을 방지할 것임을 입증하였다. 따라서, 본 발명은 TTP의 치료에서 다양한 물질의 생체내 효능을 시험하기 위해 사용될 수 있는 모델을 제공한다. 제공된 방법은 TTP의 치료에서 새로운 치료법의 유효성을 시험하기 위한 개선된 방법에 대한 당업계의 필요성을 해결한다.
따라서, 동물 모델은 혈액 응고 질환의 치료에서 치료제의 효능을 시험하기 위해 제공되고, 여기서 질환은 신체 전체에서 혈관 내의 혈괴의 존재를 특징으로 한다.
하나의 측면에서, 동물 모델에게 사망을 일으키기에 효과적인 양의 재조합 VWF를 다양한 양의 물질과 조합하여 투여하고; 모델을 물질에 노출되지 않은 모델에 비해 사망률의 감소에 대해 검사하고; 모델에서 사망률을 감소시키는 그의 능력에 대해 물질을 선택하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 혈액 응고를 감소시키는 능력에 대해 물질을 시험하는 방법을 제공한다. 보다 간단히 언급하면, 시험 물질의 존재 및 부재 하에 동물 모델에서 사망률을 비교하는 것을 포함하는, 사망을 일으키기에 효과적인 양으로 재조합 VWF를 투여한 포유동물에서 혈액 응고를 감소시키는 능력에 대해 물질을 시험하는 방법을 제공하고, 여기서 시험 물질의 존재 하에 감소된 사망률은 시험 물질이 혈액 응고를 감소시키는 능력을 가짐을 나타낸다.
동물 모델에게 동물 모델에서 병리 상태를 일으키기에 효과적인 양의 재조합 VWF를 다양한 양의 물질과 조합하여 투여하고; 모델을 물질에 노출되지 않은 모델에 비해 병리 상태의 개선에 대해 검사하고; 모델에서 병리 상태를 개선시키는 그의 능력에 대해 물질을 선택하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 혈액 응고를 감소시키는 능력에 대해 물질을 시험하는 방법을 또한 제공한다. 여기서 다시 보다 간단히 언급하면, 시험 물질의 존재 및 부재 하에 동물 모델에서 병리 상태를 비교하는 것을 포함하는, 재조합 폰 빌레브란트 인자를 병리 상태를 일으키기에 효과적인 양으로 투여한 포유동물에서 혈액 응고를 감소시키는 그의 능력에 대해 물질을 시험하는 방법을 제공하고, 여기서 시험 물질의 존재 하에 병리 상태의 감소된 발병률 또는 중증도는 시험 물질이 혈액 응고를 감소시키는 능력을 가짐을 나타낸다.
다양한 실시양태에서, 재조합 VWF는 적어도 약 10 RCoU/kg BW, 적어도 약 20 RCoU/kg BW, 적어도 약 30 RCoU/kg BW, 적어도 약 40 RCoU/kg BW, 적어도 약 50 RCoU/kg BW, 적어도 약 60 RCoU/kg BW, 적어도 약 70 RCoU/kg BW, 적어도 약 80 RCoU/kg BW, 적어도 약 90 RCoU/kg BW, 적어도 약 100 RCoU/kg BW, 적어도 약 150 RCoU/kg BW, 적어도 약 200 RCoU/kg BW, 적어도 약 250 RCoU/kg BW, 적어도 약 300 RCoU/kg BW, 적어도 약 350 RCoU/kg BW, 적어도 약 400 RCoU/kg BW, 적어도 약 450 RCoU/kg BW, 적어도 약 500 RCoU/kg BW, 적어도 약 550 RCoU/kg BW, 적어도 약 600 RCoU/kg BW, 적어도 약 650 RCoU/kg BW, 적어도 약 700 RCoU/kg BW, 적어도 약 750 RCoU/kg BW, 적어도 약 800 RCoU/kg BW, 적어도 약 850 RCoU/kg BW, 적어도 약 900 RCoU/kg BW, 적어도 약 950 RCoU/kg BW, 적어도 약 1000 RCoU/kg BW, 적어도 약 1200 RCoU/kg BW, 적어도 약 1400 RCoU/kg BW, 적어도 약 1600 RCoU/kg BW, 적어도 약 1800 RCoU/kg BW, 적어도 약 2000 RCoU/kg BW, 적어도 약 2500 RCoU/kg BW, 적어도 약 3000 RCoU/kg BW, 적어도 약 3500 RCoU/kg BW, 적어도 약 4000 RCoU/kg BW, 적어도 약 4500 RCoU/kg BW, 적어도 약 5000 RCoU/kg BW, 적어도 약 6000 RCoU/kg BW, 적어도 약 7000 RCoU/kg BW, 적어도 약 8000 RCoU/kg BW, 적어도 약 9000 RCoU/kg BW, 적어도 약 10000 RCoU/kg BW, 적어도 약 20000 RCoU/kg BW, 적어도 약 50000 RCoU/kg BW 및 적어도 약 100000 RCoU/kg BW, 및 100000 RCoU/kg BW 초과까지의 용량으로 동물 모델에게 투여된다.
제시되는 방법의 특정 측면에서, 재조합 FVIII은 임의로 적어도 약 10 IU/kg BW, 적어도 약 20 IU/kg BW, 적어도 약 30 IU/kg BW, 적어도 약 40 IU/kg BW, 적어도 약 50 IU/kg BW, 적어도 약 60 IU/kg BW, 적어도 약 70 IU/kg BW, 적어도 약 80 IU/kg BW, 적어도 약 90 IU/kg BW, 적어도 약 100 IU/kg BW, 적어도 약 150 IU/kg BW, 적어도 약 200 IU/kg BW, 적어도 약 250 IU/kg BW, 적어도 약 300 IU/kg BW, 적어도 약 350 IU/kg BW, 적어도 약 400 IU/kg BW, 적어도 약 450 IU/kg BW, 적어도 약 500 IU/kg BW, 적어도 약 550 IU/kg BW, 적어도 약 600 IU/kg BW, 적어도 약 650 IU/kg BW, 적어도 약 700 IU/kg BW, 적어도 약 750 IU/kg BW, 적어도 약 800 IU/kg BW, 적어도 약 850 IU/kg BW, 적어도 약 900 IU/kg BW, 적어도 약 950 IU/kg BW, 적어도 약 1000 IU/kg BW, 적어도 약 1200 IU/kg BW, 적어도 약 1400 IU/kg BW, 적어도 약 1600 IU/kg BW, 적어도 약 1800 IU/kg BW, 적어도 약 2000 IU/kg BW, 적어도 약 2500 IU/kg BW, 적어도 약 3000 IU/kg BW, 적어도 약 3500 IU/kg BW, 적어도 약 4000 IU/kg BW, 적어도 약 4500 IU/kg BW, 적어도 약 5000 IU/kg BW, 적어도 약 6000 IU/kg BW, 적어도 약 7000 IU/kg BW, 적어도 약 8000 IU/kg BW, 적어도 약 9000 IU/kg BW, 적어도 약 10000 IU/kg BW, 적어도 약 20000 IU/kg BW, 적어도 약 50000 IU/kg BW 및 적어도 약 100000 IU/kg BW, 및 100000 IU/kg BW 초과까지의 용량으로 동물 모델에게 투여된다.
제시되는 방법에서, 시험 물질은 다양한 용량을 비롯한 임의의 용량으로 동물 모델에게 투여된다. 투여량은 체중, 물질의 활성, 투여 경로, 동물 수여체의 상태, 및 당업자에게 공지된 다양한 인자에 기초할 수 있다.
정의
달리 규정하지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 다음 참조문헌은 당업자에게 본 발명에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 정의를 제공한다: ([Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994)]; [THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988)]; [THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 [Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)].
다음 약어를 본원 전체에서 사용한다.
ADAMTS13 - 트롬보스폰딘 타입 1 도메인 13을 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테아제
BW - 체중
IU - 국제 단위
n.a. - 적용 불가
IV - 정맥내
CV - 변이 계수
NOAEL - 유해한 효과가 관찰되지 않는 수준
SEM - 평균의 표준 오차
SOP - 표준 작업 절차
mEq - 밀리 당량
RCo - 리스토세틴 (ristocetin) 보조인자
VWF - 폰 빌레브란트 인자
rVWF - 재조합 폰 빌레브란트 인자
rFVIII - 재조합 인자 8
WFI - 주사용수
STADS - 단기 분석 데이타 세트
LTADS - 장기 분석 데이타 세트
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용될 때, 단수 형태 ("a", "an" 및 "the")는 문맥이 분명하게 다르게 지시하지 않으면 복수 언급을 포함하는 것에 주의한다.
본원에서 사용될 때, 다음 용어는 달리 명시되지 않으면 그에 대해 설명된 의미를 갖는다.
용어 "유전자"는 하나 이상의 폴리펩티드, 단백질 또는 효소의 전부 또는 일부를 포함하는 아미노산의 특정 서열을 코딩하는 DNA 서열을 의미하고, 인트론, 및 예를 들어 유전자가 발현되는 조건에 영향을 주는 조절 DNA 서열, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서 서열, 5'-비번역 구역, 또는 3'-비번역 구역을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 구조적 유전자가 아닌 일부 유전자는 DNA로부터 RNA로 전사될 수 있지만, 아미노산 서열로 번역되지 않는다. 다른 유전자는 구조적 유전자의 조절자로서 또는 DNA 전사의 조절자로서 기능할 수 있다.
"핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 의미한다. 이 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는, 공지의 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 (backbone) 잔기 또는 연결을 함유하는 합성, 천연 생성, 및 비-천연 생성 핵산을 포함한다. 상기 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA)을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
달리 나타내지 않으면, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축퇴성 (degenerate) 코돈 치환) 및 상보성 서열, 및 명백하게 나타낸 서열을 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다 ([Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; [Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; [Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]). 용어 핵산은 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드와 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 펩티드 결합을 통해 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 의미하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 이 용어는 천연 생성 아미노산 중합체 및 비-천연 생성 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 대응하는 천연 생성 아미노산의 인공적인 화학적 모방체인 아미노산 중합체에도 적용된다. 용어 "단백질"은 일반적으로 큰 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "펩티드"는 일반적으로 짧은 폴리펩티드를 의미한다. 합성 폴리펩티드는 예를 들어 자동 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산과 핵산 서열 모두에 대해 적용된다. 특정 핵산 서열에 대해, 보존적으로 변형된 변이체는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열, 또는 핵산이 아미노산 서열을 코딩하지 않는 경우에는 본질적으로 동일한 서열을 코딩하는 핵산을 의미한다. 유전자 코드의 축퇴성 때문에, 매우 많은 기능상 동일한 핵산이 임의의 제시된 단백질을 코딩한다. 예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩되는 폴리펩티드를 변경하지 않으면서 기재된 임의의 대응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 상기 핵산 변이는 보존적으로 변형된 변이의 일종인 "침묵 변이"이다. 또한, 본원에서 폴리펩티드를 코딩하는 모든 핵산 서열은 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 나타낸다. 당업자는 핵산 내의 각각의 코돈 (통상적으로 메티오닌의 유일한 코돈인 AUG, 및 통상적으로 트립토판의 유일한 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 알 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 침묵 변이는 각각의 기재된 서열에 내포된다.
아미노산 서열에 대해, 당업자는 코딩되는 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개별적인 치환, 결실 또는 부가가 "보존적으로 변형된 변이체"를 유도하고, 여기서 변경은 아미노산을 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환하는 것임을 알 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 공지되어 있다. 상기 보존적으로 변형된 변이체는 본 발명에서 부가적인 것으로서, 본 발명의 다형성 변이체, 종간 상동체, 및 대립유전자를 배제하지 않는다.
다음 8개의 군은 다음과 같이 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다:
1) 알라닌 (A), 글라이신 (G);
2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 라이신 (K);
5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W);
7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및
8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (예를 들어, 문헌 [Creighton, Proteins (1984)] 참조).
예를 들어, 세포 또는 핵산, 단백질, 또는 벡터에 대해 사용되는 용어 "재조합"은 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종성 핵산 또는 단백질의 도입 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 세포가 이와 같이 변형된 세포로부터 유도됨을 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 천연 (비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 그렇지 않으면 비정상적으로 발현되거나 과소발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.
핵산의 일부에 대해 사용되는 용어 "이종성"은 핵산이 자연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열을 포함함을 나타낸다. 예를 들어, 새로운 기능적 핵산을 생성하도록 관련되지 않은 유전자로부터의 2개 이상의 서열, 예를 들어, 하나의 공급원으로부터 프로모터 및 다른 공급원으로부터 코딩 구역이 배열된 핵산은 일반적으로 재조합 방식으로 생산된다. 이와 유사하게, 이종성 단백질은 단백질이 자연에서 서로 동일한 관계로 발견되지 않는 2개 이상의 하위서열을 포함함을 나타낸다 (예를 들어, 융합 단백질).
"프로모터"는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 조절 서열의 어레이 (array)로서 규정된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 프로모터는 전사 개시 부위 근처에 필요한 핵산 서열, 예를 들어 중합효소 II 타입 프로모터의 경우에 TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 또한 전사 개시 부위로부터 수천 개의 염기쌍만큼 멀리 위치할 수 있는 먼 인핸서 또는 리프레서 (repressor) 요소를 임의로 포함한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 및 발달 조건 하에서 활성을 갖는 프로모터이다. "유도가능한" 프로모터는 환경 또는 발달 조절 하에서 활성을 갖는 프로모터이다. 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열 (예를 들어, 프로모터, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이)과 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하고, 여기서 발현 제어 서열은 제2 서열에 대응하는 핵산의 전사를 지시한다.
"발현 벡터"는 숙주 세포에서 특정 핵산의 전사를 가능하게 하는 일련의 명시된 핵산 요소를 사용하여 재조합 방식으로 또는 합성 방식으로 생성된 핵산 구성체이다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스, 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 일반적으로, 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사되는 핵산을 포함한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 있어서, 용어 "동일한" 또는 "동일성" 비율은 2개 이상의 서열 또는 하위서열이 다음 서열 비교 알고리즘 중의 하나를 사용하여 또는 수동 정렬 및 시각 검사에 의해 측정시에 동일하거나, 또는 비교창, 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대로 대응하도록 비교 및 정렬할 때 명시된 비율의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는다는 것을 의미한다. "실질적인 동일성"은 명시된 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 의미한다. 동일성은 일반적으로 길이가 적어도 약 50-100개의 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역에 걸쳐 존재한다.
용어 "내인성"은 숙주 유기체에서 천연에서 발현되거나 세포, 조직 또는 유기체 내에서 생긴 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 또는 다른 화합물을 의미한다. "외인성"은 세포, 조직 또는 유기체의 외부에서 생긴 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 다른 화합물을 의미한다.
용어 "물질" 또는 "화합물"은 본 발명의 동물 모델에서 혈액 응고 또는 다른 생물학적 파라미터에 영향을 줄 수 있는 임의의 분자, 예를 들어 단백질 또는 약품을 설명한다.
용어 "NOAEL" 또는 "유해한 효과가 관찰되지 않는 수준"은 그의 적절한 대조군에 비교할 때 노출된 집단에서 임의의 유해한 효과의 빈도 또는 중증도의 생물학상 또는 통계상 유의한 (예를 들어, 형태, 기능적 능력, 성장, 발달 또는 수명의 변경) 증가가 없는, 실험 또는 관찰에 의해 판명된 유기체의 노출 수준을 나타낸다. 독성학에서, NOAEL은 구체적으로 보다 높은 용량 또는 농도가 유해한 효과를 일으킨 시험 유기체에서 상기 유해한 효과가 나타나지 않는 물질 (즉, 화학적) 또는 작용제 (예를 들어, 방사선조사)의 시험된 최고 용량 또는 농도이다. 상기 수준은 대부분의 위험 평가 방법에서 기본적인 단계인 용량-반응 관계를 확립하는 방법에 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, TTP 또는 모쉬코위츠병은 미세혈관병성 용혈성 빈혈 및 연관 증상을 의미한다. TTP의 증상은 신경학적 증상 (행동 변화, 변경된 정신 상태, 뇌졸중, 두통); 신 부전증; 열; 혈소판감소증 (낮은 혈소판 계수); 타박상; 자반증; 빈혈; 및 황달을 포함한다. TTP는 적혈구의 전단을 일으키는 비정상적으로 높은 수준의 혈소판 응집 및 혈액 응고를 특징으로 한다. 추가의 증상이 본원에서 설명된다.
TTP는 일반적으로 ADAMTS13의 결핍증에 의해 야기된다. 이 증후군은 2개의 범주, 즉 후천성 TTP 및 가족성 TTP로 넓게 분류될 수 있다. 후천성 TTP에서, TTP 증상은 ADAMTS13에 대해 생성된 자가-항체 때문에 발생한다. 가족성 TTP는 일반적으로 ADAMTS13 유전자의 돌연변이 (예를 들어, 넌센스 (nonsense), 프레임쉬프트, 또는 미스센스 (missense))에 의해 유발된다 (예를 들어, 문헌 [Desch et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 27:1901-08, 2007] 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, "조직병리학적 효과"는 일반적으로 조직 구조 내에서 현미경으로 또는 육안으로 관찰된 효과를 포함한다. TTP의 조직병리학적 효과는 미세혈전증 (특히 심장 및 다른 장기에서), 심근 괴사, 심근 변성, 및 증가된 관상 혈관주위염을 포함한다. 추가의 TTP 조직병리학적 효과는 실시예 섹션에 기재되어 있다.
마찬가지로, 용어 "병리 상태"는 비정상적인 생리학적 상태를 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 병리 상태는 임상, 조직학적, 또는 행동 병리 상태일 수 있고, 추정된 정상 상태로부터의 편차를 나타낸다. 병리 상태가 "임상 병리 상태"이면, 체액, 예를 들어 비제한적으로 혈액 및 소변의 이상을 반영한다. 임상 병리 상태는 화학, 미생물학, 혈액학 또는 분자 병리학을 이용하여 관찰할 수 있다. 병리 상태가 "조직학적 병리 상태"이면, 체질량의 차이를 측정하는 것을 비롯하여 장기, 조직, 또는 전신 (부검 또는 검시)의 육안, 현미경, 또는 분자 검사를 이용하여 관찰할 수 있다. 병리 상태가 "행동 병리 상태"이면, 동물의 외관 및 행동의 변화를 모니터링함으로써 관찰할 수 있다.
폰 빌레브란트 인자 또는 VWF는 혈액 응고를 돕기 위해 인자 VIII (FVIII)에 결합하는 큰 다량체성 당단백질이다. 트롬빈은 VWF로부터 FVIII을 방출하고, 이것은 FVIII의 신속한 분해를 야기한다. 정상 조건 하에, VWF 단량체는 분비 전에 소포체 및 골지체에서 다량체로 조립된다. VWF의 다량체는 >20,000 kD로 극도로 크고, 각각 250 kD의 80개 초과의 단량체 하위단위 (subunit)로 이루어질 수 있다. ADAMTS13 (트롬보스폰딘 타입 1 모티프 13을 갖는 디스인테그린-유사 및 메탈로프로테아제)은 VWF를 Y1605와 M1606 사이에서 절단하여, 다른 프로테아제에 의한 그의 분해를 야기한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 인간 재조합 VWF 또는 "rVWF"는 고분자량 다량체를 형성하는 재조합 VWF를 의미한다. 혈장-유래 VWF와는 달리, rVWF는 내인성 ADAMTS13에 노출되지 않았고, 따라서, Y1605-M1606에서 절단되지 않았다. 달리 나타내지 않으면, "rVWF"는 인간 서열 및 그의 실질적으로 동일한 변이체를 의미한다.
"인자 VIII" (FVIII)은 순환계에서 VWF와 회합하는 혈액 응고 인자를 의미한다. 상기 회합은 FVIII의 분해를 억제한다. 트롬빈에 의한 활성화시에, FVIII은 해리되고, 응고 캐스케이드에 도입된다.
"ADAMTS13" (트롬보스폰딘 타입 1 모티프 13을 갖는 디스인테그린-유사 및 메탈로프로테아제)은 혈액에서 VWF를 절단하고 그의 활성 (예를 들어, 혈소판과 내피하층 사이의 점착성 연결)을 감소시키는 메탈로프로테아제를 의미한다. TTP에서 ADAMTS13의 역할의 검토에 대해서는, 문헌 [Levy et al., Blood 106:11-17, 2005]을 참조한다.
본원에서 사용되는 "대조군"은 활성, 양성, 음성 또는 비히클 대조군을 의미할 수 있다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 대조군은 실험 결과의 적절성을 확립하고 시험되는 상태에 대한 비교를 제공하기 위해 사용된다. 예를 들어, 음성 대조군은 일반적으로 비처리 또는 "정상" 상태를 나타내는 샘플을 의미한다. 또한, 음성 대조군은 예를 들어 불활성 성분으로 처리된 샘플을 포함할 수 있다. 예시적인 대조군의 비-제한적인 세트는 실시예에 제시되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, TTP의 "급성" 모델 또는 "급성" 반응은 포유동물이 장기 손상을 비롯하여 TTP의 중증 증상을 경험함을 나타낸다. 일부 경우에, 포유동물은 완전히 회복할 수 없다. 상기 급성 모델은 중증 TTP가 있는 인간 환자, 예를 들어, ADAMTS13 내에 유전적 결함이 있는 환자에서 관찰된 병태를 표시할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, TTP의 급성 모델은 고용량의 rVWF를, 예를 들어 단일 볼러스로 투여함으로써 생성된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, TTP의 "만성" 모델 또는 "만성" 반응은 포유동물이 장기간의 덜 심각한 TTP 증상을 경험함을 나타낸다. 상기 만성 모델은 중증도가 낮은 증상을 경험하는 TTP의 일부 인간 환자, 예를 들어 중증 ADAMTS13 결핍증이 없는 환자에서 발견되는 병태를 표시할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서, TTP의 만성 모델은 보다 저용량의 rVWF를, 예를 들어, 일정 기간에 걸쳐 다수회 투여함으로써 생성된다.
TTP의 증상을 언급할 때 용어 "중증도를 감소시키다"는 증상이 발생 지연, 중증도 감소를 보이거나, 또는 동물에 보다 낮은 손상을 야기함을 의미한다. 일반적으로, 증상의 중증도는 예를 들어 예방 또는 치료 활성 조성물을 투여하지 않은 대조군과 비교된다. 이 경우에, 조성물은 증상의 대조 수준에 비해 증상이 10%, 25%, 30%, 50%, 80%, 또는 100% (즉, 본질적으로 제거됨) 감소되면 TTP 증상의 중증도를 감소시키는 것으로 언급될 수 있다.
혈액 응고 인자 및 혈액 효소
상기한 바와 같이, 제시되는 방법은 임의로 인자 VIII의 사용을 포함한다. 인자 VIII (FVIII)은 포유동물의 간에서 생산되는 약 260 kDa 분자 질량의 혈장 당단백질이다. 이 인자는 혈액 응고를 야기하는 응고 반응의 캐스케이드의 중대한 성분이다. 상기 캐스케이드 내에는 FVIII과 함께 인자 IXa가 인자 X를 활성화된 형태인 인자 Xa로 전환하는 단계가 존재한다. FVIII은 인자 IXa의 활성을 위해 칼슘 이온 및 인지질을 필요로 하는 상기 단계에서 보조인자로서 작용한다. 2개의 가장 통상적인 혈우병 질환은 기능적 FVIII (혈우병 A, 모든 환자의 약 80%) 또는 기능적 인자 IXa (혈우병 B 또는 크리스마스 (Christmas) 인자 질병)의 결핍증에 의해 야기된다.
최근까지, 혈우병 A의 표준 처리는 인간 공여자의 혈장으로부터 유도된 FVIII 농축물 제제의 빈번한 주입을 수반하였다. 상기 대체 요법은 일반적으로 효과적이지만, 상기 처리는 환자를 바이러스-전염성 질병, 예를 들어 간염 및 AIDS 감염에 대한 위험에 노출시킨다. 상기 위험은 모노클로날 항체를 사용한 면역정제에 의한 혈장으로부터 FVIII의 추가의 정제에 의해 및 유기 용매 또는 열을 사용한 처리에 의한 바이러스의 불활성화에 의해 감소되었지만, 상기 제제는 처리 비용을 크게 증가시켰고, 위험을 배제하지 못하였다. 이러한 이유로, 환자는 예방 목적보다는 증상에 따라 처리되었다. 추가의 문제는 약 15%의 환자에서 혈장-유래 FVIII에 대한 억제 항체가 발생한다는 사실이다.
혈우병 A의 치료에 있어서의 중요한 진전은 인간 FVIII의 완전한 2,351개의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA 클론의 단리 (문헌 [Wood et al., Nature, 312:330 (1984)] 및 미국 특허 4,757,006 (1988년 7월 12일) 참조) 및 인간 FVIII 유전자 DNA 서열 및 그의 재조합 생산 방법이었다. 그러나, 재조합 FVIII를 투여한 환자에서 질병의 치료를 방해하는 FVIII-특이적 항체가 계속 발생할 수 있다. 혈우병 A의 치료를 위한 인자 VIII 제품은 다음을 포함하고 이로 제한되지 않는다: 애드베이트 (ADVATE)® (항혈우병 인자 (재조합), 혈장/알부민-비함유 방법, rAHF-PFM, 박스터 (Baxter)), 재조합 항혈우병 인자 (바이오클레이트 (BIOCLATE)™, 게나크 (GENARC)®, 헬릭세이트 FS (HELIXATE FS)®, 코에이트 (KOATE)®, 코게네이트 FS (KOGENATE FS)®, 레콤비네이트 (RECOMBINATE)®): 모노클레이트-P (MONOCLATE-P)®, 인자 VIII:C의 정제된 제제, 항혈우병 인자/폰 빌레브란트 인자 복합체 (인간) 휴메이트-P (HUMATE-P)® 및 알파네이트 (ALPHANATE)®, 항혈우병 인자/폰 빌레브란트 인자 복합체 (인간); 및 히에이트 C (HYATE C)®, 정제된 돼지 인자 VIII.
따라서, 제공된 방법은 양성 대조군으로서 해메이트 (HAEMATE)® P (ZLB 베링 게엠베하 (ZLB Behring GmbH, 독일 마르부르크))의 사용을 포함한다. 본 발명의 실시예에서 사용된 해메이트® P는 활성 성분 VWF 및 FVIII (114.34 IU VWF:RCo/mL, 77 IU FVIII/mL)을 포함하고, 스크리닝된 혈액 공여자의 혈장으로부터 추출에 의해 생산된다. 그러나, 다른 형태 및 농도의 해메이트® P도 본 방법에서 사용하기 위해 고려된다.
또한, 본원에서 제공되는 방법은 다양한 측면에서 VWF의 사용을 포함한다. VWF는 단량체의 분자 질량이 약 260 kDa인 점착성 복합 당단백질이다. VWF는 450 kDa 내지 20,000 kDa의 분자 질량으로 이량체와 올리고머 모두로서 인간 혈장에서 순환한다. 전구체 폴리펩티드, 즉 프리-프로 (pre-pro)-VWF는 내피 세포 및 거핵구에서 합성되고, 22개 아미노산 잔기의 신호 펩티드, 741개 잔기의 프로-펩티드 및 2050개 잔기의 폴리펩티드로 구성된다. 신호 펩티드의 생체내 제거 후에, 2개의 프로-VWF 단위는 디술피드 결합을 통해 연결되어, 성숙 VWF 다량체의 빌딩 블록인 이량체를 형성한다. 분자량이 2,000만 달톤까지 증가한 VWF의 추가의 중합체는 연결에 의해 VWF 이량체로부터 형성된다. 특히 고분자량 VWF 다량체가 혈액 응고에서 필수적으로 중요하다고 가정된다.
VWF 증후군은 VWF가 과소생산 또는 과다생산될 때 임상적으로 나타난다. VWF의 과다생산은 증가된 혈전증 (혈액의 유동을 방해하는 혈관 내의 혈괴 또는 혈전의 형성)을 야기하는 반면, 고분자 형태의 VWF의 감소된 수준 또는 결여는 혈소판 응집 및 상처 폐쇄의 억제 때문에 증가된 출혈 및 증가된 출혈 시간을 야기한다.
또한, VWF 결핍증은 VWF가 기능적 FVIII의 필수 성분이기 때문에 표현형 혈우병 A를 야기할 수 있다. 이 경우에, 인자 VIII의 반감기는 혈액 응고 캐스케이드에서 그의 기능이 손상되는 정도로 감소된다. 폰 빌레브란트 질병 (VWD) 또는 VWF 증후군으로 고통받는 환자는 빈번하게 FVIII 결핍증을 보인다. 이들 환자에서, 감소된 FVIII 활성은 X 염색체 유전자의 결함의 결과가 아니라, 혈장에서 VWF의 정량적 및 정성적 변화의 간접적인 결과이다. 혈우병 A와 VWD의 구별은 통상적으로 VWF 항원을 측정하거나 리스토세틴-보조인자 활성을 결정함으로써 실행될 수 있다. 리스토세틴 보조인자 활성은 리스토세틴 및 혈소판 기질을 환자의 혈장에 첨가함으로써 측정된다. 리스토세틴은 VWF의 혈소판 당단백질 Ib 수용체에 대한 결합을 향상시켜 응집을 야기한다. 환자의 VWF는 광 투과 변화에 의해 측정되는 바와 같은, 리스토세틴에 의해 유도되는 혈소판 응집을 지지할 것이다. 따라서, 이것은 환자의 VWF의 기능적 활성의 시험관 내 측정치이고, VWD를 진단하기 위한 가장 감수성인 분석이다. VWF 항원 함량과 리스토세틴 보조인자 활성은 대부분의 VWD 환자에서 저하되지만, 이들은 혈우병 A 환자에서는 정상이다. VWF 증후군의 치료를 위한 VWF 제품은 휴메이트-P®; 및, 이뮤네이트 (IMMUNATE)®, 이노브랜드 (INNOBRAND)®, 및 8Y® (치료제는 혈장으로부터 FVIII/VWF 농축물을 포함함)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
인간 rVWF는 쥐 혈장 내에 존재하는 쥐 ADAMTS13의 단백질 분해 활성에 대해 저항성이다. 상기 관찰은 인간 rVWF를 마우스를 비롯한 다양한 종의 혈장에 노출시키고 잔류 VWF 활성을 측정하거나 다량체 조성물을 가시화함으로써 시험관 내에서 입증되었다. 쥐 ADAMTS13에 대한 인간 VWF의 저항성은 또한 생체 외에서 rVWF를 마우스에 주입한 후에 입증되었다. 주입 후 다양한 시점에 수득한 혈장 샘플은 Tyr1605-Met1606에서의 절단 후에 ADAMTS13의 작용으로부터 유래된 임의의 VWF 단편 (C-말단 176 kD 및 N-말단 140 kD)을 보이지 않았고, 이것은 생체 내에서 쥐 ADAMTS13에 대한 rVWF의 저항성과 일치한다. 이와 반대로, 토끼에 rVWF를 투여하면 VWF 하위단위의 예상된 절단 패턴을 생성시켜, 모노클로날 항체를 사용한 면역블롯 상에 단편이 출현한다.
rVWF는 ADAMTS13-특이적 단백질 분해작용에 노출되지 않았기 때문에, 재조합 VWF는 무손상 VWF 하위단위로 구성된다. 혈장-유래 VWF는 VWF의 A2 도메인 내의 Tyr1605-MET1606에서 절단되는 하위단위로 구성된다. 정상 C57BL/6J 마우스는 무손상 하위단위를 갖는 인간 rVWF를 절단할 수 없는 쥐 ADAMTS13을 갖는다. 따라서, rVWF를 C57BL/6J 마우스에 투여하면 초고 VWF 다량체를 생성시키고 rVWF의 손상된 대사를 일으킨다.
ADAMTS13 (트롬보스폰딘 타입 1 모티프, 구성원 13을 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제) (VWF-절단 프로테아제 (VWFCP)로도 알려짐)은 VWF를 절단하는 아연-함유 메탈로프로테아제 효소이다. ADAMTS13은 혈액에서 분비되고, 큰 VWF 다량체를 분해하여 그의 활성을 저하시킨다. ADAMTS13은 여러 구조적 및 기능적 도메인으로 구성되는 메탈로프로테아제이고, 이들 도메인은 ADAMTS13의 VWF 인식 및 이에 대한 결합에 참여할 수 있다. ULVWF 다량체는 내피 세포로부터 분비될 때 ADAMTS13에 의해 절단된다.
선천성 TTP 또는 후천성 TTP가 있는 환자는 ADAMTS13이 심각하게 결핍되는 것으로 밝혀졌다. 선천성 ADAMTS13 결핍증은 ADAMTS13 유전자의 돌연변이에 의해 유발된다. 가족성 형태의 환자는 중증 프로테아제 결핍증을 보인다. 가족성 TTP에서 ADAMTS13 유전자 돌연변이는 ADAMTS13의 불활성 또는 감소된 활성을 일으킨다. 후천성 결핍증은 ADAMTS13 활성을 억제하는 자가항체의 생산과 함께 일어난다. 후천성 TTP는 자가면역 질병, 악성종양, 줄기 세포 이식, 임신 (특히 제3분기), 특정 약물 (티클로피딘, 미토마이신, 클로피도그렐, 및 시클로스포린 포함) 또는 감염의 특발성 2차 합병증이다.
혈전성 혈소판감소성 자반증 ( TTP ) 및 다른 혈액 응고 질환
본 발명은 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP) 및 다른 혈전성 미세혈관병증을 포함하고 이로 제한되지 않는 혈액 응고 질환 (혈전성향증 (thrombophilia))을 감소시키는 그의 능력에 대해 물질을 시험하기 위한 동물 모델 및 방법을 제공한다. TTP는 빈혈, 점상출혈, 및 미시적인 혈뇨가 있는 16세 소녀를 관찰할 때 1924년에 모쉬코위츠에 위해 처음 설명된 치명적인 다발적 전신 질환이다. 이 소녀는 다발성 장기 부전증으로 죽었고, 부검시에 미만성 미세혈관 혈전이 우세하였다. 이들 혈전은 병리학적 진단의 지표가 되고 있다.
TTP 증후군은 그 형성이 응고 시스템 활성에 관련되지 않는 미세혈관병성 용혈 및 혈소판 응집/히알린 혈전을 특징으로 한다. 혈소판 미세혈전이 우세하고; 이들은 신체 전체에 걸친 미세순환 (즉, 세동맥, 모세혈관) 내에서 형성되어 혈관의 부분 폐색을 유발한다. 장기 허혈, 혈소판감소증, 및 적혈구 단편화 (즉, 분열적혈구 증가증)가 발생한다. 혈전은 증식성 내피 세포가 위에 존재하는 혈관강을 부분적으로 폐색시킨다. 신장, 뇌, 심장, 췌장, 비장, 및 부신의 내피가 특히 TTP에 취약하다. 또한, 간, 폐, 위장관, 담낭, 골격근, 망막, 뇌하수체, 난소, 자궁, 및 고환도 보다 작은 정도로 영향받는다. 염증성 변화는 발생하지 않는다.
