KR20110070588A - 벼흰잎마름병 진단용 피씨알 키트 및 이를 이용한 벼흰잎마름병의 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 두 쌍의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병 진단용 PCR 키트에 관한 것이다.

5‘-CGGTCTGCTCAATGAGGAAGA-3’ : Xoo-phage F1

5‘-TGCAATTGGTGTTCTCCAGG-3’ : Xoo-phage R1

5‘-GTCATAGGTGAGGCTTCCC-3’ : Xoo-tnp F1

5‘-AGTGCGATCTTTCAGCAGG-3’ : Xoo-tnp R1

본 발명에 따르면 벼 흰잎마름병균만 특이적으로 초기 발병시 진단할 수 있으며, 농수로의 물에서 병원균 밀도를 PCR cycle 수를 이용하여 간접적으로 확인할 수 있어 병 발생 전후에 병 방제 및 확산의 억제에 유용하다.

Description

벼흰잎마름병 진단용 피씨알 키트 및 이를 이용한 벼흰잎마름병의 진단 방법{PCR kits and Dignosing method for Bacterial blight}

본 발명은 하기 두 쌍의 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병 진단용 PCR 키트에 관한 것이다.

5‘-CGGTCTGCTCAATGAGGAAGA-3’ : Xoo-phage F1

5‘-TGCAATTGGTGTTCTCCAGG-3’ : Xoo-phage R1

5‘-GTCATAGGTGAGGCTTCCC-3’ : Xoo-tnp F1

5‘-AGTGCGATCTTTCAGCAGG-3’ : Xoo-tnp R1

벼의 흰잎마름병(白葉枯病, Bacterial blight)은 벼흰잎마름병원균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae)이 월동기간 동안 기주식물로 알려진 겨풀, 나도겨풀 등의 땅속줄기 또는 뿌리주위나 병든 볏짚, 벼 그루터기에 잠복해 있다가 관개수에 의해 논으로 이동한 후, 벼잎의 물구멍과 공기구멍 부위, 절단된 뿌리 등에 침입하여 벼에 감염되고, 감염된 벼에서 증식하여 2차로 전염되는 것에 의해 7월초~수확기, 특히 7월 상순~8월 중순에 발병하는 병해로, 최종적으로 벼가 말라 죽게 되어 수확량의 감소를 초래하므로 농가에 피해가 크다.

따라서, 종래에는 이러한 벼의 흰잎마름병을 예방 및 방제하기 위하여 저수지나 관계수로에 있는 병원균의 기주식물을 제거하는 방법; 질소질 비료의 사용량이 많으면 질소질 비료에 의해 벼가 감수성으로 되어 흰잎마름병의 발병이 촉진되므로, 질소질 비료의 사용량을 조절하는 방법; 벼가 물에 잠기지 않도록 하고, 만약 잠기게 되면 최대한 빨리 물을 빼주어 침수시간을 짧게 하여 병원균과의 접촉을 차단하여 병의 전염을 방지하는 방법; 약제를 사용한 방법 등을 사용하여 왔다.

그러나, 상기한 방법들은 그 효과가 매우 미미한 실정이다. 특히 약제방제법은 벼흰잎마름병원균이 벼의 도관내에서 증식하여 병징을 나타내기 때문에 그 효과가 매우 낮은 문제점이 있었다. 따라서, 벼흰잎마름병원균을 조기에 발견하여 미연에 벼의 흰잎마름병을 예방 또는 방제하여 농가의 피해를 최소화할 수 있는 새로운 방제방법의 개발이 필요하였지만, 현재는 벼흰잎마름병원균의 검출을 위해서 선택배지를 이용하거나 병원균의 생리, 생화학적 특성의 검정을 수행하는 방법에 의해 검정하거나, 또는 병이 어느 정도 진행된 상태에서 육안으로 병을 인지하여 왔을 뿐이다.

그러나, 병원균의 생리, 생화학적 특성을 이용하는 방법은 병원균의 분리 및 배양에 장시간이 소요되고 분리균의 농도가 상당히 높은 상태(10³CFU 이상)에서만 진단이 가능하며, 유사한 생리적 특성으로 인하여 동일한 속(Xanthomonas) 또는 동일한 종(Xanthomonas oryzae) 내의 여러 비병원성 아종들과의 관계에서 정확한 동정이 매우 어렵기 때문에 전문적인 분류학자를 통해서만 분리가 가능한 문제점이 있고, 육안으로 관찰하는 방법은 병을 조기에 진단할 수 없다는 문제점이 있었다.

