KR20110045303A

KR20110045303A - 클로로퀸 또는 바필로마이신과 항암제를 포함하는 항암제 조성물

Info

Publication number: KR20110045303A
Application number: KR1020090101812A
Authority: KR
Inventors: 조재용
Original assignee: 조재용
Priority date: 2009-10-26
Filing date: 2009-10-26
Publication date: 2011-05-04

Abstract

본 발명은 클로로퀸 및/또는 바필로마이신, 항암제, 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다. 상기 항암제 조성물은 자가포식작용 억제 화합물인 클로로퀸 및/또는 바필로마이신을 항암제와 병용함으로써 암종의 항암제 저항성을 개선하고 항암제의 활성을 강화시키는 효과를 제공한다.

자가포식작용, 클로로퀸, 바필로마이신, 항암제, 병용

Description

클로로퀸 또는 바필로마이신과 항암제를 포함하는 항암제 조성물{Anticancer agent composition containing chloroquine or bafilomycin, and anticancer agent}

본 발명은 클로로퀸 또는 바필로마이신과 항암제를 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

종양세포가 항암제에 저항성을 보이는 기전은 다양하게 알려져 있다. 그 중에서 최근에 새로이 알려지고 있는 것이 자가포식(Autophagy)이다. 자가포식은 단세포인 효모에서부터 곰팡이, 척추동물에 이르기까지 전 생물체를 통하여 나타나는 작용이다 (Kelekar, Autophagy 2008, 4:555-556). 자가포식은 세포수준에서 리소좀(lysosome)을 이용하여 세포 자신의 구성성분을 분해하는 이화작용으로, 정상세포에서는 세포산물의 합성과 분해, 재활용간의 균형을 유지하는 것을 도움으로써 세포의 성장, 발달, 항상성 유지의 역할을 수행하며 이는 철저하게 조절되고 있는 작용이다. 산소나 영양이 결핍되어 있거나 스트레스 상황하에 있는 세포에서 자가포식은 불필요한 부분에 사용되는 영양분을 좀 더 필수적인 세포 작용으로 재분배하는 주요 기전이기도 하다(Mortimore et al., Annu Rev Nutr 1987, 7:539-564; Klionsky et al., Science 2000, 290:1717-1721; Kondo et al., Nat rev Cancer 2005, 5:726-734; Maiuri et al., Nat Rev Mol Cell Biol 2007, 8:741-752; Jin et al., Autophagy 2007, 3:28-31).

항암제라는 외부의 스트레스가 존재하면 종양세포는 생존을 위해서 자가포식 작용을 하게 되고 항암제에 견디는 성질을 갖게 되어 항암제의 효과가 감소하는 양상을 보이는 경우가 있다(Carew et al., Autophagy 2007, 3:464-467). 반면 자가포식이 종양세포에서는 감소되어 있으며 세포고사(apoptosis)의 감소와 더불어 종양의 발생과 관련이 있다는 보고도 있어(Aits et al., Int J Cancer 2009, 124:1008-1019), 자가포식은 종양세포의 생존에 있어 양면적인 성질을 보인다(Gozuacik et al., Oncogene 2004, 23:2891-2906; Hippert et al., Cancer Res 2006, 66:9349-9351).

어떠한 종양과 어떠한 항암제의 경우에 자가포식작용이 종양의 사멸에 중요한 역할을 하는 지에 대해서는 아직 확실히 알려진 바가 없기 때문에, 각 작용과 그 기전에 대한 연구가 필요한 실정이다 (Apel et al., Cancer Res 2008, 68:1485-1494).

현재까지 종양세포에서 자가포식작용을 유발하는 항암약물로 알려져 있는 것으로는 자궁경부암에서 보리노스탯(vorinostat), 에토포사이드(Etoposide), 백혈병과 위장관기저종양에서의 이마티닙 메실레이트(Imatinib mesylate), 유방암에서 타목시펜(Tamoxifen), 악성 신경아교종에서의 테모졸로마이드(Temozolomide)와 라파마이신(Rapamycin), 난소암에서 레스베라트롤(Resveratrol) 등이 있다(Lee et al., DNA Cell Biol 2007, 26:713-720; Shingu et al, Int J Cancer 2009, 124:1060-1071; Shao et al., PNAS 2004, 101:18030-18035; Bursch et al., Carcinogenesis 1996, 17:1595-1607; Kanzawa et al., Cell death Differ 2004, 11:448-457; Takeuchi et al., Cancer Res 2005, 65:3336-3346; Opipari et al., Cancer Res 2004, 64:696-703).

