KR20110072277A - 혈관 내피 세포 성장인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드, 그를 포함하는 융합 단백질 및 그의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드, 이를 포함하는 융합 단백질 및 그의 제조 방법을 제공한다.
혈관 내피 세포 성장인자, 혈관 내피 세포 성장인자 수용체
Description
혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드, 이를 포함하는 융합 단백질 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
혈관 신생(angiogenesis)은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 기작을 의미하며, 기관의 형성, 정상적인 생리학적 성장, 상처 치유 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 비정상적인 혈관 신생은 종양의 성장과 전이, 연령 관련 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 건선, 류마티스성 관절염, 만성 염증과 같은 질병에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
종양의 성장과 전이는 혈관 신생 의존적이고, 항 혈관 신생 치료제는 암의 새로운 치료 방법이 될 수 있을 것이라는 가설이 제안된 이후, 새로운 개념의 암 치료제를 개발하기 위해 혈관 신생 기작에 대한 다양한 심도있는 연구가 진행되었 다. 다양한 혈관 형성 인자 중 혈관 내피 세포 성장인자(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)는 가장 많이 연구되고 있는 표적이다. 암 조직이 성장할 때, 조직 내부에서는 암 조직에 의한 혈관 퇴화 과정 및 과도한 암 조직 성장에 의한 저산소(hypoxia) 환경이 조성되어 신생 혈관이 형성될 수 있는 조건이 제공된다. 상기 조건 하에서 혈관 내피 세포는 VEGF의 발현을 증가시켜 암 세포 주변에 새로운 혈관이 생성된다. 혈관 내피 세포의 성장 및 혈관 생성은 혈관 내피 세포 성장인자의 발현 및 그 수용체와의 반응에 의하여 유도되므로 상기 반응은 신생 혈관 형성에 있어서 매우 중요한 과정이다. 이러한 점에서, VEGF과 VEGFR 사이의 결합 저해는 암 조직 내의 신생 혈관 형성을 억제하는 암 치료의 표적이 될 수 있다. 또한, VEGF은 혈관 생성의 세포 내 신호 전달을 시작하도록 하는 리간드라는 점에서 암 치료의 효과적인 표적 분자가 될 수 있다.
관련 기술은 결장, 직장암을 치료를 위해 승인된 인간 VEGF와 결합하는 인간화 항체를 개시한다. 그러나, 현재 이용 가능한 치료법들과 함께, VEGF를 표적화하는 것은 모든 환자 또는 모든 암에 대해 효과적인 것은 아니다.
혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드를 제공한다.
혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
일 양상은 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드를 제공한다:
일반식 I
X1-Arg-X2-X3-Met-Trp-X4-X5-X6-X7
상기 X1, X4, X6 및 X7은 각각 독립적으로, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp, Glu, Arg, His 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X2는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며, X3 및 X5는 각각 독립적으로, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp 및 Glu으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
상기 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드를 제공한다.
용어, "혈관 내피 세포 성장인자(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)"는 새로운 혈관을 생성하기 위해서 내피 세포를 성장시키는 인자의 한 종류인 단백질을 의미한다. 상기 VEGF 단백질은 이중 형태의 당단백질로 분비가 되며, 8개의 시스테인 잔기가 포함되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 VEGF는 예를 들어, GenBank Accession No. AAL27630 또는 AAA35789에 개시된 아미노산 서열의 단백질일 수 있다.
용어, "혈관 내피 세포 성장인자 수용체(vascular endothelial cell growth factor receptor, VEGFR)"는 리간드인 혈관 내피 세포 성장인자가 결합되면 세포 내로 신호를 전달하여 혈관 신생을 유도하도록 하는, 혈관 내피 세포의 세포막에 존재하는 수용체 티로신 키나제(receptor tyrosine kinase)의 한 종류인 단백질을 의미한다. 상기 VEGFR은 VEGFR-1, VEGFR-2 및 VEGFR-3의 3가지 종류가 있으며, 7개의 면역글로불린-유사 도메인, 하나의 막투과 도메인 및 세포 내의 키나제 도메인으로 구성된다. 상기 VEGFR은 예를 들어, GenBank Accession No. ACF47599에 개시된 아미노산 서열의 단백질일 수 있다.