1982년에, 모아크 (Moake) 및 그의 동료들은 4명의 재발성 TTP 환자의 혈장에서 초고 폰 빌레브란트 인자 (ULVWF) 다량체를 관찰하였다 ([Moake, Semin. Hematol. 34:83-89, 1997]; [Moake, Semin. Hematol. 41:4-14, 2004]). 이들 다량체는 내피 세포에서 관찰된 것과 동일한 크기였다. 정상 개체의 혈장은 훨씬 더 작은 VWF를 갖는다. 모아크는 TTP 환자의 혈장 내에 큰 VWF를 그의 정상 크기로 감소시키는 효소의 결핍증이 존재한다고 제안하였다. 또한, 상기 큰 VWF는 혈전 형성을 매개하는 혈소판에 점착하는 능력이 더 큰 것으로 관찰되었다.
교반된 내피 세포는 혈류 내의 ULVWF 다량체의 주 공급원이고, 여기서 이들은 특이적 표면 혈소판 수용체에 결합한다. ULVWF 다량체는 내피하층에 점착된 혈소판과 얽히게 된다. TTP의 발병기전은 미세혈관계 내의 혈소판 응괴로 인한 것이다. 상기 다량체를 표준화하기 위해 ULVWF의 점착 증가 및 기능성 단백질 분해 효소의 결핍이 존재한다. 미세순환계에서 유체 및 혈소판 혈전의 전단 응력은 ULVWF의 단백질 분해작용을 향상시키지 않는다. 점착성 결합이 혈전 형성을 개시하는 미세혈관병성 유도 혈소판에서 전단 응력을 저지하고 혈소판 활성에 기여하는 방법은 아직 미해결상태이다.
1991년 이래로 혈장 교환이 TTP에 대한 제1선 치료법이었다. 선천성 결핍에서 ADAMTS13 유전자의 결핍 및 돌연변이는 혈장 주입에 의해 대체될 수 있다. 후천성 결핍증에서 ADAMTS13의 억제제는 혈장 분리 교환술에 의해 제거할 수 있다. 그러나, 혈장 교환이 혈장 주입보다 더 효과적인 치료이다.
TTP에서 ADAMTS13 다량체는 풍부하고 피브리노겐/피브린은 최소인 반면, 피브리노겐은 파종성 혈관내 응고 (DIC)에서 풍부하다. ULVWF, 즉, ADAMTS13 다량체는 TTP가 재발할 가능성이 가장 큰 환자의 혈장에서 발견되는 마커이다.
상기 치명적인 병태는 조기에 진단되고 조기에 의료적 치료가 개시되면 양호한 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 TTP의 치료에서 새로운 치료법의 개발에 사용할 동물 모델을 제공한다.
TTP 에 대한 쥐 모델의 설계
재조합 VWF는 내인성 순환 ADAMTS13에 의한 단백질 분해작용에 노출되지 않았기 때문에 무손상 VWF 하위단위로 구성된다. 혈장-유래 VWF는 VWF의 A2 도메인 내의 Tyr1605-MET1606에서 ADAMTS13에 의해 절단되는 하위단위로 구성된다. 따라서, 혈장-유래 VWF 제제, 예를 들어 해메이트® P는 본 발명을 위한 유용한 대조군이다.
초고분자량 다량체는 특수한 환경에서, 예를 들어, DDAVP로 내피 세포의 자극 시에 인간에서 생리적으로 작용한다 (DDAVP는 경증 혈우병 A 및 폰 빌레브란트 질병의 치료제이다). 내피 세포의 자극 시에, 저장된 VWF는 초고 VWF의 형태로 바이벨-펠라드 (Weibel-Palade) 소체로부터 순환계 내로 방출된다. 이들 초고 VWF 다량체는 인간 ADAMTS13에 의한 VWF의 증가된 단백질 분해작용이 동반되어 2시간 내에 사라진다. DDAVP 투여 후에 VWF의 혈장 농도는 약 24시간에 걸쳐 기준선으로 되돌아간다.
인간 인자는 쥐 ADAMTS13에 대해 저항성이기 때문에, 쥐 ADAMTS13은 rVWF의 초고분자량 다량체를 감소시키도록 인간 rVWF를 충분히 절단하지 않는다. 또한, 쥐 ADAMTS13은 내인성 쥐 VWF에 대해서도 감소된 활성을 갖기 때문에, 정상 마우스는 순환계 내에 VWF의 초고분자량 다량체를 갖는다.
ADAMTS13 결핍 마우스에서, 내인성 쥐 VWF는 ADAMTS13의 부재 때문에 초고분자량 다량체로 구성된다. 따라서, 직접적인 또는 도입유전자의 발현을 통한 인간 rVWF의 투여는 초생리학적 순환 수준의 VWF 및 초고 VWF 다량체의 실질적인 증가를 일으킨다.
재조합 단백질 발현
본 발명에 따라 사용할 재조합 VWF는 인간 형태의 VWF 및 그의 다형성 및 대립유전자 변이체, 예를 들어, Genpept 기탁 번호 P04275.1의 서열에 실질적인 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 유사하게, 재조합 인자 VIII는 인간 형태의 응고 인자, 예를 들어 다양한 이소형, 대립유전자, 및 다형성 변이체를 포함한다. 일반적으로, 인자 VIII은 Genpept 기탁 번호 P00451.1의 서열에 실질적으로 동일한 서열을 가질 것이다. 인간 FVIII은 또한 상업적으로 이용가능하다. 재조합 ADAMTS13은 인간 형태의 프로테아제 및 그의 다형성 및 대립유전자 변이체, 예를 들어, Genpept 기탁 번호 Q3SYG5의 서열에 실질적인 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
rVWF, rFVIII, 또는 rADAMTS13 폴리펩티드 및 복합체를 발현하고 얻기 위해 사용될 수 있는 재조합 기술은 당업계에서 통상적인 기술이다. 본 발명에서 유용한 일반적인 방법을 개시하고 있는 기본 교재는 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)]을 포함한다.
일반적으로, 관심있는 단백질 (예를 들어, VWF, FVIII, 및 ADAMTS13)을 코딩하는 핵산 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리 (library)로부터 클로닝되거나, 또는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 증폭 기술을 사용하여 단리된다. 예를 들어, 코딩 서열은 핵산 프로브와 혼성화함으로써 인간 핵산 (게놈 또는 cDNA) 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 프라이머를 사용하는 증폭 기술이 cDNA 또는 RNA로부터 관심있는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭 및 단리시키기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Dieffenfach & Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual (1995)] 참조).
당업자는 임의의 특정 폴리펩티드 서열이 폴리펩티드의 활성 또는 본 발명에 따른 그의 용도에 해를 끼치지 않을 다형성 또는 대립유전자 변이를 포함할 수 있음을 이해할 것이다.
관심있는 단백질 (예를 들어, VWF, FVIII, ADAMTS13)의 고수준 발현을 달성하기 위해서, 일반적으로 상기 인자를 코딩하는 서열의 전사를 지시하기 위해 강한 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 서브클로닝한다. 상기 기술은 당업계에 잘 공지되어 있고, 일반적으로 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)]; 및 [Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989)]에 기재되어 있다.
단백질은 임의의 종류의 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 세균 프로모터는 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al.] 및 [Ausubel et al.]에 기재되어 있다. 단백질을 발현시키기 위한 세균 발현 시스템은 예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli), 바실루스 종 (Bacillus sp .), 및 살모넬라 (Salmonella)에서 이용가능하다 ([Palva et al., Gene 22:229-235,1983]; [Mosbach et al., Nature 302:543-545, 1983]). 상기 발현 시스템에 대한 키트는 상업적으로 이용가능하다.
다른 미생물, 예를 들어 효모 (예를 들어, 사카로마이세스 (Saccharomyces))가 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 효모는 원하는 경우에 발현 제어 서열, 예를 들어 프로모터, 예를 들어 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 해당 효소, 및 복제 기점, 종결 서열 등을 갖는 적합한 벡터의 숙주를 갖는다.
또한, 포유동물 세포 배양액은 재조합 폴리펩티드의 발현 및 생산을 위해 사용될 수 있다 ([Winnacker, "From Genes to Clones", VCH Publishers, New York (1987)] 참조). 포유동물 세포는 HEK-293 세포, HUVEC, EA.hy926, CMK 세포, CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주 등을 포함한다. 이들 세포에 대한 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예를 들어 복제 기점, 프로모터, 인핸서 (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49-68,1986), 및 필요한 프로세싱 정보 부위, 예를 들어 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결인자 서열을 포함할 수 있다. 발현 제어 서열은 SV40, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스, 사이토메갈로바이러스 등으로부터 유도된 프로모터를 포함한다. 선택가능 마커, 예를 들어 neo 발현 카세트 (cassette)가 또한 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.
이어서, 관심있는 단백질 (예를 들어, VWF, FVIII 또는 ADAMTS13)은 통상적인 방법을 이용하여 다른 오염 단백질 및 물질로부터 단리될 수 있다. 단백질 정제 기술은 예를 들어, 용해도를 이용하는 방법 (예를 들어, 염 침전 및 용매 침전), 분자량의 차이를 이용하는 방법 (예를 들어, 투석, 한외여과, 겔-여과, 및 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동), 전하의 차이를 이용하는 방법 (예를 들어, 이온-교환 컬럼 크로마토그래피), 특이적 상호작용을 이용하는 방법 (예를 들어, 친화도 크로마토그래피), 소수도의 차이를 이용하는 방법 (예를 들어, 역상 고성능 액체 크로마토그래피) 및 등전점의 차이를 이용하는 방법 (예를 들어, 등전 집중 (isoelectric focusing) 전기영동)을 포함한다. 참조 문헌은 문헌 [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer Press, 3d edition (1994)] 및 [Abelson et al., Methods in Enzymology, Volume 182: Guide to Protein Purification, Academic Press (1990)]을 포함한다.
rVWF 조성물의 투여
본 발명의 rVWF 조성물은 상이한 경로, 예를 들어 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 경점막, 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다.
조성물은 일반적으로 당업계에 통상적인 바와 같이 정맥내, 예를 들어, 꼬리 정맥을 통해 주사된다. 주사를 위해, 조성물은 멸균 생리학상 적합한 버퍼 또는 용액, 예를 들어 염수 용액, 행크 (Hank) 용액, 또는 링거 용액 내에 제형화된다. 또한, 화합물은 고체 형태로 제형화되고 사용 직전에 재용해되거나 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태가 또한 사용될 수 있다.
경점막 투여를 위해, 투과할 장벽에 적절한 침투제가 제형 내에 사용된다. 그러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 경점막 투여를 위해 담즙 염 및 푸시딘산 유도체를 포함한다. 또한, 투과를 용이하게 하기 위해 세제가 사용될 수 있다. 경점막 투여는 스프레이, 펌프, 분무기 (atomizer), 또는 연무기 (nebulizer)를 통해 수행될 수 있다.
동물에서 rVWF 의 트랜스제닉 발현
일부 실시양태에서, 본 발명은 TTP에 대한 모델로서 재조합 VWF를 발현하는 비-인간 동물을 제공한다. TTP 증상을 예방 또는 감소시키기 위해 효과적인 생물학적 활성제를 개발하기 위해 트랜스제닉 동물이 사용될 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명의 트랜스제닉 동물은 동물의 게놈 내로 안정하게 통합된 VWF를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 보유하고, 여기서 VWF는 고분자량 다량체를 형성한다. 일반적으로, VWF 도입유전자는 외인성 공급원, 즉, 도입유전자를 발현하는 것과 상이한 동물로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, VWF는 재조합 인간 VWF이다.
"트랜스제닉 동물"은 하나 이상의 세포가 통상적인 트랜스제닉 기술을 이용하여 도입된 이종성 핵산을 함유하는 임의의 비-인간 동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 다른 설치류, 돼지, 또는 영장류)를 나타낸다. 핵산은 신중한 유전자 조작, 예를 들어 미세주사에 의한 또는 재조합 바이러스로의 감염에 의한 세포의 전구체 내로의 도입에 의해, 직접 또는 간접적으로 세포 내로 도입된다. 용어 유전자 조작은 고전적인 교잡 (crossbreeding), 또는 시험관내 수정을 포함하지 않고, 대신에 재조합 DNA 분자의 도입을 나타낸다. 상기 분자는 염색체 내에 통합될 수 있거나, 염색체 외에서 복제하는 DNA일 수 있다.
본 발명은 그들의 모든 세포 내에 목적하는 도입유전자를 보유하는 트랜스제닉 동물, 및 그들의 세포의 전부가 아니라 일부 내에 도입유전자를 보유하는 동물, 즉, 모자이크 (mosaic) 동물을 고려한다. 도입유전자는 단일 카피로서 또는 콘카타머 (concatamer), 예를 들어, 머리-투-머리 탠덤 (tandem) 또는 머리-투-꼬리 탠덤으로 통합될 수 있다. 도입유전자는 또한 특정 조직 또는 세포 종류 (예를 들어, 내피 세포, 거핵구, 내피하 세포) 내로 선택적으로 도입되거나 그 내부에서 선택적으로 활성화될 수 있다. 그러한 세포 종류 특이적 활성화에 필요한 조절 서열은 당업자에게 자명할 것이다.
도입유전자는 유전자 표적화를 이용하여 내인성 상대물의 염색체 부위 내로 통합될 수 있다. 간단히 설명하면, 상기 기술이 이용되어야 할 때, 내인성 상대물에 상동성인 일부 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터를 염색체 서열과의 상동성 재조합을 통해 내인성 유전자의 뉴클레오티드 서열 내에 통합시키고 그의 기능을 파괴하기 위한 목적으로 설계한다.
배아 미세조작을 위한 기술의 진보로 현재 수정된 포유동물 난자 내로 이종성 DNA의 도입이 또한 가능해졌다. 예를 들어, 전능성 (totipotent) 또는 만능 (pluripotent) 줄기 세포는 미세주사, 인산칼슘 매개 침전, 리포좀 융합, 레트로바이러스 감염 또는 다른 수단에 의해 형질전환될 수 있다. 이어서, 형질전환된 세포는 배아 내로 도입되고, 이후 배아는 트랜스제닉 동물로 발달할 것이다. 일부 실시양태에서, 발달하는 배아를 VWF 도입유전자를 함유하는 바이러스 벡터로 감염시켜, 감염된 배아로부터 도입유전자를 발현하는 트랜스제닉 동물이 생산될 수 있도록 한다. 일부 실시양태에서, VWF 도입유전자를 바람직하게는 단일 세포 기에 배아의 전핵 (pronucleus) 또는 세포질 내로 주사하고, 배아를 성숙 트랜스제닉 동물로 발달시킨다. 트랜스제닉 동물을 생성하기 위한 이들 및 다른 변이 방법은 당업계에 잘 확립되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,175,385 및 5,175,384 참조).
트랜스제닉 동물은 "낙아웃" 및 "낙인 (knockin)"을 포함한다. "낙아웃"은 표적 유전자의 기능을 감소시키는 트랜스제닉 서열의 도입을 통한 표적 유전자의 변경을 갖고, 그에 의해 일반적으로 표적 유전자 발현은 무의미하거나 검출불가능하게 된다. "낙인"은 예를 들어, 추가의 카피의 표적 유전자의 도입에 의해, 또는 내인성 카피의 표적 유전자의 향상된 발현을 제공하는 조절 서열을 작동가능하게 삽입함으로써, 표적 유전자의 증대된 발현을 일으키는 숙주 세포 게놈 내의 변경을 갖는 트랜스제닉 동물이다. 낙인 또는 낙아웃 트랜스제닉 동물은 표적 유전자에 관하여 이종접합성 또는 동종접합성일 수 있다. 낙아웃 및 낙인은 모두 "바이제닉 (bigenic)"일 수 있으며, 즉, 2개 이상의 변경된 유전자를 갖는다. 예를 들어, 바이제닉 동물은 rVWF 낙인 및 ADAMTS13 낙아웃을 포함할 수 있다.
트랜스제닉 마우스는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 유도할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 1988]; [Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, Robertson, ed., 1987]; 및 [Capecchi et al., Science 244:1288, 1989] 참조).
본 발명의 동물
본 발명은 직접적인 또는 트랜스제닉 발현을 통한 재조합 VWF의 투여에 의해 확립될 수 있는 TTP의 동물 모델을 포함한다. 설치류가 저렴하고, 빨리 생식하고, 매우 작은 시설 내에 다수로 수용될 수 있으므로, 마우스가 일반적으로 사용된다. 다른 설치류, 예를 들어 래트, 햄스터, 게르빌루스 쥐 (gerbil), 기니 피그 등이 또한 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 실험은 매우 많은 복제물을 사용하여 수립될 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 마우스는 통상적인 실험실 동물주, 예를 들어 C57BL/6J, Balb-c, 및 FVB 주를 포함한다. 그러한 마우스는 잭슨 랩스 (Jackson Labs, 미국 메인주 바 하버)로부터 쉽게 이용가능하다.
면역결핍 마우스 및 다른 설치류가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이들 마우스 또는 설치류에는 기능성 면역계가 결여되고, 예를 들어 SCID, RAG 1 또는 2 낙아웃, 및 누드 마우스를 포함한다. 그러한 마우스 또는 설치류는 예를 들어, 마우스 또는 설치류에 외인성 물질을 도입하는 염증성 또는 면역 효과를 배제하기 위해 유용할 수 있다. 다시, 그러한 마우스는 상업적인 공급원으로부터 쉽게 이용가능하다.
또한, 인간화 설치류, 예를 들어 인간화된 마우스, 래트, 햄스터, 게르빌루스 쥐, 기니 피그 등이 사용될 수 있다. 인간화 설치류, 예를 들어 마우스는 초기에 동물에 이식되어 성장된 기능성 인간 유전자, 세포, 조직 및/또는 장기를 보유한다. 본질적으로 인간의 면역계를 갖는 인간화 설치류, 예를 들어 마우스가 종종 생성된다. 그러한 마우스는 예를 들어, 치료 물질에 대한 인간 반응을 결정하기 위해 유용하다. 예를 들어, 골수/간/흉선 또는 "BLT" 마우스에 있어서, SCID-hub 시스템에서와 같이 비-비만 당뇨병 (NOD)/SCID 마우스 (내인성 T 및 B 세포가 결여됨)에게 태아 흉선 및 간 또는 가노이드 (ganoid)를 수술에 의해 이식한다. 이어서, 마우스를 치사량 미만으로 방사선 조사하고, 태아 간에서 입수한 자가 CD34+ 줄기 세포를 이식한다. 이어서, 이들 세포는 쥐 골수 내에 계속 체류한다. 따라서, 마우스는 골수 이식을 겪어서, 그들의 인간 흉선 및 간 이식물에 자가성인 인간 줄기 세포를 받는다. 상기 방식으로 제조된 설치류, 예를 들어 마우스는 말초 혈액 내에 인상적인 범위의 인간 세포, 예를 들어 성숙 T 및 B 림프구, 단핵구, 대식세포, 및 수지상 세포를 보여준다. 마찬가지로 중요하게는, 이들은 인간 세포에 의한 간, 폐 및 위장관을 비롯한 장기 및 조직의 광범한 침윤을 보여준다. 인간화 설치류, 예를 들어 마우스는 당업계에 공지되어 있고 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Gonzales and Cheung (Aug. 5, 2008) J. Pharmacol. Exp. Ther.]; [Ito et al. (2008) Current Topics in Microbiology and Immunology, Springer-Verlag, Berlin and Heidelberg, p. 53-76]; [Schmidt et al. (2008) PLoS ONE 3:e3192] 참조).
상기 설명된 바와 같이, 그러한 설치류는 도입유전자를 발현하거나 내인성 유전자를 파괴하도록 유전적으로 변경될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시양태에서, ADAMTS13 결핍 마우스 또는 다른 설치류 (예를 들어, ADAMTS13 낙아웃 마우스)가 사용된다. 일부 실시양태에서, 내인성 VWF가 결여되는 (VWF 낙아웃) 마우스 또는 다른 설치류가 사용된다. 이중 낙아웃 (ADAMTS13-/- 및 VWF-/-)이 사용될 수 있다.
ADAMTS13 낙아웃 마우스는 초기에 유전자 표적화를 이용하여 생성되었다 ([Banno et al., Blood 107:3161-66, 2006]; [Desch et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 27:1901-08, 2007]). 이들 마우스는 광범하게 특성 결정되었고, 공개적으로 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Miyata et al., Curr. Opin. Hematol. 14:277-83, 2007]; [Chauhan et al., Blood 111:3452-57, 2008]; [Chauhan et al., J. Exp. Med. 205:2065-74, 2008] 참조). ADAMTS13 결핍 마우스는 생존가능하고 가임성이지만, 혈전증에 대해 감수성이다. 그러나, 자발성 혈소판감소증, 용혈성 빈혈, 및 미세혈관 혈전증은 일반적으로 관찰되지 않는다. 이들 증상의 일부는 예를 들어, FeCl3 또는 시가독소 (Shigatoxin)를 낙아웃 마우스에게 투여함으로써 유발될 수 있다 (Chauhan et al., Blood 111:3452-57, 2008).
VWF 낙아웃 마우스도 당업계에 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, 문헌 [Pergolizzi et al., Blood 108:862-69, 2006] 참조). VWF 낙아웃 마우스는 생존가능하고 가임성이고, 임의의 총체적 신체 또는 행동 이상을 보이지 않는다. 그러나, 이들은 연장된 출혈 시간 및 간헐적 자발성 출혈을 특징으로 하는 지혈의 결함을 나타낸다. 낙아웃은 또한 혈관 손상 후에 혈전 형성이 결여되고, FVIII 수준은 감소된다.
시험 물질 또는 화합물
본 발명의 동물 모델에 대해 시험할 물질 또는 화합물 (또는 "조성물")은 임의의 작은 화학적 화합물, 또는 거대분자, 예를 들어 단백질, 당, 핵산 또는 지질일 수 있다. 일반적으로, 시험 화합물은 작은 화학적 분자 및 펩티드일 것이다. 본질적으로 임의의 화학적 화합물이 본 발명의 상기 측면에서 시험 화합물로서 사용될 수 있지만, 종종 수성 또는 유기 (예를 들어, DMSO계) 용액에 용해될 수 있는 대부분의 화합물이 사용된다.
예시적인 시험 물질 또는 화합물 (또는 "조성물)은 VWF의 고분자량 복합체를 표적으로 하는 프로테아제, 예를 들어 ADAMTS13, 활성을 보유하는 ADAMTS13 변이체, 및 종 상동체를 포함한다. 상기 폴리펩티드 조성물은 관심있는 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 벡터를 사용하여 (예를 들어, 아데노바이러스 벡터 내에서) 설계될 수 있다. 시험 조성물은 또한 VWF의 응집을 저해하는 펩티드, 항체 단편, 및 소분자를 포함한다. 추가의 조성물은 VWF 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 안티센스 RNA, siRNA 등)의 발현을 저해하는 화합물을 포함한다. 다른 예는 TTP를 치료하기 위해 사용될 수 있는 소분자, 예를 들어 당코르티코이드, 항혈소판 의약 (예를 들어, 아스피린, 디피리다몰), 아조티프린, 시클로포스파미드, 프로스타시클린 등이다.
안티센스에 관하여, siRNA 또는 리보자임 올리고뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 포스포디에스테르 연결기뿐만 아니라 헤테로환 또는 당의 변형은 효율을 증가시킬 수 있다. 포스포디에스테르 연결기를 변형하기 위해 포스포로티오에이트가 사용된다. N3'-P5' 포스포르아미데이트 연결기는 뉴클레아제에 대한 안정화 올리고뉴클레오티드로서 및 RNA에 대한 결합을 증가시키는 것으로 설명되었다. 펩티드 핵산 (PNA) 연결기는 리보스 및 포스포디에스테르 백본을 완전히 교체하고, 뉴클레아제에 안정하고, RNA에 대한 결합 친화도를 증가시키고, RNAse H에 의한 절단을 허용하지 않는다. 그의 기본 구조는 또한 안티센스 성분으로서 그의 최적화를 허용할 수 있는 변형이 가능하다. 헤테로환의 변형에 관하여, 특정 헤테로환 변형은 RNAse H 활성을 저해하지 않으면서 안티센스 효과를 증대하는 것으로 입증되었다. 그러한 변형의 예는 C-5 티아졸 변형이다. 마지막으로, 당의 변형이 고려될 수 있다. 2'-O-프로필 및 2'-메톡시에톡시 리보스 변형은 세포 배양액 내에서 및 생체 내에서 올리고뉴클레오티드를 뉴클레아제에 대해 안정화시킨다.
예를 들어, VWF 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 대한 시험 화합물의 결합에 대한 효능 분석은, 큰 화학적 라이브러리가 일반적으로 평행으로 실행되는 자동화 분석 단계를 이용하여 스크리닝되도록 (예를 들어, 로봇식 분석으로 미세역가판 상에서 미세역가 포맷으로) 설계될 수 있다. 시그마 (Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스), 알드리치 (Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스), 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트루이스), 플루카 케미카-바이오케미카 아날리티카 (Fluka Chemika-Biochemica Analytika, 스위스 부크스) 등을 비롯한 화학적 화합물의 많은 공급회사가 존재함이 이해될 것이다.
일부 실시양태에서, 매우 많은 시험 화합물을 함유하는 조합 화학적 또는 펩티드 라이브러리를 제공하는 것을 포함하는 고속 (high throughput) 스크리닝 방법이 사용된다. 이어서, 그러한 "조합 화학적 라이브러리"를 목적하는 특징적인 활성을 보이는 라이브러리 구성원 (특정 화학 물질종 또는 하위클래스)를 확인하기 위해 하나 이상의 분석에서 스크리닝한다. 상기 경우에, 그러한 화합물을 VWF의 발현 또는 응집을 감소시키는 그의 능력에 대해 스크리닝한다.
본 발명의 방법은 시험 물질을 포함하는 조성물을 이용한다. 시험 대상에게 본원에서 설명되는 시험 물질 (폴리펩티드, 그의 단편, 및 유사체 또는 변이체 포함)을 포함하는 조성물을 투여하기 위해, 시험 물질을 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물 내에 제형화한다. 어구 "제약상 또는 약물학상 허용되는"은 아래 설명되는 바와 같이 당업계에 잘 공지된 경로를 이용하여 투여될 때 알레르기 반응 또는 다른 유해한 반응을 일으키지 않는 분자 엔티티 (entity) 및 조성물을 나타낸다. "제약상 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
또한, 특정 경우에 시험 물질인 화합물은 물 또는 통상적인 유기 용매와 용매화물을 형성한다. 상기 용매화물이 또한 고려된다.
조성물은 예를 들어 비제한적으로 경구, 국소, 경피, 비경구로, 흡입 스프레이에 의해, 질내, 직장으로, 또는 두개내 주사에 의해 투여된다. 본원에서 사용되는 용어 비경구는 피하 주사, 정맥내, 근육내, 뇌수조내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다. 정맥내, 피부내, 근육내, 유선내, 복강내, 경막내, 안구후, 폐내 주사 및/또는 특정 부위에서 수술적 이식에 의한 투여가 또한 고려된다. 특정 측면에서, 조성물은 발열원 (pyrogen)뿐만 아니라 수여체에 유해할 수 있는 다른 불순물이 본질적으로 없다.
제약 조성물의 제형은 선택된 투여 경로에 따라 다르다 (예를 들어, 용액, 에멀젼). 투여할 조성물을 포함하는 적절한 조성물은 생리학상 허용되는 비히클 또는 담체 내에 제조될 수 있다. 용액 또는 에멀젼을 위해, 적합한 담체는 예를 들어 비제한적으로 수성 또는 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들어 염수 및 완충 매질을 포함한다. 비경구 비히클은 예를 들어 비제한적으로 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거 또는 고정유를 포함한다. 정맥내 비히클은 예를 들어 비제한적으로 다양한 첨가제, 보존제 또는 유체, 영양분 또는 전해질 보충제를 포함한다.
특정 측면에서, 활성 성분으로서 시험 물질을 함유하는, 본 발명의 방법에서 유용한 제약 조성물을 비롯한 조성물은 투여 경로에 따라 제약상 허용되는 담체 또는 첨가제를 함유한다. 상기 담체 또는 첨가제의 예는 비제한적으로 물, 제약상 허용되는 유기 용매, 콜라겐, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐 중합체, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 폴리아크릴산나트륨, 알긴산나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸 전분 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 잔탄검, 아라비아검, 카제인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴 알콜, 스테아르산, 인간 혈청 알부민 (HSA), 만니톨, 소르비톨, 락토스, 제약상 허용되는 계면활성제 등을 포함한다. 사용되는 첨가제는 본 발명의 투여형에 따라 적절하게 상기한 것 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
특정 측면에서, 다양한 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 0.4% 염수, 0.3% 글라이신, 또는 수성 현탁액은 활성 화합물을 수성 현탁액의 제조를 위해 적합한 부형제와의 혼합물로 함유한다. 상기 부형제는 현탁제, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트라가칸트 검 및 아카시아 검이고; 분산제 또는 습윤제는 천연 포스파티드, 예를 들어 레시틴, 또는 알킬렌 옥시드와 지방산, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트와의 축합 생성물, 또는 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜, 예를 들어 헵타데카에틸렌옥시세탄올과의 축합 생성물, 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트로부터 유래된 부분 에스테르와의 축합 생성물, 또는 에틸렌 옥시드와 지방산 및 헥시톨 무수물, 예를 들어 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트로부터 유래된 부분 에스테르와의 축합 생성물일 수 있다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예를 들어 에틸, 또는 n-프로필, p-히드록시벤조에이트를 포함할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 조성물은 저장을 위해 동결건조되고, 사용 전에 적합한 담체 내에 재구성된다. 상기 기술은 통상적인 면역글로불린에서 효과적인 것으로 나타났다. 임의의 적합한 동결건조 및 재구성 기술이 사용된다. 당업자는 동결건조 및 재구성이 가변 정도의 항체 활성 손실을 일으킬 수 있고, 사용 수준은 보충하기 위해 조정되어야 할 수 있음을 이해할 것이다.
물의 첨가에 의해 수성 현탁액의 제조를 위해 적합한 분산가능한 분말 및 과립은 활성 화합물을 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 보존제와의 혼합물로 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제는 상기 이미 언급된 것으로 예시된다.
이들 제형 내의 시험제의 농도는 넓은 범위로, 예를 들어 약 0.5 중량% 미만, 대체로 약 1 중량% 또는 약 1 중량% 이상으로부터 15 또는 20 중량%까지 변하고, 주로 선택된 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등에 기초하여 선택될 것이다. 따라서, 예를 들어, 비경구 주사를 위한 전형적인 제약 조성물은 1 ml 멸균 완충수 및 50 mg의 시험 물질을 함유하도록 구성된다. 정맥내 주입을 위한 전형적인 조성물은 250 ml의 멸균 링거 용액 및 150 mg의 혈액 응고 인자를 함유하도록 구성된다. 비경구 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 자명할 것이고, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1980)]에 보다 상세히 설명되어 있다. 이중특이적 항체의 유효 투여량은 투여당 0.01 mg 내지 1000 mg/kg (체중)이다.
특정 측면에서, 제약 조성물은 멸균 주사가능한 수성, 유성 현탁액, 분산액, 또는 멸균 주사가능 용액 또는 분산액의 임시 제조를 위한 멸균 분말의 형태로 존재한다. 현탁액은 상기 언급된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지의 방법에 따라 제형화된다. 멸균 주사가능한 제제는 1,3-부탄 디올 내의 용액과 같은, 비-독성의 비경구로 허용되는 희석제 또는 용매 내의 멸균 주사가능한 용액 또는 현탁액을 포함한다. 특정 측면에서, 담체는 용매 또는 분산 매질, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 링거 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 멸균 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용된다. 이를 위해, 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 블랜드 고정유가 사용된다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사가능제의 제조에 사용될 수 있다.
모든 경우에, 제형은 멸균되어야 하고, 주사에 의한 투여가 이용되는 경우에 주사가 용이한 정도로 유체이어야 한다. 적합한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예를 들어 레시틴 또는 당업계에 잘 공지된 다른 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지된다. 이는 제조 및 저장의 조건 하에 안정해야 하고, 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 장기 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 모노스테아르산알루미늄 및 젤라틴의 사용에 의해 이루어진다.
투여를 위해 유용한 조성물은 예를 들어 비제한적으로, 그의 효능을 증가시키기 위해 섭취 또는 흡수 인핸서를 사용하여 제형화된다. 상기 인핸서는 예를 들어, 살리실레이트, 글리코콜레이트/리놀레에이트, 글리콜레이트, 아프로티닌, 바시트라신, SDS, 카프레이트 등을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Fix (J. Pharm. Sci., 85:1282-1285, 1996)] 및 [Oliyai et al. (Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:521-544, 1993)] 참조.
또한, 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 고려되는 조성물의 친수성 및 소수성 특성은 잘 균형을 이루고, 그에 의해 시험관내 및 특히 생체내 용도 모두를 위한 그의 효용을 향상시키는 반면, 상기 균형이 없는 다른 조성물은 실질적으로 덜 유용하다. 구체적으로, 본 발명에서 사용하기 위해 고려되는 조성물은 수성 매질 내에 적절한 용해도를 가져서 신체에서 흡수 및 생체이용률을 허용하는 한편, 또한 지질 내에 용해도를 가져서 화합물이 세포막을 가로질러 추정 작용 부위로 횡단하도록 허용한다.
생리학상 허용되는 조성물
본 발명은 TTP에 대한 최초의 타당한 동물 모델을 제공하여, TTP 예방 및 개선을 위한 조성물의 잘 제어되는 시험을 위한 기회를 생성한다. 따라서, 예를 들어, TTP의 예방 또는 개선을 위한 rVWF, FVIII 또는 조성물을 포함하는 생리학상 (또는 제약상) 허용되는 조성물이 본 발명에 포함된다.
일부 실시양태에서, 생리학상 허용되는 조성물은 경구, 복강내, 경피, 피하, 정맥내 또는 근육내 주사, 흡입, 국소, 병변내, 주입; 리포좀-매개 전달; 국소, 직장, 기관지내, 코, 경점막, 장내, 또는 다른 통상적인 수단에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 생리학상 허용되는 조성물은 투여 방법/방식에 따라 다양한 단위 투여형으로 투여될 수 있다. 적합한 단위 투여형은 분말, 정제, 알약, 캡슐, 로젠지, 좌제, 패치, 코 스프레이, 주사가능제, 이식형 지속 방출 제형 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 시험 조성물 및 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함하는 생리학상 허용되는 조성물을 제공한다. 생리학상 (또는 제약상) 허용되는 담체는 생리학상 적합하고 바람직하게는 폴리펩티드 또는 펩티드유사체의 활성을 저해하거나 달리 억제하지 않는 임의의 용매, 분산 매질, 또는 코팅을 포함한다. 담체는 일반적으로 정맥내, 근육내, 경구, 복강내, 경피, 국소, 또는 피하 투여를 위해 적합하다.
생리학상 허용되는 담체는 예를 들어, 조성물을 안정화하거나 시험 물질(들)의 흡수를 증가 또는 감소시키는 작용을 하는 하나 이상의 생리학상 허용되는 화합물(들)을 함유할 수 있다. 생리학상 허용되는 화합물은 예를 들어, 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 수크로스, 또는 덱스트란, 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이팅제, 저분자량 단백질, 활성 물질의 청소 또는 가수분해를 감소시키는 조성물, 또는 부형제 또는 다른 안정화제 및/또는 버퍼를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 제약상 허용되는 담체는 생리학적 염수이다. 다른 생리학상 허용되는 담체 및 그의 제형은 잘 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science (18th Ed., ed. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990)]에 일반적으로 기재되어 있다. 다양한 제약상 허용되는 부형제는 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients (4th ed., Ed. Rowe et al., Pharmaceutical Press, Washington, D.C.)]에서 찾을 수 있다. 다시, 제약 조성물은 용액, 미세에멀젼, 리포좀, 캡슐, 정제 또는 다른 적합한 형태로 제형화될 수 있다. 활성 성분을 표적 작용 부위에 도달하기 전에 환경에 의한 불활성화로부터 보호하기 위해 물질 내에 코팅할 수 있다.
