KR20110068576A

KR20110068576A - 새로운 바이러스 진단 시스템

Info

Publication number: KR20110068576A
Application number: KR1020090125593A
Authority: KR
Inventors: 박성은; 오현직; 윤태중
Original assignee: 주식회사 서린바이오사이언스
Priority date: 2009-12-16
Filing date: 2009-12-16
Publication date: 2011-06-22
Also published as: KR101164909B1

Abstract

본 발명은 바이러스 농축 바이오칩(Virus Incrassation Biochip, VIB)을 이용한 새로운 바이러스 진단 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 시료를 준비하는 단계; 상기 VIB를 이용하여 바이러스를 농축시키는 단계; 다이렉트(direct) qPCR을 이용하여 유전자를 증폭시키는 단계; 및 증폭된 유전자를 분석하는 단계를 포함하는 바이러스 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바이러스 진단 방법은 기존의 PCR을 이용한 바이러스 진단 방법에 비해 민감도와 정확도를 현저히 증가시키고, 간편하고 신속하게 진단할 수 있으며, 오염 발생률을 저하시킴으로써 바이러스 진단하는데 유용하게 사용될 수 있다.

바이러스 농축 바이오칩(Virus Incrassation Biochip, VIB), 접합, 농축, direct qPCR, 바이러스 진단.

Description

새로운 바이러스 진단 시스템{Novel virus detection system}

본 발명은 바이러스 농축 바이오칩(Virus Incrassation Biochip, VIB), 이를 포함하는 바이러스 진단 시스템(System), 및 이를 이용한 바이러스 진단 방법에 관한 것이다.

분자진단학(molecular diagnostics)은 분자생물학적 기술을 이용하여 DNA, RNA 및 단백질 등 생체지표물질(biomarker)을 검출하거나 분석하는 분야이다. 넓은 의미로는 항체를 이용한 면역진단의 영역을 포함할 수 있지만, 좁은 의미로는 유전정보 물질인 DNA나 RNA를 분석하고 검출하는 핵산진단학(nucleic acid diagnostics)과 같은 의미로 사용되고 있다.

분자진단은 1) 질환예방을 목적으로 유전적 소인(genetic predisposition)을 확인하거나 종양과 관련된 이상 유전자를 검출하거나 또는 감염질환을 예방하기 위한 선별검사, 2) 감염질환이나 종양 등의 조기확인, 치료법의 효능 증가 및 임상진단의 특이성 증가를 위한 진단검사, 3) 이미 수행한 진단 검사의 결과를 독립적으 로 확인하기 위한 확진 검사, 4) 치료법의 결정과 약물 선택 및 약효 평가를 위한 모니터링의 분야에 응용되고 있다. 분자진단은 배양검사가 어렵거나 불가능할 경우, 배양검사를 통해 신속하게 진단하기 힘든 경우, SARS 바이러스처럼 변종 바이러스의 출현에 의해 빠르게 전파되는 경우 등의 바이러스에서 유래한 핵산을 분석하는 검사에 매우 유용하다.

바이러스 진단 방법에는 대표적으로 효소결합면역흡수분석법(Enzyme-linked immunosobent assay, ELISA) 및 중합효소연쇄반응법(Polymerase Chain Reaction, PCR)이 있다. ELISA는 정확도가 높은 장점을 가지는 반면에 민감도가 낮으며 고가의 항체가 필요한 단점이 있으며, PCR은 민감도가 ELISA에 비해 높고 저렴하게 수행될 수 있는 반면에 정확도가 낮은 단점이 있다.

중합효소연쇄반응법 중 특히, 정량적 실시간 중합효소연쇄반응법(quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)이 바이러스 진단에 사용되고 있다. 이런 qPCR은 PCR을 기반으로 하는 기술로서, 표적 DNA 분자를 증폭 및 정량을 동시에 수행할 수 있는 것이다. 이는 일반적인 PCR 절차에 따르며, 증폭된 DNA가 반응 후 축적됨에 따라 각 증폭 사이클 후 실시간으로 정량할 수 있는 특징을 가진다. 상기 qPCR은 실험실에서 다양하게 적용하고 있으며, 주로 진단 및 기초 연구에 사용되고 있다. 진단에서의 qPCR은 감염 질환, 암 및 유전적 이상 등의 진단을 하는 핵산을 빠르게 검출할 수 있다. 특히, 인플루엔자(flu)와 같은 새롭게 나타난 바이러스 질환을 진단하는 도구로 사용될 수 있다.

qPCR을 이용한 바이러스 진단 방법은 혈액 등 시료를 약 200 ~ 400 ㎕ 채취한 후, 유전자를 추출한 다음, 상기 유전자를 증폭한 후 분석하는 단계로 수행된다. 상기 qPCR을 이용한 바이러스 진단 방법은 민감도가 높아서 일반적인 진단에 적용하는데 문제는 없으나, 혈액내 극미량의 바이러스 존재하는 경우에 위음성이 나올 확률이 높기 때문에 정확한 진단이 어려운 한계를 가지고 있다. 이런 qPCR 한계는 일반적인 바이러스 DNA prep kit에서 1회 DNA prep을 위해 200 ~ 400 ㎕의 혈액을 초과하지 않도록 사용되고 있고, 바이러스 DNA만을 선택적으로 추출하는 것이 아니라 인간의 DNA도 함께 추출되고 있으며, 추출과정에서 오염 발생률도 높은 단점을 그 원인으로 볼 수 있다.