한편, 자가포식작용을 억제하는 것으로 알려진 약물로는 클로로퀸, 바필로마이신, RTA 203, 모넨신(Monensin), 3-MA 등이 있다(Kroemer et al., Nat Rev Cancer 2005, 5:886-897).

클로로퀸은 항말라리아 약물로 사용되는 것으로, 탄자니아에서는 말라리아 발생을 예방하기 위해 클로로퀸을 예방적으로 복용했던 사람들의 경우에 버킷림프종(Burkitt Lymphoma)의 발생이 감소했다는 보고가 있으며(Geser et al., Am J Epidemiol 1989, 129:740-752), 그 기전은 림프종의 발생에 역할을 하는 종양유전자인 c-MYC 유전자가 자가포식을 통해 림프종을 형성하는 과정을 차단하기 때문으로 알려졌다(Maclean et al., J Clin Invest 2008, 118:79-88; Amaravadi et al., J Clin Invest 2007, 117:326-336). 위암에서의 연구는 아직 보고된 바 없다.

바필로마이신은 마크로라이드(macrolide)계의 항생제로, H⁺-ATPase의 저해제이다. 또한 항생, 항곰팡이, 항암, 면역억제 등의 작용이 있는 것으로 알려져 있으며, 다약제 내성을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 바필로마이신의 항종양 효과는 여러 논문에서 발표되고 있다(Wu et al., Biochem Biophys Res Commun 2009, 382:451-456). 위암에 관해서도 약제 단독의 효과가 연구된 바 있다(Nakashima et al., J Biochem 2003, 134:359-364), 그러나, 기존의 항암제와의 병용에 관한 연구는 아직 보고된 바 없다.

본 발명은 자가포식작용 억제 화합물과 항암제의 병용에 의해 암종의 항암제 저항성이 개선되고 항암제 활성이 강화되는 항암제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 하기 화학식1로 표시되는 화합물 및 하기 화학식2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 1종 이상; 항암제; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암제 조성물을 제공한다:

[화학식1]

[화학식2]

본 발명의 항암제 조성물은 자가포식작용 억제 화합물인 클로로퀸 및/또는 바필로마이신을 항암제와 병용함으로써 암종의 항암제 저항성을 개선하고 항암제의 활성을 강화시키는 효과를 제공한다. 따라서, 본 발명의 항암제 조성물을 사용하면 적은량의 항암제를 사용하여 항암제 독성을 줄이면서도 치료효과는 상승시키는 효과를 얻을 수 있다.

본 발명은 하기 화학식1로 표시되는 화합물 및 하기 화학식2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 1종 이상; 항암제; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암제 조성물에 관한 것이다:

[화학식1]

[화학식2]

상기에서 화학식1의 화합물은 클로로퀸이고, 화학식2의 화합물은 바필로마이신이며, 이 화합물들은 모두 자가포식작용을 억제하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 항암제 조성물에 포함될 수 있는 대표적인 항암제로는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(Doxorubicin), 보리노스탯(Vorinostat) 등을 들 수 있으며, 이 밖에 시클로포스파미드 (cyclophosphamide), 이리노테칸 (irinotecan), 도세탁셀 (docetaxel), 젬시타빈 (gemcitabine), 옥살리플라틴 (oxaliplatin), 에토포사이드(etoposide) 등의 항암제도 병용할 수 있다.

본 발명의 항암제 조성물은 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종 또는 신장골반 암종 등에 대한 예방 및 치료의 목적으로 사용될 수 있다.

특히, 본 발명의 항암제 조성물은 위암의 예방 및 치료에 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명의 항암제 조성물에 포함되는 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 부형제 및 희석제를 포함하는 개념이며, 이 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등을 들 수 있다.

본 발명의 항암제 조성물에서 화학식1로 표시되는 화합물 및 화학식2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 1종 이상과 항암제는 조성물 총 중량에 대하여 0.1~50중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 항암제 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화될 수 있다.

본 발명의 항암제 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 항암제 조성물에 포함되는 화학식1로 표시되는 화합물 및 화학식2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 1종 이상은 1일 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg으로 투여되도록 하는 것이 좋으며, 항암제는 1일 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg으로 투여되도록 하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 항암제 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 기존에 알려진 투여의 모든 방식이 적용될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하에서, 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기의 실험예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 하기의 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실험예1: 클로로퀸과 바필로마이신의 세포독성

화학식1의 화합물인 클로로퀸(Sigma 사)과 화학식2의 화합물인 바필로마이신의 위암세포주에 대한 단독 세포독성을 알아보기 위해 MTT 검사를 시행하였다. 세포주는 AGS, KATO-III, NCI-N87 3가지를 사용하였다. 모든 세포는 10% 열 불활성 FBS(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 배지를 사용하여 37℃에서 5% CO₂ 환경에서 배양하였다. 클로로퀸과 바필로마이신 사용 농도는 기존에 발표된 연구를 참고하여 결정하였다(Rossi et al., Anticancer Res 2007, 27:2555-2559; Nakashima et al., J Biochem 2003, 134:359-364). 즉, 클로로퀸은 25 μM, 50 μM, 바필로마이신은 25 nM 을 사용하였다.

