KR20110078606A - Anti-thrombus composition containing ginseng berry extracts - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 인삼 열매 추출물을 함유하는 혈소판 응집 억제용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집반응에서 인삼 열매 추출물이 혈소판 응집반응에 중요한 역할을 하는 [Ca2 +]i의 수준을 감소시키고, 이로 인해 인삼 열매 추출물이 cAMP를 증가시켜 세포내 Ca2 +의 생성을 억제시킴으로써 혈소판 응집을 억제하는 혈소판 응집 억제용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for inhibiting platelet aggregation containing ginseng fruit extract, and more particularly, by containing ginseng fruit extract as an active ingredient, ginseng fruit extract plays an important role in platelet aggregation reaction in collagen-induced platelet aggregation reaction. It relates to a composition for inhibiting platelet aggregation by reducing the level of [Ca 2 + ] i , thereby inhibiting platelet aggregation by increasing the cAMP to inhibit the production of intracellular Ca 2 + .
오늘날 혈관순환기계 질환이 주요 사망원인으로 증가하고 있다. 혈소판 응집반응은 보통 지혈에 있어서 필수적인 반응이다. 하지만 비정상적으로 과잉 작용되면 혈전증 또는 동맥경화증과 같은 순환계 질환을 일으킨다. 따라서, 혈소판 응집반응의 억제를 통해 이러한 질환을 줄일 수 있을 것으로 생각된다.Vascular circulatory system diseases are now increasing as the leading cause of death. Platelet aggregation is usually an essential response for hemostasis. Abnormally hyperactivity, however, causes circulatory disorders such as thrombosis or arteriosclerosis. Therefore, it is thought that such disease can be reduced by suppressing the platelet aggregation reaction.
콜라겐에 의한 혈소판 응집반응의 기전은 다음과 같다. 콜라겐이 혈소판 막의 RTK(Receptor tyrosine kinase)라는 수용체에 결합하면 수용체의 타이로신(tyrosine)이 인산화되고 이로 인해 포스포리파아제 C(PLC: phospholipase C)가 활성화 된다. PLC는 막단백질인 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트(PIP2: Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate)를 디아실글리세롤(DG: diacylglycerol)과 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트(IP3: inositol-1,4,5-trisphosphate)로 가수분해시킨다. IP3는 소포체(ER: endoplasmic reticulum)로부터 Ca2 +을 세포질내로 동원시킨다. The mechanism of platelet aggregation by collagen is as follows. When collagen binds to a receptor called receptor tyrosine kinase (RTK) on the platelet membrane, tyrosine of the receptor is phosphorylated, thereby activating phospholipase C (PLC). PLC is a membrane protein phosphatidyl inositol-4,5-bisphosphate (PIP 2 : Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate) to diacylglycerol (DG: diacylglycerol) and inositol-1,4,5-triphosphate (IP 3 : inositol-1,4,5-trisphosphate). IP 3 is ER: thereby mobilize the Ca 2 + into the cytoplasm from (ER endoplasmic reticulum).
한편, DG는 DG-의존 단백질 키나아제 C(C-kinase)를 활성화시켜 세포내의 단백질(40- 또는 47-kDa)을 인산화시킨다(Berridge MJ and Irvine RF, Inositol phosphates and cell signaling, Nature, 1989, 341 : 197-205). DG는 또한 분해되어 아라키돈산(20:4)을 생성하는데 이것은 TXA2의 전구체로 작용한다. TXA2는 오타코이드(autacoid)적인 자극제로서 혈소판을 더욱 응집시킨다. 더군다나 세포내에 증가된 칼슘은 미오신 경쇄 키나아제(MLCK: myosin light chain kinase)를 활성화시키는데 이것은 Ca2 +/칼모둘린(calmodulin)-의존 단백질 키나아제로서 20 kDa 미오신 경쇄를 인산화시킨다. 그리고 칼슘은 DG-의존 단백질의 인산화를 더욱 활성화시킨다. 이와 같은 과정을 통해 혈소판 응집이 일어나게 된다. DG, on the other hand, activates DG-dependent protein kinase C (C-kinase) to phosphorylate intracellular proteins (40- or 47-kDa) (Berridge MJ and Irvine RF, Inositol phosphates and cell signaling, Nature , 1989, 341 : 197-205). DG also decomposes to produce arachidonic acid (20: 4), which acts as a precursor of TXA 2 . TXA 2 is an otacoid stimulant that further aggregates platelets. Furthermore, the increased calcium in the cells is myosin light chain kinase: to activate the (MLCK myosin light chain kinase) which Ca 2 + / calmodulin (calmodulin) - then phosphorylates depend 20 kDa myosin light chain as a protein kinase. Calcium also activates the phosphorylation of DG-dependent proteins. Through this process, platelet aggregation occurs.
혈소판은 또 하나의 기전으로서 cAMP(Adenosine 3',5'-cyclic monophosphate) 및 cGMP(Guanosine 3',5'-cyclic monophosphate)와 같은 사이클릭 뉴클레오타이드(cyclic nucleotides)를 가지고 있다. cAMP와 cGMP는 ATP와 GTP로부터 아데닐레이트 사이클라아제와 구아닐레이트 사이클라아제(guanylate cyclase)에 의해 각각 생성된다. 이들은 22 kDa과 50 kDa 펩타이드를 인산화시켜 ER로부터의 칼슘 동원을 억제하고 세포외부로부터의 칼슘을 세포내로 유입하는 것을 억제시킨다. 또한 TXA2의 생성을 감소시켜 혈소판 응집반응을 억제시킨다고 알려져 있다.Platelets have cyclic nucleotides such as cAMP (Adenosine 3 ', 5'-cyclic monophosphate) and cGMP (Guanosine 3', 5'-cyclic monophosphate) as another mechanism. cAMP and cGMP are produced by adenylate cyclase and guanylate cyclase from ATP and GTP, respectively. They phosphorylate 22 kDa and 50 kDa peptides to inhibit calcium recruitment from ER and to inhibit the influx of calcium from the outside into the cell. It is also known to inhibit platelet aggregation by reducing the production of TXA 2 .
혈관이 손상되었을 때 혈소판 응집, 혈액응고 및 LDL 산화 등이 계속적으로 반복되면서 일어나는 현상을 혈전이라고 하며, 이러한 혈전은 주로 심혈관 질환, 고혈압, 암 등의 여러 질병을 유발하는 원인이 된다. 따라서, 이러한 혈전을 예방하는 약물의 개발이 활발히 진행되고 있다. 지금까지 개발된 항혈전제로는 데오필린(theopylline), 몰시도민(molsidomine), 베라파밀(verapamil), 니페디핀(nifedipine) 및 니트로글리세린(nitroglycerin) 등이 있다. 이들은 세포내의 칼슘 동원을 억제하는 cAMP와 cGMP의 발생을 촉진한다. 또한 비스테로이드 계열의 약물인 아스피린, 이미다졸(imidazol) 및 인도메타신(indomethacin) 등은 TXA2의 생성을 억제함으로써 항혈전 효과를 가진다. 하지만 이러한 약물들은 여러 가지 부작용을 일으키고 있으며, 따라서 천연물에서 그 해결책을 찾고자 하는 노력이 계속되고 있다.When blood vessels are damaged, platelet aggregation, blood coagulation, and LDL oxidation occur continuously, which is called a thrombus. Such a thrombus is a cause of various diseases such as cardiovascular disease, hypertension, and cancer. Therefore, the development of drugs for preventing such blood clots is actively progressing. Anti-thrombotic agents developed to date include theopylline, the molsidomine, the verapamil, the nifedipine and the nitroglycerin. They promote the development of cAMP and cGMP that inhibit intracellular calcium recruitment. In addition, nonsteroidal drugs such as aspirin, imidazol, indomethacin, and the like have an antithrombotic effect by inhibiting the production of TXA 2 . However, these drugs are causing a number of side effects, and thus efforts to find a solution in natural products continue.