이에, 본 발명자들은 새로운 바이러스 진단 시스템을 개발하던 중, 바이러스 농축 바이오칩을 이용하여 바이러스 농축 및 정제를 수행한 후 다이렉트(direct) qPCR을 수행함으로써 기존의 PCR을 이용한 바이러스 진단 방법에 비해, 보다 다량의 시료를 이용할 수 있어 민감도를 증가시키고, 바이러스만을 잡아서 농축시킴으로써 정확도를 증가시키며, DNA prep 과정을 생략함으로써 오염 발생률을 저하시킬 수 있으며, 재현성이 높음으로써, 보다 효율적인 바이러스를 진단할 수 있는 시스템 및 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 바이러스 농축 바이오칩(Virus Incrassation Biochip, VIB), 상기 바이오칩을 포함하는 바이러스 진단 시스템, 및 상기 시스템을 이용한 민감도 및 정확도가 증가한 새로운 바이러스 진단 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 바이러스를 포함하는 시료가 투입되는 주입구(Inlet hole); 상기 주입구와 연통되어, 수지(resin)가 위치될 수 있는 저장소(Resovoir); 상기 저장소와 연통되어, 수지가 배출되지 않도록 막아주는 비드 댐(bead dam)이 위치된 비드 챔버(bead chamber); 상기 저장소와 비드 챔버 바닥면에 위치되어, 어레이 형태로 구성된 전극(electrode); 및, 상기 비드 챔버와 연통되며, 주입된 시료가 배출되도록 상기 주입구의 타측에 형성된 배출구(outlet hole);를 포함하는 바이러스 농축 바이오칩(Virus Incrassation Biochip, VIB)을 제공한다.

또한, 본 발명은 시료 및 완충용액이 수용된 시험관; 상기 시험관과 이동관으로 연결되며, 상기 시험관에서 배출된 시료 및 완충용액의 유동을 선택적으로 차단하도록 설치된 밸브부; 상기 밸브부와 이동관으로 연결되며, 상기 밸브부 후단에 배치되며, 상기 이동관에서의 상기 시료 및 완충용액의 유동력을 제공하는 펌프부; 상기 펌프부와 이동관으로 연결되며, 상기 펌프부 후단에 배치되며, 상기 펌프부로 부터 이동되어 유입된 시료에서 바이러스를 농축하는 상기 바이러스 농축 바이오칩(VIB); 및, 상기 바이러스 농축 바이오칩과 이동관으로 연결되며, 상기 시료가 상기 바이러스 농축 바이오칩에서 용출된 후 폐기되기 위해 이동되어 저장되는 폐기용기;를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 진단 장치를 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 수지(resin)에 항 바이러스 항체를 접합(conjugation)시키는 단계;

2) 접합된 수지를 상기 바이러스 농축 바이오칩(VIB)에 충진하는 단계;

3) 피검체로부터 분리한 시료를 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여, 수지에 피검 바이러스를 부착시킨 후 세척하는 단계;

4) 용출 완충용액을 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여 바이러스를 용출시킨 후 상기 바이러스를 농축(incrassation)시키는 단계;

5) 농축된 바이러스에 대하여 정량적 PCR(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)을 수행하여 유전자를 증폭시키는 단계; 및

6) 증폭된 유전자를 분석하는 단계를 포함하는 바이러스 진단 효율을 높이는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 양이온 또는 음이온 교환 수지를 상기 바이러스 농축 바이오칩(VIB)에 충진하는 단계;

2) 피검체로부터 분리한 시료를 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여, 수지에 피검 바이러스를 부착시킨 후 세척하는 단계;

3) 용출 완충용액을 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여 바이러스를 용출시킨 후 상기 바이러스를 농축(incrassation)시키는 단계;

4) 농축된 바이러스에 대하여 정량적 PCR(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)을 수행하여 유전자를 증폭시키는 단계; 및

5) 증폭된 유전자를 분석하는 단계를 포함하는 바이러스 진단 효율을 높이는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 수지에 항 바이러스의 항체를 접합시키는 단계;

2) 접합된 수지를 상기 바이러스 농축 바이오칩(VIB)에 충진시킨 후 세척하는 단계;

3) 피검체로부터 분리한 시료를 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여, 수지에 바이러스를 부착시킨 후 세척하는 단계;

4) 용출 완충용액을 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여 바이러스를 용출시킨 후 상기 바이러스를 농축시키는 단계;

5) 용출된 용출물(elute)을 중화(neutralization)시키는 단계;

6) 중화된 용출물에 용해용액(Lysis solution)을 혼합하여 수득한 용해물을 인큐베이션(incubation)하는 단계;

7) 인큐베이션된 용해물로부터 qPCR을 수행하여 유전자를 증폭시키는 단계; 및

8) 증폭된 유전자를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러 스 진단 효율을 높이는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

1) 수지에 항 바이러스의 항체를 접합시키는 단계;

4) 용해 완충용액(Lysis buffer)을 첨가하여 수득된 용해물을 인큐베이션하는 단계;

5) 용해물로부터 qPCR을 수행하여 유전자를 증폭시키는 단계; 및

6) 증폭된 유전자를 분석하는 단계를 포함하는, 바이러스 진단 효율을 높이는 방법을 제공한다.

본 발명의 VIB(Virus Incrassation Biochip) 시스템, 및 이를 이용한 새로운 바이러스 진단 방법은, 기존의 qPCR을 이용한 바이러스 진단 방법에 비해 사용되는 시료의 볼륨을 증가시켜 민감도가 증가시키고, 바이러스만 잡아서 농축시킴으로써 정확도를 증가시키며, 유전자 추출시간이 단축됨으로써 신속하게 진단할 수 있으며, DNA prep 과정을 제거함으로써 오염 발생률을 저하시키며, 자동화 시스템이 가능하여 신속하고 재현가능함으로써 진단 효율을 높일 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

바이러스를 포함하는 시료가 투입되는 주입구(Inlet hole);

상기 주입구와 연통되어, 수지(resin)가 위치될 수 있는 저장소(Resovoir);

상기 저장소와 연통되어, 수지가 배출되지 않도록 막아주는 비드 댐(bead dam)이 위치된 비드 챔버(bead chamber);

상기 저장소와 비드 챔버 바닥면에 위치되어, 어레이 형태로 구성된 전극(electrode); 및,

상기 비드 챔버와 연통되며, 주입된 시료가 배출되도록 상기 주입구의 타측에 형성된 배출구(outlet hole);를 포함하는 바이러스 농축 바이오칩(Virus Incrassation Biochip, VIB)을 제공한다.

