KR20110041316A

KR20110041316A - 이미다조퓨린 유도체를 포함하는 ＴＧＦ-β 활성 저해용 조성물

Info

Publication number: KR20110041316A
Application number: KR1020090098416A
Authority: KR
Inventors: 송지영; 윤연숙; 안지연; 정인성; 엄홍덕; 박세라; 임민진; 김미형; 이새로움
Original assignee: 재단법인 한국원자력의학원
Priority date: 2009-10-15
Filing date: 2009-10-15
Publication date: 2011-04-21
Also published as: KR101086456B1; EP2488183A4; WO2011046381A3; WO2011046381A2; EP2488183B1; EP2488183A2

Abstract

본 발명은 이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 TGF-β(transforming growth factor-β) 활성 저해용 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

이미다조퓨린, 항암, 항섬유증, 항염증, TGF-β.

Description

이미다조퓨린 유도체를 포함하는 ＴＧＦ-β 활성 저해용 조성물{Composition for inhibiting TGF-β comprising imidazopurine derivatives}

본 발명은 교육과학기술부의 정부출연사업의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다.

[과제명: 방사선치료조절제 개발을 위한 화학유전체 시스템 구축]

TGF-β는 세포의 성장, 사멸, 분화, 면역, 전이 또는 세포외 기질 축적과 같은 다수의 세포생물학적 과정을 조절하는 다기능 사이토카인(cytokine)으로 거의 모든 세포에서 발현된다. TGF-β가 과발현되면 세포외 기질(Extracellular matrix, ECM)이 과도하게 축적되어 기관에서 섬유화/경화 (fibrosis/sclerosis)현상이 촉진되며, 섬유화/경화가 관련된 대부분의 질병, 예를 들어 당뇨병성 신장애, 간, 폐, 이자 등의 섬유증에서 TGF-β의 과다한 발현이 보고되었다(유럽공개특허 EP 0998936A1; Pancreas, 2005, 30(3), e71-9).

또한, TGF-β는 종양의 초기 단계에는 종양억제인자로 작용하나, 이후에는 종양유발인자로 작용한다. TGF-β는 종양으로부터 과도하게 생성되며, 직접적으로초기면역반응을 담당하는 NK(natural killer) 세포나 대식 세포를 억제함과 동시에 종양의 항원제시능력을 감소시킴으로써 T임파구의 활성을 저해하여 종양의 성장이나 침윤, 전이를 촉진한다고 잘 알려져 있다. 또한, TGF-β는 VEGF(vascular edothelial growth factor) 생성을 상향 조절함으로써 간접적으로 혈관형성에도 관여하는 것으로 보고되었다(Am. J. Respir Crit Care Med. 2002, 165, 88-94; Cancer Res. 2003, 63, 1083-1092). 따라서, TGF-β는 혈관신생, 면역억제 활성에 의해 종양의 성장이나 침윤, 전이 등을 촉진시킬 수 있다. 유방암 이식 생쥐모델에서 방사선조사나 독소루비신과 같은 항암제 처리시 TGF-β가 현저히 증가되었으며 폐로의 전이가 증가하고 항 TGF-β항체 투여시 이러한 현상이 감소함으로써 항암제나 방사선 병용치료시 TGF-β의 생성이나 활성을 억제하는 것이 효과적이라는 것이 입증되었다(J Clin Invest. 1993, 92, 2569-2576; Curr. cancer Drug targets 2006, 75, 565-578). 특히, 최근 연구결과에 따르면 TGF-β 억제가 방사선, 항암제, 자외선, 활성산소 등과 같은 각종 자극에 의해 발생된 염색체 이중 절단을 수선하는 ATM(ataxia telangientasia-mutated gene)을 억제함으로써 종양 세포의 감수성을 증가시킬 수 있다는 보고가 있으므로 (Kirshner J. et al. Cancer Research, 2006, 66(22), 10861-10869) TGF-β 활성 저해제를 방사선이나 항암제와 병용 투여시에 그 치료효율을 상승시킬 수 있을 것으로 생각된다.

