KR20110069859A

KR20110069859A - 점막 면역력 생성을 위한 경구 백신

Info

Publication number: KR20110069859A
Application number: KR1020117010631A
Authority: KR
Inventors: 프랭크 이. 알드웰; 케네스 더블유. 비글리
Original assignee: 이뮨 솔루션즈 리미티드
Priority date: 2008-10-08
Filing date: 2009-10-07
Publication date: 2011-06-23
Also published as: JP2012505197A; WO2010041143A3; AU2009302111A1; WO2010041143A2; US20120135039A1; CN102176907A; EP2344152A4; CA2737684A1; EP2344152A2

Abstract

본 발명의 실시 상태는 다양한 박테리아 감염에 대한 백신접종 대상 동물의 점막 면역 반응을 향상시키기 위한, 경구 또는 위장 투여에 유용한 지질계 면역원성 조성물(보조제 또는 담체)를 포함한다. 특정 실시 상태에서, 본 발명의 지질 조성물은 각기 다른 사슬 길이를 가지는 지방산 혼합물을 함유하고, 이로써 필요한 물리-화학적 특성을 제공한다. 박테리아 항원을 지질계 보조제 또는 담체와 혼합하는 경우, 결과 조성물은 향상된 점막 면역 반응을 이끌어내고 이로써 클라미디아 또는 헬리코박터에 의하여 야기되는 감염 또는 질환의 후유증을 감소시킨다.

Description

점막 면역력 생성을 위한 경구 백신{ORAL VACCINES FOR PRODUCING MUCOSAL IMMUNITY}

우선권 주장

본 PCT 국제 특허 출원은, 발명자 Frank E. Aldwell 및 Kenneth W. Beagley로 2008년 10월 8일에 출원된, "면역성 조성물"이라는 제목의 미국 가출원 번호: 61/195,631호, 발명자 Frank E. Aldwell 및 Kenneth W. Beagley로 2008년 10월 10일 출원된, "면역 반응을 위한 보조제"라는 제목의 미국 가출원 번호: 61/295,882호에 대한 우선권을 주장한다. 이들 출원은 양자 모두 참고 문헌으로 전체가 본 명세서에 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 저장, 투여하기에 적합하고 항원 또는 면역원의 면역원성을 향상시키기에 적합한, 백신에 사용되는 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 박테리아 항원에 대한 면역 반응을 향상시키기에 유용한 지질계 보조제 또는 담체에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 클라미디아 및 헬리코박터에 의하여 야기되는 감염에 대한 향상된 면역 반응을 제공하기 위한, 특정 지질 성분을 갖는 지질계 보조제 또는 담체 및 이들의 용도에 관한 것이다.

점막 표면에 침입하는 많은 수의 감염성 병원체는 감염 및 질병이라는 결과를 낳는다. 전 세계 인간과 동물 양자 모두에게 영향을 미치는 두 가지 중대한 점막 병원체가 클라미디아와 헬리코박터이다. 세계 보건 기구(WHO)는 1999년에 전세계적으로 9천 2백만 건의 클라미디아에 의한 새로운 생식기 감염이 있었고 그 발생의 정도가 선진국 및 개발도상국 모두에서 계속하여 증가하고 있다고 추정하였다(KW, Timms P. Journal of Reproductive Immunology 2000; 48(1 ):47-68). 헬리 코박터는 세계 인구의 50%가 감염되었다고 여겨지며 일부 개발도상국에서는 90%를 초과하는 비율로 감염되었다(Del Giudice, G., et al., Annu Rev Immunol, 2001. 19: p. 523-63; Frenck, R. W., Jr. and J. Clemens, Microbes Infect, 2003. 5(8): p. 705-13).

클라미디아

클라미디아 속의 하나로 시각장애 트라코마, 골반염질환, 자궁외임신, 및 난관성 불임, 간질 폐렴, 및 죽경화증, 다발경화증, 성인기 천식 및 알츠하이머병 등의 만성 질환과 같은 심각한 합병증이 동반되는 많은 안구, 생식기 및 호흡기 질환의 원인이 된다.

클라미디아 트라코마티스 및 씨. 뉴모니아에는 다양한 점막을 감염하여 골반염질환(PID), 불임, 맹증, 호흡기 질환, 죽경화증 및 천식의 악화라는 결과를 낳는 트라코마 등 수많은 질병을 야기한다 (Faal, N., et al., PLoS Med, 2006.3(8): p. e266; Mabey, D. and R. Peeling, Sexually transmitted infections, 2002. 78(2): p. 90-2; Hansbro, P.M., et al., Pharmacol Ther, 2004. 101(3): p. 193-210; Horvat, J., et al., Am J Respir Crit Care Med, 2007).

클라미디아에군의 미생물들은 세포 내에서만 생존할 수 있는 박테리아이다. 그들은 몇 가지 대사 및 생합성 경로가 결핍되어 예컨대 ATP 등 중간물을 숙주 세포에 의존하게 된다. 클라미디아에는(1) 일차체로 일컬어지는 감염성 입자 및 (2) 망상체로 일컬어지는 세포질 내, 번식 형태의 두 가지 단계로 존재한다. 흔히 인간을 감염시키는 3 가지 종의 클라미디아가 알려져 있다. 씨. 트라코마티스는 안과 질병 트라코마 및 성병 감염인 클라미디아의 원인이 된다. 씨. 시따치는 앵무병을 야기하고 씨. 뉴모니아에는 일종의 폐렴의 원인이 된다. 이에 더하여, 마우스는 씨. 무리다룸에 민감한데, 이는 쥐과의 생식관에 감염을 일으킨다. 먼저 언급한 두 가지는 세포벽 및 외막 단백질 상의 차이점에 기초한 많은 혈청형(serovar)를 포함한다. 클라미디아 뉴모니아에는 한 가지 혈청형 - TWAR 미생물을 포함한다.

클라미디아에는 세포에 부착하기 쉽게 하는 혈구응집소를 갖는다. 내독소-유사 독소가 알려져 있으나 세포-매개 면역 반응도 염증 진행 중 크게 조직을 손상시킨다.

클라미디아를 포함하는 대부분의 인간 및 동물에 대한 병원체는 점막 표면을 통하여 감염을 개시한다. 유사하게, 클라미디아의 생식기 감염도 점막 표면의 감염으로부터 일어난다. 따라서, 이러한 병원체들에 대한 방어 면역은 강력한 점막 면역 반응을 유도해야할 필요가 있다. 점막 부위를 통한 감염에 대한 방어 백신의 필요성이 명백함에도 오늘날 사용하고 있는 백신들은 피내(intradermal) 또는 피하 주입의 형태이다. 그러나, 비경구 면역법에 따른 점막의 면역 반응은 일반적으로 약하다.

클라미디아 트라코마티스 감염은 전세계 가장 흔한 성병 감염 박테리아이다. 클라미디아 트라코마티스는 생식기 및 직장에 성병 감염을 일으킨다. 남성에게 씨. 트라코마티스의 감염 빈도는 임질의 빈도 이상이다. 남성의 비특이성 요도염, 부고환염, 직장염은 씨. 트라코마티스 감염으로부터의 결과일 수 있다. 씨. 트라코마티스 중복 감염된 임질 환자도 또한 발생한다. 젊은 여성들의 급성 수란관염 및 자궁경관염도 자궁 경관에서의 씨. 트라코마티스 감염에서 야기된 것일 수 있다. 여성에게서 높은 비율의 임질과 씨. 트라코마티스의 생식관 공동-감염이 보고되었다. 클라미디아 트라코마티스는 감염 여성의 난관으로부터 분리된다. 정자에 부착되어 있던 씨. 트라코마티스 일차체를 수란관염 환자의 복강으로부터 회수한 보고가 있다.

감염된 산도에서 씨. 트라코마티스에 노출된 신생아들은 5일 내지 14일 내에 급성 결막염을 앓을 수 있다. 이 질환을 결막 홍반 발생, 림프세망의 증식, 및 화농성 분비물로 특징지울 수 있다. 감염을 치료하지 않으면 간질성 폐렴으로 발전할 수 있고, 이 타입의 간질성 폐렴은 생후 첫 4개월 내지 6개월 동안에만 발생한다.

최근, 씨. 트라코마티스는 성인의 하부 기도(lower respiratory tract) 감염을 유발하는 것으로 의심되고 있고, 상기 병원체를 분리해낸 면역 손상 환자들에게서 씨. 트라코마티스 폐렴의 몇 가지 경우가 보고되었다. 씨. 트라코마티스가 면역력있는 사람에게도 폐렴 또는 기관지폐 감염의 원인이 된다는 증거가 있다.

씨. 트라코마티스와 연관된 후유증은 골반염질환, 자궁외임신 및 불임, HIV/AIDS를 제외한 임의의 고비용 감염 질환을 포함한다(Westrom L, Mardh P. A., Br Med Bull 1983 Apr;39(2): 145-50). 게다가, 클라미디아 감염은 HIV에 감염될 위험률(Ho JL, et al., J Exp Med 1995 Apr 1 ; 181(4): 1493- 505) 및 허피스 단순포진(Herpes simplex)(Kaul R, et al., J Infect Dis 2007 Dec 1 ; 196( 11 ): 1692-7)에 감염될 위험률을 증가시킨다. 징후가 없는 대부분의 클라미디아 감염의 특징으로 인하여(Stamm WE.. In: Woodall JP, editor. Proceedings of the Chlamydia Vaccine Development Colloquium; 2004; Alexandia, Virginia: The Albert B. Sabin Vaccine Institute; 2004. p. 15-8), 증가하고 있는 감염의 발생을 항생제 치료로는 효과적으로 늦출 수 없었고 일반적으로 이 침묵의 전염병을 제어할 효과적인 백신이 필요하다고 여겨지고 있다.

헬리코박터

에이치. 파일로리를 포함하는 헬리코박터 속의 박테리아는 몇 가지 타입의 위장 질환의 중대 원인으로 여겨진다. 위장 점막의 헬리코박터 감염은 만성 활성 위염, 위궤양, 십이지장 궤양과 같은 질환의 발생과 연관되어 있고 위 선암(gastric adenocarcinoma)의 발생과 연관되어 있다(Enno, A., et al., Am J Pathol, 1998. 152(6): p. 1625-32; Correa, P., . J Natl Cancer Inst, 2003. 95(7): p. E3; Ernst, P. and B. Gold, Annu Rev Microbiol, 2000. 54: p. 615-40; Uemura, N., et al., N Engl J Med, 2001. 345(1 1): p. 784-9).

요약

이름하여, 많은 인간 및 동물이 점막을 통하여 감염됨에도 상기 동물들을 보호하기 위한, 점막에 작용하는 효과적인 백신의 개발이 불가능하지는 않지만 매우 어렵다는 이 기술 분야의 반갑지 않은 문제점을 본 발명자들은 이미 발견하였다. 가장 큰 문제는 경구로 전달되는 백신 항원이 예컨대 페이에르판 등 면역 유도 위치에 도달하기 전에 위장의 산도 및 단백질 해체 작용으로 분해되어 버린다는 데 있다. 또한 소화관과 연관된 림프 조직의 부적절한 자극은 적응 면역보다는 경구 저항성을 유도할 수 있다. 이에 더하여, 콜레라 독소(CT)를 사용하여 설치류의 면역을 증가시킬 수 있으나, 인간은 견디지 못한다. 클라미디아 또는 헬리코박터 중 어느 한 가지에 대하여도 인간에게 사용하기 위한 용도로 승인된 효과적인 백신은 없다. 그러므로, 현재, 점막에 효과적이고 콜레라 독소의 유리한 효과를 모방할 수 있지만 인간에게 유해한 부작용을 일으키지 않는 조성물 및 방법에 대한 필요성이 크다.

본 발명자들은 특정 지질 조성물, 특히 장쇄 지방산을 함유하는 지질 조성물을 보조제 또는 담체로 사용하는 경우 이들 또는 기타 문제들을 해결하고 점막 면역을 촉진하여 클라미디아 또는 헬리코박터로부터 야기되는 점막 감염에 대한 방어를 제공한다는 예상치 못했던 발견을 하게 되었다.

본 발명자들은 또한 예기치않게 특정 지질 조성물을, 분리된 클라미디아 항원과 더불어 보조제 또는 담체로 사용하는 경우 클라미디아에 대하여 콜레라 독소만큼이나 효과적이지만 해로운 독성 부작용은 없는 면역을 제공한다는 사실을 알아내었다. 이러한 발견은 특정 지질 조성물을 살아있는 미생물과 함께 사용하면 면역 반응이 향상될 수 있다는, 본 명세서에 참고 문헌으로 전부 포함되는 종래 발견(PCT/NZ2002/00132)에 기초하여서는 전혀 예상할 수 없는 것이었다.

유사하게, 본 발명자들은 특정 지질 조성물을 에이치. 파일로리의 항원과 더불어 보조제 또는 담체로 사용하면 에이치. 파일로리의 점막 감염에 대한 면역을 제공할 수 있다는 예기치 못한 발견을 하였다. 이러한 발견은 종래 기술로부터 전혀 예기치 못한 것이다.

이에 더하여, 경구 백신 접종의 가장 큰 문제는 위장 및 기타 소화계 기관에서 백신 항원이 분해된다는 데 있다. 이들 문제는 백신이 페이에르판과 같은 면역 유도 위치에 도달하기 전, 위장의 산도 및/또는 항원에 대한 단백질 해체에 따른 것일 수 있다. 그러므로, 소화관과 연관된 림프 조직[gut-associated lymphoid tissues("GALT")]의 부적절한 자극은 또한 적응 면역보다는 오히려 경구 면역 저항성을 유도할 수 있고, 보호가 아니라 항원과 관련된 질환을 악화시킬 수 있다.

그러므로, 본 명세서는 사멸된 항원(살아있는 미생물 또는 약독화 미생물과 반대되는 것임)이 활성 백신으로서 경구 투여되어, 점막 면역을 유도할 수 있으며, 그에 따라 병원체 미생물로 인한 점막 감염으로부터 동물을 보호할 수 있다는 것을 최초로 증명하는 것이다.

점막 면역

점막 표면은 병원체 미생물들의 진입을 위한 주요 관문이다. 그렇기 때문에, 점막 표면은 기능적으로나 해부학적으로 전신 면역계와는 구별되는 점막 면역계에 의하여 방어된다. 점막 면역계 및 전신 면역계는 병원체에 대한 보호를 제공하기 위하여 공동으로 기능을 수행한다. 소장 내에서, 항원 제시 세포(Antigen presenting cell, "APC")는 페이에르판 및 유출 장간막 림프절에서 에피토프를 제시하는 관강(luminal) 항원을 림프구로 제공한다(Owen, R. and A. Jones, Gastroenterology, 1974.66(2): p. 189-203 ; Iwasaki, A. and B. Kelsall, J Exp Med, 2000. 191(8): p. 1381-94). APC와 림프구 양쪽 모두에 많은 주요 점막 유도 조직으로서, 소화관과 연관된 림프 조직("GALT")은 경구 면역을 통한 점막 방어 면역을 유도하는데 있어서 매력적인 조직이다.

위장관은 다양한 항원에 노출되어 있고, 이는 정상적인 대사 과정으로부터 생성되는 '자가' 항원, 소화된 음식물 항원 및 공생 식물군 또는 병원체 미생물로부터의 항원 등을 포함한다. 효율적으로 기능하기 위하여, 면역계는 '유익한' 항원을 숙주에 아마도 '유해한' 항원과 분리시킬 필요가 있다. 경구 저항성은 면역계가 유해하지 않다고 여겨지는 항원들에 대해 면역 무반응 상태를 생성할 수 있게 하는 특정 기전이다. 경구 면역처리에 의해 면역을 일으키기 위한 항원 흡수는 많은 기전을 통하여 이루어질 수 있다. 장세포는 항원을 흡수, 가공하여 기저외측으로(basolaterally) 발현된 클래스 II MHC 분자들 상으로 T세포로 제시한다(S.G. Mayrhofer, and L. Spargo, in Immunology. 1990; Hershberg, R.M., et al., J Clin Invest. 1998. p. 792-803).

고유층(lamina propria)에 위치하는 수지상 세포("DC")는 표피 세포 간 밀착연접(tight junction)을 통하여 그들의 수상돌기를 '압착'함으로써 관강 항원을 제공한다(Rescigno, M., et al., Nat Immunol, 2001. 2(4): p. 361-7). 마이크로폴드("M") 세포는 소장 표피 장벽을 통하여 DC 및 대식세포를 포함하는 기저의 항원 제시 세포("APCs")까지 비특이적으로 관강 항원을 수송한다(Bockman, D., et al.,Ann N Y Acad Sci, 1983. 409: p. 129-44; Bockman, D. and M. Cooper, Am J Anat, 1973. 136(4): p. 455-77; Neutra, M.R., et al., Cell Tissue Res. 1987. p. 537-46). 능동 면역을 통하여 GALT에 도입된 단백질 항원들은 일반적으로 면역보다는 저항성 유도의 결과를 낳는다.

위장관은 관문이고 접근성이 쉽기 때문에, 위장관, 호흡기관 및 비뇨생식기관의 내부 점막 표면을 통하여 체내로 침입하는 감염제에 대항하여 숙주를 보호할 수 있는 매력적인 수단으로서 백신접종을 위한 비침습 경로인 경구 면역이 오래전부터 고려되어 왔다. 많은 동물 연구에서 증명된 바와 같은 경구 면역의 잠재력은 인간에게서는 아직 인식되지 못하고 있고, 오로지 경구 소아마비 백신, 경구 장티푸스 백신 및 경구 콜레라 백신만이 인간용으로 승인되었으며, 그들 모두는 생 약독 백신이다. 인간에게 경구 면역의 사용을 방해하는 제한 요소는 다량의 항원 투여 필요성, 정상적인 소화 과정에 의한 항원의 해체 및 종종 소단위 단백질 항원을 섭취함으로써 유발되는 경구 저항성의 유도를 극복하기 위한 강한 점막 보조제의 필요성 등을 포함한다(Weiner HL. J Clin Invest 2000 Oct;106(8):935-7).

