KR20110084118A - 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법 - Google Patents

개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a1) 피험자로부터 분리된 면역세포를 후보식품의 존재하에 배양하는 단계; 및 (b1) 상기 단계 (a1)에서의 배양결과 상기 후보식품이 면역세포를 활성화하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 개인별 맞춤형 면역증진 식품의 선별을 위한 면역분석방법을 제공한다.

Description

개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법{IMMUNOASSAY METHOD FOR SCREENING FOODS FOR ENHANCING CUSTOMIZED IMMUNE ACTIVITY}
본 발명은 면역증진 효과가 우수한 식품의 선별방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 면역증진 효과를 개인별로 극대화할 수 있는 맞춤형 식이요법을 제공하는 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법에 관한 것이다.
최근 의학의 비약적인 발전에도 불구하고 암환자, 에이즈환자, 기타 면역과 관련한 각종 질환으로 고생하는 환자의 수가 점점 늘고 있다.　 이들 질병에 대하여 아직 비약적인 치료제가 개발되고 있지 않은 상황에서 현대 의학을 대신한 각종 대체요법들이 등장하고 있다.　 이러한 대체요법 중 대표적인 식이요법은 주로 민간부문에서 주도되어지고 있지만, 정확한 의학적인 검증이 이루어지지 않은 상황에서 실제 환자 개인에게도 효과가 있는지 검증되지 않은 식품을 무분별하게 섭취하고 있는 실정이다.　 사람마다 개인적인 기질이나 환경적인 차이에 의해 어느 식품의 경우 특정 환자에게 면역력을 증진시켜주는 효과를 가져올 수 있지만, 이와는 달리 어느 환자에게는 전혀 도움이 되지 않을 수도 있음은 경험상 많이 찾아볼 수 있다.　 무분별한 건강보조식품의 남용은 오히려 환자 개인의 건강을 악화시킬 우려가 있어 이는 개인적인 문제뿐만 아니라 사회적으로도 큰 문제를 야기할 수 있다.
이와 같은 상황에서 무분별한 건강보조식품의 남용을 막기 위해 자신에게 가장 적합한 식품을 선정하고 이에 따라 선정된 식품을 섭취하는 식이요법의 개발은 면역질환을 앓고 있는 환자뿐만 아니라 모든 국민의 건강 및 복지증진을 위하여도 매우 중요한 일이다.　　　
본 발명은 상기한 바와 같은 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 다양한 건강기능식품의 개개인에 대한 효과를 체계적으로 검사/확인함으로써, 이를 통해 개개인이 실제로 자신에게 도움이 되는 식품을 선택할 수 있는 정보를 제공하는, 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라 본 발명은 (a1) 피험자로부터 분리된 면역세포를 후보식품의 존재하에 배양하는 단계; 및 (b1) 상기 단계 (a1)에서의 배양결과 상기 후보식품이 면역세포를 활성화하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 개인별 맞춤형 면역증진 식품의 선별을 위한 면역분석방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a2) 후보식품이 투입된 피험자로부터 분리된 혈액을 준비하는 단계; 및 (b2) 상기 피험자로부터 분리된 혈액을 대상으로 상기 후보식품이 혈액내 면역세포를 활성화하는지를 결정하는 단계를 포함하는, 개인별 맞춤형 면역증진 식품의 선별을 위한 면역분석방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 면역증진 효과를 개인별로 극대화할 수 있는 맞춤형 식이요법을 제공할 수 있고, 개인 맞춤형 운동요법, 식사요법, 명상요법, 심리치료요법 등과 병행할 경우 개인별 면역증진효과에 시너지(synergy)를 제공할 수 있으며, 나아가 다양한 개인에 대해 선별된 식품군을 유전자형 등에 따라 데이터베이스화함으로써 각 개인의 유전자형 등을 검사하여 맞춤형 면역증진식품에 대한 정보를 손쉽게 제공함으로써, 보다 효율적인 건강기능식품의 이용이 이루어지도록 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석 시스템에 대한 개략적인 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법에 대한 개략적인 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 맞춤형 면역활성 프로그램의 제공방법에 대한 개략적인 흐름도이다.
도 4는 본 발명에 따라 1차 선정된 후보식품군에 대한 대장암 세포주인 HT-29의 증식억제에 대한 결과이다.
도 5a 내지 5d는 본 발명에 따라 1차 선정된 후보식품군에 대한 HT-29(대장암 세포주), MCF-7(유방암 세포주), HOS(골육종 세포주), 및 HEL299(정상폐세포주)의 증식억제율에 대한 결과이다.
도 6a 내지 6h는 본 발명에 따라 1차 선정된 후보식품군에 대한 면역세포주의 증식에 미치는 영향을 평가한 시험결과이다.
도 7a내지 도 7d는 각각 피험자 1, 2, 3 및 4의 말초혈액에서 분리된 림프구에 최종 선정된 후보식품군을 처리한 후 배양하여 얻은 면역세포 CD4+, CD8+, CD56+에 대한 유세포분석(flow cytometry) 결과이다.
이하, 본 발명의 내용을 첨부된 도면을 참조하여 보다 상세하게 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석 시스템에 대한 개략적인 모식도이고, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법에 대한 개략적인 흐름도이다.
도 1 및 2를 참조하면, 먼저 피험자로부터 채취된 혈액으로부터 면역세포를 분리하여 면역세포의 활성을 평가한다 (S10).
