KR20110053416A

KR20110053416A - 기판상의 피처들을 이미지화하는 방법 및 장치

Info

Publication number: KR20110053416A
Application number: KR1020117000664A
Authority: KR
Inventors: 어거스트 제노베시오; 네일 에만스
Original assignee: 재단법인 한국파스퇴르연구소
Priority date: 2008-07-15
Filing date: 2009-07-08
Publication date: 2011-05-23
Also published as: CA2729977A1; CN102138160B; JP5451759B2; US8692876B2; CN102138160A; US20110175994A1; AU2009270534A1; ZA201100120B; EP2319014A1; WO2010006727A1; CA2729977C; HK1160273A1; EP2319014B1; JP2011527890A; AU2009270534B2

Abstract

기판상의 피처들을 이미지화하는 방법으로서, 상기 기판을 스캔하고 그 이미지를 생산하는 단계, 상기 이미지상에 그리드 모델을 오버레이하는 단계, 상기 그리드 모델을 상기 이미지상의 상기 피처들의 적어도 일부의 위치에 맞추는 단계, 및 상기 피처들의 이미지를 추출하는 단계를 포함하는 방법.

Description

기판상의 피처들을 이미지화하는 방법 및 장치{Method and apparatus for imaging of features on a substrate}

본 발명은 기판상의 피처들을 이미지화하는 방법 및 장치 특히, 마이크로어레이 상의 스팟들을 이미지화하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

기판 상의 피처들의 이미지화 및 분석은 다양한 기술적 분야에서 중요한 일이다. 예를 들면, 생화학적 분석에서 상기 이미지화 및 분석은 미리 정의된 패턴에 따라 기판 상에 담체 물질 (carrier substance)의 작은 스팟들을 적용하기 위한 통상적 기법이다. 다음으로, 적은 양의 다른 세포 물질이 상기 담체 물질의 스팟들에 첨가되고 상기 다른 스팟들의 세포 성장은 특정 기간의 시간 후에 상기 기판 상의 상기 스팟들의 이미지를 취하고 상기 이미지 내의 피처들을 분석함으로써 시간의 함수로서 모니터링된다.

상기 피처들의 이미지화는 미리 정의된 패턴에 따라 상기 기판 상에 그들을 배열함으로써 촉진될 수 있다. 보통 전용 스캐너 하드웨어 (dedicated scanner hardware)가 상기 스캐닝을 위하여 사용되고 상기 기판은 상기 기판의 준비 동안에 주석 파일에 등록된 상기 스팟들의 미리 정의된 알려진 위치들에서만 스캔된다. 이 통상적 기법은 여러 양상에서 한정된다.

상기 기판 상의 피처들의 수에 따라 상기 전체 기판의 스캐닝은, 스캐너의 앞에서 상기 기판을 움직이기 위한 상기 스캔 장치 또는 상기 기판에 대하여 상기 스캐너에 의하여 수행된 대응되는 많은 수의 반복되고 아주 정확한 기계적 이동을 포함하는, 많은 수의 단일 스캔들을 필요로 한다. 생화학적 분야에서 기판은 단일 기판 상에, 대응되는 수의 기계적 이동 단계를 필요로 하는, 3888 피처들 이상을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 스캐닝은 아주 정확하고 그에 따라 비싼 하드웨어를 필요로 한다.

더욱이, 상기 스캐닝 과정은 상기 기판상의 스팟들의 위치에 대한 정확한 정보에 강하게 의존한다. 상기 스캐닝은 정확한 위치확인 데이터 (positioning data)가 없는 경우 또는 상기 스캐너와 상기 기판 사이의 정렬오류 (misalignment)의 경우 실패할 수 있다.

이들 단점의 관점에서, 특히, 많은 수의 피처들을 포함하는 기판의 경우에,기판 상의 피처들이 더 빠르게 이미지화되고 이미징 하드웨어에 대한 요구사항을 감소시키도록 하는 개선된 방법 및 대응되는 장치에 대한 요구가 있다.

촉진된 스캐닝 과정 및 가속화된 이미지화를 포함한 피처들의 이미지화를 위한 개선된 방법 및 장치를 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 이 목적은 독립항 제1항의 특징을 포함하는 방법 및 종속항 제12항의 특징을 포함하는 장치에 의하여 달성된다.

본 발명의 바람직한 구체예들은 종속항에 정의되어 있다.

기판상의 피처들을 이미지화하기 위한 본 발명의 방법은 상기 기판을 스캔하고 그 이미지를 생산하는 단계, 상기 이미지상에 그리드 모델을 오버레이하는 단계, 상기 그리드 모델을 상기 이미지상의 상기 피처들의 적어도 일부의 위치에 피팅하는 단계, 및 상기 피처들의 이미지를 추출하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법은 상기 피처들의 위치에 관계없이 단일 또는 여러 스캐닝 단계로 상기 기판을 독립되게 스캐닝될 수 있도록 하는 동시에, 상기 피처들의 위치가 상기 이미지 상에 놓여진 그리드 모델을 사용하여 확인된다. 상기 그리드 모델은 바람직하게는 가장자리들에 의하여 연결된 지점들의 세트 (set of points)이고, 상기 그리드 모델의 각 지점은 상기 기판 상의 피처에 할당된다. 즉, 상기 그리드 모델의 지점의 수는 상기 기판 상의 관련된 피처들의 수와 같다. 상기 스캔된 이미지에 상기 그리드 모델을 오버레이하는 경우, 상기 그리드 모델의 상기 지점들의 위치는 초기에는 상기 기판 상의 상기 피처들의 실제 위치에 대응되지 않는다. 뒤이어 상기 그리드 모델을 상기 이미지 상의 피처들의 위치에 피팅하는 것에 의하여, 추가 분석을 위하여 그들 위치를 정확하게 결정할 수 있게 하고, 상기 확인된 위치에서 및 그 근처에서 상기 피처들의 부분적 이미지들을 추출할 수 있도록 한다.