본 발명에 따른 바이오칩에 있어서, 도면 1에서 보는 바와 같은 구조를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다(도 1 참조).

본 발명에 따른 바이오칩에 있어서, 외부에서 상기 주입구에 선택적으로 삽입 연통되도록, 알부민 제거 튜브(Albumin removal tube)를 포함할 수 있다.

상기 알부민 제거 튜브는 도면 2에서 보는 바와 같은 구조를 갖는 것이 바람 직하나 이에 한정되지 않는다(도 2 참조). 즉, 상기 알부민 제거 튜브는 튜브 연결부; 레진이 위치할 수 있는 알부민 제거부; 및 VIB 주입구에 연결되는 연결부를 포함하는 구조를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 바이오칩에 있어서, 수지는 항 바이러스 항체를 접합(conjugation)시킨 수지인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 바이오칩에 있어서, 비드는 아가로즈 비드 또는 세파로즈 비드인 것이 바람직하며, CNBr에 의해 활성화된 세파로즈 비드인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 바이오칩에 있어서, 비드는 직경이 45 ㎛ ~ 165 ㎛인 것이 바람직하며, 평균 90 ㎛인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 바이오칩에 있어서, 전극은 직경이 0.05 ㎛인 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 바이오칩에 있어서, 비드 챔버의 외주부에 설치되어 상기 시료가 배출되고, 상기 배출구와 연통되는 배출 채널(outlet channel)를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 바이오칩은 수지 표면에 표적 항원 코팅(conjugation)을 상기 바이오칩내에서 구현가능하다. 또한, 상기 바이오칩은 미세유체소자 시스템을 통해서 현장에서도 진단할 수 있도록 자동화, 소형화, 및 휴대화가 가능하다.

또한, 상기 바이오칩은 소량의 시료 뿐만 아니라 다량의 시료 속에 포함된 소량 바이러스도 농축이 가능하다. 이는 기존의 전통적인 정제 방식이 튜브 및 용 기의 크기에 의해서 사용할 수 있는 시료의 양이 제한적인 것을 개선한 것이다.

또한, 상기 바이오칩은 바이오칩 플랫폼을 사용함으로써 면역 반응을 이용한 방법 뿐만 아니라 이온 결합 방식을 이용한 바이러스 농축도 가능하여 다양하게 적용할 수 있다.

또한, 상기 바이오칩은 전극을 이용하여 VIB 자체에 가열(heating) 기능을 가짐으로써 시료의 반응에 있어서, VIB의 이동이나 가열 장비 없이 수행할 수 있으며, 수초 이내에 적절한 반응 온도에 도달하므로 10분 이상 걸리는 일반적인 가열 장비에 비해 성능이 우수하다.

아울러, 상기 바이오칩은 알부민 제거 튜브를 이용하여 알부민 제거 공정을 삽입함으로써, 혈액을 이용할 시 혈액 내의 바이러스와 비드의 결합 효율을 높일 수 있으며, 이들의 비특이적 결합을 줄일 수 있다.

또한, 본 발명은

시료 및 완충용액이 수용된 시험관;

상기 시험관과 이동관으로 연결되며, 상기 시험관에서 배출된 시료 및 완충용액의 유동을 선택적으로 차단하도록 설치된 밸브부;

상기 밸브부와 이동관으로 연결되며, 상기 밸브부 후단에 배치되며, 상기 이동관에서의 상기 시료 및 완충용액의 유동력을 제공하는 펌프부;

상기 펌프부와 이동관으로 연결되며, 상기 펌프부 후단에 배치되며, 상기 펌프부로부터 이동되어 유입된 시료에서 바이러스를 농축하는 본 발명의 바이러스 농 축 바이오칩(VIB); 및

상기 바이러스 농축 바이오칩과 이동관으로 연결되며, 상기 시료가 상기 바이러스 농축 바이오칩에서 용출된 후 폐기되기 위해 이동되어 저장되는 폐기용기; 를 포함하는 바이러스 진단 장치(System)을 제공한다.

본 발명에 따른 시스템에 있어서, 도면 3에서 보는 바와 같은 구조를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다(도 3 참조).

본 발명에 따른 시스템은 자동화 시스템이 가능하여 신속하고 간편하여 효율적이며, 재현가능하다.

본 발명은 바이러스의 농축을 이용한 바이러스 진단 효율을 높이는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은

2) 접합된 수지를 본 발명의 바이러스 농축 바이오칩(VIB)에 충진하는 단계;

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 수지는 아미노링크 결합 레진(AminoLink Coupling Resin)을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 항 바이러스 항체는 아데노바이러스 항체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 시료는 세포, 조직, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 활액, 뇌척수액, 땀, 소변, 배설물 및 눈물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 혈액인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 5)의 정량적 PCR은 DNA prep(plasmid preparation) 과정이 없는 다이렉트(direct) qPCR을 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한가지 실시 태양에서는 기존의 PCR을 통한 방법이 시료내 미량의 바이러스를 검출하지 못하는 구간이 있는지 알아보기 위해, 농도별 아데노바이러스를 시료로 사용하여 PCR을 수행한 결과, 기존의 PCR을 통한 방법은 아데노바이러스의 농도가 1 × 10^-1 내지 1 × 10⁰ PFU/mL인 경우 전혀 검출이 되지 않았다. 즉, 기존의 바이러스 진단 방법은 시료내 미량의 바이러스의 경우 검출할 수 없는 단점이 있음을 알 수 있다(도 4 참조).

