JP2007308508A

JP2007308508A - クラミジアワクチン

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Publication number: JP2007308508A
Application number: JP2007183164A
Authority: JP
Inventors: Jean-Paul Prieels; ジャン−ポール・プリエル; Moncef Mohamed Slaoui; モンセフ・モハメド・スラウィ; Jean-Francois Maisonneuve; ジャン−フランソワ・メゾンヌーヴ; Vincent Verlant; ヴァンサン・ヴェルラン
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1995-04-03
Filing date: 2007-07-12
Publication date: 2007-11-29
Also published as: EP0820304B1; CZ313497A3; HK1008495A1; GR3033764T3; PT820304E; CN1185740A; DK0820304T3; KR19980703666A; GB9506863D0; AU5499996A; ZA962616B; ES2149466T3; NO974561D0; TR199701113T1; NO974561L; WO1996031236A1; EP0820304A1; HUP9801572A2; DE69608959D1; ATE193974T1

Abstract

【課題】クラミジア感染症の予防のための新規ワクチンを提供すること。
【解決手段】クラミジア由来のＭＯＭＰたんぱく質をＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬと合わせて含んでなる、クラミジアによって誘導される不妊症を減少させるのに有用なワクチン組成物。
【選択図】なし

Description

本発明は、クラミジア感染症の予防用ワクチン製剤に関する。特に、アジュバントＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬと組換えＭＯＭＰを含有する製剤に関する。

偏性細胞内細菌クラミジア・トラコマチスは結膜および尿生殖管の粘膜上皮細胞に感染し、広範囲におよぶ人間の病気、例えばトラコーマおよび生殖器感染症を起こし、これは長期間の続発症を起こしうる。トラコ−マは、いくつかの開発途上国における地方病であり、予防可能な失明の世界的な主原因であり；生殖器感染症はアメリカ合衆国において１年に約３，０００，０００例に相当し、これは１年に２００，０００人の女性のクラミジア卵管炎の結果としての不妊症を引き起こす（非特許文献１（１））。従って、この病原体は、重大な公衆衛生の問題であり、ヒトクラミジア感染症に対するワクチンを開発する努力が為されてきた。

免疫原として生物全体を用いた人間および人間以外の霊長類において行われたワクチン試験は、血清型特異性防御をもたらしたが、いくつかのワクチンは再感染により、より重大な反応を引き起こした（非特許文献２（２））。いくつかの研究によって、クラミジア感染症に関連する病理は免疫学的に媒体されることが明らかになり（非特許文献３（３)）；さらに、精製されたクラミジア５７ｋＤａ（Ｈｓｐ６０）はすでに感染した動物における再感染に類似した病理を示すことが明らかになった（非特許文献４、５（４、５））。この観察から、クラミジア・トラコマチスに対する防御は、サブユニットワクチンを用いてのみ達成されるという結論が導かれた。

クラミジア・トラコマチス種は、１５種の血清型に分類され、これは３つの血清群：Ｂ複合体（血清型Ｂ、Ｂａ、Ｄ、Ｅ、Ｌ１およびＬ２）、中間複合体（血清型Ｆ、Ｇ、Ｋ、Ｌ３）およびＣ複合体（血清型Ａ、Ｃ、Ｈ、ＩおよびＪ）に分類される（非特許文献６（６））。性行為感染症（ＳＴＤ）は３つの血清群に含まれる血清型ＤないしＫにより引き起こされる。このように、クラミジアＳＴＤに対するサブユニットワクチンは多少とも抗原的に関連する複数の血清型に対して防御する。

サブユニットワクチンのデザインに関して、４０ＫＤａの主要外部膜たんぱく質（ＭＯＭＰ）に存する血清型化抗原は多くの関心を集めてきた。in vitroでポリンとして機能する（非特許文献７（７））ことが明らかになっているこのたんぱく質は、細菌の全ライフサイクル中に存在し（非特許文献８（８））；主な表面たんぱく質は人間および動物において高免疫原性である。ＭＯＭＰは血清型間で高度に保存された５つの恒常領域により囲まれた４つの可変領域（ＶＤ）を呈する（非特許文献９、１０（９、１０））。in vitroおよびin vivo中和Ｂ細胞エピトープはＶＤ上に位置決定され（非特許文献１１、１２、１３、１４、１５（１１、１２、１３、１４、１５））、一方、Ｔ細胞エピトープは、可変および恒常領域の両方において同定される（非特許文献１６、１７（１６、１７））。組換えＭＯＭＰは異なる著者によりイー・コリ中で発現されているが（非特許文献１８、１９、２０（１８、１９、２０））、マニング（Ｍanning）らは、その組換えたんぱく質は、配座ＭＯＭＰエピトープを認識するモノクローナル抗体と反応しなかったと記載している（非特許文献１８（１８））。

組換えまたは精製ＭＯＭＰでの免疫処置、続いて同型または異型クラミジア攻撃は、異なる動物モデルで行われ、感染のパラメータに対して異なる影響をおよぼした（非特許文献２１、２２、２３（２１、２２、２３））。優れた卵管炎の実験室モデルはマウスにおいて開発され、ここにおいてクラミジア・トラコマチスの人間種の子宮内接種は長期にわたる不妊症につながる（非特許文献２４、２５（２４、２５））。異型攻撃実験において、タフレイ（Ｔuffrey）らは、アルヒドロゲル上に吸着されたｒＭＯＭＰの非経口または粘膜免疫により卵管炎の重篤度および下部生殖管転移増殖の期間がそれぞれ軽減されることを明らかにした。しかし、調製は感染の結果としての不妊症に対して防御をもたらさない（非特許文献２３（２３））。

細胞性および体液性免疫は両方ともクラミジア・トラコマチスにより引き起こされる生殖器病理において防御的役割を果たすと考えられる。しかし、ランク（Ｒank）のグループは、マウスにおいて、Ｔ−細胞性免疫はクラミジア生殖器疾患を制御する主要な免疫機構であることを示唆し（非特許文献２６、２７、２８（２６、２７、２８））、ＣＤ４およびＣＤ８陽性Ｔ−細胞はin vivoで抗クラミジア免疫に寄与することが明らかになっている（非特許文献２９、３０（２９、３０））。

３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質ＡはＧＢ２２２０２１１（Ｒibi）により公知である。化学的には、これは３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａと４、５または６アシル化鎖の混合物であり、リビ・イムノケム（Ｒibi Ｉmmunochem Ｍontana）により製造されている。

ＱＳ２１は南米の木キラヤサポナリアモリナの樹皮由来のサポニンのＨｐｌｃ精製非毒性フラクションであり、その製造法は特許文献１に開示されている（ＱＡ２１として）。ＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの両方を含むワクチンは、特許文献２に開示されている。