단계 S10은 후보식품의 처리 후에 측정된 면역세포의 농도와 비교를 위한 것으로, 상기 피험자의 혈액으로부터 면역세포를 분리하여 면역세포의 활성을 측정하며, 나아가 측정된 면역세포의 활성을 면역세포의 기준수치범위와 비교하는 단계를 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 단계에서는 피험자로부터 채취된 혈액으로부터 CD4 보조(Helper) T 세포, CD8 세포독성(cytotoxic) T 세포, CD56 NK 세포, 마크로파아지(Macrophage) 등의 면역세포를 분리하고, 분리된 각 면역세포의 활성을 기준수치범위 등에 기초하여 검사하여, 피험자의 종합적인 면역상태와 문제가 있는 면역세포가 무엇인지를 확인하는 지표를 구성한다.
림프구 표면의 CD 마커는 면역기능을 추측할 수 있을 뿐 아니라, 면역담당세포들의 수적인 증감, 기능적인 상태를 조사할 수 있는 면역분석법으로 실제로 AIDS 등의 면역질환을 검사하는 데에 널리 사용되고 있는 기법이다.
예를 들어, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, CD4, CD8, CD19, CD56, CD8+ Perforin, CD56+ Perforin의 비율 등을 확인하는 데, 이 숫자는 그 기준범위는 넓지만, 개인에 있어서는 변동폭이 좁기 때문에 식품 첨가 후 배양에 따라 변화하는 결과값을 살핌으로써 면역력의 변화를 이해하기에 좋은 지표가 될 수 있다. 이들 면역세포들은 각각 별도로 작용하는 것이 아니라 상호 관련되어 작용함으로써, 일 면역세포의 수치값이 상승할 경우 나머지 면역세포의 수치값도 상승하는 형태로 나타난다. 따라서, 제시된 모든 면역세포들의 수치범위를 확인할 수도 있지만, 이들 중 하나 이상의 수치범위를 확인할 수도 있다. 예를 들어, 적어도 CD4+, CD8+, CD56+ 수치범위를 확인할 수 있다.
표지자 기준치
CD3+ 59~85%
CD19(B세포) 6.4~23%
CD4+ 남성: 29~57%
여성: 31~61%
CD8+ 11~38%
CD56+ 5.6~31%
CD8+Perforin+ 12.23~17.11%
CD56+Perforin+ 16.39~22.74%
Th1/Th2(IFN-γ/IL-10) 0.34~0.79 pg/ml
TNF-α 28.74~31.29 pg/ml
IFN-γ 10.39~25.12 pg/ml
IL-12 21.45~70.4 pg/ml
IL-10 28.9~31.91 pg/ml
혈액 채취는 주사기 등과 같은 임의의 혈액채취수단(100)에 의해 수행될 수 있으며, 혈액으로부터 면역세포의 분리는 피콜밀도구배원심분리기(ficoll density gradient centrifugator)와 같은 면역세포분리수단(200)을 이용하여 채취한 혈액으로부터 림프구(lymphocytes)를 순수 분리하는 방식으로 수행될 수 있다.
피험자로는 면역력이 저하된 개인, 예를 들어 연령대가 높은 노인, 암초기 판정자, 암 수술 후 또는 수술로 인하여 면역력이 저하된 자, 항암치료후 면역력이 저하된 자 등일 수 있으며, 통상적으로는 면역과 관련된 각종 질환, 예를 들어, 류마티스성 관절염, 타입 I 당뇨병, 다발성 경화증 및 전신성 홍반 루푸스와 같은 자가면역질환, 천식, 뇌염, 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 알러지, 폐혈병성 쇼크증, 폐섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해, 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증과 같은 염증성 질환, 각종 암, 및 감기와 같은 바이러스 질환을 앓고 있는 개인일 수 있다.
본 발명에서는 상기 언급한 면역세포 이외에도 이들의 활성에 관여하는 각종 면역인자를 측정지표로서 사용할 수 있다.　 이들 면역인자의 예로는 암괴사인자(예: TNF-α), 인터루킨(예: IL-12, IL-10), 인터페론(예: IFN-γ)과 같은 다양한 인자를 들 수 있다. 또한, 암면역 요법에 있어서 CD4의 Th1이 증가할수록 암세포의 증식을 억제하므로 Th1/Th2의 비율 또한 면역활성도 표지자로 활용될 수 있다. 이러한 면역인자의 비율은 ELISA를 이용하여 측정할 수 있으며 이들 인자들에 대한 기준수치범위를 상기 표 1에 제시하고 있다. CD8+ Perforin, CD56+ Perforin, Th1/Th2, TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-10의 경우 측정된 방법에 따라 수치가 달라질 수 있으므로, 표 1에서는 정상인의 혈액을 대상으로 ELISA와 유세포분석기(FACS)를 병행하여 측정한 수치값을 제공한다.
본 발명에서 "면역력이 저하된 개인"이란, 면역세포/면역인자의 활성범위가 예를 들어 상기 표 1에 제시된 기준치 범위보다 낮거나 기준치 범위에 속하기는 하지만 기준치 범위의 하한값에 근접하여 특정 환경에 노출시 면역력이 저하될 가능성이 있는 개인 모두를 포함하는 것으로 해석한다. 나아가, 일부 면역지표의 수치값은 정상일 수 있지만, 나머지 면역지표가 기준치 범위보다 낮거나 기준치 범위의 하한값에 근접한 개인도 포함되는 것으로 해석한다. 넓게는 앞서 언급한 바와 같은 질환을 앓고있는 개인(특히 암환자), 연령대가 높은 노인을 포함하는 개념으로 해석한다.
다음으로, 상기 면역세포를 후보식품의 존재하에 배양한다(S20).