경구 면역은 쉽게 투여할 수 있고, 사람에서 사람으로 HIV, 헤파티티스 B, 헤파티티스 C와 같은 질환이 전파될 위험과 무관한, 주사 바늘이 필요없고, 비용면에서도 효율적인 방법이다(Giudice, E.L. and J.D. Campbell, Adv Drug Deliv Rev. 2006. p. 68-89). 경구 경로는 또한 야생 동물의 면역용으로 중요한 방법이다. 경구 체제는 현재 사용되고 있는 침습적인 포획과 방생이라는 질환 관리 방법과 연관되는 동물들의 스트레스를 피하도록 해준다 (Cross, M. L. et al., Vet J. 2006). 이러한 이유로, 경구 경로는 전염성 질환의 전파를 최소화하기 위하여 많은 동물과 인간 양자 모두에게 면역법으로서의 잠재력을 제공한다. 인간에게 투여되는 널리 시판되는 경구 백신으로는 세이빈 소아마비 백신, 생 약독 장티푸스 백신 및 사멸된 전세포 B(whole-cell B) 소단위 및 생 약독 콜레라 백신이 있다.

이들 결과는 본 발명의 경구로 제공되는 백신이 에이치. 파일로리의 경우 위에서 작용(도 3 및 도 5)하고 클라미디아의 경우 생식기관 및 폐에서 작용(도 1, 2, 4 및 6)할 수 있음을 보여준다. 이들 결과는 또한 본 발명의 백신을 점막 표면에 전달함으로써 다양한 기타 점막 표면에서의 반응이 촉발될 수 있음을 보여준다. 그러므로 이들 발견은 본 발명의 백신 조성물이 이 기술 분야의 장기간 미해결 과제에 대한 해법을 제공한다는 것을 증명한다. 본 발명의 지질 조성물이 전통적인 보조제 CpG 및 CT로부터 기인하는 점막 면역을 더 증가시킬 수 있다는 발견은 본 발명의 조성물이 점막 면역을 촉진하기 위하여 시너지적으로 작용할 수 있다는 것을 나타낸다.

백신 보조제

면역 반응을 향상시키기 위하여, 항원을, 면역원성을 자극하는 다수의 보조 물질과 혼합하였다. 흔히 사용되는 보조제는 명반 및 수중유적형 에멀젼을 포함한다. 후자의 군으로는 Freund 광물 오일 보조제가 대표적이다. 그러나, Freund 완전 보조제("FCA")의 인간용 또는 수의학용 백신에의 사용은 독성 반응이 보고되었기 때문에 금지되었다. 이러한 이유로, Freund 보조제는 또한 경구 투여용으로 부적합할 수 있다.

수중유형 에멀젼에서는 그 높은 오일 함량으로 인하여 계면활성제가 필요하다. 계면활성제의 세제 특성 때문에 이들은 비경구 또는 경구 투여에 적합하지 않다. 이에 더하여, 심지어 승인된 계면활성제에서도 독성 반응이 보고되었다. 에멀전의 추가적인 단점은 섞이지 않는 액체 1종을 다른 액체에 분산시킨 이형(heterogeneous) 시스템이라는 것이다. 이러한 제제는 종종 불안정하고 시간이 흐른 뒤 수성 상의 분리라는 결과를 낳고, 그러므로 안정한 현탁액으로 백신을 유지하기에 어려움이 있다. 게다가, 수중유형 에멀젼의 수성 상 또는 전통적 리포좀에 갇힌 항원은 위 또는 기타 소화계의 분해로부터 보호받기 힘들다. 반면, 본 발명의 지질 함유 조성물과 그 사용 방법은 소화관에서 분해되기 쉬운 단백질 항원을 보호할 수 있으므로, 페이에르판 및 기타 위장관 내 면역적으로 민감한 구조에 접근할 수 있어, 점막의 면역 방어를 제공하게 된다.

ADP - 리보실화 외독소

면역원성이 약한 단백질 항원으로 경구 면역한 후 적응 면역을 상승시키기 위하여, ADP-리보실화 외독소("bAREs")와 같은 보조제를 사용하여 면역 활성화를 상승시키고 경구 저항성의 유도를 방지한다. 동물의 경구 면역 연구에서 가장 흔하게 사용되는 보조제인 ADP-리보실화 박테리아 외독소(ABARES)(Williams NA, Hirst TR, Nashar TO. Immunol Today 1999 Feb; 20(2):95-101), 예컨대, 콜레라 독소("CT") 및 열 불안정 대장균 독소("LT")는 위 및 신경계 양자 모두에 대한 독성 때문에 인간에게 사용할 수 없다(van Ginkel FW et al., J Immunol 2000; 165(9):4778-82). 이런 이유로 인간에서의 경구 면역은 오로지 ABARES와 같은 보조제를 대체할 안전한 보조제를 찾아낼 수 있어야만 실현될 것이다. CT 또는 LT 등의 ABARES는 점막 면역의 강력한 자극제이고 경구, 비강내 및 피부를 통하는 방법 등의 많은 면역 경로들에 있어서 실험적으로 사용되어 왔다(Holmgren, J., et al., Vaccine, 1993. 11(12): p. 1 179-84; Hickey, D.K., et al., Vaccine, 2004. 22(31- 32): p. 4306-15; Skelding, K.A., et al., Vaccine, 2006. 24(3): p. 355-66; Glenn, G., et al., J Immunol, 1998. 161(7): p. 321 1-4; Yu, J., et al., Infect Immun, 2002. 70(3): p. 1056-68; Berry, L.J., et al., Infect Immun, 2004. 72(2): p. 1019-28). 그러나, 경구 및 비강내 경로를 이용하는 그들의 수의과 및 인간의 면역 체제용 용도는 독성에 의하여 제한적이고, 독성은 위장액의 균형 교란 및 중추 신경계에의 독소 축적을 포함한다(van Ginkel, F., et al., J Immunol, 2000. 165(9): p. 4778-82).

본 발명의 조성물과 비교하기 위하여 사용되는 잘 알려진 강력한 점막 보조제 CT 및 CpG는 각각 세포의 Toll-유사 수용체 9(Toll-like Receptor, "TLR9")와 갱글리오사이드 수용체("GM-1")를 통하여 면역 반응을 활성화시킨다. GM-1 및TLR의 활성화 및 신호화는 세포막의 지질 부유 성분들에 의존하고, 이들은 단백질 및 신호전달 분자들을 공통 집적하게 한다(Fujinaga, Y., et al., Molecular Biology of the Cell. 2003; Orlandi, P.A. and P.H. Fishman, J Cell Biol. 1998. p. 905-15; Wolf, A.A., et al., J Biol Chem. 2002. p. 16249- 56; Triantafilou, M., et al., J Cell Sci. 2002. p. 2603-1 1 ; Triantafilou, M., et al., J Biol Chem. 2004. p. 40882-9; Dolganiuc, A., et al., Alcohol Clin Exp Res. 2006. p. 76-85; Latz, E., et al., Nat Immunol. 2004. p. 190-8).

지질 부유체들은 포화 지방산을 고 비율로 함유하는 스핑고리피드 및 콜레스테롤 양자로 구성되며, 주변의 불포화 인지질 부분보다 더 치밀한 밀도를 가진 부분을 이루게 된다(Simons, K. and W. L. Vaz, Annual review of biophysics and biomolecular structure. 2004. p.269-95; Dykstra, M., et al., Annu Rev Immunol.2003. p.457-81 ). 자유 지방산은 이중막 내로 직접 끼어들어가 그들의 구조에 따라 각기 다른 도메인으로 조직화되기 때문에 지방산 함량은 그 높은 순환률에 기하여 역동적이다(Klausner, R.D., et al., J Biol Chem. 1980. p. 1286-95). 포화 지방산의 함유는 지질 부유체 형성에 편의를 제공하면서 막의 세포 신호전달 기전에 직접 영향을 미치며 반대로 불포화 지방산 비율이 높아짐에 따라 억제된다 (Stulnig, T.M., et al., J Cell Biol, 1998. 143(3): p. 637-44; Stulnig, T.M., et al., J Biol Chem. 2001. p. 37335-40; Weatherill, A.R., et al., J Immunol, 2005. 174(9): p. 5390-7).

리포좀

백신 생존력을 높이기 위하여 연구자들은 예컨대 불활성 입자, 리포좀, 생 벡터 및 바이러스 유사 입자("VLPs")를 포함하는 많은 수의 전달 운반체의 개발을 강구하였다(Bangham, A.D. and R. W. Home, J MoI Biol. 1964. p. 660-8; Niikura, M., et al., Virology. 2002. p. 273-80; Guerrero, R.A., et al., J Virol. 2001. p. 9713-22).

리포좀 및 지질 소포도 또한 백신, 특히 쉽게 캡슐화될 수 있는 작은 면역원성 성분과 함께 사용하기 위하여 연구되었다. 일반적으로 리포좀 및 소포는 살아있는 미생물과 같은 큰 항원을 캡슐화하기에는 유용하지 않다. 게다가, 리포좀 및 소포는 생산하기에 고비용이고 시간소비적이며, 그 제조에 이용되는 추출 과정이 백신 제조물의 화학적 구조 또는 생존력, 따라서 그들의 면역원성의 변화라는 결과를 낳을 수 있다. 예를 들어, 열 및 용매는 단백질과 같은 면역원성 성분의 생물학적 온전함을 변화시킬 수 있다.

리포좀은 통상 작고(마이크로미터 크기 범위 내), 안쪽에 항원 또는 기타 물질들을 위치시킬 수 있는 내부를 가지는 구형 박층 구조이다. 항원 또는 기타 물질을 함유하는 수용액과 지질을 혼합함으로써 리포좀을 만든다. 상기 혼합물을 볼텍싱한 후, 혼합물 내의 상기 지질은 자발적으로 통상적인 리포좀 구조를 형성하는 경향이 있다. 어떤 경우에는 지질 성분과 수성 상 성분의 혼합을 돕기 위하여 세제를 첨가할 수 있다. 세제를 제거하는 투석 과정에서, 상기 지질은 수성 상을 캡슐화한 리포좀 구조를 자발적으로 형성하면서 지질 및 수성 상으로 분리된다. 그 후 리포좀은 사용하기 위하여 통상 현탁액 내에 저장된다.

리포좀 백신접종에 대한 면역 반응은 지질의 물리화학적 성질에 크게 좌우되므로, 역상 증발(reverse-phase evaporation), 에테르 증발법(ether vaporisation), 동결-융해 압출가공(freeze-thaw extrusion) 및 탈수화-재수화(dehydration-rehydration)를 포함하는 많은 수의 정교하고 복잡한 기법들이 차용된다(Szoka, F. and D. Papahadjopoulos, Proc Natl Acad Sci USA. 1978. p.4194-8; Deamer, D. and A.D. Bangham, Biochim Biophys Acta. 1976. p. 629-34; Chapman, CJ., et al., Chem Phys Lipids. 1991. p. 201-8; Sou, K., et al., Biotechnol Prog. 2003. p. 1547-52; Kirby, CJ. and G. Gregoriadis, Journal of microencapsulation. 1984. p. 33-45).

PCT 국제 특허 출원 번호 PCT/KROO/00025호(WO 00/41682; 이하 본 명세서에서는 "Kim")에 단백질 약물 또는 항원을 함유하는 "친유성 마이크로입자"(즉, 리포좀)가 개시되어 있다. 마이크로입자는 0.1 내지 200 ㎛ 범위의 크기를 가진다. 친유성 마이크로입자를 활성 성분을 함유하는 고체 입자를, 수용액 내의 친유성 물질로 또는 유기 용매를 사용하여 코팅함으로써 제조한다. 그 결과 얻어지는 수성 에멀젼 내 오일 조성물은 주입하기에 적합하다. 그러나 불행하게도, Kim의 마이크로입자는 경구 주입용으로는 부적합하다. 더하여 그들은 소화계를 통과하면서 항원을 보호하기에 적합하지 않다. 그 결과 Kim의 마이크로입자는 점막의 효율적인 경구 면역을 제공하지 못한다.

이에 더하여, 리포좀을 만들기 위한 방법은 정교한 제작 기법을 필요로 하고, 이것은 대규모 제작의 비용 효율성을 제한하게 된다(Szoka, F. and D. Papahadjopoulos, Proc Natl Acad Sci USA. 1978. p. 4194-8; Deamer, D. and A.D. Bangham, Biochim Biophys Acta. 1976. p. 629-34; Chapman, C.J., et al., Chem Phys Lipids. 1991. p. 201-8; Sou, K., et al., Biotechnol Prog. 2003. p. 1547-52; Kirby, CJ. and G. Gregoriadis, Journal of Microencapsulation. 1984. p. 33-45).

리포좀은 경구 면역에 있어 제한적 용도를 가지는데, 부분적으로는 그들이 손상되기 쉽고, 수용성 내부의 항원이 시간이 흐름에 따라 분해될 수 있기 때문이다. 이에 더하여, 통상 리포좀을 만드는데 사용되는 지질은 실온에서 액체 상태인 것들이고, 따라서 저장 조건 하에서 일반적으로 액체형이다. 이들 특성은 리포좀계 백신의 유통기한을 제한한다.

면역 자극 복합체

ISCOM^®으로 알려진면역-자극 복합체는 기본적으로 인지질과 콜레스테롤 분자로 구성되고 극성 및 비극성 부분으로 정의된다. 이에 더하여 ISCOM^®은 고 항원성 보조제 사포닌(Quil A)(Morein, B., et al., Nature. 1984. p. 457-60)을 함유한다. 포스포리피드는 구형 고리를 형성하며, 주변을 둘러싼 비친수성 힘에 의하여 상호 결합되고 수성 상 내에 다양한 항원을 캡슐화한 지질 이중막을 만든다. 양자의 시스템 모두에서 막의 온전성은 유지되지만 항원이 인접 환경으로 방출되어 분해된다는 점이 중요하다. 그러므로, 백신의 생존력 및 전달에 최적 저장 조건의 유지가 필수적이다. ISCOM^®은 투석, 초미세여과(ultrafiltration), 초원심분리 등의 복잡한 제조 기법을 리포좀보다는 덜 요구한다 (Sjolander, A., et al., Vaccine. 2001. p. 2661-5). 이들 방법은 항원의 자발적 함유라는 결과를 필연적으로 낳지는 않는다.

이에 더하여, 최근 또 다른 보조제가 언급되고 있다. ISCOMATRIX^®는ISCOM^®와 유사한 지질 보조제이다. 그러나 ISCOMATRIX^®는 항원을 물리적으로 함유하는 것이 아니라, 사포닌의 면역원성 성질을 통하여 면역을 유도하기 위한 보조제로서 공동 투여되는 것이므로, 경구 면역 도중 백신 항원(들)의 보호를 위한 전달 운반체로 사용되지 않는다(Skene, CD. and P. Sutton, Methods. 2006. p. 53-9). 리포좀 및 ISCOM^®은 백신을 근육 내, 피하, 비강 내, 경구 및 경피 등 여러 경로를 통하여 전달하는 데 실험적으로 사용되어 왔다(Mishra, D., et al., Vaccine.2006; Wang, D., et al., J Clin Virol. 2004. p. S99-106; Perrie, Y., et al., Journal of liposome Research. 2002. p. 185-97).

점막 면역을 위한 경구 백신 보조제 및 담체로서의 지질 조성물

상기 기술한 점막 면역 생산의 어려움을 예상치않게 본 발명의 지질 함유 조성물로 극복하였다. 종래의 단쇄 지질(예컨대, 오일) 또는 인지질 대신, 현탁액 중에 항원을 붙잡아 두기 위한 지질 기질로서 장쇄 지방산을 사용하면 선행 기술의 조성을 뛰어넘는 뚜렷한 장점을 얻을 수 있음을 알아내었다. 우선, 장쇄 지방산은 위장관에서의 분해에 좀 더 강하고 그러므로 항원이 그 본래의 구조를 유지할 수 있는 보호 환경을 제공하며 따라서 점막 내에서의 면역원성 반응을 증가시킨다.

인간 및 기타 동물들은 지질을 그들의 일상 식이의 일부분으로 소비하고, 지방(트리글리세롤)의 소화는 정상적인 대사 과정이다. 지질은 위장에서 위산에 의해서는 거의 분해되지 않고 약 90%의 지질 분해는 담즙산염 및 리파아제에 의해 장관 내에서 이루어진다(Erickson, R.H. and Y.S. Kim, Annu Rev Med. 1990. p. 133-9).

경구 면역 과정 중에, 포화 지방산은 불포화 지방산처럼 쉽게 담즙산염 미셀(micelle)로 포함되지 못한다. 그러므로 쉽게 장세포에 의하여 흡수되지 못한다. 관강 내 잉여 포화 지방산은 특화된 마이크로폴드 "M" 세포를 통하여 백신 성분과 함께 비특이적으로 수송될 수 있다. 하위 상피 돔(dome) 내의 지질 기질의 포화 지방산 부분은 항원 제시 세포(APC)의 이중막으로 끼어들어가고, 기능적 GM-1 수용체 및 TLR 복합체의 상향 조절을 촉진한다. 지질 제제화된 본 발명의 백신은 온전한 항원의 물리적 전달 및 점막 보조제에 의한 APC의 활성화 양자 모두를 통하여 두 배 상승된 방어를 나타낸다.

많은 약품 및 백신용 선행기술 상의 지질 조성물들과는 달리, 본 발명의 지질 조성물은 포스포리피드가 아닌 트리글리세리드로 구성된다. 트리글리세리드는 극성 및 비극성 부분을 함유하지 않으므로 동심의 구형 이중막으로 조직화하지 않는다. 대신, 본 발명의 백신에서 사용되는 지질은 그 안에 백신 성분이 포획되는 메쉬-유사(mesh-like) 기질을 형성할 수 있다. 이것은 예컨대 습도 및 수분, 및 위장의 심한 산성 환경과 같은 다양한 저장 인자에 노출되는 동안 지질 포함 항원에 대한 물리적 보호를 제공한다.