米国特許第５０５７５４０号国際特許出願公報第ＷＯ９４／００１５３号ワシントンエイ・イー（Ｗashington ＡＥ）、ジョンソンアール・イー（Ｊohnson ＲＥ）およびサンダーズエル・エル（Ｓanders ＬＬ）アメリカ合衆国におけるクラミジア・トラコマチス感染症：これにより我々は何を失うのかジェイ・エイ・エム・エイ（ＪＡＭＡ）１９８７、２５７、２０７０−２０７２グレイストンジェイ・ティー（Ｇrayston ＪＴ）およびワンエス・ピー（Ｗang ＳＰ）、クラミジアの新規知見およびこれにより引き起こされる病気、ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ（Ｔhe Ｊournal of Ｉnfectious Ｄiseases）、１９７５、１３２、８７−１０５グレイストンジェイ・ティー（Ｇrayston ＪＴ）、ワンエス・ピー（Ｗang ＳＰ）、イェーエル・ジェイ（Ｙeh ＬＪ）およびクーシー・シー（Ｋuo ＣＣ）、トラコーマの発生病理における再感染の重要性レビューズ・オブ・インフェクシャス・ディジージズ（Ｒeviews of Ｉnfectious Ｄiseases)、１９８５、７、７１７−７２５モリソンアール・ピー（Ｍorrison ＲＰ）、アール．ジェイベランド（ＲＪＢelland）、ケイリン（ＫＬyng）およびエイチ・ディーコールドウェル（ＨＤＣaldwell）、クラミジア性疾患発生病理５７ｋＤクラミジア過敏抗原はストレス応答たんぱく質であるジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（Ｊ.Ｅxp.Ｍed.）、１９８９、１７０、１２７１−１２８３ブランダーエス・ジェイ（Ｂlander ＳＪ）およびアモーテギーエイ・ジェイ（Ａmortegui ＡＪ）、クラミジア抽出物で免疫処置したマウスは、クラミジア・トラコマチスのマウス肺炎物質による生殖器感染症により炎症が増加するにもかかわらず、初期免疫が増加しない。インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfec.Ｉmmun.）、１９９４、６２、３６１７−３６２４ワンエス・ピー（Ｗang ＳＰ）、クーシー・シー（Ｋuo ＣＣ）、バーンズアール・シー（Ｂarnes ＲＣ）、ステファンズアール・エス（Ｓtephenz ＲＳ）およびグレイストンジェイ・ティー（Ｇrayston ＪＴ）クラミジア・トラコマチスのモノクローナル抗体でのイムノタイピングザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ（Ｔhe Ｊournal of Ｉnfectious Ｄiseases）、１９８５、１５２、７９１−８００バボイルピー（Ｂavoil Ｐ）、オーリンエイ（Ｏhlin Ａ）およびシャクタージェイ（Ｓchachter Ｊ）、クラミジア・トラコマチスにおける外膜構造および浸透性におけるジスルフィド結合の役割インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８４、４４、４７９−４８５ハッチティー・ピー（Ｈatch ＴＰ）、マイセリエム（Ｍiceli Ｍ）、サブレットジェイ・イー（Ｓublett ＪＥ）、クラミジア・シッタシおよびクラミジア・トラコマチスの発生サイクル中のジスルフィド結合外膜たんぱく質の合成ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ.Ｂacteriol.）、１９８６、１６５、３７９−３８５ステファンズアール・エス（Ｓtephens ＲＳ）、アールサンチェス−ペスカドール（ＲＳanchez−Ｐescador）、イー・エイウェイガー（ＥＡＷagar）、シーイノウエ（ＣＩnouye）およびエム・エスアーデア（ＭＳＵrdea）、クラミジア・トラコマチス主要外膜たんぱく質遺伝子の多様性ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ.Ｂacteriol.）、１９８７、１６９、３８７９−３８８５ユアンワイ（Ｙuan Ｙ）、チャンワイ・エックス（Ｚhang ＹＸ）、ワトキンスエヌ・ジー（Ｗatkins ＮＧ）、およびコールドウェルエイチ・ディー（Ｃaldwell ＨＤ）、１５クラミジア・トラコマチスの主要外膜タンパク質の４つの可変領域についてのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列インフェクション・アンド・イムノロジー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８９、５７、１０４０−１０４９ベールダブリュー（Ｂarhr Ｗ）、チャンワイ・エックス（Ｚhang ＹＸ）、ジョゼフティー（Ｊpseph Ｔ）、スーエイチ（Ｓu Ｈ）、ナノエフ・イー（Ｎano ＦＥ）、エベレットイー・ケイ（Ｅverett ＥＫ）およびコールドウェルエイチ・ディー（Ｃaldwell ＨＤ）クラミジア・トラコマチス主要外膜タンパク質遺伝子により発現される抗原領域のマッピングプロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc.Ｎatl Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）、１９８８、８５、４０００−４００４ルセロエム・イー（Ｌucero ＭＥ）およびクーシー・シー（Ｋuo ＣＣ）、血清型特異性モノクローナル抗体によるクラミジア・トラコマチス細胞培養感染の中和インフェクション・アンド・イムノロジー（Ｉnfect.Ｉmmun.)、１９８５、５０、５９５−５９７チャンワイ・エックス（Ｚhang ＹＸ）、スチュワートエス（Ｓtewart Ｓ）、ジョゼフティー（Ｊoseph Ｔ）、テイラーエイチ・アール（Ｔaylor ＨＲ）およびエイチ・ディーコールドウェル（ＨＤＣaldwell）、防御性モノクローナル抗体はクラミジア・トラコマチスの主要外膜タンパク質上に位置するエピトープを認識する。インフェクション・アンド・イムノロジー（Ｊ.Ｉmmun.）、１９８７、１３８、５７５−５８１ピーターソンイー（Ｐeterson Ｅ）、チョンジー（Ｚhong Ｇ）、カールソンイー（Ｃarlson Ｅ）およびデラマツァエル・エム（de la Ｍaza ＬＭ）、クラミジア・トラコマチスの感染性のモノクローナル抗体による中和におけるマグネシウムの防御的役割ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８８、５６、８８５−８９１チャンワイ・エックス（Ｚhang ＹＸ）、スチュワートエス・ジェイ（Ｓtewart ＳＪ）およびコールドウェルエイチ・ディー（Ｃaldwell ＨＤ）、クラミジア・トラコマチス血清型および血清群特異性主要外膜タンパク質決定因子に対する防御性モノクローナル抗体インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８９、５７、６３６−６３８アレンジェイ・イー（Ａllen ＪＥ）、アール．エムロクスレイ（ＲＭＬoksley）およびアール・エスステファンズ（ＲＳＳtephens）、クラミジア・トラコマチスの主要外膜タンパク質由来の単一ペプチドは、防御的決定因子に対する抗体の産生を助けるＴ細胞を惹起するジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ.Ｉmmun.）、１９９１、１４７、６７４−６７９スーエイチ（Ｓu Ｈ）、アール・ピーモリソン（ＲＰＭorrison）、エヌ・ジーワトキンス（ＮＧＷatokins）およびエイチ・ディーコールドウェル（ＨＤＣaldwell）クラミジア・トラコマチス主要外膜タンパク質のＴ−ヘルパー細胞エピトープの同定および特質化ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（Ｊ.Ｅxp.Ｍed.）、１９９０、１７２、２０３−２１２マニングディー・エス（Ｍanning ＤＳ）およびエス・ジェイスチュワート（ＳＪＳtewart）エシェリヒア・コリにおけるクラミジア・トラコマチス主要外膜タンパク質の発現インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９９３、６１、４０９３−４０９８コーラージェイ・イー（Ｋoehler ＪＥ）、バークランドエス（Ｂirkelund Ｓ）およびステファンズアール・エス（Ｓtephens ＲＳ）エシェリヒア・コリにおけるクラミジア・トラコマチス主要外膜タンパク質の過剰発現および表面局在化モレキュラ・マイクロバイオロジー（Ｍolecular.Ｍicrobiology）、１９９２、６、１０８７−１０９４ピケットエム・エイ（Ｐickett ＭＡ）、エム・イーワード（ＭＥＷard）およびアイ・エヌクラーク（ＩＮＣlarke）クラミジア・トラコマチス血清型Ｌ１の主要外膜タンパク質の高レベルの発現およびエピトープ局在化モレキュラ・マイクロバイオロジー（Ｍolecular.Ｍicrobiology）、１９８８、２、６８１−６８５テイラーエイチ・アール（Ｔaylor ＨＲ）、ジェイホィットム−ハドソン（ＪＷhittum−Ｈudson）、ジェイシャクター（ＪＳchachter）、エイチ・ディーコールドウェル（ＨＤＣaldwell）およびアール・エイプレンダーガスト（ＲＡＰrendergast）クラミジア主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）での経口免疫処置インベスティゲイティブ・オフタルモロジー・アンド・ビジュアル・サイエンス（Ｉnvestigative Ｏphthalmology and Ｖisual Ｓcience）、１９８８、２９、１８４７−１８５３バッタイガービー・イー（Ｂatteiger ＢＥ）、アール・ジーランク（ＲＧＲank）、ピー・エムバボイル（ＰＭＢavoil）およびエル・エス・エフゾデルベルク（ＬＳＦＳoderberg）モルモット封入体結膜炎のクラミジア物質の単離された主要外膜タンパク質でのモルモットの免疫処置による生殖器再感染に対する部分的防御ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊournal of Ｇeneral Ｍicrobiology）、１９９３、１３９、２９６５−２９７２タフレイエム（Ｔuffrey Ｍ）、エフアレクサンダー（ＦＡlexander）、ダブリューコンラン（ＷＣonlan）、シーウッズ（ＣＷoods）およびエムワーズ（ＭＷards）クラミジア卵管炎に対するマウスの異型防御および組換えＬ１主要外膜タンパク質での予備免疫処置によるクラミジア・トラコマチス人血清型Ｆ単離物での下部生殖管の転移増殖ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー(Ｊournal of Ｇeneral Ｍicrobiology)、１９９２、１３８、１７０７−１７１５タフレイエム（Ｔuffrey Ｍ）、ピーフェイルダー（ＰＦalder）、ジェイゲイル（ＪＧale）およびディーテイラー−ロビンソン（ＤＴaylor−Ｒobinson）クラミジア・トラコマチスの人間種により誘発されるマウスにおける卵管炎ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・パソロジー（Ｂr.Ｊ.Ｅxp.Ｐath.）、１９８６、６７、６０５−６１６タフレイエム（Ｔuffrey Ｍ）、ピーフェイルダー（ＰＦalder）、ジェイゲイル（ＪＧale）、アールクイン（ＲＱuinn）およびディーテイラー−ロビンソン（ＤＴaylor−Ｒobinson）クラミジア・トラコマチスの人間種で生殖器が感染したマウスにおける不妊症ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・パソロジー（Ｂr.Ｊ.Ｅxp.Ｐath.）、１９８６、７８、２５１−２６０ラムゼイケイ・エイチ（Ｒamsey ＫＨ）、エル・エス・エフゾデルベルク（ＬＳＦＳoderberg）およびアール・ジーランク（ＲＧＲank）Ｂ細胞欠損マウスにおけるクラミジア生殖器感染の消散および再感染に対する免疫インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８８、５６、１３２０−１３２５ランクアール・ジー（Ｒank ＲＧ）、エル・エス・エフゾデルベルク（ＬＳＦＳoderberg）およびエイ・エルバロン（ＡＬＢarron）先天性無胸腺症ヌードマウスにおける慢性クラミジア生殖器感染症インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８５、４８、８４７−８４９イジェステムジェイ・ユー（Ｉgiesteme ＪＵ）およびアール・ジーランク（ＲＧＲank）一次クラミジア生殖器感染症後の再感染に対する感受性は生殖管における抗原特異性Ｔ−細胞の減少を伴うインフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９９１、５９、１３４６−１３５１イジェステムジェイ・ユー（Ｉgiesteme ＪＵ）、ケイ・エイチラムゼイ（ＫＨＲamsey）、ディー・エムマギー（ＤＭＭagee）、ディー・エムウィリアムズ（ＤＭＷilliams）、ティー・ジェイキンシー（ＴＪＫincy）およびアール・ジーランク（ＲＧＲank）生物型特異性ＴＨ１リンパ球クローンの養子免疫細胞移入によるネズミクラミジア生殖器感染症の消散リージオナル・イムノロジー（Ｒegional Ｉmmunology）、１９９３、５、３１７−３２４イジェステムジェイ・ユー（Ｉgiesteme ＪＵ）、ディー・エムマギー（ＤＭＭagee）、ディー・エムウィリアムズ（ＤＭＷilliams）およびアール・ジーランク（ＲＧＲank）クラミジア特異性Ｔ−リンパ球クローンによる決定される抗クラミジア免疫性におけるＣＤ８＋Ｔ細胞についての役割インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９９４、６２、５１９５−５１９７