이를 위해 면역활성을 증진시키는 것으로 예상 또는 이미 알려진 식품군을 선정하는 과정이 필요하다. 이 과정은 단계 S20에서 수행할 수도 있지만, 단계 S10 이전에 미리 수행할 수도 있다. 구체적으로, 후보식품군의 선정을 위해, 먼저 국내외 논문 또는 임상에서 효과가 입증된 건강기능식품들을 데이터베이스에서 검색을 통해 기능별, 효과별로 정리한 후, 각 질병(예를 들어, 암종)에서 효과가 큰 순서로 그룹화한다.　 이들 그룹화된 건강보조식품 중에서 각 질병(예: 암)에서 면역증진효과가 있는 것으로 확인된 식품들을 1차 후보식품군으로 정할 수 있다.　 이후, 예를 들어, 각종 암종에 대하여 암세포 증식억제 및 암세포 증식억제와 관련한 면역세포주의 면역활성을 시험관 시험(in vitro test)을 통해 효과를 입증하고 유의성이 인정된 식품을 최종 후보식품군으로 선정하게 된다.
예를 들어, T 세포주 또는 NK 세포주를 96 웰 플레이트의 각 웰당 5x103 세포 농도로 접종하여 하루동안 안정화시킨 후 각각의 식품을 농도(0 내지 2000 ug/ml)별로 처리하여 2일간 배양한 후 MTT endpoint assay를 통해 증식율을 확인한다. 식품별로 독성이 없으면서 면역증진효과가 있는 식품들을 최종 후보식품군으로 선정할 수 있다.
단계 S20은 이렇게 선정된 후보식품군에 속하는 후보식품들 각각을 앞서 분리한 면역세포와 함께 배양하는 과정으로서, 구체적으로 후보식품 각각에 대하여 식품 그 자체, 기능성분(유효성분), 분쇄물, 착즙액, 추출물 내지 2차 대사산물의 형태로 재료를 준비한 후, 이를 분리한 면역세포에 처리하고 배양하는 과정이 수행되어진다.
배양과정은 면역세포의 배양을 위해 일반적으로 알려진 기본배지 (예: 10% FBS, 1x antibiotics 함유 RPMI1640)와 같은 배양수단(300)에 식품을 추가로 포함시켜 수행될 수 있다.
다음으로, 배양결과 상기 후보식품이 면역세포를 활성화하는지를 결정하여 면역증진 식품을 선정하는 과정을 수행한다(S30).
상기 단계 S30은 후보식품의 처리 전 및 후에 측정된 면역세포의 농도(비율)를 비교하여 결정될 수 있다. 즉, 상술한 바와 같이, CD4 T 세포, CD8 T 세포, CD56 NK 세포와 같은 면역세포의 증식정도(비율)를 유세포 측정법(flow cytometry, FACS)을 이용하여 측정하여 면역활성화를 유발시키는 식품을 결정할 수 있다.
그러나, 사람의 면역에 따라 다양한 인자들이 관여하므로 개인의 면역상태 및 검사시점에 따라 식품반응도가 달리 나타날 수 있으므로 상기 단계 S10, S20 및 S30은 3회 이상의 검사를 통해 결과값의 평균이 가장 높은 식품을 선정하는 것이 바람직하다. 면역활성화를 가장 많이 유발시키는 식품을 한 종류로만 특정하기 힘든 경우 두 종류 이상, 바람직하게는 2-3 종류를 선정할 수도 있다. 이러한 맞춤형 식품의 선정과정은 면역증진식품 선별수단(500)에 의해 수행될 수 있다. 이러한 면역증진식품 선별수단(500)은 컴퓨터 소프트웨어 등일 수 있다.
본 단계에서도 상기 면역세포와 함께 면역인자의 활성검사를 추가로 수행할 수 있다. 면역인자는 TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-10, 및 Th1/Th2로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
면역세포 및 면역인자의 활성화 정도는 면역활성검사수단(400)에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어 후보식품의 처리 전후의 면역세포의 농도변화를 유세포분석기(FACS)를 이용하여 측정할 수 있고, 사이토카인 수준의 표지자들의 농도는 ELISA 장치를 이용하여 측정할 수 있다.
본 발명에서는 상기 면역세포의 배양을 통해 면역세포 및 나아가 면역인자의 비율(농도)를 측정하는 상기 목적하는 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별과정뿐만 아니라, 판단의 신뢰도를 보다 높이기 위해 선정된 면역증진식품을 피험자에게 섭취하도록 함으로써 일정시간의 경과 후 상기 피험자로부터 채취한 혈액내 존재하는 면역세포의 비율 또는 면역세포와 면역인자의 비율을 측정하는 것에 의해 임상적으로 면역증진 효과를 확인하는 과정을 더 포함할 수 있다.　 이를 위해 대조군으로 식품의 섭취전 혈액을 샘플로 채취해 두는 과정이 필요할 수 있다.
예를 들어, i) 면역증진식품을 섭취한 피험자로부터 말초혈액을 3, 6, 9 개월별로 채취하여 면역활성도를 검사하고, 식이요법 전의 검사결과와 비교하며 아울러, ii) 섭취전후의 삶의 질에 대한 설문조사를 병행하고, 이에 더하여 iii) 고통의 경감, 암조직의 크기변화 및 전이여부, 재발, 생존률(기간), 부작용 등을 비교평가하는 것에 의해 임상적인 평가를 수행할 수 있다.
면역활성도 검사를 위해 면역세포 및 면역인자의 혈액내 농도를 측정하게 되는데, 면역증진식품의 투여 전후의 농도변화는 피험자로부터 분리된 혈액으로부터 피콜밀도구배 등의 방법을 이용하여 림프구를 순수분리한 후, 면역세포의 비율은 유세포분석기(FACS)를 이용하여 측정하고, 사이토카인 수준의 표지자들의 비율은 ELISA 법을 이용하여 측정할 수 있다. 면역증진식품 투여전의 면역활성도는 상기 단계 S10에서 얻어진 결과를 그대로 활용할 수도 있다.