상기 제제에 채용된 지질은 바람직하게는 동물 또는 인간 소비용으로 적합하고 오일, 지방 및 왁스 등 광범위한 천연(식물 또는 동물 유래), 또는 합성 지질 제품으로부터 선택된다. 새로운 백신을 개발하는데 있어, 부정적인 부작용의 발생을 피하는 것이 인간에게 백신 사용을 시도하기 위한 주요 결정 요인이다. 독성 보조제의 공동 투여 없이 '안전한' 소단위 항원을 사용하는 것이 이상적일 것이다. 본 발명의 지질 제제는 어떠한 부정적인 부작용과 연관되어 있지 않은 음식 또는 약제 등급의 식이 지방산을 사용하여 제조된다. 이러한 지질-제제화 MOMP(major outer membrane protein)를 이용하는 경구 면역은 클라미디아 감염으로부터 호흡기 및 생식기 점막의 중대한 방어를 유도하였다. 이에 더하여, 본 발명의 지질 제제 내에 에이치. 파일로리의 사멸된 전세포를 포함시키자 살아있는 에이치. 파일로리 SS1 박테리아 공격 후 위장관에서의 방어를 이끌어냈다(도 3 및 도 5). Lipid C 및 에이치. 파일로리 항원으로 관찰된 이 방어도는 박테리아 회수에 있어 약 25% 감소를 나타내고, 동물에의 박테리아 부하의 감소를 나타낸다. 헬리코박터 파일로리 SS1으로 6 주간 위장-내 접종한 후 면역처리는 위장 조직으로부터 회수되는 박테리아의 현저한 감소라는 결과를 낳았다.

사멸된 전세포 미생물은 정의할 수도, 그들의 면역원성을 분리할 수도 없는 수많은 항원으로 구성된다. 정제된 MOMP는 그러나, 클래스 I 및 클래스 II T 세포 에피토프 양자 모두를 함유하는 면역우세적 표면 항원이다(Caldwell, Η.D., et. al., Infect Immun. 1981. p. 1 161-76). 본 발명에 따른 MOMP의 지질 제제는 호흡기 및 생식시 클라미디아 감염 양자 모두에 대하여 부분적으로 마우스를 방어하는 면역 반응을 이끌어냈다.

본 발명에 따른 백신의 제조는 어떠한 특화된 전문 지식이나 장비의 필요가 없는 간단하고 저렴한 생리적 과정이다. 리포좀 및 ISCOM^®이 기타 비 지질 전달 운반체와 비교하여 저렴한 선택사항으로 조명되었으나, 본 발명 조성물의 간단성은 훨씬 더 저렴한 대안을 제공할 수 있다.

몇몇 실시 상태에 있어서는, 지질 제제는 약 30℃ 이상의 온도에서는 액체일 수 있다. 즉, 상기 지질은 그것이 투여되는, 대부분은 경구 경로로 투여되는 동물의 생리적 온도에서 녹는점에 이르는 것으로 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 지질은 10℃ 내지 30℃, 대기압 상태에서 고체 형태이고, 양호하게는 20℃ 내지 30℃, 대기압 상태에서 여전히 고체 형태인 것일 것이다. 그러나 지질의 녹는점은 배타적인 것은 아니고 녹는점 범위의 오일, 지방 및 왁스를 포함할 수 있다.

몇몇 실시 상태에서, 본 명세서의 용도로 사용되는 지질은 약 30℃ 내지 인간의 생리적 온도인 약 37℃ 사이에서 고체상으로부터 액체상으로 전이를 겪을 수 있다. 지질의 상 행태에 대한 요약은 이 기술 분야에서 쉽게 알 수 있다. 따라서, 숙련된 독자는 이 기술 분야의 정보 및 간단한 실험에 기초하여 적절한 특성 및 녹는점을 가지는 지질을 선택할 수 있다.

일반적으로, 적절한 지질 제제는 카복시산의 글리세릴 에스테르, 지방족 사슬 및 -COOH 말단으로 이루어진 화합물, 및 포화 및 불포화 지방산 및 이들의 혼합물과 같은 트리글리세리드를 포함할 수 있다.

몇몇 실시 상태에 있어서는, 트리글리세리드는 주로 C₈ 내지 C₂₀ 아실 그룹, 예를 들어, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 파린산(parinic acid), 라우르산, 리놀렌산, 아라키돈산, 및 에이코사펜타에노산, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.

몇몇 실시 상태에 있어서는, 본 발명에서 유용한 지질 제제는 더 긴, 예를 들어, C₁₆-C₁₈의 사슬 지방산을 포함한다. 장쇄 지방산은 마우스 및 주머니쥐용 백신에서 BCG와 같은 미생물을 방어하는데 더 효과적임이 밝혀졌다. 이러한 관점에서 볼 때, 본 발명에서 사용하기에 양호한 지질 제제는 약 30% 내지 약 100%, 혹은 약 60% 내지 약 100%, 혹은 약 80% 내지 약 100%, 및 다른 실시 상태에 있어서는, 약 90% 내지 약 100%의 C₁₆ 및/또는 C₁₈의지방산을 함유한다.

다른 실시 상태에 있어서, C₁₆ 지방산은 약 10% 내지 약 40%, 혹은 약 20% 내지 약 35%, 및 다른 실시 상태에서는 약 25% 내지 약 32%의 총 지방산 함량을 나타낼 수 있다. C₁₈ 지방산은 약 30% 내지 약 90%, 혹은 약 50% 내지 약 80%, 및 여전히 또 다른 실시 상태에서는 약 60% 내지 약 70%의 C₁₈ 지방산 총 함량을 나타낼 수 있다.

또 다른 실시 상태는 C₁₄ 이하의 지방산을 약 35% 미만으로, 혹은 약 25% 미만으로 함유하며 또 다른 실시 상태에 있어서는, 약 10% 미만으로 함유하는 지질제제에 관한 것이다.

특정 실시 상태에 있어서 지질 사슬의 길이는 C₁₄ 이하의 지방산 약 5% 미만, C₁₆ 지방산 약 25% 내지 약 32%, 및 C₁₈ 지방산 사슬 약 60% 내지 약 70%이다.

특정 실시 상태로, 본 발명에 사용되는 용도의 지질 제제는 포화 지방산을 약 20% 내지 약 60% 양, 혹은 약 30% 내지 약 55%, 및 또 다른 실시 상태로, 약 40% 내지 약 50%의 양으로 포함할 수 있다. 단일 불포화 지방산은 약 25% 내지 약 60%, 혹은 약 30% 내지 약 60%, 및 또 다른 실시 상태에서는, 약 40% 내지 약 55%의 범위일 수 있다. 다가 불포화 지방산은 약 0.5% 내지 약 15%, 혹은 약 3% 내지 약 11%, 및 또 다른 실시 상태에서는 약 5% 내지 약 9%의 범위일 수 있다.

본 발명의 몇몇 실시 상태는 약 40% 내지 약 50%의 포화 지방산, 약 40% 내지 약 50%의 단일 불포화지방산, 및 약 5% 내지 약 9%의 다가 불포화 지방산을 포함한다.

몇몇 실시 상태에서, 본 발명의 용도로 사용되는 지질 제제는 HPLC 분석으로 측정된 바와 같이 약 3% 미리스트산, 약 26% 팔미트산, 약 15% 스테아르산, 약 40% 올레산, 및 약 6% 리놀레산을 포함한다.

추가의 실시 상태에서, 본 발명의 지질 제제는 약 1% 미리스트산, 약 25% 팔미트산, 약 15% 스테아르산, 약 50% 올레산 및 약 6% 리놀레산("Lipid C")을 포함한다. 이들 실시 상태 중 몇몇에서, 조성물은 Lipid C 및 MOMP를 함유한다. 다른 실시 상태에서, 조성물은 Lipid C 및 에이치. 파일로리 항원을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "LipidC"와 "LipoVax"는 균등한 것이다.

본 발명의 다른 실시 상태는 Lipid C의 변이체 "Lipid Ca"를 포함하는데, 이는 2.8% 미리스트산, 22.7% 팔미트산, 2.5% 팔미트올레산, 1.1% 다투르산, 15.9% 스테아르산, 38.0% 올레산(C18:ln-7), 1.7% 올레산(C18:ln-9) 및 4.0% 리놀레산, 총 포화 지방 조성 42.4%, 단일 포화 지방 조성 42.2%, 및 다가 포화 지방 조성 4.0%를 가진다. 이들 실시 상태 중 몇몇에 있어서, 조성물은 Lipid Ca 및 MOMP를 포함한다. 다른 실시 상태에서는 조성물은 Lipid Ca 및 에이치. 파일로리 항원을 포함한다.

혹은, 본 발명의 지질 제제는 수소 첨가된 코코넛 오일("Lipid K")을 포함한다. 몇몇 Lipid K-함유 조성물은 7.6% 카프릴산(C8:0), 6.8% 카프르산(C10:0), 45.1% 라우르산(C12:0), 18.3% 미리스트산(C14:0), 9.7% 팔미트산(C16:0), 2.7% 스테아르산(C18:0), 7.7% 올레산(C18: l), 및 2.3% 리놀레산(C18:2)을 포함하고 약 27.1℃의 녹는점을 가진다. 이들 실시 상태 중 몇몇에서는, 조성물은 Lipid K 및 MOMP를 포함한다. 다른 실시 상태에서, 조성물은 Lipid K 및 에이치. 파일로리 항원을 포함한다.

기타 Lipid K-함유 실시 상태("Lipid Ka")는 중량으로 6.5% 카프로산(C6:0), 5.4% 카프르산(C10:0), 44.5% 라우린산염(C 12:0), 17.8% 미리스트산(C 14:0), 9.8% 팔미트산(Cl 6:0), 11.5% 스테아르산(Cl 8:0), 2.2% 올레산(C 18:0) 및 총 포화 지방 조성 95.5%, 및 단일 포화 지방 조성 2.2%의 조성을 가지는 지방산을 포함한다. 이들 Lipid Ka 실시 상태 중 몇몇에 있어, 조성물은 Lipid Ka 및 MOMP를 포함한다. 이들 Lipid Ka 실시 상태 중 몇몇에 있어, 조성물은 Lipid Ka 및 에이치. 파일로리 항원을 포함한다.

또 다른 대안으로서, 본 발명의 지질 제제는 약제 등급의 수화 코코넛 오일("Lipid PK")을 포함한다. Lipid PK-함유 실시 상태 중 몇몇은 중량 기준으로 7.0% 카프로산, 5.8% 카프르산, 45.0% 라우린산염, 18.2% 미리스트산, 9.9% 팔미트산, 2.9% 스테아르산, 7.6% 올레산 및 2.3% 리놀레산 및 총 포화 지방 조성 88.8%, 단일 포화 지방 조성 7.6%, 및 다가 포화 지방 조성 2.3%의 조성을 가지는 지방산을 포함한다. 이들 실시 상태 중 몇몇에 있어, 조성물은 Lipid PK 및 MOMP를 포함한다. 다른 실시 상태에 있어, 조성물은 Lipid PK 및 에이치. 파일로리 항원을 포함한다.

또 다른 실시 상태에서, 본 발명의 지질 제제는 중량 기준으로 6.7% 카프로산, 5.6% 카프르산, 44.3% 라우린산염, 17.9% 미리스트산, 9.6% 팔미트산, 3.0% 스테아르산, 8.4% 올레산 및 2.6% 리놀레산, 및 총 포화 지방 조성 87.3%, 단일 포화 지방 조성 8.4%, 및 다가 포화 지방 조성 2.6%의 조성을 가지는 "Lipid SPK"를 포함한다. 이들 실시 상태 중 몇몇에 있어, 조성물은 Lipid SPK 및 MOMP를 포함한다. 다른 실시 상태에 있어, 조성물은 Lipid SPK 및 에이치. 파일로리 항원을 포함한다.

조성물은 흔히 구할 수 있는 지질 성분으로부터 쉽게 제조된다. 특정 실시 상태에 있어, 본 발명의 지질 조성물은 정제 및 분별된 트리글리세리드로 이루어지는데, 이들은 37℃보다 높은 온도에서 용융 상태로 덥혀지면 다양한 항원 및 면역조절자(immunomodulator)가 포함될 수 있지만, 일단 냉각되면 안정한 고체상을 형성한다(Aldwell, F.E., et al., Infect Immun, 2003. 71(1): p. 101-8). 본 발명에 따른 백신의 제조는 어떠한 특화된 전문 지식이나 장비의 필요가 없는 간단하고 저렴한 생리적 과정이다. 리포좀 및 ISCOM^®이 기타 비 지질 전달 운반체와 비교하여 저렴한 선택사항으로 조명되었으나, 본 발명 조성물의 간단성은 훨씬 더 저렴한 대안을 제공할 수 있다.

본 발명의 지질 제제는 면역원성 조성물의 제조 및 조성물 내에서 항원을 분해되지 않도록 보호하는데 있어 유용하다. 상기 지질 제제는 특히 살아있는 생물, 특히 박테리아의 생존력을 유지시키는데 유용하다. 상기 지질 제제는 미생물을 살아는 있지만 휴면 상태로 유지시키는데 작용한다. 이것은 특히 경구 투여용으로 제조된 살아있는 미생물을 포함하는 백신에 있어 중요하다. 상기 지질은 또한 항원을 균일한 현탁액으로 유지시킨다. 즉, 본 발명의 조성물에서 면역원성 성분은 고체 또는 지질 기질과 같은 페이스트(paste) 전체에 균일하게 분포할 수 있다. 상기 지질은 또한 경구 투여되었을 때 위장관 분비액에 의한 분해로부터 항원을 보호한다. 피하 경로와 같은 기타 경로에 의하여 투여되었을 때 대식세포 공격으로부터의 보호도 또한 있을 수 있다. 이는 위장 점막을 통한 항원의 흡수 및 특히 생 미생물의 흡수를 가능하게 하고, 뒤이어 숙주 내에서의 복제를 가능하게 한다.

본 발명의 조성물은 저장 환경 중의 분해에 대하여 더 저항력이 있다. 예를 들어, 리포좀은 장기간 보관시 응집한다고 알려져 있고, 어떤 경우에 리포좀 제제는 양전하 또는 음전하 중 어느 하나를 띠어야 할 필요가 있을 수 있는데, 이로써 리포좀을 현탁액 중에 유지할 수 있도록 하는 정전기적 반발력을 제공하는 것이다.

면역원성 성분

일반적으로, 백신은 그 물질에 대하여 면역 반응이 일어날 수 있는 하나 이상의 물질을 포함한다. 이러한 물질은 지질, 단백질, 탄수화물 또는 기타 생물-특이 성분을 포함한다. 필요조건은 간단하다; 상기 물질은 면역 세포에 제공될 수 있어야 하고 그 면역 세포는 면역 반응을 생성할 수 있어야 한다. 많은 경우에, 단백질이 면역원이다.

다른 경우에, 살아있는 생물이 사용된다. 이 경로를 통한 인간의 피하 면역법에 따른 효과적인 방어는 종종 생물에 따라 매우 다양하고 예컨대, BCG는 0-80%의 범위이다(Colditz, G.A., et al., Pediatrics. 1995. p. 29-35; Colditz, G.A., et al., JAMA. 1994. p. 698-702; Fine, P.E., Lancet. 1995. p. 1339-45).

최근 발명자들 중 한 명과 동료들은 지질계 경구 전달 시스템인, Lipid C를 동물에 경구 전달 백신으로 사용하였다 (Aldwell FE, et al., Infect Immun 2003;71(l): 101-8; Aldwell, F., et al., Vaccine, 2003. 22(1): p. 70-6; PCT International Patent Application No: PCT/NZ2002/00132). Lipid C에 포함시킨 생 미코박테리움 보비스 바실레 칼메티-게우린(BCG) 백신을 마우스에게 먹였더니 감염에 대한 내성을 나타내었다(Aldwell, FE, et al., Infect Immun 2003;71(l):101-8). 유사한 결과가 흰 꼬리 사슴(NoI P, et al. J Wildl Dis 2008 Apr;44(2):247-59), 기니 피그(Clark S, et al., Infect Immun 2008 Jun 2) 및 붓꼬리 주머니쥐(Aldwell FE, et al., Vaccine 2003 Dec 8;22(1 ):70-6)에서도 발견되었는데 여기서 lipid C계 백신으로 면역처리한 것은 생 엠. 보비스의 분무 감염에 대하여 방어 성공하였다. 방어 수준은 BCG를 포함하지 않고 면역처리한 동물에서보다는 크게 관찰되었고, 피하 경로로 BCG를 투여한 것과 균등한 수준이었으며, 통합 T 세포 및 점막 T 세포에 의한 강한 인터페론 감마(IFNγ)의 생성과 관련되어 있었다. BCG를 포함하는 Lipid C, 생 약독 미생물 백신이 경구 전달 후 그 면역원성에 지대한 증가가 있었으므로, 본 발명자들은 Lipid C도 또한 경구 경로로 전달된 클라미디아 또는 헬리코박터의 특정 소단위 단백질 항원에 대한 면역 반응을 상승시킬 수 있다고 결론지었다. 그러나, 병원성 미생물의 경우에 있어, 면역화된 동물이 병원체에 의하여 심하게 부정적으로 영향받지 않도록 해야하는 것이 중요하다.

상기 언급한 생 미생물을 이용한 BCG에 대한 성공적인 면역처리와는 대조적으로, 살아있지 않은, 복제하지 못하는 BCG 항원을 이용한 경우 면역원성에 있어 효과적인 면역 반응을 유발하지 못하였다(M. I. Cross, et al., Immunology and Cell Biology, 1-4, 13 November 2007). 따라서, 이 기술 분야의 추가적인 문제, 즉 비감염성 항원을 이용한 병원성 미생물에 대한 효과적인 면역 반응의 생성이라는 문제가 있다.