96-well 세포배양판에 테스트 세포를 심고 1일 후, 클로로퀸과 바필로마이신을 처리하고 72시간 후에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma) 검사(Pieters et al., Cancer Lett 1998, 41:323-332)를 시행하여 세포 성장의 억제 정도를 확인하였다. 더욱, 상세하게 설명하면, 완충용액(Phosphate buffered saline;PBS)에 녹여 5mg/mL로 만든 MTT를 96-well 세포배양판에 20 μL씩 처리하고, 배양기에 두고 3시간이 지난 후 세포 배양액을 모두 제거하였다. 배양판에 침착된 포르마잔은 세포의 대사활성도를 나타내는데, 여기에 디메틸술폭시드(Dimethyl Sulfoxide; DMSO) 100 μL를 첨가하여 포르마잔을 용해시켜 흡광광도계로 570nm의 파장을 측정하여 세포의 활성도를 측정하였다. 각 실험은 최소 3회를 시행하였다. 세포독성은 클로로퀸과 바필로마이신을 처리하지 않고 약물 처리군과 같은 양의 디메틸술폭시드를 처리한 비교군에 대한 세포 성장 백분율로 확인하였다.

그 결과 클로로퀸 25 μM 이 KATO-III에서 효과를 보이지 않은 것을 제외하고는, 바필로마이신 25 nM, 클로로퀸 25 μM, 50 μM 모두 단독으로도 세 가지 위암 세포주에 세포 성장 억제 효과를 보이는 것으로 확인되었다(표 1). 이는 본 약제들이 단독으로도 항암작용이 있을 수 있음을 나타낸다. 클로로퀸 25 μM과 50 μM은 통계학적으로 의미있는 효과의 차이를 보이진 않았다.

세포주	바필로마이신 25nM	클로로퀸 25 μM	클로로퀸 50 μM
AGS	26.64 ± 4.6	70.97 ± 6.8	69.75 ± 8.6
KATO-III	46.78 ± 4.8	104.68 ± 8.4	76.90 ± 8.4
NCI-N87	66.40 ± 8.7	59.67 ± 8.06	53.71 ± 5.4

*상기 표의 각 값은 세포 성장 백분율± 표준 편차(%)를 나타냄.

실험예2: 클로로퀸과 항암제 병용시의 항종양 효과

화학식1의 화합물인 클로로퀸(Sigma사)의 위암세포주에 대한 항암제 병용시의 항종양 효과를 알아보기 위해 MTT 검사를 시행하였다. 세포주는 AGS, KATO-III, NCI-N87 3가지를 사용하였다. 모든 세포는 10% 열 불활성 FBS(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 배지를 사용하여 37℃에서 5% CO₂ 환경에서 배양하였다.

클로로퀸의 농도에 따른 효과의 차이를 확인하기 위해 25 μM, 50 μM 두 가지 농도를 사용하였고, 병용 항암제로는 플루오로우라실(5-fluorouracil) 100 μM, 시스플라틴(cisplatin) 100 μM, 파크리탁셀(paclitaxel) 10 nM, 독소루비신(doxorubicin) 1 μM, 보리노스탯(vorinostat, Merck 사) 5 μM을 사용하였다. 모든 항암제는 디메틸술폭시드에 용해시켰으며 클로로퀸은 증류수에 용해하여 사용하였다. 각 실험은 최소 3회 이상을 시행하여 평균값을 구하였으며, 항암제만 투여한 경우와 비교하여 클로로퀸을 병용한 경우의 효과를 t-test를 시행하여 평가하였다.

상기 실험결과 결과, 상기 세가지 세포주에서 대체적으로 항암제를 단독 투여하는 경우보다 클로로퀸을 병용할 경우에 세포 성장의 억제 효과가 더 큰 것으로 나타났다(표 2). 구체적으로, 플루오로우라실과의 병용효과는 AGS에서 통계학적으로 의미 있게 나왔으며, 시스플라틴과의 병용효과는 NCI-N87 세포주에서 가장 크게 나타났다(P<0.01). 파클리탁셀, 독소루비신, 보리노스탯과 병용한 경우에는 클로로퀸의 농도에 상관없이 모든 세포주에서 의미 있게 세포성장 억제효과가 증가하였다(도2 참조). 통계학적으로 의미있는 효과를 보인 경우는 클로로퀸을 병용하면 항암제만 사용한 경우에 비하여 추가적인 효과가 있음을 의미한다.