일부 실시양태에서, 생리학상 허용되는 조성물을 전달하기 위해 이식된 장치 (예를 들어, 동맥 및 정맥내 스텐트 (stent), 예를 들어 용출 스텐트, 및 카테터)가 사용된다. 예를 들어, 생리학상 허용되는 조성물을 포함하는 수용액이 스텐트 및 카테터를 통해 직접 투여된다. 적합한 스텐트는 예를 들어, 미국 특허 6,827,735; 6,827,735; 6,827,732; 6,824,561; 6,821,549; 6,821,296; 6,821,291; 6,818,247; 6,818,016; 6,818,014; 6,818,013; 6,814,749; 6,811,566; 6,805,709; 6,805,707; 6,805,705; 6,805,704; 6,802,859; 6,802,857; 6,802,856; 및 6,802,849에 기재되어 있다. 적합한 카테터는 예를 들어 미국 특허 6,829,497; 6,827,798; 6,827,730; 6,827,703; 6,824,554; 6,824,553; 6,824,551; 6,824,532; 및 6,819,951에 기재되어 있다.
상승된 혈청 반감기는 지속 방출 폴리펩티드 "패키징 (packaging)" 시스템의 사용에 의해 유지될 수 있다. 상기 지속 방출 시스템은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 단백질 및 폴리펩티드에 대한 ProLease 생분해성 미세구 전달 시스템이 사용되고 ([Tracy, Biotechnol. Prog., 14:108 (1998)]; [Johnson et al., Nature Med., 2:795 (1996)]; [Herbert et al., Pharmaceut. Res., 15:357 (1998)]), 이것은 다른 물질과 함께 또는 그 없이 건조 제형으로서 화합될 수 있는 중합체 매트릭스 내에 폴리펩티드를 함유하는 생분해성 중합성 미세구로 구성된 건조 분말의 사용을 포함한다.
올리고뉴클레오티드 (예를 들어, 단백질-코딩 또는 억제성)는 직접적인 형질감염 또는 형질감염 및 발현 벡터를 통한 발현에 의해 전달될 수 있다. 적절한 발현 벡터는 숙주 세포 내에서 발현을 일으키는 프로모터를 비롯한 적절한 조절 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 클로닝된 포유동물 발현 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다. 적합한 프로모터는 구성적 또는 발생-특이적 프로모터일 수 있다. 형질감염 전달은 당업계에 공지된 리포좀 형질감염 시약 (예를 들어, 엑스트림 (Xtreme) 형질감염 시약 (로슈 (Roche, 미국 캘리포니아주 알라메다)); 리포펙타민 제형 (인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드))에 의해 달성할 수 있다. 양이온성 리포좀, 레트로바이러스 벡터에 의해 매개된 전달 및 직접적인 전달이 효율적이다. 다른 가능한 전달 방식은 표적 세포에 대해 세포 표면 마커에 대한 항체를 사용하여 표적화하는 것이다.
형질감염을 위해, 하나 이상의 핵산 분자 (벡터 내에 또는 벡터 없이)를 포함하는 조성물은 동물에의 투여를 위한 전달 비히클, 예를 들어 리포좀, 담체 및 희석제 및 그의 염을 포함할 수 있고/있거나 제약상 허용되는 제형으로 존재할 수 있다. 핵산 분자의 전달 방법은 예를 들어 각각이 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Gilmore, et al., Curr. Drug Delivery (2006) 3:147-5] 및 [Patil, et al., AAPS Journal (2005) 7:E61-E77]에 기재되어 있다. siRNA 분자의 전달은 또한 각각의 개시내용이 본원에 참조로 포함되는 몇몇 미국 특허 공개, 예를 들어, 2006/0019912; 2006/0014289; 2005/0239687; 2005/0222064; 및 2004/0204377에 기재되어 있다. 핵산 분자는 당업자에게 공지된 다양한 방법, 예를 들어 비제한적으로 리포좀 내의 캡슐화, 이온영동법, 전기천공에 의해, 또는 다른 비히클, 예를 들어 생분해성 중합체, 히드로겔, 시클로덱스트린 (예를 들어, 문헌 [Gonzalez et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10:1068-1074]; PCT 국제 특허 출원 공개 WO03/47518 및 WO03/46185 (Wang et al.) 참조), 폴리(락틱-코-글리콜릭)산 (PLGA) 및 PLCA 미세구 (예를 들어, 미국 특허 6,447,796 및 미국 특허 출원 공개 2002/130430 참조), 생분해성 나노캡슐, 및 생체접착성 미세구 내로의 혼입에 의해, 또는 단백질성 벡터 (국제 특허 출원 PCT 공개 WO00/53722 (O'Hare and Normand))에 의해 세포에 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 핵산 분자는 또한 폴리에틸렌이민 및 그의 유도체, 예를 들어 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-N-아세틸갈락토사민 (PEI-PEG- GAL) 또는 폴리에틸렌이민-폴리에틸렌글리콜-트리-N-아세틸갈락토사민 (PEI-PEG-triGAL) 유도체를 사용하여 제형화 또는 복합체화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 서열은 바이러스 발현 벡터를 통해 세포 내로 전달된다. 그러한 분자를 세포로 전달하기 위해 적합한 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 벡터, 및 레트로바이러스 벡터 (렌티바이러스 벡터 포함)를 포함한다. 예를 들어, siRNA 올리고뉴클레오티드를 전달 및 발현시키기 위해 개발된 바이러스 벡터는 예를 들어, 젠디텍트 (GeneDetect, 미국 플로리다주 브래덴튼); 앰비온 (Ambion, 미국 텍사스주 오스틴); 인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼스바드); 오픈 바이오시스템즈 (Open BioSystems, 미국 알라바마주 헌츠빌); 및 임제넥스 (Imgenex, 미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 상업적으로 이용가능하다.
TTP 의 증상에 대한 시험 조성물의 효과의 결정 방법
본 발명은 TTP에 대한 최초의 동물 모델을 제공하여, TTP 예방 및 개선을 위한 조성물의 잘 제어되는 시험을 위한 기회를 생성한다. 다음 명세서는 본 발명의 동물 모델에 적용할 수 있는 관찰 및 분석의 몇몇을 설명한다.
본 발명의 동물 모델에서 관찰될 수 있는 TTP 증상은 행동 증상, 예를 들어 혼란, 털세움, 행동 저하 및 운동실조증을 포함한다. TTP의 혈액학적 및 혈청화학적 증상은 감소된 혈소판 계수, 감소된 적혈구 용적률, 및 증가된 크레아티닌 키나제, 크레아티닌 및 락테이트 데히드로게나제를 포함한다. 용어 "증가" 및 "감소"는 비-TTP 대조군, 예를 들어, 정상 조건 하의 동물에 비교하여 결정된다. 관찰할 수 있는 조직병리학적 증상은 다양한 장기 및 조직, 특히 심장에서 미세혈전 또는 괴사를 포함한다. 추가의 현미경 및 육안 TTP 증상은 실시예 섹션에 기재되어 있다.
용혈의 양은 혈장 내의 헤모글로빈 수준을 측정함으로써 결정할 수 있다. 정상보다 더 높은 수준은 TTP와 연관된 것과 같은 RBC 용해를 표시한다. 따라서, 본 발명의 마우스 또는 다른 설치류 모델에서 관찰된 것에 비해 혈장 헤모글로빈의 감소는 시험 화합물이 TTP를 효과적으로 개선함을 나타낸다.
혈장 헤모글로빈 수준은 예를 들어, 부드러운 원심분리에 의해 세포성 혈액 성분을 분리한 후 시각적으로 측정할 수 있다. 전통적인 방법은 또한 예를 들어, 문헌 [Crosby and Furth (1956) Blood 11:380]에 기재된 바와 같이 벤지딘 (Benzidine) 기술을 포함한다. 혈장 헤모글로빈은 또한 문헌 [Kruszyna et al. (1977) Clin. Chem. 23:2156-59]에 기재된 방법을 이용하여 (세포성 성분의 분리가 인간보다 더 도전적일 수 있는) 설치류에서 특이적으로 측정할 수 있다. 간단히 설명하면, 철시안화물을 혈액의 혈장 부분에 첨가하고, 540 nm에서 흡광도를 측정한다. 이어서, 시안화물을 용액에 첨가하고, A540을 재측정한다. 이어서, A1을 A2로부터 공제하여 유리 헤모글로빈의 양을 결정한다. 추가의 방법은 당업계에 공지되어 있다.
적혈구 용적률은 적혈구 (RBC)가 차지하는 혈액 부피의 비율의 측정치이고, 총 혈액 부피의 백분율로서 표현된다. 이것은 예를 들어, 부피 표시가 있는 관 내에서 혈액을 부드럽게 원심분리함으로써 비교적 간단하게 측정할 수 있다. 저변 (최중량)층은 RBC로 구성되고, 이어서 보다 작은 층의 백혈구이고, 최상층은 무-세포 혈장 성분이다. 자동화 적혈구 용적률 분석기가 상업적으로 이용가능하고, 종종 보다 정확한 판독치를 제공한다. 마우스에서 적혈구 용적률은 일반적으로 약 38-45 범위이다. 정상보다 더 낮은 적혈구 용적률은 RBC 용해를 표시하고, TTP와 연관된다.
혈소판 계수는 통상적인 실험실 기술을 이용하여, 예를 들어 혈구계 상에서 계수함으로써 달성할 수 있다. 별법으로, 전자 혈액 분석기가 사용될 수 있다. 2가지 종류의 전자 계수 시스템, 즉, 전압-펄스 및 전기-광학 계수 시스템이 존재한다. 두 시스템 모두에서, 수집된 혈액을 희석하고, 혈액을 전자 계수기를 통해 통과시킴으로써 계수한다. 기기를 혈소판에 대해 적합한 크기 범위 내의 입자만을 계수하도록 설정한다. 크기 범위의 상한 및 하한 수준은 크기 배제 한계로 불린다. 크기 배제 한계보다 더 크거나 더 작은 임의의 세포 또는 물질은 계수되지 않을 것이다. 정상 범위는 일반적으로 150,000-450,000/□l (혈액)이다. 높은 혈소판 계수는 보통 혈소판 병태와 연관되지만, TTP는 일반적으로 낮은 혈소판 계수를 특징으로 한다.
크레아티닌 수준은 일반적으로 신장 기능을 결정하기 위해 검출된다. 정상 범위는 대체로 약 50 내지 120 μmol/리터 (혈액)이지만, TTP에서 일반적으로 상승된다. 신장은 고도로 혈관이 발달된 장기이므로, 유의한 수의 TTP 환자는 신 부전증을 겪는다. 크레아티닌 키나제 (CK)는 주로 심장 및 골격근 및 뇌에서 발견되는 효소이다. CK는 주로 세포 내에 존재하므로, 정상보다 더 높은 CK 수준은 TTP와 연관된 것과 같은 조직 및 세포 손상을 표시한다. 혈액 크레아티닌 키나제는 일반적으로 약 15-180 단위/리터 (혈액)으로 존재한다. 크레아티닌 및 CK 수준은 모두 일반적으로 자동화 혈액 분석 장비를 이용하여 측정한다.
락토스 데히드로게나제 수준은 용혈의 또 다른 표시자이고, 일반적으로 TTP 환자에서 극도로 높다. 상승된 LDH 수준 및 용혈은 또한 고빌리루빈혈증 (혈액 내 담즙) 및 낮은 합토글로불린 (haptoglobulin) 수준과 연관된다. LDH는 예를 들어, 문헌 [J. Clin Lab. Invest. 33: 291-306 (1974)]에 기재되어 있는 바와 같이 간접적인 효소에 의한 분광분석 방법을 이용하여 측정할 수 있다. LDH는 pH 8.8-9.8에서 락테이트에서 피루베이트로의 반응을 촉매하면서, NADH를 동시에 생산한다. 이어서, NADH를 340 nm에서 분광광도법으로 측정하고, LDH를 비례적으로 계산한다. LDH 수준은 정상적으로 약 100-250 U/리터 (혈액) 범위이다.
추가의 증상은 열, 신 부전증, 황달의 징후 (황색을 띈 눈 또는 피부), 및 빈혈의 징후, 예를 들어 낮은 헤모글로빈 수준 및 진한색 소변을 포함할 수 있다. 발작이 일어날 수 있고, 또한 심장 부정맥 또는 심 부전증이 일어날 수 있다.
일부 실시양태에서, 시험 조성물은 TTP 동물 모델에서 관찰된 적어도 하나의 TTP 증상의 중증도 감소 또는 증상 발생의 지연을 일으킨다. 일부 실시양태에서, TTP 증상의 중증도는 적어도 5%, 예를 들어, 10%, 20%, 30% 또는 그 초과로 감소된다. 일부 실시양태에서, 시험 조성물은 증상을 제거할 것이고, 즉, 적절한 대조군에 비해 증상의 중증도를 통계상 무의미하게 감소시킬 것이다.
일반적으로, 특정 시험 조성물의 연구에서는 예를 들어, 투여를 위해 사용된 버퍼의 배경 효과를 배제하기 위해 적절한 대조군을 포함한다. 적절한 대조군의 예는 실시예 섹션에 기재되어 있다. 예를 들어, 시험 조성물 연구에서는 시험 조성물 버퍼를 단독으로 사용하는 조건에 비해 시험 조성물을 사용한 조건을 포함할 수 있다. 이들 조건은 본원에서 설명되는 임의의 동물 모델에서 시험될 수 있다.
동물 모델
일반적으로, 본 발명의 동물은 인간을 제외한 임의의 종을 포함한다. 마우스, 래트, 토끼, 양, 햄스터, 게르빌루스 쥐, 기니 피그 및 돼지와 같은 종을 포함하고, 방법이 개발될 때, 소 및 비-인간 영장류를 포함한 포유동물이 특히 중요하다. 하나의 측면에서, 동물은 마우스이다. 추가의 측면에서, 마우스는 동물주 C57BL/6J의 것이다.
또 다른 추가의 측면에서, 본 발명의 동물은 적어도 하나의 외래 유전자가 게놈 내로 삽입되거나 게놈에서 낙아웃된 유전적으로 변형된 동물이다. 상기 트랜스제닉 동물은 세포성 수준에 대한 조절 과정이 다른 시험 시스템을 사용하여 달성가능하지 않은 전신적 및 특이적 방식으로 검사되고 영향을 받도록 허용한다. 상기한 종류의 트랜스제닉 동물은 치료 시험 물질의 투여의 생체내 효과를 분석하기 위해 유용하다. 하나의 측면에서, 본 발명의 트랜스제닉 동물은 VWF-결핍 동물을 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명의 트랜스제닉 동물은 ADAMTS13-결핍 동물을 포함한다.
트랜스제닉 동물은 또한 추정 내성 숙주 면역계의 환경에서 항-자가 항체의 발달을 일으키는 것에 대한 시험 물질의 효과를 평가하기 위한 모델로서 역할을 한다. 그러한 이해는 TTP, VWD 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 혈액 응고 질환의 치료를 위한 물질의 설계 및 시험에 필수적이다.
본원에서 도입유전자는 천연 조절 (발현 제어) 서열이 측면에 접하거나 이종성 서열, 예를 들어 프로모터, 내부 리보좀 진입 부위 (IRES) 및 다른 리보좀 결합 부위 서열, 인핸서, 반응 요소, 억제자, 신호 서열, 폴리아데닐화 서열, 인트론, 5'- 및 3'-비-코딩 구역 등과 회합된 인간 혈액 응고 인자 또는 다른 단백질에 대한 코딩 서열 (예를 들어, cDNA, 합성 코딩 서열, 또는 게놈 DNA)을 포함한다. 특정 측면에서, 코딩 서열은 당업계에 공지된 많은 수단에 의해 변형된다. 그러한 변형의 비제한적인 예는 유사체를 사용한 하나 이상의 천연 생성 뉴클레오티드의 메틸화, "캡 (cap)", 치환, 및 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어, 대전되지 않은 연결기 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카르바메이트 등) 및 대전된 연결기 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)를 사용하는 변형을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 비제한적으로 하나 이상의 추가의 공유 연결된 모이어티, 예를 들어, 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-라이신 등), 삽입제 (intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유한다. 특정 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 메틸 또는 에틸 포스포트리에스테르 또는 알킬 포스포르아미데이트 연결기의 형성에 의해 유도체화된다. 또한, 본원에서 폴리뉴클레오티드는 다시 특정 측면에서, 직접 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 표지로 변형된다. 예시적인 표지는 방사성 동위원소, 형광 분자, 비오틴 등을 포함한다.
유전자 발현의 제어는 당업계에 잘 공지된 다양한 수단에 의해 달성된다. 도입유전자의 발현은 별법으로 구성적이거나, 일반적으로 주어진 조건 세트, 예를 들어, 주어진 화합물의 존재, 또는 명시된 물질, 또는 조직 종류 또는 온도와 같은 환경 조건의 변화에 반응성인 프로모터를 선택함으로써 공지의 수단에 의해 유도가능한 또는 억제성이도록 조절된다. 용어 "유도가능한 발현"은 규정된 조건 하에 유전자 발현이 일어나도록 하는 임의의 수단으로 확장하고, 여기서 수단 및 조건의 선택은 숙주 유기체에 대한 편의성 및 적절성에 기초하여 선택된다.
형질전환은 유기체, 유기체의 세포 및 그의 생물학의 특징에 따라 다양한 공지의 기술에 의해 수행된다. 안정한 형질전환은 세포 내로 및 세포 핵 내로 DNA 진입을 포함한다. 단일 세포로부터 재생될 수 있는 유기체 (일부 포유동물을 포함함)에 대해, 형질전환은 예를 들어, 시험관내 배양액에서 수행된 후, 형질전환체에 대한 선택 및 형질전환체의 재생이 이어진다. DNA 또는 RNA를 세포 내로 전달하기 위해 종종 사용되는 방법은 미세-주사, 입자 총 충격법 (gun bombardment), 양이온성 지질, 리포좀 또는 다른 담체 물질과 DNA 또는 RNA 복합체의 형성, 전기천공, 및 형질전환하는 DNA 또는 RNA를 바이러스 벡터 내로 포함시키는 것을 포함한다. 다른 기술은 당업계에 공지되어 있다. 세포 핵 내로 DNA 전달은 세포성 과정에 의해 일어나고, 특정 측면에서, 세포내 트랜스포사제 또는 재조합효소이 작용성인 통합 부위 서열을 포함함으로써 적절한 벡터의 선택에 의해 보조된다 (예를 들어, 문헌 [Craig, Ann. Rev. Genet. 1988, 22:77]; [Cox. In Genetic Recombination (R. Kucherlapati and G.R. Smith, eds.) 1988, American Society for Microbiology, Washington, D.C., pages 429-493]; [Hoess. In Nucleic Acid and Molecular Biology (F. Eckstein and D.M.J. Lilley eds.) Vol. 4, 1990, Springer-Verlag, Berlin, pages 99-109] 참조).
상기 기재된 바와 같이, 하나의 측면에서, 본 발명의 동물 모델은 마우스이다. 마우스 주 C57BL/6J 또는 129로부터 기원하는 ES 세포를 비롯한, 그로부터 다양한 배아 줄기 (ES) 세포가 유래하는 마우스 주의 유전자 배경은 당업계에 공지되어 있고: R1 세포는 하위동물주 129/Sv 및 129/Sv-CP 사이의 교배로부터의 마우스 배반포로부터 기원하고 (Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8424-8, 1993); GS1 세포는 129/Sv/Ev로부터 기원한다. D3-세포 (Doetschman et al., Nature 330:576-8, 1987) 및 J1 세포는 129/Sv 또는 129/terSv로부터 기원한다. ES 마우스를 또한 생성시키는 TT2 세포는 F1 하이브리드 주 (C57BL/6 x CBA)로부터 기원하였다 (Yagi et al., Anal. Biochem. 14:70-6, 1993). 특정 측면에서, 본 발명은 C57BL/6J 마우스, 및 C57BL/6J 마우스로부터 유래하는 낙아웃 마우스를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 본 발명에서 관심있는 단백질을 발현하기 위해 사용되는 발현 벡터 및 핵산은 조직-특이적 프로모터이다. 그러한 프로모터는 당업계에 공지되어 있고, 간-특이적 프로모터 (예를 들어, 알부민; [Miyatake et al., J. Virol. 1:5124-32, 1997]; α-페토단백질), 근육-특이적 프로모터 (예를 들어, 미오신 경쇄 1 [Shi et al., Hum. Gene Ther. 8:403-10, 1997], α-액틴), 췌장-특이적 프로모터 (예를 들어, 인슐린 또는 글루카곤 프로모터), 신경-특이적 프로모터 (예를 들어, 티로신 히드록실라제 프로모터 또는 뉴런-특이적 에놀라제 프로모터), 내피 세포-특이적 프로모터 (예를 들어, 폰 빌레브란트 인자; [Ozaki et al., Hum. Gene Ther. 7:1483-90, 1996]), 및 평활근-세포 특이적 프로모터 (예를 들어, 22a; Kim et al., J. Clin. Invest. 100:1006-14, 1997)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 다른 조직 특이적 프로모터는 또한 암 치료법을 개발하는데 사용되고 있는 프로모터, 예를 들어 티로시나제-특이적 프로모터 (Diaz et al., J. Virol. 72:789-95, 1998), 인간 아로마타제 시토크롬 p450 (p450arom)으로부터 유래된 지방 조직 프로모터 (미국 특허 5,446,143; [Mahendroo et al., J. Biol. Chem. 268:19463-19470, 1993]; 및 [Simpson et al., Clin. Chem. 39:317 324, 1993])를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 벡터 및 다른 핵산 분자는 또한 도입유전자의 일시적 발현을 제한하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도입유전자는 예를 들어 cAMP 반응 요소 인핸서를 프로모터 내에 포함시키고 형질감염된 또는 감염된 세포를 cAMP 조정 약물로 처리함으로써 약물 유도가능한 프로모터에 의해 제어될 수 있다 (Suzuki et al., Hum. Gene Ther. 7:1883-93, 1996). 별법으로, 리프레서 요소는 약물의 존재 하에 전사를 방지한다 (Hu et al., Cancer Res. 57:3339-43, 1997). 발현의 공간적 제어는 erg 유전자 프로모터와 함께 이온화 방사선 (방사선요법)을 사용함으로써 또한 달성되었다 (Sung et al., Cancer Res. 55:5561-5, 1995).
관심있는 단백질을 코딩하는 재조합 핵산 구성체는 예를 들어, 증폭을 위해 임의의 적합한 플라스미드, 박테리오파지 또는 바이러스 벡터 내로 삽입되고, 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)]에 기재되어 있는 방법을 이용하여 전파된다. 하나의 실시양태에서, 진핵 세포, 예를 들어 척추동물 세포에서 적합한 발현 벡터가 사용된다. 진핵 세포 발현 벡터는 당업계에 잘 공지되어 있고, 상업적인 공급원으로부터 이용가능하다. 고려되는 발현 벡터는 원핵 서열 (세균 내에서 벡터의 전파를 용이하게 하기 위해), 및 돼지 세포에서 기능성인 하나 이상의 진핵 전사 단위를 모두 함유한다. 일반적으로, 그러한 벡터는 목적하는 재조합 DNA 분자의 삽입을 위한 편리한 제한 부위를 제공한다. pcDNAI, pSV2, pSVK, pMSG, pSVL, pPVV-1/PML2d 및 pTDT1 (ATCC No. 31255) 유래된 벡터가 비-인간 세포의 형질감염에 적합한 포유동물 발현 벡터의 예이다. 이들 벡터 중 일부는 원핵 및 진핵 세포 모두에서 복제 및 약물 내성 선택을 용이하게 하기 위해 pBR322와 같은 세균 플라스미드로부터의 서열을 사용하여 변형된다. 별법으로, 돼지 세포 내에서 단백질의 발현을 위해 소 유두종 바이러스 (BPV-1), 또는 엡스타인-바아 (Epstein-Barr) 바이러스 (pHEBo, pREP-유래 및 p205)와 같은 바이러스의 유도체가 사용될 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 세포의 형질전환에서 사용된 다양한 방법이 당업계에 잘 공지되어 있다. 본 발명에서 유용한 다른 적합한 발현 시스템 및 일반적인 재조합 절차에 대해서는 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)]을 참조한다.
트랜스제닉 동물, 특히 마우스 또는 래트를 생성하기 위한 기술은 잘 공지되어 있다 (Gordon, International Rev. Cytol. 115:171-229, 1989). 도입유전자를 도입하기 위한 다양한 방안, 예를 들어 세포 내로 핵산의 미세주사, 레트로바이러스 벡터 방법, 및 배아 줄기 (ES) 세포 내로 유전자 전달이 이용가능하다. 특정 측면에서, 유전자는 트랜스제닉 낙아웃 동물을 생성하도록 차단된다.
낙아웃 동물을 생성하기 위한 임의의 방법이 본 발명에서 고려된다. 일부 실시양태에서, VWF 유전자는 동물의 배아 줄기 세포 전구체 내로 도입된 내인성 대립유전자 또는 그의 일부를 결실시키기 위해 내인성 대립유전자 및 돌연변이체 VWF 유전자 또는 적절한 서열 사이의 상동성 재조합에 의해 파괴된다. 이어서, 배아 줄기 세포 전구체를 발달시켜, 기능상 파괴된 VWF 유전자를 갖는 동물을 생성시킨다. 동물은 기능상 파괴된 1개의 VWF 유전자 대립유전자를 가질 수 있거나 (즉, 동물은 전결실 (null) 돌연변이에 대해 이종접합성일 수 있다), 다른 측면에서, 동물은 기능상 파괴된 두 VWF 유전자 대립유전자를 모두 갖는다 (즉, 동물은 돌연변이에 대해 동종접합성일 수 있다). 본 발명의 하나의 실시양태에서, 두 VWF 유전자 대립유전자의 기능적 파괴는 비-돌연변이체 동물에 비해 동물의 세포에서 VWF 유전자 생성물의 발현이 실질적으로 또는 완전히 부재하는 동물을 생성시킨다. 또 다른 실시양태에서, VWF 유전자 대립유전자는 파괴되어, 변경된 (즉, 돌연변이체) VWF 유전자 생성물이 동물의 세포에서 생산되도록 한다. 그러한 동물은 VWF가 결핍될 수 있거나 VWF가 완전히 결여할 수 있다. 하나의 측면에서, 기능상 파괴된 VWF 유전자를 갖는 본 발명의 비-인간 동물은 마우스이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은 파괴된 ADAMTS13 유전자를 갖는 동물의 사용을 포함한다. 하나의 측면에서, 기능상 파괴된 ADAMTS13 유전자를 갖는 비-인간 동물은 마우스이다. ADAMTS13-결핍 마우스가 본 발명에서 사용되고, 이것은 상기 트랜스제닉 동물주가 VWF에 대한 ADAMTS13-절단 프로테아제가 결여되는 환자에서의 병태를 모방하기 때문이다. 추가로, 마우스는 급성 독성 연구에서 널리 사용되고 규제 당국에 의해 그러한 독성 연구를 위해 적합한 것으로 일반적으로 인정되기 때문에, 이들 마우스를 본 발명에서 사용한다. 추가의 측면에서, 본 발명의 ADAMTS13-결핍 및 VWF-결핍 마우스는 C57BL/6J 주로부터 유래된다. 심지어 추가의 측면에서, C57BL/6J 마우스는 추가의 대조군으로서 사용되고, 본 발명의 모델로서 사용된다.
트랜스제닉을 생성하기 위해 수정된 난모세포가 사용되면, 목적하는 외래 DNA 또는 도입유전자는 난모세포 내로 포함된다. 난모세포 내로 도입유전자의 혼입은 적절한 레트로바이러스 벡터를 통하는 것과 같은 몇몇 방법, 또는 미세주사에 의해 수행된다. 트랜스제닉 마우스는 미국 특허 4,736,866에 기재되어 있고 문헌 [B. Hogan, "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., U.S.A. (1986)]에서 제공되는 바와 같이 임신 마우스로부터 단리된 배반포 내로 DNA의 미세주사에 의해 당업계에서 통상적으로 생성된다 (또한 예를 들어, 문헌 [Haren et al., Annu. Rev. Microbiol. 53:245-281, 1999]; [Reznikoff et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 266(3):729-734, 1999]; [Ivics et al., Methods Cell Bid., 60:99-131, 1999]; [Hall et al., FEMS Microbiol. Rev. 21:157-178 1997] 참조). 미국 특허 6,492,575에서는 ES 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 4배체 배반포 내로 주사함으로써 트랜스제닉 마우스를 제조하는 방법을 설명하고 있다. 이종접합성 동기 (sibling)들을 교배함으로써, 목적하는 유전자를 보유하는 동종접합성 동물을 얻을 수 있다.
추가로, 카페치 (Capecchi) 등은 그에 의해 도입유전자가 배아, 태아 또는 성인 만능 줄기 세포 내로 포함될 수 있는 방법을 설명하였다 (Science 244:1288-1292, 1991). 상기 방법에서, 시험관 내에서 배양된 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리한다. 이들 배아 줄기 세포는 분화 없이 많은 세포 세대에 걸쳐 배양액 내에서 안정하게 유지될 수 있다. 이어서, 도입유전자가 전기천공 또는 다른 형질전환 방법에 의해 배아 줄기 세포 내로 포함된다. 도입유전자를 보유하는 줄기 세포가 선택되고 배반포의 내부 세포 질량 내로 주사된다. 이어서, 배반포를 위임신 암컷에 이식한다. 배반포의 내부 세포 질량의 모든 세포가 도입유전자를 보유하지는 않으므로, 동물은 도입유전자에 관하여 키메라 (chimera)이다. 키메라 동물을 교잡하면 도입유전자를 보유하는 동물이 생산된다. 과정의 개요는 문헌 [Capecchi, Trends in Genetics 1989, 5:70-76]에 제시되어 있다.
하나의 측면에서, 도입유전자의 전달은 레트로바이러스 전달 시스템에 의해 달성된다 (예를 들어, 문헌 [Eglitis et al., Adv. Exp. Med Biol. 241:19, 1988] 참조). 하나의 실시양태에서, 레트로바이러스 구성체는 바이러스의 구조적 유전자가 단일 유전자에 의해 교체되는 구성체이고, 상기 단일 유전자는 이후 바이러스 긴 말단 반복체 (LTR)에 함유된 조절 요소의 제어 하에 전사된다. 몰로니 (Moloney) 쥐 백혈병 바이러스 (MoMuLV)를 비롯한 다양한 단일 유전자-벡터 백본이 사용되었다. 내부 프로모터의 제어 하에 선택가능 마커에 대한 유전자 및 관심있는 제2 유전자와 같은 상이한 유전자들의 다수 삽입을 허용하는 레트로바이러스 벡터는 상기 유형의 백본으로부터 유래될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gilboa, Adv. Exp. Med Biol. 241:29, 1988] 참조).
단백질 생성물의 발현을 위한 벡터의 제작의 요소는 당업자에게 공지되어 있다. 레트로바이러스 벡터로부터의 효율적인 발현은 문헌 [Chang et al., Int. J. Cell Cloning 7:264, 1989]에서 검토된 SV40 프로모터 또는 LTR 프로모터와 같은 "강한" 프로모터가 전사 제어를 위해 사용될 때 관찰된다. 이들 프로모터는 구성적이고, 일반적으로 조직-특이적 발현을 허용하지 않는다. 다른 적합한 프로모터는 본원에서 논의된다.
패키징 세포주의 사용은 생산된 재조합 비리온의 효율 및 감염성을 증가시킨다 (문헌 [Miller, 1990, Human Gene Therapy 1:5] 참조). 쥐 레트로바이러스 벡터가 유전자를 쥐 배아 (예를 들어, 문헌 [Wagner et al., 1985, EMBO J. 4:663]; [Griedley et al., Trends Genet. 3:162, 1987] 참조), 및 조혈 줄기 세포 (예를 들어, 문헌 [Lemischka et al., Cell 45:917-927, 1986]; [Dick et al., Trends Genet. 2:165-170, 1986] 참조) 내로 효율적으로 전달하기 위해 유용하였다.
이전에 가능한 것보다 훨씬 더 높은 바이러스 역가의 획득을 허용하는 추가의 레트로바이러스 기술은 동종숙주 (ecotropic) 및 양친화성 (amphotropic) 패키징 세포주들 사이에서 연속 전달에 의한 증폭, 소위 "핑퐁 (ping-pong)" 방법을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Kozak et al., J. Virol. 64:3500-3508, 1990]; [Bodine et al., Prog. Clin. Biol. Res. 319: 589-600, 1989] 참조). 또한, 바이러스 역가를 증가시키는 기술은 효율적인 형질도입을 얻기 위해 바이러스-생산 세포주와 함께 직접 인큐베이션보다는 바이러스-함유 상등액의 사용을 허용한다 (예를 들어, [Bodine et al., Prog. Clin. Biol. Res. 319:589-600, 1989] 참조). 숙주 게놈 내로 레트로바이러스 벡터의 통합을 위해 세포성 DNA의 복제가 요구되기 때문에, 예를 들어, 성장 인자를 사용한 시험관내 처리에 의해 분할하도록 표적 세포를 유도함으로써 활동적으로 순환하는 표적 줄기 세포의 빈도를 증가시키거나 (예를 들어, 문헌 [Lemischka et al., Cell 45:917-927, 1986]; [Bodine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:8897-8901, 1989] 참조), 수여체를 5-플루오로우라실에 노출시키는 (예를 들어, 문헌 [Mori et al., Japan. J. Clin. Oncol. 14 Suppl. 1:457-463, 1984] 참조) 것이 바람직할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 낙아웃 동물 (예를 들어, 마우스)를 제2 동물 (예를 들어, 제2 마우스)과 교배하는 것을 포함하는, 트랜스제닉 동물의 생성 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 a) 동물을 화합물에 노출시키고; 및 b) 화합물에 대한 동물의 반응을 결정하는 것을 포함하는, 화합물 (물질)을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 화합물에 노출되지 않은 대조군 동물에 비교한 반응의 변화는 화합물에 대한 반응을 표시한다. 다른 실시양태에서, 동물 (동물의 세포, 조직 또는 장기)을 야생형 동물에 비교하지 않으면서 직접 검사한다.
일부 실시양태에서, 화합물에 대한 동물의 반응을 결정하는데 있어서, 동물로부터의 혈액 및 소변을 검사한다. 다른 실시양태에서, 동물로부터의 장기 또는 조직을 검사한다. 눈, 눈 조직, 망막, 망막 조직, 신장, 신장 조직, 췌장, 췌장 조직, 전립선, 전립선 조직, 방광, 방광 조직, 심장, 심장 조직, 뇌, 뇌 조직, 부신, 부신 조직, 간, 간 조직, 폐, 폐 조직, 비장, 비장 조직, 또는 그의 조합을 포함하고 이로 제한되지 않는 그러한 장기 및 조직을 검사한다. 예를 들어, 이들 장기 또는 조직에서 혈액 응고를 감소 또는 방지하는 화합물은 TTP의 치료에서 잠재적으로 유익할 것으로 간주될 수 있다.