本発明はまず第一に、クラミジア感染症に起因する不妊症に対して防御をもたらすのに有効なワクチン組成物を提供する。
したがって、本発明は、３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１およびクラミジア由来のＭＯＭＰを含むワクチン製剤を提供する。特に、ワクチンはＢ複合体血清群由来のＭＯＭＰを含有する。好ましくは、ワクチンは少なくとも血清型Ｌ２由来のＭＯＭＰを含有するが、加えて他の血清型、例えばＤおよびＥ由来の抗原も含む。

好ましい具体例において、このような組成物は反応原性が減少し、ＱＳ２１の塩基性加水分解に対する安定性を向上させるので、ＱＳ２１はステロールとともに提供される。

本発明の好ましい組成物において、ＱＳ２１はコレステロールを含有するリポソーム構造（以下、ＤＱと称する）に関連している。このようなアジュバント組成物は係属中のＵＫ特許出願番号９５０８３２６．７および９５１３１０７．４に記載されており、この開示を出典明示により本発明の一部とする。抗原およびＭＰＬは、この好ましい製剤においてはリポソームの構造の外側にある。

ワクチン製剤は、一般に、ニュー・トレンズ・アンド・デベロプメンツ・イン・バクシンズ（Ｎew Ｔrends and Ｄevelopments in Ｖaccines）、ボラー（Ｖoller）ら編（Ｕniversity Ｐark Ｐress Ｂaltimore，Ｍaryland，Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７８）に記載されている。リポソーム中の封入は、例えばファラートン（Ｆullerton）、ＵＳ特許番号４２３５８７７により記載されている。たんぱく質の巨大分子との複合は、例えばリックハイト（Ｌikhite）、ＵＳ特許番号４３７２９４５およびアーモー（Ａrmor）ら、ＵＳ特許番号４４７４７５７に記載されている。

各ワクチン用量中のたんぱく質の量は、典型的な被接種者において著しい副作用を起こすことなく免疫防御応答を誘発する量として選択される。このような量は、どの特異性免疫原を用いるか、またどのように提供されるかによって変わる。一般に、各用量は、１ないし１０００μｇ、好ましくは、２ないし１００μｇ、最も好ましくは４ないし４０μｇのたんぱく質を含有すると考えられる。特定のワクチンに対する最適量は、被験者における適当な免疫応答の観察を含む標準的研究により確認できる。初回接種の後、被験者は、１回または適当な間隔を空けて数回の追加抗原刺激免疫を受ける。

本発明の製剤は予防および治療目的の両方について用いられ得る。
一態様によると、本発明は有効量の本発明のワクチンを患者に投与することからなる治療法を提供する。

本発明の一具体例において、ＭＯＭＰ抗原は血清型２由来であり、イー・コリにおいて、組換えＤＮＡ技術により産生される。このような状況において、たんぱく質はシグナル配列なしで産生される。

本発明において、ＭＰＬ＋ＱＳ２１を用いるかまたは用いない抗原のアジュバント化は、免疫処置グループにおけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａの比に大きく影響し、ＭＰＬ＋ＱＳ２１を用いた免疫では、ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比が低くなり、部分的防御が得られるが、ＭＰＬ＋ＱＳ２１を用いない免疫処置の結果、ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比が高くなり、防御は得られない。面白いことに、Ｂ細胞によるＩｇＧ２ａ抗体産生へのスイッチングはＴ−ヘルパーリンパ球のＴｈ１サブセットにより産生されるガンマインターフェロンにより媒介され、ＩｇＧ１産生はＴｈ２細胞により分泌されるインターロイキン−４により媒介される（４０）。ＩｇＧ２ａ産生はＴｈ１細胞産物により制御されるので、防御されたグループはＭＰＬ＋ＱＳ２１によるＴｈ１細胞活性化をもたらしうると考えられる。人間およびマウスモデルにおいて、Ｔｈ１サイトカイン、ＩＬ−２およびＩＦＮ−ガンマは一般に細胞内病原体での感染に対する耐性に関連し、一方、Ｔｈ２サイトカイン、ＩＬ−４およびＩＬ−１０は進行性疾患に関連する。これは、マウスの同系交配種のリーシュマニア、メジャーに対する耐性または感受性に関して説明でき、これは特定のＴｈ１またはＴｈ２応答の誘発と相関する（４１）。さらに、インターフェロンガンマはin vitroで抗クラミジア活性を有し、in vitroでの感染の消散に関与する（４２、４３）。このように、免疫促進物質推進Ｔｈ１サイトカインは、この予防接種実験において観察される防御の原因となる。

他の２つの観察は、ｒＭＯＭＰ＋ＭＰＬ＋ＱＳ２１接種群における防御細胞性免疫の装備の仮説を支持する：第一に、膣分泌物中に特異性分泌性ＩｇＡが存在しないことおよび強い血清抗体応答の非中和性は体液性防御を有する可能性を除外し；第二に、ＭＯＭＰＶＤ配列のレベルが相当異なる２つの異なる血清型を用いて得られる防御の異型特性は、ＭＯＭＰのプロセスを受けた保存領域由来のＴ−細胞エピトープは不妊症に対する防御の薬剤となりえることを示唆する。

以下に本発明を説明する。
１．材料および方法
１．１クラミジア種および動物タフレイ（Ｔuffrey）らにより単離され、ジェイ・オーフィラ（Ｊ．Ｏrfila）博士の好意により提供されたクラミジア・トラコマチスＦ血清型ＮＩ１株およびクラミジア・トラコマチスＬ２血清型４３４株（ＡＴＣＣ、Ｒockville，ＭＤ）をこの研究において用いた。クラミジアを１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（ＧibcoＢＲＬ製品）を補足したＭＥＭ中マッコイ細胞（ＡＴＣＣ、Ｒockville，ＭＤ）に適当には１０^６封入体形成単位／ｍｌの濃度で接種した。１時間の遠心分離（１５００ｇ）および２時間の３７℃でのインキュベーション（５％ＣＯ_２）の後、接種物を除去し、細胞に０．５μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（シグマ製品）を補足した新鮮な培地を再供給した。３７℃で４８時間インキュベーションした後、細胞をガラスビーズで破砕し、２５０ｍＭシュークロース、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭＬ−グルタミン酸ｐＨ７．２（ＳＰＧ）中に約１０^７ないし１０^８ＩＦＵ／ｍｌの濃度で収穫し、−７０℃で貯蔵した。
雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ（Ｈ−２ｋ）マウス（６ないし８週齡）をＩｆｆａＣｒｅｄｏ（フランス）から入手した。同系（Ｂ＆Ｋ、イギリス）由来の８ないし１０週齡の雄を繁殖のために用いた。

１．２ＰＣＲ増幅およびプラスミド構築
増幅ＭＯＭＰＬ２血清型ＤＮＡを、デナマー（Ｄenamur）ら（３３）により記載されているように、１０μｌのクラミジア接種物の２４０μｌ溶解緩衝液中溶解およびＰＣＲ増幅により得た。合成オリゴヌクレオチド５’−ＧＡＧＡＣＴＣＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＡＡＴＣＣＴＧＣ−３’および５’−ＴＴＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＴＴＧＴＧＣＡＴＴＴＡＣ−３’（ＳＢＢiologicals、ベルギー）を公開された配列（３４）から選択した。５’オリゴヌクレオチドはＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（太文字）が先行する成熟ＭＯＭＰ（下線）のアミノ末端をコードするヌクレオチド配列を含む。増幅は、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓtratagen）およびＫoch Ｌight ＮＢＳＴhermal Ｃycler（Ｎew Ｂrunswick）を用いて行った。適切な大きさのＰＣＲ産物を１％アガロースゲルからジェネクリーンＩＩキット（Ｂio １０１）を用いて精製した。

１．３クローニング
増幅したＬ２血清型ＭＯＭＰＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑末端にし、あらかじめＳｍａＩで消化したｐＧＥＭ４Ｚ（Ｐromega）中に結紮し、標準ＣａＣｌ_２法を用いてイー・コリＪＭ１０９中に形質転換した。得られたクローンについて制限分析を行い、適切なＤＮＡ構築物をニュークレオボンドＰＣ−１００キット（Ｍacherey−Ｎagel）を用いて増幅し、精製した。ＭＯＭＰＤＮＡを次にＢａｍＨＩでの消化によりｐＧＥＭ４Ｚ−ＭＯＭＰから切除し、Ｔ７ｌａｃプロモーターおよびＨｉｓ．Ｔａｇ配列の下流のＢａｍＨＩ消化ｐＥＴ１５（Ｎovagen）中に挿入した。適切なクローンを、イー・コリＤＨ１０Ｂ株（Ｓtratagen）中への形質転換後、制限分析により選択し；クローンしたＤＮＡの完全ヌクレオチド配列をジデオキシ鎖成長停止法（３５）により確認した。ｐＥＴ１５−ＭＯＭＰプラスミド調製物を最終的にＢＬ２１（ＤＥ３）株（ノバゲン製品）を形質転換するのに用い、これはＩＰＴＧ誘発性Ｔ７ポリメラーゼを有するので組換え産物発現を促進できる。