상기 그리드 모델을 상기 이미지의 피처들에 피팅하기 때문에, 반복된 스캐닝 단계를 포함하는 스캐닝 과정이 필요 없다. 따라서, 스캐너에 대한 요구사항들이 감소된다. 더욱이, 스캐너의 반복된 이동 동안에 소비되는 시간이 회피되기 때문에 전체 이미지화 과정에 걸리는 시간이 감소된다.

일 구체예에 따르면, 상기 그리드 모델은 우선적으로 (priori) 알려진 기판 상의 피처들의 위치의 패턴에 기반된다. 특정한 기판에 대한 그리드 모델을 생성하는 경우, 피처들 사이의 거리 및 그들 상호간 방향 (orientation)에 대한 추가 정보를 포함한 이 패턴은 상기 그리드 모델의 상기 지점들의 초기 위치를 정의하기 위하여 및 어떤 지점의 이웃을 정의하기 위하여 대응되는 지점들 사이의 가장자리들을 확립하기 위하여 사용된다.

다른 구체예에 따르면 상기 그리드 모델은 규칙적 그리드, 직선 그리드, 카르티전 그리드, 다각형 그리드 및 육각형 그리드를 포함하는 그리드 군에 기반된다.

규칙적 그리드, 직선 그리드 및 카르티전 그리드는 각각 합동 (congruent) 또는 비합동 (incongruent) 직사각형에 의한 또는 단위 정사각형에 의한 상기 기판 면의 쪽매맞춤 (tesselation)을 나타낸다. 상기 그리드 모델의 지점들은 상기 쪽매맞춤의 노드 상에 놓여진다. 상기 피처들의 위치의 패턴은 또한 다각형 또는 육각형에 의한 상기 평면의 타일링을 기술하는 다각형 또는 육각형 그리드에 의하여 나타내어질 수 있다. 상기 그리드 모델의 지점들은 상기 그리드의 대응되는 노드들 상에 놓여진다.

본 발명의 다른 구체예에 따르면, 상기 오버레이하는 단계는 대략적 근사에 의하여 상기 기판의 상기 피처들의 일부의 위치를 결정하는 단계 및 상기 그리드 모델의 지점들의 일부를 상기 위치에 오버레이하는 단계를 포함한다. 이는 예를 들면 경계 지점들 또는 상기 기판의 이미지 상의 피처들의 영역의 구석들과 같은 3개의 눈에 띄는 지점들 (prominent points)을 확인하고 상기 그리드 모델의 상기 대응되는 구석들을 그들과 정렬함으로써 이루어질 수 있다. 아핀 변환과 같은 임의의 방법이 상기 그리드 모델의 나머지 상기 지점들을 순응시키기 위하여 사용될 수 있다. 이 오버레이하는 단계는 추가 단계들을 위한 초기 구조 (initial configuration)를 정의한다.

또다른 구체예에 따르면, 상기 기판의 이미지를 처리하는 것이, 특히 복수 개의 이미지들이 스캐닝 과정 동안 생산되었다면 또한 이로울 수 있다. 특히 그들의 크기는 상기 그리드 모델의 피팅 전에 축소될 수 있다. 한편으로 상기 크기 축소는 처리되어야 할 데이터의 감소된 양으로 인하여 추가 처리 단계를 가속화시키고, 다른 한편으로 크기 축소는 상기 이미지의 가우스 평활화 (Gaussian smoothing)에 해당하여 상기 이미지에서 노이즈를 감소시킨다.

다른 구체예에서 상기 이미지는 그리드 모델의 상기 피팅 전에 더 처리되고 필터의 적용, 평활화 (smoothing), 가장자리 강화 (edge enhancement), 색상 순응화 (color adaptation) 중 하나 또는 여러 과정들을 포함한다. 이들 방법들 중 하나 또는 여러 가지를 이용하는 것은 상기 이미지 중의 피처 특징을 더 구분시키는 것을 돕는다. 예를 들면 평활화는 상기 이미지 중의 노이즈를 감소시키기 위하여 사용될 수 있으며, 또는 가장자리 강화는 경계 (borders) 및 상기 피처들의 질감 (textures)을 강조하기 위하여 사용될 수 있다. 선택적 색상 강화는 특정한 색상 특징을 가진 피처의 대조를 강화하기 위하여 적용될 수 있다.