많은 백신이 미생물의 동결건조 제조법 사용에 의존한다. 예를 들어, 인간 TB에 대한 현존 백신은 바실레 칼미티 구에린["BCG(Bacille Calmette Guerin)"]으로 불리는 생 약독 박테리움의 동결 건조법에 기초하고 있다. 그러나, 동결 건조 방법은 BCG 생존율 30% 내지 50%의 감소를 초래하고 살아있는 나머지 박테리아의 회수량을 손상시킨다는 것이 알려졌다(Gheorghiu, M., et al., Dev. Biol. Stand. Basel, Karger. 87:251-261). 사용 전에 미생물의 생존력을 높게 유지시키는 조성물은 이러한 백신의 효율에 크게 기여할 것이다.

다른 경우에, 하나의 미생물로부터의 특정 단백질을 사용하는 것이 바람직하다. 클라미디아의 경우, 주요 외막 단백질(MOMP)은 면역원성 화합물로 사용되는데, 왜냐하면 이 단백질이 클라미디아 미생물의 기능에 연루되어 있기 때문이다.

클라미디아 항원 성분

클라미디아의 세포 외벽은 40 킬로달톤(kDa)의 주요 외막 단백질(MOMP), 두 개의 시스테인 리치 단백질들인 60 내지 62 kDa의 외막 복합체 B 단백질(OmcB) 및 12 내지 15 kDa 외막 복합체 A 단백질(OmcA), 74 kDa 종-특이 단백질, 및 31 kDa, 18 kDa 진핵세포 결합 단백질들을 포함하는 몇 가지 면역원성 단백질들을 함유하는데, 이들은 같은 일차 서열을 공유한다.

항원형 L2로부터의 40-kDa MOMP 단백질에 대한 과다면역 마우스의 항혈청은 씨. 트라코마티스 항원형 Ba, E, D, K, Ll, L2, 및 L3의 일차체와 간접 면역형광법을 통하여 반응하였으나 항원형 A, B, C, F, G, H, I, 및 J 또는 씨. 시따치와는 반응하지 않았다. 사실, 씨. 트라코마티스 MOMP 유전자의 클로닝 및 시퀀싱 결과, 혈청형 L2 및 B의 경우 같은 수의 아미노산을 가짐을 보여준 반면, 혈청형 C는 세 개의 추가적인 아미노산에 대한 코돈을 포함하고 있는 것으로 밝혀졌다.

클라미디아 MOMP의 다양성은 네 개의 변화가능-서열 도메인에서도 드러나는데, 그들 중 두 개는 타입 특이 항원 결정인자로 추정되는 후보이다. 씨. 트라코마티스 혈청형들 간의 MOMP 차이점의 근거는 근접 연관된 혈청형들 간에는 뉴클레오티드 치환 군집에 있고, 원격 연관된 혈청형들 간에는 뉴클레오티드 삽입 및 결손에 있다. MOMP가 일차체의 외부 껍질에 끼어들어가면 MOMP의 노출된 도메인이 혈청형을 결정하는 인자 및 방어 항원 결정인자 양자 모두로 작용한다. 대개 항원형 C 및 B의 보존된 부분은 변화 가능한 짧은 도메인으로 산재한다.

혈청형 D, E, F, G, H, I, J, 및 K는 인간의 질환과 관련되어 있다고 알려져 있다. 혈청형 E,F 및 G에 대하여 함께 백신 접종하면 대략 75-80% 인간을 보호할 것이다. 혈청형 D, E, F, G, H, I, J, K 및 L은 클라미디아에 의한 생식기 감염과 관련되어 있고, 혈청형 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, 및 K는 안과 감염과 관련되어 있다. 클라미디아 뉴모니아에는 또한 알츠하이머병, 관상동맥질환 및 천식과 관련되어 있다.

시스테인 리치 막 단백질의 에피토프를 인식하는 세 가지의 단일클론항체가 인간의 모든 15 가지 씨. 트라코마티스 항원형과 반응하고, 이 항원의 종 특이성을 보여준다. OmcA에 대한 단일클론항체는 이란성(biovar) 특이성 및 종 특이성을 나타내었다. OmcB 및 OmcA 시스테인 리치 단백질은 자연적인 감염시에 고 면역원성이지만, 그 항체는 씨. 트라코마티스 일차체의 감염을 중화하지 못한다.

그러므로, 백신 개발을 위한 항원 후보는 클라미디아의 주요 외막 단백질("MOMP")이다. 본 발명자들은 예기치 않게 Lipid C에 포함되거나 강력한 점막 보조제 CT 및 CpG 올리고디옥시뉴클레오티드와 혼합된 클라미디아의 MOMP 중 하나로 경구 면역화된 동물들이 클라미디아 무리다룸의 질 내 경로 감염을 방어한다는 것을 발견하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 Lipid C, CpG/CT, 및 MOMP를 함께 조합하면 Lipid C와 MOMP를 함께 또는 CpG/CT와 MOMP를 함께 사용하여 관찰했을 때보다 씨. 무리다룸의 감염에 대한 면역 반응이 훨씬 더 향상된다는 것을 발견하였다.

MOMP 유래 면역법에 더하여, 클라미디아 감염은 MOMP가 아닌 다른 면역원성 성분을 사용하여 민감한 동물에 면역처리함으로써 감소될 수 있다. 씨. 트라코마티 스 및 씨. 시따치에서 몇 가지 분명한 면역원성 성분이 밝혀졌고, 일부는 그룹 특이적이고 다른 일부는 종 특이적이다. 일차체 및 망상체로부터 항원을 추출하기 위하여 세제를 사용하였다. 클라미디아 뉴모니아에(TWAR 미생물)는 혈청학적으로 독특하고 씨. 트라코마티스 종 및 모든 씨. 시따치 균주들과는 다르다.

씨. 무리다룸으로부터의 면역원성 성분이 또한 클라미디아 감염의 쥐과 모델에 시험하기에 유용한 조성물에 포함될 수 있다고 여겨진다. 또한 본 발명의 활성 경구 백신에 포함 및 함께 혼합될 수 있는 클라미디아 항원들의 조합은 무수히 많음을 알 수 있다.

헬리코박터 항원 성분

넓은 스펙트럼의 접종원을 제공하기 위하여, 자외선("UV")으로 사멸시킨 전세포 헬리코박터 파일로리 시드니 균주 1(에이치. 파일로리 SS1)를 사용할 수 있다. 미생물 전체를 사용함으로써 헬리코박터 항원의 어느 부분이 면역원성인지를 결정할 필요가 없다. 기타의 헬리코박터 균주들도 본 발명의 범위에서 벗어남이 없이 사용할 수 있다고 여겨진다.

본 발명의 실시 상태

본 발명의 지질 조성물의 제조

본 발명의 조성물을 이 기술 분야에서 알려진 기법으로 제조할 수 있다. 편의상, 필요하다면 상기 지질 제제를 액화하기 위하여 가열하고, 상기 기술한 바와 같이 면역원성 성분(들) 및 기타 원료(사용된다면)를 첨가한다. 면역원성 조성물의 분산은 혼합, 진탕 또는 면역원성 요소의 생존력에 부정적 영향을 미치지 않는 기타 기법에 의하여 이루어질 수 있다. 몇 가지 실시 상태에 있어서, 상기 항원은 지질 제제에 균일하게 분산된다.

본 발명에 사용되는 대안 조성물은 물을 비롯한 수성 성분을 본질적으로 함유하지 않을 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "본질적으로 함유하지 않는다"라는 용어는 조성물이 수성 성분을 약 10% 미만으로, 양호하게는 수성 성분을 약 5% 미만으로 함유한다는 의미이다. 전술한 바와 같이, 성분, 특히 수용성 용매의 존재는 특히 소화관 내에서 상기 지질 제제의 방어 효과를 감소시킨다.

본 발명의 면역원성 조성물은 전술한 면역원성 성분, 특히 면역원성이 약한 성분들에 대한 전술한 유형의 제2의 또는 또 다른 면역원성 분자에 대한 반응을 생성하는데도 유용할 수 있다. 이것은 면역원성 분자와 상기 조성물의 다른 면역원성 요소를 컨쥬게이션시켜 면역원성 조성물 내에 제2의 또는 또 다른 면역원성 분자를 공동 전달함으로써 이루어질 수 있다. 컨쥬게이션은 표준 기술 기법으로 이루어질 수 있다. 특히 관심대상 항원은 생체 내에서 항체 생성과 간섭하지 않는 연결 그룹에 의한 면역원성 담체 또는 보조제와 컨쥬게이션 될 수 있다. 면역원성 담체 또는 보조제는 상기 밝혀진 미생물들을 포함하여 임의의 면역원성 성분들일 수 있지만 양호하게는 미코박테 리움, 및 더 양호하게는 BCG일 수 있다. 적절한 연결 그룹은 오브알부민과 같은 만노즈 수용체 결합 단백질 및 Fc 수용체에 결합하는 단백질들일 수 있다. 두번째 또는 그 다음의 면역원성 분자는 양호하게는 단백질 또는 펩티드이다. 특히 양호한 단백질은 면역피임 immunocontraceptive) 단백질이다. 상기 지질은 다시 전달 기질로서 작용한다. 상기 조성물이 투여되면 짝 분자 또는 공동 전달된 분자에 대한 상승된 면역 반응이라는 결과가 나타난다.

본 명세서에서 사용하는 "동물"이라는 용어는 정온 동물, 특히 포유류를 말한다.

인간, 개, 고양이, 새, 소, 양, 사슴, 염소, 쥐, 마우스, 토끼, 주머니쥐, 오소리, 기니 피그, 족제비, 돼지 및 버팔로가 상기 용어의 의미 범위 내의 동물들의 예이다. 단위동물(monogastric animal) 및 반추동물이 특히 이 용어의 대상으로 고려된다.

본 발명의 백신 조성물이라는 문맥으로 본 명세서에서 사용하는 "항원"이라는 용어는 "면역원"이라는 용어와 균등하고, 동물의 면역 반응을 이끌어 낼 수 있는 물질, 또는 그 물질에 대하여 면역화된 동물의 면역 시스템 세포 또는 항체와 특이적으로 결합될 수 있는 물질을 말한다.

광범위한 전달 경로를 위한 제제는 또한 지질 제제 및 하나 이상의 면역원성 성분뿐 아니라, 첨가제, 예컨대, 충전제, 증량제, 바인더, 습윤제, 유화제, 연마제, 계면활성제, 현탁제제, 보존제, 염색제, 염, 모노 소듐 글루타메이트(MSG)와 같은 항산화제, 비타민 E와 같은 비타민, 부틸화 히드록사니솔(BHA), 알부민 덱스트로스-카탈레이즈(ADC), 보호용 코팅제, 유인제 및 방향제, 및 미생물의 생존을 도와줄 수 있는 물질들 또는 상기 지질에 함유된 기타 항원들을 포함할 수 있지만 그에 국한되지는 않는다.

보호용 코팅제 또는 장용 코팅제는 예를 들어 겔, 파라핀, 및 젤라틴을 포함하는 플라스틱으로부터 선택될 수 있다. 상기 코팅제는 경구 투여 경로를 선택하였을 때 위산 및 효소들에 대한 노출 예방을 더 돕는다.

경구 투여용으로 사용되면, 상기 제제는 또한 예를 들어 식미를 높이기 위한 예컨대 향료(아니스 오일, 초콜렛 및 페퍼민트 등), 및 감미료(포도당, 과당, 또는 기타 임의의 당 또는 인공 감미료 등)와 같은 첨가제를 포함할 수 있다.

전술한 내용으로부터 면역원성 성분은 단백질 또는 펩티드 또는 그 유사물의 복합체일 수 있다는 것을 알 수 있다.

하나의 실시 상태에서 상기 조성물은 상기 규정된 것들 중 임의의 것으로부터 적어도 두 가지의 면역원성 성분을 포함하고, 소단위 항원의 다중 조합을 포함할 수 있다. 세 가지 또는 그 이상의 면역원성 성분들이 실행 가능하다.

상기 조성물 내의 면역원성 성분(들)의 농도는 제공된 공지의 기술 프로토콜에 따라 달라질 수 있다. 그것은 동물에 투여하여 면역 반응을 자극하기에 효과적인 양으로 존재한다. 특히, 소화관에서의 면역 반응은 소장의 림프 조직과 관련되어 있다. 미코박테리아의 경우 1 x 10⁵ 내지 1 x 10¹⁰의 콜로니 형성 단위(CFU)/ml가 적당하다. 양호하게는 그 농도는 1 x 10⁷내지 1 x 10⁹CFU/ml 이다. 클라미디아 MOMP 및 에이치. 파일로리 항원과 같은 단백질 및 펩티드 타입의 항원에 있어서는, 제제 그램당 10-1000 Fg의 범위가 적당하다. 바이러스 타입 항원에 있어서는, 1 x 10³내지 1 x 10¹⁰, 양호하게는 1 x 10⁵ 내지 1 x 10⁸ 플라크 형성 단위(PFU)/ml가 적당하다. 상기 면역 반응은 체액성(예컨대, 항체 또는 면역 조절자 등의 용해성 성분들을 통한 면역 반응) 또는 점막 면역 반응과 같은 세포 매개성일 수 있다.

예를 들어, 일련의 생체 내 실험에서, 본 발명자들은 위장의 헬리코박터 감염 및 생식기, 위장, 및 호흡기의 클라미디아 감염인 BALB/c 마우스 모델을 연구하였다. 이들 시스템은 인간의 질환과 관련된 것으로 잘 알려져 있고, 본 발명의 조성물 및 방법이 점막의 방어 면역 유도에 얼마나 효과적인지를 결정하기 위하여 사용되었다.

사멸된 또는 소단위 백신은 생 약독 백신에 대하여 부작용이 덜한, 안전한 대안을 제공한다. 사멸된 전세포 에이치. 파일로리 또는 정제된 클라미디아 MOMP 중 어느 하나 단독의 경구 면역은 생 박테리아의 감염 후 점막 표면을 보호하지 못한다. 그러므로 본 발명자들은 헬리코박터 및 클라미디아의 점막 감염에 대한 방어를 위하여, 강력한 점막 보조제 CT 및 CpG-ODN을 첨가하거나 첨가하지 않은 상태로, 살아있지 않은 전세포 항원 및 한정된 단백질 항원으로 경구 면역화한 후 지질 제제화된 조성물이 점막 면역을 유도하는 가능성을 연구하였다.

본 명세서에서, 발명자들은 본 발명인 지질 조성물에 제제화된 백신을 사용한 마우스의 경구 면역법이 여러 점막 표면에서 생 박테리아 감염에 대한 방어를 상승시켰다는 것을 증명하였다. CpG-ODN 및 콜레라 독소(CpG/CT)와 혼합된 지질-제제화된 사멸 전세포 또는 단백질 항원은 단지 소화관에 국소적인 방어가 아니라 해부학적으로 거리가 먼 생식기 및 호흡기 표면의 방어까지 이끌어 냈다.

경구 면역방법의 주요 한계점은 백신접종을 위한 최적 항원 투여량의 결정 및 유지이다. 경구로 투여된 항원은 장 관강에서 예측될 수 없고 다소 낮은 비율로 흡수되게 된다. GALT로 도입된 단백질 항원은 일반적으로 면역보다는 저항력의 유도라는 결과를 낳는다(Challacombe, S.J. and T.B. Tomasi, J Exp Med. 1980. p. 1459-72). 이러한 이유로, 경구 백신은 적응 면역을 신장시키기 위하여 많은 양의 항원 및/또는 보조제를 요구한다. 불행하게도, 많은 양의 항원 및 독성 보조제의 존재는 부정적인 부작용을 더 증가시킬 수 있다. 본 연구에서, 클라미디아 MOMP 및 사멸 전세포 에이치. 파일로리 양자를 단독으로 투여한 경우 박테리아 감염으로부터 점막 표면을 보호할 수 없었고 이 결과는 비면역화 대조군과 비슷하다. 경구 경로를 이용한 방어 면역의 유도를 위하여 강력한 점막 보조제와의 공동 투여가 바람직하다.

CT는 인간에게 독성이 있기 때문에, 이것은 본 발명의 인간용 면역원성 조성물의 성분으로 바람직하지 않다. 그러나, CT도 특정한 다른 동물들에게는 독성이 없기 때문에, 그 동물들에의 면역 유도를 위한 면역원성 조성물에 포함될 수 있다.

CpG는 올리고뉴클레오티드이기 때문에, 그 독성은 CT보다는 덜하고, CpG는 본 발명의 인간에 사용할 용도의 면역원성 조성물로 포함될 수 있다. 그러므로, 인간에 대한 면역 유도를 위하여, 본 발명의 조성물은 클라미디아의 항원, 지질 제제 및 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 실시 상태에서, 본 발명의 조성물은 클라미디아 또는 에이치. 파일로리 둘 중 하나의 항원, Lipid C, Lipid Ca, Lipid K, Lipid Ka, Lipid PK 또는 Lipid SPK를 포함하는 지질 제제, 및 CpG 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

활용

본 발명의 조성물 및 방법은 점막을 감염시키는 미생물에 대한 면역을 제공하기에 유용하다. 본 발명의 지질 함유 조성물이 점막 면역을 제공하기 때문에, 그들은 다양한 용도로 아주 적합하다. 본 발명의 면역원성 조성물은, 기질을 통하여 항원이 균일하게 분산되게 할 수 있어 항원을 안정한 기질에 유지되도록 하는 지질 제제를 포함한다. 이는 지나친 과량 투여 및 비효율적인 낮은 양의 투여를 막고 충분한 양의 항원을 투여할 수 있도록 해준다. 지질 제제는 또한 항원을 위산 및 소화 효소들에 의한 분해로부터 보호한다. 또한 지질계 제제 내의 면역원성 성분의 생존력 결실은 동결 건조 제품에서 보고된 것보다 현저히 낮다. 또한 습윤 또는 수분 환경하에서도 상기 제제의 비친수성 성질로 인하여 기능의 저하 없이 저장할 수 있다.