본 발명의 또다른 한가지 실시 태양에서는 기존의 PCR을 통한 방법과 본 발 명의 VIB를 이용한 방법을 각각 수행하여 바이러스 검출 효율을 비교한 결과, PCR에 의한 기존 방법은 바이러스의 농도가 10 PFU/mL까지 검출이 되는 반면에, VIB를 적용한 방법은 1 PFU/mL까지 검출할 수 있었다(도 5 참조).

따라서, 본 발명의 바이러스 진단 방법은 바이러스 농축 미세칩을 이용하여 바이러스를 농축한 후 다이렉트(direct) qPCR을 수행함으로써, 기존의 qPCR에 비해 보다 다량의 시료, 즉 3000 ㎕까지 사용할 수 있어 민감도를 증가시키고, 바이러스만을 잡아서 농축시킴으로써 정확도를 증가시키며, DNA prep 과정을 생략함으로써 오염 발생률을 저하시킬 수 있으므로, 기존의 PCR을 이용한 일반적인 바이러스 진단 방법에 비해 바이러스를 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 양이온 또는 음이온 교환 수지를 본 발명의 바이러스 농축 바이오칩(VIB)에 충진하는 단계;

본 발명의 VIB는 바이오칩 플랫폼을 사용함으로써 면역 반응을 이용한 방법 뿐만 아니라 이온 결합 방식을 이용한 바이러스 농축도 가능하다.

본 발명에 따른 방법에 있어서, 본 발명은 양이온 또는 음이온 교환 수지를 VIB에 충진시킴으로써 반대의 전하를 띈 바이러스를 농축시킬 수 있다.

또한, 본 발명은

1) 수지에 항 바이러스의 항체를 접합시키는 단계;

2) 접합된 수지를 본 발명의 바이러스 농축 바이오칩(VIB)에 충진시킨 후 세척하는 단계;

5) 용출된 용출물(elute)을 중화(neutralization)시키는 단계;

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 수지는 아미노링크 결합 레진(AminoLink Coupling Resin)을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 2) 및 단계 3)의 세척은 PBS(phosphate-buffered saline)을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 시료는 PBS로 희석시켜 사용하고, 이때 PBS의 양은 시료의 양의 3 내지 5배로 희석시켜 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 희석된 시료를 미세칩에 12 ~ 20분 동안 흘리는 것이 바람직하고 15분 동안 흘리는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 용출 완충용액은 glycine-HCl을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정지 않는다. 상기 용출용액을 칩에 흘려서 용출시킨 용출물은 50 ㎕씩 나누어 받는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 5)의 중화는 Tris[(HOCH₂)₃CNH₂]를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 6)의 용해용액은 Lyse Ⅱ를 사용하는 것이 바람직하고, 상기 용해용액을 중화시킨 용출물과 1 : 1로 혼합시키는 것이 바람직하며, 상기 인큐베이션은 95℃에서 10분 동안 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 7)의 qPCR은 DNA prep 과정을 생략한 다이렉트(direct) qPCR을 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 상기 바이러스 진단 방법은, 칩과 펌프를 사용하여 시료의 볼륨의 한계를 좁힘으로써 기존의 qPCR이 200 내지 400 ㎕의 시료를 사용하는데 반해 3000 ㎕까지 시료를 사용할 수 있으므로 바이러스 진단의 민감도를 증가시키며, 유전자 추출 대신 바이러스를 농축함으로써 시간을 단축시키며, 바이러스만을 걸러서 농축시킴으로써 바이러스 진단의 정확도를 증가시키며, 유전자 증폭 단계에서 DNA prep 과정을 생략하여 오염 발생률을 저하시킬 수 있으며, 상기 칩을 자동화 장비로의 연결이 가능하여 간단하고 신속하게 수행할 수 있으므로, 기존의 PCR을 이용한 바이러스를 진단 방법에 비해 현저한 효율성을 가진 바이러스 진단 방법임을 알 수 있다.

본 발명의 한가지 실시 태양에서는 상기 바이러스 진단 방법이 기존의 일반적인 PCR 방법과 비교하여 미량의 바이러스양을 검출할 수 있는지 알아보기 위해, 시료로서 1 PFU/mL 농도의 아데노바이러스를 이용하여 바이러스를 검출한 결과, 본 발명의 상기 바이러스 진단 방법이 기존의 PCR 방법에 비해 약 3.2배 높은 바이러스양을 검출할 수 있음을 알 수 있었다(도 6 참조).

아울러, 본 발명은

1) 수지에 항 바이러스의 항체를 접합시키는 단계;

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 시료는 PBS로 희석시켜 사용하고, 이때 PBS의 양은 시료의 양의 3 내지 5배로 희석시켜 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 희석된 시료를 미세칩에 12 ~ 20분 동안 흘리는 것이 바람직하 고 15분 동안 흘리는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 용해완충용액은 Lyse Ⅱ를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정지 않는다. 상기 특정 용해완충용액을 칩에 흘려서 용출시킨 용출물은 50 ㎕씩 나누어 받는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 인큐베이션은 95℃에서 10분 동안 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 5)의 정량적 PCR은 DNA prep 과정을 생략한 다이렉트(direct) qPCR을 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 한가지 실시 태양에서는 상기 바이러스 진단 방법이 기존의 일반적인 PCR 방법과 비교하여 미량의 바이러스양을 검출할 수 있는지 알아보기 위해, 시료로서 1 PFU/mL 농도의 아데노바이러스를 이용하여 바이러스를 검출한 결과, 본 발명의 상기 바이러스 진단 방법이 기존의 PCR 방법에 비해 약 4.6배 높은 바이러 스양을 검출할 수 있음을 알 수 있었다(도 6 참조).

