KR20110036570A - 수지상 세포를 관용원성이 되게 하는 호흡기 합포체 바이러스 - Google Patents
수지상 세포를 관용원성이 되게 하는 호흡기 합포체 바이러스 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 분리된 항원 제시 세포를 이를 감염시키기에 충분한 유효량의 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)로 감염시키고 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 다를 RSV-감염된 항원 제시 세포와 접촉시켜 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 다를 혼합 백혈구 반응에 의해 시험관내에서 측정시 관용원성이 되게 함으로써, 항원 제시 세포를 사용하여 면역관용을 유도하기 위한 조성물, 방법 및 시스템을 포함한다.
Description
본 발명은 일반적으로 면역 세포 관용 분야, 특히 면역 억제를 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본원 발명의 배경이, 이의 범위를 제한하지 않으면서, 관용원성 (tolerogenicity)과 연관지어 설명된다. 미국 특허 제6,936,468호 (Robbins 등에게 허여됨)은 숙주에서 관용원성을 증진시키기 위한 관용원성 수지상 세포의 이용 및 이를 생성하는 방법을 교시한다. 간단히 설명하면, 이 방법은 관용원성 포유동물 수지상 세포 (DC) 및 관용원성 DC의 생성 방법에 관한 것이다. 또한, 이 방법은 이 발명의 관용원성 포유동물 DC를 숙주에 투여하는 것을 포함하는 숙주에서의 관용원성 증진에 대해 교시한다. 관용원성 DC는 하나 이상의 NF-κB 결합 부위를 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 (ODN)을 포함한다. 이 발명의 관용원성 DC는 바이러스 벡터 및 바람직하게는 아데노 바이러스 벡터를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 존재하더라도 관용원성 DC의 관용원성에 영향을 끼치지 않는다. 숙주에서의 증진된 관용원성은 외래 이식편의 생존을 연장시키고 염증 관련 질환, 예를 들어 자가면역 질환을 치료하는데 유용하다.
미국 특허 제5,597,563호 (Beschorner에게 허여됨)는 항원-특이적 면역 관용을 유도하는 방법을 교시한다. 정주하는 흉선 항원 제시 세포 (APC)의 고갈 및 관용을 위한 항원을 포함하는 새로운 APC와 흉선의 재거주에 의한 항원-특이적 면역 관용 유도 방법은, 수용체 동물의 흉선 수질 중의 수지상 세포를 고갈시키기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에서, 수용체 동물에 수지상 세포 고갈 양의 면역억제제를 투여하는 방법; 수용체 동물에 관용원성 양의 종내 (intraspecies) 수지상 세포군을 항원과 함께 투여하고 실질적으로 동시에 면역억제제를 투여하고, 이때 종내 수지상 세포군은 항원에 대해 관용원성인 종내 수지상 세포와 함께 농축되며, 투여는 수용체의 수지상 세포-고갈된 흉선 수질의 재거주시키기에 충분한 조건 하에서 수행되는 방법; 및 수지상 세포의 흉선으로의 점증을 유도하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에서 흉선 재생제를 투여하고, 이때 흉선 재생제는 면역억제제 투여 후, 동시 또는 수지상 세포의 투여 후에 투여되는 방법을 포함한다.
미국 특허원 제20060182726호 (Thomas 등에 의해 출원됨)는 면역조절 조성물, 이의 생성 방법 및 이의 용도를 교시한다. 이 특허원은 프라이밍된 면역 반응을 포함하여 면역 반응의 항원-특이적 억제를 위한 조성물 및 방법을 기술한다. 특히, 이 발명은 CD40 또는 이의 등가물의 수준 및 기능 활성이 손상, 저지 또는 감소된 항원-제시 세포, 특히 수지상 세포, 및 자가면역 질환, 알러지 및 이식 거부에서의 증상을 포함한 목적하지 않거나 유해한 면역 반응을 치료 및/또는 예방하기 위한 이의 용도를 기술한다.