백신 제조에 있어 면역원의 안정성은 강력하고 오래 지속 가능한 방어 면역을 유도하기 위하여 중요하다. 이것이 본 발명의 조성물을 이용하여 이루어질 수 있다. 상기 조성물은 또한 제조가 간단하고, 생산하기에 더욱 알맞으며, 바늘과 주사기의 사용을 피할 수 있다는 점에서 소비자 수용성 증가 및 안전성을 확보하였다.

본 명세서는 클라미디아 및 헬리코박터 감염에 대한 점막 면역 유도의 직접 증거를 제공한다. 본 발명자들은 Lipid C에 포함된 MOMP로 마우스를 경구 면역처리하면 씨. 무리다룸의 생식기 감염에 대하여 BALB/c 마우스를 방어하는데 있어, 강력한 점막 보조제 CT 및 CpG와 혼합한 MOMP로 면역화한 경우만큼 효과적이라는 것을 예기치않게 발견하였다. 이것은 CT/CpG와 MOMP를 함께 면역처리한 경우와 비교하여 Lipid C로 면역처리한 마우스에서 관찰되는 낮은 수준의 IFNγ 생성 및 생식기 관의 항체 수준으로 보아 놀라운 것이었다. 중요한 것은, MOMP 및 CT/CpG 양자 모두를 포함하는 lipid C가 훨씬 더 높은 수준의 보호 결과를 나타냈다는 것이다. 이는 lipid C와 보조제를 조합하였을 때 시너지 효과가 있음을 의미한다.

본 발명자들은 또한 본 발명의 지질 조성물에 자외선("UV")-사멸 전세포 헬리코박터 파일로리 시드니 균주 1(에이치. 파일로리 SS1)을 포함시키면 생 미생물의 감염에 대한 점막의 면역 유도에 효과적이라는 사실을 예기치않게 발견하였다. 이에 추가로, 콜레라 독소("CT") 및 박테리아 CpG 올리고뉴클레오티드("CpG- ODN" 또는 "CpG")와 혼합된 상기 조성물은 또한 위장, 호흡기 및 생식기 점막에서 방어 면역을 유도하였다.

본 발명의 지질/항원 조성물에 의하여 제공되는 방어도는 항원과 함께 CpG/CT를 항원으로서 처리했을 때 관찰된 것과 비슷하였다. 그러므로, 본 발명의 지질 조성물은 CT 및 CpG의 유해한 부작용 없이 점막 면역을 제공한다.

점막 방어는 비장의 강한 IFNγ 사이토카인 발현 및 혈청과 점막 분비물 양자 모두에서의 항원 특이 항체와 관련되어 있다. 대개 IgG는 혈청 및 BAL 액체 내에서 검출되는 반면, IgA 생성은 생식기 세척 및 배설물 세척액에서 명확하다. 본 연구에서, 또한 MOMP를 제제화한 본 발명의 지질 조성물을 이용하여 경구 면역처리한 후 추가적인 보조제 CT 및 CpG의 첨가 없는 방어가 관찰되었다. 이것은 생 박테리아 감염 이후 호흡기 및 생식기 관 양자 모두에서 클라미디아 부하의 50% 감소라는 결과를 낳았다. 본 발명의 조성물로 경구 면역처리하면 다양한 점막 표면에 방어 면역을 효과적으로 이끌어낼 수 있었다.

경구 면역법이 통상 위장, 및 보다 적게는, 호흡기 병원체에 대한 방어를 유도하는데 이용되었지만, 많은 연구는 경구 면역법이 여성의 생식기 관을 표적으로 할 수 있다는 것을 증명하였다. 챠라콤베 등[Challacombe et al.(Vaccine 1997 Feb; 15(2): 169-75)]은 다가 D,L-락티드-코-글리콜리드(PLG) 마이크로 입자내의 오브알부민으로 경구 면역처리하면 질 세척액에서 OVA-특이 항체를 현저하게 이끌어낼 수 있다는 것을 보여주었다. 생 인플루엔자 바이러스로 경구 면역처리하면 방광, 자궁, 질 균질액 및 자궁 세척액에서 바이러스 특이 IgA를 이끌어낼 수 있었다(Briese V, et al., Arch Gynecol 1987;240(3): 153-7).

마우스를 정자 수용체 ZP3을 발현하는 재조합 살모넬라로 경구 면역처리하자 불임 뿐 아니라 질 분비물에서 ZP3-특이 IgA가 유도되었다(Zhang X et al.,(published erratum appears in Biol Reprod 1997 Apr;56(4): 1069). Biology of Reproduction 1997;56(1):33-41).

또한 클라미디아 글리코리피드 외항원에 대한 항-개별특이형 항체(anti-idiotypic antibody)를 함유하는 PLG 마이크로입자로 마우스를 경구 면역처리하자 부분적으로 씨. 트라코마티스 인간 균주의 생식기 감염에 대하여 마우스를 방어하였다(Whittum-Hudson JA, etal., Nature Medicine 1996;2(10): l 1 16- 21).

상기 모든 연구는 생식기 관에서의 면역을 이끌어내기 위하여 생(인플루엔자 바이러스) 미생물 또는 약독 미생물(살모넬라) 또는 PLG 마이크로입자 내로 항원의 포함을 필요로 하였다. PLG 마이크로입자의 생산은 고비용이고 용매 추출법의 사용은 일부 단백질 항원의 면역원성을 파괴할 수 있다. 게다가, 생 클라미디아 백신의 사용은 트라코마를 방지하기 위하여 생 백신 및 사멸 백신을 시도한 후에 나타났던 염증 반응의 증가로 인하여 승인될 것 같지 않다(Grayston JT, Wang SP. Sexually Transmitted Diseases 1978;5(2):73-7).

Lipid C는 오로지 일상식의 일부로서 소비되는 식품-등급의 지질로만 구성되고 성분들의 간단한 혼합에 의하여 쉽게 제조될 수 있기 때문에 제조의 용이성 및 비용의 측면에서 리포좀 및 PLG와 같은 기타 미립자 전달 시스템을 넘어서는 현저한 이점을 제공할 수 있다. 게다가, Lipid C는 33℃ 미만에서 고체 형태가 되므로 저장 기간 중 항원 성분을 분해되지 않게 보호할 수 있고 따라서 백신의 효과적인 유통기한을 연장시킬 수 있다. BCG 포함 Lipid C는 긴 저장 기간 동안 확실하게 4℃ 및 실온 양자 모두에서 그 생존력을 상승시켰다(Aldwell FE, et al., Vaccine 2006 Mar 15;24(12):2071-8).

본 발명의 지질 제제의 작용 기전이 완전히 파악되지는 않았다. 그러나, Lipid C의 보조제 또는 담체로서의 효과는 어떤 특정한 작용 기전과 결합되지 않고 많은 인자로부터 기인한 것일 수 있다. 우선, 지방은 췌장 효소에 의하여 위장이 아닌 소장에서 분해되기 때문에(Armand M. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2007 Mar; 10(2): 156-64), 본 발명의 조성물은 위장의 소화 과정 및 산성 pH로부터 항원을 분해되지 않게 보호할 수 있고 소장의 페이에르 판 또는 장의 수지상 세포와 같은 면역 유도 지점으로 항원을 전달할 수 있다(Rescigno M, et al. Nat Immunol 2001 ;2(4):361-7).

지질은 또한 지질 부유체 및 막 유동성에 대한 영향을 통하여 이들 면역 유도 지점에서 면역 세포의 기능에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다. 지질 부유체는 효과적인 세포-세포 신호전달을 위하여 지질 부유체에서 군집할 필요가 있는 MHC 분자, T 세포 및 B 세포의 수용체와 같은 신호전달 분자로서 면역 세포간 신호전달에 필수적이다(Horejsi V. Immunol Rev 2003 Feb;191 : 148-64; Dykstra M, et al., Annu Rev Immunol 2003;21 :457-81 ; Anderson HA, et al., Nat Immunol 2000 Aug; 1(2): 156-62).

지질 부유체는 통상 세포막의 주변 지역보다 많은 양의 포화 지방산을 함유하고 Lipid C에서 지질 부유체의 기능은 상기 포화 지방산에 의하여 상승되는 것이 가능하다. 반면, 불포화 지방산의 비율이 증가하면 막의 유동성이 증가할 수 있고, 이는 식균작용을 상승시켜 그 결과 잠재적으로 APC에 의한 항원 흡수를 증가시킬 수 있다(Mahoney EM, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1977 Nov;74(l l):4895-9; Weatherill AR, et al., J Immunol 2005 May l ;174(9):5390-7; Schweitzer SC, et al. J Lipid Res 2006 Nov;47(l l):2525-37).

항염증 효과를 가지고 림프구 자극을 억제하는 다양한 지질들이 또한 보고되고 있다(Calder PC, et al., Biochem Soc Trans 1989 Dec; 17(6): 1042-3; Calder PC, et al., Biochem Soc Trans 1990 Oct; 18(5):904-5). Lipid C의 보조제 효과에 어떤 기전들이 중요한지 결정하는 것이 유용할 것이다. 식품 등급 지질로부터 제제화된 보조제의 낮은 독성은 점막 백신에 또 다른 중요한 이점을 제공할 수 있다. 점막 반응은 일반적으로 수명이 짧은데, 이는 형질세포의 짧은 반감기 및 정상적인 생식 순환의 일부로서 여성의 생식기 관에서의 조직 재구성 때문이다. 면역의 방어 수준을 유지하기 위하여는 이렇게 잦은 부양이 필요하다. Lipid C에 대한 본 연구 및 다른 연구들에서 본 발명자들은 Lipid C의 다량 경구 투여에 대한 어떠한 부작용도 관찰하지 못하였고 이는 잦은 사용에 있어서도 잘 저항할 수 있음을 의미한다.

매개 동물의 백신

동물의 질병을 감소시키는 한 가지 방법은 그 동물의 병원체에의 노출을 감소시키는 것이다. 특정 병원체들의 경우, 매개 동물은 비록 그 동물이 질병의 신호 또는 징후를 나타내지 않는다 하더라도 병원체 "풀(pool)"을 제공할 수 있다. 그러므로, 주머니쥐, 오소리, 소, 설치류, 사슴 및 그 유사한 동물들과 같은 야생 동물의 백신 접종은 병원체에 의하여 야기되는 질병의 발생 정도를 감소시키는 데 효과적일 수 있다. 매개 동물을 백신 접종하기 위하여, 점막 경로로 백신을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 그러므로 경구 백신은 현실적이고 비용 효율적인 전달 방법이다. 따라서, 특정 실시 상태에 있어서, 본 발명의 지질 조성물은 백신 접종될 매개 동물에 기초하여 선택될 수 있는 유인제, 향료 및 방향제를 포함할 수 있다. 인간의 경구 백신 접종은 또한 비용 효율적 백신 접종 방법이고 사용자들이 선호할 것이다.

이에 더하여, 피하 경로와 같은 다른 방법으로 투여되면, 본 발명의 상기 지질 제제는 예를 들어, 대식세포 또는 기타 청소세포의 공격으로부터의 방어를 제공할 수 있다. 피하 투여, 또는 주입에 의한 투여로 지질 창고인 상기 제제는 또한 지속적인 방출을 가능하게 하여 감염 과정을 모방하고, 면역 반응의 증가를 용이하게 한다.

상기 조성물들은 생식기, 눈 기관, 위장 및 호흡기 병원체 등의 광범위한 감염 미생물에 대한 면역 반응을 유도하는데 효율적일 수 있다. 한 예로서, Lipid C는 생식기 관 및 위장관에서, lipid PK는 상부 및 하부 소화관 및 호흡기 관에서 면역 반응을 이끌어내는 데 효과적일 수 있다.

본 발명의 조성물들은 또한 광범위한 항원들의 백신 전달 시스템으로 사용될 수 있고, 또는 면역원성 분자, 특히 투여량이나 면역원성이 약하다는 이유의 면역원성 분자들의 공동 전달 또는 짝 전달용으로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물들은 또한 백신 보조제로서도 유용하고 종래의 보조제들과 함께 전달될 수도 있다(예컨대, Freund의 완전 보조제 또는 불완전 보조제).

본 발명을 특정 실시 상태를 참조하여 설명한다. 본 발명의 기타 특징들은 다음의 도면들을 참조함으로써 이해할 수 있다.
도 1A 및 1B는 혈청(도 1A) 및 질 세척액(도 1B)에서의 MOMP-특이 항체 IgG 및 IgA를 ELISA로 측정한 그래프를 나타낸다. y축은 면역화 그룹의 종말점 역가(E.T.P)를 비면역화 대조군의 E.T.P로 나누어 결정한 E.T.P의 비를 나타낸다. Lipid C와 클라미디아 MOMP는 함께, 비면역화 대조군과 비교하여, CpG/CT와 MOMP를 함께 처리하여 관찰한 것과 유사한 결과인 약 두 배의 IgG를 생성하였다. 본 발명자들은 lipid C가 클라미디아 MOMP 항원에 대한 질 점막의 면역 반응을 증가시킬 수 있다고 결론지었다. 결과는 각 실험에서 그룹당 5 마리 마우스를 포함한 개별적인 두 실험을 대변한다. 비면역 대조군과 비교하여 * p<0.05, ** p 0.01이다. 에러바, 평균의 표준 오차.
도 2A 및 2B는 씨. 무리다룸으로 생 박테리아 감염시킨 후 질 면봉 표본으로부터의 박테리아 회수량의 그래프를 나타낸다. 씨. 무리다룸으로 질 내 감염시킨 후 질 면봉 표본을 면역화 마우스(MOMP와 CpG/CT의 혼합, Lipid C 제제화 MOMP 또는 Lipid C 제제화 MOMP와 CpG/CT의 혼합) 및 대조군 마우스로부터 3일 간격으로 수집하였다. 질 면봉 표본으로부터의 살아있는 박테리아의 회수량(bacterial recovery)(박테리아 분출량(bacterial shedding))을 3일 간격의 세포 배양을 통하여 측정하였다(도 2A). 총 감염 수준을 각 곡선하면적을 측정함으로써 결정하였다(도 2B). 결과는 각 실험에서 그룹당 5 마리 마우스의 개별적인 두 실험을 대변한다. 본 발명자들은 MOMP에만 노출된 동물들과 비교하여 lipid C와 MOMP가 함께 박테리아 분출량을 약 60% 감소시킨다는 것을 예기치않게 발견하였다(도 2B). CpG/CT와 MOMP는 함께 박테리아 분출량을 약 57% 감소시켰다. 게다가, 본 발명자들은 CpG/CT + MOMP로 처리한 동물들과 비교하여 lipid C가 박테리아 분출량(lipid C + MOMP + CpG/CT)을 약 48%까지 감소시킨다는 것을 발견하였다. 비면역 대조군과 비교하여 * p<0.05, ** p 0.01이다. 에러바, 평균의 표준 오차. 이들 결과는 질 점막의 면역 반응을 증가시키기 위하여 lipid C가 CpG/CT와 시너지적으로 작용할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 3A 및 3B는 혈청(위) 및 분립액(아래)에서의 에이치. 파일로리 특이 항체의 그래프를 나타낸다. IgG 및 IgA를 ELISA로 측정하였다. y축은 면역화 그룹의 E.T.P를 비면역화 대조군의 E.T.P로 나누어 결정한 종말점 역가(E.T.P)의 비를 나타낸다. 결과는 각 실험에서 그룹당 5 마리 마우스를 포함한 개별적인 두 실험을 대변한다. 도 3A는 Lipid C가 비면역 대조군과 비교하여 혈청에서의 에이치. 파일로리 특이 IgG의 생성을 증가시킴을 보여준다. 게다가, 도 3B는 Lipid C가 분립에서의 에이치. 파일로리 특이 IgA의 생성을 증가시킴을 보여준다(도 3B). lipid C와 에이치. 파일로리 항원으로 관찰된 방어도는 박테리아 회수량에 있어서 약 25%의 감소였고, 이는 생물 내에서의 박테리아 부하의 감소를 나타낸다. 이들 결과는 lipid C가 위장관에서의 점막 면역을 촉진할 수 있음을 나타낸다.
도 4A, 4B, 및 4C는 혈청(도 4A), 기관지-폐 세척액(도 4B) 및 질 세척액(도 4C)에서 클라미디아 MOMP 특이 항체의 그래프를 나타낸다. IgG 및 IgA의 역가를 ELISA로 측정하였다. y축은 면역화 그룹의 E.T.P를 비면역화 대조군의 E.T.P로 나누어 결정한 종말점 역가(E.T.P)의 비를 나타낸다. 결과는 각 실험에서 그룹당 5 마리 마우스를 포함한 개별적인 두 실험을 대변한다. 비면역 대조군과 비교하여 * p<0.05, ** p 0.01이다. 에러바, 평균의 표준 오차. 경구의 lipid C와 MOMP의 합은 혈청 IgG의 보통 수준의 증가를 일으켰다(도 4A). 경구의 lipid C와 MOMP의 합은 호흡기 관에서 거의 효과를 나타내지 못하였다(도 4B). 반면, 경구의 lipid C와 MOMP의 합은 질의 MOMP 특이 IgA를 약 2배까지 증가시켰다(도 4C).
도 5는 에이치. 파일로리 SS1으로 위장 내 감염한 후 박테리아 회수량의 그래프를 나타낸다. 최종 면역처리 일주일 후 마우스를 1 x 10⁷ cfu의 헬리코박터 파일로 리 SS1으로 두 벌 위장 내 접종 감염시켰다. 생 박테리아 감염 후 제 6주에 위 조직을 균질화하고 GLAXO 보충성분(실험재료 및 방법 참고)을 함유하는 CSA아가(agar) 플레이트에서 6일간 배양하였다. y축은 균질화된 위 조직의 그램당 콜로니 형성 단위(cfu/gram) 수를 나타내고, 로그 단위로 표현된다. 비면역 대조군과 비교하여 lipid C와 에이치. 파일로리 SS1 항원을 조합하여 면역처리하면 위장 내 접종 6주 후 위 조직으로부터 회수되는 박테리아가 약 25% 감소하는 결과를 낳았다. 에이치. 파일로리 항원과 CpG/CT의 합은 박테리아 회수량을 감소시켰고, lipid C의 첨가는 비면역 대조군과 비교하여 약 85%까지 박테리아 회수량을 더 감소시켰다. 결과는 개별적인 두 실험을 대변한다. 비면역 대조군과 비교하여 * p<0.05이다; 실험당 각 그룹의 동물 n=5. 에러바, 평균의 표준 오차. 이들 결과는 lipid C를 함유하는 경구 조성물이 위에서의 에이치. 파일로리에 대한 점막 면역을 촉진할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 6은 씨. 무리다룸으로 생 박테리아 감염한 후 폐 조직으로부터의 박테리아 회수량의 그래프를 나타낸다. MOMP와 CpG/CT의 혼합, lipid C 제제화 MOMP 또는 lipid C 제제화 MOMP와 CpG/CT의 혼합으로 경구 면역처리된 암컷 BALB/c TCI 및 비면역 대조군 마우스를 생 씨. 무리다룸으로 비강내로 감염시켰다. 폐를 박테리아 감염 12일 후(감염 최고점)에 잘라내어 회수된 생 클라미디아의 양을, 배양으로 측정하였다. 결과는 개별적인 두 실험을 대변한다. 이들 결과는 lipid C와 MOMP를 함께 경구 면역처리하면 비면역 대조군과 비교하여 클라미디아의 회수를 감소시킨다는 것을 보여준다. 비면역 대조군과 비교하여 * p<0.05이다; 실험당 각 그룹의 동물 n=5. 에러바, 평균의 표준 오차.