이처럼, 1종 이상의 후보식품에 대한 기능성분(유효성분), 분쇄물, 착즙액, 추출물 내지 2차 대사산물 등의 형태로 준비된 각 식품을 면역세포에 일정량 처리하여 일정기간 배양한 후, 배양기내 CD4 T, CD8 T, CD 56 NK 등의 농도변화를 관찰하는 것에 의해 상기 각 식품에 대한 당해 피험자의 면역증진효과를 평가하여 식이요법을 위한 면역증진식품을 선정할 수 있다.　 마지막으로 보다 확실한 판단을 위하여 임상적 효과를 실험하기 위해 선정된 면역증진식품을 피험자에게 섭취시킨 후 일정기간 경과 후 예를 들어 3, 6, 9개월 후의 혈액을 채취하고, 혈액내 CD4 T, CD8 T, CD56 NK, CD8+Perforin+, CD56+Perforin+, TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-10, Th1/Th2의 농도를 측정하는 것에 의해 당해 피험자에 대하여 상기 면역증진식품에 대한 면역증진효과를 보다 정확하게 판단할 수 있다.
본 발명의 면역분석법은 (a1) 피험자로부터 분리된 면역세포를 후보식품의 존재하에 배양하는 단계 및 (b1) 상기 단계 (a1)에서의 배양결과 상기 후보식품이 면역세포를 활성화하는지를 결정하는 단계를 포함하는 제1 선별과정과; (a2) 후보식품이 투입된 피험자로부터 분리된 혈액을 준비하는 단계 및 (b2) 상기 피험자로부터 분리된 혈액을 대상으로 상기 후보식품이 혈액내 면역세포를 활성화하는지를 결정하는 단계를 포함하는 제2 선별과정을 포함할 수 있는 데, 이들 선별과정은 택일적으로 수행될 수도 있지만, 판단의 신뢰도를 보다 높이기 위해 함께 수행될 수도 있다. 도 2는 제1 선별과정과 제2 선별과정을 함께 수행한 경우를 예시하고 있다.
상기 과정을 통해 최종적으로 확인된 식품은 당해 피험자에게서 최적의 면역증진효과가 있는 것으로 인정된 식품으로서, 재료에 따른 통상적인 식이법에 따라 섭취하면 되며, 통상적인 식이법 이외의 다른 투여방법을 배제하는 것은 아니다. 이는 경구투여를 원칙으로 하지만, 비경구적 투여를 배제하지는 않음을 나타낸다.　 따라서, 필요에 따라서 정제, 캅셀제, 마이크로 캅셀제 등으로 하여 경구적으로, 혹은 주사제의 형태로 비경구적으로도 투여될 수 있다.　 정제, 캅셀제 등에 혼화할 수 있는 첨가제로는, 예를 들면, 젤라틴, 옥수수 전분, 트라간트, 검아라빅과 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수 전분, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제, 스테아린산마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 유당 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트, 아카모노유 또는 체리와 같은 향미제 등이 이용될 수 있다.　 조제 단위 형태가 캅셀인 경우에는 상기 타입의 재료에 한층 더 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다.　 주사용 수성액으로는, 예를 들면, 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함한 등장용액(예를 들면, D－솔비톨, D－만니톨, 염화 나트륨 등) 등이 이용되어 적당한 용해 보조제, 예를 들면, 알코올(예, 에탄올), 폴리 알코올(예, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜), 비이온성 계면활성제(예, 폴리솔베이트 80 TM, HCO－50)등과 병용해도 무방하다. 유성액으로서는, 예를 들면, 참기름, 콩기름 등이 이용되어 용해 보조제인 안식향산벤질, 벤질 알코올 등과 병용해도 무방하다.
시너지(synergy) 효과를 제공하기 위해 면역증진식품을 피험자에게 투여하면서 운동요법, 식사요법, 명상요법 및 심리치료요법 중 하나 이상을 병행할 수도 있다.
예를 들어, 개인 맞춤형 운동요법은 암의 형태, 진단시기, 특정위치, 수술여부, 현재증상(피로, 통증 등), 수술 후 치료(화학치료, 방사선치료)에 따른 컨디션 파악, 항암치료기간, 합병증 여부에 따른 고려사항 파악 및 개별방문을 통해 심리적 안도감 및 암 환자와의 라포르 형성을 하는 단계, 건강에 대한 의식과 환경을 포함한 신체적 특성을 알기 위한 흡연, 음주, 수면습관, 운동습관, 식사습관, 생활습관 조사 및 운동전 환자의 동의와 환자본인의 암과 관련된 복합적인 컨디션에 대해 파악을 하는 단계, 운동처방을 위한 운동정밀 검사를 간략히 설명하고 이를 통해 체력수준을 평가함으로써 안전하고 효과적인 암 재활 운동을 계획 및 운동정밀검사의 결과평가를 토대로 암 환자의 체력수준을 고려하여 시행할 수 있는 적절한 운동방법을 제시하여 운동을 실시하며, 궁극적으로는 체력의 다양한 요소를 균형적으로 발달시켜 신체활동을 통한 자신감과 긍정적 자아를 함양하여 삶의 질을 회복하고 궁극적으로는 암을 극복하는데 도움을 주는 단계로 구성될 수 있다. 개인맞춤형 식사요법은 녹황색 채소나 과일 중에는 암의 여러 진행 단계에서 그 과정을 지연시키거나 이미 발생된 암의 진행을 저지하는 항산화물질(생리활성물질인 피토케미칼/phytochemicals + 항산화영양소/비타민 CㆍEㆍβ-카로틴 및 셀레늄)이 풍부하다고 인정된 천연식품들을 이용하여 개개인의 건강상태에 맞는 식사를 제공함으로써, 암 치료의 조기회복과 암의 재발 예방으로 암 치료의 목표를 달성하기 위한 식단을 작성해 줄 수 있다.