용어, " 특이적으로 결합(specifically binding)" 은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 2 이상의 폴리펩티드 또는 단백질 사이에서 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 분자간에 특이적인 상호 작용을 하는 것을 의미한다. 예를 들어, 항원 및 항체가 특이적으로 상호 작용하여 면역학적 반응을 하는 것일 수 있다.
용어 "폴리펩티드(polypeptide)"는 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 4 내지 20개의 아미노산 잔기를 갖는 것일 수 있으며, 4 내지 10개의 아미노산 잔기를 갖는 것일 수 있다.
상기 폴리펩티드는 예를 들어, 유전자 클로닝 방법 및 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)과 같이 당업계에 알려진 다양한 방법을 통해 제조될 수 있다. 또한, 상기 폴리펩티드는 상업적으로 구입 가능한 폴리펩티드 라이브러리(예를 들어, Dyax 사 폴리펩티드 라이브러리, New England Biolab 사의 박테리오파지 M13-폴리펩티드 라이브러리 등)를 통해 실험적으로 획득할 수 있다.
한편, 상기 일반식 I에서, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr 및 Try는 극성이나 전하를 띄지 않는 R기를 갖는 아미노산이고, Asp, Glu, Arg, His 및 Lys는 전하를 띄는 R기를 갖는 아미노산이며, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp 및 Val는 비극성인 R기를 갖는 아미노산을 나타낸다.
또 다른 양상은 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
다른 양상은 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역은 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 연결하는 링커를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 융합 단백질은 펩티바디를 의미하는 것일 수 있다. 용어 "펩티바디(peptibody)"는 항체의 Fc 영역에 직접 또는 간접적으로 융합된 1 이상의 폴리펩 티드를 포함하는 분자를 의미한다. 상기 폴리펩티드는 목적하는 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들어, 상기 폴리펩티드는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드일 수 있으며, 이는 링커의 존재 또는 부재 하에 항체의 Fc 영역으로 구성되는 폴리펩티드와 결합하여 펩티바디를 생성할 수 있다.
상기 융합 단백질은 링커, 예를 들어, 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 상기 링커는 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있으며, 예를 들어, 복수의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 링커일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 상기 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역으로 구성되는 폴리펩티드를 충분한 거리로 이격시켜 각각의 폴리펩티드가 적합한 이차 및 삼차 구조로 폴딩되도록 할 수 있다. 예를 들어, 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, (Gly4-Ser)3 또는 Gly4-Ser-Gly5-Ser일 수 있다. 상기 링커는 상기 융합 단백질의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 불필요하거나, 또는 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 상기 혈관 내피 세포 성장인자 수용체-2와 혈관 내피 세포 성장인자 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역으로 구성되는 폴리펩티드는 상기 펩티드 링커의 존재 하에 순차적으로 결합될 수 있다.
또한, 펩티드 링커는 상기 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 연결될 수 있다. 특히, 상기 펩티드 링커가 상기 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단에 모두 연결되어 있는 경우, 상기 펩티드 링커는 각각 시스테인을 포함할 수 있으며, 각각의 시스테인 사이에 이황화결합이 일어나 상기 2개의 시스테인 사이에 상기 폴리펩티드가 존재할 수 있다.
상기 항체의 Fc 영역은 인간, 마우스, 토끼 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 동물로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 폴리펩티드 또는 이를 포함하는 융합단백질은 혈관 내피 세포 성장인자 수용체에 특이적으로 결합하여 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 것일 수 있다. 상기 결합의 저해는 예를 들어, 일 구체예에 따른 폴리펩티드 또는 이를 포함하는 융합 단백질이 상기 혈관 내피 세포 성장인자 수용체에 결합하여 상기 혈관 내피 세포 성장인자 수용체와의 결합 부위를 막음으로써 혈관 내피 세포 성장인자가 혈관 내피 세포 성장인자 수용체에 결합하지 못하도록 하는 것일 수 있다. 상기 결합의 저해는 상기 혈관 내피 세포 성장인자 수용체에 의한 세포 내 신호 전달을 막아 혈관 내피 세포 성장인자가 혈관 내피 세포 성장인자 수용체에 결합하여 발생하는 분자적 신호에 따른 반응, 예를 들어, 신생 혈관의 생성을 억제하도록 할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티 드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24 내지 서열번호 28의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 29 내지 서열번호 46의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역은 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 연결하는 링커를 더 포함하는 것일 수 있다.