이에, 본 발명자들은 콜라겐이 유인하는 혈소판 반응에서 인삼의 지상부인 인삼 열매 추출물이 cAMP의 생성을 촉진시킴으로써 혈소판 응고반응을 억제하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have found that the ginseng fruit extract, which is the ground portion of ginseng, inhibits platelet coagulation reaction by promoting the production of cAMP in platelet reaction induced by collagen.
따라서, 본 발명의 목적은 cAMP의 생성을 촉진시킴으로써 혈소판 응고반응을 억제하는 혈소판 응집 억제용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a composition for inhibiting platelet aggregation by inhibiting platelet coagulation by promoting the production of cAMP.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 억제용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a composition for inhibiting platelet aggregation containing ginseng fruit extract as an active ingredient.
본 발명에 의한 인삼 열매 추출물은 콜라겐에 의해 유도된 혈소판 응집반응에서 인삼 열매 추출물이 혈소판 응집반응에 중요한 역할을 하는 [Ca2 +]i의 수준을 감소시켰다.Ginseng fruits according to the present invention the ginseng extract fruit extract on the platelet aggregation response induced by collagen and reduced the level of [Ca 2 +] i to play an important role in platelet agglutination.
본 발명은 인삼 열매 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈소판 응집 억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 조성물은 혈소판 응집과 관련된 혈전, 뇌졸증, 뇌출혈, 고혈압, 빈혈 및 편두통 등을 예방 또는 치료하기 위한 조성물일 수 있다.The present invention relates to a composition for inhibiting platelet aggregation containing ginseng fruit extract as an active ingredient. The composition according to the present invention may be a composition for preventing or treating thrombus, stroke, cerebral hemorrhage, hypertension, anemia and migraine associated with platelet aggregation.
본 발명에서 사용하는 인삼 열매 추출물은 종자를 분리하여 제거한 인삼 열매의 과육과 과피를 일광건조 또는 열풍건조한 후 물 또는 에탄올로 추출하여 제조한 것이다. The ginseng fruit extract used in the present invention is prepared by extracting the flesh and skin of the ginseng fruit by removing the seed after drying with sunlight or hot air drying with water or ethanol.
본 발명에 의한 조성물은 활성성분인 인삼 열매 추출물 이외에 생리학적으로 허용가능한 약학적 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물일 수 있으며, 그 제형에는 특별히 한정되지 않으나, 경구투여용으로 구강용 또는 주사약제가 가능하며, 식품 첨가물로도 사용할 수 있다.The composition according to the present invention may be a pharmaceutical composition comprising a physiologically acceptable pharmaceutical carrier or diluent in addition to the ginseng fruit extract as an active ingredient, and is not particularly limited in the formulation, oral or injectable for oral administration is possible. It can also be used as a food additive.
본 발명의 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태가 되어 경구용 제형, 피하주사, 정맥주사 또는 근육주사 등의 비경구형 제형으로 제형화할 수 있다.The compositions of the present invention may be in the form of solutions, suspensions or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of dry powders which are dissolved in sterile, pyrogen-free water before use, orally formulated, subcutaneous, intravenous or It may be formulated into parenteral formulations such as intramuscular injection.
경구용 제형의 경우, 본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 부형제를 이용하여 공지의 방법으로, 예를 들면, 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산가능 가루 또는 입자, 유화액, 연질 또는 경질 캡슐, 시럽 또는 일릭서와 같은 형태로 제제화되며, 이는 단위 투여량 형태 및 다용량 용기에 담아서 완성품을 제조할 수 있다. In the case of oral formulations, the compositions of the present invention may be used in known manner using pharmaceutically acceptable carriers and excipients, for example tablets, troches, sugar-containing tablets, aqueous or oily suspensions, dispersible flours or particles. , In the form of emulsions, soft or hard capsules, syrups or elixirs, which can be prepared in unit dosage form and in multi-dose containers to produce the finished product.
경구용 제형 중, 정제는 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 및인산나 트륨 등의 불활성 희석제; 옥수수, 녹말 및 알긴산 등의 입자화제; 붕해제; 녹말, 젤라틴 및 아카시아 등의 결합제; 및 스테아르산마그네슘(magnesium stearate), 스테아르산 및 탈크 등의 윤활제와 같이, 정제의 제조에 사용 가능한 부형제와 혼합된 상태로 제조될 수 있다. 정제는 코팅되지 않은 상태로 사용하거나, 위장관내의 흡수와 정제의 분해를 저해하기 위해 코팅하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴모노스테아레이트와 글리세릴디스테아레이트 등의 시간 저해 물질을 적용할 수도 있다. 경질캅셀은 본 발명의 화합물을 탄산칼슘, 인산칼슘 및 카올린 등의 불활성 고체 희석제에 섞은 것이고, 연질캅셀은 물이나 혼합이 가능한 폴리프로필렌글리콜(polypropylene glycol), PEGs(polyethylene glycol) 및 에탄올 등의 용매와 땅콩기름, 액상 파라핀 및 올리브 오일 등의 기름 용매에 활성성분을 섞은 것이다. In oral formulations, tablets may be inert diluents such as calcium carbonate, sodium carbonate, lactose, calcium phosphate and sodium phosphate; Granulating agents such as corn, starch and alginic acid; Disintegrants; Binders such as starch, gelatin and acacia; And lubricants such as magnesium stearate, stearic acid and talc, in admixture with excipients usable for the manufacture of tablets. Tablets can be used uncoated or coated to inhibit absorption and degradation of the tablets in the gastrointestinal tract. For example, time-inhibiting substances, such as glyceryl monostearate and glyceryl distearate, can also be applied. Hard capsules are a compound of the present invention mixed with an inert solid diluent such as calcium carbonate, calcium phosphate and kaolin, and soft capsules are solvents such as polypropylene glycol, PEGs (polyethylene glycol) and ethanol that can be mixed with water. And the active ingredient in oil solvents such as peanut oil, liquid paraffin and olive oil.
수용성 현탁제는 수용성 현탁제 제조에 적당한 부형제와 활성 성분을 함께 혼합한 것으로, 부형제로는, 예를 들면, 나트륨카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시-프로필메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 트래거캔스검(gum tragacanth) 및 아카시아검(gum acacia) 등의 현탁화제; 폴리옥시에틸렌스테아레이트와 같은 지방산과 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 헵타데카에틸렌옥시세탄올(heptadecaethyleneoxycetanol)과 같이 긴 지방산에 알킬렌 옥사이드를 축합한 화합물들; 폴리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들; 습윤제; 또는 분산화제 등이 있다. 상기 수용성 현탁제는 방부제, 착색제, 향신료 및 감미료 등을 더 함유할 수 있다.The water-soluble suspending agent is a mixture of excipients and active ingredients suitable for the preparation of water-soluble suspending agents. Excipients include, for example, sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxy-propyl methyl cellulose, sodium alginate, polyvinyl-pi Suspending agents such as rollidone, gum tragacanth and gum acacia; Compounds condensing fatty acids such as polyoxyethylene stearate and alkylene oxides; Compounds in which alkylene oxides are condensed with long fatty acids such as heptadecaethyleneoxycetanol; Compounds which condensate partial esters derived from anhydrous hexitol anhydride and fatty acids, such as polyoxyethylene sorbitol monooleate, with ethylene oxide; Wetting agents; Or dispersing agents. The water-soluble suspending agent may further contain preservatives, colorants, spices and sweeteners.