한편, 항체반응을 이용한 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 진단법을 이용하여 검출하는 방법도 이용되었는데, 이 방법은 검출 감도가 높은 것임에도 불구하고 절차가 복잡하고 고가의 분석비용이 요구되며, 시간이 많이 소요되는 동정방법이라는 문제점이 있었다.

따라서, 본 발명자들은 최근의 분자생물학적 기법의 발전에 의하여 유전자(DNA) 수준에서 생물종을 식별하는 방법을 이용하여 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하고자 하였다.

일반적으로, 유전자 수준에서 생물종을 식별하는 방법으로 가장 광범위하게 사용되고 있는 방법은 핵산지문법(DNA fingerprinting)이다. 이 방법은 다시, 제한효소단편장다형(RFLP; Restriction Fragment Length Polymorphism) 분석법, 라이보좀 구성 핵산 염기서열의 차이를 이용한 방법, 특정 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction) 진단법 등으로 구분된다. PCR법은 10~20mer로 구성된 특정 DNA 단편(프라이머)을 세균의 게놈유전자(genomic DNA)에 접촉(annealing)한 후, 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase)를 첨가하고 합성반응을 반복적으로 행하게 되면, 프라이머가 결합된 영역이 급속히 증폭하게 되며, 그 PCR 증폭산물을 아가로스젤(agarose gel) 또는 아크릴아마이드젤(acrylamide gel)에 전기영동하고 에티디움브로마이드(ethidium bromide) 및 은염색(silver stain)으로 DNA를 염색한 후 나타나는 DNA 밴드의 유무 혹은 형태의 차이와 같은 세균종의 DNA 다형성을 검출 진단하는 방법이다. 현재, 이러한 PCR에 의한 세균의 진단법은 인체 나 동물의 세균성 질병을 진단하는데 이용되고 있는데, 식중독 관련 병원성 세균인 대장균, 콜레라균 등의 검출용 PCR 진단 키트들이 개발되어 있다. 또한 외국의 경우는 식물 병원균에 대해서도 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)를 비롯한 다양한 병원균에 대한 PCR 진단법이 개발되어 병의 진단과 함께 수출입 농산물의 검역에 이용되고 있다.

더구나, PCR 진단에 소요되는 시간은 다른 진단방법에 비해 매우 짧아 6시간 이내에 완료되고, 진단에 소요되는 비용 또한 저렴할 뿐 아니라 많은 샘플을 동시에 검정할 수 있어 경제적이므로, 본 발명에서도 핵산지문법 중 PCR 공정을 이용하

여 벼의 벼흰잎마름병원균을 조기에 진단하여 농가의 피해를 최소화하고자 하였다.

본 발명은 PCR을 이용하여 병 의심 증상에서 병원균의 분리 및 배양하는 과정 없이 병이 의심되는 잎에서 병의 유무를 정확하게 판단하고, 병원균의 밀도를 간접적으로 측정할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 하기 두 쌍의 프라이머 세트를 포함하는 벼흰잎마름병 진단용 PCR 키트를 제공한다.

5‘-CGGTCTGCTCAATGAGGAAGA-3’ : Xoo-phage F1(서열번호 3)

5‘-TGCAATTGGTGTTCTCCAGG-3’ : Xoo-phage R1(서열번호 4)

5‘-GTCATAGGTGAGGCTTCCC-3’ : Xoo-tnp F1(서열번호 5)

5‘-AGTGCGATCTTTCAGCAGG-3’ : Xoo-tnp R1(서열번호 6)

한편 본 발명은, 벼 검체를 분리하여 증류수에 마쇄하는 단계; 마쇄된 액체와 청구항 1의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; 및 PCR 증폭결과로부터 청구항 1의 특이 DNA 단편의 존재여부를 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼의 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 농수로물과 청구항 1의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하는 단계; 및 PCR 증폭결과로부터 청구항 1의 특이 DNA 단편의 존재 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 벼흰잎마름병원균의 밀도 측정 방법을 제공 한다.