실시예

이하의 실시예들은 본 발명의 특정 실시 상태들을 구체적으로 설명하기 위하여 제시된 것이다. 이 기술 분야의 숙련된 기술자라면 본 명세서 및 명세서의 지침을 쉽게 응용하여 과도한 실험 없이 다른 실시 상태들을 만들어 낼 수 있을 것이라고 여겨진다. 이러한 모든 실시 상태들도 본 발명의 일부로 고려한다.

실시예 1: 재조합 클라미디아 MOMP 의 제조

마우스에서의 클라미디아 및 그 감염성은 인간 질환에서 발견되는 그것과 매우 유사하며, 따라서, 이러한 감염, 그 성질 및 그 치료법에 대한 연구는 인간의 치료법에 대한 예상을 매우 높인다. 클라미디아 감염 연구를 위하여, 주요 외막 단백질(MOMP)를 Berry 등의 방법을 응용하여 정제하였다(Berry, LJ. , et al., Infect Immun, 2004. 72(2): p. 1019-28). 간단히, 말토오스 결합 단백질(MBP)-MOMP 융합 단백질[친절하게도 Harlam Caldwell - Rocky Mountain Labs에서 제공, Hamilton, Mont.(Su, H., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(20): p. 1 1 143-8]을 코딩하는 pMAL-c2 벡터를 발현하는 형질전환 대장균(DH5α{pMMM3})을 앰피실린 영양 아가(agar)에서 배양한 후 소니케이션(sonication)을 통하여 수확(Berry 등의 방법에서와 같이)하여 분리하였다.

씨. 무리다룸의 주요 외막 단백질(MOMP)을 말토오스 결합 단백질(MBP)-MOMP 혼성 재조합 단백질(친절하게도 Harlam Caldwell - Rocky Mountain Labs에서 제공)을 코딩하는 pMAL-c2 벡터를 발현하는 형질전환 대장균(DH5α{pMMM3})으로부터 Berry 등의 방법으로 정제하였다. 씨. 무리다룸은 마우스의 생식기 관의 감염을 야기하는 미생물이다.

MOMP를 제조사의 설명에 따라(Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australia) 준비한 투석 튜브를 이용하여 8 M 우레아로부터 PBS(pH 7.2)로 정제하고 리폴딩(refolding)하였다. 단백질 농도를 Pierce BSA 단백질 측정 키트를 이용하여 측정하고, 필요할 때까지 -20℃에 보관하였다.

실시예 2: 에이치. 파일로리 에 대한 면역처리용 항원의 제조

에이치. 파일로리 감염 연구를 위하여, Sutton 등에 의하여 출판된 바와 같이(Sutton, P., et al., Vaccine, 2000. 18(24): p. 2677-85) 혈액 아가 베이스 No. 2(Oxoid Ltd., Basingstoke, England)에 5%(v/v) 멸균 말 혈액 및 Skirrow 보충제로 이루어지는 캄필로박터 선택 아가(CSA)에서 배양된 에이치. 파일로리 시드니 균주 1[친절하게도 Dr. Hazel Mitchell이 제공, University of New South Wales(Lee, A., et al., Gastroenterology, 1997. 112(4): p. 1386-97]을 이용하여 사멸된 전체 항원을 제조하였다. 플레이트에서 멸균 PBS로 수확하고 McFarland 표준을 이용하여 농도(ml당 콜로니 형성 단위)를 설정하였다. 생 박테리아를 자외선(UV) 조사에의 노출 및 배양 중 이루어진 박테리아 생존력의 결손을 통하여 비활성화시켰다. 에이치. 파일로리 사멸 전세포를 사용할 때까지 -20℃에 보관하였다.

실시예 3: 면역처리 조성물 I의 제조

1% 미리스트산, 25% 팔미트산, 15% 스테아르산, 50% 올레산 및 6% 리놀레산을 함유하는 분획화 및 정제된 트리글리세리드로 이루어지는 lipid C 제제를 Immune Solutions Ltd(Dunedin, New Zealand)가 제공하였다. 클라미디아 감염 연구를 위하여 200μg MOMP를 항원으로 사용하였고 10⁷cfu의 에이치. 파일로리 전세포를 헬리코박터 면역처리를 위하여 사용하였다. 면역화 그룹은(1) 비-면역화 대조군 동물들,(2) lOμg CpG-ODN 1826(5'- TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT -3 ' ; SEQ ID NO: 1)(Geneworks) 및 1Oμg 콜레라 독소(Sapphire Biosciences)(CpG/CT)와 혼합한 항원으로 처리한 동물들,(3) lipid C 및 항원 단독, 및(4) lipid C와 항원을 CpG/CT와 혼합한 것을 포함한다.

Lipid C, MOMP, CT 및 CpG를 3-구 꼭지 및 2개의 주사기를 이용하여 혼합하여 150 μl의 Lipid C가 200 μg의 MOMP와 CT(10 μg) 및 CpG(10 μg)을 각각 또는 함께 포함하도록 하였다. CT 및 CpG의 이러한 사용량은 최적 보조제 효과를 제공하는 것으로 이미 알려져 있었고, 따라서 CT 및 CpG만 없는 면역원으로 처리한 동물들과 비교하였을 때, 면역 반응을 극대화하는 충분량을 나타낸다. 지질 제제화 하지 않는 MOMP 백신에 대하여는, CT 및 CpG를 각각 또는 조합하여 PBS에서 제조하였다. 모든 제제화 백신은 첫번째 면역처리 전에 제조되었고 필요할 때까지 4℃에서 보관되었다. 제제화되지 않은 백신은 각 면역처리 당일에 제조되었다.

실시예 4: 마우스의 면역처리

특정 병원체 프리[SPF(specific pathogen free)]암컷 BALB/c 마우스를 동물 지원 센터(ARC)(Perth, WA)로부터 구하였다. 마우스를 표준 주야 순환 조건 하에서 길렀고 멸균 음식 및 물을 자유롭게 먹을 수 있도록 제공하였다. 뉴캐슬 대학 동물 보호 및 윤리 위원회가 모든 과정을 승인하였다.

이소플루오레인 마취하에 볼-말단 주사를 이용하여 경구 위관영양법에 의하여 주당 3회의 시간 간격으로 면역처리 용액 150 μl로 마우스를 면역화시키고, 3 주 후 증가시켰다. 대조군 동물들을 면역화하지만 않고 동일하게 처리하였다.

클라미디아 또는 헬리코박터로 감염시킨 마우스는 그로부터 인간에서 관찰되는 효과를 합리적으로 예측하게 해주는, 기술분야에서 인정된 시스템이다. 그러므로, 본 발명의 조성물을 이용하여 이들 쥐과의 시스템에서 얻은 결과는 클라미디아 또는 헬리코박터에 의하여 영향받는, 인간에게서 관찰되는 효과를 대변한다.

실시예 5: 샘플 수집 및 MOMP -특이 IgG 및 IgA ELISA 분석 I

상기 실시예 4에 따라 면역화된 동물에 대하여 최종 면역처리하고 일주일 후, 50 μl의 멸균 PBS로 질원개를 세척하여 질 세척액(VL)을 수집하였다. 치사량의 소듐 펜토바르비톤을 투여한 후 심장에서 피를 뽑아 혈액을 수집하였다.

혈청 및 VL 내의 MOMP 특이 IgG 및 IgA를 ELISA로 측정하였다. 붕산염 완충 용액(pH 9.6)에 희석한 씨. 무리다룸의 MBP-MOMP(2μg/웰)를 Greiner immunopure ELISA plates(Interpath Ltd, Australia)에 코팅하고 4℃에서 밤새 반응시켰다. 플레이트를 0.05% Tween 20 포함 PBS(PBST)로 세 번 세척하고 37℃에서 1 시간 동안 5% 송아지 태아 혈청(foetal calf serum)을 포함하는 PBST 100 μl로 블로킹하였다. 플레이트를 세 차례 PBST로 세척하고, 100 μl 샘플을 두 벌 첨가하여 순차적으로 PBST로 2 배 희석하였다. 혈청을 PBST로 1/100 내지 1/12800로 희석하고, VL 액체는 1/20 내지 1/2560으로 희석하였다. 멸균 PBS를 각 ELISA의 음성 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 덮고 한 시간 동안 37℃에서 반응시키고 그 후 PBST로 세 번 세척하였다. MOMP-결합 항체를 각각 1/500 및 1/1000으로 희석된 HRP-결합 항 IgA 또는 HRP-결합 항-IgG(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), 뒤이어 테트라메틸벤지딘(TMB) 발색 시스템을 이용하여 검출하였다. 종말점역가(E.P.T)는 PBS 대조군 웰의 평균값 + 2 개 표준 편차로 정의하였다. 항원 특이 항체 비율은 면역화된 샘플 '시험' 그룹의 E.P.T를 비 면역화된 대조군의 E.P.T로 나누어 계산하였다.

실시예 6: T-세포 증식 및 사이토카인 생성 I

상기 실시예 1에서와 같이 처리한 동물들로부터 비장 림프구를 준비하고, CFSE로 표지한 후 완전 RPMI 배지(5% FCS, L-글루타민, 5 x 10^-5 M 2-머캅토에탄올, HEPES 완충용액, 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 , 모두 Trace Biosciences에서 구입)에 ml당 5 x 10⁶세포가 되도록 현탁한다. 세포를(lOOμl) 96 웰 플레이트에 세 벌씩 첨가한다(염색하지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용한다). 배지(백그라운드 대조군), 항원 MOMP(2μg/웰) 또는 Con A(2μg/웰)(양성 대조군)를 적당한 웰에 첨가한다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 96 시간 동안 배양하고 그 후 원심 분리에 의하여 세포를 수집하였다. 세포를 PECy7 사전-결합 CD3 항체(Becton Dickinson)로 염색하고 증식된 T 세포를 FACSCanto flow cytometer(Becton Dickinson, Sydney, Australia)를 이용하여 분석하였다. 항원과 함께 인 비트로 배양으로 증식한(> 3 회 세포 분열) 유도 T 세포의 퍼센트를 Weasel 소프트웨어(Walter and Elisa Hall Institute, Melbourne, Australia)를 이용하여 측정하였다.

실시예 7: MOMP -특이 T-세포 반응 I

T 세포 증식을 CFSE를 이용한 염료 희석 실험으로 시험하였고 3 회보다 많은 세포 분열이 이루어진 CD3+ 세포의 퍼센트로 표현하였다. MOMP + CT/CpG로 면역화한 마우스로부터 세포 재자극 인 비트로 실험 결과는 10.2%(7-13% 범위)의 세포가 3회 초과 분열을 경험한 반면 Lipid C에 MOMP를 포함하여 면역화한 동물로부터의 CD3+ 지라세포 중 9.7%( 8-11% 범위)가 증식하였다. Lipid C에 MOMP 및 CT/CpG 양자 모두를 조합하여 면역처리한 결과 인 비트로 자극 후 9.9%(8-11% 범위)의 CD3 T 세포의 증식이 있었다(표 1).

표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, T-세포 증식은 M0MP + CpG/CT 및 Lipid C + MOMP, 및 Lipid C + MONP + CT/CpG의 조합에 의하여도 증가하였다. 게다가, 인터페론 감마(IFNγ)는 Lipid C에 MOMP를 포함하여 면역화한 동물들과 비교하여 CT/CpG 보조제로 면역화한 동물들의 모든 실험 그룹 세포에서 높은 수준으로 생성되는 우세한 사이토카인이었다. MOMP와 CT/CpG를 함께 면역화한 동물들의 세포에서 또한 가장 많은 Th2 사이토카인 IL-4 및 IL-10의 생성을 볼 수 있었다. 비면역화 대조군과 비교하여 모든 실험 그룹의 세포들에서 IL-1O 및 IL-12 생성의 소량 증가를 볼 수 있었다.

이들 결과는 클라미디아로 감염된 마우스가, 이 미생물에 노출된 인간에서 볼 수 있는 반응과 유사하게 면역적으로 반응한다는 것을 나타낸다(예컨대, T-세포 증식 및 IFNγ 생성). 이들 결과는 또한 쥐과 시스템에서 관찰된 결과들로부터 인간에게서 관찰될 효과를 예측할 수 있음을 나타낸다.

실시예 8: MOMP -특이 항체 I

최종 면역처리하고 일주일 후 MOMP-특이 항체가 혈청 및 질 세척액에서 검출되었다(도 1). 도 1A은 MOMP + CT/CpG 로 면역처리한 동물들에서 혈청 IgG 항체가 가장 많았고(비면역화 대조군과 비교하여 EPT 비율 >30, p <0.05) 또한 Lipid C에 포함된 MOMP 및 CT/CpG 양자 모두로 면역처리한 동물들에서 또한 현저하게 증가하였음을(EPT 비율 >20, p <0.05) 나타내고 있다. Lipid C에 MOMP를 포함하여 면역처리한 동물들에서 혈청 IgG 수준이 5배 증가하였음을 볼 수 있다(도 1A).

MOMP + CpG/CT로 면역처리된 마우스로부터 수집된 질 세척액(VL)도 또한 비면역화 대조군과 비교하여 통계적으로 의미있는 10배 증가로 IgG 수준의 상승을 나타내었다(p<0.05). 이에 더하여, lipid C와 MOMP는 함께 VL 액에서 IgG 2배 증가를 나타내었다(도 1B).

이들 결과는 본 발명의 조성물을 사용한 면역처리가 항체 반응을 이끌어내는 데 효과적이라는 것을 나타낸다(예컨대, IgG 생성). 본 발명자들은 lipid C가 클라미디아 MOMP 항원에 대한 질 점막의 면역 반응을 증가시킬 수 있다는 결론을 얻었다. 이들 결과는 클라미디아로 감염된 인간에서 보여지는 효과를 예측케 한다.

실시예 9: 씨. 무리다룸 의 생식기 감염에 대한 방법 및 박테리아 회수량 I

질 내 감염 7일 전 실시예 1에 따라 또는 대조군 중 어느 하나로 처리된 모든 마우스는 2.5 mg의 메드록시프로게스테론 아세테이트(Depo-Ralovera; Kenral, Rydalmere, New South Wales, Australia)를 피하로 주입받았다. 마우스를 크실라진(90 mg/kg) 및 케타민(lO mg/kg)으로 마취하고, 20 μl의 수크로오스 포스페이트 글루타메이트(SPG) 내 씨. 무리다룸 5 xlO⁴ ifu로 질 내로 감염시켰다. 감염을 21일간 진행시켰다. 질의 면봉 채취 표본 (nasopharyngeal Calgiswab, Interpath)을 차가운 멸균 SPG에 녹여, 감염 0일부터 18일까지 3일 시간 간격으로 클라미디아 감염의 제거를 모니터하였다. 면봉을 500 μl의 멸균 SPG와 두 개의 유리 비드를 포함하는 멸균 에펜도르프 튜브에 넣고 볼텍싱한 후 -80℃에 보관하였다. 박테리아의 회수량을 이미 개시되고(Barker CJ, et al., Vaccine 2008 Mar 4;26( 10): 1285-96) 응용된 바와 같이(Hickey, D.K., et al., Vaccine 2002 22:4306-4315) McCoy 단층 세포 상에 인 비트로 세포 배양하여 측정하였다.

간단히, McCoy 세포는 DMEM 완전 배지(5% FCS, HEPES 완충용액, 5 μg/ml 젠타마이신, 및 lOO μg/ml 스트렙토마이신)로 48 웰 편평 바닥 플레이트에서 70%의 세포 밀도까지 생장하였다. 20 μl의 혈청 또는 질 세척액을 1000 봉입-형성 단위(IFU)의 씨. 무리다룸( 씨. 트라코마티스 마우스 간질성폐렴의 이란성형, ATCC VR-123) 일차체(EB)와 37℃에서 30분간 반응시켰다. 상기 항체와 씨. 무리다룸 용액을 DMEM 완전 배지(최종 부피 250 μl)에서 배양한 McCoy 세포에 첨가하여 5% CO₂, 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 1 μg/ml의 시클로헥사마이드(Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australia)를 포함하는 신선한 DMEM(500 μl)을 각 웰에 첨가하고, 그 후 5% CO₂, 37℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 클라미디아 봉입체의 존재에 대하여 플레이트를 광학 현미경으로 관찰하였고, 각 포인트에서 세포를 PBS로 2회 세척하고 100% 메탄올에서 10분간 고정시킨 후 클라미디아-특이 염색하였다.