유성 현탁제는 올리브유, 세사미유(sesami oil) 등의 식물성 오일 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일에 활성 성분을 현탁시킨 것으로, 예를 들어 비즈왁스, 경화 파라핀 및 세틸알코올 등의 농후제(thickening agent)를 함유할 수 있다. 또한, 방부제, 착색제, 향신료 및 감미료 등을 더 함유할 수 있는데, 이러한 조성은 비타민 C 같은 항산화제를 가하여 보존할 수 있다.The oily suspension is a suspension of an active ingredient in a vegetable oil such as olive oil, sesami oil or a mineral oil such as liquid paraffin. For example, a thickening agent such as beeswax, hardened paraffin and cetyl alcohol may be used. It may contain. It may also contain preservatives, colorants, spices, sweeteners, and the like, which can be preserved by adding antioxidants such as vitamin C.
분산성의 파우더와 입자는 분산화제, 습윤제, 현탁화제 및 보존제 등을 넣어 함께 혼합한 상태로 활성 성분을 가지고 있다. 적절한 분산화제, 습윤제나 현탁화제는 앞서 이미 언급한 것을 예로 들 수 있다. 부가적인 부형제로는 예를 들어, 감미료, 향신료 및 착색제 등을 들 수 있다.Dispersible powders and particles have an active ingredient in a state of mixing together a dispersing agent, wetting agent, suspending agent and preservative. Suitable dispersing, wetting or suspending agents can be mentioned by way of example already mentioned above. Additional excipients include, for example, sweeteners, spices and colorants.
유중수형 유화액은 올리브유 같은 식물성 기름 또는 액상 파라핀 같은 광물성 오일을 유상으로 하고, 대두레시틴(soy bean lecithin) 등의 자연산 인지질, 소르비탄모노올레이트와 같은 무수헤시톨이나 지방산의 에스테르에서 유래된 것, 리옥시에틸렌소르비톨모노올레이트와 같이 무수헥시톨(hexitol anhydride)과 지방산에서 유래한 부분 에스테르를 에틸렌 옥사이드와 축합한 화합물들을 유화제로하여 활성성분을 유화시킨 것 등이 있다. Water-in-oil emulsions are derived from vegetable oils such as olive oil or mineral oils such as liquid paraffin, and are derived from natural phospholipids such as soy bean lecithin, and esters of anhydrous hecitol or fatty acids such as sorbitan monooleate. And compounds obtained by condensation of ethylene oxide with partial esters derived from anhydrous hexitol anhydride and fatty acids, such as lyoxyethylene sorbitol monooleate, as emulsifiers.
시럽과 일릭서는 글리세롤, 프로필렌글리콜, 소르비톨 및 수크로오스 등의 감미료와 함께 활성성분을 혼합하여 제조될 수 있다. Syrups and elixirs can be prepared by mixing the active ingredients with sweeteners such as glycerol, propylene glycol, sorbitol and sucrose.
비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 혹은 무독성의 사용가능한 희석제나 용매, 예를 들어 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사할 수 있다. 사용 가능한 부형제나 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 식염수 용액이 있다. 또한, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적으로 용매 혹은 현탁 용매로 사용할 수 있다. 이런 목적으로 섞는 무자극, 비휘발성 오일(bland fixed oil)은 합성 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 사용한다. 또한, 올레인산과 같은 지방산을 주사제 마련에 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장내의 온도에서는 액체가 되어 직장 내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터, 폴리에틸렌글리콜과 혼합하여, 제제화한 후, 직장에 투여할 수 있다. Parenteral formulations may be injected as sterile injectable solutions or as suspensions in which the active ingredient is suspended in a non-toxic usable diluent or solvent such as 1,3-butanediol. Among the excipients or solvents that can be used are water, Ringer's solution and isotonic saline solution. Cosolvents such as ethanol, polyethylene glycol, and polypropylene glycol can also be used. In addition, sterile, nonvolatile oils can be customarily used as solvents or suspending solvents. Mixed, non-stimulating, bland fixed oils for this purpose include synthetic mono- and diglycerides. In addition, fatty acids such as oleic acid can be used to prepare the injections. The suppository form is formulated by mixing the drug with a suitable non-irritating excipient, e.g. cocoa butter, polyethylene glycol, which is solid at room temperature but liquid at the rectal temperature and will melt in the rectum to release the drug. May be administered.
식품 첨가물로는 음료수, 제빵, 드링크, 유지류, 아이스크림, 과자, 떡, 스넥류, 이유식, 주류, 조미료류, 레토르트 또는 통조림 등 각종 조리가공식품류를 포함할 수 있다.Food additives may include beverages, baking, drinks, fats, ice cream, sweets, rice cakes, snacks, baby food, alcoholic beverages, seasonings, retort or canned food.
본 발명의 콜레스테롤 저하제 조성물은 오일 또는 수성매질에서 용액, 현탁액 또는 유화액의 형태가 되거나, 사용하기 전에 무균 상태의, 발열물질이 제거된 물로 녹여 사용하는 건조분말의 형태 등의 경구용 제형으로 제형화할 수도 있고, 피하주사, 정맥주사 또는 근육주사 등의 비경구형 제형으로 제형화할 수도 있다.The cholesterol lowering composition of the present invention may be formulated in an oral dosage form such as a dry powder which is in the form of a solution, a suspension or an emulsion in an oil or an aqueous medium, or dissolved in sterile, water-free water before use. It may also be formulated into parenteral formulations such as subcutaneous, intravenous or intramuscular injection.
경구용 제형의 경우는 약제학적으로 허용 가능한 담체(carrier) 또는 부형제(forming agent)를 이용하여 공지의 방법으로, 예를 들면, 정제, 트로키제, 함당정제, 수성 또는 유성 현탁액, 분산 가능한 가루 혹은 입자, 유화액, 연질 혹은 경질 캡슐, 시럽, 일릭서와 같은 형태의 경구형 제형으로 제제화될 수 있으며, 이는 단위 투여량, 형태 등에 따라 알맞게 제조될 수 있다.In the case of oral dosage forms, for example, tablets, troches, sugar-containing tablets, aqueous or oily suspensions, dispersible powders, etc., in a known manner using a pharmaceutically acceptable carrier or forming agent. Or in the form of oral dosage forms in the form of particles, emulsions, soft or hard capsules, syrups, elixirs, which may be suitably prepared according to unit dosages, forms and the like.
비경구형 제형은 멸균된 주사 가능 용액 혹은 무독성의 사용 가능한 희석제 (diluent)나 1,3-부탄디올 등의 용매에 활성성분을 현탁시킨 현탁액으로 제제화하여 주사할 수 있다. 사용 가능한 부형제나 용매로는 물, 링거액 그리고 등장성 식염수 용액이 있으며, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜 같은 공용매를 사용할 수 있다. 또한, 멸균된 비휘발성 오일을 관습적으로 용매 혹은 현탁 용매로 사용할 수 있다. 좌제 형태는 약물을 상온에서는 고체였다가 직장내의 온도에서는 액체가 되어 직장 내에서 녹아 약물을 방출하게 하는 적절한 무자극성 부형제, 예를 들면, 코코아버터 또는 폴리에틸렌글리콜 등과 혼합하여, 제제화한 후, 직장에 투여한다.Parenteral formulations may be injected as a sterile injectable solution or as a suspension in which the active ingredient is suspended in a solvent such as a non-toxic usable diluent or 1,3-butanediol. Excipients or solvents that may be used include water, Ringer's solution, and isotonic saline solution. Cosolvents such as ethanol, polyethylene glycol, and polypropylene glycol may be used. In addition, sterile, nonvolatile oils can be customarily used as solvents or suspending solvents. The suppository form is formulated by mixing the drug with a suitable non-irritating excipient, such as cocoa butter or polyethylene glycol, which is solid at room temperature but liquid at the rectal temperature and will melt in the rectum to release the drug and then enter the rectum. Administration.