본 발명에 따르면 벼 흰잎마름병균만 특이적으로 초기 발병시 진단할 수 있으며, 농수로의 물에서 병원균 밀도를 PCR cycle 수를 이용하여 간접적으로 확인할 수 있어 병 발생 전후에 병 방제 및 확산의 억제에 유용하게 활용될 것이다.

1. Xoo_Duplex primer의 염기서열 :

벼흰잎마름병 유전체 정보를 이용하여 primer의 염기서열을 제작하였다. Duplex primer의 염기서열에 사용된 유전자는 phage-related integrase(서열번호 1)와 transposase(서열번호 2) 유전자로 벼흰잎마름병균만 가지고 있는 특이 유전자로 이들 유전자에서 각각 1쌍씩 선발하였다.

표1. Xoo_Duplex primer의 염기서열

프라이머 명	염기서열	증폭크기	유전자
Xoo-phage F1	TGCAATTGGTGTTCTCCAGG	401	Phagease
Xoo-phage R1	CGGTCTGCTCAATGAGGAAGA		Phagease
Xoo-tnp F1	GTCATAGGTGAGGCTTCCC	492	tnp
Xoo-tnp R1	AGTGCGATCTTTCAGCAGG		tnp

2. Xoo_Duplex primer의 PCR 조건 및 특이성 검정 :

선발된 primer의 농도는 각각 4pmol로 하였으며 kit의 최종량은 20㎕로 조정하였다. PCR 증폭 조건은 초기 Denaturation 94℃ 4분을 실시하였고, Denaturation 94℃ 15초, Annealing 63℃ 15초, Extention 72℃ 30초를 36 cycle을 실시하였고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시켰다. 본 kit의 특이성을 확인하기 위하여 벼흰잎마름병균 6, 유사세균 26종 및 벼 주요재배 26품종의 DNA를 검정한 결과 벼흰잎 마름병균만 검출되는 것을 확인하였다.

표2. 벼흰잎마름병균 검출을 위한 Xoo_Duplex primer의 PCR조건

step	온도	시간	Cycle
1	94℃	4분	1
2	94℃	15초
	63℃	15초	35
	72℃	30초
3	72℃	5분	1
4	4℃	forever	1

표3. 벼흰잎마름병 정밀진단을 위한 Xoo_Duplex primer의 특이성 검정 결과

균주번호	균 주 명	증폭결과	비 고
HB01009	Xanthomoans oryzae pv. oryzae	+	K3a 레이스
HB01013	X. oryzae pv. oryzae	+	K1 레이스
Kacc10331	X. oryzae pv. oryzae	+	K1 레이스
HB01015	X. oryzae pv. oryzae	+	K3 레이스
HB03011	X. oryzae pv. oryzae	+	-
HB01014	X. oryzae pv. oryzae	+	K2 레이스
	Escherichia coli	-
	Agrobacterim	-
KACC10408	Pseudomonas caratovora subsp. cartovorum	-
KACC10477	P. atrosepticum	-
KACC10192	P. putida	-
KACC10292	P. syringae	-
KACC10447	P. savastanoi pv. phaeolicola	-
KACC10751	P. savastanoi pv. savastanoi	-
KACC10466	P. marginalis pv. marginalis	-
KACC10162	Acidovorax avenae subsp. avenae	-
KACC10161	X. axonopodis pv. aurantifolii	-
KACC12874	X. axonopodis pv. malvacearum	-
KACC12869	X. axonopodis pv. begoniae	-
KACC12122	X. axonopodis pv. begoniae	-
KACC12870	X. axonopodis pv. vesicatoria	-
KACC12867	X. axonopodis pv. dieffenbachiae	-
KACC10935	X. axonopodis pv. axonopodis	-
KACC11119	X. axonopodis pv. alfalfae	-
KACC10315	X. axonopodis pv. citri	-
KACC10559	X. axonopodis pv. phaseoli	-
KACC10060	Ewinia amylovora	-
KACC10695	Rastonia solanacearum	-
KACC10535	Dickeya paradisiaca	-