용어 “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.
또 다른 양상은 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
다른 양상은 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역은 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 연결하는 링커를 더 포함하는 것일 수 있다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등과 같은 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등과 같은 파지 또는 SV40 등과 같은 바이러스를 조작하여 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터에서 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결된다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 프로모터 서열과 같은 뉴클레오티드 발현 조절 서열과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
상기 재조합 벡터는, 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는, 발현용 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pL λ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스 로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
또 다른 양상은 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 제공한다.
다른 양상은 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 제공한다.
상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역은 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 연결하는 링커를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 세포는 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 것인 세포일 수 있다.
즉, 상기 세포는 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 숙주 세포의 게놈 상에 포함하거나, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 포함된 재조 합 벡터를 포함하는 것이다.
상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 배양하는 단계 및 배양물로부터 발현된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
다른 양상은 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 배양하는 단계 및 배양물로부터 발현된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역은 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 연결하는 링커를 더 포함하는 것일 수 있다.
형질 전환된 세포의 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 형질 전환된 세포를 적절한 항생제가 포함된 LB 액상 배지에 접종하여 배양을 실시한 다음, 세포 밀도가 일정 수준에 도달한 시점에서 IPTG를 배지에 첨가하여 lacZ 프로모터에 의한 단백질 발현을 유도하고 배양함으로써, 세포 내 또는 배지로 분비된 단백질을 얻을 수 있다.
세포 내 또는 배지로 분비된 단백질은 당업계에 공지된 다양한 정제 방법에 따라 정제된 형태로 얻을 수 있다. 예를 들어, 암모늄 설페이트에 의한 용해도 분획화(solubility fractionation), 크기 분별 여과 및 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 정제 방법을 통하여 정제된 형태로 단백질을 얻을 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질이 GST에 융합된 경우에는 글루타티온이 결합된 레진 칼럼, 6x His에 융합된 경우에는 Ni2+-NTA His-결합 레진 칼럼을 이용하여 원하는 단백질을 용이하게 얻을 수 있다.
다른 양상은 약학적 유효량의 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역은 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 연결하는 링커를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 암의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 상기 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 암은, 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함한다. 상기 암은 예를 들어, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부 근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 간암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 간암 및 다양한 유형의 두경부암을 포함하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 조성물은 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 혈관 신생은 기존의 혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정으로, 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 비정상적으로 성장함으로써 질환이 야기될 수 있다. 상기 혈관신생으로 인한 질환은 예를 들면, 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 및 암의 침윤과 전이를 포함하나 이에 한정하지 않는다.
상기 조성물이 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 제조되는 경우, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 투여량은 예를 들면, 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량(pharmaceutically effective amount)"은 암을 예방 또는 치료하는 데, 또는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적 으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
다른 양상은 약학적 유효량의 상기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질; 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 동물의 혈관신생으로 인한 질환 또는 암 치료 방법을 제공한다.
상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역은 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 연결하는 링커를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 암 치료 방법에 사용되는 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명하였으므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
한편, 상기 혈관신생으로 인한 질환 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조 성물을 투여할 수 있는 개체는 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 인간 또는 개, 고양이, 마우스와 같은 인간을 제외한 동물일 수 있다.
일 구체예에 따른 폴리펩티드 또는 이를 포함하는 융합 단백질에 의하면, 혈관신생으로 인한 질환 또는 암을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: VEGF에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 스크리닝
(1) 바이오 패닝
혈관 내피 세포 성장인자(R&D systems)를 적절한 고형 표면(예를 들어, 플레이트)에 고정시킨 다음 파지 디스플레이 폴리펩티드 라이브러리(Dyax)를 첨가하여 결합시키고, 다양한 결합 시간 및 세척 조건을 통하여 높은 친화력으로 결합하는 폴리펩티드 발현 파지를 선별하였다.