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

하기 실시예 및 실험예는 단지 본 발명의 내용을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되지 않는다.

<실시예 1> VIB(Virus Incrassation Biochip) 시스템을 이용한 바이러스 진단 방법(개선 방법 1)

<1-1> 레진의 접합 및 충진

본 발명자들은 1 mM HCl 15 ml, 1 mM HCl(과량)에 팽창된 CNBr에 의해 활성화된 세파로즈 4B(GE Healthcare) 500 ㎕(bead vol. 100 ㎕), 결합 완충용액(Coupling buffer) 2 mL를 도 3에서 보는 바와 같이 밸브 & 펌프 시스템에 연결하고, 하기의 실험 방법과 같이 소프트웨어에 세팅하였다. 즉, a) 밸브에 1 mM HCl, b) 밸브에 비드, c) 밸브에 결합 완충용액을 연결하고 유속은 1 mL/min으로 하여, a) 1분, b) 30초, a) 10분 및 c) 1분씩 작동하도록 입력하였다(도 3).

구체적으로, a) 1 mM HCl 1 mL를 VIB의 주입구를 통해 흘려주어 VIB를 세척하였다.

그런 다음, b) CNBr에 의해 활성화된 세파로즈 4B(GE Healthcare) 500 ㎕(bead vol. 100 ㎕)를 VIB의 주입구를 통해 칩 안 비드 저장소(bead reservoir) 에 넣어 주었다.

그런 다음, a) 1 mM HCl 10 mL을 10분 동안 VIB의 주입구를 통해 채널에 흘려주어 세척하였다.

그런 다음, 결합 완충용액(0.1M NaHCO3, 0.5 M NaCl pH 8.3) 1 mL을 1분 동안 주입구를 통해 흘려주어 비드를 세척하였다.

그런 다음, VIB를 밸브 및 펌프 시스템과 분리하여 파이펫으로 결합 완충용액으로 투석된 아데노바이러스 항체(0.4 mg)(abcam)를 비드 저장소에 채워 넣고 4℃에서 밤새 방치하였다(이때, 칩을 회전시켜서 비드와 항체의 반응 효율을 최대화 시켰다).

그런 다음, 0.1 M Tris HCl, pH 8.0, 2 mL를 a) 밸브에 연결시켰다.

그런 다음, a) 0.1 M Tris HCl, pH 8.0, 1 mL를 1분 동안 주입구를 통해 흘려주어 비드를 세척하였다.

그런 다음, 0.1 M Tris HCl, pH 8.0을 주입구를 통해 비드 저장소에 채워 넣고 실온에서 2시간 차단(blocking)시켰다.

그런 다음, 0.5 M NaCl & 0.1 M acetate 완충용액 pH 3 ~ 4, 4 mL, 0.5 M NaCl & 0.1 M Tris-HCl 완충용액 pH 8 ~ 9, 4 mL, PBS 2 mL, 아데노바이러스(Qbiogene의 AdEasy vector system을 이용하여 직접 제작) 3 mL를 PBS로 12 mL로 희석시킨 시료 15 mL, 0.1 M glycine-HCl pH 2.5 또는 Lyse Ⅱ(바이오퀘스트) 500 ㎕를 각각 밸브 a), b), c), d), e)에 연결하고, 다음과 같이 작동되도록 프로그래밍하였다.

우선, a) 0.5 M NaCl & 0.1 M acetate 완충용액 pH 3 ~ 4, 1 mL를 1분 동안 주입구를 통해 흘려주어 비드를 세척하였다.

그런 다음, b) 0.5 M NaCl & 0.1 M Tris-HCl 완충용액 pH 8 ~ 9, 1 mL를 1분 동안 주입구를 통해 흘려주어 비드를 세척하였다.

그런 다음, 상기 두 과정을 순차적으로 2번 더 반복하였다.

그런 다음, c) PBS 1 mL를 1분 동안 주입구를 통해 채널에 흘려주어 비드를 세척하였다.

<1-2> 바이러스의 농축

우선, d) 시료 15 mL를 주입구를 통해, 채널에 연결되어 있는 알부민 제거 튜브(Albumin removal tube)(Millipore)에 15분 동안 흘려주어 비드에 접합된 항체와 아데노바이러스가 붙게 하였다.

그런 다음, c) PBS 0.5 mL를 30초 동안 주입구를 통해 채널에 흘려주어 비드를 세척하였다.

그런 다음, e) 0.1 M glycine-HCl pH 2.5 0.4 mL를 2분 동안 주입구를 통해 채널에 흘려주어 VIB의 배출구를 통해 용출된 용출물(elute)를 50 ㎕씩 나누어 받았다.

그런 다음, 50 ㎕ 용출물에 1 M Tris, pH 9.0, 2.5 ㎕를 넣어 중화(neutralization)시켰다.

그런 다음, Lyse Ⅱ(바이오퀘스트)와 1:1로 혼합하여 95℃에서 10분 동안 반 응시켰다.