TGF-β의 활성저해제는 TGF-β 과발현에 의한 섬유증, 간경변, 크론씨병, 피 부경화증, 심근증, 류마티스성 관절염, 만성 이식편대 숙주병 또는 암과 같은 질병의 치료에 효과를 갖는 것으로 보고되었다. 예를 들어 TGF-β에 대한 항체는 사구체 신염(Nature, 1990, 346, 371-374) 신경이나 피부의 상흔형성(Eur. J. Neurosci. 1994, 6, 355-363; Lancet, 1992, 339, 213-214), 폐 섬유화 (Thorax 1993, 48, 959-966), 방사선 유발 섬유화(미국특허 제 5,616,561호), 골수 섬유증, 화상, 뒤퓌트렌 구축(Dupuytren's contracture), 위궤양, 류마티스성 관절염(J. Exp. Medicine, 1993, 177, 225-230)의 치료에 유효하다. 따라서 다양한 질병의 발병 기전에서 중요한 역할을 담당하는 TGF-β의 반응을 조절할 수 있는 약제의 개발이 끊임없이 요구되고 있다. 이에 본 발명자들은 TGF-β의 활성을 저해함으로써 항염증, 항섬유증, 항암 보조효과를 나타내는 물질을 발굴하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 TGF-β 활성을 저해하는 이미다조퓨린 유도체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 TGF-β 활성을 저해하는 이미다조퓨린 유도체를 포함하는 암, 염증 또는 섬유증의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 TGF-β 활성을 저해하는 이미다조퓨린 유도체를 포함하는, 항암제의 활성 증강용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은

하기 화학식 A의 이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, TGF-β 활성 저해용 조성물을 제공하며,

화학식 A

상기에서,

X, Y, 및 Z는 각각 독립적으로 수소, 또는 할로를 나타내고,

R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, C₁-C₄ 알킬, 또는, 히드록시, 할로, C₁-C₄ 알킬, 및 C₁-C₄ 할로알킬로 구성된 군으로부터 선택된 치환기에 의해 선택적으로 치환된 C₁-C₄알킬을 나타내며,

할로는 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도이다.

TGF-β는 염증 및 섬유증을 매개하며, 종양에서 종양유발인자로 작용하는 다기능 사이토카인이다. 따라서, TGF-β 활성을 저해하는 작용제는 항암, 항염증 및 항섬유증 효과를 통해 다양한 질환의 예방 또는 치료를 위해 이용될 수 있다. TGF-β에 의해 섬유화가 진행된 세포에 상기 화학식 A의 화합물을 처리하는 경우 섬유화가 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 염증이 유발된 세포에 상기 화학식 A의 화합물을 처리하는 경우, 염증성 사이토카인의 유의성있는 감소가 관찰되었다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온 화합물은 하기 화학식 I의 3-(2-클로로벤질)-1,7-디메틸-1H-이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온일 수 있다.

화학식 I

본 발명의 일 구체예에서, 상기 이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온 화합 물은 하기 화학식 II의 3-(2-클로로-6-플루오로벤질)-1,6,7-트리메틸-1H-이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온일 수 있다.

화학식 II

본 발명의 일 구체예에 따른 조성물은 TGF-β의 과발현과 관련된 각종 장기의 섬유증이나 경변증, 다발성 경화증, 심근증, 크론씨병, 피부경화증, 사구체신염, 수술 후 유착, 켈로이드 및 비후성 상흔형성, 증식성 유리체망막증, 각막손상, 만성 이식편대 숙주병, 혈관신생, 종양, 화상, 및 류마티스성 관절염을 포함하나, 이에 한정되지 않는, TGF-β의 과발현과 관련된 질병의 예방 및 치료를 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 암, 염증 또는 섬유증의 예방 또는 치료를 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 섬유증은 폐, 간, 신장 또는 췌장의 섬유증일 수 있다.

본 발명은 또한,

하기 화학식 A의 이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 항암제 보조용 조성물을 제공하고,

화학식 A

상기에서,

X, Y, 및 Z는 각각 독립적으로 수소, 또는 할로를 나타내고,

할로는 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도이다.