미국 특허원 제20040072348호 (Leishman에게 허여됨)는 관용원성 항원-제시 세포를 교시한다. 성숙할 수는 없으나 일차 시그널을 T 세포에 제공하고 단 공동-자극 시그널을 제공할 수는 없는 수지상 세포가 제조될 수 있다. 따라서, 영구적 미성숙 수지상 세포에 의해 자극된 T 세포는 무반응하게 되므로, 상기 수지상 세포는 면역원성보다는 관용원성이다. 세포는 일반적으로 CD40-, CD80- 및 CD86-이며, 염증 매개자, 예를 들어 지질다당류에 의해 자극되는 경우에 잔류한다. 상기 세포는 통상적으로 부착성 배아 줄기 세포를 GM-CSF의 존재 하에서 배양함으로써 제조될 수 있다.
마지막으로, 미국 특허원 제20040043483호 (Qian에 의해 출원됨)는 새로운 관용원성 수지상 세포 및 이의 치료적 용도를 교시한다. 이 출원은 관용원성 수지상 세포 (DC) 및 조직 제조시 이들 세포의 농축 및 이식 거부를 예방 또는 최소화하거나 자가면역 질환을 치료 또는 예방하기 위한 이들 세포의 이용 방법에 관한 것이다.
본 발명은 항원 제시 세포를 사용하여 면역 관용을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 하나의 양태에서, 본 발명은, 무반응 (anergic) 또는 면역관용유도된 (tolerized) 면역 세포, 및 분리된 항원 제시 세포를 이를 감염시키기에 충분한 유효량의 호흡기 합포체 바이러스 (respiratory syncytial virus: RSV) 또는 이의 일부로 감염시키고; CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 다를 RSV-감염된 항원 제시 세포와 접촉시켜, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 다를, 혼합 백혈구 반응에 의해 시험관내에서 측정시, 관용원성이 되게 함으로써, 무반응 또는 면역관용유도된 면역 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 하나의 양상에서, RSV-감염된 항원 제시 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 미성숙 수지상 세포, 성숙 수지상 세포 또는 랑게르한스 세포이다. 또 다른 양상에서, RSV-감염된 항원 제시 세포는 1:1 내지 1:100의 관용원성 항원 제시 세포 대 T 세포의 비율로 관용원성이다. 또 다른 양상에서, RSV-감염된 세포는 T 세포와의 접촉 전에 고정된다. 상기 방법을 이용하여 제조된 세포는 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low인 RSV-감염된 항원 제시 세포일 수 있다. 또 다른 양상에서, RSV-감염된 항원 제시 세포는, Flu 감염된 항원 제시 세포와 비교하여, CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low이다. RSV-감염된 항원 제시 세포는 조절 T 세포의 증식을 유도하는 것으로 밝혀졌다. RSV-감염된 항원 제시 세포는 IL-10을 분비하고, 비처리된 항원 제시 세포에 비해 증가된 SIGLEC-1, PDL-1, ILT-4, HLA-G, SLAM 및 LAIR 발현을 갖는다. 또한, RSV-감염된 항원 제시 세포는 비처리된 항원 제시 세포에 비해 증가된 IL-10, LAIR2, SOCS2, PTPN2, ILT-6, AQP9, PTX3 및 SLAMF1 유전자 발현을 가질 수 있다.
또 다른 양태에서, 수지상 세포를 면역관용이 되게 하는 방법은, 수지상 세포를 유효량의 호흡기 합포체 바이러스로 감염시켜 IL-10 의존적 관용원성 면역 기능을 발달시키는 것을 포함하고, 이때 호흡기 합포체 바이러스는 동종이형 CD4+ T-세포를 면역관용이 되게 하고 억제제 T-세포 증식을 일으키며 IL-10을 분비하고 억제 분자인 PDL-1, ILT-4 및 HLA-G를 발현하는 수지상 세포의 능력을 증가시키며, 감염 수지상 세포는 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low이다. 또 다른 양상에서, 동종이형 CD4+ T-세포를 활성화시키는 수지상 세포의 능력 억제는 수지상 세포간의 세포-대-세포 접촉을 필요로 한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 분리된 수지상 세포를 유효량의 호흡기 합포체 바이러스로 감염시켜 IL-10 의존적 관용원성 면역 기능을 발달시킴으로써 피험자에서 수지상 세포의 항바이러스성 면역을 억제하는 방법을 포함하고, 이때 호흡기 합포체 바이러스는, 환자에 재도입시, 동종이형 CD4+ T-세포를 활성화시키고 미감작 (naive) T-세포 조절 반응을 유도하며 IL-10을 분비하고 억제 분자인 PDL-1, IKT-4, 및 HLA-G를 발현하는 수지상 세포의 능력을 억제한다. 하나의 양상에서, 동종이형 CD4+ T-세포를 활성화시키는 수지상 세포의 능력 억제는 수지상 세포 사이의 세포-대-세포 접촉을 필요로 한다.