표4. 벼 주요품종에 대한 Xoo_Duplex primer의 특이성 검정 결과

품 종 명	증폭결과	품 종 명	증폭결과
운 광 벼	-	소 비 벼	-
황 금 보 라	-	동 안 벼	-
새 누 리	-	신 동 진 벼	-
황 금 노 들	-	호 품 벼	-
만 나 벼	-	동 진 벼	-
보 석 찰	-	동 진 1호	-
신 선 찰	-	호 평 벼	-
눈 보 라	-	온 누 리	-
강 백 벼	-	황 금 누 리	-
다 미	-	남 평 벼	-
해 찬 물 결	-	흑 향 벼	-
한 마 음	-	흑 남 벼	-
동 진 찰	-	일 미 벼	-
동 진 2호	-	주 남 벼	-
새 계 화	-

3. PCR Cycle를 이용하여 벼흰잎마름병원세균 밀도측정 :

PCR에서 DNA의 증폭은 Cycle 수에 따라서 대수로 증폭된다. 이러한 원리를 이용하여 PCR cycle 횟수를 조정하면 일정한 DNA의 농도나 세균의 밀도를 측정하 수 있을 것으로 판단하였다. 따라서 본 발명에서는 PCR Cycle 횟수를 조절하여 병원세균의 밀도를 간접적으로 측정하는 방법을 고안하였다.

본 발명에 따른 키트와 PCR Cycle 수별 병원세균의 검출 한계를 조사한 결과 20 Cycle에서는 3.5×10⁷cfu/㎖, 30 Cycle에서는 3.5×10⁵cfu/㎖까지 검출되어 간접적으로 병원균의 밀도를 측정할 수 있어 병의 예찰에 활용이 가능할 것이다.

병원균의 밀도 측정은 시료의 OD(600λ)를 0.1로 조정하여 배지에 출현하는 Colony 수로 정하였다. 하기 표5는 희석 배수에 따른 병원균의 수를 나타낸다.

표5. OD(600λ) 0.1 값에 의한 벼흰잎마름병원세균 밀도 설정

희석배수	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7	10-8
세균 수 (cfu/㎖)	3.5×108	3.5×107	3.5×106	3.5×105	3.5×104	3.5×103	3.5×102	3.5×101

이와 같은 방법을 이용하여 농수로물에 OD(600λ) 0.1로 조정된 병원세균을 10배씩 희석 후 10,000rpm으로 원심분리하여 수거된 병원세균을 멸균 증류수로 10^-1으로 다시 희석하여 하여 PCR을 실시한 결과 동일한 결과를 얻었다.

상기와 같은 동일한 방법으로 병 발생이 심한 익산 함열 삼기, 김제 월촌과 병 발생이 없는 김제 부량지역에서 농수로물을 채취하여 병원균을 검정한 결과 병 발생이 심했던 지역에서는 모두 병원균의 검출이 확인되었고, 병 발생이 없었던 김제 부량에서는 병원균 검출이 되지 않음을 확인하였다.

도 1은 Xoo_Duplex primer의 벼흰잎마름병균 검출 특이성을 확인하는 유전자 증폭한 결과이다.

※ A : M; Maker, 1～6; Xoo DNA, 7～8; DW

B : M; Maker, 1～2; Xoo DNA, 3; DW, 4; Escherichia coli, 5; Agrobacterim, 6; Pectobacterium caratovora subsp. cartovorum, 7; P. atrosepticum, 8; p. putida, 9; P. syringae, 10; P. savastanoi pv. phaeolicola, 11; P. savastanoi pv. savastanoi, 12; P. marginalis pv. marginalis.

C : M; DNA 크기 마커, 1; 운광벼, 2; 황금보라, 3; 새누리, 4; 황금노들, 5; 만나벼, 6; 보석찰, 7; 신선찰, 8; 눈보라, 9; 강백벼, 10; 다미, 11; 해찬물결; 12; 한마음, 13; 동진찰, 14; 동진2호; 15; 새계화; 16; 소비벼;, 17; 동안벼; 18; 신동진벼, 19; 호품벼; 20; 동진벼, 21; 동진1호, 22; 호평벼, 23, 온누리; 24; 황금누리, 25; 남평벼, 26; 흑향벼, 27; 흑남벼, 28; 일미벼, 29; 주남벼, 31～31; 증류수, 32～33; 벼흰잎마름병균(Xoo)

도 2는 벼잎에서 벼흰잎마름병균을 분리 배양하는 단계를 거치지 않고 증류수 500㎕에 1×1㎝의 크기로 자른 벼잎을 넣어 마쇄하여 유전자를 증폭하여 벼 흰잎마름병균을 검출하는 순서와 결과이다.