１．４免疫原産生、特質化、精製および配合
１．４．１産生および特質化
ｐＥＴ１５−ＭＯＭＰ形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）菌を２００μｇ／ｍｌアンピシリン（Ｓigma）を補足したＬＢ培地（Ｇibco ＢＲＬ）中に培養した。培地の６００ｎｍで測定した光学密度が０．６ないし０．８に達したときに１ｍＭＩＰＴＧを添加することにより発現を誘発した。細胞を誘発後３時間に収穫し、３回ＰＢＳで洗浄し、２％ＳＤＳおよび５％メルカプトエタノールを含有するサンプル緩衝液中に溶解させた。サンプルを３分間９５℃で加熱し、全たんぱく質を同じゲル（Ｇibco ＢＲＬ）上で分離した分子量マーカーを用いて１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。イムノブロッティングについて、１２％ＳＤ−ＰＡＧＥ分離たんぱく質をニトロセルロース上に移し、エイチ・コールドウェル（Ｈ．Ｃaldwell）博士の好意により提供されたｍＡｂｓＬ２Ｉ−４５およびＬ２Ｉ−１０ならびにヤギ抗ＭＯＭＰ抗血清（Ｃhemicon）を用いて検出した。ｒＭＯＭＰの細胞位置をマニアティス（Ｍaniatis）ら（３６）に記載されているような細胞分画により決定し；ペレットおよび上清をサンプル緩衝液中に再懸濁または調節し、全細胞溶解物と同様に分析した。

１．４．２精製
１００ｍｌ容積の３ｈＩＰＴＧ誘発性培養物をマーストン（Ｍarston）ら（３７）により記載されたようにして、リゾチームおよびデオキシコレートを用いて溶解した。細胞溶解物を遠心分離し（１２０００ｇで１５分間）、ペレットを２％ＳＤＳを含有するが、メルカプトエタノールを含有しない２ｍｌのＳＤＳＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁し、３分間沸騰させた。溶解物を遠心分離し（１２０００ｇで１５分間）、ペレットを捨て、上清を２０ｍＭＴris−ＨＣｌｐＨ７.９、０.５％ＳＤＳ、５００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールの最終濃度に調節した。サンプルを２ｍｌＨｉｓ結合樹脂（Ｎovagen）を含有するクロマトグラフィーカラムにかけ；イオンメタルアフィニティークロマトグラフィーを製造業者の手順にしたがって行った。溶出された生成物の同一性および純度を、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてクーマシーブルー染色またはイムノブロッティングにより評価した（前記参照）。たんぱく濃度をローリー試験により測定した。ｒＭＯＭＰ含有フラクションをプールし、ＰＢＳに対してＳlide ＡＬyserカセット（Ｐierce）を用いて透析した。
抗原の配合３種の配合物を試験した：
１）ＭＯＭＰ＋ＱＳ２１３ＤＭＰＬ
２）ＭＯＭＰ＋ＳＢ６２水中油型乳剤
３）ＭＯＭＰ、ＳＢ６２、ＱＳ２１、３ＤＭＰＬ

これを、ＷＯ９５／１７２１０および／またはＷＯ９４／００１５３中に記載された手順にしたがって行った。簡単には、精製し、透析したｒＭＯＭＰをＰＢＳ中に希釈し、注射用に５μｇＭＰＬ＋１０μｇＱＳ２１を含む２５μｇ／ｍｌ（２００μｌ）または１００μｌのＳＢ６２と称する５μｇＭＰＬ／１０μｇＱＳ２１を含むかまたは含まない水中油型乳剤と混合するために５０μｇ／ｍｌ（１００μｌ）にした。各処方に関して、ワクチンを以下のように調製した：
１）ＭＰＬ（１００ｎｍ粒子として）をＭＯＭＰ抗原に添加し、つづいて緩衝液、次にＱＳ２１を添加することによりＭＰＬ／ＱＳ２１を処方した。
２）抗原を緩衝液に、次にＳＢ６２、続いて１００ｎｍ粒子としてＭＰＬ、次にＱＳ２１を添加することによりＭＰＬ／ＱＳ２１／ＳＢ６２を処方した。この処方において、抗原は外側（すなわち、乳剤液滴の外側）にあり、ＭＰＬは外側に、ほとんどのＱＳ２１も外側にあると考えられる。
３）緩衝液中抗原にＳＢ６２を添加することによりＳＢ６２を処方した。抗原は外側にある。

１．５卵管炎のマウス実験における予防接種、受胎力および血清学的研究
１０匹の雌Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪのグループに０および２週に尾の基底部に異なる製剤２００μｌ中２×５μｇのｒＭＯＭＰを皮下投与することにより免疫処置し；対照群は同じスケジュールに従い、５μｇＭＰＬおよび１０μｇのＱＳ２１を含有する乳剤で疑似免疫処置した。接種を６週にタフレイ（Ｔuffrey）らにより記載されている手順（２４）にしたがって行った。簡単に説明すると、マウスに、５ｘ１０^５ＩＦＵクラミジア・トラコマチスＮＩ１の１００μｌＳＰＧまたは１００μｌのマッコイ細胞抽出物中溶液を両側に子宮内接種することにより行った攻撃の７日前に２．５ｍｇのプロゲステロンを皮下投与（Ｄepo−Ｐrovera、Ｕpjohn）した。
１０週に、受胎力評価のために処置マウスを雄と一緒に３カ月間ケージに入れた（雌２匹に対して雄１匹、各群内で雄を週ごとにローテーションした）。繁殖期間にわたって計算したパラメーターは、１群あたりの新生マウスの平均数（Ｍ）および平均同産児サイズ（Ｎ）であった。
６週に血液を採取し、血清をｒＭＯＭＰ特異性抗体、Ｆ血清型ＮＩ１株クラミジア封入体認識およびヘテロローガスな（ＮＩ１）in vitro感染のの中和に関して分析した。膣洗浄液を６週に、５０μｌのＰＢＳを腟内にピペットで数回注入出することにより集め、ｒＭＯＭＰ特異性分泌ＩｇＡ抗体に関して分析した。

１．６血清学的分析
１．６．１抗ｒＭＯＭＰ抗体の決定ｒＭＯＭＰ特異性ＩｇＧまたはＩｇＡ価を、酵素結合抗体免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）において抗体としてｒＭＯＭＰを用いて測定した。プレート（Ｍaxisorp，Ｎunc）を４℃で５μｇ／ｍｌの抗原の１０ｍＭ炭酸塩／炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９.６）緩衝液中溶液で一夜コートし、０.１％Ｔween２０ＰＢＳ（洗浄緩衝液）で洗浄し、１時間、３７℃でＰＢＳ３％ＢＳＡ（Ｓigma）でブロックした。試験血清を順次０．５％ＢＳＡ（インキュベーション緩衝液）を含有する洗浄緩衝液中に３７℃で１時間希釈した。プレートを洗浄し、１時間、３７℃でホースラディッシュペルオキシダーゼ−共役ヤギ抗ネズミＩｇＧまたはＩｇＡ（Ｓigma）とともにインキュベートした。洗浄後、基質オルトフェニレン−ジアミン（Ｓigma）を室温で２０分間添加し；２ＭＨ_２ＳＯ_４の添加により反応を停止させ、４９２ｎｍでの吸光度をラブシステムズマルチスキャンで測定した。抗ｒＭＯＭＰＩｇＧまたはＩｇＡ価を中間吸光度を与える血清サンプル希釈の逆数として表した。
各血清サンプルに関して、ｒＭＯＭＰ特異性ＩｇＧ応答を前記のような直接ＥＬＩＳＡに若干修正を加えてｒＭＯＭＰ特異性ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ１比に分割した。試験血清を三重試験においてインキュベートし、プレートを洗浄し、インキュベーション緩衝液中に希釈したビオチニル化ヤギ抗ネズミＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ１（Ａmersham）を三重試験の各レーンに添加した。３７℃で１時間後、プレートを洗浄し、ストレプタビジンホースラディッシュペルオキシダーゼコンプレックス（Ａmersham）とともに１時間インキュベートした。暴露および力価測定を前記のように行った。％で表した３つのＩｇＧサブタイプのそれぞれの罹患率をこのＩｇＧサブタイプ力価と３つのサブタイプについて測定された力価の合計間の比として計算した。

１．６．２クラミジア封入体の異型検出
マッコイ細胞を無菌平底９６−ウェルマイクロプレート（Ｎunc）中で培養し、コンフルエントな単層を約５ｘ１０^４ＩＦＵのクラミジア・トラコマチスＦ血清型ＮＩ１株で感染させた。感染後２４時間に、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０分間メタノールで固定した。洗浄を繰り返し、ＰＢＳで１／１００に希釈した１００μｌの血清サンプルを１時間３７℃でインキュベートした。プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓigma）で１時間３７℃で処理した。ＰＢＳで洗浄後、抗体結合を、ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ、Ｓigma）の添加により可視化した。抗ｒＭＯＭＰＩｇＧＮＩ１封入体の存在を、倒立光学顕微鏡を用いて評価した。