본 발명의 조성물을 사용하여 질병을 치료하는 경우, 활성 성분인 인삼 열매 추출물의 용량은 환자의 나이, 체중, 일반적 건강 상태, 성, 식사, 투여시간, 배설 속도, 약물 병용, 치료하는 동안의 질병의 정도 등에 따라 다르지만, 질병에 따라 0.01 내지 140 mg/체중kg 까지를 매일 사용할 수 있으며, 환자 당 1일 기준으로 0.5 mg 내지 7 g까지 사용할 수 있다.When treating a disease using the composition of the present invention, the dose of the active ingredient ginseng fruit extract is the age, weight, general state of health, sex, meal, time of administration, rate of excretion, combination of drugs, disease during treatment Depending on the degree of, etc., depending on the disease can be used every day up to 0.01 to 140 mg / kg, can be used up to 0.5 mg to 7 g per day per patient.
한편, 한가지 제형을 결정짓기 위해 담체 물질과 혼합하는 본 발명의 화합물의 양은 투여 경로별 방식과 치료하는 환자에 따라 달라진다. 예를 들어, 사람에게 피부 외용제 도포 및 경구 투여를 목적으로 하는 제형은 전체 조성 중에서 5 내지 95 중량%를 차지하는 담체 물질들과 0.5 mg 내지 5 g의 활성성분을 함유하게 되고, 사람에게 비경구 투여를 목적으로 하는 제형은 전체 조성 중에서 5 내지 99%를 차지하는 담체 물질들과 0.1 mg 내지 2.5 g의 활성성분을 함유하게 된다.On the other hand, the amount of the compound of the present invention mixed with the carrier material to determine one formulation depends on the mode of administration and the patient being treated. For example, formulations intended for topical application and oral administration of skin to humans will contain from 5 to 95% by weight of carrier materials and from 0.5 mg to 5 g of active ingredient and parenteral administration to humans. Formulations intended for this purpose will contain from 5 to 99% of the carrier composition and from 0.1 mg to 2.5 g of active ingredient.
이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이에 대한 것도 본 발명의 범위에 포함된다.Hereinafter, the content of the present invention will be described in more detail through examples and test examples. These examples are provided only for understanding the contents of the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples, and modifications, substitutions, and insertions commonly known in the art may be performed. This is also included in the scope of the present invention.
[실시예 1] 인삼 열매 추출물 제조Example 1 Preparation of Ginseng Fruit Extract
1) 인삼 열매 전처리: 생(生)인삼 열매를 수확하여 종자를 분리하여 제거한 후 인삼 열매의 과육과 과피를 일광건조 또는 열풍건조를 통하여 인삼 열매 건조원료를 제조하였다.1) Ginseng fruit pretreatment: Raw ginseng fruit was harvested, seed was separated and removed, and then the ginseng fruit dried raw material was prepared by sun drying or hot air drying.
2) 인삼 열매 추출물 제조: 인삼 열매 건조물 1 kg에 물 3 L를 가하여 환류 추출한 다음 여과한 후 40∼45℃에서 감압농축하여 인삼 열매 추출물 300 g을 얻었다.2) Preparation of ginseng fruit extract: 3 g of water was added to 1 kg of dried ginseng fruit extract to extract reflux, and then filtered and concentrated under reduced pressure at 40 to 45 ° C. to obtain 300 g of ginseng fruit extract.
[비교예 1] 인삼근 추출물Comparative Example 1 Ginseng Root Extract
인삼근 각 1 kg에 물 3 L를 가하여 환류 추출한 다음 여과한 후 40∼45℃에서 감압농축하여 인삼근 추출물을 제조하였다.3 g of water was added to each kg of ginseng root to extract reflux, followed by filtration and concentrated under reduced pressure at 40 ~ 45 ℃ to prepare a ginseng root extract.
[시험예 1] 인삼 열매 추출물의 성분비교Test Example 1 Comparison of Ingredients of Ginseng Fruit Extract
<인삼 열매와 인삼근의 진세노사이드(인삼사포닌) 성분분석><Ginsenoside (Ginseng Saponin) Analysis of Ginseng Fruit and Ginseng Root>
실시예 1 및 비교예 1에서 각각 인삼 열매와 인삼근 추출물을 제조한 다음 이들 추출물에 에테르(ether)를 처리하여 지용성 성분을 제거한 후 부탄올(BuOH)로 조사포닌을 추출, 농축하여 HPLC를 통한 진세노사이드 성분분석을 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.In Example 1 and Comparative Example 1, respectively, ginseng fruit and ginseng root extract were prepared, and then, the extracts were treated with ether to remove fat-soluble components, followed by extracting and concentrating ginsponin with butanol (BuOH). Cenoside component analysis was performed, and the results are shown in Table 1 below.
실시예 1에서 제조한 인삼 열매 추출물은 조사포닌 함량에 있어서 비교예 1에서 제조한 인삼근 추출물의 약 2배 함량을 가지고 있었으며, 진세노사이드를 PD(Protopanaxadiol)계-"진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd" 및 PT(Protopanaxatriol)계-"진세노사이드 Re, Rg1 및 Rg2"의 비율로 구분하였을 때 각각 0.73과 3.23으로 그 조성에 있어서 인삼 열매와 인삼근은 뚜렷한 차이 및 특징을 나타내었다.The ginseng fruit extract prepared in Example 1 had about twice the content of the ginseng root extract prepared in Comparative Example 1 in the content of irradiated phonynin, and ginsenosides were PD (Protopanaxadiol)-"ginsenoside Rb1, Rb2. And Rc and Rd "and PT (Protopanaxatriol)-" Ginsenoside Re, Rg1 and Rg2 "ratios were 0.73 and 3.23, respectively. .
<인삼 열매 추출물의 미네랄 성분분석>Mineral Analysis of Ginseng Fruit Extract
실시예 1에서 제조한 인삼 열매 추출물이 인삼과는 다른 '과실'로서의 특징을 가짐을 구분하기 위하여 비타민을 비롯한 미네랄 성분분석을 실시하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.In order to distinguish that the ginseng fruit extract prepared in Example 1 has the characteristics of 'fruit' different from ginseng, mineral components including vitamins were analyzed, and the results are shown in Table 2 below.
이상과 같이 본 발명에서 사용하는 인삼 열매의 성분적 특성은 인삼근 보다 많은 인삼사포닌을 함유함과 동시에 사포닌 조성의 성질이 정반대이고, 또한 인삼근과 달리 열매로서 비타민과 미네랄 16 종의 함량이 풍부함을 확인할 수 있었다.As described above, the ginseng fruit used in the present invention contains more ginseng saponin than the ginseng root, and at the same time, the composition of the saponin is opposite to that of the ginseng root. Could confirm.
[시험예 2] 본 발명에 따른 실시예 농도에 의한 아세틸콜린 이완반응 측정[Test Example 2] Determination of Acetylcholine Relaxation by Example Concentration According to the Present Invention
생후 4개월 된 고혈압 모델 래트(spontaneously hypertensive rats, 이하 'SHR'이라 칭한다)를 사용하였으며, 상기 고혈압 모델 래트에 6주간 식수를 연속 투여한 군을 대조군으로 하여, 본원 발명에 따른 실시예 1의 인삼 열매 추출물 100 mg/kg/day을 6주간 식수에 녹여 연속투여한 군 및 은행추출물(양성대조군) 60 mg/kg/day을 6주간 식수에 녹여 연속투여한 군과 비교하여 내피세포 의존성 혈관 확장능을 분석하였다.Four-month-old hypertensive model rats (spontaneously hypertensive rats, hereinafter referred to as 'SHR') were used, and the ginseng of Example 1 according to the present invention was used as a control group of the group administered with continuous drinking water for 6 weeks to the hypertension model rats. Endothelial cell-dependent vasodilation ability compared to the group administered continuously by dissolving 100 mg / kg / day of fruit extract in drinking water for 6 weeks and the group administered with 60 mg / kg / day dissolved in drinking water for 6 weeks. Was analyzed.