통계적 분석. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타내었다. 각 그룹의 면역글로불린 농도 및 인 비트로 중화 활성 간의 차이점을 시험하기 위하여 일방 변량분석(ANOVA) 후 Bonferroni의 사후-시험을 이용하였다. 모든 시험에서 유의미한 수준을 P<0.05로 설정하였다. 모든 통계 시험은 윈도우즈용 GraphPad Prism version 4.00을 이용하여 수행되었다(GraphPad Software, San Diego California, USA).

실시예 10: 클라미디아 의 생식기 감염에 대한 방어 I

3일 간격으로 수집한 질의 면봉 표본을 인 비트로 배양하여 생 박테리아 감염 후 박테리아의 분출량을 측정하였다(도 2). 도 2A는 면역화된 동물들 및 대조군 동물들에서 씨. 무리다룸의 감염 후 시간에 따른 감염 형성 단위(IFU)의 회수 효과를 보여준다.

도 2B는 총 감염성이 각 곡선하 총 면적을 측정함으로써 구한 그래프를 보여준다. MOMP 단독으로 경구 면역처리하면 비면역 대조군과 크게 차이가 없었다. MOMP 및 CpG/CT로 경구 면역처리하면 감염 최고점에서(제6일; 도 2A) 30%의 박테리아 분출량 감소라는 결과를 나타내었다. 감염 기간 18일 이후 MOMP 및 CpG/CT로 면역처리한 것은 비면역 대조군과 비교하여 50%의 감염성 감소라는 결과를 나타내었다(도 2B).

Lipid C에 MOMP를 포함시키면 총 감염성의 50% 감소(도 2B, p<0.05) 및 제6일에 박테리아 분출량의 60% 감소라는 결과를 나타내었다(도 2A). 가장 높은 수준의 생식기 방어는 Lipid C 제제화한 MOMP와 CpG/CT를 공동 투여로 경구 면역한 후에 관찰되었다. 이 그룹은 총 감염의 75% 감소 및 제6일에 회수되는 씨. 무리다룸의 75% 감소를 보여주었다(p<0.01). 모든 그룹에서 경구 면역법은 감염에 대한 부분적인 방어라는 결과를 낳았다. 그러나, Lipid C에 MOMP 및 CT/CpG 양자 모두를 포함시키는 것이 Lipid C에 MOMP만을 또는 MOMP 와 CT/CpG를 함께 면역처리한 동물들에서 보여지는 것 이상으로 현저하게 방어를 증가시켰다. 예기치않게, MOMP 및 CpG/CT를 함유하는 조성물에 lipid C를 첨가한 것이 클라미디아의 회수량을 더 감소시켰다. CpG/CT의 적용량은 그 자체로 최적이기 때문에, lipid C의 첨가에 의한 감염의 추가적 감소는 선행기술 보조제 CpG/CT 와 Lipid C 사이에 전적으로 예기치 못한 시너지 효과가 있음을 나타낸다.

이들 결과는 본 발명의 조성물을 이용하여 면역화하는 동물이 클라미디아에 의한 차후 접종으로 야기되는 감염을 현저하게 감소시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 게다가, 이들 결과는 클라미디아 감염에 대한 실질적인 면역 방어가 독성 보조제인 CpG 또는 CT를 필요로 할 것 없이 본 발명의 지질 조성물을 이용하여 얻을 수 있다는 것을 나타낸다. 이들 결과는 인간에게서 관찰되는 효과를 예측케 하고, 클라미디아 항원을 함유하는 종래 면역원성 조성물을 넘어서는 주요한, 예상치 못한 이점을 나타낸다.

실시예 11: 분석 II 를 위한 샘플 수집

혈청, 질 세척액, 기관지-폐포 세척액 및 분립 세척액을 최종 면역처리 1주일 후 얻어내었다. 혈청, 질 세척액(VL) 및 기관지-폐포 세척액(BAL)은 클라미디아 연구를 위하여 수집하였고 혈청 및 분립(FP) 세척액은 에이치. 파일로리 연구를 위하여 수집하였다. 심장의 최종 혈액 수집은 소듐 펜타바르비톤 치사량 하에 멸균 23 게이지 바늘 및 1 ml 주사기를 이용하여 수행되었고, 혈액은 그 후 멸균 1.5 ml 에펜도르프 튜브로 옮겨져 원심분리를 통하여 혈청을 획득하였다. 질 세척액은 질원개를 50 μl의 멸균 인산 완충된 살라인("PBS")로 세척하여 수집하였다. 그 액체를 0.5 ml 멸균 에펜도르프 튜브로 수집하였다. 기관지-폐포 세척액은 뭉툭한 23 게이지 바늘의 기관 내 삽입을 통하여 수집되었고, 폐를 750 μl의 행크 균형 염 용액("HBSS")으로 두 번 세척하여 멸균 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 수집하였다. 혈청, VL 및 BAL 샘플은 -20℃에 보관되었다.

두 개의 신선한 분립을 l μg/ml 콩 트립신 억제제를 함유하는 PBS 1 ml에 모아 15분간 볼텍싱하고 그 후 10000 rpm에서 10분간 고체를 제거하기 위하여 원심분리하였다. 상층액(800μl)을 200μl 글리세롤 + 20μl PMSF(200 mM, Sigma)를 포함하는 새 에펜도르프 튜브에 첨가하여 간단히 볼텍싱하고 -80℃에 보관하였다.

실시예 12: 항원 특이 IgG 및 IgA 를 측정하는 방법 ELISA II

혈청, VL, BAL 및 FP의 항원 특이 IgG 및 IgA의 수준을 효소결합면역흡착검사("ELISA")로 측정하였다. Greiner Immunopure™ ELISA plates(Interpath Ltd, Australia)를 면역화 모델에 따라 씨. 무리다룸의 MBP-MOMP(2 μg/웰) 또는 에이치. 파일로리의 거친 초음파분해물(0.05 μg/웰)로 코팅하고 붕산염 완충된 용액(pH 9.6)에 희석하여 4℃에서 밤새 배양한다. 플레이트를 0.05% Tween 20 포함 PBS(PBST)로 세 번 세척하고 37℃에서 1시간 동안 클라미디아 연구를 위하여는 5% 송아지 태아 혈청(foetal calf serum)을 포함하는 PBST 100 μl로, 에이치. 파일로리 연구를 위하여는 5% 무지방 우유를 포함하는 PBST로 블로킹하였다. 플레이트를 세 차례 PBST로 세척하고, 100 μl 샘플을 A 열에 두 벌 첨가하여 순차적으로 PBST로 2배 일곱 번 희석하였다. 혈청을 PBST로 1/100 내지 1/12800로 희석하였다. VL 액은 1/20 내지 1/2560으로 희석하였다. BAL 액 및 FP 세척액을 적절히 첨가하고 1/128로 희석하였다. 멸균 PBS를 각 ELISA의 음성 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 덮고 한 시간 동안 37℃에서 반응시키고 그 후 PBST로 세 번 세척하였다. MOMP-결합 항체를 각각 1/500 및 1/1000으로 희석된 HRP-결합 항 IgA 또는 HRP-결합 항-IgG(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL), 뒤이어 테트라메틸벤지딘("TMB") 색-현상 시스템을 이용하여 검출하였다(Hickey, D.K., et al., Vaccine, 2004. 22(31-32): p. 4306-15). 종말점역가(E.P.T) 경계선은 PBS 대조군 웰의 평균값 + PBS의 2 개 표준 편차로 측정하였다. 항원 특이 항체 비율은 면역화된 샘플 '시험' 그룹의 E.P.T를 비면역화된 대조군의 E.P.T로 나누어 계산하였다.

실시예 13: 비장 T 세포 증식 실험 II

전체 조직을 스테인레스 스틸 체)sieves)로 균질화하고 HBSS로 두 번 세척하여 비장세포 단일의 세포 현탁액을 제조하였다. 적혈구세포 용해 완충용액(NH₄Cl)을 첨가하여 적혈구를 용해시키고 HBSS로 두 번 세척하였다. 세포를 CFSE(최종농도 5μM)를 함유하는 멸균 PBS에 lO⁷/ml로 현탁하고 어두운 곳에서 10 분간 37℃에서 반응시켰다. CFSE 처리를 두 배 부피의 FCS를 첨가하여 중단하고 RPMI 완전배지(5% FCS, L-글루타민, 5 x 10^-5 M 2-머캅토에탄올, HEPES 완충용액, 페니실린-스트렙토마이신로 보충된 RPMI 1640, 모두 Trace Biosciences에서 구입)로 세 번 세척하였다.

세포를 5 x 10⁶ 세포/ml의 밀도로 현탁하고 96 웰 플레이트에 세 벌로 첨가하였다(염색하지 않은 세포를 음성 대조군으로 사용). 배지(백그라운드 대조군), 항원(클라미디아 MOMP 2 μg/웰 또는 에이치. 파일로리의 거친 초음파분해물 O.l μg/웰) 또는 콘코나발린 A("Con A"; 2 μg/웰)(양성 대조군)을 적당한 웰에 첨가하였다. 플레이트를 5% CO₂, 37℃에서 96 시간 동안 배양하고 원심분리로 수집하였다. 세포를 PerCy7 사전-결합 CD3 항체를 사용하여 염색하고 CFSE 표지된 T 세포를 규명하기 위하여, 양성 반응 세포를 FACSCanto™ flow cytometer(Becton Dickinson, Sydney, Australia)를 이용하여. 488 nm 형광에서 분석하였다. 항원을 처리한 인 비트로 배양에 의하여 증식 유도된(> 3회 세포 분열) T 세포의 퍼센트는 Weasel™ 소프트웨어(Walter and Elisa Hall Institute, Melbourne, Australia)를 이용하여 측정하였다.

실시예 14: 사이토카인 발현 실험 방법 II

비장세포 단일의 세포 현탁액을 상기 설명한 바와 같이 제조하였다. 세포를 5 x 10⁶ 세포/ml의 밀도로 RPMI 완전배지에 현탁하고 100 μl를 96 웰 플레이트에 세 벌로 첨가하였다(Greiner - Interpath Ltd). 배지(백그라운드 대조군), 항원(클라미디아 MOMP 2 μg/웰 또는 에이치. 파일로리의 거친 초음파분해물 O.l μg/웰) 또는 Con A(2 μg/웰)(양성 대조군)을 적당한 웰에 첨가하고, 5% CO₂, 37℃에서 72시간 동안 배양하였다. 상층액을 새 에펜도르프 튜브에 모아 Bioplex 분석으로 사이토카인 분석을 할 때까지 -80℃에 보관하였다. Bio-rad 6-plex 마우스 사이토카인 키트(Bio-Rad)로 배양 상층액의 IFNγ, TNFα, 인터류킨-12, 인터류킨-4, 인터류킨-10 및 과립성 백혈구 대식세포 콜로니 자극 인자("GMCSF")의 농도(pg/ml)를 알아냈고 제조사의 지시에 따라 Bioplex™ machine(BIO-RAD)로 분석하였다.

실시예 15: 헬리코박터 파일로리 SS1 감염 및 박테리아 회수량

37℃, 10% CO₂ 및 95% 습도의 조건에서 이틀간 5%(v/v) 말 혈청 및 스키로우 보충성분을 포함하는 뇌-심장 혼성("BHI") 배지 배양액(oxoid)에서 에이치. 파일로리 SS1을 배양하였다. 박테리아를 300 rpm에서 20분간 원심분리로 침전시키고 10⁸ cfu/ml의 농도로 현탁하였다. 약하게 이소플루로테인 마취한 상태에서 위관영양 바늘을 이용하여 3일 간격으로 2회, 100 μl의 박테리아 현탁액(~10⁷ cfu/마우스)을 마우스 위장내로 접종하였다. 최종 면역처리 일주일 후 동물을 감염시켰고 감염을 6주간 진행되도록 하였다. 마우스를 죽여 위를 잘라내어, 큰 쪽의 만곡부를 따라 절제하고, 내용물을 제거하기 위하여 살라인으로 세척하였다. 기저부를 제거하고 위를 작은 쪽의 만곡부를 따라 반으로 잘랐다. 조직의 절반을 칭량하여 500 μl BΗI에 넣었다. 위 조직을 Tissue Tearor™(Biospec Products Inc.)을 이용하여 균질화하고 10배 계대 희석물을 BHI에서 제조하였다. 각 희석액 100 μl(비희석액 내지 1:1000 희석액)를 Glaxo Selective Supplement A("GSSA", 반코마이신 10 μg/ml, 폴리믹신 B 0.33 μg/ml, 바치트라신 20 μg/ml, 날리딕신산 1.2 μg/ml 및 암포테라신 B 5 mg/ml)로 보충된 CSA 혈액 아가 플레이트(상기와 같다)에 도포하였다.

습하고, 미호기성인 37℃ 조건 하에서 6일간 배양한 후, 콜로니를 계수하고 위 조직 그램 당 콜로니 형성 단위("cfu")를 계산하였다. 에이치. 파일로리 특이 중합효소 사슬 반응("PCR") 도 또한 확인하였다. 제조사의 지침에 따라 DNA Wizard™ extraction kit(Promega)를 이용하여 균질화 조직(20 mg)을 추출하였다. GoTaq Green Master Mix™(Promega, Australia)를 이용하여 DNA의 PCR 증폭실험을 하였고(20 μl 반응) 헬리코박터 특이 프라이머 Hp 001(5' TATGACGGGTATCCGGC 3'; SEQ ID NO:2) 및 Hp 002(5' ATTCCACTTACCTCTCCCA 3'; SEQ ID NO:3)(서열은 친절하게도 Dr. Sutton, Melbourne University에 의하여 제공되었다)를 사용하였다. 증폭 조건은 95℃에서 2분, 이후 30 사이클은 94℃에서 각 2초, 53℃에서 각 2초, 72℃에서 각 30초이고 마지막 72℃단계는 5분간 진행하였다. 밴드를 에티디움 브로마이드를 함유하는 1.5% 아가로오스 겔 상에서 자외선으로 확인하였다.

실시예 16: 씨. 무리다룸 의 생식기 감염 및 박테리아 회수량

질 내 감염 7 일 전 모든 마우스는 2.5 mg의 메드록시프로게스테론 아세테이트(Depo-Ralovera; Kenral, Rydalmere, New South Wales, Australia)를 피하로 주입받았다. 마우스를 크실라진(90 mg/kg) 및 케타민(lO mg/kg)으로 복강내 마취하고, 20 μl의 수크로오스 포스페이트 글루타메이트(SPG) 내 씨. 무리다룸 5 xlO⁴ 감염 형성 단위("IFC")로 질 내로 감염시켰다. 감염을 21일간 진행시켰다. 감염 0일부터 18일까지 3일 시간 간격으로 수집한 질의 면봉 채취 표본 [nasopharyngeal Calgiswab^TM(Interpath) 차가운 멸균 SPG에 녹임]을 통하여 클라미디아 감염의 제거를 모니터하였다. 면봉을 500 μl의 멸균 SPG와 두 개의 유리 비드를 포함하는 멸균 에펜도르프 튜브에 넣고 -80℃에 보관하였다.

박테리아의 회수를 인 비트로 세포 배양하여 측정하였다. McCoy 단층 세포를 70%의 세포 밀도까지 생장시키고, 5% FCS, HEPES 완충용액, 젠타마이신(5 μg/ml) , 및 스트렙토마이신(lOO μg/ml)을 함유하는 신선한 DMEM 배지 300 μl를 함유하는 배양 웰에 10 μl의 볼텍싱한 면봉 용액을 첨가하였다. 5% CO₂, 37℃에서 3시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고 1 μg/ml의 시클로헥사마이드(Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australia)를 포함하는 신선한 DMEM 완전배지 500 μl로 교체하고, 그 후 5% CO₂, 37℃에서 밤새 배양하였다. 봉입체를 광학 현미경으로 관찰하였고, 각 포인트에서 세포를 PBS로 2회 세척하고 100% 메탄올에서 10분간 고정시킨 후 클라미디아 특이 염색하였다[Hickey 등의 방법에 따랐다.(Hickey, D.K., et al., Vaccine, 2004. 22(31-32): p. 4306-15)].

실시예 17: 씨. 무리다룸 의 호흡기 감염 및 박테리아 회수량

호흡기 감염을 위하여, 동물들을 약한 이소플루로테인으로 마취하고, 차가운 수크로오스 포스페이트 글루타메이트("SPG") 용액 내의 10³ IFU의 씨. 무리다룸을 비강내 접종을 통하여 투여하였다(각 콧구멍에 5 μl씩). 마우스를 그들의 우리로 되돌려 보내어 생물학적으로 안전한 PC2 조건 하에서 사육하고, 감염을 12일간 진행시켰다(추정되는 감염 최고점까지의 시간). 마우스를 죽여 무게를 단 왼쪽 폐를 2 개의 유리 비드를 포함하는 500 μl SPG로 모았다. 조직을 가위로 정교하게 잘라 1분간 볼텍싱하였다. 조직 5 mg을 70% 세포밀도까지 배양한 McCoy 단층 세포를 포함하고, DMEM 완전 배지(5% FCS, HEPES 완충용액, 5 μg/ml 젠타마이신, 및 lOO μg/ml 스트렙토마이신) 500 μl를 함유하는 48 웰 배양 플레이트에 넣고 5% CO₂, 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 1 μg/ml의 시클로헥사마이드(Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australia)를 포함하는 신선한 DMEM 완전배지 500 μl로 교체하고, 그 후 5% CO₂, 37℃에서 밤새 배양하였다. 봉입체를 광학 현미경으로 관찰하였고, 각 포인트에서 세포를 PBS로 2회 세척하고 100% 메탄올에서 10분간 고정시킨 후 클라미디아-특이 염색하였다[Hickey 등의 방법에 따랐다.(Hickey, D.K., et al., Vaccine, 2004. 22(31-32): p. 4306-15)].