<1-3> 바이러스의 검출

상기 <1-2>의 반응 용액을 주형(template)로 하여 qPCR을 다음과 같이 수행하였다[정방향 프라이머(제노텍): 5'-CCA GAC ACC GTC CTG AGT GTA T-3'(서열번호: 1); 및 역방향 프라이머(제노텍): 5'-CGT TCC CAG AAA TGT AGC AAC A-3'(서열번호: 2), 증폭 사이즈: 236 bp].

qPCR 조성		qPCR 조건
시약	부피(ul)	온도	시간	사이클
2×mix(바이오퀘스트)	10	95 ℃	15 min	1 cycle
5 uM 정방향 프라이머	1	94 ℃	30 sec	40 cycle
5 uM 역방향 프라이머	1	56 ℃	30 sec
D.W.	6	72 ℃	1 min
template	2	95 ℃	30 sec	1 cycle
총계	20	55 ℃	1 min	1 cycle
총계	20	75 ℃	30 sec	41 cycle

<실시예 2> VIB 시스템을 이용한 바이러스 진단 방법(개선 방법 2)

상기 실시예 <1-1>의 과정을 동일하게 수행한 다음, 하기와 같이 수행하여 바이러스를 농축 및 검출하였다.

그런 다음, e) Lyse Ⅱ(바이오퀘스트) 0.4 mL를 30초 동안 주입구를 통해 채널에 흘려주어 칩 안(비드 저장소)을 채운 후, 95℃에서 10분 동안 반응시켰다(이때, 전극봉(Electrode)(0.05 um)이 칩 자체를 가열시켜준다).

그런 다음, 0.4 mL를 2분 동안 주입구를 통해 채널에 흘려주어 배출구를 통해 용출된 용출물(elute)을 50 ㎕씩 나누어 받았다.

그런 다음, 상기 용출물을 주형으로 하여 Direct qPCR을 다음과 같은 조건에서 수행하였다[정방향 프라이머(제노텍): 5'-CCA GAC ACC GTC CTG AGT GTA T-3'(서열번호: 1); 및 역방향 프라이머(제노텍): 5'-CGT TCC CAG AAA TGT AGC AAC A-3'(서열번호: 2), 증폭 사이즈: 236 bp].

<비교예 1> 기존의 방법을 이용한 바이러스 검출

본 발명자들은 기존의 바이러스 검출 방법의 한계를 확인하고, 본 발명의 방법과 그 효율을 비교하기 위해, 하기와 같이 기존의 알려진 PCR 방법으로 바이러스를 검출하였다.

구체적으로, 음성 대조군은 아데노바이러스를 넣지 않은 경우이고, 양성 대조군은 기존에 확인된 아데노바이러스 DNA를 첨가한 경우이다. PBS를 이용하여 아데노바이러스를 농도별(1 × 10^-1 PFU/mL, 1 × 10⁰ PFU/mL, 1 × 10¹ PFU/mL, 1 × 10² PFU/mL, 1 × 10³ PFU/mL, 1 × 10⁴ PFU/mL, 1 × 10⁵ PFU/mL, 1 × 10⁶ PFU/mL, 1 × 10⁷ PFU/mL, 1 × 10⁸ PFU/mL)로 희석하였으며, 농도별 아데노바이러스 200 ㎕씩을 QIAamp MiniElute Virus Spin(Qiagen)를 사용하여 최종 20 ㎕가 되도록 DNA를 추출하였다. 그런 다음, 추출된 아데노바이러스 DNA를 주형으로 하여 하기와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다[정방향 프라이머(제노텍): 5'-CCA GAC ACC GTC CTG AGT GTA T-3'(서열번호: 1); 및 역방향 프라이머(제노텍): 5'-CGT TCC CAG AAA TGT AGC AAC A-3'(서열번호: 2), 증폭 사이즈: 236 bp].

PCR 조성		PCR 조건
시약	부피(ul)	온도	시간	사이클
2×mix(바이오퀘스트)	10	95 ℃	5 min	1 cycle
5 uM 정방향 프라이머	1	94 ℃	30 sec	40 cycle
5 uM 역방향 프라이머	1	56 ℃	30 sec
D.W.	6	72 ℃	1 min
template	2	72 ℃	10 min	1 cycle
총계	20	72 ℃	10 min	1 cycle

그 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 기존의 PCR을 통한 바이러스 검출방법은 10 PFU/mL의 농도까지는 아데노바이러스가 검출되었으나, 그 이하인 1 × 10^-1 내지 1 × 10⁰ PFU/mL의 농도에서는 검출되지 않았다(도 4).

<실험예 1> VIB를 이용한 바이러스 검출 효율 증진 확인

본 발명자들은 VIB 시스템을 이용한 바이러스 검출 방법과 기존의 바이러스 검출 방법의 바이러스 검출 효율을 비교하였다.

구체적으로, 기존방법은 다음과 같이 수행하였다: PBS를 이용하여 아데노바이러스를 농도별(1×10^-1 PFU/mL, 1×10⁰ PFU/mL,1×10¹ PFU/mL, 1×10² PFU/mL, 1×10³ PFU/mL)로 희석하였으며, 농도별 아데노바이러스 200 ㎕씩을 QIAamp MiniElute Virus Spin(Qiagen)를 사용하여 최종 20 ㎕가 되도록 DNA를 추출하였다. 그런 다음, 추출된 아데노바이러스 DNA를 주형으로 하여 하기 표 4와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다[정방향 프라이머: 5'-CCA GAC ACC GTC CTG AGT GTA T-3'(서열번호: 1); 및 역방향 프라이머: 5'-CGT TCC CAG AAA TGT AGC AAC A-3'(서열번호: 2), 증폭 사이즈: 236 bp].