본 발명은 또한 상기의 방법에 의해 선별된 개인별 맞춤형 면역증진 식품군을 제공한다.
상술된 과정에 의해 선별된 식품들에 대한 자료가 축적되면 이들 식품군을 개인별 맞춤형 면역활성 프로그램의 제공을 위해 데이터베이스에 입력하여 특정 유전자형 등에 따라 상기 식품군을 분류할 수 있다. 이때 유전자형은 암유전자형일 수 있다.
이러한 방식으로 분류된 식품군에 대한 데이터베이스에 기초하여, 새로운 환자들이 내원했을 때 이들 개개인에 대해 적합화된 면역증진 식품을 제공할 수 있다.
예를 들어, 도 3을 참조하면, 상술된 과정에 따라 선별된 식품군을 데이터베이스에 입력하는 단계(S60); 특정 유전자형에 따라 상기 식품군을 분류하는 단계(S70); 피험자의 조직 또는 혈액으로부터 유전자형을 확인하는 단계(S80); 확인된 유전자형에 따라 데이터베이스에 저장된 식품들 중에서 상기 피험자의 면역력 향상에 최적의 효과를 나타내는 식품을 선택하는 단계(S90); 선택된 식품을 피험자에게 선발하고 통보하는 단계(S100); 나아가, 선택된 식품을 섭취한 상기 피험자로부터 혈액을 채취하여 면역세포의 활성 정도를 평가하는 단계(S110)로 진행되도록, 맞춤형 면역활성 프로그램의 제공방법에 활용할 수 있다.
이하의 실시예에서는 주로 암환자를 대상으로 한 실험에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고 있지만, 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시되어지는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하고자 하는 취지가 아님을 유의해야 한다.
< 실시예 1> 후보식품군의 선정
(1) 1차 후보식품군의 선정
본 실험을 위해, 임상에서 효과가 입증된 건강기능식품을 국내외 논문, 웹사이트 등(Pubmed http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/, Koreamed http://www.koreamed.org/, 한국식품영양과학회지 등)에서 검색을 통해 기능별 효과별로 정리한 다음 각 질병(암종)에서 효과가 큰 순서로 그룹화하였다.
이렇게 그룹화된 식품 중에서 항암활성이 우수한 것으로 보고된 식품을 1차적으로 선정하여 이를 하기 표 2에 요약하였다.　
번호 식품
1 발효홍삼
2 　강황
3 　차가버섯
4 　후코이단
5 　꽃송이버섯
6 　상어연골
7 　영지버섯(만난타케)
8 　AHCC
9 　니게로올리고당
10 　아가리쿠스
　11 효모
(2) 최종 후보식품군의 선정
(가) in vitro 항암활성 측정
상기 표 2의 각 식품의 암세포 증식억제효과를 확인하기 위하여 한국세포주은행에서 입수한 암세포주인 HT-29(대장암 세포주), MCF-7(유방암 세포주) 및 HOS(골육종 세포주)를, 3% FBS가 함유된 RPMI-1640, RPMI-1640 및 EMEM 배지 각각을 포함한 96-웰 플레이트의 각 웰당 5 x 103 세포농도로 접종하여 하루 동안 배양기(5% CO2, 37℃)에서 안정화시킨 후 각각의 식품을 농도(0 ug/ml ~ 2000 ug/ml) 별로 배양배지에 첨가하여 3일간 배양한 후 MTS endpoint assay(CellTiter 96R AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Technical Bulletin #TB245, Promega Corporation)를 통하여 암세포 증식억제 효과를 확인하였다.　 이때 동일량의 PBS 처리군을 대조군으로 사용하였다.　
실험결과 도 4 및 도 5a-5d에 제시된 바와 같이 항암효과가 있는 대표식품으로는 발효홍삼, 강황, 차가버섯, 후코이단, 만난타케, AHCC(표고버섯균사체를 배양한 액에 α-아밀라아제, 펙티나아제, 프로테아제를 처리한 후 원심분리하고 상층액을 농축하여 살균, 동결건조한 식품), 꽃송이버섯 등으로 나타났다.　 상기의 식품들에 대해, 암세포에서 정해진 IC50값을 기초로 하여 정상 폐세포주인 HEL299(한국세포주은행)에서 세포독성시험을 시행하였으며 모두 독성이 없는 것으로 확인되었다.
(나) in vitro 면역활성 측정
상기 실시예 1의 표 2에 수록된 각 식품을 대상으로 면역증진효과를 확인하였다. 이를 위해 T 세포주(Jurkat E6-1, 한국세포주은행)를, RPMI-1640 (3% FBS)을 포함한 96-웰 플레이트의 각 웰당 2 x 104 세포농도로 접종하여 배양기(5% CO2, 37℃)에서 하루 동안 안정화시킨 후 각각의 식품을 농도(0 ug/ml ~ 2000 ug/ml)별로 처리하여 2일간 배양한 후 MTS endpoint assay(CellTiter 96R AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Technical Bulletin #TB245, Promega Corporation)를 통하여 증식률을 확인하였다.　 이때 동일량의 PBS 처리군을 대조군으로 사용하였다.　 그 결과를 도 6a 내지 도 6h에 나타내었다.
도 6a 내지 도 6h를 살펴보면, 면역증진효과가 있는 대표식품으로는 영지버섯(만난타케), 발효홍삼, 꽃송이버섯, 차가버섯, AHCC, 아가리쿠스 등으로 나타났다. 이때 각각의 식품별로 세포독성이 나타나지 않으면서 면역활성효과가 우수한 농도를 하기 표 3에 나타내었다.