패닝은 비드 패닝 방법을 사용하였다. 구체적으로, 스트렙트아비딘이 표면에 고정된 마그네틱 비드와 비오틴을 결합시킨 혈관 내피 세포 성장인자 항원을 혼합한 다음, 4℃에서 18 시간 동안 교반시켜 상기 항원을 비드 표면에 고정하였다. 상기 항원이 고정화된 마그네틱 비드를 탈지유(skim milk)로 상온에서 2 시간 동안 블로킹한 후, 상기 비드의 표면에 폴리펩티드를 디스플레이하고 있는 파지 용액을 넣어 주었다. 상기 결과물을 2 시간 동안 교반시키면서 반응시키고, PBS 용액 (1.06 mM KH2PO4, 155.17 mM NaCl, 2.97 mM Na2HPO4-7H2O)및 0.1%의 Tween 20이 포함된 PBS 용액을 이용하여 세척한 후, 상기 항원과 결합한 파지만을 분리하였다. 상기 패닝 과정은 패닝 후 얻어진 파지 수에 따라 2회 또는 3회까지 진행하였다.
(2) 파지 ELISA 및 혈관 내피 세포 성장인자와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 부분의 염기 서열 확인
상기 패닝 과정에서 얻어진 파지 클론들을 E.coli XL1-Blue에 각각 감염시킨 후, 37℃에서 14 시간 동안 배양하여 파지 용액을 얻었다. 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc)에 혈관 내피 세포 성장인자 항원을 첨가한 다음, 4℃에서 18 시간 동안 두어 상기 항원을 플레이트 표면에 고정하였다. 상기 항원이 고정된 플레이트를 탈지유로 상온에서 1 시간 동안 블로킹한 후, 100 ㎕의 파지 용액을 첨가하였다. 2 시간 동안 파지와 항원을 상온에서 반응시키고, 0.1%의 Tween 20이 포함된 PBS 용액을 이용하여 세척하였다. 이후, 파지에 특이적으로 반응하는 HRP가 컨쥬게이트된 항-M13 항체(GE Healthcare)를 첨가하여 상온에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 0.1%의 Tween 20이 포함된 PBS 용액으로 2회 세척하였다. 마지막으로 상기 플레이트 각 웰에 100 ㎕의 트리메틸벤지딘(trimethylbenzidine, TMB) 기질(Sigma)을 첨가하여 발색 반응을 유도시켰으며, 이후, 5 N의 H2SO4 용액 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices)로 측정하였다. 그 결과, 총 23개의 파지 클론이 혈관 내피 세포 성장인자 수용체와 높은 반응성을 갖 는 것으로 확인되었다. 상기 파지들의 단일 클론들로부터 상기 혈관 내피 세포 성장인자 수용체와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 부분의 염기 서열을 확인하기 위한 각각의 프라이머 세트(서열번호 47 및 서열번호 48; 서열번호 49 및 서열번호 50)를 사용하여 콜로니 PCR을 수행하였다. 각각의 프라이머는 Dyax 폴리펩티드 라이브러리의 기원(origin)에 따라 다르게 적용하였다. 예를 들어, 서열번호 47 및 서열번호 48은 파지에 디스플레이되는 폴리펩티드의 아미노산 서열이 8 또는 9개인 것을 확인하기 위한 프라이머이고, 서열번호 49 및 서열번호 50은 아미노산 서열이 10개인 것을 확인하기 위한 프라이머이다. PCR은 GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystem)를 사용하여 수행하였으며, PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 5분; 94℃에서 1분, 60℃에서 1분 및 72℃에서 1.5분의 연속 반응을 30회 반복; 72℃에서 10분; 4℃로 냉각. 이후, 상기 반응으로부터 얻어진 폴리뉴클레오티드 절편의 세정 및 염기 서열 분석(솔젠트)을 수행하였으며, 이로부터 상기 혈관 내피 세포 성장인자와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 부분의 염기 서열을 확인하였다(표 1). 하기 표 1은 상기 파지에 디스플레이된 폴리펩티드에서 펩티드 링커 부분을 제외한 부분, 즉, 혈관 내피 세포 성장인자와 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 부분의 아미노산 서열 및 그로부터 유추된 염기 서열을 나타낸다.