M : DNA 크기 마커, 1～12 : 벼흰잎마름병 의심 벼잎, 13～14 : 벼흰잎마름병균 표준 DNA(양성반응), 15～16 : 건전한 벼잎(음성반응)

도 3은 PCR Cycle 수를 이용하여 벼흰잎마름병원세균의 밀도를 간접적으로 확인 한 결과로 Cycle 수에 따라서 증폭되는 밀도가 달라지고 있는 그림이다.

M; DNA 크기 마커, 1; 3.5×108cfu/㎖, 2; 3.5×107cfu/㎖, 3; 3.5×106cfu/㎖, 4; 3.5×105cfu/㎖, 5; 3.5×104cfu/㎖, 6; 3.5×103cfu/㎖, 7; 3.5×102cfu/㎖, 8; 3.5×101cfu/㎖, 9; 증류수

도 4은 병 발생 심한지역과 발생이 없는 지역의 농수로물을 채취하여 병원균을 검출한 결과로 병발생이 없는 지역에서는 병원균 검출이 없었으나 병 발생이 심한 지역에서는 병원균을 검출한 그림이다.

(농수로물 그림)

M; DNA 크기 마커, (1, 5, 9); 논물 100농도, (2, 6, 10); 논물 10-1농도, (3, 7, 11); 논물 10-2농도, (4, 8, 12); 논물 10-3농도

(양성 및 음성 대조 그림)

M; DNA 크기 마커, (1, 5, 9); DNA 10ng, (2, 6, 10); DNA 1ng, (3, 4, 7, 8, 11, 12); D.W

<110> Rural development department(KOREA) <120> PCR kits and Dignosing method for Bacterial blight <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1275 <212> DNA <213> Xanthomonas oryzae pv. oryzae phage-related integrase <400> 1 tcagcgccgt cgtggaggtt tcacgaccgg taactcgtgg tcgtaacgat ctgtcatcga 60 cgacgagacg tgcccagctg catcttgctt atcgcctcga ttgccctcgg tgtcggtaac 120 gccccgatgc ttcaaaccat gtagtgagaa gcgctcctca gacttgatca cgccatcgcg 180 tattgccgca gggatgaatc gctgccatgc gctgtcgagt gacgacttga caatcggatt 240 gccggtctgc tcaatgagga agaagcgttc ttccggcttc attggtatcg gaaagttgcg 300 gccaggcttg ttgcagattt ctgatcggcg agccagcaac gcctcccatg cttccgtcat 360 gtgggcgtcc cacgtggtga gtgtgtcgcg cgatcccttt ctacgtgacg cgtgcacgcc 420 gtgttctagc cgatgtgcgt cagtgagtga gcaaacttcg ataccgcgca gcctggcgct 480 gtatgccagc accatgactg gggggagata gctgggaaag ctacctttgg tgtgaggctt 540 taaagcgccg cgctcgcggg cgaactgtag aacagcctcg aacgcatcag gcgtaggcat 600 cctgaaggcc ttagcctcct tcgcctggag aacaccaatt gcaggattct ccttgcagta 660 gccatggcgc accccccacg cgagtgttcg ccggaggtag cgatacagat gattggcctt 720 gctaggcgtt ggaggaagcg cctgctgcag gcgagtagcc ggtctcccgt ttgcaaaggt 780 ctcaagcagc cgctgcacca cgggcgtagt gatgtgttcc aactgcacac caccgagctt 840 ggacccatcc ttgcggacat agttggcaag cgtatcagcg tagcgtcggt aatccttctg 900 cgtgtcatgc tgtagttcct taaattcgct cgcttcgtgg aaacggtcga agaggtaacg 960 cagcgtgcca cgcacgtccc ctcgtagtcg agattctgcg attgcatgga gttcagagag 1020 acgagcactt cgaaaggcga ccgtacgctt cacttgtcgg ccaccgtccg gatggtcttc 1080 atgcatgtac cagcggccgt tctcccagta gatgccttta gggagcgcct cctgctcgat 1140 gtgacctgga atattcgggt tgaacctccg tttacgtccc cgcgccatca gatgagatcc 1200 tcgtcttggt gctgttcttg atttgctgca gtgacaaggc caagagatgc gtttatcgca 1260 tccaacgttg tccat 1275 <210> 2 <211> 1026 <212> DNA <213> Xanthomonas oryzae pv. oryzae transposase <400> 2 tcaacttgca agtgcaacac gtgagttgaa ttgagcgatc tcttcttcca gcgcctggtt 60 tggggtcttc cagccaagcg tctgccgtgg ccgggcgttc atcaggtcgg cgacgttgtt 120 gagatactcc tggctggcct tggacaagtc cacgcctttg ggcatgaact ggcacagcag 180 gccgttggtg ttctcattgc tgccgcgctg ccagggcgca tgtggatcgg cgaaccacag 240 gtcgatgttg agccgcttca tcagctctgg ataacacgtc atctcggttc cacggtcata 300 ggtgaggctt cccagcaggc aatgcggcag cttcttcatc tgtcgcgtga agccctccag 360 cgcatcctgt ggagtacagc catccatctt gcacagcacc acaaagcgcg tctttcgctc 420 caccagcgtg cctacgcacg agcggttgaa agcccctttg atcaggtcgc cttcccagtg 480 cccaggaatc aagcgctgcg ccacctcttc aggccgatgg acgatacgca gctcctccgg 540 cacccacgtg cgcttggcag cggtcgtacg gcgcaagccg cgcgtcggct tgtgctgacg 600 aagcgcttcc acgagctcct tcttcaaacc accacgcgga tgcgtgtaga tagcggtgta 660 gattgtttcg tggctcacgc gttgacttgg atcatccgga tgcatggcct tgagcttggc 720 agcaatttgc tggggcgacc aacgatatag aaccaagtcg tcacgcacct gctgaaagat 780 cgcactgcct tcaacaagcc ggcgccttcg aacgcaggcc ctgcggcgca gccgatagtt 840 gctggctgcg ctggttgccg catagccagg tgcgccctgt cgccgtatct cgcgcgacag 900 cgtgcacgca ttgcgattga gtcgccttgc aatggagttg atgctcattc cgacagttac 960 cgagttcgat ttgaagcaaa gcgcgttctt cggaatccag gggtctgtac tgtttgccca 1020 tgccac 1026 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Xoo-phage F1 <400> 3 cggtctgctc aatgaggaag a 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Xoo-phage R1 <400> 4 tgcaattggt gttctccagg 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Xoo-tnp F1 <400> 5 gtcataggtg aggcttccc 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Xoo-tnp R1 <400> 6 agtgcgatct ttcagcagg 19