TGF-β 활성의 저해는 방사선을 포함한 항암제에 대한 암세포의 감수성을 증가시키는 것으로 확인되었다. 방사선 치료나 독소루비신과 같은 항암제의 투여 전에 상기 화학식 A의 화합물을 투여하면 항암 효과, 즉, 암세포의 사멸효과가 증강되었다.

본 명세서에서 사용된 용어 "C₁-C₄알킬"은 직쇄형 및 분지형 C₁-C₄알킬을 의미하며, 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, sec-부틸, 및 이들의 이성질체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "C₁-C₄할로알킬"은 상기 정의한 바와 같은 직쇄형 및 분지형 알킬에서 하나 이상의 수소가 동일한 방식으로 또는 상이하게 할로겐으로 치환된 것을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, C₁-C₄할로알킬은 예컨대, 클로로메틸, 플루오로프로필, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리클로로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 펜타플루오로에틸, 브로모부틸, 트리플루오로메틸, 요오도에틸, 및 이들의 이성질체이다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항암제 보조용 조성물"은 항암제와 병용 투여시 항암제에 대한 암세포의 감수성을 증가시켜 항암제의 효과를 상승적으로 증가시키는 조성물을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "항암제"는 암세포의 증식을 저해하거나 암세포를 사멸시키는 작용제를 의미하며, 감마선과 같은 방사선, 시스플라틴, 독소루비신, 빈블라스틴 등과 같은 화학요법제를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 항암제는 방사선, 시스플라틴, 독소루비신, 빈블라스틴, 플로오로우라실, 이리노테칸, 파클리탁셀, 비노렐빈, 및 젬시타빈으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

화학식 I

본 발명의 일 구체예에서, 상기 이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온 화합물은 하기 화학식 II의 3-(2-클로로-6-플루오로벤질)-1,6,7-트리메틸-1H-이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온일 수 있다.

화학식 II

이하, 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명을 한정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 발명의 조성물은 TGF-β 활성을 저해하여, 암, 염증 또는 섬유증을 포함한, TGF-β 과발현에 의해 유발되는 질병을 예방 또는 치료할 수 있고, 항암제에 대한 암세포의 감수성을 증가시켜 항암 효과를 증진시킬 수 있다.

실시예 1. TGF-β-활성 저해제의 탐색

TGF-β 활성을 저해하는 작용제를 탐색하기 위해 TGF-β 활성에 대한 효과를 측정할 수 있는 루시퍼라아제 발현 플라스미드에 의해 안정적으로 형질전환된 세포를 이용하였다.

TGF-β 활성에서 중요한 역할을 수행하는 Smad 결합 부위와 혈소판 활성저해인자 (platelet activator inhibitor, PAI) 프로모터 부위를 갖는 플라스미드를 미국, Vanderbilt 대학의 Carlos Arteaga 교수로부터 공여받아 pGL2-널 리포터 플라스미드(Promega, U.S.A.)에 삽입하였다. 도 1은 Smad 결합 부위인 TRE(TGF-βResponse Element), PAI-1 프로모터 및 루시퍼라아제 유전자를 포함하는 3TP-pGL2 플라스미드의 개략적 구조를 보여준다. 리포펙타민 2000(Invitrogen, Calsbad, CA, USA)을 이용하여, 제조사의 설명서에 따라 상기 플라스미드를 HEK(Human Embryonic Kidney) 293 세포에 형질전환시켜 루시퍼라아제의 활성을 통해 TGF-β에 대한 효과를 탐색할 수 있는 시스템을 구축하였다. 루시퍼라아제의 활성은 듀얼 루시퍼라아제 분석 키트(Promega, Medison, WI, USA)를 이용하여 측정하였다. HEK 293 세포는 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구매하였으며, 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 100 units/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)로 5% CO₂ 및 37℃에서 배양하였다.

형질전환된 HEK 293 세포를 3배수로 웰당 20,000개의 세포로 96-웰 플레이트에 접종하고, 상기 조건에서 24시간 동안 배양한 후, TGF-β를 각각 0.5, 1, 및 5ng/ml씩 농도별로 첨가하여 15시간 배양한 후 반딧불 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. TGF-β 처리시 루시퍼라아제 활성은 처리 전 대비 30-40배 증가되었으며 TGF-β 0.5ng/ml 처리에서 최적의 효능을 나타내었다. 도 2는 TGF-β 처리에 의해 루시퍼라아제의 활성이 증가된다는 것을 보여준다.