한편, 상기 혈관 내피 세포 성장인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드의 스크리닝 과정을 도 1에 개략적으로 나타내었다.
| 표식번호 | 아미노산 서열 | 염기 서열 |
| 55 | PRFEMWHDDK(서열번호 1) | cctcgttttgagatgtggcatgatgataag (서열번호 24) |
| 63 | PRLSMWQNME(서열번호 2) | cctcgtctttctatgtggcagaatatggag (서열번호 25) |
| 66 | DRFSMWKNLE(서열번호 3) | gatcgtttttctatgtggaagaatcttgag (서열번호 26) |
| 70 | SRFEMWNDIS(서열번호 4) | tctcgttttgagatgtggaatgatatttct (서열번호 27) |
| 80 | DRFTMWDSQS(서열번호 5) | aatcgtcttattatgcatacttctgagcag (서열번호 28) |
| 50 | QRDQQYKHMY(서열번호 6) | cagcgtgatcagcagtataagcatatgtat (서열번호 29) |
| 16 | DRYSQYQSPM(서열번호 7) | gatcgttattctcagtatcagtctcctatg (서열번호 30) |
| 52 | DFLKMYRDEK(서열번호 8) | gattttcttaagatgtatcgtgatgagaag (서열번호 31) |
| 56 | MHRPWPWDMF(서열번호 9) | atgcatcgtccttggccttgggatatgttt (서열번호 32) |
| 65 | QMDRMFPHVG(서열번호 10) | cagatggatcgtatgtttcctcatgttggt (서열번호 33) |
| 68 | PIGQRWNRLE(서열번호 11) | cctattggtcagcgttggaatcgtcttgag (서열번호 34) |
| 69 | RLFEMYPSLE(서열번호 12) | cgtctttttgagatgtatccttctcttgag (서열번호 35) |
| 73 | ERTEMFPSAS(서열번호 13) | gagcgtactgagatgtttccttctgcttct (서열번호 36) |
| 76 | QRDEMYPHLN(서열번호 14) | cagcgtgatgagatgtatcctcatcttaat (서열번호 37) |
| 78 | PHQEMWQFES(서열번호 15) | cctcatcaggagatgtggcagtttgagtct (서열번호 38) |
| 82 | MKSAMYHDIR(서열번호 16) | atgaagtctgctatgtatcatgatattcgt (서열번호 39) |
| 83 | FDKYYRDWFI(서열번호 17) | tttgataagtattatcgtgattggtttatt (서열번호 40) |
| 40 | RMGPFGTTH(서열번호 18) | cgtatgggtccttttggtactactcat (서열번호 41) |
| 42 | YRGVWGGYF(서열번호 19) | tatcgtggtgtttggggtggttatttt (서열번호 42) |
| 44 | HDYAFYSAW(서열번호 20) | catgattatgctttttattctgcttgg (서열번호 43) |
| 13 | EDYRFYSVW(서열번호 21) | gaggattatcgtttttattctgtttgg (서열번호 44) |
| 46 | TWWTHDFTI(서열번호 22) | actcgtcttcagattctttggggtgtt (서열번호 45) |
| 34 | YGYPWSGT(서열번호 23) | tatggttatccttggtctggtact (서열번호 46) |
상기 실시예 1에서 얻어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 인간 항체의 Fc 영역을 발현하는 벡터에 클로닝시켰다. 상기 클로닝에 사용한 벡터는 CMV 프로모터를 가지고 있으며, 인간 항체의 Fc 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로, 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 인간 항체의 Fc 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 위치에 연결되어, 상기 폴리펩티드가 인간 항체의 Fc 영역을 구성하는 폴리펩티드의 C-말단 부분에 발현되도록 클로닝하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 얻어진 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 벡터를 각각 NotⅠ(Roche)과 XbaⅠ(Roche)의 제한 효소를 처리한 후, 그 결과물을 T4 DNA 리가제(NEB)로 연결(ligation)시켜 원하는 폴리펩티드 영역이 포함된 융합 단백질(peptibody) 발현용 벡터를 제조하였다. 상기 제조한 재조합 벡터들을 HEK-293E 세포(한국생명공학연구원)에 트랜스펙션(transfection)시켰다. 상기 세포를 혈청을 넣지 않은 DMEM(Invitrogen)배지에서 배양 시키면서 3일 간격으로 총 4번 동안 배양액을 교환하였다. 원심분리를 통하여 상기 배양액 내에 잔류 하는 세포 및 불순물을 제거 한 후, 프로테인 A를 이용한 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 칼럼 (AKTAexplorer, GE Healthcare)을 이용하여 상기 배양액 내의 단백질을 정제하였다. 그 결과, 상기 정제된 단백질은 상기 표 1의 폴리펩티드가 인간의 Fc에 융합된 융합 단백질임을 확인할 수 있었다(도 2).