１．６．３異型in vitro中和活性
補体独立性in vitro中和検定をスー（Ｓｕ）ら（３８）により記載されているようにして多少変更を加えて行った。簡単にいうと、５０μｌの補体除去個体マウス血清の２倍のＳＰＧ希釈を５０μｌＳＰＧ中に希釈した１０^５ＩＦＵの血清型ＦＮＩ１株に添加した。混合物を３０分間３７℃（５％ＣＯ_２）でインキュベートし、次に１００μｌをＨＢＳＳ（Ｇibco ＢＲＬ製品）洗浄シリア産ハムスター腎臓細胞（ＨａＫ、ＡＴＣＣ、Ｒockville、ＭＤ）上に接種し、２時間３７℃（５％ＣＯ_２）でインキュベートした。次に、接種物を除去し、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび０．５μｇ／ｍｌシクロヘキシミドを含有するＭＥＭを添加した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、細胞を固定し、封入体を前記のようにして市販のヤギ抗ＭＯＭＰ抗血清（Ｃhemicon）およびアルカリホスファターゼ共役ウサギ抗ヤギ（Ｓigma）を用いて免疫化学的に検出した。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、Ｓigma）を酵素反応の基質として用いた。５領域を２００倍の倍率で倒立顕微鏡を用いて計測することによりＩＦＵを定量化した。サンプル血清について得られた１領域あたりの平均ＩＦＵ数を、感受性マウスからの血清を含む負対照混合物について得られた平均ＩＦＵ数の減少（％）として表した。中和価（ＮＴ５０）を、感染性の５０％減少をもたらす血清サンプル希釈度の逆数として計算した。

１．７結果
１．７．１組換え抗原発現および特質化
成熟ＭＯＭＰ血清型Ｌ２をコードするヌクレオチド配列を含有するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントを正リーディングフレーム中に挿入し、ｐＥＴ１５発現ベクター中に配向させ；クラミジアたんぱく質のヌクレオチド配列および５’−末端Ｈｉｓ−Ｔａｇペプチドをコードするポリヌクレオチド鎖との融合点をクローニング法のデザインにより推測した。細胞分画後、発現産物はイー・コリの不溶性フラクション中にあり、これは不溶性封入体の形態で発現されることを示唆する。組換えＭＯＭＰ含有ペレットを２％ＳＤＳ緩衝液中に可溶化させ、組換えＭＯＭＰと融合したＨｉｓ．ｔａｇペプチドにより支持されるヒスチジン残基をキレート化するために固定化ニッケルイオンを用いるイオンメタルアフィニティークロマトグラフィーカラムにかけた。あらかじめ洗浄し、ＳＤＳを含まない緩衝液中に溶出した精製たんぱく質は予想された分子量を示し、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析で示されるように、抗ＭＯＭＰモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体と免疫反応性であった。透析後、ｒＭＯＭＰ濃度は５００μｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌの間で、組換え産物の純度は９０％と推定された。

１．７．２マウス血清学的応答および異型攻撃後の受胎力に対するアジュバント化ｒＭＯＭＰでの免疫処置の効果
異なってアジュバント化された組換えＭＯＭＰの予防力を評価するためにデザインされた実験の結果を第１表に要約する。第４および５群は５μｇのＭＰＬおよび１０μｇのＱＳ２１でアジュバント化したｒＭＯＭＰで皮下免疫処置した。第４群において、アジュバント化組換えたんぱく質を油相としてスクアレンおよびアルファトコフェロール、界面活性剤としてＴween８０を含有するＳＢ６２乳剤中に調製した。第６群は、第４群と同じであるが、免疫促進物質を含まないＳＢ６２乳剤と合したｒＭＯＭＰで皮下免疫処置した。３つの対照群もデザインした。未処置動物群（第１群）、ＳＢ６２乳剤と合した免疫促進物質を用いた疑似免疫化マウス群（第２群）および疑似感染させる以外は第４群と同様に免疫処置した第３群。第２、４、５および６群は、異型クラミジア・トラコマチスＮＩ１株で攻撃した。

１．７．３免疫処置の血清学的応答に対する影響
異なる製剤の免疫原性を評価するために、ＩｇＧ価をワクチンの第２回投与（攻撃の日）後４週間目に抜き取った血清に関するＥＬＩＳＡにより測定し、数学的平均力価（ＡＭＴ）を各群について計算した。５μｇのｒＭＯＭＰを２回注射することによる免疫処置により、高レベルの抗ｒＭＯＭＰＩｇＧが出現した。第１表に示すように、ＡＭＴは実際に第４および第６群について同じであるが、乳剤および免疫促進物質の組み合わせによりｒＭＯＭＰ特異性ＩｇＧ平均力価が２倍に増加した。アジュバントのみで疑似免疫処置した動物（第２群）はクラミジア組換え抗原に対して有効な抗体力価を有しない。どの群においても、特異性ｒＭＯＭＰ分泌ＩｇＡは攻撃直前に集められた膣洗浄物中に検出されなかった。
第１表に示すように、免疫促進物質含有群（４および５）とＳＢ６２乳化ｒＭＯＭＰで免疫処置した第６群の間にはＩｇＧ亜群特性における明らかな違いが見られる。ＭＰＬ＋ＱＳ２１の利用はＩｇＧ２ａの相対的レベルを明らかに増加させ、ＩｇＧ１の相対的レベルの減少させることが判明し；非乳化製剤の場合にこの現象の影響が最大になった。
ｒＭＯＭＰ特異性ＩｇＧがクラミジアの異型感染株と交差反応できるかどうかを確かめるために血清を１：１００に希釈し、それぞれをメタノール固定感染細胞上クラミジア封入体を認識する能力に関して免疫酵素検定で試験した。各免疫処置群からの全マウス血清は攻撃に用いるクラミジア・トラコマチス血清型ＦＮＩ１株と反応するＩｇＧを含有することが判明した。したがって、これらすべてを、負の対照として疑似免疫処置マウスからの血清を用いて、この株に対するin vitro補体独立性中和活性について試験した。結果は、免疫血清はいずれも著しくクラミジア感染性を減少させることができないので、ＥＬＩＳＡおよび免疫酵素検定により得られた結果と一致しなかった。

１．７．４攻撃後の受胎力に対する異型免疫処置の影響
ｒＭＯＭＰでの最終免疫処置（または疑似免疫処置）の８週間後および子宮内感染（または疑似感染）の４週間後に、マウスを２月間雄とつがわせた。Ｃ３Ｈ／Ｈｅ０ｕＪマウス受胎力に対するヘテロローガスなＮＩ１株での攻撃の結果を以下のパラメータについて測定した：１群あたりの新生児の平均数（Ｎ）および平均同産児サイズ（Ｍ）。未処置マウスと比較して、第２群（疑似免疫処置）におけるクラミジア接種マウスの受胎力は著しく変更され；この結果から、この例における動物モデルの有効性を確認できる。免疫処置および疑似感染動物（第３群）では、未処置群に比べて受胎力のパラメーターが減少し；動物の受胎力の非病理学的変更を考慮するようデザインされているこの群は、ｒＭＯＭＰ製剤の予防力を評価するための対照として用いた。第１表に示すように、免疫促進物質同時接種群（第４および５群）とＳＢ６２乳化ｒＭＯＭＰで免疫処置した第６群間に受胎力レベルの明らかな違いが見られた。第５群は１０匹のマウス中７匹について最良の結果を示し、同産児の出生および最大の受胎力パラメーターをもたらし；Ｎ値は対照群３の値の５０％に達し、Ｍ値は同じ対照群について計算される値に匹敵した。逆に、免疫促進物質を欠く第６群により示される受胎力パラメーターは、感染対照群２において得られるものに匹敵する。免疫促進物質およびＳＢ５２乳剤を組み合わせたｒＭＯＭＰ免疫処置の結果としても、不妊症に対する防御が得られるが、ＳＢ６２乳剤の利用は防御率を部分的に減少させるように思われる。このように、ＭＰＬ＋ＱＳ２１の利用は上部生殖管クラミジア感染症に対して部分的な防御をもたらし、非乳化製剤についてこの減少の効果は最大に達する。

１．８結論
我々の結果は、ＭＰＬ＋ＱＳ２１アジュバント化ｒＭＯＭＰでの非経口免疫処置はマウス生殖管のヘテロローガスなクラミジア感染により起こる不妊症を部分的に防御するが、反対に、両免疫促進物質を含まないＳＢ６２乳化ｒＭＯＭＰの注射は防御を誘発しないことを示す。一方、全製剤は免疫処置動物の血清において強く、比較的均質なＭＯＭＰ特異性全ＩｇＧ応答を惹起し；これらの抗体は異型感染株のメタノール固定クラミジア封入物と交差反応できるが、in vitroでのクラミジア感染性を減少できない。攻撃直前に、ｒＭＯＭＰ特異性ＩｇＡは膣分泌物中に検出されず、これは非経口抗原投与法と一致する。このように、全免疫処置群についての全特異性ＩｇＧ力価または中和価の病理学の結果との比較により、これらの比較について明らかな相関は見られなかった。
この調査の結果から、ＭＰＬ＋ＱＳ２１と組み合わせた組換えＭＯＭＰは、クラミジア・トラコマチスにより引き起こされる不妊症に対して免疫防御を惹起できることが判明した。

２．種々のＭＯＭＰアジュバント処方の第二の実験
２．１材料および方法を試験した
クラミジアおよびマウス種は実施例１において記載した実験において用いたのと同じであった。