상기에서 구축된 탐색 시스템을 이용하여 화합물 라이브러리 중의 8,000개의 화합물을 대상으로 TGF-β 활성 저해 효과를 탐색하였다. 각각 화합물의 최종농도가 10 μM이 되도록 상기 형질전환된 HEK 293 세포가 접종된 96-웰 플레이트에 첨가하고, 2시간 인큐베이션 후 0.5ng/ml의 TGF-β를 첨가하고 상기에 기재된 방법으로 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 그 결과, TGF-β 활성 저해 효능이 우수한 저분자 화합물을 발굴하였다.

도 3a 및 3b는 각각 화학식 I 및 II의 화합물(이하에서, 각각 화합물 I 및 화합물 II라 함)이 농도 의존적으로 TGF-β 활성을 저해한다는 것을 보여준다. 또한, 루시퍼라아제 활성의 억제가 세포의 사멸이 아닌, TGF-β 활성 억제제에 의한 것이라는 것을 확인하기 위해, CCK-8 생존율 분석 키트(도진도, 일본)를 이용하고 분광분석계(랩시스템즈, 미국)로 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 수를 측정하였다. 표시된 값은 3회의 독립적인 실험으로부터 수득된 평균값이다. 도 4a 및 4b는 각각 CCK-8 분석법에 의해 측정된 화합물 I 및 II의 세포 독성 테스트 결과로서, 유의성 있는 세포수의 감소는 관찰되지 않았다는 것을 보여준다.

실시예 2. 이미다조퓨린 유도체에 의한, 간성상세포에서 근섬유세포로의 분화 억제

실시예 1에서 TGF-β 활성을 효과적으로 저해하는 것으로 확인된 화합물 I 및 II가 간성상세포의 섬유화를 억제할 수 있는지 여부를 실험하였다. 간 섬유화의 주된 대상세포인 간성상세포(hepatic stellate cell, HSC)는 미국 Mount Sinai의 S.L. Friedman 교수가 안정된 세포주로 만든 HSC-T6 세포를 분양받아 사용하였다. HSC-T6 세포를 10% 우태아 혈청(FBS), 100 units/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지로 5% CO2, 37℃의 조건에서 배양하였다. 화합물 I 및 II가 직접적으로 간성상세포의 증식능에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여 무혈청 배지에서 24시간 배양한 후 혈청을 첨가하기 2시간 전에 화합물 I 및 II를 0, 1, 10, 및 20 μM의 농도로 처리하였다. 뒤이어, 상기 조건에서 48시간 추가 배양한 후 CCK-8 생존율 분석키트를 이용하고 분광분석계(랩시스템즈, 미국)로 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 수를 측정하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, 무혈청 배양 조건에서는 간성상세포가 휴지기 상태로 존재하다가 혈청을 첨가해주면 빠르게 증식하며 화합물 I을 처리했을 때 간성상세포의 증식이 거의 완벽하게 차단되었다. 도 5b는 동일한 조건에서 화합물 II를 처리했을 때의 결과로 각각 1, 10 및 20 μM의 농도로 처리했을 때, 농도 의존적으로 간성상세포의 증식이 12, 25, 및 30% 억제되었다는 것을 보여준다.