실시예
2: 융합 단백질의
VEGF
결합 능력 확인
실시예 1에서 제조된 융합 단백질이 혈관 내피 세포 성장인자 항원을 인지하는지 여부를 ELISA 방법을 이용하여 확인하였다. 이를 위하여 인간과 마우스 유래의 혈관 내피 세포 성장인자 (R&D Systems)를 한 웰당 각각 50 ㎕ (2 ㎍/㎖)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 실시예 1에서 제조된 융합 단백질을 각각 웰에 50 ng씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 0.05%의 Tween 20이 포함된 PBS 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 상기 웰에 HRP가 결합된 항-인간 Fc 항체(PIERCE)를 첨가하여 30분 동안 상온에서 반응시킨 다음, TBS-T 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응 정도는 ELISA 해독기(Molecular devices)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 혈관 내피 세포 성장인자에 실시예 2에서 제조한 융합 단백질이 결합되는지 여부를 판독하였다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 융합 단백질은 마우스 및/또는 인간 유래의 혈관 내피 세포 성장인자 항원에 대하여 우수한 결합력을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예
3: 융합 단백질의
VEGF
-
VEGFR
사이의 결합 저해 능력 확인
혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합 저해 능력을 측정하기 위해서 경쟁적 ELISA 방법을 사용하였다.
0.5 ㎍/㎖의 마우스 유래 혈관 내피 세포 성장인자(R&D Systems)를 각각 96-웰 MaxiSorpTM 플랫-바텀 플레이트(Nunc)에 고정시키고, 0.1%의 Tween-20이 포함된 PBS로 플레이트를 5회 세척한 다음, 5% BSA가 포함된 PBS로 상온에서 2 시간 동안 블로킹시켰다. 웰에 각각 0.0625 ㎍/㎖, 0.625 ㎍/㎖, 6.25 ㎍/㎖, 31.5 ㎍/㎖, 62.5 ㎍/㎖의 농도의 상기 실시예 2에서 제조한 융합 단백질 100 ㎕를 넣고, 플레이트를 상온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이후, 1 ㎍/㎖의 혈관 내피 세포 성장인자 수용체(R&D Systems)를 상기 웰에 넣고, 플레이트를 상온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 상기 플레이트를 0.1%의 Tween-20이 포함된 PBS로 5회 세척하고, 항-VEGFR 마우스 항체 (R&D systems)를 1%의 BSA가 포함된 PBS에 1:5,000의 비율로 희석하여 상온에서 1 시간 동안 반응시켰다. 상기 플레이트 각각의 웰에 1%의 BSA가 포함된 PBS에 1:5,000 비율로 희석시킨 100 ㎕의 고트 항-마우스-IgG-HRP(Pierce)를 첨가하여 상온에서 30분 동안 반응시킨 다음, 다시 0.1%의 Tween-20이 포함된 PBS로 5회 세척하였다. 마지막으로 플레이트 각 웰에 100 ㎕의 트리메틸벤지딘(trimethylbenzidine, TMB)(Sigma)을 첨가하여 발색 반응을 유도시켰으며, 이후, 5N의 H2SO4 용액 50 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices)로 측정하였다.
도 5에서 나타난 바와 같이, 표 1에 개시된 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질은 혈관 내피 세포 성장인자와 그 수용체 사이의 결합을 저해하는 효과가 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 이러한 결합의 저해 정도는 첨가한 융합 단백질의 양에 의존한 것으로 보아, 상기 결합의 저해는 상기 융합 단백질에 의해 일어난 것임을 확인할 수 있었다.