에테르 마취 하에 각 SHR 복부를 절개하고 흉곽대동맥을 적출하여 0.5cm 크기의 링 형태로 절단하고, 95%+0.5%-CO+O2의 가스로 포화시킨 37℃ KH(Krebs-Henseleit, pH 7.4) 생리용액으로 채워진 20 ml 용적의 조직조(organ bath) 내에 현수하였다.Each SHR abdomen was cut under ether anesthesia, the thoracic aorta was removed, cut into 0.5 cm rings, and 37 ° C. KH (Krebs-Henseleit, pH 7.4) saturated with 95% + 0.5% -CO + O 2 gas. Suspension was carried out in a 20 ml volume of tissue bath filled with physiological solution.
혈관을 매단 다른 쪽은 장력변환기(force transducer)에 연결하여 수축 및 이완반응을 생리신호기록기(physiograph) 상에 기록하였다. 2 g의 안정장력(resting tension)을 주어 60분간 안정시켰다. 그 후 노르에피네프린(norephinehprione) 10M을 가하여 약 1 g 정도 수축시킨 후, 아세틸콜린에 의한 이완반응을 누적법으로 측정하였고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 아세틸콜린은 내피세포 의존성 이완반응 물질로 정상 흰쥐의 흉곽대동맥에 비해 고혈압이 유발된 SHR의 혈관에서는 이완반응이 보다 감소되는 것으로 보고되었다.The other end of the vessel was connected to a force transducer and the contraction and relaxation responses were recorded on a physiograph. A rest tension of 2 g was given and allowed to rest for 60 minutes. Thereafter, about 10 g of norepinephrine (norephinehprione) was added to shrink about 1 g, and the relaxation reaction by acetylcholine was measured cumulatively and the results are shown in FIG. 1. Acetylcholine is an endothelial cell-dependent relaxation agent, and it has been reported that the relaxation response in the blood vessels of hypertensive SHR is higher than that of normal rat thoracic aorta.
도 1의 결과에서 알 수 있듯이, 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 투여한 군에서 투여량에 비례하여 아세틸콜린의 이완반응이 민감하게 증가되었다.As can be seen from the results of Figure 1, the relaxation response of acetylcholine was increased sensitively in proportion to the dose in the group administered the ginseng fruit extract of Example 1.
[시험예 3] 내피세포 의존성 혈관 확장능Test Example 3 Endothelial Cell-dependent Vasodilation Capacity
본 발명에 따른 대조군과 실시예 1의 인삼 열매 추출물 10 M 및 은행추출물 10-5 g/ml을 상기 조직조에 각각 투여하고, 각각의 조직조에 염화칼륨 10, 20, 30, 40, 50, 60 mM 농도와, 안지오텐신 II 10-M에서 10 M 농도를 누적적으로 가해 각각에서 혈관 수축반응을 측정 비교하였으며, 그 결과를 도 2a 및 2b에 나타내었다.10 g of ginseng fruit extract and ginseng extract 10-5 g / ml of the control group according to the present invention and 10-5 g / ml of the extract was administered to the tissue tank, respectively, 10, 20, 30, 40, 50, 60 mM concentration of potassium chloride in each tissue tank In addition, 10 M concentration in angiotensin II 10-M was cumulatively measured and compared with each other, and the results are shown in FIGS. 2A and 2B.
도 2a 및 2b의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의한 인삼 열매 추출물 투여군은 염화칼륨 및 안지오텐신 II에 의한 용량의존적인 수축반응에 영향을 미치지 않았다.As can be seen from the results of Figures 2a and 2b, the ginseng fruit extract administration group according to the present invention did not affect the dose-dependent contraction response by potassium chloride and angiotensin II.
[시험예 4] 콜라겐이 유인하는 혈소판 응집반응에서 인삼 열매 추출물의 영향Test Example 4 Effect of Ginseng Fruit Extract on Platelet Aggregation Induced by Collagen
<실험 재료><Experimental material>
본 발명의 시험예에서 사용하는 콜라겐은 크로노-로그사(Chrono-Log Corporation, 미국 펜실베니아주 하버타운 소재)로부터 구입하였다. 8-브로모아데노신(Bromoadenosine)-3′,5′-사이클릭 모노포스포로티오에이트(cyclic monophosphorothioate), Rp-이성질체(Rp-isomer; Rp-8-Br-cAMPS), 9-(테트라하이드로-2´-퓨릴)아데닌(SQ22536), 1-에틸-4-[(1-메틸에틸리덴)하이드라지노(hydrazino)]1H-피라졸로[3,4-b]피리딘-5-카르복시산(Etazolate), 그 외 다른 시약들은 시그마 케미컬사(Sigma Chemical Corporation, 미국 세인트 루이스 소재)로부터 구입하였다. cAMP와 cGMP, TXB2 효소면역분석 키트(enzymeimmunoassay kit)는 아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience, 영국 버킹엄셔(Buckinghamshire) 소재)의 제품을 사용하였다.Collagen used in the test example of the present invention was purchased from Chrono-Log Corporation (Harbourtown, Pennsylvania, USA). 8-Bromoadenosine-3 ′, 5′-cyclic monophosphorothioate, Rp-isomer (Rp-8-Br-cAMPS), 9- (tetrahydro- 2′-puryl) adenine (SQ22536), 1-ethyl-4-[(1-methylethylidene) hydrazino] 1H-pyrazolo [3,4-b] pyridine-5-carboxylic acid (Etazolate ) And other reagents were purchased from Sigma Chemical Corporation, St. Louis, USA. cAMP, cGMP, TXB 2 enzyme immunoassay kit (enzymeimmunoassay kit) used a product of Amersham Bioscience (Buckinghamshire, UK).
< 세척 래트(rat) 혈소판 제조 ><Preparation of Washed Rat Platelets>
정상 SD 래트의 복대정맥에서 0.38% 구연산나트륨(sodium citrate)을 항응고제로 사용하여 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 220× g에서 10분간 원심분리하여 상층의 PRP(platelet-rich plasma)를 얻었다. PRP를 1650× g에서 10분간 원심분리하여 하층의 혈소판 펠렛(platelet pellets)을 얻었다. 펠렛을 세척용 완충액(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.36 mM NaH2PO4, 5.5 mM 글루코오스, 1 mM EDTA, pH 6.9)으로 두 번 세척하였다. 세척된 혈소판을 현탁용 완충액(suspending bufer: 138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.36 mM NaH2PO4, 5.5 mM 글루코오스, 0.49 mM MgCl2, 0.25% 젤라틴, pH 7.4)를 이용하여 세포 현탁액을 제조하였다. 그리고 혈소판 수를 5×108 혈소판/ml가 되도록 조정하였다. 모든 과정은 실온에서 진행되었으며 이는 낮은 온도에서 혈소판에 미치는 영향을 배제시키기 위함이다(Reuter H, et al., Studies of the aggregation of human blood platelets. 3. On the inhibition of platelet aggregation in EDTA plasma following incubation at 37 degrees C, Klin Wochenschr, 1967, 45 : 1147-1149).Blood was collected using 0.38% sodium citrate as an anticoagulant in the abdominal vein of normal SD rats. The collected blood was centrifuged at 220 × g for 10 minutes to obtain an upper layer platelet-rich plasma (PRP). PRP was centrifuged at 1650 × g for 10 minutes to obtain lower platelet pellets. The pellet was washed twice with wash buffer (138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO 3 , 0.36 mM NaH 2 PO 4 , 5.5 mM glucose, 1 mM EDTA, pH 6.9). The washed platelets were suspended using suspension buffer (138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO 3 , 0.36 mM NaH 2 PO 4 , 5.5 mM glucose, 0.49 mM MgCl 2 , 0.25% gelatin, pH 7.4). Cell suspensions were prepared. The platelet count was then adjusted to 5 × 10 8 platelets / ml. All procedures were conducted at room temperature, to rule out the effects on platelets at low temperatures (Reuter H, et. al ., Studies of the aggregation of human blood platelets. 3.On the inhibition of platelet aggregation in EDTA plasma following incubation at 37 degrees C, Klin Wochenschr , 1967, 45: 1147-1149).