일부 실시양태에서, 시험된 화합물은 ADAMTS13 발현 또는 활성을 증가시키는 후보 항-응고제 또는 물질이다. 임의의 메카니즘에 제한되지 않지만, 본 발명의 동물 모델은 혈액 응고에 대해 증가된 감수성을 갖는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 동물 모델을 이용하면 후보 화합물의 항-응고 가능성을 쉽게 평가할 수 있다.
본원에서 상기 기재된 바와 같이, 용어 "물질" 및 "화합물"은 본 발명의 동물 모델에서 혈액 응고에 영향을 미칠 수 있는 임의의 분자, 예를 들어 단백질 또는 약품을 설명하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. 하나의 측면에서, 물질은 동물 모델에서 혈액 응고를 감소시킨다. 다른 측면에서, 물질은 동물 모델에서 사망을 감소시킨다. 추가의 측면에서, 물질은 동물 모델에서 병리 상태를 개선한다. 일반적으로, 복수의 분석 혼합물을 다양한 농도에 대한 차별적인 반응을 얻기 위해 상이한 물질 농도로 평행으로 실행시킨다. 대개, 이들 농도는 제로 농도 또는 검출 수준 미만에서 음성 대조군으로서 역할을 한다.
후보 물질 (화합물)은 많은 화학물질 클래스 (class)를 포함하고, 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 비롯한 매우 다양한 공급원으로부터 얻어진다. 예를 들어, 랜덤화 올리고뉴클레오티드 및 올리고펩티드의 발현을 비롯한 많은 수단이 매우 다양한 유기 화합물 및 생체분자의 랜덤 및 유도 (directed) 합성을 위해 이용가능하다. 별법으로, 세균, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리가 이용가능하거나 쉽게 생산된다. 추가로, 천연 또는 합성 방식으로 생산된 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 변형되고, 조합 라이브러리를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 공지의 약물학적 물질은 구조적 유사체를 생산하기 위해 유도 또는 랜덤 화학적 변형, 예를 들어 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등으로 처리될 수 있다. 스크리닝은 공지의 약물학상 활성 화합물 및 그의 화학적 유사체에 대해 지시될 수 있다.
동물의 임상 평가
혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)은 질병 특유의 실험실 시험 소견이 없는 임상 진단이다. 과거에는, 5원의 징후 및 증상 (즉, 병리 상태)이 TTP와 연관되었다: 혈소판감소증, 미세혈관병성 용혈성 빈혈, 신경 이상, 신 부전증, 및 열. 본 발명은 이들 및 다른 임상, 행동, 및 조직학상 관련 병리 상태를 감소시키는 물질에 대해 이들 병리 상태를 모니터링하는 것을 포함한다.
TTP의 진단을 제안하기 위해 현재의 임상 실무 진단 기준은 혈소판감소증, 분열적혈구증가증, 및 혈청 LDH 수준의 유의한 상승을 포함한다. 생체 내에서 ADAMTS13에 의한 ULVWF 다량체의 절단에 요구되는 모든 분자 상호작용의 이상을 검출할 수 있는 시험관내 시험의 부재가 제한점이다. 따라서, 본 발명은 동물 모델의 혈액, 소변, 및 신체의 다양한 장기의 병리학적 검사를 포함한다. 동물에 대해 다양한 시점에서 검시를 수행하고, 비제한적으로 부신, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 비장 및 눈을 포함한 조직을 조직병리학적 검사를 위해 수집한다.
혈액학적 조사는 적혈구 용적률, 헤모글로불린 농도, 적혈구 계수, 망상적혈구, 총 백혈구 계수, 감별 백혈구 계수, 혈액 형태의 이상, 혈소판 계수, 평균 세포 헤모글로불린, 평균 세포 부피 및 평균 세포 헤모글로불린 농도의 분석을 포함한다.
동물 모델에 대한 다양한 물질의 효과를 시험하는데 1차 종점은 사망이지만, 본 발명은 처리 후에 동물의 활동 수준 및 신체 상태의 모니터링을 포함한다. 동물 체중은 전반적인 건강을 표시하므로, 동물을 또한 다양한 시점 (예를 들어, 제0일, 1일, 7일, 14일 등)에 칭량한다. 장기 연구가 또한 본 발명에서 고려되므로, 시점을 수주, 수개월 등으로 연장할 수 있다.
본 발명은 TTP의 진단을 위해 종종 사용되는 실험실 시험의 사용을 포함한다. 그러한 시험은 혈액 시험을 포함한다. 혈액 및/또는 소변을 마취 하에 (적절한 경우에) 채취하고, 다음 시험을 포함하고 이로 제한되지 않는다: (1) 완전 혈액 계수 (CBC) - 혈소판감소증 및 빈혈이 알려진다. 혈소판감소증의 증거는 단편화된 RBC의 출현 및 LDH 상승에 수일 선행할 수 있다. (2) 말초 혈액 도말 (smear) - 단편화된 RBC (즉, 분열적혈구증가증)는 용혈과 일치한다. 혈액 도말 상의 분열적혈구증가증은 질병의 형태학적 지표이지만, TTP를 다른 혈전성 미세혈관병증과 구분하기 위해 요구되는 분열적혈구증가증의 수에 관한 지침은 존재하지 않는다. (3) 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 수준 - 용혈보다는 대부분 허혈성 또는 괴사성 조직 세포로부터 LDH의 결과로서 극도로 상승됨. (4) 간접적인 빌리루빈 수준 - 상승됨. (5) 망상적혈구 계수 - 상승됨. (6) 프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) - 정상. (6) DIC 패널 (예를 들어, 피브리노겐, D-이량체) - 결과는 대체로 정상이다. 증가하는 D-이량체 수준은 가장 특이적인 DIC 파라미터이고, 가교결합된 피브린의 피브린용해를 반영한다. (7) 크레아티닌 수준 - 완화하게 상승됨 (46%). (8) 뇨분석 - 단백뇨 및 미시적인 혈뇨.
통계적 방법, 계산, 비교
본 발명은 당업자에게 공지된 임의의 통계적 방법, 계산 및 비교의 사용을 포함한다. 아래 실시예에서 논의되는 일부 통계적 방법, 계산 및 비교는 본원에서 설명된다. 그러나, 당업자는 당업자에게 공지된 임의의 허용되는 방법을 사용할 수 있으므로 이들은 어떠한 방식으로도 독점적이거나 제한적인 것을 의미하지 않는다. 예를 들어, 하나의 측면에서, 본 발명은 체질량 발달 (development)에서 최소 검출가능한 용량 (MDD)의 모니터링을 포함한다. MDD는 대응하는 버퍼로부터 옮겨진 최소 용량으로서 정의된다. 본 발명의 실시예에서, MDD는 단계-하향 (step-down) 방식으로 시험된 대비물 (contrast)을 사용함으로써 rVWF + rFVIII뿐만 아니라 rVWF에 대해 추정되었다. 사망률 및 체질량 발달에 대해 상이한 용량의 rVWF + rFVIII 및 rVWF를 또한 대응하는 버퍼와 비교하였다. 추가로, 2000 RCoU/kg VWF + 1664 IU/kg FVIII의 용량에서 해메이트® P를 2000 RCoU/kg rVWF + 1538 IU/kg rFVIII의 용량에서 rVWF + rFVIII와 비교하였다. 상기 비교는 사망률 및 체질량 발달에 대해 이루어졌다.
아래 실시예에서 논의된 모든 통계적 계산은 예를 들어, 리눅스 (Linux)용 SAS 버전 8.2를 사용하여 수행하였다. 통계적 유의성의 수준을 5%로 설정하였다. 차이 없음의 귀무 (null) 가설을 그의 양측 대립물 (two-sided alternative)에 대해 시험하였다. 단기 분석 데이타 세트 (STADS)는 연구일 0일에 처리제를 투여하고 연구일 1일에 치사시킨 동물로 구성되었다. 장기 분석 데이타 세트 (LTADS)는 연구일 0일에 처리제를 투여하고 연구일 14일에 치사시킨 동물로 구성되었다.
본 발명의 특정 측면에서, 동물 모델에서 시험 물질의 유효성을 평가하는데 있어서 임의의 종점이 고려된다. 하나의 측면에서, 통계적 평가를 위한 1차 종점은 사망이다. 추가의 측면에서, 통계적 평가를 위한 2차 종점은 체질량 발달 (제0일의 체질량의 백분율으로서) 및 혈액학적 및 혈청학적 변수의 변화이었다. 혈액학적 및 혈청학적 변수의 변화는 기술 (descriptive) 통계학을 이용하여 분석한다. 정확도 검정으로서 코크란-아미티지 (Cochran-Armitage) 경향 검정을 이용하여 증가하는 용량의 rVWF + rFVIII를 사용할 때 및 양측 대립물에 대항한 rVWF 단독을 사용할 때 사망률의 경향 없음의 귀무 가설을 시험하기 위해 추가의 분석을 수행한다 [SAS 절차에 의해, PROC FREQ, 진술 = EXACT TREND].
본 발명의 하나의 측면에서, 단독으로 또는 상이한 용량의 rFVIII와 조합한 상이한 용량의 rVWF를 사용하여 연구를 수행한다. 그러한 연구에서, 체질량 발달에서 최소 검출가능한 용량 (MDD; 대응하는 버퍼로부터 옮겨진 최소 용량으로서 정의됨)은 대비물을 사용하여 단계-하향 방식으로 추정된다. 본 발명의 방법에서 사용된 다양한 시약의 독성에 기초하여 연구의 변형을 수행한다. 예를 들어, 4000 RCoU/kg의 용량에서 해메이트® P를 rVWF + rFVIII와 비교하는 것이 초기 실험에서 계획되었지만, 상기 용량은 해메이트® P (시트레이트 독성)에서 실현가능하지 않은 것으로 증명되었고, 2000 RCoU/kg의 해메이트® P의 용량이 포함되었다. 따라서, 2000 RCoU/kg + 1538 IU/kg의 용량에서 rVWF + rFVIII를 2000 RCoU/kg VWF의 용량에서 해메이트® P와 비교하였다 (실시예 참조).
하나의 측면에서, 화합물 및 연구일에 의해 분류된 혈액학적 및 혈청학적 변수는 중앙값 및 범위 대신에 평균 및 변이 계수를 사용하여 요약된다. 이것은 변이 계수가 규모 (scale) 비의존적이고 실험실 변수에서 용량의 변이성의 차이의 평가를 허용하기 때문에 이루어진다.
사망률의 분석
본 발명은 사망률의 분석을 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 통계적 방법이 본 발명에서 사용하기 위해 고려된다. 본 발명은 다음 통계적 방법을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 관찰기 동안 죽은 동물의 비율, 및 대응하는 양측 95% 신뢰 구간은 화합물 및 용량마다 계산할 수 있다. 양측 95% 신뢰 구간은 윌슨 (Wilson) 스코어 방법에 의해 계산할 수 있다 (Altman et al., Statistics with Confidence. Brit. Med. J. Books, 2nd ed., JW Arrowsmith Ltd., Bristol, pages 46-48, 2000). 이들 분석은 STADS, LTADS 및 STADS 및 LTADS 합계에 대해 따로 수행될 수 있다. 이들 분석은 또한 수컷 및 암컷 동물에 대해 따로 및 합한 수컷 및 암컷 동물에 대해 제공될 수 있다.
상이한 용량의 rVWF 및 rVWF + rFVIII와 대응하는 버퍼 사이에서 사망률의 차이를 양측 피셔 (Fisher) 정확도 검정에 의해 합한 수컷 및 암컷 동물에 대해 평가할 수 있다 [SAS 절차에 의해, PROC MULTTEST]. 상기 분석은 STADS 및 LTADS 합계에 대해 수행할 수 있다. 5개의 용량군을 대응하는 버퍼와 동시에 비교하기 위한 다중도에 대한 조정은 홀름 (Holm) 방법 (Scandinavian J. Stat. 6:65-70, 1979)을 이용하여 적용될 수 있다. 조정되지 않은 및 다중도 조정된 양측 p-값을 제시한다. 상이한 화합물의 조사를 위해 다중도에 대한 조정은 적용되지 않는다.
정확도 검정으로서 코크란-아미티지 경향 검정을 이용하여 증가하는 용량의 rVWF + rFVIII를 사용할 때 및 양측 대립물에 대항한 rVWF 단독을 사용할 때 사망률의 경향 없음의 귀무 가설을 시험하기 위해 추가의 분석을 수행한다 [SAS 절차에 의해, PROC FREQ, 진술 = EXACT TREND]. 상기 분석은 STADS 및 LTADS 합계에 대해 및 합한 수컷 및 암컷에 대해 수행할 수 있다.
체질량 발달의 분석
연구일 0일 및 연구일 1일, 7일 및 14일 사이의 체질량 변화 (제0일의 체질량의 백분율으로서)는 또 다른 평가점이고, 특정 측면에서, 화합물 및 용량에 의해 분류된 상자 그림 (box plot)을 이용하여 시각화한다. 수컷 및 암컷 동물은 특정 측면에서, 이들 상자 그림을 위해 합해진다. 4000 RCoU/kg의 용량으로 투여된 해메이트® P의 처리 아암 (arm)은 2마리의 동물로부터의 데이타만 이용가능하였으므로 본 발명의 실시예에서 상자 그림에 포함되지 않았다.
상자의 아랫변은 제25 백분위수 (또는 제1 사분위수)를 나타내고, 상자의 윗변은 제75 백분위수 (또는 제3 사분위수)를 나타내고, 상자의 아랫변 및 윗변 내의 선은 중앙값을 나타냈다. 플러스 표시는 평균을 나타냈다. 상자의 아랫변에서 윗변까지의 거리는 사분위 범위 (IQR)를 나타냈다. 제75 백분위수 위로 1.5*IQR인 값보다 더 작거나 같은 수염그림 (whisker)을 최대 데이타 값에 대한 제75 백분위수 위에 그렸다. 그보다 더 큰 임의의 데이타 값은 표시하였다. 제25 백분위수 아래로 1.5*IQR인 값보다 더 작거나 같은 수염그림을 최소 데이타 값에 대한 제25 백분위수 아래에 그렸다. 그보다 더 작은 임의의 데이타 값은 표시하였다.
평균 및 대응하는 양측 95% 부트스트랩 (bootstrap)-t 신뢰 구간 (Efron et al., "An Introduction to the Bootstrap." Chapman and Hall/CRC, Boca Raton, London, N.Y., Washington D.C., 1993)은 화합물 및 용량에 의해 분류된 연구일 0일 및 연구일 1일, 7일 및 14일 사이의 체질량 변화 (제0일의 체질량의 Δ%로서)에 대해 제공되었다. 이들 분석은 수컷 및 암컷 동물에 대해 따로 및 합한 수컷 및 암컷 동물에 대해 제0일 내지 제1일의 변화 (STADS), 제0일 내지 제7일의 변화 (LTADS) 및 제0일 내지 제14일의 변화 (LTADS)에 대해 수행하였다. 부트스트랩-t 신뢰 구간은 성별에 의해 계층화된 10,000 부트스트랩 복제에 기초하여 계산하였다. 평균에 대한 양측 95% 부트스트랩-t 신뢰 구간은 3마리 초과의 동물의 샘플 크기에 대해 제공되었다.
체질량 발달의 평균에 대한 상자 그림, 평균 및 대응하는 양측 95% 신뢰 구간은 계획된 치사 일자 전에 죽은 동물을 포함하지 않기 때문에 주의 깊게 해석되어야 한다. 계획 일자 전에 죽은 동물은 양측 p-값의 계산을 위해 최저 순위 (rank) (Lachin, Controlled Clinical Trials 20: 408-422, 1999)를 받는다. 따라서, 양측 p-값은 체질량 발달의 평균 및 대응하는 양측 95% 신뢰 구간보다 화합물들 사이에서 체질량 발달에서의 효과를 평가하기 위해 적절하다.
상이한 용량의 rVWF 및 rVWF + rFVIII와 대응하는 버퍼 사이의 체질량 발달의 차이는 예를 들어, 제0일 내지 제1일의 변화 (STADS) 및 제0일 내지 제14일의 변화 (LTADS)에 대해 따로 평가한다.
체질량 발달은 1,000,000 과돌연변이 복제를 사용하여 성별에 의해 계층화된 양측 과돌연변이 시험 [SAS 절차에 의해, PROC MULTTEST, 옵션 = 과돌연변이, 진술 = TEST MEAN]에 의해 명시된 대비물에 대해 비교된다.
5개의 용량군을 대응하는 버퍼와 동시에 비교하기 위한 다중도에 대한 조정은 예를 들어, 홀름 방법 (Scandinavian J. Stat. 6:65-70, 1979)을 이용하여 적용된다. 본원의 실시예에서, 조정되지 않은 및 다중도 조정된 양측 p-값을 제시한다. 상이한 화합물의 조사를 위해 및 상이한 연구일의 조사를 위해 다중도에 대한 조정은 적용되지 않는다.
해메이트® P 및 대응하는 용량의 rVWF + rFVIII 사이의 체질량 발달의 차이는 예를 들어, 제0일 내지 제1일의 변화 (STADS) 및 제0일 내지 제14일의 변화 (LTADS)에 대해 따로 평가하였다. 양측 p-값은 1,000,000 과돌연변이 복제를 사용하여 성별에 의해 계층화된 과돌연변이 시험 [SAS 절차에 의해, PROC MULTTEST, 옵션 = 과돌연변이, 진술 = TEST MEAN]에 의해 계산한다. 2개의 상이한 연구일의 조사를 위해 다중도에 대한 조정은 적용되지 않는다.
최소 검출가능한 용량 (MDD; 대응하는 버퍼로부터 옮겨진 최소 용량으로서 정의됨)은 하나의 측면에서 문헌 [Tamhane et al. (Biometrics 52:21-37, 1996; procedure SD2)]에서 제안된 바와 같이 단계-하향 방식으로 시험되는 대비물을 사용하여 추정한다. 상기 분석은 예비적이므로, 최저 MDD를 생성시키는 대비물이 보고된 추정을 위해 선형 및 역 헬머트 (helmert) 대비물이 고려된다.
이렇게 결정된 최소 검출가능한 용량은 유해한 효과가 관찰되지 않는 수준 용량 (NOAEL)보다 더 높은 하나의 용량 수준이다. 최소 검출가능한 용량은 예를 들어, rVWF + rFVIII에 대해 및 rVWF에 대해, 제0일 내지 제1일의 체질량 변화 (STADS) 및 제0일 내지 제14일의 체질량 변화 (LTADS)에 대해 따로 추정한다.
선형 대비물에 대한 양측 p-값은 예를 들어, 1,000,000 과돌연변이 복제를 사용하여 성별에 의해 계층화된 과돌연변이 시험 [SAS 절차에 의해, PROC MULTTEST, 옵션 = 과돌연변이, 진술 = TEST MEAN]에 의해 계산한다. 상이한 화합물의 조사를 위해 또는 상이한 연구일의 조사를 위해 다중도에 대한 조정은 적용되지 않는다.
예를 들어, 연구일 1일 및 연구일 14일에 혈액학적 및 혈청학적 변수는 화합물 및 용량에 의해 분류된 상자 그림을 이용하여 시각화된다. 이들 도면을 위해 수컷 및 암컷 동물은 임의로 합해진다. 4000 RCoU/kg의 용량으로 투여된 해메이트® P의 처리 아암은 2마리의 동물로부터의 데이타만 이용가능하였으므로 상자 그림에 포함되지 않았다.
예를 들어, 연구일 1일 및 연구일 14일에 혈액학적 및 혈청학적 변수는 화합물 및 용량에 의해 분류된 평균 및 변이 계수 (CV)를 이용하여 요약된다. 이들 통계학은 수컷 및 암컷 동물에 대해 따로 및 합한 수컷 및 암컷 동물에 대해 제공된다.
체질량 발달은 예를 들어, 연구일마다 조사된 모든 화합물에 대해 순위 결정된다. 계획된 치사 일자 전에 죽은 동물은 최저 순위를 받았다. 체질량 발달의 순위는 조사된 대비물에 대해 사용된다. 분실한 값은 평균 및 대응하는 신뢰 구간의 계산, 또는 상자 그림의 생성을 위해 교체되지 않는다.
분실한 값은 계획된 치사 일자 전에 동물의 혈액학적 및 혈청학적 변수를 위해 교체되지 않는다.
다양한 병리 상태의 검사
본 발명은 추정된 정상 상태로부터의 편차를 나타내는 다양한 병리 상태의 모니터링 및/또는 측정을 포함한다. 그러한 병리 상태는 임상, 행동, 및 조직학적 병리 상태를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
병리 상태가 "임상 병리 상태"이면, 체액, 예를 들어 비제한적으로 혈액 및 소변의 이상을 반영한다. 임상 병리 상태는 예를 들어, 화학, 미생물학, 혈액학 또는 분자 병리학을 이용하여 관찰한다. 예를 들어, 적혈구 용적률, 헤모글로불린 농도, 적혈구 계수, 망상적혈구, 총 백혈구 계수, 감별 백혈구 계수, 혈액 형태의 이상, 혈소판 계수, 평균 세포 헤모글로불린, 평균 세포 부피 및 평균 세포 헤모글로불린 농도의 이상을 검출하기 위해 혈액학적 조사가 이용된다. 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 및/또는 크레아티닌 키나제 (CK) 수준의 이상을 검출하기 위해 혈액 화학 조사가 이용된다. 소변을 구리색 소변, 혈뇨 및 다른 소변 이상에 대해 검사한다.
병리 상태가 "행동 병리 상태"이면 하나의 측면에서, 동물의 외관 및 행동의 변화를 모니터링함으로써 관찰한다. 예를 들어, 행동 병리 상태는 행동 저하, 자세의 변화 (예를 들어, 엎드린 또는 모로 누운), 호흡곤란, 운동실조증, 부동성, 발작, 호흡곤란, 경련 및 털세움을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
병리 상태가 "조직학적 병리 상태"이면 하나의 측면에서, 체질량의 차이를 측정하는 것을 비롯하여 장기, 조직, 또는 전신 (부검 또는 검시)의 육안, 현미경, 또는 분자 검사를 이용하여 관찰한다.
조직의 조직학적 준비를 수행한다. 시험 화합물-처리된 고용량군, 참조 화합물-처리군, 대조군에서 모든 동물로부터 검시에서 수집한 모든 조직 샘플뿐만 아니라 모든 육안 소견의 조직 샘플의 슬라이드를 처리하고, 파라핀 내에 포매하고, 2-4 ㎛의 공칭 두께로 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하고, 연구 병리학자가 광학 현미경으로 검사한다. 동일한 과정을 모든 다른 시험 화합물-처리군 내의 모든 동물의 몇몇 장기 (심장, 뇌, 눈, 신장, 부신, 및 폐)로부터의 조직 샘플에 적용한다.
현미경 소견은 조직병리학적 검사 동안 병리학자가 기록한다. 슬라이드를 평가하고, 조직학적 변화를 가능한 경우마다 분포, 중증도 및 형태학적 특징에 따라 설명한다. 상기 조직병리 상태는 미세혈전, 심근 괴사, 증가된 관상 혈관주위염, 심근 변성/보상, 아교 세포 병소, 피질 괴사, 출혈, 미세혈전의 증가된 발병률 또는 평균 중증도, 파종성 혈관내 응고병증 (DIC), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 허혈성 심장병, 혈전색전성 변화, 괴사, 반응성 관상 혈관주위염, 염증, 섬유증, 헤모시데린 축적, 석회화, 신 경색증, 및 체질량 감소를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
본원에서 언급되는 각각의 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 본 명세서와 불일치하지 않는 정도로 그 전문이 참조로 포함된다.
본원에서 설명되는 실시예 및 실시양태는 단지 예시의 목적을 위한 것이고, 그의 면에서 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고 본원의 취지와 범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함될 것임이 이해된다. 본원에서 언급되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적으로 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
실시예
본 발명의 추가의 측면 및 상세한 내용은 제한보다는 예시적인 것으로 의도되는 다음 실시예로부터 자명해질 것이다. 실시예 1은 C57BL/6J 마우스에서 인간 rVWF의 단독으로 또는 인간 rFVIII와의 조합으로의 급성 독성을 설명한다. 실시예 2는 VWF-결핍 마우스에서 인간 rVWF의 단독으로 또는 인간 rFVIII와의 조합으로의 급성 독성을 설명한다. 실시예 3은 ADAMTS13-결핍 마우스에서 인간 rVWF의 단독으로 또는 인간 rFVIII와의 조합으로의 급성 독성을 설명한다. 실시예 4는 ADAMTS13-결핍 마우스에서 인간 rVWF의 급성 독성이 인간 rADAMTS13의 동시투여로 약화될 수 있음을 보여준다. 실시예 5는 쥐 ADAMTS13은 rVWF와 반응하지 않음을 보여준다. 실시예 6은 C57BI/6J 마우스에서 인간 rVWF의 단독으로 또는 인간 rFVIII와의 조합으로의 정맥내 적용을 설명한다. 실시예 7은 VWF-결핍 마우스에서 인간 rVWF의 단독으로 또는 인간 rFVIII와의 조합으로의 정맥내 적용을 설명한다. 실시예 8은 ADAMTS13-결핍 마우스에서 인간 rVWF의 단독으로 또는 인간 rFVIII와의 조합으로의 정맥내 적용을 설명한다. 실시예 9는 ADAMTS13 결핍 마우스에서 인간 rADAMTS13과 인간 rVWF의 동시투여를 설명한다.
실시예 1:
C57BL /6J 마우스에서 인간 재조합 폰 빌레브란트 인자 ( rVWF )의 단독으로 또는 인간 재조합 인자 VIII ( rFVIII )와의 조합으로의 급성 독성
본 연구의 목표는 C57BL/6J 마우스에서 단일 정맥내 주사 (임상 적용 경로) 후에 재조합 VWF (rVWF)의 단독으로 또는 재조합 인자 VIII (rFVIII) (애드베이트®, 박스터)와 조합으로의 급성 독성 프로필을 결정하기 위한 것이다. 혈전 사건, 특히 미세혈관성의 혈전 사건이 시험 물질의 투여 후에 일어날 수 있는지 결정하기 위해 연구를 수행하였다. 본 연구를 위해 C57BL/6J 주의 마우스를 선택하였고, 이는 평행 급성 독성 연구에서 사용된 VWF-결핍 마우스 및 ADAMTS13-결핍 마우스에 대한 유전적 배경 동물주이기 때문이다 (실시예 2 및 3 참조).
단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여되는 재조합 VWF를 인간 혈장-유래 VWF-FVIII 제제 (해메이트® P), 대응하는 용액 버퍼 (비히클 대조군), 및 등장성 염수 (음성 대조군)와 비교하였다.
재조합 VWF를 단독으로 5개의 용량 수준에서 (4000, 2000, 1000, 500 및 250 리스토세틴 보조인자 (RCo) U/kg (체중) (BW)), 및 rFVIII와 조합으로 또한 5개의 용량에서 시험하였다. 조합 투여에서, rVWF의 용량은 단일 투여에서와 동일하였고, rFVIII의 용량은 감소하는 순서로 3077, 1538, 769, 385 및 192 IU/kg rFVIII이었으며, 즉, 4000 RCoU/kg BW rVWF는 3077 IU/kg rFVIII와 동시투여되고, 2000 RCoU/kg BW rVWF는 1538 IU/kg rFVIII와 동시투여된다. 해메이트® P는 2000 RCoU/kg BW (+ 1347 IU/kg BW FVIII)에서 시험되었다. rVWF 단독에 대한 대응하는 버퍼, 혼합 버퍼, 및 등장성 염수를 주어진 최고 용량 부피에 따라 투여하였다 (즉, 각각 31.7 mL/kg, 49.3 mL/kg, 및 49.3 mL/kg).
각각의 동물에게 2 mL/min의 유속을 목표로, 단일 정맥내 주사를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 군 배정 및 치료 요법은 아래 표 1에 기재된 바와 같이 수행하였다:
Figure pct00001
가능한 즉각적 및 지연된 효과를 평가하기 위해 연구를 단기 부분 및 장기 부분으로 나누었다. 각각의 부분은 14개의 군으로 구성되고, 각각의 군은 10마리의 동물 (5마리 수컷 및 5마리 암컷)을 포함하였다. 단기 부분은 처리 1일 후에 종결되고, 장기 부분은 14일의 관찰 후에 종결되었다. 혈액 샘플은 제1일 (연구 부분 1) 또는 제14일 (연구 부분 2)에 마취 (케타민 및 자일라진) 하에 마우스로부터 심장 천자에 의해 채취하였다. 모든 생존하는 동물을 각각의 연구 부분의 끝에 칭량하고, 적혈구 용적률, 혈소판 계수, 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 수준, 및 크레아티닌 키나제 (CK) 수준의 분석을 위해 혈액 샘플을 채취하였다. 검시를 수행하고, 선택된 장기 (부신, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 비장, 및 눈)을 보존하고 조직병리학적으로 평가하였다.
1차 종점은 사망이었다. 활동 수준 및 신체 상태를 주사 후 처음 6시간 동안 면밀하게 모니터링하고, 독성을 표시하는 징후에 대해 그 후 14일까지 매일 검토하였다. 전반적인 건강의 표시를 제공하기 위해 모든 동물을 제0일 및 제1일 (단기 부분) 및 제1일, 제7 (8)일 및 제14일 (장기 부분)에 칭량하였다.
통계적 평가를 위한 2차 종점은 체질량 발달 (제0일의 체질량의 백분율으로서) 및 혈액학적 및 혈청학적 변수의 변화였다. 혈액학적 및 혈청학적 변수의 변화는 기술 통계학을 이용하여 분석하였다. 분석된 변수는 적혈구 용적률, 혈소판 계수, LDH 및 CK이었다.
본 연구의 조건 하에, rVWF의 단독으로 4000, 2000, 1000, 500 및 250 RCoU/kg BW의 용량에서 또는 rFVIII과 조합으로 3077, 1538, 769, 385 및 192 IU/kg BW의 용량에서 정맥내 투여는 임의의 자발적인 사망과 연관되지 않았다. 체질량의 명백한 용량-관련 변화는 없었다. 해메이트® P와 비교하면 통계상 유의한 차이는 없었다.
마우스에서 독성을 표시하는 임상 증상을 rFVIII와 함께 또는 그 없이 4000 또는 2000 RCoU/kg BW에서 rVWF로 처리한 고용량군에서 관찰하였다. rVWF를 2000 RCoU/kg BW 또는 그 초과의 용량에서 단독으로 또는 rFVIII와 조합으로 사용할 때 제1일에 혈소판감소증이 명백하였고 14일 후에 회복하였다. 다른 변수들은 생물학상 관련 변화를 보이지 않았다. 선택된 혈액학적 및 혈청 화학 변수의 데이타를 비교하면, 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여된 2000 RCoU/kg 및 그 초과의 용량에서 rVWF의 투여 후에 제1일에 혈소판-계수의 강하가 관찰되었다. 1일 후에 rFVIII와 조합으로 rVWF로 2000 RCoU/kg BW 또는 그 초과의 용량으로 처리한 군에서 혈액 내의 락테이트 데히드로게나제 농도의 증가가 보였다. 모든 변수는 14일 후에 정상 수준으로 되돌아갔다.
조직병리학적 변화는 500 RCoU/kg BW 또는 그 초과의 용량에서 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 rVWF를 투여한 후에 저등급 "허혈성 심장병"의 모습을 밝혔다. 이들 변화는 관상 미세혈전, 심근 괴사, 심근 변성/보상 (모두 최소 내지 중등도의 중증도), 및 경미하게 증가된 관상 혈관주위염으로 이루어졌다. 대부분의 이들 변화는 특히 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 동물에서 발병률 (및 부분적으로 또한 중증도)에서 경미한 용량-의존 증가를 보였다. 이들은 rVWF가 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여되어, 500 RCoU/kg 및 그 초과의 용량에서 C57BL/6J 마우스에서 혈전생성 가능성을 가짐을 나타냈다.
제1일에 예정된 검시를 한 동물에서, 저산소증에 매우 예민한 심장에서 혈전색전성 변화가 기록되었다. 관상 미세혈전에 의한 혈관 폐색은 심장으로의 혈류를 감소시키고, 이는 허혈성 심근 괴사 (산소 결핍에 이차적인 세포 단식 (starvation)) 및 반응성 관상 혈관주위염을 유발한다 (초기 효과).
제14일에 예정된 검시를 한 동물에서, 심장에서 두드러진 변성 및/또는 보상적 변화가 기록되었다 (염증, 섬유증, 석회화, 헤모시데린 축적). 이들 심근 경색-유사 변화는 미세혈전에 의한 선행 혈관 폐색의 결과인 것으로 보였다 (지연된 효과).
해메이트® P 처리 (본원에서 양성 대조군으로서 사용됨)에 대해 독성 효과가 입증될 수 없었다. 해메이트® P에서 독성 효과의 이러한 결여는 아마도 VWF 다량체의 상이한 조성 때문이고, 여기서 초고분자량 형태가 부재하고 이것은 해메이트® P 내에 존재하는 VWF 하위단위가 ADAMTS13에 의해 절단되기 때문이다. 또한, 해메이트® P는 다양한 오염 혈장 단백질뿐만 아니라 최종 조성물 내에 시트레이트를 함유하고, 이것이 또한 결과에 영향을 미칠 수도 있다.
인간 rVWF는 쥐 ADAMTS13에 대해 저항성이기 때문에, 마우스는 쥐 ADAMTS13에 의해 인간 rVWF 하위단위를 충분하게 절단하고 rVWF의 초고분자량 다량체를 감소시킬 수 없다. 또한, 웨스턴 블롯 분석에 의해, C57BL/6J 정상 마우스는 이들 마우스에서 ADAMTS13 활성이 감소되기 때문에 순환계 내에 초고분자량 다량체를 갖는 VWF를 갖는다. 따라서, 인간 rVWF의 투여는 초생리학적 순환 수준의 VWF 및 특히 초고 VWF 다량체의 존재의 실질적인 증가를 일으킨다. 결과적으로, 미세혈전증의 관찰된 증상은 과장된 약물학적 효과로서 해석될 수 있다.
C57BL/6J 마우스에서 rVWF에 대한 "유해한 효과가 관찰되지 않는 수준 용량 (NOAEL)"은 250 RCoU/kg BW이었다. 따라서, C57BL/6J 마우스는 250 RCoU/kg BW보다 더 큰 농도에서 rVWF의 용량을 투여받으면 TTP의 모델로서 사용될 수 있다.
rVWF의 독성학 프로필의 동물주-특이적 차이에 관련하여, 정상 C57BL/6J 마우스는 rVWF에 대해 ADAMTS13-결핍 마우스보다 명백하게 덜 감수성이지만, rVWF에 대해 VWF-결핍 마우스보다 경미하게 더 감수성이다 (실시예 2 및 3 참조).