또다른 구체예에 따르면, 상기 피팅은 상기 그리드 모델의 에너지 함수의 결과의 반복적 최적화를 포함할 수 있다. 상기 에너지 함수는 상기 그리드 모델의 지점들의 함수이고 상기 지점들의 현재 토폴로지를 나타낸다. 더욱이, 상기 에너지 함수는 또한 상기 이미지 상의 상기 피처들의 위치로부터 상기 그리드 모델의 지점들의 벗어남을 기술한다. 글로벌 에너지는, 즉 상기 에너지 함수의 결과는 상기 글로벌 에너지를 최적화하는 그것의 주어진 이웃에서의 위치에 상기 그리드 모델의 지점을 움직임으로써 최적화된다. 이 과정은 다음 최적 글로벌 에너지를 결정하기 위하여 상기 그리드 모델의 각 지점에 대하여 반복된다. 이는 상기 에너지 함수가 최적으로 유지되고 더 개선될 수 없을 때까지 반복된다. 반복적 세밀화 (iterative refinement)를 위한 다른 방법들이 또한 적용될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 상기 에너지 함수의 결과는 최소화되고 상기 에너지 함수는 E(P)=αF(P)+βG(P)+γH(P)로 정의되고, 여기서 α,β 및 γ는 가중인자이고, F(P)는 그리드 모델의 이웃하는 지점들 사이의 거리에 의하여 결정되는 거리 항 (distance term)이고, G(P)는 그리드 모델의 수직성 항 (perpendicularity term)이고, H(P)는 상기 그리드 모델의 상기 지점들의 상기 이미지의 곡률 지도 (curvature map)로부터 계산된 상기 피처들의 상기 위치들로부터의 벗어남에 의하여 결정되는 곡률 항 (curvature term)다.

상기 대응되는 항들은 아래와 같이 주어진다:

,

여기서,

이고

, 여기서

이고,

.

특히,상기 항 F(P) 및 G(P)는 상기 그리드 모델의 공간적 구조를 나타내며 상기 그리드 모델의 상기 지점들이 카르티전 그리드를 근사하게 하도록 한다. 특히, F(P)는 상기 스팟간 거리가 알려진 거리로부터 벗어나는 경우 더 큰 값을 갖는다. G(P)는 두 이웃하는 지점들 사이의 각도가 90도로부터 벗어나는 경우 더 큰 값을 갖는다. 공간적 특징 외에, H(P)는 상기 그리드 모델의 상기 지점들과 상기 피처 위치들 사이의 연결을 생성하기 위하여 사용된다. H(P)는 아래에 기술되는 바와 같이 상기 기판의 상기 이미지의 곡률 지도로부터 유도되며 상기 지점들이 피처 위치로부터 먼 경우 더 큰 값을 갖는다.

일 구체예에 따르면, 상기 피처들의 적어도 일부의 위치에 상기 그리드 모델의 상기 피팅은 상기 피처들의 중앙에 상기 그리드 모델의 지점들을 피팅하는 것을 포함한다. 여기서 상기 그리드 모델의 상기 지점들은 상기 피팅 과정 후 각 피처의 중앙을 표시하도록 최적화된다.

바람직한 구체예는 상기 피처들이 마이크로어레이 상의 스팟들인 것을 포함한다.

다른 구체예에 따르면, 상기 마이크로어레이는 siRNA 형질도입된 세포의 성장을 포함한다. 이 구체예에서, 상기 기판은 상기 마이크로어레이를 포함하고 상기 피처들은 상기 마이크로어레이 상의 스팟들을 포함하고, 각 스팟은 siRNA 형질도입된 세포의 성장의 결과를 갖는다.

본 발명은 또한 장치를 포함한다. 본 발명의 이미징 장치는, 피처들의 기판을 스캔하고 그들의 적어도 부분적 이미지를 생산하는 이미지 획득 장치; 및 상기 이미지상에 그리드 모델을 오버레이하고; 상기 피처들의 적어도 일부의 위치에 상기 그리드 모델을 피팅하고; 및 상기 피처들의 이미지를 추출하는 상기 이미지 상의 피처들의 위치를 확인하기 위한 분석 장치를 포함한다.

본 발명의 상기 이미지 획득 장치는 기판 상에 위치된 상기 피처들의 위치와는 관계없이 기판을 스캔하도록 되어 있다. 상기 스캐닝은 기판의 하나 또는 복수 개의 이미지를 형성하도록 수행될 수 있다. 상기 이미지 데이터는 데이터 베이스에 저장되거나 상기 이미지 상의 상기 피처들의 위치를 확인하기 위하여 상기 분석 장치에 의하여 즉시 사용된다. 그렇게 하기 위하여, 상기 분석 장치는 하나 또는 여러 스캔된 이미지들을 포함하는 상기 이미지 상에 오버레이되고 상기 피처들의 위치에 피팅되는 그리드 모델을 사용한다. 상기 그리드 모델의 상기 지점들의 최종 위치에 기반하여, 상기 분석 장치는 상기 피처들의 부분적 이미지들을 추출한다.

상기 장치의 일 구체예에 따르면, 상기 기판 상의 상기 피처들은 어떤 패턴에 따라 배열되고, 상기 패턴은 규칙적 그리드, 직선 그리드, 카르티전 그리드, 다각형 그리드 및 육각형 그리드를 포함하는 그리드의 군이다. 상기 피처들의 특이적 배열의 선택은 상기 이미지 상의 상기 피처들의 분석의 과정 및 상기 그리드 모델의 피팅을 유리하게 할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 기판은 마이크로어레이이다. 상기 마이크로어레이는 하나 또는 여러 핵산의 스팟들을 포함할 수 있거나, 세포성 마이크로어레이일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 이미지 획득 장치는 서브세포성 해상을 갖는 이미지를 생산하도록 되어 있다.