Claims (3)

1. 하기 두 쌍의 프라이머 세트를 포함하는 벼흰잎마름병 진단용 PCR 키트.

   5‘-CGGTCTGCTCAATGAGGAAGA-3’ : Xoo-phage F1(서열번호 3)

   5‘-TGCAATTGGTGTTCTCCAGG-3’ : Xoo-phage R1(서열번호 4)

   5‘-GTCATAGGTGAGGCTTCCC-3’ : Xoo-tnp F1(서열번호 5)

   5‘-AGTGCGATCTTTCAGCAGG-3’ : Xoo-tnp R1(서열번호 6)
2. 프라이머를 이용한 PCR(polymerase chain reaction) 진단법으로서,

   벼 검체를 분리하여 증류수에 마쇄하는 단계;

   상기 벼 검체가 마쇄된 액체에 청구항 1의 프라이머 세트를 접촉시켜 PCR 반응을 통해 증폭하는 단계; 및

   상기 PCR 증폭결과로부터 청구항 1의 특이 DNA 단편의 존재 여부를 확인하는 단계;를 포함하는 벼의 벼흰잎마름병원균의 감염여부를 진단하는 방법.
3. 농수로 물에 청구항 1의 프라이머 세트를 접촉시켜 PCR 반응을 통해 증폭하는 단계;

   상기 PCR 증폭결과물의 흡광도(OD)를 0.1로 조정하여 희석한 후 배지에 접종하고, 출현하는 Colony 수를 하기 표와 대조하여 농수로의 벼흰잎마름병원균의 밀 도를 측정하는 방법.

   희석배수 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 10^-8 세균 수
   (cfu/㎖) 3.5×10⁸ 3.5×10⁷ 3.5×10⁶ 3.5×10⁵ 3.5×10⁴ 3.5×10³ 3.5×10² 3.5×10¹

Images