또한, VIB를 적용한 방법은 다음과 같이 수행하였다: PBS를 이용하여 아데노바이러스를 농도별(1×10^-1 PFU/mL, 1×10⁰ PFU/mL,1×10¹ PFU/mL, 1×10² PFU/mL, 1×10³ PFU/mL)로 희석하였으며, 상기 <실시예 1>의 접합(conjugation)을 수행한 후, 농도별 아데노바이러스 3 mL에 PBS 12 mL를 각각 넣고, 15분 동안 채널에 흘려주었다. PBS 0.5 mL을 30초 동안 VIB의 채널에 흘려주어 비드를 세척하였다. 0.1 M glycine-HCl pH2.5 0.4 mL를 2분 동안 VIB의 채널에 흘려주어 배출구를 통해 용출된 용출물을 50 ㎕씩 나누어 받았다. QIAamp MiniElute Virus Spin(Qiagen)를 사용하여 최종 20 ㎕가 되도록 DNA를 추출하였다. 그런 다음, 추출된 아데노바이러스 DNA를 주형으로 하여 하기 표 4와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다[정방향 프라이머: 5'-CCA GAC ACC GTC CTG AGT GTA T-3'(서열번호: 1); 및 역방향 프라이머: 5'-CGT TCC CAG AAA TGT AGC AAC A-3'(서열번호: 2), 증폭 사이즈: 236 bp].

그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, PCR에 의한 기존 방법은 바이러스의 농도가 10 PFU/mL까지 검출이 되는 반면에, VIB를 적용한 방법은 1 PFU/mL까지 검출이 되었다(도 5).

<실험예 2> 바이러스 진단 방법에 따른 바이러스양 비교

본 발명자들은 상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>의 방법이 기존의 일반적인 PCR 방법인 <비교예 1>에 비해 바이러스 검출 효율이 우수한지 알아보기 위해, 시료로서 1 PFU/mL 농도의 아데노바이러스를 이용하여 각각 하기 표 5에 기재된 조건으로 바이러스를 검출하였다. 음성대조군과 양성대조군은 Direct qPCR에 관한 것으로, 각각 template를 넣지 않은 것, 및 이미 확인된 아데노바이러스 DNA를 넣은 것이다.

	기존 방법	실시예 1의 방법	실시예 2의 방법
정제	DNA 정제	VIB 시스템 사용: 단백질 정제	VIB 시스템 사용: 단백질 정제
시료
시료양	200 ㎕	3000 ㎕	3000 ㎕
용출	D.W. 20 ㎕	0.1 M glycine-HCl pH 2.5	특정 Lysis buffer
qPCR의 전처리	-	용출물과 Tris pH 9.0을 1 : 1로 혼합한 후 인큐베이션	-
qPCR	qPCR	direct qPCR	direct qPCR
방법	비교예 1	실시예 1	실시예 2

그 결과, 도 6에서 보는 바와 같이, 기존의 PCR 방법인 <비교예 1>의 방법으로 바이러스를 정량한 경우에는 6.3 PFU/mL의 농도를 나타내었다. 또한, 6.3 PFU/mL를 1로 하여 상기 <실시예 1> 및 <실시예 2>의 방법으로 정량한 바이러스 양을 비교한 결과, 기존의 PCR 방법에 비해 각각 3.2배 및 4.6배로 바이러스양을 검출할 수 있었다(도 6).

본 발명의 바이러스 진단 방법은, 기존의 PCR을 이용한 바이러스 진단 방법에 비해 민감도 및 정확도가 증가되고, 진단 시간이 단축되며, 오염 발생률을 낮출 수 있어 신속하고 정확하게 진단할 수 있으므로, 바이러스의 진단 효율을 높이는 새로운 방법 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 VIB(Virus Incrassation Biochip)를 도식화한 그림이다.

도 2는 알부민 제거 튜브(Albumin removal tube)를 도식화한 그림이다.

도 3은 상기 VIB를 포함하는 VIB 시스템을 도식화한 그림이다.

도 4는 기존의 PCR을 이용한 바이러스 진단 방법이 미량의 바이러스의 경우 검출이 안되는 것을 보여주기 위해, 바이러스를 농도별로 사용하여 DNA prep후 PCR을 수행한 전기영동한 결과를 나타내는 그림이다.

도 5는 기존의 PCR을 이용한 바이러스 진단 방법에 비해 본 발명의 VIB 시스템을 이용한 방법의 바이러스 검출 효율을 비교하기 위해, 상기 각각의 방법을 이용하여 바이러스를 농도별로 검출한 결과를 나타내는 그림이다.

도 6은 기존의 PCR을 이용한 바이러스 진단 방법에 비해 본 발명의 바이러스 농축을 이용한 방법이 더 많은 바이러스양을 검출할 수 있는 것을 보여주기 위해, 동일한 농도의 바이러스를 사용하여 각각 기존방법(용출 → DNA prep → qPCR), 개선방법 1(바이러스 농축 → 용출 → qPCR을 위한 전처리 → direct qPCR) 및 개선방법 2(바이러스 농축 → 특정 Lysis buffer로 용출 → direct qPCR)을 수행한 전기영동 결과(아래) 및 정량값을 비교한 그래프(위)를 나타내는 그림이다.

<110> Seoulin Bioscience Co., Ltd <120> Novel virus detection system <130> 9p-08-38 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for qPCR <400> 1 ccagacaccg tcctgagtgt at 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for qPCR <400> 2 cgttcccaga aatgtagcaa ca 22

Claims

바이러스를 포함하는 시료가 투입되는 주입구(Inlet hole);

상기 주입구와 연통되고, 내부에는 표면에 결합용 수지(resin)가 위치될 수 있는 저장소(Resovoir);

상기 저장소와 연통되어, 수지가 배출되지 않도록 막아주는 비드 댐(bead dam)이 위치된 비드 챔버(bead chamber);

상기 저장소와 비드 챔버 바닥면에 위치되어, 어레이 형태로 구성된 전극(electrode);

상기 비드 챔버와 연통되며, 주입된 시료가 배출되도록 상기 주입구의 타측에 형성된 배출구(outlet hole);