또한, 간성상세포의 섬유화를 확인하기 위한 섬유화의 분자적 표지로 통상적 으로 사용되는 알파-평활근 액틴(α-smooth muscle actin, α-SMA)과 세포외 기질 물질인 피브로넥틴(fibronectin)의 수준을 웨스턴 블랏팅을 이용해 확인하였다. 상기 조건에서 배양된 HSC-T6 세포에 TGF-β (5ng/ml) 처리 2시간 전에 각각 화합물 I 및 II를 농도별(0, 1, 5 및 10 μM)로 첨가하고 5% CO₂, 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 배양 후에, 프로테아제 저해제(1 mM PMSF, 1 M/mL 아프로티닌, 1g/mL 류펩틴, 및 1 mM Na₃VO₄)가 포함된 RIPA 완충액(50 mM Tris-Cl (pH7.4), 1% NP-40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)으로 용해시켜 세포질 분획을 준비하고, 4-12% 구배 SDS-PAGE(Invitrogen)를 수행하여 단백질을 분리하였다. 상기 SDS-PAGE 겔 상에 분리된 단백질을 니트로셀룰로오즈 막(BioRad, Hercules, CA, USA)으로 옮기고, 상기 막을 5% 무지방 밀크로 블록킹(blocking)시켰다. 그 후, 항-α-SMA 항체(Sigma, 미국), 항-피브로넥틴 항체(Santa Cruz, 미국), 및 항-GAPDH 항체(Ab Frontier, 한국)를 상기 막에 처리하였다. 그 후, 상기 막을 호스레디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase) 연결 이차항체로 항온 반응시킨 후, ECL 키트(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 이용하여 시각화시켰다. 도 6a 및 6b는 화합물 I 및 II가 인간 간성상세포에서 알파-평활근액틴과 파이브로넥틴의 증가에 따른 섬유화를 억제한다는 것을 보여준다. TGF-β처리에 의해 섬유화 마커인 α-SMA와 피브로넥틴이 현저히 증가하였으며 화합물 I에 의해 농도 의존적으로 α-SMA와 피브로넥틴 발현이 감소함을 확인하였다. 또한 화합물 II도 화합물 I에 비하여 현저하지는 않지만 섬유화 마커의 유의적인 감소를 가져왔다.

실시예 3. 이미다조퓨린 유도체에 의한 인간 폐섬유세포의 섬유화 억제

실시예 1에서 TGF-β 활성을 효과적으로 저해하는 것으로 확인된 화합물 I 및 II가 인간 폐섬유세포의 섬유화를 억제할 수 있는지 여부를 실험하였다.

(1) TGF-β에 의해 유발되는 섬유화 억제

인간 정상 폐 섬유세포인 IMR-90 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, 미국)로부터 구매하였으며, 10% 우태아 혈청, 100 units/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 1 mM 소디움 피루베이트와 0.1 mM 비-필수 아미노산을 첨가한 MEM(Modified Eagle's medium) 배지로 5% CO₂, 37℃에서 24시간 배양한 후, 화합물 I을 TGF-β (5ng/ml) 처리 2시간 전에 농도별(0, 1, 5 및 10 μM)로 첨가하고 24시간 배양하였다. 그 후, 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 웨스턴 블랏팅을 수행하여, 화합물 I의 폐섬유세포의 분화억제정도를 섬유화 마커 분자인 α-SMA와 피브로넥틴의 발현 수준을 통해 확인하였다. 도 7a에 도시된 바와 같이, 화합물 I은 농도 의존적으로 인간 폐섬유세포의 섬유화를 감소시켰다. 세포외 기질 중 섬유화에 있어 중요한 물질 중 하나인 콜라겐(collagen)의 양도 콜라겐 Sircol 분석 키트(Biocolor, 영국)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다. 도 7b에 따르면, TGF-β 처리에 의해 콜라겐의 양은 무처리군에 비해 2.4배 증가하였으며 화합물 I은 농도 의존적으로 콜라겐의 양을 감소시켰다.

(2) 방사선에 의해 유발되는 섬유화 억제

TGF-β의 외부적인 자극 외에, 내부적으로 TGF-β를 증가시킬 수 있는 방사선을 조사하여 섬유화를 유도하고 화합물 I이 방사선 유발 섬유화를 억제하는지 여부를 확인하였다. 10% 우태아 혈청, 100 units/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 1 mM 소디움 피루베이트와 0.1 mM 비-필수 아미노산을 첨가한 MEM 배지가 담긴 6 cm 플레이트에 상기 (1)과 같이 배양된 IMR-90 세포를 접종하고, 화합물 I을 10 μM의 농도로 처리하고 2시간 배양한 후, 4 Gy 용량으로 방사선을 조사하고 48시간이 경과한 후 세포를 수확하였다. 그 후, 상기 세포로부터 웨스턴 블랏팅에 의해 실시예 2에 기재된 바와 같은 섬유화 마커를 확인하였다. 도 7c 및 7d에 도시된 바와 같이, 화합물 I은 유의성 있게 α-SMA와 피브로넥틴 발현을 감소시켰으며 콜라겐의 양도 방사선 처리군에서 1.7배의 증가를 나타낸 반면 화합물 I을 처리한 경우, 거의 무처리 대조군 수준으로 감소됨을 확인하였다.