식품 기준치
발효홍삼 150 ㎍/ml
　차가버섯 100 ㎍/ml
　꽃송이버섯 500 ㎍/ml
　영지버섯(만난타케) 150 ㎍/ml
　AHCC 500 ㎍/ml
　니게로올리고당 500 ㎍/ml
　아가리쿠스 500 ㎍/ml
효모 500 ㎍/ml
(다) 최종 후보식품군의 선정
상기 결과에서, 영지버섯(만난타케), AHCC, 차가버섯, 발효홍삼 및 꽃송이 버섯이 항암활성뿐만 아니라 면역활성이 보다 우수한 것으로 나타남에 따라 이들 식품군을 하기 실험을 위해 최종 선정하고 이들 각각에 대해 상기 표 3에 개시된 농도를 면역식품선별검사 농도로 사용하였다.
< 실시예 2> 개인맞춤형 면역증진식품의 선정
(1) 개인별 시험관 시험( in vitro 시험) I
양평송도병원에 입원치료를 받고 있는 4인의 암환자, 35세 남성 간암 환자, 50세 여성 직장암 환자, 47세 여성 유방암 환자 및 47세 여성 유방암 환자 각각을 피험자 1, 2, 3 및 4로 지정하고, 이들의 초기 면역활성도를 평가하기 위하여 각 피험자는 전날 저녁 6시 이후에는 식품섭취를 금지시켰으며 오전 9시에 말초혈액으로부터 피콜밀도구배원심분리(ficoll density gradient centrifugation) 방법을 이용하여 림프구를 순수 분리한 후 유세포분석기(FACS)를 이용하여 각각의 림프구 서브셋(CD4 T 세포, CD8 T 세포, CD56 NK세포) 농도를 측정하고, CD8 T 세포와 NK세포의 활성화는 FACS를 이용하여 퍼포린(perforin) 생산능을 측정함으로써 확인하였다(Bernard A, 등, Leucocyte Typing. New York, NY: Springer-Verlag: 9-108(1984), Evans RL, 등, Proc Natl Acad Sci USA.78:544-548(1981), 및 Ledbetter JA, et al., J Exp Med. 153:310-323 (1981) (CD4+); Eichmann K. 등, Eur J Immunol. 17:643-650(1987), Anderson P, 등, J Immunol. 139:678-682(1987), 및 Gallagher PF, 등, Proc Natl Acad Sci USA. 86:10044-10048 (1989) (CD8+); Lanier LL, 등, J Immunol. 146:4421-4426(1991), Schubert J., 등, Leucocyte Typing IV : White Cell Differentiation Antigens. New York, NY: Oxford University Press, 699-702(1989) 및 Cunningham BA, 등, Science. 236:799-806(1987) (CD56+); Hameed A., 등, Int J Gynecol Pathol . 14(2):143-150(1995), Hameed A., 등, Am J Pathol. (Immunogen: Immunohistochemistry, Immunoprecipitation), 140(5):1025-1030(1992), 및 Rukavina D., 등, Transplantation . (Clone-specific: Flow cytometry), 61(2):285-291(1996) (Perforin) 참조).　또한 분리된 혈청을 이용하여 각각의 면역세포의 활성도를 TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-10 등과 같은 사이토카인 수준 표지자로 사용하여 ELISA로 측정하였다 (Salih H.R., 등, J. Immunol., 165(5):2903-2910(2000), Sester U., 등, Nephrology Dialysis Transplantation., 15:1217-1223(2000), 및 Wolfers J. 등, Medicine, 9(3):297-303(2001) (IFN-γ); Danis VA, 등, Clin Exp Immunol ., 85(1):143-150 (1991), J Histochem Cytochem . 1981; 29(4):577-580.(Methodology: Immunocytochemistry (cytospins)), Am J Clin Pathol . 1981; 75(5):734-738.(Methodology: Immunocytochemistry (cytospins)), 및 Mol Immunol . 1991; 28(1-2):79-86.(Clone-specific: ELISA) (TNF-a); Kiziltepe U, 등, Annals of Thoracic Surgery. 2001; 71: 639-646, Ajdary S, 등, Infection and Immunity. 2000; 68 (4): 1760-1764, 및 Edwards-Smith C.J., 등, Hepatology. 1999; 30 (2): 526-530 (IL-10); 및 Zeh III, H.J., 등, Interleukin-12. In The Cytokine Handbook . Second Edition. A.W. Thomsom, ed. Academic Press Limited, London, 239-256(1994), Schoenhaut, 등, Cloning and expression of murine IL-12. J. Immunol. 148: 3433-3440(1992), 및 D'Andrea, A., 등, Production of natural killer cell stimulatory factor (Interleukin 12) by peripheral blood mononuclear cells. J. Exp . Med. 176: 1387-1398(1992) (IL-12) 참조).
피험자들에 대한 초기 면역활성 정도를 하기 표 4에 나타내었다.