를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 농축 바이오칩(Virus Incrassation Biochip, VIB).
제 1항에 있어서, 외부에서 상기 주입구에 연통되는, 알부민 제거 튜브(Albumin removal tube)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 농축 바이오칩.
제 1항에 있어서, 상기 비드는 아가로즈 비드 또는 세파로즈 비드인 것을 특징으로 하는 바이러스 농축 바이오칩.
제 1항에 있어서, 상기 비드의 직경은 45 ㎛ ~ 165 ㎛인 것을 특징으로 하는 바이러스 농축 바이오칩.
제 1항에 있어서, 상기 비드 챔버의 외주부에 설치되어 상기 시료가 배출되고, 상기 배출구와 연통되는 배출 채널(outlet channel)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 농축 바이오칩.
시료 및 완충용액이 수용된 시험관;

상기 시험관과 이동관으로 연결되며, 상기 시험관에서 배출된 시료 및 완충용액의 유동을 선택적으로 차단하도록 설치된 밸브부;

상기 밸브부와 이동관으로 연결되며, 상기 밸브부 후단에 배치되며, 상기 이동관에서의 상기 시료 및 완충용액의 유동력을 제공하는 펌프부;

상기 펌프부와 이동관으로 연결되며, 상기 펌프부 후단에 배치되며, 상기 펌프부로부터 이동되어 유입된 시료에서 바이러스를 농축하는 제 1항의 바이러스 농 축 바이오칩(VIB); 및

상기 바이러스 농축 바이오칩과 이동관으로 연결되며, 상기 시료가 상기 바이러스 농축 바이오칩에서 용출된 후 폐기되기 위해 이동되어 저장되는 폐기용기;

를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 진단 장치.
1) 수지(resin)에 항 바이러스 항체를 접합(conjugation)시키는 단계;

2) 접합된 수지를 제 1항의 바이러스 농축 바이오칩(VIB)에 충진하는 단계;

3) 피검체로부터 분리한 시료를 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여, 수지에 피검 바이러스를 부착시킨 후 세척하는 단계;

4) 용출 완충용액을 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여 바이러스를 용출시킨 후 상기 바이러스를 농축(incrassation)시키는 단계;

5) 농축된 바이러스에 대하여 정량적 PCR(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)을 수행하여 유전자를 증폭시키는 단계; 및

6) 증폭된 유전자를 분석하는 단계를 포함하는 바이러스 진단 효율을 높이는 방법.
제 7항에 있어서, 단계 5)의 qPCR은 DNA prep(plasmid preparation) 과정이 없는 다이렉트(direct) qPCR인 것을 특징으로 하는 방법.
1) 양이온 또는 음이온 교환 수지를 제 1항의 바이러스 농축 바이오칩(VIB)에 충진하는 단계;

2) 피검체로부터 분리한 시료를 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여, 수지에 피검 바이러스를 부착시킨 후 세척하는 단계;

3) 용출 완충용액을 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여 바이러스를 용출시킨 후 상기 바이러스를 농축(incrassation)시키는 단계;

4) 농축된 바이러스에 대하여 정량적 PCR(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)을 수행하여 유전자를 증폭시키는 단계; 및

5) 증폭된 유전자를 분석하는 단계를 포함하는 바이러스 진단 효율을 높이는 방법.
제 9항에 있어서, 단계 4)의 qPCR은 DNA prep(plasmid preparation) 과정이 없는 다이렉트(direct) qPCR인 것을 특징으로 하는 방법.
1) 수지에 항 바이러스의 항체를 접합시키는 단계;

2) 접합된 수지를 제 1항의 바이러스 농축 바이오칩(VIB)에 충진시킨 후 세 척하는 단계;

3) 피검체로부터 분리한 시료를 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여, 수지에 바이러스를 부착시킨 후 세척하는 단계;

4) 용출 완충용액을 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여 바이러스를 용출시킨 후 상기 바이러스를 농축시키는 단계;

5) 용출된 용출물(elute)을 중화(neutralization)시키는 단계;

6) 중화된 용출물에 용해용액(Lysis solution)을 혼합하여 수득한 용해물을 인큐베이션(incubation)하는 단계;

7) 인큐베이션된 용해물로부터 qPCR을 수행하여 유전자를 증폭시키는 단계; 및

8) 증폭된 유전자를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 바이러스 진단 효율을 높이는 방법.
제 11항에 있어서, 단계 4)의 용출 완충용액은 글리신(glycine)-HCl인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 단계 6)의 용해용액은 Lyse Ⅱ인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11에 있어서, 단계 7)의 qPCR은 DNA prep(plasmid preparation) 과정이 없는 다이렉트(direct) qPCR인 것을 특징으로 하는 방법.
1) 수지에 항 바이러스의 항체를 접합시키는 단계;

2) 접합된 수지를 제 1항의 바이러스 농축 바이오칩(VIB)에 충진시킨 후 세척하는 단계;

3) 피검체로부터 분리한 시료를 상기 바이러스 농축 바이오칩의 주입구에 주입하여, 수지에 바이러스를 부착시킨 후 세척하는 단계;

4) 용해 완충용액(Lysis buffer)을 첨가하여 수득된 용해물을 인큐베이션하는 단계;

5) 용해물로부터 qPCR을 수행하여 유전자를 증폭시키는 단계; 및

6) 증폭된 유전자를 분석하는 단계를 포함하는, 바이러스 진단 효율을 높이는 방법.
제 15항에 있어서, 단계 4)의 용해 완충용액은 Lyse Ⅱ인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항에 있어서, 단계 5)의 qPCR은 DNA prep(plasmid preparation) 과정이 없는 다이렉트(direct) qPCR인 것을 특징으로 하는 방법.