< 콜라겐 농도별 혈소판 응집반응 ><Platelet aggregation reaction by collagen concentration>
콜라겐 농도에 따른 혈소판 응집반응을 알아보기 위하여, 세척 혈소판 108/ml에 CaCl2 2 mM을 첨가하여 37℃에서 3분간 예비배양한(preincubation) 후 콜라겐 0.5, 1, 3, 5 및 10 μg/ml로 자극하여 5분간 응집율을 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 혈소판 응집율(%)은 응집계(Lumiaggregometer; 크로노-로그사, 미국 펜실베니아주 하버타운 소재)의 660 nm에서 빛의 투과율을 측정하여 구하였으며, 빛의 투과율로부터 혈소판 응집율(%)을 계산하는 법은 다음과 같다.To determine the platelet aggregation reaction according to collagen concentration, CaCl 2 in 10 8 / ml After addition of 2 mM and preincubation at 37 ° C. for 3 minutes, the collagen was stimulated with 0.5, 1, 3, 5 and 10 μg / ml to measure the aggregation rate for 5 minutes, and the results are shown in FIG. 3. Platelet aggregation rate (%) was obtained by measuring the light transmittance at 660 nm of the Lumiaggregometer (Chrono-Logsa, Harbortown, Pa.), And calculates the platelet aggregation rate (%) from the light transmittance. The law is as follows.
빛의 투과율은 최고 100%이며, 혈소판의 응집율(%)은 투과율이 증가하면 증가한다. 도 3과 같이 응집계의 기록지는 0%부터 100%의 눈금으로 구성되어 있다. 빛이 혈소판이 함유된 세척 혈소판의 부유액에 투과된 경우를 이 기록지의 10%가 되는 지점으로 맞추고 제로(zero)로 고정하여 기준선(base line)으로 하고, 빛이 혈소판이 없는 세정 완충액에 투과된 경우를 90%가 되는 지점으로 맞추고 최대의 투과율로 고정하여, 세척 혈소판의 부유액에 콜라겐을 첨가하여 혈소판 응집반응을 일으키면 기록지의 10% 지점(기준선)으로부터 기록지의 90% 지점(최대 투과율)을 향하여 투과율이 증가하면서 응집반응 곡선이 기록지에 그려진다. 즉, 세척 혈소판의 10% 지점으로부터 투과율이 증가되는 것은 응집반응율의 증가를 의미한다. The transmittance of light is up to 100%, and the platelet aggregation rate (%) increases as the transmittance increases. As shown in Fig. 3, the recording paper of the coagulation system is composed of 0% to 100% scale. When light penetrates the platelet-containing suspended platelet suspension to 10% of the recording paper, it is fixed to zero as a base line, and the light penetrates the platelet-free washing buffer. Set the case to 90% and fix it at the maximum transmittance. When collagen is added to the suspension of washed platelets to cause platelet aggregation reaction, from 10% point of the recording paper (baseline) to 90% point of the recording paper (maximum transmittance) As the transmittance increases, agglomeration reaction curves are drawn on the recording paper. That is, the increase in permeability from 10% of the washed platelets means an increase in the aggregation reaction rate.
그러나 콜라겐에 의해 증가되는 투과율이 응집계의 기록지에서 투과율 100%를 투과율 80% (90% - 10% = 80%)로 전환시켜 고정한 상태에서 측정되는 것이므로 실제 혈소판 응집율(%)은 하기 수학식 1로 계산된다. However, since the permeability increased by collagen is measured in a fixed state by converting 100% permeability to 80% (90%-10% = 80%) in the recording paper of the aggregation system, the actual platelet aggregation rate (%) is expressed by the following equation. Is calculated as 1.
여기에서, A는 약물을 투여하거나 투여하지 않은 쥐의 혈액으로부터 준비한 세척 혈소판 부유액에 콜라겐 첨가 5분 후의 투과율이다.Here, A is the
상기 도 3의 결과에서, 10 μg/ml의 콜라겐을 가했을 때 응집율이 가장 높았으므로 이후 모든 실험은 10 μg/ml의 콜라겐을 사용하였다.In the results of FIG. 3, since the aggregation was the highest when 10 μg / ml collagen was added, all experiments used 10 μg / ml collagen.
< 콜라겐이 유인하는 혈소판 응집반응에서 인삼 열매 추출물의 영향 ><Effect of Ginseng Fruit Extract on Platelet Aggregation Induced by Collagen>
혈소판 응집반응 측정은 Born의 방법을 사용하였다(Born, G. V. R., Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal, Nature (London), 1962, 194 : 927-929). The measurement of platelet aggregation was performed by Born's method (Born, GVR, Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal, Nature (London), 1962, 194: 927-929).
세척혈소판 108/ml에 CaCl2 2 mM을 첨가하여 37℃에서 3분간 예비배양(preincubation)시킨 후 콜라겐 10 μg/ml 및 인삼 열매 추출물 0, 1, 5, 10, 30 및 50 μM를 각각 첨가하여 상기와 동일하게 5분간 응집반응을 진행한 다음 그 응집율을 측정하였으며, 그 결과를 도 4a에 나타내었다. 이 때, 현탁용 완충액을 블랭크(blank)로 사용하였으며(투과율 0), 인삼 열매 추출물은 증류수에 녹여 사용하였으므로 용매에 대한 영향은 없었다.CaCl 2 to washed
도 4a의 결과에서, 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 전처리한 경우 인삼 열매 추출물의 농도에 비례하여 혈소판 응집율이 감소하는 것을 확인하였다. In the results of Figure 4a, it was confirmed that the platelet aggregation rate decreased in proportion to the concentration of the ginseng fruit extract when the ginseng fruit extract of Example 1 was pretreated.
이러한 결과를 토대로 하여 인삼 열매 추출물 농도에 따라 혈소판 응집이 억제되는 억제율을 하기 수학식 2에 따라 산출하였으며, 그 결과를 도 4b에 나타내었다. Based on these results, the inhibition rate for inhibiting platelet aggregation according to the ginseng fruit extract concentration was calculated according to Equation 2 below, and the results are shown in FIG. 4B.
C: 콜라겐만 처리한 혈소판에서의 응집율 C: Coagulation rate in platelets treated with collagen only
T: 콜라겐과 인삼 열매 추출물을 함께 처리한 혈소판에서의 응집율T: Coagulation Rate in Platelets Treated with Collagen and Ginseng Fruit Extract
도 4b의 결과에서, 실시예 1의 인삼 열매 추출물 함량이 50 μM인 경우, 인삼 열매 추출물을 첨가하지 않은 시험군에 비하여 무려 80% 가까이 혈소판 응집이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.In the results of Figure 4b, when the ginseng fruit extract content of Example 1 is 50 μM, it was confirmed that platelet aggregation is suppressed as much as 80% compared to the test group without the ginseng fruit extract.
[시험예 5] 콜라겐에 의한 세포내 칼슘 증가에 있어서의 인삼 열매 추출물의 영향Test Example 5 Effect of Ginseng Fruit Extract on Intracellular Calcium Increase by Collagen
세포내의 칼슘은 혈소판 응집반응 등을 포함한 여러 세포 반응에 매우 중요하다. 형광물질인 fura 2-AM을 이용하여 세포내의 칼슘을 측정하였다. Intracellular calcium is critical for many cellular responses, including platelet aggregation. Intracellular calcium was measured using the fluorescent material fura 2-AM.