실시예 18: 통계적 분석 및 결과

데이터는 각 실험 그룹에서 5마리 마우스에 대하여 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타내었다. 각 그룹의 면역글로불린 농도, ASC 수, 및 중화 능력 간의 차이점을 시험하기 위하여 일방 변량분석(ANOVA) 후 Bonferroni의 사후-시험을 이용하였다. 모든 시험에서 유의미한 수준을 P<0.05로 설정하였다. 모든 통계 시험은 윈도우즈용 GraphPad Prism version 4.00을 이용하여 수행되었다(GraphPad Software, San Diego California, USA, www.graphpad.com).

실시예 19: T 세포 반응 II

T 세포 증식을 CFSE 염료 희석 실험을 이용하여 측정하였다. 증식은 3회 초과의 분열을 경험한 CD3 양성 세포의 퍼센티지(%)로 나타내었다. MOMP 및 에이치. 파일로리의 초음파분해물 단독으로 처리하여도 본래 세포에서 낮은 수준의 세포 분열을 일으키기 때문에 3회의 세포 분열은 백그라운드에 대한 역치값이라고 생각되었다.

사멸된 에이치. 파일로리만으로 경구 면역처리한 후, CpG/CT와 혼합한 사멸된 전세포 에이치. 파일로리로 제제화한 lipid C로 면역처리한 마우스로부터 분리한 비장의 T 세포는 비면역화 대조군(1-2%)와 비교하여 증가된 분열(6-7%)를 보여주었다. 모든 면역처리 그룹에서 비면역화 대조군과 비교하여 MOMP 항원으로 경구 면역처리한 후에 세포 증식이 증가하였다. MOMP + CpG/CT로 면역화한 동물들의 인 비트로 세포 재자극 실험은 3회 초과의 증식 순환을 경험한 세포가 7-13%인 결과를 나타내었고 MOMP + lipid C로 면역화한 동물들은 7-11% 의 세포가 그러한 결과를 나타내었다. 보조제와 MOMP 항원을 함유한 lipid C 양자 모두를 조합한 결과는 8-11% T 세포의 증가를 나타내었다. 이 조합은 MOMP + CpG/CT 또는 lipid C 제제화 MOMP 단독으로 면역화한 동물들의 세포에서 볼 수 있었던 수준을 넘어서 T 세포 증식을 더 상승시키지는 못했다(표 2).

MOMP 또는 에이치. 파일로리 초음파분해물로 인 비트로 자극한 후의 사이토카인 생성을 Bioplex 분석을 이용하여 측정하였다. 양자의 면역화 모델의 모든 그룹에서 T 세포에 의하여 생성된 우세한 사이토카인은 IFNγ였다. CpG/CT 보조제로 면역화한 후 세포에서 생성된 IFNγ의 농도는 lipid C로 면역화한 동물들의 세포에서 관찰되었던 것과 비교하여 일반적으로 상승하였다. 사멸된 전세포 에이치. 파일로리로 면역화한 후 IL-4 수준은 일관되게 낮았으나(<10 pg/ml), MOMP와 CpG/CT를 혼합하여 면역화한 후의 클라미디아 연구에서는 >100 pg/ml의 결과가 관찰되었다. 일반적으로 모든 면역화 그룹의 IL-10 수준은 비면역화 대조군의 배양에서 보여진 수준을 넘어서 증가하였다. 그러나, MOMP 또는 사멸 전세포 에이치. 파일로리 항원을 lipid C에 제제화하였을 때 IL-10의 생성은 실험 간 변동이 컸다. 인 비트로 항원 자극 후 IL-12 생성 증가를 모든 면역화 그룹의 세포 배양에서 관찰할 수 있었으나, lipid C 제제화 항원 단독 처리 그룹에서는 양 모델 모두 실험 간 변동이 관찰되었다(표 2). IFNγ가 지배적인 사이토카인이었다.

표 2는 인 비트로에서 최종 면역처리 일주일 후 측정된 항원 특이 비장 T 세포 증식 및 사이토카인 발현을 보여준다.

표2

경구 면역처리는 모든 그룹에서 최종 면역처리 일주일 후 비장으로부터 분리한 MOMP 특이 T 세포의 증식을 크게 유도하였다. 사이토카인 생성의 정량은 Bioplex 분석을 통하여 결정되었고 pg/ml로 나타내었다. 결과는 두 개의 개별적인 실험을 나타낸다.

이들 결과는 에이치. 파일로리 또는 클라미디아 감염 후에 마우스는 T 세포 증식 및 염증 매개체의 생성 증가로 통상적인 면역 반응으로 반응한다는 것을 나타낸다. 이에 더하여, 본 발명의 조성물을 이용한 면역법은 에이치. 파일로리 또는 클라미디아 접종에 대한 면역 반응을 증가시키는데 효과적이었다. 이들 결과는 또한 본 발명의 조성물을 이용하여 독성 CpG 또는 CT를 사용하지 않고도 실질적인 면역 방어를 이끌어 낼 수 있다는 것을 보여준다. 이들 결과는 인간에게서 관찰될 효과를 예측하게 해주고 선행기술 조성물을 넘어서는 기대치 않았던 개선효과를 나타낸다.

실시예 20: 헬리코박터 특이 항체

마우스를 사멸 전세포 에이치. 파일로리로 경구 면역처리한 후, 혈청 및 분립(FP)에서의 항원 특이 항체의 생성을 에이치. 파일로리의 거친 세포 초음파분해물로 코팅한 ELISA 플레이트를 이용하여 검출하였다. 경구 면역법은 전신의 IgG 및 배설물 내의 IgA 에이치. 파일로리 항체의 생성을 이끌어냈다(도 3). 사멸 전세포 에이치. 파일로리와 혼합한 CpG/CT로 면역처리한 후 비면역화 대조군과 비교하여 각각 혈청의 IgG 및 배설물의 IgA가 4배(p<0.05) 및 6배로 현저한 증가가 관찰되었다. lipid C의 첨가는 통합 항체 및 위장 점막의 항체 생성 양자 모두를 약 50%로 감소시켰다. 또한 lipid C 제제화 사멸 전세포 에이치. 파일로리만을 투여받은 동물들은 비면역 대조군과 비교하여 혈청의 IgG 2배 증가 및 배설물의 IgA 3배 증가(p<0.05)를 보여주었다. 사멸 전세포 에이치. 파일로리와 CpG/CT를 혼합한 Lipid C 제제도 또한 혈청의 IgG 2배 증가 및 배설물의 IgA 3배 증가라는 결과를 낳았지만, 비면역 대조군과 통계적으로 다르지 않았다.

실시예 21: 클라미디아 및 에이치. 파일로리 특이 항체 II

최종 면역처리하고 일주일 후 혈청, 기관지-폐 세척액(BAL) 및 질 세척액(VL) 샘플에서 MOMP 특이 항체를 검출하였다. 비면역화 대조군과 비교하여 사멸 전세포 에이치. 파일로리와 혼합한 CpG/CT로 면역처리한 후 통합 IgG 생성이 현저하게 유도되었다(p<0.05). Lipid C 제제화 면역 용액도 또한 비면역화 대조군과 비교하여 통합 IgG를 현저하게 증가시켰다(도 4A). 제제화되지 않은 MOMP와 CpG/CT의 혼합물을 경구 투여받은 마우스의 호흡기 BAL에서 비면역화 대조군과 비교하여 IgG 항체(7배, p<0.01) 및 IgA 항체(5배) 양자 모두의 생성 증가를 관찰하였다. MOMP + CpG/CT를 lipid C로 제제화했을 때 3배 증가가 관찰되었고 lipid C 제제화 MOMP만으로 면역화한 마우스로부터 수집한 BAL 액에서는 어떠한 항체의 생성도 관찰하지 못하였다(도 4B). MOMP + CpG/CT로 면역화된 마우스로부터 수집한 VL액도 또한 비면역화 대조군과 비교하여 10배로 현저하게 증가된, 증가된 수준의 IgG를 함유하였다(p<0.05). 이에 더하여 비면역화 대조군과 비교하여 모든 면역화 그룹의 VL액에서 IgA의 2배 증가를 관찰하였지만(도 4C), 이는 통계적으로 유의하지 않다.

실시예 23: 위장관 방어

경구 면역법 이후 내장에서의 국소적인 적응 면역 반응이 나타날 것을 기대하였다. 그러나, 사멸 전세포 에이치. 파일로리 항원 및 강력한 점막 보조제 CpG/CT로 면역화한 마우스는 박테리아 콜로니 형성의 감소라는 결과를 낳았다. 소화 효소로부터 항원을 보호하기 위하여 사멸 전세포 에이치. 파일로리 항원만을 lipid C 기질에 포함시키자, 비면역화 대조군과 비교하여 다시 방어가 유도되었다. 오로지 CpG/CT와 사멸 전세포 에이치. 파일로리 항원을 포함하는 lipid C를 경구 투여한 경우에만, 관찰되는 콜로니 형성이 통계적으로 유의하게 감소하였다(p<0.05). 이 면역 그룹에서 비면역화 대조군과 비교하여 생 에이치. 파일로리 SS1 박테리아의 1 로그 감소를 회복하였다(도 5).

이하 표 3은 각 조성물로 접종한 후 에이치. 파일로리의 감염이 검출된 동물의 수에 대한 데이터를 나타낸다.

도 5로부터, lipid C 및 에이치. 파일로리 항원으로 처리한 동물들에서, 대조군 동물들 또는 에이치. 파일로리 항원에만 노출시킨 동물들 중 어느 하나와 비교하였을 때 생 에이치. 파일로리의 회수량이 감소한다는 것이 명백하고 따라서 백신 처리된 동물들에서의 박테리아 부하가 감소함을 나타낸다. lipid C 및 에이치. 파일로리 항원으로 처리된 마우스가 감염의 징후를 보이고, 살아있는 에이치. 파일로리가 회수되므로, lipid C 및 에이치. 파일로리 항원을 함께 면역처리함은 완전한 방어를 제공하지는 못한다(표 3).

이들 결과는 lipid C 및 열처리로 사멸된 에이치. 파일로리 항원을 이용한 경구 면역법이 감염된 조직에서 박테리아 부하를 감소시킴으로써 위장 감염을 감소시키는데 효과적일 수 있다는 것을 나타낸다. 게다가, 경구로 투여되는 에이치. 파 일로리 항원 및 CpG/CT를 함유하는 조성물에 lipid C를 첨가하는 것이 박테리아의 회수량을 훨씬 감소시켰다는 사실은 lipid C와 종래 기술 보조제 CpG/CT가 시너지적으로 작용하여 예기치않게 에이치. 파일로리에 대한 점막 면역 상승을 제공한다는 것을 나타낸다.

실시예 24: 호흡기 관 방어

감염 최고점(12일)에서 균질화시킨 폐 조직으로부터 클라미디아를 분리하고 본 명세서에 기재된 방법으로 인 비트로 세포 배양하여 감염 형성 단위를 측정하였다. 결과를 도 6에 나타내었다. 비면역화 대조군과 비교하여 MOMP + CpG/CT 면역처리 이후 클라미디아의 회수량에 있어 유의미한 차이가 없었다. 그러나 본 발명자들은 lipid C + MOMP + CpG/CT 또는 lipid C + MOMP를 경구 투여하는 면역처리 이후 통계적으로 유의미한 호흡기 관의 방어를 관찰하였다. 이들 면역처리 그룹에서, 비면역화 대조군과 비교하여 박테리아의 회수량이 50% 감소된 것으로 관찰되었다(p<0.05; 각 그룹당 n=10).

이들 결과는 본 발명의 조성물로 면역처리하는 것이 클라미디아에 의한 감염으로부터 동물을 방어하는데 효과적일 수 있다는 것을 나타낸다. 이 예기치 못했던 결과는 이제는 본 발명의 조성물을 이용하여 독성 CpG 또는 CT 보조제를 사용할 필요없이 효과적인 면역 방어를 제공할 수 있다는 것을 나타낸다.

본 명세서에서 발명자들은 장쇄 지방산 및 비감염성 항원을 함유하는 면역 조성물이 경구 면역 후 방어적인 점막 면역의 상승을 위한 효과적인 전달 매질이 될 수 있다는 것을 증명하였다. 이에 더하여, 생식기 및 호흡기 점막의 방어를 유도하기 위하여 본 발명의 지질 함유 조성물을 '안전한' 정제 단백질과 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 단백질 항원의 경구 투여를 위한 지질 함유 면역원성 조성물의 사용은, 인간의 백신 접종용으로서의 현재의 생 백신에 비하여 저렴하고, 투여하기 용이하며, 안전한 대안을 잠재적으로 제공한다.

참고문헌

본 명세서에 인용된 모든 참고문헌 및 서열 목록은 개별적으로 포함된 것과 마찬가지로 표현에 있어 전적으로 포함된다. 본 섹션과 상기 텍스트가 인용에 있어 어떤 차이점을 갖는다면 아래 인용을 참고하면 해결될 것이다.

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Claims

30% 이상의 C₁₆ 내지 C₁₈의 지방산을 함유하고 고체로부터 유체로의 전이온도가 약 30℃ 이상인 지질 제제; 및
클라미디아(Chlamydia) 또는 헬리코박터(Helicobacter)의 항원 성분
을 포함하는 면역원성 조성물로서, 상기 조성물은 경구 또는 위장관 경로로 상기 조성물을 투여받은 동물의 점막 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지질 제제는 약 1%의 미리스트산, 약 25%의 팔미트산, 약 15%의 스테아르산, 약 50%의 올레산 및 약 6%의 리놀레산을 함유하는 것("Lipid C")인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 지질 제제는 Lipid C, Lipid Ca, Lipid K, Lipid Ka, Lipid PK 또는 Lipid SPK를 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 클라미디아 미생물로부터의 항원 성분은 주요 외막 단백질(MOMP), 60kDa 내지 62kDa의 시스테인 리치 단백질 막 단백질, 15 kDa의 시스테인 리치 막 단백질, 74 kDa의 종 특이 단백질, 31 kDa의 진핵세포 결합 단백질 또는 18 kDa의 진핵세포 결합 단백질 중 1종 이상인 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 MOMP는 A, B, Ba, C, D, E, F, G, Hi, I, J, K, Ll , L2 또는 L3로 이루어지는 군에서 선택되는 항원형인 것인 조성물.
제4항에 있어서, 상기 헬리코박터의 항원 성분은 에이치. 파일로리로부터의 사멸 전체 항원인 것인 조성물.
제1항 내지 제 6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가적인 보조제를 더 함유하는 것인 조성물.
제7항에 있어서, 상기 추가적인 보조제는 콜레라 독소(CT) 및 CpG 올리고뉴클레오티드("CpG-ODN": SEQ ID NO: 1) 중 1종 이상인 것인 조성물.
MOMP 및 Lipid C를 함유하는 경구 면역원성 조성물.
제1항 내지 제5항 또는 제7항 내지 제9항 중 어느 하나의 항의 조성물을, 상기 조성물의 투여를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 클라미디아에 과(family) 미생물에 의하여 야기되는 점막 감염을 치료하기 위한 방법.
제10항에 있어서, 상기 치료는 상기 동물의 점막 면역 반응 유도를 통하여 이루어지는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 동물은 사람인 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 조성물은 MOMP, Lipid C 및 1종 이상의 CT 및 CpG-ODN을 함유하는 것인 방법.
클라미디아 또는 헬리코박터에 의하여 야기되는 감염에 대하여 동물에게 면역 방어를 제공하기 위한 방법으로서, 면역 반응을 나타내는 소견을 갖는 상기 동물에게 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 소견은 흉선세포(T 세포) 증식, 인터페론 감마(IFNγ), 감마 면역글로불린(IgG), 인터류킨 12(IL-12) 및 인터류킨 10(IL-10)의 생성, 또는 상기 클라미디아 또는 상기 헬리코박터의 분출량 감소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
클라미디아에 의하여 야기되는 점막 감염을 예방, 감소 또는 치료하기 위한 경구 의약품의 제조에 있어서, 30% 이상의 C₁₆ 내지 C₁₈의 지방산 및 상기 클리미디 아로부터의 1종 이상의 항원을 함유하는 지질 조성물의 용도.
제16항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 주요 외막 단백질(MOMP), 60kDa 내지 62kDa의 시스테인 리치 단백질 막 단백질, 15 kDa의 시스테인 리치 막 단백질, 74 kDa의 종 특이 단백질, 31 kDa의 진핵세포 결합 단백질 또는 18 kDa의 진핵세포 결합 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 지질 조성물의 용도.
제16항에 있어서, 상기 MOMP는 A, B, Ba, C, D, E, F, G, Hi, I, J, K, Ll , L2 또는 L3로 이루어지는 군에서 선택되는 항원형인 것인 지질 조성물의 용도.
제17항에 있어서, 상기 항원형은 D, E, F, G, H, I, J, K 및 L로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것이고, 상기 용도는 클라미디아에 의하여 야기되는 생식기 감염을 예방, 감소 또는 치료하기 위한 것인 지질 조성물의 용도.
제17항에 있어서, 상기 지질은 lipid C, lipid K, lipid PK 및 lipid SPK로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 지질 조성물의 용도.
헬리코박터에 의하여 야기되는 점막 감염을 예방, 감소 또는 치료하기 위한 경구 의약품의 제조에 있어서, 30% 이상의 C₁₆ 내지 C₁₈의 지방산 및 상기 헬리코박터로부터의 항원 1종 이상을 함유하는 지질 조성물의 용도.
제21항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 사멸 전세포 헬리코박터 파일로리인 것인 지질 조성물의 용도.
제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항의 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트.