다른 구체예에 따르면, 상기 장치는 상기 기판 상의 상기 피처들을 생성하기 위한 프린터 및 상기 피처들의 위치를 포함하는 주석 파일 (annotation files)을 더 포함한다. 상기 주석 파일은 상기 피처들의 토폴로지를 기술하고 그래서 상기 그리드 모델의 초기 패턴을 정의하기 위하여 및 필요한 데이터 및 정보를 제공하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 장치의 다른 구체예에 따르면, 상기 프린터는 스팟들을 생성하고, 각 스팟 상에, 라이브러리로부터의 핵산 또는 라이브러리로부터의 화합물이 적용되고, 상기 라이브러리는 RNAi 라이브러리, siRNA 라이브러리, 또는 화합물 라이브러리/cDNA 라이브러리를 포함하고, 상기 마이크로어레이는 전체 라이브러리 또는 그들의 서브세트를 나타낸다. 이 구체예에서 상기 이미징 장치는 스팟들을 포함하는 상기 마이크로어레이를 스캔하고, 상기 대응되는 이미지들 상의 상기 스팟들의 위치를 확인하고, 추가 분석을 위하여 상기 스팟들의 상기 이미지를 추출한다.

본 발명의 추가적인 특징, 잇점 및 특징은 첨부된 도면과 조합된 본 발명의 예시적 구체예의 하기의 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 이미징 장치의 일 구체예를 도식적으로 나타낸다.
도 2a-2d는 기판상의 피처들의 이미지를 스캔하는 단계 (도 2a), 상기 스캐닝에 의하여 얻어진 피처들의 단일 이미지 (도 2b), 상기 기판의 상기 이미지 상에 카르티전 그리드 모델을 오버레이하는 단계 (도 2c), 및 피팅된 카르티전 그리드 모델 (도 2d)을 포함하는 본 발명의 일 구체예에 따른 이미징 방법의 단계들 및 단계들의 결과를 나타낸다.
도 3a-3c는 본 발명의 일 구체예에 따른 두 이웃하는 지점들 사이의 거리 (도 3a), 상기 그리드 모델의 두 이웃하는 지점들 사이의 수직성 (fig. 3b) 및 이미지의 곡률 지도 (도 3c)를 포함하는 그리드 모델의 에너지 함수의 항들을 도시한다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 일 구체예에 따른 피팅 과정에 의하여 얻어진 좌표 (coordinates)를 사용하여 피처의 추출된 직사각형 이미지 (도 4a) 및 누락 스팟 검출 및 적색 siRNA 스팟 이미지 상의 그리드 오버레이를 보여주는 큰 마이크로어레이에 피팅된 그리드 모델 (도 4b)을 나타낸다.
도 5는 기판이 siRNA 형질도입된 세포의 스팟들을 포함하는 마이크로어레이인, 본 발명의 일 구체예에 따른 이미징 장치의 이미지 획득 장치에 의하여 생산된 스팟 채널의 이미지를 나타낸다.

도 1은 기판 11의 이미지를 생산하기 위한 이미지 획득 장치 10, 분석 장치 12, 프린터 13 및 데이터 베이스 14를 포함하는 본 발명에 따른 이미징 장치 1의 구체예를 나타낸다.

많은 양의 피처들을 포함하는 기판 131이 피처들의 위치에 관계없이 상기 이미지 획득 장치 10에 의하여 스캔되어 상기 기판 11의 단일 이미지 또는 복수의 부분적 이미지들을 생성한다.

예를 들면, 서브세포성 해상력 (sub-cellular resolution)을 사용하여 3888 스팟들을 가진 마이크로어레이를 포함하는 기판 131을 스캔하면 약 5500 개의 그레이 스케일 이미지들, 또는 약 1800개의 rgb-이미지들이 생성된다. 조합으로 이들 이미지들은 상기 마이크로어레이의 전체 표면을 나타낼 수 있다. 상기 기판 11의 이미지들은 상기 분석 장치 12에서 추가적인 처리를 위하여 상기 데이터 베이스 14에 저장된다.

도 1에 나타낸 구체예에 의하면, 상기 분석 장치 12는 먼저 상기 데이터 베이스 14에 접근하고 상기 이미지들의 추가적인 처리가 수행되기 전에 상기 이미지들의 해상도 (resolution)를 감소시킨다 (도 1에서 121 단계). 그러나, 이 단계는 생략될 수 있다. 상기 이미지 획득 장치 10에 의하여 상기 기판 11의 복수 개의 이미지들이 생산되었다면, 상기 분석 장치 12는 상기 이미지들을 배열하고 조합하여 상기 기판 131의 전체 표면의 단일 이미지를 형성한다.