항암제		플루오로우라실 (100 μM)		시스플라틴 (100 μM)		파클리탁셀 (10 nM)		독소루비신 (1 μM)		보리노스탯 (5 μM)
클로로퀸		25 μM	50 μM	25 μM	50 μM	25 μM	25 μM	25 μM	50 μM	25 μM	50 μM
세포주	AGS	0.219	0.004	0.221	0.048	0.048	**	**	**	0.048	0.003
	KATO-III	0.490	0.425	N/A	**	**	**	**	**	**	**
	NCI-N87	0.273	0.124	**	0.010	0.010	**	0.011	0.002	0.010	**

*상기 표의 각 값은 항암제만 투여한 경우에 비교하여 클로로퀸을 병용한 경우의 세포 독성효과의 차이를 t-test 를 시행하여 구한 P 값으로 나타낸 것임.

**: P < 0.001

N/A: 클로로퀸의 투여가 세포성장 억제에 영향을 미치지 않음.

실험예3: 바필로마이신과 항암제 병용시의 항종양 효과

화학식2의 화합물인 바필로마이신의 위암세포주에 대한 항암제 병용시의 항종양 효과를 알아보기 위해 MTT 검사를 시행하였다. 시행방법은 상기 실험예2와 같으며, 바필로마이신은 디메틸술폭시드에 용해시켜 25 nM의 농도로 사용하였다.

상기 실험결과 세가지 세포주에서 모두 항암제를 단독 투여하는 경우보다 바필로마이신을 병용할 경우에 세포 성장의 억제 효과가 더 큰 것으로 통계학적으로 확인되었다(표3, 도3 참조).

항암제		플루오로우라실(100 μM)	시스플라틴 (100 μM)	파클리탁셀 (10 nM)	독소루비신 (1 μM)	보리노스탯 (5 μM)
바필로마이신		25 nM	25 nM	25 nM	25 nM	25 nM
세포주	AGS	**	**	0.004	0.005	**
	KATO-III	0.027	0.023	**	0.001	**
	NCI-N87	**	**	0.001	**	**

*상기 표의 각 값은 항암제만 투여한 경우에 비교하여 바필로마이신을 병용한 경우의 세포 독성효과의 차이를 t-test 를 시행하여 구한 P 값으로 나타낸 것임.

** P < 0.001

상기에서 실험예에서 살펴본 바와 같이, 각각 화학식 1 및 2 로 표시되는 화합물인 클로로퀸 및 바필로마이신은 항암약물에 대한 저항성을 일으키게 하는 기전인 자가포식을 억제함으로써 항암제 저항을 개선하고 항암제의 활성을 증가시킨다.

도 1은 위암 세포주 AGS, KATO-III, NCI-N87에서 클로로퀸(화학식 1)과 항암제의 병용시 세포독성 효과를 나타낸 그래프이다[CQ: 클로로퀸, A: 플루오로우라실, B: 시스플라틴, C: 파클리탁셀, D: 독소루비신, E: 보리노스탯, ★: 통계학적으로 유의함(P 값 < 0.05)].

도2는 위암 세포주 AGS, KATO-III, NCI-N87에서 바필로마이신(화학식2)과 항암제의 병용시 세포독성 효과를 나타낸 그래프이다[BM: 바필로마이신, A: 플루오로우라실, B: 시스플라틴, C: 파클리탁셀, D: 독소루비신, E: 보리노스탯, ★: 통계학적으로 유의함(P 값 < 0.05)].

Claims

하기 화학식1로 표시되는 화합물 및 하기 화학식2로 표시되는 화합물 중에서 선택되는 1종 이상; 항암제; 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암제 조성물:

[화학식1]

[화학식2]
청구항 1에 있어서, 상기 항암제는 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 시스플라틴(cisplatin), 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(Doxorubicin), 보리노스탯(Vorinostat), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이리노테칸(irinotecan), 도세탁셀(docetaxel), 젬시타빈(gemcitabine), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 및 에토포사이드(etoposide)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것임을 특징으 로 하는 항암제 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 암질환이 자궁경부암, 폐암, 췌장암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종 또는 신장골반 암종인 것을 특징으로 하는 항암제 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 암질환이 위암인 것을 특징으로 하는 항암제 조성물.