면역지표 피험자 1 피험자 2 피험자 3 피험자 4
CD4+T(%) 31.25 43.46 30.18 35.5
CD8+T(%) 39.99 30.01 41.48 29.25
CD56+NK (%) 24.03 27.93 17.22 32.3
CD8+perforin+(%) 29.44 19.38 30.05 20.07
CD56+perforin+(%) 26.89 23.4 11.93 26.59
IFN-γ(pg/ml) 15.68 36.64 15.79 10.6
TNF-α(pg/ml) 26.12 36.7 40.21 40.2
IL-12(pg/ml) 28.31 55.68 26.07 26.45
IL-10(pg/ml) 38.1 40.18 24.47 25.49
Th1/Th2 (pg/ml) 0.41 0.91 0.64 0.41
이후, 상기 피험자 1-4의 말초혈액에서 분리된 림프구를 24-웰 플레이트에 접종하여 하루 동안 안정화시킨 후 상기 실시예에서 선정한 최종 후보 식품들, 영지버섯(만난타케), 발효홍삼, 차가버섯, AHCC 및 꽃송이버섯 각각을 150㎍/㎖, 150㎍/㎖, 100㎍/㎖, 500㎍/㎖, 500㎍/㎖ 농도로 처리하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다.　 대조군으로 동일 농도의 PBS를 사용하였다. 배양 후 유세포 분석기를 이용하여 각각의 면역세포, CD4 T 세포, CD8 T 세포, CD56 NK 세포의 농도를 측정하여 면역활성화를 가장 많이 유발시킨 식품을 식이요법에 사용하도록 하였다.　 이때 동일 피험자에서 1주일 간격으로 3회의 검사를 통하여 면역세포 증강효과에 대한 평균값이 가장 높은 식품을 선택하였으며, 그 결과는 하기 표 5, 표 6, 도 7a내지 도 7d 에 제시되어 있다.　 도 7a 내지 도 7d는 각각 피험자 1, 2, 3, 4의 면역세포 CD4 T, CD8 T, CD56 NK에 대한 평균 그래프 값이다.
식품명 CD4 T CD8 T CD56 NK
피험자 1 피험자 2 피험자 1 피험자 2 피험자 1 피험자 2
PBS 31.62 38.08 31.72 18.4 31.74 21.01
만난타케 31.1 36.91 35.21 25.63 32.29 17.39
AHCC 31.7 37.74 37.89 18.74 31.75 18.3
차가버섯 33.68 38.56 48.1 31.6 36.11 25.72
홍삼 31.28 38.05 38.21 19.42 32.05 19.03
꽃송이버섯 31.62 37.96 39.06 20.36 30.66 22.39
* 상기 표의 각 항목에 대한 수치는 3회 시행결과의 평균값을 나타낸다.
식품명 CD4 T CD8 T CD56 NK
피험자 3 피험자 4 피험자 3 피험자 4 피험자 3 피험자 4
PBS 37.4 34.42 40.05 23.18 24.35 30.5
만난타케 34.6 41.66 42.35 24.5 23.6 29.34
AHCC 36.57 34.02 40.94 26.42 23.01 27.8
차가버섯 38.7 40.8 50.13 26.86 26.17 31.02
홍삼 37.8 41.16 38.57 22.8 25.6 25.4
꽃송이버섯 50.26 41.76 23.17 25.96 30.96 28.02
* 상기 표의 각 항목에 대한 수치는 3회 시행결과의 평균값을 나타낸다.
상기 표 5, 표 6, 도 7a 내지 도 7d에 나타낸 바와 같이, 피험자 1, 2의 경우 모두 차가버섯이 가장 효과적인 면역증진식품인 것으로 확인되었고, 피험자 3은 꽃송이버섯과 차가버섯으로 확인되었으며, 피험자 4는 차가버섯과 AHCC로 확인되었다. 한편, 상기 수치값들 중 식품 투여 후 정상수치 범위보다 높은 값들은 식품을 피험자에게 직접 투여한 것이 아니고 피험자로부터 분리된 세포 등을 대상으로 실험한 것이라 이러한 과도한 수치가 나올 수 있는 것으로 추측된다.
(2) 개인별 시험관 시험 II
특정 질환이 없는 준건강인 9명 (54세 여성, 52세 여성, 55세 여성, 48세 여성, 32세 여성, 41세 여성, 51세 여성, 60세 여성, 67세 남성) 각각을 피험자 A-I로 지정한 다음, 이들의 초기 면역활성도를 평가하기 위하여 각 피험자는 전날 저녁 6시 이후에는 식품섭취를 금지시켰으며 오전 9시에 말초혈액(13 ㎖)으로부터 피콜밀도구배원심분리(ficoll density gradient centrifugation) 방법을 이용하여 림프구를 순수 분리한 후 상술한 개인별 시험관 시험 I에서와 같은 방법으로 림프구 서브셋(CD8 T 세포, CD56 NK세포) 농도를 측정하였다.
이후, 상기 피험자 A-I의 말초혈액에서 분리된 림프구를 24-웰 플레이트에 접종하여 하루 동안 안정화시킨 후 상기 실시예에서 선정한 최종 후보 식품들 중 차가버섯을 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다.　 배양 후 상술한 바와 동일한 방법으로 림프구 서브셋(CD8 T 세포, CD56 NK세포) 농도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타내고 있다.
피험자 차가버섯 처리 전 차가버섯 처리 후
CD8 T(%) CD56 NK(%) CD8 T(%) CD56 NK(%)
A 16.6 25.1 16.2 22.6
B 31.4 17.6 30.4 16.5
C 11.9 24.3 10.7 21.8
D 24.8 13.4 23.0 20.6
E 19.9 10.4 18.0 10.9
F 17.6 22.5 17.6 21.8
G 16.3 13.0 17.9 15.1
H 29.5 23.66 29.9 22.9
I 16.7 16.4 17.8 17.9
상기 표 7을 살펴보면, 일반적으로 건강기능식품으로 알려진 차가버섯에 대해 모든 피험자가 면역증진효과를 나타내는 것은 아니었으며 일부 피험자(D, G, H, I)의 경우에만 면역증진효과를 나타내고 있다. 이러한 결과로부터, 일반적으로 면역증진효과가 있는 것으로 알려져 있더라도 정작 본인에게는 다양한 기질적인 특성 내지 환경적 특성으로 인해 면역증진효과가 없을 수도 있는 특정 식품에 대한 의존성을 배제하고, 실제 자신에게 맞는 식품만을 선정하여 섭취함으로써 면역증진효과를 극대화하는 것이 중요함을 알 수 있다.