２．２ＭＯＭＰ産生および処方
抗原産生についてのＤＮＡ構築物ｐＥＴ１５−ＭＯＭＰの産生および使用は実施例１に記載してある。より大量のエンドトキシンを含まない抗原を産生するために、抗原精製法を変更した。簡単に説明すると、１０ｍｌＨｉｓ結合樹脂（Ｎovagen）を製造業者にしたがった精製手順を行う前に２５容積の２％ＳＤＳ、６Ｍ水中尿素で洗浄し、一方、２５０ｍｌの遠心分離でペレット化した誘発された溶解物を、Ｔris−ＨＣｌｐＨ７．９、０．５％ＳＤＳ、５００ｍＭＮaＣl、５ｍＭイミダゾール中に可溶化する前に４Ｍ尿素、２ＭＮaＣl、つづいて２％Ｚwittergen（Ｃalbiochem）で洗浄した。抗原をＴris−ＨＣｌｐＨ７.９、１００ｍＭイミダゾール中に溶出し、５ｍＭＴris−ＨＣｌｐＨ７．４に対して透析し、０.２２μｍ滅菌フィルター（Ｍillipore）上で濾過した。リムルスアメーバ様細胞溶解試験（Ｃoatest、Ｃhromogenix）を用いて、ＬＰＳ含量を評価した。

２．３処方
抗原を用量あたりのＭＰＬの量を１０μｇに調節する以外は実施例１に記載したようにして処方し；係属中のＵＫ出願９５０８３２６.７、９５１３１０７.４に記載されているような修飾ＱＳ２１（ＤＱと称する）を用いた群も試験し、用量あたり１０μｇの割合でワクチンに添加した。より詳細には、緩衝液に抗原を添加することによりワクチンを処方した。１００ｎｍ粒子としてのＭＰＬを次に添加した。別の試験管中で、ＱＳ２１をジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）およびコレステロールから成る小ユニラメラリポソーム（ＤＯＰＣ：コレステロール＝４：１ｗ／ｗ）と混合し、ＱＳ２１のコレステロール比が１：５になるようにした。（この条件下で、すべてのＱＳ２１はリポソーム膜中に取り込まれる）。ＱＳ２１／ＳＵＶミックス（ＤＱと称する）を次に抗原／ＭＰＬミックスに添加する。この処方において、抗原は外にあり、ＭＰＬは外にあり、ＱＳ２１はリポソーム中にある。

２．４卵管炎のマウスモデルにおける接種、受胎力、免疫学的および組織学的研究
免疫処置、実験的感染およびサンプリングを、負の対照群を１０μｇＭＰＬおよび１０μｇＱＳ２１を含有する乳剤で疑似感染させ、ＭＰＬ＋ＤＱと合した抗原で免疫処置した別の群を添加する以外は前記のように計画した。群は１５匹のマウスからなり、その内１０匹を８週間つがわせ、一方５匹を組織病理学的、免疫細胞化学的分析のための攻撃後２週間で殺した。群の受胎率を評価するのに用いたパラメータは次の通りである：Ｆ（１回またはそれ以上出産したマウスの数を全マウスの数で割ったもの）、Ｍ（新生マウス（死亡または生存）の数を全同産児数で割ったもの）、およびＮ（新生マウス（死亡または生存）の数を全マウス数で割ったもの）。
血清および膣洗浄物をｒＭＯＭＰ特異性抗体に関してＥＬＩＳＡにより分析し、血清はまた血清型ＦＮＩ１株クラミジア封入体認識およびヘテロローガスな（ＮＩ１）in vitro感染の中和に関して試験した。すべての技術は前記の通りである。
生殖管の上半分（卵巣、卵管および子宮角の上部）をＯＣＴ化合物（組織−ＴＥＫ、Ｍiles）中に包埋し、急速凍結させ、凍結部分（１０μｍ）をスライドガラス（スーパーフォースト、Ｍenzel−Ｇlaser）上に載せた。切片を風乾し、アセトン中５分間固定し、−７０℃で保存した。組織病理学的分析のために、再水和切片をヘマトキシリン（Ｈ）およびエオシン（Ｅ）で染色した。免疫細胞化学的染色のために、切片をＰＢＳ中で再水和し、６０分間１００μｌＰＢＳ中２μｇのビオチニル化ラット抗マウスＣＤ４またはＣＤ８ｍＡｂ（Ｓerotec）とともにインキュベートし、２回ＰＢＳで洗浄し、１／２０００希釈のＨＲＰ−ストレプタビジン（Ｚymed）とともに３０分間再インキュベートした。洗浄後、液体ＤＡＢキット（Ｚymed）で発色させ、ヘマトキシリンで確認し、アクリトール（Ｓurgipath）中で永久的にスライド作製した。

２．５インターフェロンガンマ分析
マウスの尾基底部に２００μｌの製剤を０および２週目に皮下注射し、対照群は、乳剤に合した１０μｇＭＰＬと１０μｇＱＳ２１で疑似免疫処置した。動物を血清学的分析のために採血し、４週目に屠殺し、脾臓を滅菌的に除去し、プールし、単一細胞懸濁液を１μｇ／ｍｌｒＭＯＭＰまたは対照として４／ｍｌＣｏｎＡ（Ｂoerhinger・Ｍannheim）での再刺激のために調製した。このように、培養物を平底２４−ウェル培養皿中にＲＰＭＩ１６４０１ｍｌあたり１０^６個の応答細胞と１０％ウシ胎仔血清（Ｇibco−ＢＲＬ）を用いて準備した。再刺激後９６時間に収穫した上清を、ＩＦＮ−ガンマに関して市販のＥＬＩＳＡキット（Ｃytoscreen、Ｂiosource）を用いて分析した。

２．６結果
２．６．１抗原
透析後、ｒＭＯＭＰ濃度は約２ｍｇ／ｍｌと推定され、エンドトキシン汚染は０．０５ＥＵ／μｇｒＭＯＭＰ／以下であった。

２．６．２アジュバント化ｒＭＯＭＰでの免疫処置の、マウス体液性免疫応答、異型攻撃後の受胎力および感染の結果起こる炎症性浸潤に対する影響
異なってアジュバント化されたｒＭＯＭＰの予防能力を評価するようデザインされた実験の結果を第２表に要約する。

２．６．３体液性応答に対する免疫処置の効果予防接種後の体液性応答を攻撃の日に集めた血清および膣洗浄液において評価した。抗原の全処方は、３００００付近の同じような抗−ｒＭＯＭＰＩｇＧ幾何平均値（ＧＭＴ）を示した。アジュバントのみで疑似免疫処置した動物は、クラミジア組換え抗原に対して有効な抗体価を有しない。どの群においても、ｒＭＯＭＰ特異性分泌ＩｇＡは攻撃の直前に集めた膣洗浄液において検出されなかった。ｒＭＯＭＰ特異性ＩｇＧ応答のイソタイプ化により、乳剤のみ中のＭＯＭＰにより発生する応答と比較して、ＭＰＬおよびＱＳ２１またはＤＱの存在がＩｇＧ２ａの相対的レベルを増加させることが判明した。すべての免疫血清は、攻撃に用いられた血清型ＦＣトラコマチスＮＩ１株のメタノール固定封入体と反応するＩｇＧを含有することが判明した。

２．６．４異型免疫処置の攻撃後の受胎力に対する影響
ヘテロローガスなＮＩ１株での攻撃のマウス受胎力に対する影響を実験手順において定義したＦ、ＮおよびＭパラメータにより測定した。各群について、交配期間中にわたって計算したこれらのパラメータ値を第１表に示す。疑似感染群に対して、疑似免疫処置群の感染の結果、ほとんど完全な不妊症を引き起こし、観察された不妊症は、動物の処置ではなく、シー・トラコマチスにより誘発されることが解る。両免疫促進物質でアジュバント化したｒＭＯＭＰで免疫処置した群において、抗原のＭＰＬ＋ＤＱ処方は部分的防御をもたらし、この群において、ＦおよびＮパラメータの値は疑似感染群（正対照）において記録された値のほぼ８０％に達する。反対に、乳剤中に配合されたｒＭＯＭＰでの攻撃前の免疫処置はＦおよびＮ受胎力パラメータを低下させる。

２．６．５攻撃後の組織病理学的変化
受胎力実験の組織病理学的カウンターパートにおいて、組織片について行った古典的なＨＥ着色は疑似免疫処置群および予防接種群間の卵管および卵巣の炎症指数において明らかな違いを示さなかった。しかし、免疫細胞化学的染色によるＴ−細胞サブセットの頻度を見ると、ＣＤ４陽性Ｔ−細胞はＭＰＬ＋ＤＱ予防接種群においてのみ検出され（４匹のマウス中４匹）、一方、ＣＤ８陽性Ｔ−細胞は免疫処置および疑似免疫処置群において検出された（第３表）。このように、この実験において、ＣＤ４陽性浸潤Ｔ−細胞は、実験の受胎力カウンターパートにおいて唯一防御された群であるＭＰＬ＋ＤＱ予防接種群においてのみ見いだされた。