세포질 내 Ca2 + ([Ca2 +]i) 농도를 측정하기 위하여, 형광 지시 염료(fluorescent indicator dye)인 Fura 2-AM을 혈소판 내에 로딩하여 fura 2가 Ca2 +과 결합하여 나타내는 형광성(fluorescence)의 변화를 SPF 25 형광분석기(SPF 25 fluorimeter; Kontron)를 이용하여 측정하였다. 여기(excitation) 340 nm, 방출(emission) 510 nm로 세팅하여 37℃에서 8분간 시간 드라이브를 시행하였는데, 3분 되는 지점에서 콜라겐 10 μg/ml을 첨가하여 혈소판을 자극시켰다. 실제 [Ca2 +]i은 상대 형광성(rf: relative fluorescence)로 나타나기 때문에 Grynkiewicz의 방법(Grynkiewcz G, Poenie M and Tsien RY. A new generation of [Ca2 +] indicators with greatly improved fluorescence properties, J Biol Chem, 1985, 260 : 3440-3450)을 이용하여 하기 수학식 3에 따라 Ca2 + ([Ca2 +]i) 농도를 계산한 다음 하기 수학식 4에 따라 억제율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. Cytoplasm in Ca 2 + ([Ca 2 + ] i) In order to measure the concentration of, by loading the fluorescent indicator dye Fura 2-AM in (fluorescent indicator dye) in the platelet fluorescence indicating the fura 2 in combination with Ca 2 + (fluorescence ) Was measured using an SPF 25 fluorimeter (Kontron). The drive was performed for 8 minutes at 37 ° C with excitation of 340 nm and emission of 510 nm. At 3 minutes, 10 μg / ml of collagen was added to stimulate platelets. Actual [Ca 2 +] i is the relative fluorescence.: Grynkiewicz method of it were a (rf relative fluorescence) (Grynkiewcz G , Poenie M and Tsien RY A new generation of [Ca 2 +] indicators with greatly improved fluorescence properties, J Biol Chem , 1985, 260: 3440-3450) was used to calculate the concentration of Ca 2 + ([Ca 2 + ] i ) according to the following Equation 3, and then the inhibition rate was calculated according to the following
여기에서, Kd는 fura 2-AM의 분해정수(224 nM, 37℃)이며, F는 각 샘플의 실제 측정 rf값이며, Fmax는 최대 형광성으로서 2 mM CaCl2가 존재하는 상태에서 0.1% 트리톤(Triton) X-100을 첨가하여 측정하였고, Fmin 최소 형광성으로서 CaCl2를 첨가하지 않고 0.1% 트리톤 X-100과 20 mM 트리스-3 mM EGTA를 첨가하여 측정하였다[mean±S.D. (n=7)].Where K d is the resolution constant of fura 2-AM (224 nM, 37 ° C.), F is the actual measured rf value of each sample, and F max is the maximum fluorescence of 0.1% in the presence of 2 mM CaCl 2. Measured by addition of Triton X-100, 0.1 min Triton X-100 and 20 mM Tris-3 mM EGTA without CaCl 2 as F min minimum fluorescence [mean ± SD (n = 7)].
C: 콜라겐만 처리한 혈소판에서의 [Ca2 +]i C: [Ca 2 +] i in a treatment of collagen, only platelets
T: 콜라겐과 인삼 열매 추출물을 함께 처리한 혈소판에서의 [Ca2 +]i T: [Ca 2 + ] i in platelets treated with collagen and ginseng fruit extract
상기 표 3의 결과에서, 콜라겐 자극으로 인해 혈소판 내의 칼슘량이 급격히 증가하였다. 그러나, 실시예 1의 인삼 열매 추출물을 전처리한 결과, 인삼 열매 추출물의 농도에 비례하여 [Ca2 +]i의 농도가 최대 41.6%까지 억제되었다. 즉, [Ca2 +]i의 농도는 인삼 열매 추출물 농도에 비례하여 감소하였다.In the results of Table 3, due to collagen stimulation, the amount of calcium in the platelets rapidly increased. However, as a result of pre-treatment with ginseng fruit extract of Example 1, in proportion to the concentration of the ginseng extract of the fruit is the concentration of [Ca 2 +] i was inhibited up to 41.6%. In other words, the concentration of [Ca 2 + ] i decreased in proportion to the concentration of ginseng fruit extract.
[시험예 6] 아데닐레이트 사이클라아제 억제제 또는 A-키나아제 억제제의 존재 하에서 콜라겐이 유도하는 혈소판 응집반응에 대한 인삼 열매 추출물의 효과Test Example 6 Effect of Ginseng Fruit Extract on Collagen-induced Platelet Aggregation in the Presence of Adenylate Cycase Inhibitor or A-Kinase Inhibitor
인삼 열매 추출물에 의해 증가된 cAMP가 혈소판 응집반응에 있어 직접적인 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 세척 혈소판 108/ml에 CaCl2 2 mM을 첨가하여 37℃에서 3분간 예비배양한(preincubation) 후 콜라겐 10 μg/ml, 인삼 열매 추출물 50 μM, SQ 22536 10 μM 및 Rp-8-Br-cAMPS 20 μM을 각각 첨가하여 5분간 응집반응을 진행한 다음 혈소판 응집율을 측정하였으며, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다. To determine whether cAMP increased by ginseng fruit extract directly affects platelet aggregation, CaCl 2 in washed
도 5의 결과에서, 인삼 열매 추출물만을 처리한 군에서 혈소판 응집반응은 현저하게 저하되었으며, 여기에 아데닐레이트 사이클라아제의 억제제인 SQ22536을 처리하자 혈소판 응집율이 다시 증가하였다. 상기 결과를 통하여 본 발명에 의한 인삼 열매 추출물이 세포 내 cAMP를 증가시킴으로써 혈소판 응집반응을 억제하고 있음을 확인할 수 있었다. In the results of Figure 5, the platelet aggregation reaction was significantly reduced in the group treated only ginseng fruit extract, the platelet aggregation rate increased again when the SQ22536 inhibitor of adenylate cyclase was treated. Through the results, it was confirmed that the ginseng fruit extract according to the present invention inhibits platelet aggregation by increasing the intracellular cAMP.
또한 세포내의 cAMP는 A-키나아제를 활성화시켜 여러 세포반응을 유도한다. 따라서 cAMP의 하류(down stream)인 A-키나아제에 대한 영향을 알아보기 위하여 A-키나아제 저해제인 Rp-8-Br-cAMPS를 인삼 열매 추출물과 함께 처리하였을 때의 혈소판 응집반응을 측정해 본 결과(도 6), 인삼 열매 추출물만을 처리하였을 때 억제되었던 혈소판 응집반응이 Rp-8-Br-cAMPS를 처리하자 SQ22536을 처리하였을 때와 동일하게 응집율이 증가하는 것을 확인하였다. 즉, A-키나아제의 억제제인 Rp-8-Br-cAMPS를 처리함으로써 인삼 열매 추출물이 억제시킨 혈소판 응집반응이 다시 증가되는 것을 알 수 있었다. In addition, intracellular cAMP activates A-kinase to induce several cellular responses. Therefore, in order to investigate the effect of cAMP on the downstream A-kinase, we measured the platelet aggregation reaction when R-P-8-Br-cAMPS, an A-kinase inhibitor, was treated with ginseng fruit extract ( 6), the platelet aggregation reaction that was inhibited when only the ginseng fruit extract was treated was confirmed that the aggregation rate increased in the same manner as the SQ22536 treatment when Rp-8-Br-cAMPS treatment. In other words, by treating Rp-8-Br-cAMPS, an inhibitor of A-kinase, it was found that the platelet aggregation reaction inhibited by the ginseng fruit extract was increased again.