실시예 2:
VWF -결핍 마우스에서 인간 재조합 폰 빌레브란트 인자 ( rVWF )의 단독으로 또는 인간 재조합 인자 VIII ( rFVIII )와의 조합으로의 급성 독성
본 연구의 목표는 VWF-결핍 마우스에서 단일 정맥내 주사 (임상 적용 경로) 후에 rVWF 단독으로 또는 rFVIII (애드베이트®, 박스터)와 조합으로의 급성 독성을 결정하기 위한 것이다. VWF-결핍 마우스 (박스터)를 연구를 위해 선택하였고, 이것은 상기 트랜스제닉 동물주가 VWF가 결여되는 환자에서의 병태를 모방하기 때문이다.
단독으로 또는 rFVIII (애드베이트®)와 조합하여 투여되는 rVWF의 하나의 로트 (lot)를 혈장-유래 VWF-FVIII 제제 (해메이트® P), 대응하는 용액 버퍼 (비히클 대조군), 및 등장성 염수 (음성 대조군)와 비교하였다. 재조합 VWF를 단독으로 5개의 용량 수준에서 (4000, 2000. 1000, 500 및 250 리스토세틴 보조인자 (RCo) U/kg (체중) (BW)), 또는 rFVIII와 조합으로 또한 5개의 용량에서 시험하였다. 조합 투여에서, rVWF의 용량은 단일 투여에서와 동일하였고, rFVIII의 용량은 감소하는 순서로 3077, 1538, 769, 385 및 192 IU/kg rFVIII이었으며, 즉, 4000 RCoU/kg BW rVWF는 3077 IU/kg rFVIII와 동시투여되고, 2000 RCoU/kg BW rVWF는 1538 IU/kg rFVIII와 동시투여된다. 해메이트® P는 2000 RCoU/kg BW (+ 1347 IU/kg BW FVIII)에서 시험되었다. rVWF 단독에 대한 대응하는 버퍼, 혼합 버퍼, 및 등장성 염수를 주어진 최고 용량 부피에 따라 투여하였다.
각각의 동물에게 2 mL/min의 유속을 목표로, 단일 정맥내 주사를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 군 배정 및 치료 요법에 대해서는 아래 표 2를 참조한다:
Figure pct00002
가능한 즉각적 및 지연된 효과를 평가하기 위해 연구를 단기 부분 및 장기 부분으로 나누었다. 각각의 부분은 14개의 군으로 구성되고, 각각의 군은 10마리의 동물 (5마리 수컷 및 5마리 암컷)을 포함한다. 단기 부분은 처리 1일 후에 종결되고, 장기 부분은 14일의 관찰 후에 종결되었다. 모든 생존하는 동물을 각각의 연구 부분의 끝에 칭량하고, 적혈구 용적률, 혈소판 계수, 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 수준, 및 크레아티닌 키나제 (CK) 수준의 분석을 위해 혈액 샘플을 채취하였다. 검시를 수행하고, 선택된 장기 (부신, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 비장, 및 눈)을 보존하고 조직병리학적으로 평가하였다.
상기 제시된 조건 하에, rVWF의 단독으로 4000, 2000. 1000, 500 및 250 RCoU/kg BW의 용량에서 또는 rFVIII와 조합으로 3077, 1538, 769, 385 및 192 IU/kg BW의 용량에서 정맥내 투여는 임의의 자발적인 사망과 연관되지 않았다.
체질량 발달은 rVWF 단독 또는 rVWF + rFVIII를 각각 500 또는 4000 RCoU/kg BW의 용량에서 사용한 처리에 의해 영향을 받지 않았다. 해메이트® P로 처리한 동물과 대응하는 용량의 rVWF + rFVIII로 처리한 동물의 평균 체질량 발달 (제0 내지 1일 및 제0 내지 14일) 사이에 통계상 유의한 차이는 없었다.
임상 증상을 rFVIII와 함께 또는 그 없이 4000 RCoU/kg BW에서 rVWF로 처리한 고용량군의 동물에서 관찰하였다. rFVIII와 함께 또는 그 없이 2000 RCoU/kg BW 또는 그 이상의 rVWF의 용량에서 제1일에 혈소판감소증이 명백하였고 14일 후에 회복하였다. 다른 변수들은 생물학상 관련 변화를 보이지 않았다.
조직병리학적 변화는 1000 RCoU/kg BW 또는 그 초과의 용량에서 단독으로 또는 rFVIII와 조합으로의 rVWF의 투여 후에 저등급 "허혈성 심장병"의 모습을 밝혔다. 해메이트® P에 대해 독성 효과가 입증될 수 없다. 본원에서 실시예 1에서 논의된 바와 같이, 인간 rVWF가 쥐 ADAMTS13에 대해 저항성이기 때문에, 마우스는 쥐 ADAMTS13에 의해 rVWF 하위단위를 충분하게 절단하고 rVWF의 초고분자량 다량체를 감소시킬 수 없다. 따라서, 미세혈전증의 관찰된 증상은 과장된 약물학적 효과로서 해석될 수 있다.
VWF-결핍 마우스에서 rVWF에 대한 NOAEL은 500 RCoU/kg BW이었다. 따라서, VWF-결핍 마우스는 마우스가 500 RCoU/kg BW보다 더 큰 농도에서 rVWF의 용량을 투여받으면 VWF가 결핍되는 사람에 대한 TTP의 모델로서 사용될 수 있다.
추가로, 본 연구는 내인성 쥐 VWF의 존재 (실시예 1에서 마우스에서 명백한)가 독성에 대해 영향을 미쳤음을 보여주고, 이것은 대조 마우스 (C57BL/6J)가 250 RCoU/kg BW의 NOAEL을 가져서 rVWF에 대해 더 감수성이었기 때문이다.
실시예 3:
ADAMTS13 -결핍 마우스에서 인간 재조합 폰 빌레브란트 인자 ( rVWF )의 단독으로 또는 인간 재조합 인자 VIII ( rFVIII )와의 조합으로의 급성 독성
본 연구의 목표는 ADAMTS13-결핍 마우스 (박스터)에서 단일 정맥내 주사 (임상 적용 경로) 후에 rVWF 단독으로 또는 rFVIII (애드베이트®, 박스터)와 조합으로의 급성 독성을 결정하기 위한 것이다. ADAMTS13은 고분자량 다량체를 감소시키도록 VWF를 절단하는 프로테아제이다. 따라서, ADAMTS13 낙아웃 마우스는 ADAMTS13의 결여 때문에 Tyr1605-MET1606에서 rVWF 하위단위를 절단할 수 없다. 결과적으로, 이들 마우스는 초고 VWF 다량체를 파괴할 수 없어서, 다수 장기에서 미세혈관 혈전증을 일으킨다. 따라서, 이들은 그의 상대물 대조군보다 훨씬 더 저용량에서 rVWF의 유해한 효과에 감수성일 것이다. ADAMTS13-결핍 마우스를 연구를 위해 선택하였고, 이것은 상기 트랜스제닉 동물주가 VWF에 대한 ADAMTS13-절단 프로테아제가 결여되는 환자에서의 병태를 모방하기 때문이다.
단독으로 또는 애드베이트®와 조합하여 투여되는 재조합 VWF를 혈장-유래 VWF-FVIII 제제 (해메이트® P), 대응하는 용액 버퍼 (비히클 대조군), 및 등장성 염수 (음성 대조군)와 비교하였다. 재조합 VWF를 단독으로 5개의 용량 수준에서 (4000, 2000, 1000, 500 및 250 리스토세틴 보조인자 (RCo) U/kg (체중) (BW)), 또는 rFVIII와 조합으로 또한 5개의 용량에서 시험하였다. 조합 투여에서, rVWF의 용량은 단일 투여에서와 동일하였고, rFVIII의 용량은 감소하는 순서로 3077, 1538, 769, 385 및 192 IU/kg rFVIII이었고, 즉, 4000 RCoU/kg BW rVWF는 3077 IU/kg rFVIII와 동시투여되고, 2000 RCoU/kg BW rVWF는 1538 IU/kg rFVIII와 동시투여된다. 해메이트® P는 4000 RCoU/kg BW VWF (+ 3322 IU/kg BW FVIII) 및 2000 RCoU/kg BW VWF (+ 1664 IU/kg BW FVIII)에서 시험되었다 (표 3). rVWF 단독에 대한 대응하는 버퍼, 혼합 버퍼, 및 등장성 염수를 주어진 최고 용량 부피에 따라 투여하였다. 예를 들어, rVWF 단독에 대한 대응하는 버퍼는 31.7 mL/kg (rVWF의 최고 용량 부피에 따라)에서, 혼합 버퍼는 49.3 mL/kg (rVWF + rFVIII의 조합 투여의 최고 부피에 따라)에서, 등장성 염수는 51.1 mL/kg (해메이트® P의 최고 부피에 따라)에서 투여되었다.
각각의 동물에게 2 mL/min의 유속을 목표로, 단일 정맥내 주사를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 군 배정 및 치료 요법에 대해서는 아래 표 3을 참조한다:
Figure pct00003
가능한 즉각적 및 지연된 효과를 평가하기 위해 연구를 단기 부분 및 장기 부분으로 나누었다. 각각의 부분은 10마리의 동물 (5마리 수컷 및 5마리 암컷)의 군으로 구성되었다. 단기 부분은 처리 1일 후에 종결되고, 장기 부분은 14일의 관찰 후에 종결되었다. 모든 생존하는 동물을 각각의 연구 부분의 끝에 칭량하고, 적혈구 용적률, 혈소판 계수, 및 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 수준의 분석을 위해 혈액 샘플을 채취하였다. 검시를 수행하고, 선택된 장기 (부신, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 비장, 및 눈)을 보존하고 조직병리학적으로 평가하였다.
시험 화합물로 처리된 고용량군, 참조 화합물-처리군, 대조군에서 모든 동물로부터 검시에서 수집한 모든 조직 샘플뿐만 아니라 모든 육안 소견의 조직 샘플의 슬라이드를 처리하고, 파라핀 내에 포매하고, 2-4 ㎛의 공칭 두께로 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하고, 연구 병리학자가 광학 현미경으로 검사하였다. 동일한 과정을 모든 다른 시험 화합물 처리군 내의 모든 동물의 몇몇 장기 (심장, 뇌, 눈, 신장, 부신, 및 폐)로부터의 조직 샘플에 적용하였다.
본 연구에서 최고 사망률은 해메이트® P를 4000 RCoU/kg 용량 수준에서 처리한 군에서 관찰되었고; 80% (10마리 중 8마리)는 투여 직후에 죽었고, 이때 시트르산나트륨 과부하 (overload) (281 mg/kg 시트레이트를 51.1 mL/kg의 투여된 부피로 주사하였다)의 명백한 징후를 보였다. 마우스에서 정맥내 적용 후 시트르산나트륨의 LD50는 231 mg/kg이므로 (Sax's Dangerous Properties of Industrial Materials, 8th edition, 1992), 해메이트® P의 용량을 2000 RCoU/kg VWF로 바꾸었다. 추가의 사망은 해메이트® P를 사용할 때 상기 용량 수준에서 관찰되지 않았다.
4000 RCoU/kg의 rVWF를 단독으로 투여한 동물의 40% (20마리 중 8마리)는 죽은 반면, 2000 RCoU/kg을 투여한 동물에서 사망률은 20% (20마리 중 4마리)로 감소하였다. 보다 저용량군에서 추가의 사망은 없었다. 4000 RCoU/kg rVWF를 3077 IU/kg rFVIII와 조합하여 투여한 동물의 25% (20마리 중 5마리)가 죽었다. 보다 저용량군에서, 심지어 2000 RCoU/kg을 rFVIII와 조합하여 투여한 군에서 추가의 사망은 없었다. 4000 RCoU/kg 용량군의 주사된 부피 내에 141 mg/kg 시트르산나트륨이 존재하므로, 이것이 또한 이들 군에서 일부 돌연사에 대한 이유일 수 있다. 상기 사인은 고용량군에서 지연된 사례 및 2000 RCoU/kg 용량군에서 돌연사를 위해 배제될 수 있다.
통계상 애드혹 (ad hoc) 수행된 경향 검정은 rVWF의 용량이 증가함에 따라 사망 확률이 증가함을 입증하였다 (양측 p-값 < 0.0001).
2000 RCoU/kg VWF + 1664 IU/kg FVIII의 용량으로 투여된 해메이트® P에서 사망은 없었고 (20마리 중 0마리), 2000 RCoU/kg rVWF + 1538 IU/kg rFVIII를 사용할 때 사망은 없었다 (20마리 중 0마리).
임상 관찰은 넓은 스펙트럼의 이상을 밝혔다. 버퍼군의 동물의 20% (20마리 중 4마리)에서 시트르산나트륨 독성에 대한 전형적인 증상 (예를 들어, 단기 행동 저하, 발작, 호흡곤란)이 기록되었기 때문에, 단기 증상은 주사된 시트르산나트륨의 양에 의해 또한 명백하게 유발되었다.
그러나, 투여된 용량과 증상의 발병률 및 중증도 사이에 명백한 상관관계가 존재하였다. 동물의 85% (20마리 중 17마리)는 4000 RCoU/kg rVWF를 투여받은 후 이환된 반면, 동물의 45% (20마리 중 9마리)는 2000 RCoU/kg rVWF를 투여받은 후 이환되었다.
4000 RCoU/kg을 3077 IU/kg rFVIII와 조합하여 투여한 동물의 75% (20마리 중 15마리)에서 임상 이상이 관찰된 반면, 35% (20마리 중 7마리)는 2000 RCoU/kg rVWF를 1538 IU/kg rFVIII와 조합하여 투여한 후에 이환되었다. rVWF 단독으로 또는 rFVIII와 조합으로 처리한 임의의 다른 군에서 임상 이상이 기록되지 않았다.
해메이트® P를 4000 RCoU/kg 용량 수준에서 처리한 군 (90%, 10마리 중 9마리의 동물)에서 관찰된 증상은 명백하게 시트레이트 과부하 (281 mg/kg)에 의해 유발되고, 즉사를 일으켰다. 2000 RCoU/kg 해메이트® P로 처리한 군에서 모든 이환된 동물 (40%, 20마리 중 8마리 동물)은 또한 시트르산나트륨 독성 (140.5 mg/kg; 예를 들어, 단기 행동 저하, 발작, 호흡곤란)을 표시하는 단기 이상만을 보였다. 추가의 장기 증상이 기록되지 않았다.
제0일 내지 제1일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량 (MDD)은 1000 RCoU/kg rVWF + 769 IU/kg rFVIII인 것으로 추정되었다. 따라서, 500 RCoU/kg rVWF + 385 IU/kg rFVIII의 용량은 제0일 내지 제1일의 체질량 발달의 면에서 NOAEL 용량으로서 간주될 수 있었다. 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량은 없었고, 따라서, 조사된 rVWF + rFVIII의 최고 용량 (4000 RCoU/kg + 3077 IU/kg)은 제0일 내지 제14일의 체질량 발달의 면에서 NOAEL 용량으로서 간주될 수 있었다.
단독 투여된 rVWF에 대한 제0일 내지 제1일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량 (MDD)은 2000 RCoU/kg인 것으로 추정되었다. 따라서, 1000 RCoU/kg의 용량은 제0일 내지 제1일의 체질량 발달의 면에서 유해한 효과가 관찰되지 않는 수준 (NOAEL) 용량으로서 간주될 수 있었다. 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량은 조사된 rVWF의 최저 용량 (250 RCoU/kg)인 것으로 추정되었다. 따라서, 조사된 rVWF의 용량들 사이의 용량은 제0일 내지 제14일의 체질량 발달의 면에서 NOAEL 용량으로서 간주될 수 없었다. 체질량의 증가 (2.3% vs. 버퍼군에 대해 4.8%)는 염수 (1.8%) 및 해메이트® P (1.5%)보다 더 높고, 250 RCoU/kg rVWF + rFVIII (2.7%)로 처리한 군에 유사하기 때문에, 상기 추정된 차이는 예측불가능한 것으로 여겨질 수 있다. 제0일 내지 제1일의 평균 체질량 발달은 2000 RCoU/kg의 용량으로 투여된 해메이트® P + 1664 IU/kg FVIII를 사용할 때 0.6%, 및 대응하는 용량의 투여된 rVWF + rFVIII를 사용할 때 -7.4%이었다. 상기 차이는 5% 수준에서 통계상 유의하였다 (양측 p-값 < 0.0001). 제0일 내지 제14일에 통계상 유의한 차이는 발견되지 않았다.
생존하는 동물에서 선택된 혈액학적 및 혈청 화학 변수의 데이타를 비교하면, 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여되는 1000 RCoU/kg rVWF 및 그 초과의 용량의 투여 후에 제1일에 혈소판-계수의 강하가 관찰되었다. 추가로, 적혈구 용적률은 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여되는 2000 RCoU/kg rVWF 및 보다 고용량의 투여 후에 강하하였다.
대조군에 비해, 락테이트 데히드로게나제는 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여되는 2000 RCoU/kg rVWF 및 보다 고용량을 사용한 처리 후에 제1일에 증가하였다.
혈소판 계수의 강하는 해메이트® P (+ 1664 IU/kg FVIII) 내에서 2000 RCoU/kg VWF의 적용의 1일 후에만 측정될 수 있었다. 측정된 변수는 14일의 관찰 후에 모든 이환된 군에서 정상 수준으로 되돌아갔다.
조직병리학적 검사에 의해 많은 이환된 장기를 밝혔다: 심장 (관상 미세혈전, 심근 괴사, 증가된 관상 혈관주위염, 심근 변성/보상), 뇌 (미세혈전, 아교 세포 병소), 눈 (미세혈전), 신장 (미세혈전, 피질 괴사), 부신 (미세혈전, 출혈), 및 폐 (미세혈전의 증가된 발병률 또는 평균 중증도). 이들 병리조직학적 변화는 파종성 혈관내 응고병증 (DIC)으로서 요약될 수 있다. 고용량 (≥2000 RCoU rVWF)에서, 동물은 어느 정도까지 인간의 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)의 모습과 유사하다. 보다 저용량 (500-1000 RCoU)에서, 심장은 저등급 "허혈성 심장병"의 모습과 유사한 병리조직학적 변화로 주로 이환되었다. 재조합 생성물(들)을 투여받은 시험 화합물-처리된 동물과는 반대로, 인간 혈장-유래 VWF-FVIII 제제 (해메이트® P)를 투여받은 참조 화합물-처리된 동물에서 그러한 소견은 기록되지 않았다. 여기에서, 단지 저등급 폐 미세혈전이 대조군 동물에서와 유사한 발병률로 기록되었다.
예정일 제1일에 치사시킨 (또는 투여 직후에 자발적으로 죽은) 시험 화합물-처리된 동물에서 하나 또는 몇몇 장기에 대해 혈전색전성 변화가 기록되었다. 저산소증에 매우 예민한 심장이 가장 중증으로 이환된 장기이다. 관상 미세혈전에 의한 혈관 폐색은 심장으로의 혈류를 감소시키고, 이는 허혈성 심근 괴사 (산소 결핍에 이차적인 세포 단식) 및 반응성 관상 혈관주위염을 유발한다 (초기 효과).
예정일 제14일에 치사시킨 (또는 투여 후에 조금 늦추어 자발적으로 죽은) 시험 화합물-처리된 동물의 심장에서 두드러진 변성 및/또는 보상적 변화가 기록되었다 (염증, 섬유증, 헤모시데린 축적, 석회화). 이들 심근 경색-유사 변화는 미세혈전에 의한 선행 혈관 폐색의 결과인 것으로 보였다 (지연된 효과). 자발적으로 죽은, 2000 RCoU/kg rVWF 단독으로 처리한 군의 1마리의 동물에서 기록된 신 피질 괴사는 동일한 방식으로 해석될 수 있다. 여기서, 미세혈전에 의한 신장 혈관의 혈관 폐색은 신 경색증을 일으켰다.
동반하는 장기 파괴 없이 낮은 발병률의 미세혈전 (최소 내지 경미한 등급)이 염수-, 버퍼- 및 또한 해메이트® P-처리된 대조군 동물의 몇몇 장기 (폐, 신장, 뇌)에 대해 기록되었다.
기록된 병리학적 변화는 하나 또는 몇몇 장기 내의 유해한 미세혈전증으로 구성되었다. 이들은 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여되는 500 RCoU/kg rVWF 및 보다 고용량에서, VWF 절단 프로테아제가 결여되는 상기 동물 모델 (ADAMTS13-결핍 마우스)에서 시험 화합물인 rVWF의 혈전생성 가능성을 나타낸다. 저용량 군 (rVWF 단독 및 rVWF와 조합된)에서 유해한 조직병리학적 변화가 기록되지 않았으므로, NOAEL은 250 RCoU/kg로 확립될 수 있었다.
rVWF를 절단하지 못하기 때문에, ADAMTS13-낙아웃 마우스는 rVWF를 사용한 처리에 매우 감수성이었다. 실제로, ADAMTS13 낙아웃 마우스는 본 연구에서 시험된 가장 감수성인 쥐 동물주를 나타낸다. 결과는 내인성 쥐 ADAMTS13의 부재에 의해 및 또한 초고 VWF 다량체를 갖는 내인성 쥐 VWF의 존재에 의해 유발된, 고용량에서 rVWF의 과장된 약물학적 효과로서 해석될 수 있다. ADAMTS13 낙아웃 마우스에서 rVWF에 대한 NOAEL은 250 RCoU/kg BW이었다. 따라서, ADAMTS13-결핍 마우스는 마우스가 250 RCoU/kg BW보다 더 큰 농도에서 rVWF의 용량을 투여받으면 ADAMTS13이 결핍되는 사람에 대한 TTP의 모델로서 사용될 수 있다.
내인성 쥐 VWF의 존재 하에 ADAMTS13의 부재 (ADAMTS13 낙아웃)는 사망률 및 독성에 대해 가장 중증 효과를 갖고, 다수 장기에서 미세혈관 혈전증을 일으킨다.
실시예 4:
ADAMTS13 -결핍 마우스에서 인간 재조합 폰 빌레브란트 인자 ( rVWF )의 급성 독성은 ADAMTS13의 동시투여로 약화될 수 있다
본 연구의 목적은 ADAMTS13-결핍 마우스 (박스터)에서 재조합 ADAMTS13의 동시투여 (즉, 교체)에 의해 rVWF의 급성 독성이 약화될 수 있는지 여부를 평가하기 위한 것이다.
실시예 3에 기재된 바와 같이, 인간 rVWF로 처리한 마우스에 비해, 양성 대조군으로서 사용된 해메이트® P로 처리한 ADAMTS13-결핍 마우스에서 실질적인 효과는 없었다. 상기 차이는 상이한 화합물 내의 VWF 다량체의 상이한 조성 때문이고, 여기서 해메이트® P 내에 존재하는 VWF 하위단위가 ADAMTS13에 의해 절단되기 때문에 해메이트® P 내에 초고분자량 형태가 부재한다. 또한, 해메이트® P는 다양한 오염 혈장 단백질뿐만 아니라 시트레이트 및 ADAMTS13을 함유하고, 이것이 또한 결과에 영향을 미칠 수도 있다.
본 연구에서, 인간 rVWF (박스터)를 2000 RCoU/kg의 투여량에서 + 인간 rADAMTS13 (CHO 세포, 클론 938으로부터, 박스터)를 19.4 ㎍/kg의 투여량에서 (인간 혈장-유래 제제인 해메이트® P 내에서 분석된 비에 따라) 투여하였다. 화합물들을 적용 직전에 시린지 (syringe) 내에서 예비혼합된 상태로 주사하거나 (군 A, 10마리의 마우스), rADAMTS13의 제1 주사에 이어 즉시 rVWF 주사로서 연속적으로 주사하였다 (군 B, 10마리의 마우스).
동물을 제1일에서 종결까지 주사 후에 독성을 표시하는 징후에 대해 관찰하였다. 본원에서 상기 기재된 선행 연구에서와 같이, 혈액 샘플은 마취 하에 채취하고, 조직을 조직학 분석을 위해 준비하고, 검시를 수행하였다.
치료 요법에 무관하게 어떠한 동물에서도 사망 또는 임상 독성의 징후가 관찰되지 않았고, 이것은 rVWF의 독성을 감소시키는데 있어서 ADAMTS13의 역할을 명백하게 입증한다.
분석 데이타를 비교하면, 예비혼합된 화합물들의 투여와 반대로 rADAMTS13 및 rVWF의 연속 투여의 1일 후에 혈소판 계수의 강하가 측정되었다. 가능한 시험 화합물-관련 연관성을 표시하는 검시 소견은 없었다. 시험 화합물-처리된 동물 군 A 및 B에서 관상 미세혈전 (최소 내지 경미한 등급), 심근 괴사 (최소 내지 중등도 등급), 및 경미하게 증가된 관상 혈관주위염으로 이루어지는 심장에 대한 조직병리학적 변화가 기록되었다.
또한, 군 B의 단일 시험 화합물-처리된 동물에서 경미한 등급 섬유증이 기록되었다. 명백하게 만성의 징후를 특징으로 하는 상기 소견은 투여의 1일 후에 치사시킨 동물에서 기록되었으므로 기존에 존재하는 것으로 보였고, 따라서, 시험 화합물에 관련되지 않았다.
2개의 군 (A vs. B)을 비교하고 rADAMTS13 및 rVWF의 연속 투여 후 혈소판 계수의 강하를 고려하면, 조직병리학적 변화의 중증도 또는 발병률의 확연한 차이는 기록되지 않았다. 그러나, 실시예 3에 기재된 연구 (rADAMTS13 동시투여 없이)와 반대로, 본 연구에서 검시에서 사망 및 시험 화합물-관련된 육안 소견이 기록되지 않았다. 심근 괴사의 발병률 및 중증도는 두 연구에서 유사하였다 (실시예 3 및 4). 그러나, 관상 미세혈전증 및 관상 혈관주위염은 rADAMTS13 동시투여에서 덜 확연하였다. 또한, rADAMTS13 동시투여시에 처리-관련 효과는 심장에 대해서만 기록된 한편, ADAMTS13 동시투여가 없는 연구 (실시예 3)에서 뇌, 신장 및 폐에 대해 미세혈전이 또한 기록되었다.
절단 효소 ADAMTS13과의 동시투여 후에 rVWF의 응고촉진 활성의 감소는 상기 동물 모델에서 rVWF의 약물학적 효과에 대한 ADAMTS13의 중요성을 반영하고, 또한 실시예 3에서 해메이트® P의 관찰된 독성의 결여를 부분적으로 해명한다.
실시예 5:
쥐 ADAMTS13 은 rVWF 와 반응하지 않는다
ADAMTS13은 고분자량 다량체를 감소시키도록 VWF를 절단하는 프로테아제이다. 쥐 ADAMTS13은 시험관내 시험 및 생체 외에서 입증된 바와 같이 인간 재조합 VWF와 반응하지 않는다.
마우스는 감소된 ADAMTS13 활성을 갖고, 따라서, 쥐 혈장은 초고 VWF 다량체를 함유한다. rVWF의 투여는 초생리학적 수준 및 과장된 약물학적 효과를 일으킬 것이다.
인간 rVWF는 쥐 ADAMTS13의 단백질 분해 활성에 대해 저항성이다. 데이타는 인간 rVWF를 마우스를 비롯한 다양한 종의 혈장에 노출시키고 잔류 VWF 활성을 측정하거나 다량체 조성물을 가시화함으로써 시험관 내에서 이를 입증하였다. 데이타는 또한 쥐 ADAMTS13에 대한 인간 VWF의 저항성을 생체 외에서 rVWF를 마우스에 주입한 후에 입증하였다. 주입 후 다양한 시점에 수득한 혈장 샘플은 Tyr1605-Met1606에서 ADAMTS13 절단의 작용으로부터 유래된 임의의 VWF 단편 (C-말단 176 kD 및 N-말단 140 kD)을 보이지 않았고, 이것은 생체 내에서 쥐 ADAMTS13에 대한 rVWF의 저항성과 일치한다. 이와 반대로, 토끼에 rVWF를 투여하면 VWF 하위단위의 예상된 절단 패턴을 생성시켜, 모노클로날 항체를 사용한 면역블롯 상에 단편이 출현한다. 도 1을 참조한다.
rVWF는 ADAMTS13 특이적 단백질 분해작용에 노출되지 않았기 때문에, rVWF는 무손상 VWF 하위단위로 구성된다. 혈장-유래 VWF는 VWF의 A2 도메인 내의 Tyr1605-Met1606에서 절단된 하위단위로 구성된다. rVWF는 마우스 내에서 보다 저분자량 VWF 다량체로 처리되지 않아서, 과장된 약물학적 효과 및 잠재적으로 혈전생성성 다량체를 생성시킨다.
실시예 6-9의 실험 개관
마우스를 다양한 조건에 노출시키고 TTP 증상 및 독성을 관찰함으로써 TTP에 대한 동물 모델을 확립하였다. 야생형 (C57BL/6J) 마우스, VWF-결핍 마우스, 및 ADAMTS13 낙아웃 마우스로부터 데이타 세트를 모았다. 마우스를 rVWF 단독 (5개의 투여량 중 하나에서), rVWF의 rFVIII (애드베이트)와 조합으로 (각각 5개의 투여량 중 하나에서), 해메이트® P (인간 혈청으로부터 단리된 VWF 및 FVIII의 시판 제제), 또는 대응하는 버퍼의 단일 주사로 처리하였다. 마우스를 주사 후 1일 및 14일에 관찰하였고, 그 후에 검시 분석을 수행하였다.
보다 구체적으로, 연구된 조건은 다음과 같았다. rVWF를 단독으로 5개의 용량 수준에서 (4000, 2000, 1000, 500 및 250 리스토세틴 보조인자 (RCo) U/kg (체중) (BW)), 및 rFVIII와 조합으로 또한 5개의 용량에서 시험하였다. 조합 투여에서, rVWF의 용량은 단일 투여에서와 동일하였고, rFVIII의 용량은 감소하는 순서로 3077, 1538, 769, 385 및 192 IU/kg rFVIII이었고, 즉, 4000 RCoU/kg BW rVWF는 3077 IU/kg rFVIII와 동시투여되고, 2000 RCoU/kg BW rVWF는 1538 IU/kg rFVIII와 동시투여된다. 해메이트® P는 2000 RCoU/kg BW (+ 1347 IU/kg BW FVIII)에서 시험되었다. rVWF 단독에 대한 대응하는 버퍼, 혼합 버퍼, 및 등장성 염수를 주어진 최고 용량 부피에 따라 투여하였다.
가능한 즉각적 및 지연된 효과를 평가하기 위해 연구를 단기 부분 및 장기 부분으로 나누었다. 각각의 부분은 14개의 군으로 구성되고, 각각의 군은 10마리의 동물 (5마리 수컷 및 5마리 암컷)을 포함하였다. 단기 부분은 적용 1일 후에 종결되고, 장기 부분은 14일의 관찰 후에 종결되었다. 모든 생존하는 동물을 각각의 연구 부분의 끝에 칭량하고, 적혈구 용적률, 혈소판 계수, 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 수준, 및 크레아티닌 키나제 (CK) 수준의 분석을 위해 혈액 샘플을 채취하였다. 검시를 수행하고, 선택된 장기 (부신, 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 비장, 및 눈)을 보존하고 조직병리학적으로 평가하였다.
1. 물질
실험을 위해 다음 물질을 사용하였다.
동결건조된 인간 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF) (630.85 IU VWF:RCo/바이알 (실제값))를 5 ml 주사용수 (WFI) 내에 재구성하였다. 재구성 시에, rVWF는 126 IU VWF:RCo/ml로 존재하였다. VWF 버퍼는 부피팽창제, 계면활성제, 안정화제 및 아미노산을 함유한 hepes/시트레이트 버퍼로 구성되었다.
애드베이트 rAHF-PFM (항혈우병 인자 (재조합) 혈장 알부민-비함유 방법; FVIII)은 876 IU/바이알로 존재하였다. WFI 내에 재구성 시에, 용액은 적절한 염, 부피팽창제, 계면활성제, 안정화제, 아미노산 및 항산화제를 함유한 Tris 버퍼로 구성되었다. 용액을 2-8℃에서 저장하였다.
rVWF 및 애드베이트의 혼합물의 비는 1.3부 rVWF:RCo (IU) 대 1부 rFVIII(IU)였다.
비히클 대조군은 rVWF에 대한 시트레이트 버퍼, 및 rVWF 버퍼 및 애드베이트 버퍼의 혼합물인 조합 버퍼로 구성되었다. 조합 버퍼는 고-용량 조합된 rVWF 및 애드베이트 군에 대해 혼합된 것과 같이 rVWF 및 애드베이트 버퍼에 대해 동일한 부피비를 혼합함으로써 제조하였다. 등장성 염수를 음성 대조군으로서 사용하였다 (0.9% NaCl).
해메이트® P (인간 혈장-유래, 항혈우병 인자-폰 빌레브란트 인자 복합체)를 활성 대조군으로서 사용하였다. 조성은 독일의 ZLB 베링 게엠베하로부터 입수한 바와 같은 1143.4 IU VWF:RCo/바이알, 770 IU FVIII/바이알이었다. WFI 내에 재구성 시에, 조성은 다음과 같았다: NaCl, 시트르산나트륨, 인간 알부민, 및 글라이신의 버퍼 내에 114.34 IU VWF:RCo/mL, 77 IU FVIII/mL.
2. 절차
a. 동물의 처리
마우스를 마크로론 (Macrolon) II 케이지 내에 수용하였다. 동물을 20.8±0.44℃ 및 21.6±0.36℃ (표적 범위: 20-24℃)의 온도 (평균±SEM), 52.8±3.51% 및 53.5±2.77% (표적 범위: 45-65%)의 상대 습도 (평균±SEM)에서 실내 3/1-83 (매시간 18회 공기 교환) 및 1:1의 주야비 (12 h 주: 12 h 야; 인공 조명)로 유지하였다.
마우스를 군 당 10마리의 동물 (5마리 수컷 및 5마리 암컷)의 28개의 군 (1-일 연구 부분에 대해 A-J 및 U-X, 및 14-일 연구 부분에 대해 K-T 및 Y-BB)에 배정하였다. 각각의 군에게 다음 처리 중 하나를 제공하였다:
- 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)를 단독으로 5개의 용량 수준에서;
- rVWF를 애드베이트 (RCoU:IUFVIII를 1.3:1의 비로)와 조합으로 5개의 용량 수준에서;
- 해메이트® P;
- rVWF 단독에 대한 대응하는 제형화 버퍼;
- 고-용량 rVWF 및 애드베이트 조합물에 대해서와 동일한 부피비로 rVWF 및 애드베이트에 대한 조합된 제형화 버퍼;
- 등장성 염수.
1차 종점은 사망이었다. 활동 수준 및 신체 상태를 주사 후 처음 6시간 동안 면밀하게 모니터링하고, 독성을 표시하는 징후에 대해 그 후 14일까지 매일 검토하였다. 전반적인 건강의 표시를 제공하기 위해 모든 동물을 제0일 및 제1일 (단기 부분) 및 제1일, 제7 (8)일 및 제14일 (장기 부분)에 칭량하였다.
각각의 동물에게 2 mL/min의 유속을 목표로, 단일 정맥내 주사를 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 군 배정 및 치료 요법에 대해서는 아래 표 4를 참조한다:
Figure pct00004
b. 체질량 분석
연구일 0일 및 연구일 1일, 7일 및 14일 사이의 체질량의 변화 (제0일의 체질량의 Δ%로서)를 품목 (item) 및 용량에 의해 분류된 상자 그림을 이용하여 시각화하였다. 이들 상자 그림을 위해 수컷 및 암컷 동물을 합하였다 (도 2-4, 13-15, 24-26 참조).