２．６．６ in vitro再刺激によるＩＦＮガンマ分泌に対する配合の影響
抗原処方により誘発される細胞活性化（第４表）を別の実験において分析した。一方、ＭＰＬ＋ＱＳ２１またはＭＰＬ＋ＤＱと組み合わせたｒＭＯＭＰで予防接種し、抗原でin vitro再刺激した動物から単離した脾臓細胞のその培養上清中のＩＦＮ−ガンマ濃度は同じ期間中４μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡで刺激されたものに匹敵するものであった。一方、免疫促進物質を含まないｒＭＯＭＰで疑似予防接種または予防接種した動物から単離した細胞は検出可能なレベルのＩＦＮ−ガンマを生じなかったが、ＣｏｎＡと同時培養したそのカウンターパートはすべてサイトカインについて陽性であった。各群からの血清のプールについて行った血清学的分析からＩＦＮ−ガンマ分泌は抗原特異性ＩｇＧ２ａ比の増加を伴うことが判明した。

結論
まとめると、攻撃試験およびＩＦＮ−ガンマ検出検定からのデータにより、マウスにおいて、２つのアジュバントＭＰＬおよびＱＳ２１またはＤＱと組換えＭＯＭＰの組み合わせにより、ＩＦＮ−ガンマ分泌および増加したＩｇＧ２ａ比により解るような抗原特異性Ｔｈ−１様免疫応答が誘発され、この結果クラミジア感染症の結果起こる不妊症に対する防御がもたらされ得る。