실시예 4. 이미다조퓨린 유도체에 의한, LPS로 자극된 대식세포에 대한 항염증 효과

대식세포는 다양한 항원에 대해 초기면역반응을 담당하는 최전방의 면역세포로 강력한 염증반응을 일으킨다. 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 ATCC(American Type Culture Collection, 미국)에서 구매하여 10% 우태아 혈청, 100 units/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)로 5% CO₂ 및 37℃ 배양기에서 배양하였다. 상기 배양된 세포에 화합물 I 또는 II를 10 mM 첨가한 다음 2시간 후에 그람음성균의 세포벽 성분인 인지질다당체(lipopolysaccharide, LPS) 1 ㎍/ml를 처리하고 6시간 추가 배양한 후, 세포를 수확하여 TRIzol을 사용하여 총 RNA를 분리하고 정량하였다. 이 중 1㎍의 RNA를 취하여 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하고, 이를 주형으로 사이토카인의 발현 수준을 확인하기 위한 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하였다. 상기 cDNA를 주형으로 하고 각각 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α, 질소산화물 생성효소인 iNOS와 대조군인 β-액틴을 증폭시키기 위해 DNA 중합효소의 존재 하에 94℃에서의 30초간, 55℃에서의 45초, 및 72℃에서의 45초로 구성된 사이클을 30회 반복하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. IL-1β, IL-6, TNF-α, iNOS 및 β-액틴의 증폭을 위해, 하기 표 1에 표시된 바와 같은 서열번호 1 내지 10의 프라이머를 이용하였다.

표 1. RT-PCR에 사용된 프라이머 염기서열

프라이머		염기서열
IL-1β	정방향	5'-TGAAGGGCTGCTTCCAAACCTTTGACC-3' (서열번호 1)
	역방향	5'-TGTCCATTGAGGTGGAGAGCTTTCAGC-3'(서열번호 2)
IL-6	정방향	5'-TTCACAGAGGATACCACT-3'(서열번호 3)
	역방향	5'-TAGCCACTCCTTCTGTGA-3'(서열번호 4)
TNF-α	정방향	5'-CAGGCAGGTTCTGTCCCTTTCA-3'(서열번호 5)
	역방향	5'-CACTTGGTGGTTTGCTACGACG-3'(서열번호 6)
iNOS	정방향	5'-CCTTGTTCAGCTACGCCTTC-3'(서열번호 7)
	역방향	5'-CTGAGGGCTCTGTTGAGGTC-3'(서열번호 8)
β-액틴	정방향	5'-AGGCTGTGCTGTCCCTGTATGC-3'(서열번호 9)
	역방향	5'-ACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAA-3'(서열번호 10)

PCR 반응을 통해 수득된 증폭 산물을 에티디움 브로마이드(ethidium bromide, 염색제)가 존재하는 1% 아가로즈 겔 상에서 전기영동하여 상기 사이토카인의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 도 8a 및 8b는 각각 화합물 I 및 II의 처리에 따른 염증성 사이토카인의 양의 변화를 보여준다. LPS처리에 의해 상기 염증성 사 이토카인들이 현저히 증가한 반면 화합물 I의 처리시 IL-1β와 iNOS가 유의적으로 억제되었으며 화합물 II의 경우 IL-6와 iNOS를 뚜렷이 감소시켰다. 또한, 화합물 I 및 II는 모두 TNF-α의 발현도 약간 감소시켰다.