다음 단계에서, 상기 분석 장치 12는 상기 기판 11의 상기 이미지 상의 상기 피처들의 위치에 대하여 그리드 모델을 피팅한다 (도 1의 122 단계). 이하에 더 상세하게 기술된 이 피팅은 피처들의 크기 또는 서로에 대한 상대적 위치와 같은 상기 기판 131 상의 상기 피처들의 토폴로지에 대한 얼마간의 지식을 필요로 한다. 상기 기판 131의 제조 동안에 생성되었거나 당업계의 숙력자에게 알려진 적당한 방법에 의하여 제조 후 결정될 수 있는, 이 정보는 예를 들면, 주석 파일 132에 저장될 수 있다. 종종, 상기 피처들은 규칙적 그리드 (regular grid), 직선 그리드 (rectilinear grid), 카르티전 그리드 (Cartesian grid), 다각형 그리드 (polygonal grid), 육각형 그리드 (hexagonal grid) 등과 같은 패턴에 따라 상기 기판 131 상에 배열된다.

상기 그리드 모델을 피팅한 후 (도 1의 122 단계), 상기 피처들의 이미지들이 상기 피팅된 그리드 모델에 의하여 얻어진 그들의 위치에 대한 정보에 기반하여 추출된다 (도 1의 123 단계). 상기 이미지 크기가 상기 그리드 모델을 피팅하기 전에 축소되었다면, 상기 축소된 이미지들 대신에 상기 원 이미지들 (original images)은 상기 데이터 베이스 14로부터 회수되고 상기 피처 이미지들의 추출을 위하여 사용된다. 상기 피처는 상기 기판 11의 복수 개의 이미지들 상에 위치될 수 있고 그래서 상기 기판 11의 여러 이미지들이 상기 피처의 이미지를 추출하기 위하여 요구될 수 있다는 것은 주목되어야 한다.

다음 단계에서 상기 피처들의 상기 추출된 이미지들은, 아래에 기술되는 바와 같이, 분석된다 (도 1의 124 단계). 본 구체예에서 상기 기판 131은 프린터 13에 의하여 생성되고, 상기 기판 131은 마이크로어레이, 바람직하게는 피막된 혼합물 (encapsulation mixture)을 포함하는 핵산 또는 세포 마이크로어레이를 포함한다. 세포는 뒤이어 상기 마이크로어레이에서 성장할 수 있고, 그에 따라서 각 스팟 위치 상에 핵산에 의하여 형질도입될 수 있다. 상기 프린터 13는 또한 각 스팟의 좌표를 포함하는 주석 파일 132을 생성한다. 그러나, 이 정보는 상기 세포 성장을 포함하는 상기 기판 131의 크기 및 불규칙성 (irregularity)으로 인하여 상기 기판 11의 이미지들을 생성하기 위하여는 사용되지 않는다는 것이 주의되어야 한다. 그러나, 이 정보는 상기 분석 장치 12의 상기 그리드 모델을 피팅하는 단계 122를 위한 초기 그리드 모델을 정의하는데 사용된다.

기판 상의 피처들을 확인하는 전술한 방법은 도 2a-2d에 나타낸 특정한 구체예에 기반하여 설명된다. 기판 상의 피처들의 이미지 201는 단일 이미지 상 또는 배열되고 조합되어 상기 기판의 전체 이미지를 형성하는 복수 개의 이미지들 21 상에 피처들 20을 포함한다 (도 2a). 보통 피처 (20)는 도 2b에 나타낸 바와 같이 이미지 22의 중앙에 정확하게 위치하지 않을 것이고, 다른 위치들 보다 상기 이미지 23의 가장자리들 (edges) 또는 구석들 (corners) 중 하나에 더 가까울 것이고 어떤 경우에는 4개까지의 이웃하는 이미지들 21의 일부분일 수 있다.

도 2c에 나타낸 바와 같이, 피처들의 이미지 201는 초기 그리드 모델 203에 의하여 오버레이된다. 일 구체예에서, 상기 초기 그리드 모델 203은 가장자리들 28에 의하여 연결된 지점들 (points) 25을 포함한다. 상기 초기 그리드 모델 203의 지점들 25 및 가장자리들 28에 의하여 정의된 그들의 이웃 (their neighborhood)은 상기 기판 상의 상기 피처들 20의 위치의 패턴에 기반하고 규칙적 그리드, 직선 그리드, (도 2c에 나타내 바와 같은) 카르티전 그리드, 또는 육각형 그리드와 같은 다각형 그리드와 같은 임의의 적당한 패턴을 포함할 수 있다.

상기 초기 그리드 모델 203은 상기 피처들 20의 위치의 대략적 근사 (rough approximation)에 의하여 피처들의 이미지 201 상에 놓여진다. 상기 근사는 임의의 적당한 기법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 초기 그리드 모델 203의 3개의 구석 지점들 24이 피처들의 전체 이미지 201 상의 피처들 20의 군의 대응되는 구석들에 놓여질 수 있다. 상기 이미지 201 상에 상기 초기 그리드 모델 203을 놓는 것은 손으로 이루어질 수 있다. 그러나, 자동 과정이 또한 사용될 수 있다. 다음으로 상기 초기 그리드 모델 203은 셰어링 (shearing)을 포함한 아핀 변환 (affine transformation)과 같은 적당한 기법에 의하여 변형된다. 상기 그리드 모델 203의 초기 놓여짐 (initial placement) 후, 상기 초기 그리드 모델 203의 지점들 25은 도 2d에 나타낸 바와 같이 상기 피처들 20의 위치에 피팅되어 피팅된 그리드 모델 204을 생성한다. 상기 피팅 과정 후 상기 피팅된 그리드 모델 204의 각 지점 26은 피처 20의 정확한 위치를 나타낸다. 피처들 20이 불결하거나 (corrupted), 또는 누락 (missing)되어 있다 하더라도, 상기 피팅된 그리드 모델 204의 대응되는 지점들 27은 상기 누락 피처들의 가장 그럴듯한 위치를 나타낸다.