상자 그림을 다음과 같이 설계한다. 상자의 아랫변은 제25 백분위수 (또는 제1 사분위수)를 나타내고, 상자의 윗변은 제75 백분위수 (또는 제3 사분위수)를 나타내고, 상자의 아랫변 및 윗변 내의 선은 중앙값을 나타냈다. 플러스 표시는 평균을 나타냈다. 상자의 아랫변에서 윗변까지의 거리는 사분위 범위 (IQR)를 나타냈다. 제75 백분위수 위로 1.5*IQR인 값보다 더 작거나 같은 수염그림을 최대 데이타 값에 대한 제75 백분위수 위에 그렸다. 그보다 더 큰 임의의 데이타 값은 표시하였다. 제25 백분위수 아래로 1.5*IQR인 값보다 더 작거나 같은 수염그림을 최소 데이타 값에 대한 제25 백분위수 아래에 그렸다. 그보다 더 작은 임의의 데이타 값은 표시하였다.
평균 및 대응하는 양측 95% 부트스트랩-t 신뢰 구간 (Efron B and Tibshirani RJ, An Introduction to the Bootstrap, Chapman and Hall/CRC, Boca Raton, London, N.Y., Washington D.C., page 160-167 (1993))을 품목 및 용량에 의해 분류된 연구일 0일 및 연구일 1일, 7일 및 14일 사이의 체질량의 변화 (제0일의 체질량의 Δ%로서)에 대해 제공하였다. 이들 분석은 수컷 및 암컷 동물에 대해 따로 및 합한 수컷 및 암컷 동물에 대해 제0일 내지 제1일의 변화 (STADS 및 LTADS 합계), 제0일 내지 제7일의 변화 (LTADS) 및 제0일 내지 제14일의 변화 (LTADS)에 대해 수행하였다. 부트스트랩-t 신뢰 구간은 성별 및 데이타 세트에 의해 계층화된 100,000 부트스트랩 복제에 기초하여 계산하였다.
상이한 용량의 rVWF 및 rVWF + rFVIII와 대응하는 버퍼 사이의 체질량 발달의 차이는 제0일 내지 제1일의 변화 (STADS 및 LTADS 합계) 및 제0일 내지 제14일의 변화 (LTADS)에 대해 따로 평가하였다.
체질량 발달은 1,000,000 과돌연변이 복제를 사용하여 성별에 의해 계층화된 양측 과돌연변이 시험 [SAS 절차에 의해, PROC MULTTEST, 옵션 = 과돌연변이, 진술 = TEST MEAN]에 의해 명시된 대비물에 대해 비교하였다.
5개의 용량군을 대응하는 버퍼와 동시에 비교하기 위한 다중도에 대한 조정은 홀름 방법 (1979) (Holm S., Scandinavian Journal of Statistics, 6:65-70 (1979))을 이용하여 적용되었다. 조정되지 않은 및 다중도 조정된 양측 p-값을 제시하였다. 상이한 품목의 조사를 위해 및 상이한 연구일의 조사를 위해 다중도에 대한 조정은 적용되지 않았다.
해메이트® P 및 대응하는 용량의 rVWF + rFVIII 사이의 체질량 발달의 차이는 제0일 내지 제1일의 변화 (STADS 및 LTADS 합계) 및 제0일 내지 제14일의 변화 (LTADS)에 대해 따로 평가하였다. 양측 p-값은 1,000,000 과돌연변이 복제를 사용하여 성별에 의해 계층화된 과돌연변이 시험 [SAS 절차에 의해, PROC MULTTEST, 옵션 = 과돌연변이, 진술 = TEST MEAN]에 의해 계산하였다. 2개의 상이한 연구일의 조사를 위해 다중도에 대한 조정은 적용되지 않았다.
최소 검출가능한 용량 (MDD; 대응하는 버퍼로부터 옮겨진 최소 용량으로서 정의됨)은 문헌 [Tamhane et al. (Biometrics 52:21-37, 1996)]에서 제안된 바와 같이 단계-하향 방식으로 시험되는 대비물을 사용하여 추정하였다. 상기 분석은 예비적이므로, 최저 MDD를 생성시키는 대비물이 보고된 추정을 위해 선형 및 역 헬머트 대비물이 고려되었다.
이렇게 결정된 최소 검출가능한 용량은 유해한 효과가 관찰되지 않는 수준 용량 (NOAEL)보다 더 큰 하나의 용량 수준이다. 최소 검출가능한 용량은 rVWF + rFVIII에 대해 및 rVWF에 대해, 제0일 내지 제1일의 체질량 변화 (STADS 및 LTADS 합계) 및 제0일 내지 제14일의 체질량 변화 (LTADS)에 대해 따로 추정하였다.
선형 대비물에 대한 양측 p-값은 1,000,000 과돌연변이 복제를 사용하여 성별에 의해 계층화된 과돌연변이 시험 [SAS 절차에 의해, PROC MULTTEST, 옵션 = 과돌연변이, 진술 = TEST MEAN]을 이용하여 계산하였다. 상이한 품목의 조사를 위해 또는 상이한 연구일의 조사를 위해 다중도에 대한 조정은 적용되지 않았다.
c. 혈액 샘플링, 제조, 및 혈액학 및 혈청 화학 변수의 측정
혈액 샘플은 제1일 (연구 부분 1) 또는 제14일 (연구 부분 2)에 마취 (케타민 + 자일라진 i.m.) 하에 심장 천자에 의해 채취하였다. 약 300 ㎕의 혈액을 혈액학적 조사를 위해 EDTA관 내에 수집하고, 약 300 ㎕의 혈액을 혈청 제조를 위해 준비하고, 샘플 컵에 채우고 실온에서 분석을 위한 실험실에 보냈다. 다음 변수들을 해마톨로지시스템 (Haematologiesystem) ADVIA 120 및 세럼케미어낼리세게래트 (Serumchemieanalysegerat) Konelab 20i를 사용하여 조사하였다.
혈액학적 조사는 적혈구 용적률, 헤모글로불린 농도, 적혈구 계수, 망상적혈구, 총 백혈구 계수, 감별 백혈구 계수, 혈액 형태의 이상, 혈소판 계수, 평균 세포 헤모글로불린, 평균 세포 부피, 및 평균 세포 헤모글로불린 농도를 포함하였다. 혈액 화학 조사는 락테이트 데히드로게나제 (LDH) 및 크레아티닌 키나제 (CK)를 포함하였다.
통계적 분석을 위해서는 변수 적혈구 용적률, 혈소판 계수, LDH 및 CK만을 추가로 고려하였다.
연구일 1일 및 연구일 14일에 혈액학적 및 혈청학적 변수 (적혈구 용적률, 혈소판 계수, LDH, CK)를 품목 및 용량에 의해 분류된 상자 그림을 이용하여 시각화하였다. 이들 도면을 위해 수컷 및 암컷 동물을 합하였다.
연구일 1일 및 연구일 14일에 혈액학적 및 혈청학적 변수를 품목 및 용량에 의해 분류된 평균 및 변이 계수 (CV)를 이용하여 요약하였다. 이들 통계학은 수컷 및 암컷 동물에 대해 따로 및 합한 수컷 및 암컷 동물에 대해 제공되었다.
d. 검시 및 조직학.
제1일 (연구 부분 1) 및 제14일 (연구 부분 2)에서 모든 생존하는 동물에서 검시를 수행하였다. 모든 거시적으로 변화된 조직 및 다음 조직들을 추가의 조직병리학적 검사를 위해 수집하였다:
부신
뇌 (연수 포함)
심장
신장
간
폐 (관류시킴, 기관 비포함)
비장
눈
모든 장기 및 조직을 4% 완충 포름알데히드 (눈은 변형 데이빗슨 (Davidson) 용액) 내에 고정시키고, 조직학적 준비를 위해 실온에서 조직학 실험실로 보냈다.
시험 품목-처리된 고용량군, 참조 품목-처리군, 대조군에서 모든 동물로부터 검시에서 수집한 모든 조직 샘플뿐만 아니라 모든 육안 소견의 조직 샘플의 슬라이드를 처리하고, 파라핀 내에 포매하고, 2-4 ㎛의 공칭 두께로 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하고, 연구 병리학자가 광학 현미경으로 검사하였다. 동일한 과정을 모든 다른 시험 품목-처리군 내의 모든 동물의 심장으로부터의 조직 샘플에 적용하였다.
현미경 소견은 조직병리학적 검사 동안 병리학자가 기록하였다. 별개의 병리학 보고서에서, 조직학적 변화를 가능한 경우마다 분포, 중증도 및 형태학적 특징에 따라 설명하였다. 중증도 스코어는 "코드 및 기호의 해설" 하에 제시된 바와 같이 정해졌다.
현미경 소견을 기록하고, 이들 데이타로부터 유도된 발병률 표를 생성하였다.
e. 통계적 방법 및 데이타 세트
최소 검출가능한 용량 (MDD; 대응하는 버퍼로부터 옮겨진 최소 용량으로서 정의됨)은 단계-하향 방식으로 시험된 대비물을 사용함으로써 rVWF + rFVIII뿐만 아니라 rVWF에 대해 추정되었다. 상이한 용량의 rVWF + rFVIII 및 rVWF를 또한 대응하는 버퍼와 비교하였다.
추가로, 해메이트® P를 2000 RCoU/kg VWF + 1347 IU/kg FVIII의 용량에서 2000 RCoU/kg rVWF + 1538 IU/kg rFVIII의 용량에서 rVWF + rFVIII와 비교하였다.
모든 통계적 계산은 리눅스용 SAS 버전 8.2를 사용하여 수행하였다 (SAS 인스티튜트 인크. (SAS Institute Inc.) (2000). SAS OnlineDoco, 버전 8, 2000년 2월, 미국 노쓰캐롤리나주 캐리: SAS 인스티튜트 인크.; SAS 인스티튜트 인크. (2001). SAS/STAT® 소프트웨어: Changes and Enhancements, 릴리스 8.2, 미국 노쓰캐롤리나주 캐리: SAS 인스티튜트 인크.). 통계적 유의성의 수준을 5%로 설정하였다. 차이 없음의 귀무 가설을 그의 양측 대립물에 대해 시험하였다.
단기 분석 데이타 세트 (STADS)는 연구일 0일에 처리제를 투여하고 연구일 1일에 치사시킨 동물로 구성되었다. 장기 분석 데이타 세트 (LTADS)는 연구일 0일에 처리제를 투여하고 연구일 14일에 치사시킨 동물로 구성되었다.
통계적 평가를 위한 1차 종점은 사망이었다. 통계적 평가를 위한 2차 종점은 체질량 발달 (제0일의 체질량의 Δ%로서) 및 혈액학적 및 혈청학적 변수의 변화이었다. 혈액학적 및 혈청학적 변수의 변화는 기술 통계학을 이용하여 분석하였다. 분석된 변수는 적혈구 용적률, 혈소판 계수, LDH 및 CK이었다.
실시예 6:
C57BL /6J 마우스에서 인간 rVWF 의 단독으로 또는
인간 rFVIII 와의 조합으로의 정맥내 적용
1. 마우스
연구를 위해 C57BL/6J 마우스를 선택하였고, 이는 평행 연구에서 사용된 VWF-결핍 마우스 및 ADAMTS13 결핍 마우스에 대한 유전적 배경 동물주이기 때문이다. 일반적으로, 마우스는 급성 독성 연구에서 널리 사용되고, 규제 당국에 의해 상기 목적에 적합한 것으로 인정된다.
2. 본 연구에서 사용된 프로토콜
조사된 임의의 품목을 사용할 때 사망은 없었다. 따라서, 사망의 통계적 분석을 수행하지 않았다. 체질량 발달의 비교는 체질량 측정 전에 죽은 동물이 최저 순위를 받아야 할 순위로 계획되었다 (Lachin JM, Controlled Clinical Trials, 20(5) 408-422 (1999)). 사망은 없었고, 따라서, 체질량 발달의 비교는 상대적인 변화 (제0일의 체질량의 Δ%로서)에 대해 수행하고, 대응하는 순위에 대해 수행하지 않았다.
6개의 상이한 용량의 rVWF 및 rVWF + rFVIII를 조사하였다. 이러한 이유로, 최소 검출가능한 용량 (MDD; 대응하는 버퍼로부터 옮겨진 최소 용량으로서 정의됨)은 대비물을 사용하여 단계-하향 방식으로 추정하였다.
변이 계수는 규모 비의존적이고 실험실 변수에서 용량의 변이성의 차이의 평가를 허용하기 때문에, 품목 및 연구일에 의해 분류된 혈액학적 및 혈청학적 변수는 중앙값 및 범위 대신에 평균 및 변이 계수를 사용하여 요약되었다.
3. 임상 이상
독성을 표시하는 임상 이상은 4000 RCoU/kg rVWF의 투여 후에 동물의 75% (20마리 중 15마리, 군 J 및 T)에서, 및 4000 RCoU/kg rVWF 및 3077 IU/kg rFVIII의 조합 투여 후에 동물의 85% (20마리 중 17마리, 군 B 및 L)에서 관찰되었다.
단기 증상은 또한 조합된 버퍼 용액 (49.3 mL/kg의 총 부피)으로 처리된 동물의 20% (20마리 중 4마리, 군 A 및 K)에서 보였다. 모든 다른 처리군은 관찰기 동안 정상이었다.
군 당 동물의 임상 이상의 요약을 표 5에 제시한다.
Figure pct00005
Figure pct00006
4. 체질량 분석
연구일 0일 및 연구일 1일, 7일 및 14일 사이의 체질량 변화 (제0일의 체질량의 Δ%로서)는 품목 및 용량에 의해 분류된 상자 그림을 이용하여 시각화하였다. 이들 상자 그림을 위해 수컷 및 암컷 동물을 합하였다 (도 2-4). 체질량 발달의 비교를 또한 표 6에 제시한다.
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
대응하는 버퍼 (1.0%의 평균 Δ%)를 사용할 때보다 4000 + 3077 (-2.9%의 평균 Δ%) 및 2000 + 1538 (-1.6%의 평균 Δ%)의 용량을 사용할 때 제0일 내지 제1일의 체질량에서 통계상 유의한 (다중도 조정된 5% 수준에서) 더 큰 감소가 있었다. 또한, 대응하는 버퍼를 사용할 때보다 250 + 192의 용량 (-1.9%의 평균 Δ%)을 사용할 때 체질량 발달의 통계상 유의한 더 큰 감소가 있었다 (다중도 조정된 양측 p-값 = 0.0033).
다중도에 대해 조정된 모든 양측 p-값이 5%보다 더 크기 때문에, 상이한 용량의 rVWF + rFVIII 및 대응하는 버퍼 사이에서 제0일 내지 제14일의 체질량 발달의 통계상 유의한 차이 (다중도 조정된 5% 수준에서)는 없었다.
단계-하향 방식으로 제0일 내지 제1일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량의 추정은 양측 p-값이 여전히 5% 미만인 조사된 최저 용량에 대한 대비물에서 중단하였다. 따라서, 최소 검출가능한 용량은 250 U/kg VWF:RCo + 192 IU/kg FVIII이었다.
단계-하향 방식으로 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량의 추정은 최고 용량에 대한 대비물에서 중단하였다. 최고 용량에 대한 양측 p-값은 0.8476이었고, 이것은 5%를 초과하였고, 추가의 대비물을 조사하지 않았다. rVWF + rFVIII를 사용할 때 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량은 존재하지 않았고, 조사된 최고 용량은 NOAEL 용량으로서 간주될 수 있었다.
다중도에 대해 조정된 모든 양측 p-값이 5%보다 더 크기 때문에, 상이한 용량의 rVWF 및 대응하는 버퍼 사이에서 제0일 내지 제1일의 체질량 발달 (제0일로부터 Δ%로서)의 통계상 유의한 차이 (다중도 조정된 5% 수준에서)는 없었다. rVWF의 최고 용량 (-1.9%의 평균 Δ%) 및 최저 용량 (-2.2%의 평균 Δ%)을 대응하는 버퍼 (0.5%의 평균 Δ%)와 비교하면 5% 미만의 조정되지 않은 양측 p-값을 생성시킨 반면, 다중도-조정된 양측 p-값은 5%를 초과하였다. 따라서, 귀무 가설이 진실이면 이들 유의한 결과는 5% 초과의 확률로 우연히 발생할 수 있었다.
다중도에 대해 조정된 모든 양측 p-값이 5%보다 더 크기 때문에, 상이한 용량의 rVWF 및 대응하는 버퍼 사이에서 제0일 내지 제14일의 체질량 발달 (제0일로부터 Δ%로서)의 통계상 유의한 차이 (다중도 조정된 5% 수준에서)는 없었다.
단계-하향 방식으로 제0일 내지 제1일의 체질량 변화뿐만 아니라 제0일 내지 제14일의 변화에 대한 최소 검출가능한 용량의 추정은 최고 용량에 대한 대비물에서 중단하였다. 최고 용량에 대한 양측 p-값은 5%를 초과하였고, 추가의 대비물을 조사하지 않았다. rVWF를 사용할 때 제0일 내지 제1일의 체질량 변화에 대한 또는 제0일 내지 제14일의 변화에 대한 최소 검출가능한 용량은 존재하지 않았고, 조사된 최고 용량은 NOAEL 용량으로서 간주될 수 있었다.
제0일 내지 제1일의 평균 체질량 발달은 해메이트® P를 사용할 때 -1.1% (95% CI: -2.3% 내지 1.8%)이고 대응하는 용량의 rVWF + rFVIII을 사용할 때 -1.6% (95% CI: -2.6% 내지 -0.6%)이었다. 상기 차이는 5% 수준에서 통계상 유의하지 않았다 (양측 p-값 = 0.6931).
제0일 내지 제14일의 평균 체질량 발달은 해메이트® P를 사용할 때 4.7% (95% CI: -1.1% 내지 7.7%)이고 대응하는 용량의 rVWF + rFVIII를 사용할 때 7.7% (95% CI: 5.4% 내지 14.4%)이었다. 상기 차이는 5% 수준에서 통계상 유의하지 않았다 (양측 p-값 = 0.2289).
5. 혈액학적 및 혈청학적 변수
연구일 1일 및 연구일 14일에 혈액학적 및 혈청학적 변수 (적혈구 용적률, 혈소판 계수, LDH, CK)를 품목 및 용량에 의해 분류된 상자 그림을 이용하여 시각화하였다. 이들 도면을 위해 수컷 및 암컷 동물을 합하였다.
연구일 1일 및 연구일 14일에 혈액학적 및 혈청학적 변수를 품목 및 용량에 의해 분류된 평균 및 변이 계수 (CV)를 이용하여 요약하였다. 이들 통계학은 수컷 및 암컷 동물에 대해 따로 및 합한 수컷 및 암컷 동물에 대해 제공되었다.
상자 그림으로서 표시된 적혈구 용적률, 혈소판 계수, LDH 및 CK의 비교를 도 5-12 및 표 7-10에 제시한다.
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
6. 검시
가능한 시험 품목-관련 연관성을 표시하는 검시 소견은 없었다. 그러나, 다양한 부수적인 변화가 발견되고 기록되었다.
7. 조직병리학
단기 연구 (1일)에서, rVWF 단독으로 또는 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 500 RCoU/kg, 1000 RCoU/kg 및 2000 RCoU/kg 및 고용량군의 시험 품목-처리된 동물의 심장에서 심근 괴사 (최소 내지 중등도 등급)가 기록되었다. 추가로, rVWF 단독으로 처리한 2000 RCoU/kg 및 고용량군의 시험 품목-처리된 동물에서뿐만 아니라 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 1000 RCoU/kg 및 2000 RCoU/kg 및 고-용량 동물에서 미세혈전 (최소 내지 중등도 등급)이 기록되었다. 두 변화는 모두 특히 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 동물에서 발병률 (및 부분적으로 또한 중증도)의 명백한 용량-의존 증가를 보여주었다.
추가로, rVWF 단독으로 처리한 2000 RCoU/kg 용량군의 동물에서뿐만 아니라 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 1000 RCoU/kg 및 2000 RCoU/kg 및 고용량군의 동물에서 경미하게 증가된 관상 혈관주위염이 기록되었다.
뇌에서, 시트레이트-버퍼-처리된 대조군 동물에서 단일 미세혈전 (최소 등급)이 기록되었다. 단기 연구 부분 (1일)의 임의의 시험 품목-처리된 동물 또는 장기 연구 부분 (14일)의 임의의 동물에서 상기 소견은 기록되지 않았다. 따라서, 상기 장기를 보다 저용량군에서 조사하지 않았다.
폐에서, 시험 품목-처리된 동물뿐만 아니라 해메이트® P, 염수 또는 시트레이트 버퍼로 처리된 대조군 동물에서 낮은 발병률의 미세혈전 (모두 최소 등급)이 기록되었다 (발병률: ≤2/10; 평균 중증도: ≤1.0). 그러나, 시험 품목-처리된 동물 및 대조군 사이에서 차이는 기록되지 않았다. 따라서, 상기 장기를 보다 저용량군에서 조사하지 않았다.
장기 연구 부분 (14일)에서, rVWF 단독으로 처리한 1000 RCoU/kg 및 2000 RCoU/kg 및 고용량군의 시험 품목-처리된 동물뿐만 아니라 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 500 RCoU/kg, 1000 RCoU/kg, 2000 RCoU/kg 및 고용량군의 동물의 심장에서 심근 변성/보상 (최소 내지 중등도 등급)이 기록되었다. 상기 변화는 발병률 (및 부분적으로 또한 중증도)의 경미한 용량-의존 증가를 보였고, 염증 (주로 단핵성) 및 섬유증을 특징으로 하였고, 헤모시데린 축적 및 때때로 또한 심근 석회화가 동반되었다.
폐에서, 시험 품목-처리된 동물뿐만 아니라 해메이트® P, 염수, 시트레이트 버퍼 또는 조합 버퍼로 처리된 대조군 동물에서 낮은 발병률의 미세혈전 (모두 최소 등급)이 기록되었다 (발병률: ≤1/10; 평균 중증도: ≤1.0). 그러나, 시험 품목-처리된 동물 및 대조군 사이에서 차이는 기록되지 않았다. 따라서, 상기 장기를 저용량군 및 중간-용량군에서 조사하지 않았다.
주사 부위에서, 단일 시험 품목-처리된 동물 (저용량군)에서 꼬리 혈관의 중등도 등급 혈전증이 기록되었고, 꼬리의 원위 단부의 흑색 변색이 검시에서 기록되었다. 본 연구의 임의의 다른 동물에서 상기 소견이 기록되지 않았으므로, 그의 발병률 및 형태학적 외관은 시험 품목-관련 연관성을 표시하지 않았다. 이것은 정맥내 적용의 기술 절차에 의해 야기된 것으로 보였다.
8. 논의
상기한 바와 같이, rVWF를 단독으로 5개의 용량 수준에서 (4000, 2000, 1000, 500 및 250 리스토세틴 보조인자 (RCo) U/kg (체중) (BW)), 및 rFVIII와 조합으로 또한 5개의 용량에서 시험하였다. 조합 투여에서, rVWF의 용량은 단일 투여에서와 동일하였고, rFVIII의 용량은 감소하는 순서로 3077, 1538, 769, 385 및 192 IU/kg rFVIII이었고, 즉, 4000 RCoU/kg BW rVWF는 3077 IU/kg rFVIII와 동시투여되고, 2000 RCoU/kg BW rVWF는 1538 IU/kg rFVIII와 동시투여된다. 해메이트® P, 혈장-유래 VWF-FVIII 제제는 2000 RCoU/kg (+ 1347 IU/kg FVIII)에서 시험되었다. 버퍼 단독 및 등장성 염수는 대조군으로서 포함되었다.
독성을 표시하는 증상은 4000 RCoU/kg rVWF 단독으로 (20마리 중 15마리 동물에서) 및 rFVIII와 조합으로 (20마리 중 17마리 동물에서) 처리한 고용량군에서 및 조합 버퍼로 처리한 군 (20마리 중 4마리 동물에서)에서 임상 관찰 동안 6시간까지 보였다. 49.3 mL/kg의 대응하는 부피 내의 투여된 시트르산나트륨 용량이 143 mg/kg이기 때문에, 버퍼군에서 보인 바와 같은 단기 증상은 시트르산나트륨 독성 (예를 들어, 호흡곤란, 발작, 단기간 행동 저하)를 표시한다. 유사한 증상은 또한 고용량군의 32마리의 이환된 동물 중 2마리에서 관찰되었고, 이는 또한 시트르산나트륨 독성 효과를 표시한다. 이와 반대로, 단독으로 또는 rFVIII와 조합으로 4000 RCoU/kg rVWF로 처리한 군에서 32마리의 동물 중 30마리는 투여 후에 6시간까지 장기 증상 (예를 들어, 행동 저하, 운동실조증, 털세움)을 보였다. 임의의 다른 군에서는 증상이 관찰되지 않았으므로, 이들 증상은 명백하게 고용량의 직접적인 독성 효과를 표시한다.
rVWF를 사용할 때 제0일 내지 제1일의 체질량 변화뿐만 아니라 제0일 내지 제14일의 변화의 최소 검출가능한 용량 (MDD; 대응하는 버퍼로부터 옮겨진 최소 용량으로서 정의됨)은 존재하지 않았다. 따라서, 조사된 rVWF의 최고 용량 (4000 RCoU/kg)은 유해한 효과가 관찰되지 않는 수준 (NOAEL) 용량으로서 간주될 수 있었다.
rVWF + rFVIII를 사용할 때 제0일 내지 제1일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량 (MDD)은 조사된 rVWF + rFVIII의 최저 용량 (250 RCoU/kg + 192 IU/kg rFVIII)인 것으로 추정되었다. 따라서, rVWF + rFVIII를 사용하여 조사된 용량들 사이의 용량은 제0일 내지 제1일의 체질량 발달의 면에서 NOAEL 용량으로서 간주될 수 없었다. 그 다음으로 높은 용량 수준의 500 RCoU/kg rVWF + 385 IU/kg rFVIII에서 체중 증가가 존재하고 체중 감소는 250 RCoU/kg rVWF 단독으로 처리한 군에 직접 비교할 때 중등도 (-1.9% 대 -2.2%)이기 때문에, 상기 추정된 효과는 우연히 발생하는 것으로서 간주될 수 있다. 따라서, 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량은 없었고, 조사된 rVWF + rFVIII의 최고 용량 (4000 RCoU/kg + 3077 IU/kg rFVIII)은 제0일 내지 제14일의 체질량 발달의 면에서 NOAEL 용량으로서 간주될 수 있었다.
제0일 내지 제1일의 평균 체질량 발달 (제0일로부터 체질량의 Δ%로서)은 해메이트® P를 사용할 때 -1.1%이고 대응하는 용량의 rVWF + rFVIII를 사용할 때 -1.6%이었다. 상기 차이는 5% 수준에서 통계상 유의하지 않았다 (양측 p-값 = 0.6931). 제0일 내지 제14일의 평균 체질량 발달은 해메이트® P를 사용할 때 4.7%이고 대응하는 용량의 rVWF + rFVIII를 사용할 때 7.7%이었다. 상기 차이는 5% 수준에서 통계상 유의하지 않았다 (양측 p-값 = 0.2289).
선택된 혈액학적 및 혈청 화학 변수의 데이타를 비교하면, 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여된 2000 RCoU/kg rVWF 및 그 초과의 용량의 투여 후에 제1일에 혈소판-계수의 강하가 관찰되었다. 해메이트® P의 투여 후에 변화가 보이지 않았다.
크레아티닌 키나제는 단독으로 또는 rFVIII와 조합으로 250 RCoU/kg 및 500 RCoU/kg rVWF의 투여 후에 제1 및 14일에 증가하였다. 이들 변수의 증가는 보다 저용량군에서만 보였기 때문에, 용량 의존성은 배제될 수 있다. 또한, 최저 용량에서 조직병리학적 상관관계는 찾을 수 없었다.
1일 후에 rFVIII와 조합으로 2000 RCoU/kg BW rVWF 또는 그 초과의 용량으로 처리한 군에 대해 락테이트 데히드로게나제의 증가가 보였다.
가능한 rVWF-관련 연관성을 표시하는 검시 소견은 없었다.
500 RCoU rVWF 또는 그 초과의 용량 (단독으로 또는 rFVIII와 조합으로)으로 처리한 시험 품목-처리된 동물의 심장에 대해 조직병리학적 변화가 기록되었다. 이들 변화는 관상 미세혈전, 심근 괴사, 심근 변성/보상 (모두 최소 내지 중등도의 중증도), 및 경미하게 증가된 관상 혈관주위염으로 이루어졌다. 대부분의 이들 변화는 특히 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 동물에서 발병률 (및 부분적으로 또한 중증도)에서 경미한 용량-의존 증가를 보였다. 병리조직학적 변화는 저등급 "허혈성 심장병"의 모습과 유사하였다. 재조합 생성물(들)을 투여한 시험 품목-처리된 동물과는 반대로, 인간 혈장-유래 VWF-FVIII 제제 (해메이트® P)를 투여한 참조 품목-처리된 동물에서 상기 소견은 기록되지 않았다.
제1일에 예정된 검시에서 치사시킨 시험 품목-처리된 동물에서, 저산소증에 매우 예민한 심장에서 혈전색전성 변화가 보고되었다. 관상 미세혈전에 의한 혈관 폐색은 심장으로의 혈류를 감소시키고, 이는 허혈성 심근 괴사 (산소 결핍에 이차적인 세포 단식) 및 반응성 관상 혈관주위염을 유발한다 (초기 효과).
제14일에 예정된 검시에서 치사시킨 시험 품목-처리된 동물에서, 심장에서 두드러진 변성 및/또는 보상적 변화가 기록되었다 (염증, 섬유증, 석회화, 헤모시데린 축적). 이들 심근 경색-유사 변화는 미세혈전에 의한 선행 혈관 폐색의 결과인 것으로 보였다 (지연된 효과).
추가로, 동반하는 장기 파괴 없이 낮은 발병률의 미세혈전 (모두 최소 등급)이 시험 품목-처리된 동물뿐만 아니라 염수, 버퍼 및 해메이트® P로 처리된 대조군 동물의 폐 (및 부분적으로 뇌에 대해)에 대해 기록되었다. 또한, 연구에서 1마리의 시험 품목-처리된 동물에서 꼬리 혈관의 혈전증이 기록되었다. 이들 "배경 변화"는 기술 절차 (샴 (sham) i.v. 처리, 심장내 혈액 샘플링)에 의해 야기된 것으로 보였고, 따라서, 시험 품목에 관련되지 않았다.
요약하면, 독성을 표시하는 임상 증상이 단독으로 또는 rFVIII와 조합으로 4000 RCoU/kg BW rVWF로 처리한 고용량군에서 6시간까지 관찰되었다. 급성 혈소판감소증은 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여되는 2000 RCoU/kg BW rVWF 및 그 초과의 용량의 투여 후에 유도되었다. 병리학적 변화는 저등급 "허혈성 심장병"의 모습과 유사하였다. 이들은 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여된 500 RCoU/kg 및 그 초과의 용량에서 C57BL/6J 마우스에서 시험 품목인 rVWF의 혈전생성 가능성을 나타냈다.
rVWF의 독성학 프로필의 동물주-특이적 차이에 관련하여, 정상 C57BL/6J 마우스는 ADAMTS13-결핍 마우스보다 덜 감수성이지만 (실시예 8), VWF-결핍 마우스보다 경미하게 더 감수성이다 (실시예 7).
본원에서 양성 대조군으로서 사용된 해메이트® P로 처리한 C57BL/6J 마우스에서 실질적인 관찰이 이루어지지 않았다. 해메이트® P는 상이한 조성의 VWF 다량체를 갖고, 내인성 인간 ADAMTS13에 의한 절단으로 인해 초고분자량 형태가 결여된다. 또한, 해메이트® P는 다양한 오염 혈장 단백질뿐만 아니라 시트레이트를 함유하고, 이것이 또한 결과에 영향을 미칠 수 있다.
모든 결과를 고려하면, C57BL/6J 마우스의 총 NOAEL은 250 RCoU/kg로 설정할 수 있다.
실시예 7:
VWF -결핍 마우스에서 인간 rVWF 의 단독으로 또는
인간 rFVIII 와의 조합으로의 정맥내 적용
1. 마우스
VWF-결핍 마우스를 연구를 위해 선택하였고, 이것은 상기 트랜스제닉 동물주가 VWF가 결여되는 환자에서의 병태를 모방하기 때문이다. 마우스는 급성 독성 연구에서 널리 사용되고, 규제 당국에 의해 상기 목적에 적합한 것으로 일반적으로 인정된다.
2. 본 연구에서 사용된 프로토콜
조사된 임의의 품목을 사용할 때 사망은 없었다. 따라서, 사망의 통계적 분석을 수행하지 않았다. 체질량 발달의 비교는 체질량 측정 전에 죽은 동물이 최저 순위를 받아야 할 순위로 계획되었다. 사망은 없었고, 따라서, 체질량 발달의 비교는 상대적인 변화 (제0일의 체질량의 Δ%로서)에 대해 수행하고, 대응하는 순위에 대해 수행하지 않았다.
4개의 상이한 용량의 rVWF 및 rVWF + rFVIII (제로 용량으로서 대응하는 버퍼 포함)를 사용한 연구를 계획하였지만, 최종적으로 6개의 상이한 용량의 rVWF 및 rVWF + rFVIII를 조사하였다. 이러한 이유로, 최소 검출가능한 용량 (MDD; 대응하는 버퍼로부터 옮겨진 최소 용량으로서 정의됨)은 대비물을 사용하여 단계-하향 방식으로 추정하였다.
변이 계수는 규모 비의존적이고 실험실 변수에서 용량의 변이성의 차이의 평가를 허용하기 때문에, 품목 및 연구일에 의해 분류된 혈액학적 및 혈청학적 변수는 중앙값 및 범위 대신에 평균 및 변이 계수를 사용하여 요약되었다.
3. 임상 이상
본 연구에서 사망은 관찰되지 않았다.
독성의 임상 징후는 4000 RCoU/kg rVWF 단독의 투여 (군 H, R) 후에 20마리 중 3마리 (15%) 동물에서, 4000 RCoU/kg rVWF를 3077 IU/kg rFVIII (애드베이트, 군 C, M)와 조합하여 투여한 후 20마리 중 4마리 (20%) 동물에서, 31.7 mL/kg의 rVWF의 대응하는 제형화 버퍼의 투여 (군 G, Q) 후에 20마리 중 4마리 동물 (20%)에서, 및 또한 49.3 mL/kg의 조합된 제형화 버퍼의 투여 (군 D, N) 후에 20마리 중 4마리 동물 (20%)에서 관찰되었다.
기록된 증상은 치료 요법에 무관하게, 주사 후 단기 행동 저하 (2분까지 지속함)이었다.
4. 체질량 분석
연구일 0일 및 연구일 1, 7 및 14 사이에 체질량의 변화 (제0일의 체질량의 Δ%로서)를 품목 및 용량에 의해 분류된 상자 그림을 이용하여 시각화하였다. 이들 상자 그림을 위해 수컷 및 암컷 동물을 합하였다. 체질량 분석을 표 11 및 도 13-15에 제공한다.