실시예 5. 이미다조퓨린 유도체와 항암제의 병용 투여에 따른 상승적 항암 효과

TGF-β는 종양과 관련하여 상반되는 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 즉, 종양의 초기에는 종양의 성장을 억제하는 효능을 나타내지만 후반기에는 종양의 전이나 침윤을 촉진한다. 따라서 종양 세포주들을 대상으로 화합물 I과 II의 직접적인 세포 사멸 효과와 더불어 항암제인 독소루비신과의 병용시 세포사멸 효과를 측정하였다. 폐암 세포주인 H1299와 뇌암 세포주 U87-MG를 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구매하여 사용하였으며 독소루비신은 자체적으로 세포사멸을 크게 일으키지 않는 농도로 0.05 μM을 처리하였다. 화합물은 도 9에 제시된 농도로 독소루비신을 첨가하기 2시간 전에 처리하였으며 상기 조건에서 48시간 추가 배양한 후 CCK-8 생존율 분석키트(도진도, 일본)를 이용하여 정량하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 화합물 I과 II는 단독 처리시, 폐암세포주인 H1299에서 5 μM 이상 처리시 세포사멸을 유발하였으나(도 9a 및 9c), 뇌암세포주인 U87-MG에서는 세포독성을 나타내지 않았다(도 9b 및 9d). 그러나, 독소루비신과의 병용처리시 화합물 I과 II는 두 종양세포 모두에서 세포사멸의 상가 혹은 상승 효능을 나타냄으로 항암제 사용시 항암제의 효능을 증진시키는 보조제로 사용가능하다는 것을 시사 하였다.

실시예 6. 이미다조퓨린 유도체와 방사선의 병용 투여에 따른 상승적 항암 효과

방사선 치료의 주 대상 암인 폐암의 세포주 H1299를 대상으로 방사선과 화합물 I 또는 II를 병용처리하였을 때 세포사멸을 측정하였다. 6cm 세포배양 플레이트에 실시예 3에 기재된 바와 같이 접종된 H1299 세포에 화합물 I 또는 II를 방사선 조사 2시간 전에 처리한 후 6 Gy의 방사선을 조사하고 48시간째에 세포사멸을 아넥신(Annexin)-PI염색 및 FACS분석을 통해 측정하였다. 하기 표 2에 기재된 바와 같이, 화합물 I 또는 II 또는 방사선 조사 단독에 의한 경우보다, 각각의 화합물과 방사선 치료를 병용한 경우, 세포사멸을 일으키는 상승효과가 나타났다. 이 결과는 방사선 치료시에도 화합물 I과 II는 효과적인 보조제 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다.

표 2. 방사선 조사와 병용시 유발되는 세포사멸

실험군	세포사멸 정도(%, 평균± SEM)
H1299세포	2.34± 0.11
H1299세포 + 방사선조사(6 Gy)	26.50± 1.59
H1299세포 + 화합물 I (5 μM)	20.86± 1.03
H1299세포 + 방사선조사(6 Gy) + 화합물 I (5 μM)	73.42± 1.84
H1299세포 + 화합물 II (5 μM)	14.79± 0.78
H1299세포 + 방사선조사(6 Gy) + 화합물 II (5 μM)	55.91± 5.58

도 1 은 HEK 293 세포에 TGF-β에 반응하는 PAI 프로모터와 SMAD 결합부위를 지닌 벡터를 안정적으로 삽입한 다음 루시퍼라아제 활성을 측정하는, TGF-β 활성 저해 물질을 탐색하는 시스템을 도식화한 것이다.

도 2 는 본 발명의 일 구체예에서 사용된 탐색 시스템을 이용하여 TGF-β 자극에 의해 루시퍼라아제 활성이 증가된다는 것을 보여주어, 상기 탐색 시스템의 유효성을 확인한다. 도면에서, pGL2는 루시퍼라아제를 코딩하는 유전자만 포함된 벡터로 형질전환된 세포주, 3TP-pGL2는 TRE(TGF-β response element)를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포주를 의미하고, TGF-b는 각각 표시된 농도의 TGF-β로 자극된 3TP-pGL2 세포주를 의미한다.

도 3a 및 3b는 각각 화합물 I 및 II가 농도 의존적으로 TGF-β 신호전달을 저해한다는 것을 보여준다.

도 4a 및 4b는 각각 화합물 I 및 II가 HEK 293 세포에 대한 자체 독성이 없다는 것을 보여준다.