상기 초기 그리드 모델 203의 상기 지점들 25을 상기 피처들 20의 위치에 피팅하는 것은 통계적 방법 또는 최적화 방법을 포함한 임의의 적당한 기법에 의하여 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 상기 피팅은 상기 그리드 모델에 결합된 에너지 함수의 결과의 최적화에 의하여 이루어진다.

상기 에너지 함수 (energy functional)는 도 3a-3c에 도시된 바와 같이, 거리 항 301으로서 두 이웃하는 지점들 25 사이의 거리, 수직성 항 302으로서 상기 그리드 모델 203, 204의 수직성 및 곡률 항 303으로서 지점 25의 이웃 (neighborhood)에 있는 피처들 201의 이미지의 특징들을 나타내는 상기 그리드 모델 203, 204의 상기 지점들 25의 3개 항들의 가중된 합계로 최소화되고 정의된다. 상기 가중된 합계의 상기 항들의 가중 인자들은 글로벌 에너지 (global energy) 즉, 에너지 함수의 결과에 대한 각 항의 상대적 유의성 (relative significance)을 정의하기 위하여 사용될 수 있다.

두 지점들 25 사이의 상기 거리 31의 초기 값은 상기 기판 상의 피처들의 내재적 패턴 (underlying pattern)에 의하여 이전에 결정되고 도 3a에 나타낸 바와 같이 그 초기 상태의 가장자리 28의 길이에 의하여 주어진다. 카르티전 그리드에 대하여, 예를 들면, 상기 거리 31는 가장자리 28에 의하여 연결된 지점들 25의 각 쌍에 대하여 동일하다. 상기 에너지 함수의 부분을 정의하는데 사용될 수 있는 대응되는 거리 항 (301)은 두 지점들 25 사이의 거리 31가 상기 초기 값으로부터 더 멀리 벗어날 경우 더 큰 값을 갖는다. 그러므로, 상기 거리 항 301의 최소화는 상기 지점들 25이 서로로부터 상기 초기 값에 가깝게 유지되도록 한다.

상기 그리드 모델 203, 204의 수직성은 도 3b에 도시된 바와 같이 두 이웃하는 지점들 34을 연결하는 두 가장자리 28 사이의 각도 32에 의하여 특징지워진다. 예를 들면, 규칙적 그리드에 대하여, 상기 각도 32의 초기 값은 바람직하게는 90도이다. 그러나, 상기 초기 값은 임의의 값이 될 수 있고 상기 초기 그리드 모델 203에 의하여 정의된다. 상기 에너지 함수의 상기 대응되는 수직성 항 302은 상기 각도 32가 상기 초기 값으로부터 더 멀리 벗어나는 경우 더 큰 값을 갖는다. 상기 거리 항 301과 비슷하게, 수직성 항 302을 최소화하는 것은 상기 지점들 25이 상기 피팅된 규칙적 그리드 모델 204 중의 직사각형 패턴에 가깝게 유지되도록 한다.

본 구체예에서 상기 에너지 함수의 상기 곡률 항 303은 피처들 201의 이미지에 투영된 상기 그리드 모델 203, 204의 지점 25의 이웃 (neighborhood)에 의하여 주어진다. 본 구체예에서 피처들 201의 상기 이미지는 그림 요소들 (픽셀들)의 마트릭스을 포함하고, 여기서 각 픽셀은 적어도 한 색상 값, 예를 들면 그레이 스케일 이미지에 대하여는 하나의 값, 또는 rgb-이미지에 대하여는 3개의 값을 갖는다. 상기 곡률 항 303은 상기 지점 25의 현 위치에 의하여 주어진 이웃에 있는 피처들 201의 상기 이미지의 픽셀들의 색상 값들의 함수이다. 상기 이웃은 임의의 크기 및 모양의 윈도우에 의하여 정의된다. 상기 윈도우는 이미지 처리에서 사용되는 대부분의 회선 기법 (convolution techniaues)에서의 경우와 같이, 직사각형 크기의 것일 수 있다. 본 특정한 구체예에서, 상기 직사각형 윈도우 크기는 도 2c, 2d, 3a, 및 3b에 나타낸 바와 같이, 상기 그리드 모델 203, 204의 상기 지점들 25을 둘러싸는 사각형 (square)으로서 그려진다. 원형 또는 타원형 크기와 같은, 상기 윈도우의 각 크기 및 형태가 대신에 사용될 수 있다는 것은 자명하다. 상기 곡률 항 303은 예를 들면 어떤 지점 25이 피처 20의 위치로부터 멀리 있는 경우 더 큰 값을 갖는 도 3c에 나타낸 계산된 곡률 지도에 기반될 수 있다.