参考文献
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５．ブランダーエス・ジェイ（Ｂlander ＳＪ）およびアモーテギーエイ・ジェイ（Ａmortegui ＡＪ）、クラミジア抽出物で免疫処置したマウスは、クラミジア・トラコマチスのマウス肺炎物質による生殖器感染症により炎症が増加するにもかかわらず、初期免疫が増加しない。インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfec.Ｉmmun.）、１９９４、６２、３６１７−３６２４
６．ワンエス・ピー（Ｗang ＳＰ）、クーシー・シー（Ｋuo ＣＣ）、バーンズアール・シー（Ｂarnes ＲＣ）、ステファンズアール・エス
（Ｓtephenz ＲＳ）およびグレイストンジェイ・ティー（Ｇrayston ＪＴ）クラミジア・トラコマチスのモノクローナル抗体でのイムノタイピングザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ（Ｔhe Ｊournal of
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７．バボイルピー（Ｂavoil Ｐ）、オーリンエイ（Ｏhlin Ａ）およびシャクタージェイ（Ｓchachter Ｊ）、クラミジア・トラコマチスにおける外膜構造および浸透性におけるジスルフィド結合の役割インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８４、４４、４７９−４８５
８．ハッチティー・ピー（Ｈatch ＴＰ）、マイセリエム（Ｍiceli Ｍ）、サブレットジェイ・イー（Ｓublett ＪＥ）、クラミジア・シッタシおよびクラミジア・トラコマチスの発生サイクル中のジスルフィド結合外膜たんぱく質の合成ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ.Ｂacteriol.）、１９８６、１６５、３７９−３８５
９．ステファンズアール・エス（Ｓtephens ＲＳ）、アールサンチェス−ペスカドール（ＲＳanchez−Ｐescador）、イー・エイウェイガー（ＥＡＷagar）、シーイノウエ（ＣＩnouye）およびエム・エスアーデア（ＭＳＵrdea）、クラミジア・トラコマチス主要外膜たんぱく質遺伝子の多様性ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ.Ｂacteriol.）、１９８７、１６９、３８７９−３８８５
１０．ユアンワイ（Ｙuan Ｙ）、チャンワイ・エックス（Ｚhang ＹＸ）、ワトキンスエヌ・ジー（Ｗatkins ＮＧ）、およびコールドウェルエイチ・ディー（Ｃaldwell ＨＤ）、１５クラミジア・トラコマチスの主要外膜タンパク質の４つの可変領域についてのヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列インフェクション・アンド・イムノロジー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８９、５７、１０４０−１０４９
１１．ベールダブリュー（Ｂarhr Ｗ）、チャンワイ・エックス（Ｚhang ＹＸ）、ジョゼフティー（Ｊpseph Ｔ）、スーエイチ（Ｓu Ｈ）、ナノエフ・イー（Ｎano ＦＥ）、エベレットイー・ケイ（Ｅverett ＥＫ）およびコールドウェルエイチ・ディー（Ｃaldwell ＨＤ）クラミジア・トラコマチス主要外膜タンパク質遺伝子により発現される抗原領域のマッピングプロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc.Ｎatl Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）、１９８８、８５、４０００−４００４
１２．ルセロエム・イー（Ｌucero ＭＥ）およびクーシー・シー（Ｋuo ＣＣ）、血清型特異性モノクローナル抗体によるクラミジア・トラコマチス細胞培養感染の中和インフェクション・アンド・イムノロジー（Ｉnfect.Ｉmmun.)、１９８５、５０、５９５−５９７
１３．チャンワイ・エックス（Ｚhang ＹＸ）、スチュワートエス（Ｓtewart Ｓ）、ジョゼフティー（Ｊoseph Ｔ）、テイラーエイチ・アール（Ｔaylor ＨＲ）およびエイチ・ディーコールドウェル（ＨＤＣaldwell）、防御性モノクローナル抗体はクラミジア・トラコマチスの主要外膜タンパク質上に位置するエピトープを認識する。インフェクション・アンド・イムノロジー（Ｊ.Ｉmmun.）、１９８７、１３８、５７５−５８１
１４．ピーターソンイー（Ｐeterson Ｅ）、チョンジー（Ｚhong Ｇ）、カールソンイー（Ｃarlson Ｅ）およびデラマツァエル・エム（de la Ｍaza ＬＭ）、クラミジア・トラコマチスの感染性のモノクローナル抗体による中和におけるマグネシウムの防御的役割ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８８、５６、８８５−８９１
１５．チャンワイ・エックス（Ｚhang ＹＸ）、スチュワートエス・ジェイ（Ｓtewart ＳＪ）およびコールドウェルエイチ・ディー（Ｃaldwell ＨＤ）、クラミジア・トラコマチス血清型および血清群特異性主要外膜タンパク質決定因子に対する防御性モノクローナル抗体インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８９、５７、６３６−６３８
１６．アレンジェイ・イー（Ａllen ＪＥ）、アール．エムロクスレイ（ＲＭＬoksley）およびアール・エスステファンズ（ＲＳＳtephens）、クラミジア・トラコマチスの主要外膜タンパク質由来の単一ペプチドは、防御的決定因子に対する抗体の産生を助けるＴ細胞を惹起するジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ.Ｉmmun.）、１９９１、１４７、６７４−６７９
１７．スーエイチ（Ｓu Ｈ）、アール・ピーモリソン（ＲＰＭorrison）、エヌ・ジーワトキンス（ＮＧＷatokins）およびエイチ・ディーコールドウェル（ＨＤＣaldwell）クラミジア・トラコマチス主要外膜タンパク質のＴ−ヘルパー細胞エピトープの同定および特質化ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メジシン（Ｊ.Ｅxp.Ｍed.）、１９９０、１７２、２０３−２１２
１８．マニングディー・エス（Ｍanning ＤＳ）およびエス・ジェイスチュワート（ＳＪＳtewart）エシェリヒア・コリにおけるクラミジア・トラコマチス主要外膜タンパク質の発現インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９９３、６１、４０９３−４０９８
１９．コーラージェイ・イー（Ｋoehler ＪＥ）、バークランドエス（Ｂirkelund Ｓ）およびステファンズアール・エス（Ｓtephens ＲＳ）エシェリヒア・コリにおけるクラミジア・トラコマチス主要外膜タンパク質の過剰発現および表面局在化モレキュラ・マイクロバイオロジー（Ｍolecular.Ｍicrobiology）、１９９２、６、１０８７−１０９４
２０．ピケットエム・エイ（Ｐickett ＭＡ）、エム・イーワード（ＭＥＷard）およびアイ・エヌクラーク（ＩＮＣlarke）クラミジア・トラコマチス血清型Ｌ１の主要外膜タンパク質の高レベルの発現およびエピトープ局在化モレキュラ・マイクロバイオロジー（Ｍolecular.Ｍicrobiology）、１９８８、２、６８１−６８５
２１．テイラーエイチ・アール（Ｔaylor ＨＲ）、ジェイホィットム−ハドソン（ＪＷhittum−Ｈudson）、ジェイシャクター（ＪＳchachter）、エイチ・ディーコールドウェル（ＨＤＣaldwell）およびアール・エイプレンダーガスト（ＲＡＰrendergast）クラミジア主要外膜タンパク質（ＭＯＭＰ）での経口免疫処置インベスティゲイティブ・オフタルモロジー・アンド・ビジュアル・サイエンス（Ｉnvestigative Ｏphthalmology and Ｖisual Ｓcience）、１９８８、２９、１８４７−１８５３
２２．バッタイガービー・イー（Ｂatteiger ＢＥ）、アール・ジーランク（ＲＧＲank）、ピー・エムバボイル（ＰＭＢavoil）およびエル・エス・エフゾデルベルク（ＬＳＦＳoderberg）モルモット封入体結膜炎のクラミジア物質の単離された主要外膜タンパク質でのモルモットの免疫処置による生殖器再感染に対する部分的防御ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊournal of Ｇeneral Ｍicrobiology）、１９９３、１３９、２９６５−２９７２
２３．タフレイエム（Ｔuffrey Ｍ）、エフアレクサンダー（ＦＡlexander）、ダブリューコンラン（ＷＣonlan）、シーウッズ（ＣＷoods）およびエムワーズ（ＭＷards）クラミジア卵管炎に対するマウスの異型防御および組換えＬ１主要外膜タンパク質での予備免疫処置によるクラミジア・トラコマチス人血清型Ｆ単離物での下部生殖管の転移増殖ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー(Ｊournal of Ｇeneral Ｍicrobiology)、１９９２、１３８、１７０７−１７１５
２４．タフレイエム（Ｔuffrey Ｍ）、ピーフェイルダー（ＰＦalder）、ジェイゲイル（ＪＧale）およびディーテイラー−ロビンソン（ＤＴaylor−Ｒobinson）クラミジア・トラコマチスの人間種により誘発されるマウスにおける卵管炎ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・パソロジー（Ｂr.Ｊ.Ｅxp.Ｐath.）、１９８６、６７、６０５−６１６
２５．タフレイエム（Ｔuffrey Ｍ）、ピーフェイルダー（ＰＦalder）、ジェイゲイル（ＪＧale）、アールクイン（ＲＱuinn）およびディーテイラー−ロビンソン（ＤＴaylor−Ｒobinson）クラミジア・トラコマチスの人間種で生殖器が感染したマウスにおける不妊症ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・パソロジー（Ｂr.Ｊ.Ｅxp.Ｐath.）、１９８６、７８、２５１−２６０
２６．ラムゼイケイ・エイチ（Ｒamsey ＫＨ）、エル・エス・エフゾデルベルク（ＬＳＦＳoderberg）およびアール・ジーランク（ＲＧＲank）Ｂ細胞欠損マウスにおけるクラミジア生殖器感染の消散および再感染に対する免疫インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８８、５６、１３２０−１３２５
２７．ランクアール・ジー（Ｒank ＲＧ）、エル・エス・エフゾデルベルク（ＬＳＦＳoderberg）およびエイ・エルバロン（ＡＬＢarron）先天性無胸腺症ヌードマウスにおける慢性クラミジア生殖器感染症インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８５、４８、８４７−８４９
２８．イジェステムジェイ・ユー（Ｉgiesteme ＪＵ）およびアール・ジーランク（ＲＧＲank）一次クラミジア生殖器感染症後の再感染に対する感受性は生殖管における抗原特異性Ｔ−細胞の減少を伴うインフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９９１、５９、１３４６−１３５１
２９．イジェステムジェイ・ユー（Ｉgiesteme ＪＵ）、ケイ・エイチラムゼイ（ＫＨＲamsey）、ディー・エムマギー（ＤＭＭagee）、ディー・エムウィリアムズ（ＤＭＷilliams）、ティー・ジェイキンシー（ＴＪＫincy）およびアール・ジーランク（ＲＧＲank）生物型特異性ＴＨ１リンパ球クローンの養子免疫細胞移入によるネズミクラミジア生殖器感染症の消散リージオナル・イムノロジー（Ｒegional Ｉmmunology）、１９９３、５、３１７−３２４
３０．イジェステムジェイ・ユー（Ｉgiesteme ＪＵ）、ディー・エムマギー（ＤＭＭagee）、ディー・エムウィリアムズ（ＤＭＷilliams）およびアール・ジーランク（ＲＧＲank）クラミジア特異性Ｔ−リンパ球クローンによる決定される抗クラミジア免疫性におけるＣＤ８＋Ｔ細胞についての役割インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９９４、６２、５１９５−５１９７
３１．マイヤーズケイ・アール（Ｍyers ＫＲ）およびジェイ・ティーアルリッチ（ＪＴＵlrich）アジュバントとしてのモノホスホリルリピッドＡの有効的な使用。新規ワクチン法。粘膜、アジュバントおよび遺伝子法。インターナショナル・ビジネス・コミュニケイション（Ｉnternational Ｂusines Ｃommunication，Ｍａ，ＵＳＡ）
３２．ニューマンエム・ジェイ（Ｎewman ＭＪ）、ジェイ・ワイウー（ＪＹＷu）、ビー・エイチガードナー（ＢＨＧardner）、ケイ・ジェイモンロー（ＫＪＭunroe）、ディーレオンブルノ（ＤＬeombruno）、ジェイレッチア（ＪＲecchia）、シー・アールケンシル（ＣＲＫensil）およびアール・ティーコーリン（ＲＴＣoughlin）卵巣アルブミン特異性ＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球応答のサポニンアジュバント誘発ザ・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｔhe Ｊournal of Ｉmmunology）、１９９２、１４８、２３５７−２３６２
３３．デナマーイー（Ｄenamur Ｅ）、シーサヤダ（ＣＳayada）、ジェイオーフィラ（ＪＯrfila）、エイロドラキス（ＡＲodolakis）およびジェイエリオン（ＪＥlion）主要外膜タンパク質遺伝子の制限パターンが、クラミジア・シッタシの反芻動物単離物の均質な侵入性群についての証拠を提供するジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー(Ｊournal of Ｇeneral Ｍicrobiology）、１９９１、１３７、２５２５−２５３０
３４．チャンワイ・エックス（Ｚhang ＹＸ）、エス・ジーモリソン（ＳＧＭorrison）およびコールドウェルエイチ・ディー（Ｃaldwell ＨＤ）、主要外膜遺伝子のヌクレオチド配列ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎucleic Ａcids Ｒesearch）、１９９０、１８、１０６１
３５．テイバーエス（Ｔabor Ｓ）およびシー・シーリチャードソン（ＣＣＲichardson）プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc Ｎatl Ａcad Ｓci ＵＳＡ）、１９８９、８６、４０７６−４０８０
３６．サムブルックジェイ（Ｓambrook Ｊ）、イー・エフフリッシュ（ＥＦＦritsch）およびティーマニアティス（ＴＭaniatis）モレキュラ・クローニングア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍolecular Ｃloning ＡＬaboratory Ｍanual）、第２版、（Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory Ｐress）１９８９
３７．マーストンエフ・エイ・オー（Ｍarston ＦＡＯ）、ＤＮＡクローニング：ア・プラクティカル・アプローチ［ディ−・エムグローバー（ＤＭＧlover）］編）エシェリヒア・コリにおいて発現された真核性ポリペプチドの精製、第３巻、ｐ５９、ＩＲＬＰress Ｏxford
３８．スーエイチ（Ｓu Ｈ）およびエイチ・ディーコールドウェル（ＨＤＣaldwell）クラミジア・トラコマチスの主要外膜タンパク質の抗原的に共通のＴ−ヘルパーおよびＢ−細胞中和エピトープに対応する合成オリゴペプチドの免疫原性ワクチン（Ｖaccine）、１９９３、１１、１１５９−１１１６６
３９．タフレイエム（Ｔuffrey Ｍ）、エフアレクサンダー（ＦＡlexander）、シーインマン（ＣＩnman）およびエム・イーワーズ（ＭＥＷards）クラミジア・トラコマチスの人生殖管単離物により誘発される卵管炎を有するマウスにおける変更された多形性および機能と不妊症との相関ジャーナル・オブ・レプロダクション・アンド・ファーティリティー（Ｊ.Ｒeprod.Ｆert.)、１９９０、８８、２９５−３０５
４０．スナッパーシー・エム（Ｓnapper ＣＭ）およびダブリュー・イーポール（ＷＥＰaul）インターフェロン−ガンマおよびＢ−細胞刺激因子−１は相互にＩｇイソタイプ複製を制御するサイエンス（Ｓcience）、１９８７、２３６、９４４−９４７
４１．ハインツェルエフ・ピー（Ｈeinzel ＦＰ）、エム・ディーサディック（ＭＤＳadick）、エス・エスムタ（ＳＳＭutha）およびアール・エムロクスレイ（ＲＭＬoksley）ＣＤ４＋リンパ球によるin vitroのインターフェロン−ガンマ、インターロイキン２、インターロイキン４、およびインターロイキン１０の産生プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ）、１９９１、８８、７０１１
４２．バイルンジー（Ｂyrne Ｇｉ）、エル・ケイレーマン（ＬＫＬehmann）およびジー・ジェイランドリー（ＧＪｌandry）Ｔ２４細胞における細胞内クラミジア・シッタシ複製のガンマ−インターフェロン−媒介抑制についてのトリプトファンカタボリズムの誘発インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.）、１９８６、５３：３４７
４３．ランクアール・ジー（Ｒank ＲＧ）、ケイ・エイチラムゼイ（ＫＨＲamsey）、イー・エイパック（ＥＡＰack）およびディー・エムウィリアムズ（ＤＭＷilliams）ネズミクラミジア生殖器感染症のガンマインターフェロン消散の効果インフェクション・アンド・イミュニティー（Ｉnfect.Ｉmmun.)、１９９２、６０、４４２７−４４２９

Claims

クラミジア由来のＭＯＭＰたんぱく質をＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬと合わせて含んでなる、クラミジアによって誘導される不妊症を減少させるのに有用なワクチン組成物。
たんぱく質がクラミジアＬ２血清型由来である請求項１記載のワクチン。
さらに異なる血清型由来のたんぱく質を含んでなる請求項１または２記載のワクチン。
さらにステロールを含んでなる請求項１記載のワクチン。
ステロールがコレステロールである請求項４記載のワクチン。
ＱＳ２１がコレステロール含有リポソームと結合する請求項５記載のワクチン。
抗原がリポソームの外側にある請求項６記載のワクチン。
ＱＳ２１のコレステロールに対する比率が約１：５である請求項５〜７のいずれか１項記載のワクチン。
クラミジアによって誘導される不妊症を減少させるためのワクチンの製造におけるＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬと組み合わせたクラミジア由来のＭＯＭＰたんぱく質の使用。