도 5a 및 5b는 각각 화합물 I 및 II가 인간 간성상세포의 증식에 미치는 효과를 보여준다.

도 6a 및 6b는 각각 화합물 I 및 II가 인간 간성상세포에서 알파-평활근액틴(α-smooth muscle actin)과 세포외기질인 피브로넥틴의 증가에 따른 섬유화를 효과적으로 억제한다는 것을 보여준다.

도 7a와 7b 및 7c와 7d는 화합물 I이 각각 TGF-β 및 방사선에 의해 유발된 인간 정상 폐 섬유세포의 섬유화를 억제한다는 것을 보여준다.

도 8a 및 8b는 각각 화합물 I 및 II가 LPS에 의해 자극된 대식세포의 염증성 사이토카인 활성을 저해함으로써 항염 효과가 있다는 것을 보여준다.

도 9a와 9b 및 9c와 9d는 각각 화합물 I 및 II를 항암제인 독소루비신과 병용처리 하였을 때 폐암 세포(H1299) 및 뇌암 세포(U87-MG)의 세포사멸에 대한 상승효과를 갖는다는 것을 보여준다. C, Com I, Com II 및 Doxo는 각각 대조군, 화합물 I, 화합물 II 및 독소루비신을 의미한다.

<110> Korea Institute of Radiological & Medical Sciences <120> Composition for inhibititing TGF-beta comprising imidazopurine derivatives <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-1B <400> 1 tgaagggctg cttccaaacc tttgacc 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-IB <400> 2 tgtccattga ggtggagagc tttcagc 27 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-6 <400> 3 ttcacagagg ataccact 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-6 <400> 4 tagccactcc ttctgtga 18 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for TNF-alpha <400> 5 caggcaggtt ctgtcccttt ca 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for TNF-alpha <400> 6 cacttggtgg tttgctacga cg 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for iNOS <400> 7 ccttgttcag ctacgccttc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for iNOS <400> 8 ctgagggctc tgttgaggtc 20 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for beta-actin <400> 9 aggctgtgct gtccctgtat gc 22 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for beta-actin <400> 10 acccaagaag gaaggctgga aa 22

Claims

하기 화학식 A의 이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, TGF-β 활성 저해용 조성물:

화학식 A

상기에서,

X, Y, 및 Z는 각각 독립적으로 수소, 또는 할로를 나타내고,

R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, C₁-C₄ 알킬, 또는, 히드록시, 할로, C₁-C₄ 알킬, 및 C₁-C₄ 할로알킬로 구성된 군으로부터 선택된 치환기에 의해 선택적으로 치환된 C₁-C₄알킬을 나타내며,

할로는 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도이다.
제1항에 있어서, 상기 이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온 화합물은 3-(2-클로로벤질)-1,7-디메틸-1H-이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온 화합물은 3-(2-클로로-6-플루오로벤질)-1,6,7-트리메틸-1H-이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 암, 염증 또는 섬유증의 치료 또는 예방을 위한 것인 조성물.
하기 화학식 A의 이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 항암제 보조용 조성물:

화학식 A

상기에서,

X, Y, 및 Z는 각각 독립적으로 수소, 또는 할로를 나타내고,

R1, R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소, C₁-C₄ 알킬, 또는, 히드록시, 할로, C₁-C₄ 알킬, 및 C₁-C₄ 할로알킬로 구성된 군으로부터 선택된 치환기에 의해 선택적으 로 치환된 C₁-C₄알킬을 나타내며,

할로는 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 요오도이다.
제5항에 있어서, 상기 화학식 이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온 화합물은 3-(2-클로로벤질)-1,7-디메틸-1H-이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온인 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온 화합물은 3-(2-클로로-6-플루오로벤질)-1,6,7-트리메틸-1H-이미다조[2,1-f]퓨린-2,4(3H,8H)-디온인 것인 조성물.
제5항에 있어서, 상기 항암제는 방사선, 시스플라틴, 독소루비신, 빈블라스틴, 플로오로우라실, 이리노테칸, 파클리탁셀, 비노렐빈, 및 젬시타빈으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.