상기 곡률 지도 curv（）는 상기 이미지 Iσ곡률과 원 이미지 Iσ의 지점과 지점 (point by point) 곱으로서 정의된다 (Iσ는 크기 σ의 가우스 커넬 (Gaussian Kernel)에 의하여 이미지 I를 필터링한 결과이다). 상기 함수 curv()는 주어진 크기의 스팟-유사 물체가 강조되는 지도를 생산하는 경향을 갖는다. 어떤 지점에서 2차원 표면의 상기 가우스 곡률은 이 지점에서 헤스 마트릭스 (Hessian matrix)의 행렬식 (determinant)이다 (상기 헤스 마트릭스는 2차 도함수의 마트릭스이다). 이 양의 값은 상기 고려된 지점이 캡 또는 컵을 형성하는 경우에만 높다. 이 지점에서 원 이미지 값에 의하여 곱하여지는 경우, 컵은 그러면 상기 지도 상에 낮은 값을 생산하는 반면 캡은 높은 값을 생산할 것이다. 그러므로, 음의 곡률 항 (negative curvature term) 303을 최소화하는 것은 모든 (모든 위치들에 대한 합계) 지점들 25이 피처들 201의 상기 이미지 상의 상기 피처들 20의 위치를 향하여 움직이도록 한다.

상기 에너지 함수는 E(P)=αF(P)+βG(P)+γH(P)로 주어지고, 여기서 α,β 및 γ는 가중인자이고, P=(P₁ _,1,,P₁ _,2,..., P_n _,m)은 상기 그리드 모델 203, 204의 상기 지점들 25이고, 상기 대응되는 항들은 거리 항 301으로서,

,여기서,

이고, D_interspot은 거리 31의 초기 값이고 d(p,q)는 가장자리 28에 의하여 연결된 두 지점 p와 q 25의 현재 거리 31를 나타내고, 수직성 항 302는

, 여기서

이고, 상기한 곡률 지도에 기반한 곡률 항 303으로서

로서 주어진다.

상기 그리드 모델 204을 피팅한 후, 각 지점 25의 좌표는 도 4a에 나타낸 바와 같이 상기 피처 401의 이미지를 추출하기 위하여 사용된다. 위에서 기술된 바와 같이, 상기 피처 20는 4개까지의 이웃하는 이미지들 21 상에 위치될 수 있다. 특정한 구체예에서, 이것은 축소된 해상의 상기 이미지 상에 상기 그리드 모델 204을 피팅하는 것으로부터의 좌표를 사용하는 이웃하는 고해상 이미지들로부터 생성된 고해상 복합 스팟 이미지 (high resolution composite spot image)일 수 있다.

도 4b는 누락 스팟 검출 27을 보이는 큰 마이크로어레이상의 피팅된 그리드 모델 204 및 삽도 (inset)에 나타낸 바와 같은, 적색 siRNA 스팟 이미지 상으로의 그리드 오버레이를 포함하는 특정한 구체예의 결과를 나타낸다. 프린트되지 않은 스팟들은 다음의 방식으로 자동으로 검출되고 추가 분석으로부터 제외될 수 있다. 상기 피팅된 그리드 모델 204의 상기 지점들 25에 의하여 주어진 각 스팟의 이론적 위치에서 상기 이웃은 맞게 프린트된 스팟에 대하여 상대적으로 강한 스팟 강도 및 곡률을 갖는 그림 (picture)을 나타내야 한다. 그러므로, 상기 어레이 상의 정상 분포 보다 더 낮은 강도 및 곡률을 보이는 그림은 프린트되지 않은 스팟으로 여겨지고 제거된다.

siRNA 스팟들을 포함하는 마이크로어레이로부터 유래된 이미지들이 사용될 수 있다. 상기 스팟 채널로부터 유래된 그러한 이미지의 예가 도 5에 주어진다. 상기 이미지는 4개 스팟들 50, 51을 포함하며, 그들 중 하나는 상기 이미지 50 상에 온전하게 있고 그들 중 3개는 단지 부분적으로만 볼 수 있는 것 51 이다.

상기 그리드 모델 204이 일단 피팅되고 상기 피처 이미지들 401이 하나씩 자동으로 추출되면, 상기 이미지들은 추가 알고리듬에 의하여 분석될 수 있다. 이것은 이미지 당 단일 중심 피처 (single centered feature)를 각각 갖는 주석달린 이미지들 (annotated images)의 흐름을 생성한다. 본 발명의 일 구체예에서 개시된 바와 같은 마이크로어레이 상의 스팟들의 분석을 위하여, 이 적용 분야에서 대부분의 이미지 분석 알고리듬은 단일 스팟 상에 위치하는 세포를 분석하기 위하여 특이적으로 설계되었기 때문에, 이 타입의 이미지는 유리하다.

본 발명의 상기 기술된 피처들 및 특징들은 임의의 조합으로 본 발명에 대하여 중요할 수 있다.

1 이미징 장치 도 1
10 이미지 획득 장치
11 기판의 이미지
12 분석 장치
121 이미지 해상을 축소하는 단계
122 그리드 모델을 피팅하는 단계
123 피처들의 이미지를 추출하는 단계
124 피처들의 추출된 이미지를 분석하는 단계
13 프린터
131 기판
132 주석 파일들
14 데이터 베이스
201 피처들의 이미지 도 2
20 피처
21 이미지
202 이피지 상의 피처들의 위치
22 중심에 피처를 갖는 이미지
23 복수의 피처들을 갖는 이미지
203 초기 그리드 모델
24 구석 지점
25 지점
28 모서리
204 피팅된 그리드 모델
26 피처에 피팅된 지점
27 누락된 피처 (missing feature)에 피팅된 지점
301 거리 항 도 3
31 거리
302 수직성 항
32 각도
33 지점
34 이웃하는 지점
303 곡률 항
401 피처의 추출된 이미지 도 4
402 피팅된 그리드 모델
5 스팟들을 포함하는 마이크로어레이의 부분적 이미지 도 5
50 스팟
51 부분적 스팟