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
다중도에 대해 조정된 모든 양측 p-값이 5%보다 더 크기 때문에, 상이한 용량의 rVWF + rFVIII 및 대응하는 버퍼 사이에서 제0일 내지 제1일의 체질량 발달 (제0일로부터 Δ%로서)의 통계상 유의한 차이 (다중도 조정된 5% 수준에서)는 없었다. rVWF + rFVIII의 최저 용량 (0.5%의 평균 Δ%)과 대응하는 버퍼 (-2.6%의 평균 Δ%)의 비교에 대해 0.0299의 하나의 조정되지 않은 양측 p-값이 존재한 반면, 다중도 조정된 양측 p-값은 0.1496이었다. 따라서, 귀무 가설이 진실이면, 최저 용량의 rVWF + rFVIII를 사용할 때보다 버퍼를 사용할 때 체질량 발달의 상기 유의하게 더 큰 감소는 5% 초과의 확률로 우연히 발생할 수 있었다.
다중도에 대해 조정된 모든 양측 p-값이 5%보다 더 크기 때문에, 상이한 용량의 rVWF + rFVIII 및 대응하는 버퍼 사이에서 제0일 내지 제14일의 체질량 발달의 통계상 유의한 차이 (다중도 조정된 5% 수준에서)는 없었다.
단계-하향 방식으로 제0일 내지 제1일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량의 추정은 최고 용량에 대한 대비물에서 중단하였다. 최고 용량에 대한 양측 p-값은 0.1195이었고, 이것은 5%를 초과하였고, 추가의 대비물을 조사하지 않았다. rVWF + rFVIII를 사용할 때 제0일 내지 제1일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량은 없었고, 조사된 최고 용량은 NOAEL 용량으로서 간주될 수 있었다.
단계-하향 방식으로 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량의 추정은 최고 용량에 대한 대비물에서 중단하였다. 최고 용량에 대한 양측 p-값은 0.3031이었고, 이것은 5%를 초과하였고, 추가의 대비물을 조사하지 않았다. rVWF + rFVIII를 사용할 때 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량은 없었고, 조사된 최고 용량은 NOAEL 용량으로서 간주될 수 있었다.
제0일 내지 제1일에 대응하는 버퍼 (-0.5%의 평균 Δ%)를 사용할 때보다 2000의 rVWF 용량 (-2.6%의 평균 Δ%)을 사용할 때 체질량의 통계상 유의한 (다중도 조정된 5% 수준에서) 더 큰 감소가 존재하였다. 5% 미만의 2개의 조정되지 않은 양측 p-값이 존재한 반면, 다중도 조정된 양측 p-값은 5%를 초과하였다. 따라서, 귀무 가설이 진실이면, 버퍼 (-0.5%의 평균 Δ%)를 사용할 때에 비해 1000의 용량 (-2.1%의 평균 Δ%) 및 250의 용량 (0.9%의 평균 Δ%)을 사용할 때 이들 유의한 차이는 5% 초과의 확률로 발생할 수 있었다.
제0일 내지 제14일에 대응하는 버퍼 (6.2%의 평균 Δ%)를 사용할 때보다 1000의 rVWF 용량 (1.3%의 평균 Δ%)을 사용할 때 체질량의 더 작은 증가에 대한 통계적 경향 (0.0693의 다중도 조정된 양측 p-값)이 존재하였다. 최고 용량의 rVWF (1.8%의 평균 Δ%)와 대응하는 버퍼 (6.2%의 평균 Δ%)의 비교에 대한 0.0279의 하나의 조정되지 않은 양측 p-값이 존재한 반면, 다중도 조정된 양측 p-값은 0.1117이었다. 따라서, 귀무 가설이 진실이면, 대응하는 버퍼를 사용할 때보다 최고 용량의 rVWF를 사용할 때 상기 유의한 더 작은 체질량 발달은 5% 초과의 확률로 우연히 발생할 수 있었다.
단계-하향 방식으로 제0일 내지 제1일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량의 추정은 5%를 초과하는 제1 양측 p-값 (양측 p-값 = 0.0741)인 500 U/kg에 대한 대비물에서 중단하였다. 따라서, 최소 검출가능한 용량은 1000 U/kg rVWF이었다.
단계-하향 방식으로 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량의 추정은 5%를 초과하는 제1 양측 p-값 (양측 p-값 = 0.7267)인 500 U/kg에 대한 대비물에서 중단하였다. 따라서, 최소 검출가능한 용량은 1000 U/kg rVWF이었다.
제0일 내지 제1일의 평균 체질량 발달은 해메이트® P를 사용할 때 -1.7% (95% CI: -2.5% 내지 -0.7%), 및 대응하는 용량의 rVWF + rFVIII를 사용할 때 -1.8% (95% CI: -6.1% 내지 0.8%)이었다. 상기 차이는 5% 수준에서 통계상 유의하지 않았다 (양측 p-값 = 0.9499).
제0일 내지 제14일의 평균 체질량 발달은 해메이트® P를 사용할 때 2.8% (95% CI: -2.1% 내지 5.8%), 및 대응하는 용량의 rVWF + rFVIII를 사용할 때 6.5% (95% CI: 2.2% 내지 10.4%)이었다. 상기 차이는 5% 수준에서 통계상 유의하지 않았다 (양측 p-값 = 0.1855).
5. 혈액학적 및 혈청학적 변수
선택된 변수 적혈구 용적률, 혈소판 계수, CK 및 LDH의 비교를 다음 도 16-23 및 표 12-15에 제시한다.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
6. 검시
그의 발병률, 분포 또는 형태학적 외관이 가능한 rVWF-관련 연관성을 표시하는 검시 소견은 없었다.
7. 조직병리학
단기 연구 (1일)에서, rVWF 단독으로 또는 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한, 1000 RCoU/kg 및 보다 고용량군의 시험 품목-처리된 동물에서 심근 괴사 (최소 내지 경미한 등급)가 기록되었다. 상기 변화는 특히 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 동물에서 경미한 용량 관계를 보였다. rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 고용량군의 단일 동물에서 단일 미세혈전 (경미한 등급)이 기록되었다. 추가로, rVWF 단독으로 또는 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한, 고용량군의 rVWF-처리된 동물에서 관상 혈관주위염의 경미하게 증가된 발병률이 기록되었다.
장기 연구 (14일)에서, rVWF 단독으로 또는 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한, 2000 RCoU/kg 및 보다 고용량군의 몇몇 시험 품목-처리된 동물에서 최소 심근 변성/보상이 기록되었다. 상기 변화는 매우 저등급의 것이고, 부분적으로 헤모시데린 축적이 동반되는 최소 염증 (주로 단핵성) 및 섬유증을 특징으로 하였다. 추가로, 최소 심근 변성/보상이 해메이트® P로 처리한 단일 동물에서 또한 기록되었다.
다양한 다른 변화가 또한 본 연구에서 발견되었다. 이들은 정맥내 적용 시에 통상적으로 발생한다. 폐 내의 미세혈전 (최소 내지 경미한 등급)이 이들 소견에 있다. 또한, 중등도 등급 심근 변성/보상이 단일 동물에서 제1일에 기록되었다 (rFVIII와 조합한 1000 RCoU/kg). 이들 변화의 발병률, 분포 및 형태학적 외관은 rVWF-관련 연관성을 표시하지 않았다.
8. 논의
상기 설명된 바와 같이, rVWF를 단독으로 5개의 용량 수준에서 (4000, 2000, 1000, 500 및 250 RCoU/kg BW), 및 rFVIII와 조합으로 또한 5개의 용량에서 시험하였다. 조합 투여에서, rVWF의 용량은 단일 투여에서와 동일하였고, rFVIII의 용량은 감소하는 순서로 3077, 1538, 769, 385 및 192 IU/kg rFVIII이었고, 즉, 4000 RCoU/kg BW rVWF는 3077 IU/kg rFVIII와 동시투여되고, 2000 RCoU/kg BW rVWF는 1538 IU/kg rFVIII와 동시투여된다. 해메이트® P는 2000 RCoU/kg BW + 1347 IU/kg BW FVIII에서 시험되었다. rVWF 단독에 대한 대응하는 버퍼는 31.7 mL/kg (최고 용량 부피에 따라)의 부피에서, 혼합 버퍼는 49.3 mL/kg의 부피에서, 등장성 염수는 49.3 mL/kg의 부피에서 투여하였다.
시트르산나트륨 독성을 표시하는 단기 증상 (주로 행동 저하, 수분 동안 지속함)이 단독으로 또는 rFVIII와 조합으로 고용량의 rVWF 및 대응하는 버퍼 부피의 투여 후에 관찰되었다. 발병률 및 중증도는 모든 이환된 군에서 유사하였다.
최소 검출가능한 용량 (MDD; 대응하는 버퍼로부터 옮겨진 최소 용량으로서 정의됨)은 제0일 내지 제1일의 체질량 변화뿐만 아니라 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대해 1000 RCoU/kg rVWF인 것으로 추정되었다. 따라서, 500 RCoU/kg의 용량은 제0일 내지 제1일의 체질량 발달 및 제0일 내지 제14일의 체질량 발달의 면에서 유해한 효과가 관찰되지 않는 수준 (NOAEL) 용량으로서 간주될 수 있었다.
제0일 내지 제1일의 체질량 변화뿐만 아니라 제0일 내지 제14일의 변화에서 rVWF + rFVIII에 대한 최소 검출가능한 용량은 존재하지 않았다. 따라서, 조사된 rVWF + rFVIII의 최고 용량 (4000 RCoU/kg VWF + 3077 IU/kg rFVIII)은 제0일 내지 제1일의 체질량 발달 및 제0일 내지 제14일의 체질량 발달의 면에서 NOAEL 용량으로서 간주될 수 있었다.
제0일 내지 제1일의 평균 체질량 발달 (제0일의 체질량의 Δ%로서)은 해메이트® P를 사용할 때 -1.7%이고 대응하는 용량의 조사된 rVWF + rFVIII를 사용할 때 1.8%이었다. 상기 차이는 5% 수준에서 통계상 유의하지 않았다 (양측 p-값 = 0.9499). 제0일 내지 제14일의 평균 체질량 발달은 해메이트® P를 사용할 때 2.8%이고 대응하는 용량의 rVWF + rFVIII를 사용할 때 6.5%이었다. 상기 차이는 5% 수준에서 통계상 유의하지 않았다 (양측 p-값 = 0.1855).
선택된 혈액학적 및 혈청 화학 변수의 데이타를 비교하면, 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여된 4000 RCoU/kg rVWF (-23%) 및 2000 RCoU/kg rVWF (-15%)의 투여 후에 제1일에 버퍼 처리 대조군에 비해 혈소판 계수의 강하가 관찰되었다 (각각 -48% 및 -21%). 해메이트® P의 투여 후에 변화가 보이지 않았다.
크레아티닌 키나제는 1000 RCoU/kg rVWF 단독의 투여 후에 제1일에 대조군에 비해 증가하였다. 증가된 수준이 500 및 1000 RCoU/kg rVWF로 단독으로 및 rFVIII와 조합으로 처리한 군에서 14일의 관찰 후에 측정되었다. 락테이트 데히드로게나제의 증가가 500 RCoU/kg rVWF로 rFVIII와 조합하여 처리한 군에서 14일의 관찰 후에 보였다. 용량 의존성은 배제될 수 있고, 이들 변수의 증가가 보다 저용량군에서만 보였기 때문에 시험 품목 관련성은 매우 가망이 없다.
조직병리학적 변화가 1000 RCoU rVWF 또는 그보다 높은 용량에서 (단독으로 또는 rFVIII와 조합으로) rVWF-처리된 동물에서 심장에 대해 기록되었다. 관상 미세혈전, 심근 괴사 (둘 모두 최소 내지 경미한 등급) 및 경미하게 증가된 관상 혈관주위염이 적용 1일 후에 발견되었다 (초기 효과). 심근 변성/보상 (최소 등급)은 14일 후에 발견되었고, 지연된 효과로서 평가될 수 있다. 이들 변화 중 일부는 특히 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 동물에서 경미한 용량 의존성을 보였다. 병리조직학적 변화는 저등급 "허혈성 심장병"의 모습과 유사하였다. 재조합 생성물(들)을 투여한 시험 품목-처리된 동물과는 반대로, 상업적으로 이용가능한 인간 혈장-유래 VWF-FVIII 제제 (해메이트® P)를 투여한 참조 품목-처리된 동물에서 대부분의 이들 소견은 기록되지 않았다. 그러나, 최소 심근 변성/보상이 해메이트® P로 처리한 1마리의 동물에서 또한 기록되었다 (14일). 상기 소견의 참조 품목 관련성은 불명확하다.
추가로, 동반하는 장기 파괴 없이 최소 내지 경미한 중증도의 미세혈전의 매우 낮은 발병률이 rVWF-처리된 동물뿐만 아니라 염수-처리된 대조군 동물의 폐에 대해 기록되었다. 모두 피브린 축합의 징후를 보이지 않는 초기 상태인 이들 미세혈전은 제1일에 치사시킨 동물에서 기록되지 않았다. 따라서, 상기 변화는 시험 품목에 관련되지 않는 것으로 보였다. 상기 배경 변화는 자발적 소인에 의해 야기될 수 있고, 이는 기술 절차 (예를 들어, 심장내 혈액 샘플링)에 의해 추가로 향상될 수 있다.
쥐 ADAMTS13은 인간 재조합 VWF와 반응하지 않는다. 따라서, 본 연구 동안, 혈전생성성 및 파종성 혈관내 응고병증의 증상 (혈소판감소증, 미세혈전증)을 비롯한 혈액학적 및 병리조직학적 소견은 절단되지 않은 재조합 VWF에 의해 유발되는 것으로 가정할 수 있다. 그러나, 상기 동물 모델은 내인성 VWF를 갖지 않으므로 다른 마우스 주보다 덜 감수성이었다. VWF-결핍 마우스에서 rVWF에 대한 NOAEL은 500 RCoU/kg BW이었다.
3마리의 상이한 마우스 주를 비교하면, 결과는 다음을 나타냈다. C57BL/6J 마우스는 VWF 결핍 마우스에 비해 증상 및 조직병리학적 소견의 증가된 중증도를 가졌으므로, 내인성 쥐 rVWF의 존재는 독성에 대해 영향을 미친다. 내인성 쥐 VWF의 존재 하에 ADAMTS13의 부재는 사망률 및 독성에 대해 가장 중증 효과를 갖는다.
실시예 8:
ADAMTS13 결핍 마우스에서 인간 rVWF 의 단독으로 또는
인간 rFVIII 와의 조합으로의 정맥내 적용
1. 마우스
ADAMTS13 결핍 마우스를 연구를 위해 선택하였고, 이것은 상기 트랜스제닉 동물주가 VWF에 대한 ADAMTS13 프로테아제가 결여되는 환자에서의 병태를 모방하기 때문이다.
2. 본 연구를 위해 사용된 프로토콜
정확도 검정으로서 코크란-아미티지 경향 검정을 이용하여 양측 대립물에 대항한 증가하는 용량의 rVWF (rFVIII와 함께 또는 그 없이)를 사용할 때 사망률의 경향 없음의 귀무 가설을 시험하기 위해 추가의 분석을 수행하였다 (SAS 절차에 의해, PROC FREQ, 진술 = EXACT TREND).
6개의 상이한 용량의 rVWF 및 rVWF + rFVIII를 조사하였다. 상기 이유로, 체질량 발달의 최소 검출가능한 용량 (MDD; 대응하는 버퍼로부터 옮겨진 최소 용량으로서 정의됨)은 대비물을 사용하여 단계-하향 방식으로 추정하였다.
4000 RCoU/kg의 용량에서 해메이트® P와 rVWF + rFVIII의 비교가 계획되었지만, 상기 용량은 해메이트® P (시트레이트 독성)에서 실현가능하지 않은 것으로 증명되었고, 2000 RCoU/kg의 해메이트® P의 용량이 포함되었다. 따라서, 2000 RCoU/kg + 1538 IU/kg의 용량에서 rVWF + rFVIII를 2000 RCoU/kg VWF의 용량에서 해메이트® P와 비교하였다.
2마리의 동물로부터의 데이타만 이용가능하기 때문에, 4000 RCoU/kg의 용량에서 해메이트® P로부터 체질량 데이타는 품목 및 실험실 변수를 비교하기 위해 사용된 체질량 발달의 순위의 계산으로부터 배제하였다.
변이 계수는 규모 비의존적이고 실험실 변수에서 용량의 변이성의 차이의 평가를 허용하기 때문에, 품목 및 연구일에 의해 분류된 혈액학적 및 혈청학적 변수는 중앙값 및 범위 대신에 평균 및 변이 계수를 사용하여 요약되었다.
3. 사망률의 분석
관찰기 동안 죽은 동물의 비율 및 대응하는 양측 95% 신뢰 구간을 품목 및 용량마다 계산하였다. 양측 95% 신뢰 구간은 윌슨 스코어 방법에 의해 계산하였다 (Altman et al., Brit. Med. J. Books, 2nd ed., JW Arrowsmith Ltd., Bristol, p 46-48 (2000)). 이들 분석은 STADS, LTADS 및 STADS 및 LTADS 합계에 대해 따로 수행되었다. 이들 분석은 또한 수컷 및 암컷 동물에 대해 따로 및 합한 수컷 및 암컷 동물에 대해 제공되었다.
상이한 용량의 rVWF 및 rVWF + rFVIII와 대응하는 버퍼 사이에서 사망률의 차이를 양측 피셔 (Fisher) 정확도 검정에 의해 합한 수컷 및 암컷 동물에 대해 평가하였다 (SAS 절차에 의해, PROC MULTTEST). 상기 분석을 STADS 및 LTADS 합계에 대해 수행하였다. 5개의 용량군을 대응하는 버퍼와 동시에 비교하기 위한 다중도에 대한 조정은 홀름 방법을 이용하여 적용되었다. 조정되지 않은 및 다중도 조정된 양측 p 값을 계산하였다. 상이한 품목의 조사를 위해 다중도에 대한 조정은 적용되지 않았다.
정확도 검정으로서 코크란-아미티지 경향 검정을 이용하여 양측 대립물에 대항한 증가하는 용량의 rVWF (rFVIII와 함께 또는 그 없이)를 사용할 때 사망률의 경향 없음의 귀무 가설을 시험하기 위해 추가의 분석은 수행하였다 (SAS 절차에 의해, PROC FREQ, 진술 = EXACT TREND). 상기 분석은 STADS 및 LTADS 합계에 대해 및 합한 수컷 및 암컷에 대해 수행하였다.
4000 RCoU/kg rVWF의 투여 후에, 동물의 40%는 처리 후에 즉시 또는 4일까지 죽었다 (20마리 중 8마리, 군 E 및 O에서). 2000 RCoU/kg rVWF의 투여 후에, 동물의 20%가 처리 후에 즉시 또는 9일까지 죽었다 (20마리 중 4마리, 군 B 및 L에서). 4000 RCoU/kg rVWF + 3077 IU/kg rFVIII의 투여 후에 처리 후에 즉시 또는 처리 후에 1일까지 25%의 사망률이 기록되었다 (20마리 중 5마리, 군 A 및 K에서). 군 I 및 S (2000 RCoU/kg rVWF + 1538 IU/kg rFVIII), 또는 임의의 다른 보다 저용량 또는 음성 대조군에서 사망은 없었다.
해메이트® P로 4000 RCoU/kg VWF에서 처리한 군 (군 T)에서 동물의 80% (10마리 중 8마리)가 투여 직후에 죽었다. 보다 저용량 수준의 2000 RCoU/kg VWF로 처리된 군 (군 J 및 U)에서 동물은 죽지 않았다.
사망률의 요약을 다음 표 16에 제시한다.
Figure pct00028
Figure pct00029
2000 RCoU/kg 용량을 사용할 때 20% (20마리 중 4마리)의 사망률 및 4000 RCoU/kg 용량의 rVWF를 사용할 때 40% (20마리 중 8마리)의 사망률이 있었다. 조사된 나머지 용량에서 사망은 없었다.
rVWF + rFVIII를 사용할 때, 조사된 최고 용량에서 25% (20마리 중 5마리)의 사망률이 있었다. 조사된 나머지 용량에서 사망은 없었다.
4000 RCoU/kg 해메이트® P (+ 3322 IU/kg FVIII)의 용량을 사용할 때 80% (10마리 중 8마리)의 사망률이 있었다. 2000 RCoU/kg 해메이트® P (+ 1664 IU/kg FVIII)의 용량에서 사망은 없었다 (20마리 중 0마리).
최고 용량의 rVWF + rFVIII를 사용할 때 25% (20마리 중 5마리)의 사망률이 있었다. 나머지 용량 또는 대응하는 버퍼를 사용할 때 사망은 없었다 (20마리 중 0마리).
다중도에 대해 조정된 모든 양측 p-값이 5%보다 더 크기 때문에, 상이한 용량의 rVWF + rFVIII 및 대응하는 버퍼 사이에서 사망률의 통계상 유의한 (다중도 조정된 5% 수준에서) 차이는 없었다.
최고 용량의 rVWF + rFVIII 및 대응하는 버퍼 사이에서 25%의 사망률의 관찰된 차이는 다중도 조정된 5% 수준에서 통계상 유의하지 않았다. 그러나, 조정되지 않은 양측 p-값은 0.0471이었다. 상기 비처리 양측 p-값은 5개의 상이한 용량군을 대응하는 버퍼와 동시에 비교하기 위해 조정되지 않았다. 따라서, 5개의 상이한 용량 및 버퍼 사이에서 차이 없음의 전체 귀무 가설이 진실이면, 유의한 결과는 5% 초과의 확률로 우연히 발생할 수 있었다.
최고 용량의 rVWF 및 대응하는 버퍼 사이에서 40%의 사망률의 관찰된 차이는 통계상 유의하였다 (다중도 조정된 양측 p-값 = 0.0164).
rVWF의 버퍼 및 2000, 1000, 500 및 250 RCoU/kg의 용량 사이에서 사망률의 통계상 유의한 차이 (다중도 조정된 5% 수준에서)는 없었다.
코크란-아미티지 경향 검정은 rVWF + rFVIII를 사용할 때뿐만 아니라 rVWF 단독을 사용할 때 사망률의 용량-경향 가설을 지지한다. 두 양측 p-값은 모두 1% 미만이었고, 용량이 증가함에 따라 사망 확률이 증가함을 입증하였다.
2000 RCoU/kg (+ 1664 IU/kg FVIII)의 용량에서 해메이트® P를 사용할 때 사망은 없었고 (20마리 중 0마리), 2000 RCoU/kg + 1538 IU/kg rFVIII의 용량에서 rVWF + rFVIII를 사용할 때 사망은 없었다 (20마리 중 0마리) (양측 p-값 = 1.0000).
4. 임상 이상
독성을 표시하는 임상 이상이 4000 RCoU/kg rVWF로 처리한 동물의 85% (20마리 중 17마리, 군 E 및 O에서), 및 4000 RCoU/kg rVWF + 3077 IU/kg rFVIII로 처리한 동물의 75% (20마리 중 15마리, 군 A 및 K에서)에서 관찰되었다. 증상은 2000 RCoU/kg rVWF 단독으로 처리한 동물의 45% (20마리 중 9마리, 군 B 및 L에서), 및 2000 RCoU/kg rVWF + 1538 IU/kg rFVIII로 처리한 동물의 35% (20마리 중 7마리, 군 I 및 S에서)에서 보였다. 독성을 표시하는 증상이 4000 RCoU/kg 해메이트® P로 처리한 동물의 90% (10마리 중 9마리, 군 T에서), 및 2000 RCoU/kg 해메이트® P로 처리한 동물의 40% (20마리 중 8마리, 군 J 및 U에서)에서 보였다.
임상 증상이 조합 버퍼 용액으로 처리한 동물의 20% (20마리 중 4마리, 군 C 및 M에서)에서 또한 관찰되었다.
모든 다른 처리군은 임상학상 정상이었다. 요약을 다음 표 17에 제시한다.
Figure pct00030
Figure pct00031
5. 체질량 분석
연구일 0일 및 연구일 1일, 7일 및 14일 사이에 체질량의 변화 (제0일의 체질량의 Δ%로서)를 품목 및 용량에 의해 분류된 상자 그림을 이용하여 시각화하였다. 이들 상자 그림을 위해 수컷 및 암컷 동물을 합하였다. 체질량 분석을 표 18 및 도 24-26에 제공한다.
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
대응하는 버퍼 (-1.1%의 평균 Δ%)를 사용할 때보다 최고 용량 (-5.7%의 평균 Δ%) 및 제2 최고 용량 (-7.4%의 평균 Δ%)을 사용할 때 제0일 내지 제1일의 체질량의 통계상 유의한 (다중도 조정된 5% 수준에서) 감소가 있었다.
다중도에 대해 조정된 모든 양측 p-값이 5%보다 더 크기 때문에, 상이한 용량의 rVWF + rFVIII 및 대응하는 버퍼 사이에서 제0일 내지 제14일의 체질량 발달의 통계상 유의한 차이 (다중도 조정된 5% 수준에서)는 없었다.
단계-하향 방식으로 제0일 내지 제1일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량의 추정은 5%를 초과하는 제1 양측 p-값 (양측 p-값 = 0.1069)인 500 RCoU/kg + 385 IU/kg에 대한 대비물에서 중단하였다. 따라서, 최소 검출가능한 용량은 1000 RCoU/kg + 769 IU/kg rFVIII이었다.
단계-하향 방식으로 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량의 추정은 최고 용량에 대한 대비물에서 중단하였다. 최고 용량에 대한 양측 p-값은 0.2276이었고, 이것은 5%를 초과하였고, 추가의 대비물을 조사하지 않았다. rVWF + rFVIII를 사용할 때 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량은 없었고, 조사된 최고 용량은 NOAEL 용량으로서 간주될 수 있었다.
대응하는 버퍼 (-0.7%의 평균 Δ%)를 사용할 때보다 최고 용량 (-2.7%의 평균 Δ%) 및 제2 최고 용량 (-6.5%의 평균 Δ%)를 사용할 때 제0일 내지 제1일의 체질량의 통계상 유의한 (다중도 조정된 5% 수준에서) 더 큰 감소가 있었다.
다중도에 대해 조정된 모든 양측 p-값이 5% 미만이었기 때문에, 대응하는 버퍼를 사용할 때보다 조사된 모든 용량에서 제0일 내지 제14일의 체질량의 통계상 유의한 (다중도 조정된 5% 수준에서) 더 큰 차이가 있었다.
단계-하향 방식으로 제0일 내지 제1일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량의 추정은 5%를 초과하는 제1 양측 p-값 (양측 p-값 = 0.6932)인 1000 RCoU/kg에 대한 대비물에서 중단하였다. 따라서, 최소 검출가능한 용량은 2000 RCoU/kg이었다.
단계-하향 방식으로 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량의 추정은 양측 p-값이 여전히 5% 초과인 조사된 최저 용량에 대한 대비물에서 중단하였다. 따라서, 최소 검출가능한 용량은 250 RCoU/kg이었다.
제0일 내지 제1일의 평균 체질량 발달은 해메이트® P (2000 RCoU/kg + 1664 IU/kg FVIII)를 사용할 때 0.6% (95% CI: -0.3% 내지 2.7%)이고 투여된 대응하는 용량의 rVWF + rFVIII를 사용할 때 -7.4% (95% CI: -9.4% 내지 -4.6%)이었다. 상기 차이는 5% 수준에서 통계상 유의하였다 (양측 p-값 < 0.0001).
제0일 내지 제14일의 평균 체질량 발달은 해메이트® P (2000 RCoU/kg + 1664 IU/kg FVIII)를 사용할 때 1.5% (95% CI: -1.3% 내지 3.5%)이고 투여된 대응하는 용량의 rVWF + rFVIII를 사용할 때 3.6% (95% CI: 2.0% 내지 5.8%)이었다. 상기 차이는 5% 수준에서 통계상 유의하지 않았다 (양측 p-값 = 0.2079).
6. 혈액학적 및 혈청학적 변수
적혈구 용적률, 혈소판 계수, 및 LDH의 비교를 표 19-21 및 도 27-32에 제시한다.
1000 RCoU/kg rVWF 및 버퍼로 처리한 군에서 제14일에 적혈구 용적률 및 혈소판 계수에 대한 데이타는 샘플 손상 때문에 분실된다.
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
7. 검시
검시 소견은 rVWF와 자발적으로 죽은 동물과의 연관성을 나타냈다.
8. 조직병리학
단기 연구에 대해, 단독으로 또는 rFVIII와 조합으로, 500 RCoU/kg rVWF 및 그 초과의 용량으로 처리한 rVWF-처리군에서 심장 심근 괴사 (최소 내지 중등도 등급, 초점 또는 다초점)가 기록되었다. 단독으로 또는 rFVIII와 조합으로, 1000 RCoU/kg 및 그 초과의 용량으로 rVWF-처리된 동물에서 미세혈전 (최소 내지 중등도 등급)이 기록되었다. 이들 변화는 둘 모두 중증도 및/또는 발병률의 경미한 용량-의존 증가를 보였다.
추가로, 단독으로 또는 rFVIII와 조합으로, 1000 RCoU/kg rVWF 및 그 초과의 용량으로 시험 품목-처리된 동물에서 관상 혈관주위염에 대한 증가된 발병률이 기록되었다.
rVWF 단독으로 처리한 고용량군의 뇌에서 아교 세포 병소 (최소 등급)와 조합된 미세혈전 (최소 등급)이 기록되었다. rVWF 단독으로 처리한 2000 RCoU/kg 용량군의 동물 및 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 1000 RCoU/kg 용량군의 동물에서 경미하게 증가된 발병률의 미세혈전 (모두 최소 등급)이 기록되었다.
동반하는 변성 병변 없이 최소 발병률 및 등급의 미세혈전이 상이한 군의 단일 rVWF-처리된 동물에서뿐만 아니라 등장성 염수로 처리한 1마리의 대조군 동물에서 기록되었다.
자발적으로 죽은 고용량군의 1마리의 rVWF-처리된 동물의 눈에서 미세혈전 (최소 등급)이 기록되었다. 상기 소견은 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 동물에서 관찰되지 않았다.
고용량군 (자발적으로 죽은)의 rVWF-처리된 동물의 신장에서 및 500 RCoU/kg 용량군의 rVWF-처리된 동물에서 (둘 모두 rVWF 단독으로 처리함), 및 rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 1000 RCoU/kg 및 고용량군의 동물에서 미세혈전 (최소 내지 경미한 등급)이 기록되었다.
시험 품목-처리된 동물의 폐뿐만 아니라 해메이트® P, 등장성 염수 또는 조합 버퍼로 처리한 대조군 동물에서 낮은 발병률의 미세혈전 (최소 내지 경미한 등급)이 기록되었다 (발병률: ≤ 4/10; 평균 중증도: ≤ 1.5). 모든 미세혈전은 초기 단계이고, 피브린 축합의 징후를 보이지 않고, 괴사 또는 경색이 동반되지 않았다.
추가로, rVWF 단독으로 처리한 고용량군의 시험 품목-처리된 동물에서 최소 증가된 평균 중증도의 미세혈전이 기록되었다. 상기 증가는 상기 군의 2마리의 동물에 의해 야기되었고, 둘 모두 중등도 중증도의 폐 미세혈전 (등급 3)을 가졌다. 분명한 용량 관계는 기록될 수 없었다.
장기 연구에 대해, 단독으로 또는 rFVIII와 조합으로, 500 RCoU/kg rVWF 및 그 초과의 용량으로 처리한 시험 품목-처리된 동물의 심장에서 심근 변성/보상 (최소 내지 현저한 등급)이 기록되었다. 상기 변화는 중증도 및/또는 발병률의 용량-의존 증가를 보였고, 종종 헤모시데린 축적 및 때때로 또한 심근 석회화가 동반되는 염증 (주로 단핵성) 및 섬유증을 특징으로 하였다.
추가로, 특히 자발적으로 죽은 동물에서 미세혈전 및 심근 괴사가 낮은 발병률로 기록되었다.
rVWF 단독으로 처리한 고용량군의 뇌뿐만 아니라 2000 RCoU/kg rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 군에서 아교 세포 병소 (최소 등급)와 조합된 미세혈전 (최소 등급)이 기록되었다.
추가로, 2000 RCoU/kg rVWF 단독으로 처리한 동물에서 경미하게 증가된 발병률의 미세혈전 (모두 최소 등급)이 기록되었다. 동반하는 변성 병변 없이 최소 발병률 및 등급의 미세혈전이 상이한 군의 단일 시험 품목-처리된 동물뿐만 아니라 조합 버퍼로 처리한 1마리의 대조군 동물에서 기록되었다.
1000 RCoU/kg rVWF 및 보다 고용량을 단독으로 처리한 군의 시험 품목-처리된 동물의 신장뿐만 아니라 rFVIII와 조합으로 500 RCoU/kg rVWF 및 보다 고용량으로 처리한 군의 동물에서 미세혈전 (최소 내지 경미한 등급)이 기록되었다. 상기 소견은 조합 버퍼로 처리한 1마리의 대조군 동물에서 최소 등급으로 또한 기록되었다.
rVWF 단독으로 처리한 2000 RCoU/kg 용량군에서 1마리의 시험 품목-처리된 동물 (자발적으로 죽은)에서 미세혈전 (경미한 등급)에는 피질 괴사 (중등도 등급)가 동반하였다.
rVWF 단독으로 처리한 고용량군의 1마리의 시험 품목-처리된 동물 (자발적으로 죽은)의 부신 피질에서 미세혈전 (최소 등급)이 기록되었다. 상기 소견은 rFVIII와 조합하여 rVWF로 처리한 동물에서 관찰되지 않았다.
추가로, rVWF 단독으로 처리한 고용량군의 3마리의 시험 품목-처리된 동물 (자발적으로 죽은)에서 경미한 내지 중등도의 출혈이 기록되었다. 상기 소견은 rFVIII와 조합하여 rVWF로 처리한 동물에서 관찰되지 않았다.
시험 품목-처리된 동물뿐만 아니라 해메이트® P, 등장성 염수, 시트레이트 버퍼 또는 조합된 버퍼로 처리된 대조군 동물의 폐에서 낮은 발병률의 미세혈전 (최소 내지 경미한 등급)이 기록되었다 (발병률: ≤ 3/10; 평균 중증도: ≤ 1.5). 모든 미세혈전 (아래에 설명한 하나를 제외함)은 초기 상태이고, 피브린 축합의 징후를 보이지 않고, 괴사 또는 경색을 동반하지 않았다.
추가로, rVWF 단독으로 처리한 2000 RCoU/kg 용량군의 시험 품목-처리된 동물에서 경미하게 증가된 평균 중증도의 미세혈전이 기록되었다. 상기 증가는 본 연구에서 히알린 폐 혈전만을 가진 상기 군의 단일 동물에 의해 야기되었다. 상기 혈전증은 검시에서 기록된 폐에서 육안으로 가시적인 청적 변색을 일으켰다 (병리학 보고서에서 "육안 소견의 표" 참조). 분명한 용량 관계는 기록될 수 없었다.
또한, rVWF 및 rFVIII의 조합물로 처리한 고용량군의 시험 품목-처리된 동물에서 경미하게 증가된 발병률의 미세혈전 (모두 최소 등급)이 기록되었다. 분명한 용량 관계는 기록될 수 없었다.