도 1은 일 구체예에 따른 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드의 스크리닝 과정을 개략적으로 나타낸다.
도 2는 일 구체예에 따른 폴리펩티드 및 인간의 Fc 융합 단백질을 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 일 구체예에 따른 융합 단백질과 마우스 및/또는 인간 유래의 혈관 내피 세포 성장인자 항원 사이의 결합력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 일 구체예에 따른 융합 단백질과 마우스 및/또는 인간 유래의 혈관 내피 세포 성장인자 항원 사이의 결합력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 일 구체예에 따른 융합 단백질의 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합 저해 능력을 측정한 경쟁적 ELISA 결과를 나타내는 그래프이다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd
<120> Polypeptide binding specifically to vascular endothelial cell
growth factor, fusion protein comprising thereof and method for
preparation thereof
<160> 50
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
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<213> Artificial Sequence
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<223> TN8,9-forward primer
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Claims (21)
- 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드:일반식 IX1-Arg-X2-X3-Met-Trp-X4-X5-X6-X7상기 X1, X4, X6 및 X7은 각각 독립적으로, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp, Glu, Arg, His 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X2는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며, X3 및 X5는 각각 독립적으로, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp 및 Glu으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리펩티드.
- 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 혈관 내피 세포 성장인자의 혈관 내피 세포 성장인자 수용체가 결합하는 부위에 특이적으로 결합하는 것인 폴리펩티드.
- 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질:일반식 IX1-Arg-X2-X3-Met-Trp-X4-X5-X6-X7상기 X1, X4, X6 및 X7은 각각 독립적으로, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp, Glu, Arg, His 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X2는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며, X3 및 X5는 각각 독립적으로, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp 및 Glu으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
- 제5항에 있어서, 상기 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 아미 노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 융합 단백질.
- 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질.
- 제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역은 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 연결하는 링커를 더 포함하는 것인 융합 단백질.
- 제5항 또는 제7항에 있어서, 상기 항체의 Fc 영역은 인간, 마우스, 토끼 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택되는 동물로부터 유래된 것인 융합 단백질.
- 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드:일반식 IX1-Arg-X2-X3-Met-Trp-X4-X5-X6-X7상기 X1, X4, X6 및 X7은 각각 독립적으로, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp, Glu, Arg, His 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X2는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며, X3 및 X5는 각각 독립적으로, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp 및 Glu으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
- 제10항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 24 내지 서열번호 28의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제12항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 29 내지 서열번호 46의 염기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 폴리뉴클레오티드.
- 제10항 또는 제12항에 있어서, 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역은 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 연결하는 링커를 더 포함하는 것인 폴리뉴클레오 티드.
- 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터:일반식 IX1-Arg-X2-X3-Met-Trp-X4-X5-X6-X7상기 X1, X4, X6 및 X7은 각각 독립적으로, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp, Glu, Arg, His 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X2는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며, X3 및 X5는 각각 독립적으로, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp 및 Glu으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
- 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 적으로 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
- 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역은 상기 폴리펩티드 및 항체의 Fc 영역을 연결하는 링커를 더 포함하는 것인 재조합 벡터.
- 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포:일반식 IX1-Arg-X2-X3-Met-Trp-X4-X5-X6-X7상기 X1, X4, X6 및 X7은 각각 독립적으로, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp, Glu, Arg, His 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X2는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며, X3 및 X5는 각각 독립적으로, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp 및 Glu으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
- 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택 되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포.
- 하기 일반식 I로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 배양하는 단계 및 배양물로부터 발현된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법:일반식 IX1-Arg-X2-X3-Met-Trp-X4-X5-X6-X7상기 X1, X4, X6 및 X7은 각각 독립적으로, Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp, Glu, Arg, His 및 Lys로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이고, X2는 Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며, X3 및 X5는 각각 독립적으로, Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Try, Asp 및 Glu으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이다.
- 서열번호 6 내지 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택 되는 하나의 폴리펩티드를 포함하는 혈관 내피 세포 성장인자와 혈관 내피 세포 성장인자 수용체 사이의 결합을 저해하는 폴리펩티드; 및 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포를 배양하는 단계 및 배양물로부터 발현된 단백질을 수득하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법.
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