[시험예 7] 독성 실험Test Example 7 Toxicity Test
<경구투여><Oral administration>
ICR계 마우스와 스프라그 도올리(Sprague Dawley, 대구효창사이언스)를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 실시예 1의 추출물을 각각 500, 725, 1000 및 5000 mg/kg의 용량으로 경구투여한 후 2주간 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.ICR-based mice and Sprague Dawley (cod hyochang science) were divided into four groups of 10 mice each, orally administered with the extracts of Example 1 of the present invention at doses of 500, 725, 1000 and 5000 mg / kg, respectively. After two weeks of toxicity, none of the four groups died and no symptoms were found.
<복강투여><Abdominal administration>
ICR계 마우스(25±5 g)와 스프라그-도올리(Sprague Dawley) (대구효창사이언스)를 각각 10마리씩 4군으로 나누어 본 발명의 실시예 1의 추출물을 각각 25, 250, 500 및 725 mg/kg의 용량으로 복강투여한 후 24시간 동안 독성여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 사망한 예가 한 마리도 없었고 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다. 이상의 결과에서 본 발명의 추출물은 급성독성이 거의 없음이 확인되었다.ICR mice (25 ± 5 g) and Sprague Dawley (cod hyochang science) were divided into four groups of 10 animals each, and the extracts of Example 1 of the present invention were 25, 250, 500 and 725 mg, respectively. Toxicity was observed for 24 hours after intraperitoneal administration at / kg. There were no deaths in all four groups and no symptoms were apparent in the control group. From the above results, it was confirmed that the extract of the present invention has little acute toxicity.
하기에 상기 약학조성물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.Hereinafter, an example of the preparation of the pharmaceutical composition will be described, but it is not intended to limit the present invention but merely to explain in detail.
[제형예 1] 산제Formulation Example 1 Powder
약전 제제총칙 중 산제의 제조방법에 따라 1포당 실시예 1의 인삼열매 추출물 50 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg를 함유하는 산제를 제조하였다. A powder containing 50 mg of ginseng fruit extract of Example 1, 100 mg of lactose and 10 mg of talc was prepared per package according to the preparation method of powder in the pharmacopeia formulation.
[제형예 2] 정제Formulation Example 2 Tablet
약전 제제총칙 중 정제의 제조방법에 따라 1정 당 실시예 1의 인삼열매 추출물 50 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 함유하는 정제를 제조하였다.A tablet containing 50 mg of ginseng fruit extract of Example 1, 100 mg of corn starch, 100 mg of lactose and 2 mg of magnesium stearate was prepared per tablet according to the preparation method of the tablet in the pharmacopeia formulation.
[제형예 3] 캅셀제Formulation Example 3 Capsule
약전 제제총칙 중 캅셀제의 제조방법에 따라 1 캅셀당 실시예 1의 인삼열매 추출물 50 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 함유하는 캅셀제를 제조하였다.A capsule containing 50 mg of ginseng fruit extract of Example 1, 100 mg of corn starch, 100 mg of lactose and 2 mg of magnesium stearate was prepared per capsule according to the preparation method of the capsule in the pharmacopeia formulation.
[제형예 4] 주사제Formulation Example 4 Injection
약전 제제총칙 중 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 실시예 1의 인삼 열매 추출물 50 mg에 주사용 멸균 증류수 및 pH 조절제를 적절히 혼합하여 주사제를 제조하였다.Injectable drugs were prepared by appropriately mixing sterile distilled water and a pH adjusting agent for injection into 50 mg of ginseng fruit extract of Example 1 per ampule (2 ml) according to the preparation method of injectable drugs.
[제형예 5] 액제Formulation Example 5 Liquid
약전 제제총칙 중 액제의 제조방법에 따라 액제 100 ㎖당 실시예 1의 인삼 열매 추출물 50 mg, 이성화당 10 g, 만니톨 5 g 및 정제수를 혼합하여 액제를 제조하였다. According to the preparation method of the liquid formulation in the pharmacopeia formulation, 50 mg of ginseng fruit extract of Example 1, 10 g of isomerized sugar, 5 g of mannitol, and purified water were mixed per 100 ml of the formulation.
[제형예 6] 건강 기능성 음료Formulation Example 6 Healthy Functional Drink
통상의 건강기능성음료 제조방법에 따라 실시예 1의 인삼 열매 추출물 1000 ㎎, 구연산 1000 ㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 및 정제수를 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2℃ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다. According to the conventional method for preparing a health functional beverage, 1000 mg of ginseng fruit extract of Example 1, 1000 mg of citric acid, 100 g of oligosaccharide, 2 g of plum concentrate, 1 g of taurine, and purified water were added and mixed to make a total of 900 ml, then about 1 After stirring and heating at 85 ° C. for a period of time, the resulting solution was collected by filtration into a sterilized 2 ° C. container, sealed and sterilized and then stored in the refrigerator.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.Although the composition ratio is mixed with a relatively suitable component in a preferred embodiment in a preferred embodiment, the compounding ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, use purpose.
도 1은 아세틸콜린에 의한 혈관이완 반응을 보여주는 그래프이다.1 is a graph showing the vasorelaxation response by acetylcholine.
도 2a 및 2b는 염화칼륨과 안지오텐신 II에 의한 혈관수축반응을 나타낸 그래프이다.2a and 2b are graphs showing vasoconstriction by potassium chloride and angiotensin II.
도 3은 혈소판 응집율을 측정하기 위한 응집계(Lumiaggregometer)의 기록지이다. 3 is a recording sheet of a lumiaggregometer for measuring platelet aggregation rate.
도 4a는 콜라겐이 유도하는 혈소판 응집반응에서 인삼 열매 추출물 농도에 따른 응집율의 변화를 보여주는 그래프이고, 도 4b는 인삼 열매 추출물 농도에 따른 혈소판 응집 억제율을 보여주는 그래프이다[mean±S.D. (n=3-4). * P<0.05, ** P<0.01, 인삼 열매 추출물 없이 콜라겐 유도된 혈소판과 비교].Figure 4a is a graph showing the change of aggregation rate according to the concentration of ginseng fruit extract in platelet aggregation reaction induced collagen, Figure 4b is a graph showing the inhibition of platelet aggregation according to the concentration of ginseng fruit extract [mean ± SD (n = 3 -4). * P <0.05, ** P <0.01, compared with collagen induced platelets without ginseng fruit extract].
도 5는 SQ22536의 존재 하에서 콜라겐이 유도하는 혈소판 응집반응에서 인삼 열매 추출물의 영향을 보여주는 그래프이다[mean±S.D. (n=3). ** P<0.01, SQ22536 없이 인삼 열매 추출물만 첨가한 콜라겐 유도된 혈소판과 비교].5 is a graph showing the effect of ginseng fruit extract on collagen-induced platelet aggregation in the presence of SQ22536 [mean ± SD (n = 3). ** P <0.01, compared with collagen induced platelets added only ginseng fruit extract without SQ22536].
도 6은 Rp-8-Br-cAMPS의 존재 하에서 콜라겐이 유도하는 혈소판 응집반응에서 인삼 열매 추출물의 영향을 보여주는 그래프이다[mean±S.D. (n=3). ** P<0.01, Rp-8-Br-cAMPS 없이 인삼 열매 추출물만 첨가한 콜라겐 유도된 혈소판과 비교].6 is a graph showing the effect of ginseng fruit extract on collagen-induced platelet aggregation in the presence of Rp-8-Br-cAMPS [mean ± SD (n = 3). ** P <0.01, compared with collagen-induced platelets added only ginseng fruit extract without Rp-8-Br-cAMPS].
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