Claims

기판상의 피처들 (20)을 이미지화하기 위한 방법으로서,
- 상기 기판을 스캔하고 그 이미지 (21)를 생산하는 단계;
- 상기 이미지 (21)상에 그리드 모델 (203)을 오버레이하는 단계;
- 상기 그리드 모델 (204)을 상기 이미지 (21)상의 상기 피처들 (20)의 적어도 일부의 위치에 피팅하는(fitting) 단계; 및
- 상기 피처들 (20)의 이미지를 추출하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 그리드 모델 (203)은 상기 기판상의 상기 피처들 (20)의 상기 위치의 패턴에 기반한 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 그리드 모델 (203)은 규칙적 그리드 (regular grid), 직선 그리드(rectilinear grid), 카르티전 그리드(Cartesian grid), 다각형 그리드 및 육각형 그리드를 포함하는 그리드 군에 기반한 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 한 항에 있어서, 상기 오버레이하는 단계는 대략적 근사 (rough approximation)에 의하여 상기 기판상의 상기 피처들 (20)의 일부의 위치를 결정하는 단계 및 상기 그리드 모델 (203)의 지점들 (points)(25)의 일부를 상기 위치에 오버레이하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 한 항에 있어서, 상기 이미지 (21)의 크기는 그리드 모델 (203)의 상기 피팅 전에 축소되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 한 항에 있어서, 상기 이미지 (21)는 상기 그리드 모델 (203)의 상기 피팅 전에 처리되고 필터의 적용, 평활화 (smoothing), 가장자리 강화 (edge enhancement), 및 색상 순응화 (color adaptation) 중 하나이상을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 한 항에 있어서, 상기 피팅은 상기 그리드 모델 (203)의 에너지 함수 (energy functional)의 결과의 반복적 최적화를 포함하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 에너지 함수의 결과는 다음 식으로서 정의되고,
E(P)=αF(P)+βG(P)+γH(P)
식 중 α,β 및 γ는 가중인자 (weight factor)이고, F(P)는 상기 그리드 모델 (203)의 이웃하는 지점들 (25) 사이의 거리 (31)에 의하여 결정되는 거리 항 (301)이고, G(P)는 상기 그리드 모델 (203)의 수직성 항 (302)이고, H(P)는 상기 그리드 모델 (203)의 상기 지점들 (25)의 상기 이미지 (21)의 곡률 지도 (curvature map)로부터 계산된 상기 피처들 (20)의 상기 위치들로부터의 벗어남에 의하여 결정되는 곡률 항 (303)이며, 상기 대응되는 항들은 아래와 같이 주어진 것인 방법:

,
여기서,
이고

, 여기서
이고,

.
제1항 내지 제8항 중 한 항에 있어서, 상기 그리드 모델 (203)을 상기 피처 들(20)의 적어도 일부의 상기 위치에 피팅하는 것은 상기 피처들 (20)의 중앙에 상기 그리드 모델 (203)의 지점들(25)을 피팅하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제9항 중 한 항에 있어서, 상기 피처들 (20)은 상기 마이크로어레이 상의 스팟들인 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 마이크로어레이는 siRNA 형질도입된 세포의 성장 결과를 포함하는 것인 방법.
이미징 장치 (1)로서, 피처들의 기판 (131)을 스캔하고 그들의 적어도 부분적 이미지 (11)를 생산하는 이미지 획득 장치 (10); 및
상기 이미지 (11)상에 상기 그리드 모델을 오버레이하고; 상기 피처들의 적어도 일부의 위치에 상기 그리드 모델을 피팅 (122)하고; 및 상기 피처들의 이미지를 추출 (123)하는 상기 이미지 (11) 상의 피처들의 위치를 확인하기 위한 분석 장치 (12);를 포함하는 이미징 장치.
제12항에 있어서, 상기 기판 (131)상의 상기 피처들은 패턴에 따라 배열되어 있고, 상기 패턴은 규칙적 그리드, 직선 그리드, 카르티전 그리드, 다각형 그리드 및 육각형 그리드를 포함하는 그리드 군인 것인 장치.
제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 기판 (131)은 스팟들을 포함하는 마이크로어레이이고 상기 이미지 획득 장치 (10)는 서브세포성 해상 (subcellular resolution)을 가진 이미지 (11)를 생산하는 것인 장치.
제14항에 있어서, 상기 기판 (131)상의 상기 피처들을 생성하기 위한 프린터 (13), 및 상기 피처들의 위치를 포함하는 주석 파일 (annotation files)(132)을 더 포함하는 장치.
제15항에 있어서, 상기 프린터 (13)는 스팟들을 생성하고, 각 스팟 상에, 라이브러리로부터의 핵산 또는 라이브러리로부터의 화합물이 적용되고, 상기 라이브러리는 RNAi 라이브러리, siRNA 라이브러리, 또는 화합물 라이브러리/cDNA 라이브러리를 포함하고, 상기 마이크로어레이는 전체 라이브러리, 서브세트 또는 그들의 임의의 조합을 나타내는 것인 장치.