(3) 개인별 임상시험(식이요법)
상기 개인별 시험관 시험 II에서의 9명의 피험자 A-I에 대해, 다른 건강식품은 일체 먹지 않도록 하면서 하기 표 8의 방식으로 피험자들에게 차가버섯을 음용시킨 후, 1개월 째 오전 9시에 피험자 각각의 말초혈액(10 ㎖)을 채취하여 상술한 바와 동일한 방법으로 림프구 서브셋(CD8 T 세포, CD4CD25 Treg) 농도를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 9 및 10에 나타내고 있다.
체중(kg) 차가분말(g)/일(day) 음용(스푼)
40-60 3 아침(1), 점심(1), 저녁(1)
61-80 4 아침(1), 점심(1), 저녁(2)
81-100 5 아침(2), 점심(1), 저녁(2)
피험자 차가버섯 음용 전 차가버섯 음용 후
CD8 T(%) CD4CD25 Treg(%) CD8 T(%) CD4CD25 Treg(%)
A 32.04 6.89 21.44 9.93
B 31.58 15.15 30.96 15.00
C 24.91 13.44 13.73 14.16
D 25.67 16.70 26.22 16.33
E 23.10 25.34 23.74 24.28
F 16.03 13.35 22.59 17.85
G 21.32 27.99 24.06 19.87
H 26.24 14.81 27.83 11.54
I 16.98 16.41 17.18 15.49
Positive group
(D, G, H, I)		 Negative group
(A, B, C, E, F)
CD8 T(%) CD4CD25 Treg(%) CD8 T(%) CD4CD25 Treg(%)
음용전 평균 22.55 18.98 25.53 14.83
음용후 평균 23.82 15.81 22.49 16.24
변화량 + - - +
상기 표 9 및 10을 살펴보면, 피험자 D, G, H, I는 높은 CD8 수치 및 낮은 CD4CD25 Treg수치를 나타내는 데, 이는 피험자 D, G, H, I에서 상술한 시험관(in vitro) 시험에서와 마찬가지로 차가버섯의 음용에 의한 우수한 면역증진 효과 및 항암효과를 기대할 수 있음을 알 수 있다. 특히, 시험관 시험에서 positive group으로의 판정이 다소 모호했던 피험자 D, H의 경우, 식이요법 실험을 통해 positive group 임을 보다 명확히 확인할 수 있었다.
상술한 바에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법에 따라 선정된 면역증진식품을 특정 개인들에게 투여한다면 면역증진효과가 크게 개선될 것으로 기대한다.　 따라서, 본 발명의 면역분석방법은 면역증진의 효과를 개인별로 극대화할 수 있는 식이요법을 제공할 수 있다는 점에서 매우 유용함을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. (a1) 피험자로부터 분리된 면역세포를 후보식품의 존재하에 배양하는 단계; 및
    (b1) 상기 단계 (a1)에서의 배양결과 상기 후보식품이 면역세포를 활성화하는지를 결정하는 단계
    를 포함하는, 개인별 맞춤형 면역증진 식품의 선별을 위한 면역분석방법.
  2. (a2) 후보식품이 투입된 피험자로부터 분리된 혈액을 준비하는 단계; 및
    (b2) 상기 피험자로부터 분리된 혈액을 대상으로 상기 후보식품이 혈액내 면역세포를 활성화하는지를 결정하는 단계
    를 포함하는, 개인별 맞춤형 면역증진 식품의 선별을 위한 면역분석방법.
  3. (a1) 피험자로부터 분리된 면역세포를 후보식품의 존재하에 배양하는 단계 및 (b1) 상기 단계 (a1)에서의 배양결과 상기 후보식품이 면역세포를 활성화하는지를 결정하는 단계를 포함하는 제1 선별과정; 및
    상기 제1 선별과정과 함께 수행되거나 이와 택일적으로 수행되고, (a2) 후보식품이 투입된 피험자로부터 분리된 혈액을 준비하는 단계 및 (b2) 상기 피험자로부터 분리된 혈액을 대상으로 상기 후보식품이 혈액내 면역세포를 활성화하는지를 결정하는 단계를 포함하는 제2 선별과정
    을 포함하는, 개인별 맞춤형 면역증진 식품의 선별을 위한 면역분석방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역세포는 CD4 T 세포, CD8 T 세포, CD56 NK 세포, CD4CD25 Treg, CD8+Perforin+, 및 CD56+Perforin+로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역세포와 함께 면역인자의 활성검사를 더 수행하는 것을 특징으로 하는, 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 면역인자는 TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-10, 및 Th1/Th2로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법.
  7. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 단계 (b1)에서의 면역세포의 활성화 정도는 후보식품의 처리 전 및 후에 측정된 면역세포의 농도를 비교하여 결정하는 것을 특징으로 하는, 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법.
  8. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 단계 (b2)에서의 면역세포의 활성화 정도는 후보식품의 처리 전 및 후에 측정된 면역세포의 농도를 비교하여 결정하는 것을 특징으로 하는, 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법.
  9. 제 5 항에 있어서,
    상기 면역인자의 활성화 정도는 후보식품의 처리 전 및 후에 측정된 면역인자의 농도를 비교하여 결정하는 것을 특징으로 하는, 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법.
  10. 제 1 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 단계 (a1) 이전에 후보식품군을 선정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법.
  11. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
    상기 단계 (a2) 이전에 후보식품군을 선정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 개인별 맞춤형 면역증진식품의 선별을 위한 면역분석방법.
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