9. 논의
상기 설명된 바와 같이, rVWF를 단독으로 5개의 용량 수준에서 (4000, 2000, 1000, 500 및 250 RCoU/kg (BW)), 및 rFVIII와 조합으로 또한 5개의 용량에서 시험하였다. 조합 투여에서, rVWF의 용량은 단일 투여에서와 동일하였고, rFVIII의 용량은 감소하는 순서로 3077, 1538, 769, 385 및 192 IU/kg rFVIII이었고, 즉, 4000 RCoU/kg BW rVWF는 3077 IU/kg rFVIII와 동시투여되고, 2000 RCoU/kg BW rVWF는 1538 IU/kg rFVIII와 동시투여된다. 해메이트® P는 4000 RCoU/kg BW (+ 3322 IU/kg BW FVIII) 및 2000 RCoU/kg BW (+ 1664 IU/kg BW FVIII)에서 시험되었다.
rVWF 단독에 대한 대응하는 버퍼는 31.7 mL/kg (rVWF의 최고 용량 부피에 따라)의 부피에서, 혼합 버퍼는 49.3 mL/kg의 부피에서, 등장성 염수는 51.1 mL/kg의 부피에서 투여하였다.
본 연구에서 최고 사망률은 해메이트® P로 4000 RCoU/kg 용량 수준에서 처리한 군에서 관찰되었고, 여기서, 80% (10마리 중 8마리)는 투여 직후에 죽었고, 이때 시트르산나트륨 과부하 (281 mg/kg 시트레이트를 51.1 mL/kg의 투여된 부피로 주사하였다)의 명백한 징후를 보였다. 마우스에서 정맥내 적용 후 시트르산나트륨의 LD50는 231 mg/kg이므로 (Sax's Dangerous Properties of Industrial Materials, 1992), 해메이트® P의 용량을 2000 RCoU/kg VWF로 바꾸었다. 추가의 사망은 해메이트® P를 사용할 때 상기 용량 수준에서 관찰되지 않았다.
4000 RCoU/kg의 rVWF를 단독으로 투여한 동물의 40% (20마리 중 8마리)는 죽은 반면, 2000 RCoU/kg을 투여한 동물에서 사망률은 20% (20마리 중 4마리)로 감소하였다. 보다 저용량군에서 추가의 사망은 없었다. 4000 RCoU/kg rVWF를 3077 IU/kg rFVIII와 조합하여 투여한 동물의 25% (20마리 중 5마리)가 죽었다. 보다 저용량군에서, 심지어 2000 RCoU/kg을 rFVIII와 조합하여 투여한 군에서 추가의 사망은 없었다. 4000 RCoU/kg 용량군의 주사된 부피 내에 141 mg/kg 시트르산나트륨이 존재하므로, 이것이 또한 이들 군에서 일부 돌연사에 대한 이유일 수 있다. 상기 사인은 고용량군에서 지연된 사례 및 2000 RCoU/kg 용량군에서 돌연사를 위해 배제될 수 있다.
통계상 애드혹 수행된 경향 검정은 rVWF의 용량이 증가함에 따라 사망 확률이 증가함을 입증하였다 (양측 p-값 < 0.0001).
2000 RCoU/kg VWF + 1664 IU/kg FVIII의 용량으로 투여된 해메이트® P에서 사망은 없었고 (20마리 중 0마리), 2000 RCoU/kg rVWF + 1538 IU/kg rFVIII를 사용할 때 사망은 없었다 (20마리 중 0마리).
임상 관찰은 넓은 스펙트럼의 이상을 밝혔다. 버퍼군의 동물의 20% (20마리 중 4마리)에서 시트르산나트륨 독성에 대한 전형적인 증상 (예를 들어, 단기 행동 저하, 발작, 호흡곤란)이 기록되었기 때문에, 단기 증상은 주사된 시트르산나트륨의 양에 의해 또한 명백하게 유발되었다.
그러나, 투여된 용량과 증상의 발병률 및 중증도 사이에 명백한 상관관계가 존재하였다. 동물의 85% (20마리 중 17마리)는 4000 RCoU/kg rVWF를 투여받은 후 이환된 반면, 동물의 45% (20마리 중 9마리)는 2000 RCoU/kg rVWF를 투여받은 후 이환되었다.
4000 RCoU/kg을 3077 IU/kg rFVIII와 조합하여 투여한 동물의 75% (20마리 중 15마리)에서 임상 이상이 관찰된 반면, 35% (20마리 중 7마리)는 2000 RCoU/kg rVWF를 1538 IU/kg rFVIII와 조합하여 투여한 후에 이환되었다. rVWF 단독으로 또는 rFVIII와 조합으로 처리한 임의의 다른 군에서 임상 이상이 기록되지 않았다.
해메이트® P를 4000 RCoU/kg 용량 수준에서 처리한 군 (90%, 10마리 중 9마리의 동물)에서 관찰된 증상은 명백하게 시트레이트 과부하 (281 mg/kg)에 의해 유발되고, 즉사를 일으켰다. 2000 RCoU/kg 해메이트® P로 처리한 군에서 모든 이환된 동물 (40%, 20마리 중 8마리 동물)은 또한 시트르산나트륨 독성 (140.5 mg/kg; 예를 들어, 단기 행동 저하, 발작, 호흡곤란)을 표시하는 단기 이상만을 보였다. 추가의 장기 증상이 기록되지 않았다.
제0일 내지 제1일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량 (MDD)은 1000 RCoU/kg rVWF + 769 IU/kg rFVIII인 것으로 추정되었다. 따라서, 500 RCoU/kg rVWF + 385 IU/kg rFVIII의 용량은 제0일 내지 제1일의 체질량 발달의 면에서 "유해한 효과가 관찰되지 않는 수준" (NOAEL) 용량으로서 간주될 수 있었다. 따라서, 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량은 없었고, 조사된 rVWF + rFVIII의 최고 용량 (4000 RCoU/kg + 3077 IU/kg)은 제0일 내지 제14일의 체질량 발달의 면에서 NOAEL 용량으로서 간주될 수 있었다.
단독 투여된 rVWF에 대한 제0일 내지 제1일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량 (MDD)은 2000 RCoU/kg인 것으로 추정되었다. 따라서, 1000 RCoU/kg의 용량은 제0일 내지 제1일의 체질량 발달의 면에서 유해한 효과가 관찰되지 않는 수준 (NOAEL) 용량으로서 간주될 수 있었다. 제0일 내지 제14일의 체질량 변화에 대한 최소 검출가능한 용량은 조사된 rVWF의 최저 용량 (250 RCoU/kg)인 것으로 추정되었다. 따라서, 조사된 rVWF의 용량들 사이의 용량은 제0일 내지 제14일의 체질량 발달의 면에서 NOAEL 용량으로서 간주될 수 없었다. 체질량의 증가 (2.3% vs. 버퍼군에 대해 4.8%)는 염수 (1.8%) 및 해메이트® P (1.5%)보다 더 높고, 250 RCoU/kg rVWF + rFVIII (2.7%)로 처리한 군에 유사하기 때문에, 상기 추정된 차이는 예측불가능한 것으로 여겨질 수 있다. 제0일 내지 제1일의 평균 체질량 발달은 2000 RCoU/kg의 용량으로 투여된 해메이트® P + 1664 IU/kg FVIII를 사용할 때 0.6%, 및 대응하는 용량의 투여된 rVWF + rFVIII를 사용할 때 -7.4%이었다. 상기 차이는 5% 수준에서 통계상 유의하였다 (양측 p-값 < 0.0001). 제0일 내지 제14일에 통계상 유의한 차이는 발견되지 않았다.
생존하는 동물에서 선택된 혈액학적 및 혈청 화학 변수의 데이타를 비교하면, 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여되는 1000 RCoU/kg rVWF 및 그 초과의 용량의 투여 후에 제1일에 혈소판 계수의 강하가 관찰되었다. 추가로, 적혈구 용적률은 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여되는 2000 RCoU/kg rVWF 및 그 초과의 용량의 투여 후에 강하하였다.
대조군에 비해, 락테이트 데히드로게나제는 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여되는 2000 RCoU/kg rVWF 및 보다 고용량을 사용한 처리 후에 제1일에 증가하였다.
혈소판 계수의 강하는 해메이트® P (+ 1664 IU/kg FVIII) 내에서 2000 RCoU/kg VWF의 적용의 1일 후에만 측정될 수 있었다. 측정된 변수는 14일의 관찰 후에 모든 이환된 군에서 정상 수준으로 되돌아갔다.
조직병리학적 검사에 의해 많은 이환된 장기를 밝혔다: 심장 (관상 미세혈전, 심근 괴사, 증가된 관상 혈관주위염, 심근 변성/보상), 뇌 (미세혈전, 아교 세포 병소), 눈 (미세혈전), 신장 (미세혈전, 피질 괴사), 부신 (미세혈전, 출혈), 및 폐 (미세혈전의 증가된 발병률 또는 평균 중증도). 이들 병리조직학적 변화는 파종성 혈관내 응고병증 (DIC)으로서 요약될 수 있다. 고용량 (≥2000 RCoU rVWF)에서, 동물은 어느 정도까지 인간의 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)의 모습과 유사하다. 보다 저용량 (500-1000 RCoU)에서, 심장은 저등급 "허혈성 심장병"의 모습과 유사한 병리조직학적 변화로 주로 이환되었다. 재조합 생성물(들)을 투여받은 시험 품목-처리된 동물과는 반대로, 인간 혈장-유래 VWF-FVIII 제제 (해메이트® P)를 투여받은 참조 품목-처리된 동물에서 그러한 소견은 기록되지 않았다. 여기에서, 단지 저등급 폐 미세혈전이 대조군 동물에서와 유사한 발병률로 기록되었다.
예정일 제1일에 치사시킨 (또는 투여 직후에 자발적으로 죽은) 시험 품목-처리된 동물에서 하나 또는 몇몇 장기에 대해 혈전색전성 변화가 기록되었다. 저산소증에 매우 예민한 심장이 가장 중증으로 이환된 장기이다. 관상 미세혈전에 의한 혈관 폐색은 심장으로의 혈류를 감소시키고, 이는 허혈성 심근 괴사 (산소 결핍에 이차적인 세포 단식) 및 반응성 관상 혈관주위염을 유발한다 (초기 효과).
예정일 제14일에 치사시킨 (또는 투여 후에 조금 늦추어 자발적으로 죽은) 시험 품목-처리된 동물의 심장에서 두드러진 변성 및/또는 보상적 변화가 기록되었다 (염증, 섬유증, 헤모시데린 축적, 석회화). 이들 심근 경색-유사 변화는 미세혈전에 의한 선행 혈관 폐색의 결과인 것으로 보였다 (지연된 효과). 자발적으로 죽은, 2000 RCoU/kg rVWF 단독으로 처리한 군의 1마리의 동물에서 기록된 신 피질 괴사는 동일한 방식으로 해석될 수 있다. 여기서, 미세혈전에 의한 신장 혈관의 혈관 폐색은 신 경색증을 일으켰다.
동반하는 장기 파괴 없이 낮은 발병률의 미세혈전 (최소 내지 경미한 등급)이 염수-, 버퍼- 및/또한 해메이트® P-처리된 대조군 동물의 몇몇 장기 (폐, 신장, 뇌)에 대해 기록되었다.
기록된 병리학적 변화는 하나 또는 몇몇 장기 내의 유해한 미세혈전증으로 구성되었다. 이들은 단독으로 또는 rFVIII와 조합하여 투여되는 500 RCoU/kg rVWF 및 보다 고용량에서, VWF 절단 프로테아제가 결여되는 상기 동물 모델 (ADAMTS13-결핍 마우스)에서 시험 품목인 rVWF의 혈전생성 가능성을 나타낸다. 저용량 군 (rVWF 단독 및 rVWF와 조합된)에서 유해한 조직병리학적 변화가 기록되지 않았으므로, NOAEL은 250 RCoU/kg로 확립될 수 있었다.
rVWF의 독성학 프로필의 동물주-특이적 차이에 관련하여, ADAMTS13-결핍 마우스는 시험된 쥐 동물주 중 가장 큰 감수성을 나타낸다. ADAMTS13-결핍 마우스와 반대로, VWF-결핍 마우스 및 C57BL/6J 마우스 모두에서 최고 용량의 rVWF에서도 사망이 관찰되지 않았다. ADAMTS13 낙아웃 마우스에서 rVWF에 대한 NOAEL은 250 RCoU/kg BW이었다.
실시예 9:
ADAMTS13 결핍 마우스에서 인간 재조합 ADAMTS13 과 인간 rVWF 의 동시투여
본 연구의 목적은 ADAMTS13-결핍 마우스에서 rVWF와 재조합 인간 ADAMTS13 (rADAMTS13)의 동시투여의 효과를 평가하기 위한 것이었다. 인간 혈장-유래 제제인 해메이트® P 내에서 발견된 비에 따라, rVWF를 2000 RCoU/kg로 투여하고 rADAMTS13을 19.4 ㎍/kg로 투여하였다. 2000 RCoU의 rVWF를 선택하였고, 이는 상기 용량이 ADAMTS13-결핍 마우스에서 20% 사망을 일으키기 때문이다 (연구 번호 PV1940601). rVWF 및 rADAMTS13을 적용 직전에 시린지 내에서 예비혼합된 상태로 주사하거나 (군 A), rADAMTS13의 주사에 이어 즉시 rVWF 주사로서 연속적으로 주사하였다 (군 B).
해메이트® P는 초고 VWF 다량체가 결여될 뿐만 아니라 또한 ADAMTS13을 함유한다. 실시예 8에서 입증되는 바와 같이, ADAMTS13 결핍 마우스는 해메이트® P를 사용한 처리 후에 혈전생성성의 징후를 보이지 않았다.
1. ADAMTS13 및 rVWF의 동시투여를 위한 프로토콜
2000 RCoU/kg rVWF (15.9 mL/kg와 동등함) 및 19.4 ㎍/kg rADAMTS13 (5 mL/kg와 동등함)의 용량을 사용하였다. 처리군 A에서는 두 품목을 꼬리 정맥 주사 직전에 시린지 내에서 혼합하였다. 처리군 B에서는 rADAMTS13을 rVWF의 주사 직전에 투여하였다.
상기한 것과 같은 프로토콜에 유사하게, 동물을 제1일에서 종결까지 주사 후에 독성을 표시하는 징후에 대해 관찰하였다. 혈액학적 (적혈구 용적률, 혈소판 계수) 및 혈청학적 변수 (LDH, CK)의 분석을 위해 혈액 샘플을 투여의 1일 후에 마취 (케타민 + 자일라진 i.m.) 하에 심장 천자에 의해 채취하였다.
검시를 수행하고 선택된 장기 (폐 [관류시킴, 기관 비포함], 심장, 신장, 부신, 간, 뇌 [연수 비포함], 비장, 눈)를 표준 헤마톡실린-에오신 염색 절차 후에 조직병리학적 평가를 위해 4% 포름알데히드 용액 내에 보존하였다.
모든 동물로부터 검시에서 수집한 모든 조직 샘플(뿐만 아니라 모든 육안 소견의 조직 샘플)의 슬라이드를 처리하고, 파라핀 내에 포매하고, 2-4 ㎛의 공칭 두께로 절단하고, 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색하고, 광학 현미경으로 검사하였다.
2. 결과
어떠한 동물에서도 사망이 일어나지 않고, 독성을 표시하는 임상 증후가 기록되지 않았다.
혈액학적 및 혈청학적 변수의 임상 및 분석 데이타를 아래에 요약한다.
처리군 사망률
(%)		 임상 이상
(%)		 분석 제1일 (평균±SEM)
적혈구 용적률
(%)		 혈소판
(x1000/㎕)		 CK
(U/L)		 LDH
(U/L)
A 0 0 41.3±0.7 1065.6±52.4 193.0±16.4 255.9±13.8
B 0 0 41.2±0.5 716.2±87.0 196.4±15.2 346.7±25.9
3. 논의
본 연구의 목적은 ADAMTS13 결핍 마우스에서 재조합 ADAMTS13의 동시투여에 의해 rVWF의 급성 독성이 약화될 수 있는지 여부를 평가하기 위한 것이었다.
실시예 8에서 ADAMTS13 결핍 마우스에서 rVWF의 독성이 명백하게 관찰되었다. 실시예 8에서는 또한 해메이트® P가 ADAMTS13 결핍 마우스 (양성 대조군)에 대한 유의한 효과가 없었음을 예시한다.
본 연구에서, 사망 또는 독성의 징후가 관찰되지 않았고, 이것은 ADAMTS13에 의한 절단이 rVWF 독성을 방지할 수 있음을 입증한다.
분석 데이타를 비교하면, 예비혼합된 품목들의 투여와는 반대로, rADAMTS13 및 rVWF의 연속 투여의 1일 후에 혈소판 계수의 강하가 측정되었다. 검시 소견은 없었다. 시험 품목-처리된 동물군 A 및 B에서, 관상 미세혈전 (최소 내지 경미한 등급), 심근 괴사 (최소 내지 중등도 등급), 및 경미하게 증가된 관상 혈관주위염으로 구성되는 심장에 대한 조직병리학적 변화가 기록되었다.
추가로, 군 B의 단일 시험 품목-처리된 동물에서 경미한 등급 섬유증이 기록되었다. 섬유증은 투여의 1일 후에 희생시킨 동물에서 기록되었으므로 만성의 기존 병태인 것으로 나타났다. 따라서, 이것은 시험 품목에 비관련된 것으로 보였다.
2개의 군 (A vs. B)을 비교하면, 조직병리학적 변화의 중증도 또는 발병률의 확연한 차이는 기록되지 않았다. 그러나, rADAMTS13 동시투여가 없는 선행 연구와 반대로, 본 연구에서 검시에서 사망 및 육안 소견이 기록되지 않았다. 심근 괴사의 발병률 및 중증도는 두 연구에서 유사하였다. 그러나, 관상 미세혈전증 및 관상 혈관주위염은 ADAMTS13 처리한 마우스에서 덜 확연하였다. 또한, ADAMTS13을 투여한 마우스는 심장에서만 미세혈전을 나타낸 한편, 선행 연구에서 마우스의 심장, 뇌, 신장 및 폐에 대해 미세혈전이 기록되었다.
본 연구의 결과는 ADAMTS13에 의한 절단이 rVWF 독성을 방지할 수 있음을 입증한다.
본 발명을 본 발명의 실시를 위한 구체적인 방식을 포함하는 것으로 밝혀지거나 제안된 특정 실시양태의 면에서 설명하였다. 설명된 발명의 다양한 변형 및 변이는 본 발명의 범위 및 취지로부터 벗어나지 않으면서 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명을 구체적인 실시양태와 연관하여 설명하였지만, 청구된 발명은 상기 구체적인 실시양태에 부당하게 제한되지 않아야함을 이해해야 한다. 실제로, 당업자에게 자명한 발명을 수행하기 위한 설명된 방식의 다양한 변형은 다음 특허청구범위 내에 있는 것으로 의도된다.

Claims (68)

  1. 혈액 응고 질환의 치료에서 치료제의 효능을 시험하기 위한 동물 모델로서, 상기 동물 모델이 재조합 폰 빌레브란트 인자 (von Willebrand factor; VWF) 폴리펩티드를 파괴하지 못하고, 상기 질환이 상기 동물 모델에서 하나 이상의 혈괴의 존재를 특징으로 하는 것인 동물 모델.
  2. 제1항에 있어서, 질환이 혈전성 혈소판감소성 자반증인 모델.
  3. 제1항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 폴리펩티드가 인간의 것인 모델.
  4. 제1항에 있어서, 모델이 마우스인 모델.
  5. 제4항에 있어서, 마우스가 트롬보스폰딘 타입 1 도메인 13을 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테아제 (ADAMTS13) 폴리펩티드가 결핍되는 것인 모델.
  6. 제4항에 있어서, 마우스가 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 폴리펩티드가 결핍되는 것인 모델.
  7. 제4항에 있어서, 마우스가 C57BL/6J 주의 것인 모델.
  8. 시험 물질의 존재 및 부재 하에 동물 모델에서 사망률을 비교하는 것을 포함하고, 여기서 시험 물질의 존재 하에 감소된 사망률은 시험 물질이 혈액 응고를 감소시키는 능력을 가짐을 나타내는 것인, 재조합 폰 빌레브란트 인자를 사망을 일으키기에 효과적인 양으로 투여한 포유동물에서 혈액 응고를 감소시키는 그의 능력에 대해 물질을 시험하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 동물 모델이 트롬보스폰딘 타입 1 도메인 13을 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테아제 (ADAMTS13) 폴리펩티드가 결핍되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 1000 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 2000 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 4000 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  13. 시험 물질의 존재 및 부재 하에 동물 모델에서 병리 상태를 비교하는 것을 포함하고, 여기서 시험 물질의 존재 하에 병리 상태의 감소된 발병률 또는 중증도는 시험 물질이 혈액 응고를 감소시키는 능력을 가짐을 나타내는 것인, 재조합 폰 빌레브란트 인자를 병리 상태를 일으키기에 효과적인 양으로 투여한 포유동물에서 혈액 응고를 감소시키는 그의 능력에 대해 물질을 시험하는 방법.
  14. 제8항 또는 제13항에 있어서, 시험 물질을 다양한 범위의 투여량에 걸쳐 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제8항 또는 제13항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자 (VWF) 폴리펩티드가 인간의 것인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 동물 모델이 트롬보스폰딘 타입 1 도메인 13을 갖는 디스인테그린 및 메탈로프로테아제 (ADAMTS13) 폴리펩티드가 결핍되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 250 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 500 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 1000 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 2000 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 4000 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  22. 제13항에 있어서, 동물 모델이 폰 빌레브란트 인자 폴리펩티드가 결핍되는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 500 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 1000 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 2000 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 4000 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  27. 제13항에 있어서, 동물 모델이 C57BL/6J 주의 마우스인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 250 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 500 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 1000 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 2000 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 재조합 폰 빌레브란트 인자의 양이 4000 RCoU/kg을 초과하는 것인 방법.
  33. 제8항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 동물 모델인 마우스인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 마우스가 C57BL/6J 주의 것인 방법.
  35. 제13항에 있어서, 병리 상태가 임상 병리 상태인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 임상 병리 상태가 소변 내의 락테이트 데히드로게나제 수준, 크레아티닌 키나제 수준, 적혈구 용적률, 헤모글로불린 농도, 적혈구 계수, 망상적혈구 계수, 총 백혈구 계수, 감별 백혈구 계수, 혈액 형태의 이상, 혈소판 계수, 평균 세포 부피, 평균 세포 헤모글로불린 농도, 또는 혈액 세포 수준의 변화인 방법.
  37. 제13항에 있어서, 병리 상태가 조직학적 병리 상태인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 조직학적 병리 상태가 미세혈전, 심근 괴사, 증가된 관상 혈관주위염, 심근 변성, 심근 경색, 심근 보상 (reparation), 아교 세포 병소 (foci), 피질 괴사, 출혈, 미세혈전의 증가된 발병률 또는 평균 중증도, 파종성 혈관내 응고병증 (DIC), 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP), 허혈성 심장병, 혈전색전성 변화, 반응성 관상 혈관주위염, 염증, 섬유증, 괴사, 헤모시데린 축적, 석회화, 신 경색증, 또는 체질량 감소인 방법.
  39. 제13항에 있어서, 병리 상태가 행동 병리 상태인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 행동 병리 상태가 행동 저하, 엎드린 자세, 모로 누운 자세, 이상 자세, 호흡곤란, 운동실조증, 부동성 (immobility), 발작 (convulsion), 경련 (cramp), 또는 털세움인 방법.
  41. 마우스에게 재조합 인간 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 rVWF 조성물은 고분자량 다량체를 형성하고, 투여는 마우스에서 감소된 혈소판 수준, 빈혈, 조직병리학적 효과, 증가된 혈액 크레아티닌 키나제 수준, 증가된 락테이트 데히드로게나제 수준, 및 증가된 미세혈전으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)의 적어도 하나의 증상을 생성시키는 것인, 마우스에서 TTP의 증상을 유도하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 마우스가 정상 수준의 내인성 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 갖는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 마우스가 결핍 수준의 내인성 VWF를 갖는 것인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 마우스가 결핍 수준의 내인성 ADAMTS13을 갖는 것인 방법.
  45. 제41항에 있어서, 마우스가 내인성 VWF 및 내인성 ADAMTS13 모두를 결핍 수준으로 갖는 것인 방법.
  46. 제41항에 있어서, 마우스에게 재조합 인자 VIII을 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  47. 제41항에 있어서, rVWF가 적어도 1000 RCoU/kg (체중)의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  48. 제41항에 있어서, rVWF가 적어도 2000 RCoU/kg (체중)의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  49. 제41항에 있어서, rVWF가 적어도 4000 RCoU/kg (체중)의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  50. 제41항에 있어서, rVWF가 정맥내로 투여되는 것인 방법.
  51. 제41항에 있어서, rVWF가 1회 초과로 투여되는 것인 방법.
  52. 제50항에 있어서, rVWF가 주기적으로 투여되는 것인 방법.
  53. 제50항에 있어서, rVWF가 250 내지 1000 RCoU/kg (체중)의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  54. 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)의 마우스 모델로서, 재조합 인간 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)를 포함하는 조성물이 주사된 마우스를 포함하고, 여기서 rVWF 조성물은 고분자량 다량체를 형성하고, 주사는 감소된 혈소판 수준, 빈혈, 조직병리학적 효과, 증가된 혈액 크레아티닌 키나제 수준, 증가된 락테이트 데히드로게나제 수준, 및 증가된 미세혈전으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 TTP의 적어도 하나의 증상을 생성시키는 것인, TTP의 마우스 모델.
  55. 제54항에 있어서, 마우스가 정상 수준의 내인성 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 갖는 것인 마우스 모델.
  56. 제54항에 있어서, 마우스가 결핍 수준의 내인성 VWF를 갖는 것인 마우스 모델.
  57. 제54항에 있어서, 마우스가 결핍 수준의 내인성 ADAMTS13을 갖는 것인 마우스 모델.
  58. 제54항에 있어서, 마우스가 내인성 VWF 및 ADAMTS13 모두를 결핍 수준으로 갖는 것인 마우스 모델.
  59. 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)의 마우스 모델로서, 재조합 인간 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 도입유전자 (transgene)로부터 rVWF를 발현하는 트랜스제닉 (transgenic) 마우스를 포함하고, 여기서 rVWF 조성물은 고분자량 다량체를 형성하고, 발현은 감소된 혈소판 수준, 빈혈, 조직병리학적 효과, 증가된 혈액 크레아티닌 키나제 수준, 증가된 락테이트 데히드로게나제 수준, 및 증가된 미세혈전으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 TTP의 적어도 하나의 증상을 생성시키는 것인, TTP의 마우스 모델.
  60. 제59항에 있어서, 마우스가 정상 수준의 내인성 폰 빌레브란트 인자 (VWF)를 갖는 것인 마우스 모델.
  61. 제59항에 있어서, 마우스가 결핍 수준의 내인성 VWF를 갖는 것인 마우스 모델.
  62. 제59항에 있어서, 마우스가 결핍 수준의 내인성 ADAMTS13을 갖는 것인 마우스 모델.
  63. 제59항에 있어서, 마우스가 내인성 VWF 및 ADAMTS13 모두를 결핍 수준으로 갖는 것인 마우스 모델.
  64. (a) 마우스에게 재조합 폰 빌레브란트 인자 (rVWF)를 포함하는 조성물을 투여하고, 여기서 rVWF 조성물은 고분자량 다량체를 형성하고, 투여는 감소된 혈소판 수준, 빈혈, 조직병리학적 효과, 증가된 혈액 크레아티닌 키나제 수준, 증가된 락테이트 데히드로게나제 수준, 및 증가된 미세혈전으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 혈전성 혈소판감소성 자반증 (TTP)의 적어도 하나의 증상을 형성시키고;
    (b) 시험 조성물을 마우스에게 투여하고;
    (c) TTP의 증상에 대한 시험 조성물의 효과를 결정하는 단계
    를 포함하는, TTP의 증상에 대한 시험 조성물의 효과를 평가하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 시험 조성물 및 rVWF 조성물이 동시에 투여되는 것인 방법.
  66. 제64항에 있어서, 시험 조성물이 rVWF 조성물 전에 투여되는 것인 방법.
  67. 제64항에 있어서, 시험 조성물이 rVWF 조성물 후에 투여되는 것인 방법.
  68. 제64항에 있어서, 시험 조성물이 1회를 초과하여 투여되는 것인 방법.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2009322367B2 (en) 2008-12-05 2015-03-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of measuring ADAMTS13-mediated in vivo cleavage of von Willebrand factor and uses thereof
RU2570162C1 (ru) * 2014-10-21 2015-12-10 Общество с ограниченной ответственностью "АптаНова" Способ моделирования тромбообразования у мышей для оценки действия препаратов антикоагулянта
US11597778B2 (en) 2015-04-07 2023-03-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Human monoclonal autoantibodies to ADAMTS13 and uses thereof
CN115413627B (zh) * 2022-10-21 2023-03-24 首都医科大学附属北京儿童医院 腹型过敏性紫癜动物模型的构建方法及应用

Family Cites Families (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4736866A (en) 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
US5175385A (en) 1987-09-03 1992-12-29 Ohio University/Edison Animal Biotechnolgy Center Virus-resistant transgenic mice
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US6821287B1 (en) 1991-05-24 2004-11-23 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Multi-mode vascular catheter system
WO1993019679A1 (en) 1992-04-07 1993-10-14 The Johns Hopkins University A percutaneous mechanical fragmentation catheter system
US5446143A (en) 1993-09-14 1995-08-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Adipose-specific promoter region of human aromatase cytochrome P450 gene
US6447796B1 (en) 1994-05-16 2002-09-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Sustained release hydrophobic bioactive PLGA microspheres
CA2175720C (en) 1996-05-03 2011-11-29 Ian M. Penn Bifurcated stent and method for the manufacture and delivery of same
US6818014B2 (en) 1995-03-01 2004-11-16 Scimed Life Systems, Inc. Longitudinally flexible expandable stent
US6824553B1 (en) 1995-04-28 2004-11-30 Target Therapeutics, Inc. High performance braided catheter
DE19632532A1 (de) 1996-08-13 1998-02-19 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zur Herstellung von Säugetieren mit definierten genetischen Eigenschaften
US6391032B2 (en) 1996-08-23 2002-05-21 Scimed Life Systems, Inc. Stent delivery system having stent securement means
AT405485B (de) * 1997-05-28 1999-08-25 Immuno Ag Eine das vwf-propeptid enthaltende pharmazeutische präparation
US6818016B1 (en) 1997-06-27 2004-11-16 The Regents Of The University Of Michigan Methods for coating stents with DNA and expression of recombinant genes from DNA coated stents in vivo
US6827730B1 (en) 1998-01-13 2004-12-07 Endovascular Technologies, Inc. Reduced diameter stent/graft deployment catheter
US6206914B1 (en) 1998-04-30 2001-03-27 Medtronic, Inc. Implantable system with drug-eluting cells for on-demand local drug delivery
JP4340339B2 (ja) 1998-07-31 2009-10-07 財団法人化学及血清療法研究所 血液凝固因子もしくは血液凝固制御因子欠損モデル動物並びに該モデル動物の作製方法
DE60040274D1 (de) 1999-03-10 2008-10-30 Phogen Ltd Verabreichung von nukleinsäuren und proteinen an zellen
US6368315B1 (en) 1999-06-23 2002-04-09 Durect Corporation Composite drug delivery catheter
US6829497B2 (en) 1999-09-21 2004-12-07 Jamil Mogul Steerable diagnostic catheters
US6254631B1 (en) 1999-09-23 2001-07-03 Intratherapeutics, Inc. Stent with enhanced friction
DE19951477A1 (de) 1999-10-26 2001-05-03 Biotronik Mess & Therapieg Stent
US6827703B1 (en) 1999-11-24 2004-12-07 Coopersurgical, Inc. Single lumen balloon catheter apparatus
JP4263826B2 (ja) 1999-11-26 2009-05-13 テルモ株式会社 カテーテルの製造方法およびカテーテル
US6254593B1 (en) 1999-12-10 2001-07-03 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Bifurcated stent delivery system having retractable sheath
US6537311B1 (en) 1999-12-30 2003-03-25 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Stent designs for use in peripheral vessels
ATE255860T1 (de) 2000-03-03 2003-12-15 Cook Inc Endovaskuläre vorrichtung mit stent
US6818247B1 (en) 2000-03-31 2004-11-16 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Ethylene vinyl alcohol-dimethyl acetamide composition and a method of coating a stent
CA2414075A1 (en) 2000-06-05 2001-12-13 Theragenics Corporation A device for delivering a therapeutic dosage
US6805704B1 (en) 2000-06-26 2004-10-19 C. R. Bard, Inc. Intraluminal stents
US6802857B1 (en) 2000-10-11 2004-10-12 Uab Research Foundation MRI stent
US6565599B1 (en) 2000-12-28 2003-05-20 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Hybrid stent
US20020130430A1 (en) 2000-12-29 2002-09-19 Castor Trevor Percival Methods for making polymer microspheres/nanospheres and encapsulating therapeutic proteins and other products
US6821291B2 (en) 2001-06-01 2004-11-23 Ams Research Corporation Retrievable stent and method of use thereof
US6818013B2 (en) 2001-06-14 2004-11-16 Cordis Corporation Intravascular stent device
US6517889B1 (en) 2001-11-26 2003-02-11 Swaminathan Jayaraman Process for coating a surface of a stent
US7060498B1 (en) 2001-11-28 2006-06-13 Genta Salus Llc Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers
US7141540B2 (en) 2001-11-30 2006-11-28 Genta Salus Llc Cyclodextrin grafted biocompatible amphilphilic polymer and methods of preparation and use thereof
US6805707B1 (en) 2001-12-27 2004-10-19 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Stent with improved ring and link pattern
US20050222064A1 (en) 2002-02-20 2005-10-06 Sirna Therapeutics, Inc. Polycationic compositions for cellular delivery of polynucleotides
US6802859B1 (en) 2002-07-12 2004-10-12 Endovascular Technologies, Inc. Endovascular stent-graft with flexible bifurcation
US6819951B2 (en) 2002-09-24 2004-11-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Peripherally inserted central catheter with continuous central venous oximetry and proximal high flow port
DE60332277D1 (de) 2002-11-26 2010-06-02 Univ Massachusetts Verabreichung von sirnas
AU2004305111B2 (en) 2003-12-19 2011-04-28 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell transfecting formulations of small interfering RNA, related compositions and methods of making and use
WO2006019430A2 (en) 2004-04-20 2006-02-23 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Methods and compositions for enhancing delivery of double-stranded rna or a double-stranded hybrid nucleic acid to regulate gene expression in mammalian cells
US7514530B2 (en) 2004-04-26 2009-04-07 Centre National De La Recherche Scientifique Peptide carrier for delivering siRNA into mammalian cells
ATE544866T1 (de) * 2005-06-17 2012-02-15 Baxter Int Adamts13-haltige zusammensetzungen mit thrombolytischer wirkung
WO2008005290A2 (en) * 2006-06-29 2008-01-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for testing anti-thrombotic agents

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