본 발명의 또 다른 양상은 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low인 분리된 수지상 세포를 포함하는 관용원성 수지상 세포이다. 관용원성 수지상 세포는, 말초 혈액 단핵 세포를, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 다를, 혼합 백혈구 반응에 의해 시험관내에서 측정시, 관용원성이 되게 하기에 충분한 유효량의 호흡기 합포체 바이러스 또는 이의 일부로 감염시키는 방법에 의해 제조되며, CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low이다.
본 발명의 또 다른 양태는, T 세포를, CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low 중 하나 이상의 표면 발현을 유도하기에 충분한 양의 호흡기 합포체 바이러스 또는 이의 일부로 감염된 수지상 세포와 접촉시킴으로써, 관용원성 T 세포-매개된 면역 반응을 촉진하는 방법이다. 또 다른 양태는, 분리된 항원 제시 세포 (APC)를, 이를 감염시키고 세포 표면 마커 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low 중 하나 이상의 표면 발현을 유도하기에 충분한 양의 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)와 함께 항온배양하고; RSV-감염된 항원 제시 세포를, 혼합 백혈구 반응에 의해 시험관내에서 측정시 T 세포를 면역관용이 되게 하는 조건 하에서, T 세포와 접촉시키는 것을 포함하여, 무반응 T 헬퍼 세포를 유도하는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는, 분리된 수지상 세포를, 세포 표면 마커 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low 의 세포 표면 발현을 유도하는 조건 하에서, 수지상 세포를 감염시키기에 충분한 양의 호흡기 합포체 바이러스와 함께 항온배양하는 것을 포함하여, 분리된 관용원성 수지상 세포를 생성하는 방법이다. 또한, 본 발명은, 호흡기 합포체 바이러스로 미리 감염되고 세포 표면 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low를 갖는 분리된 관용원성 수지상 세포를 포함하는, 포유동물 숙주에서 관용원성을 증진시키기 위한 키트를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 항원 제시 세포 (APC)를 수지상 세포를 감염시키기에 충분한 양의 호흡기 합포체 바이러스로 감염시키고; 세포 표면 마커 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low를 발현시켜 관용원성 APC를 생성하는 것을 포함하여, 관용원성 APC를 생성하는 방법을 포함한다. 또한, 본 발명은 포유동물 피험자에게 호흡기 합포체 바이러스로 미리 감염되고 세포 표면 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low를 갖는 관용원성 항원 제시 세포를 자가면역 질환을 감소 또는 제거하거나 이의 발생 또는 재발을 방지하기에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하여, 포유동물 피험자의 자가면역 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명을 이용하여 치료될 수 있는 자가면역 질환의 비제한적 예는 인슐린-의존적 당뇨병, 다발성 경화증, 자가면역 뇌척수염, 류마티스 관절염, 자가면역 관절염, 중증근무력증, 갑상선염, 포도막망막염 (uveoretinitis), 하시모토 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis), 원발성 점액수종, 갑상선중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축위염, 애디슨 질환 (Addison's disease), 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군 (Goodpasture's syndrome), 심상성 천포창, 유사천포창, 건선 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구감소증, 원발성 담관경화증, 활성적 만성 간염, 잠복 경화증, 궤양성 결장염, 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 공피증, 베게너 육아종증, 폴리/피부근염, 원반상 홍반성 루푸스, 또는 전신 홍반성 루푸스를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항원에 대한 면역 반응의 조절이 필요한 환자에게, 면역 반응을 조절하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에서, 분리된 면역관용유도 항원 제시 세포를 투여함으로써 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 방법을 포함하고, 이때 항원-특이적 항원-제시 세포는, 항원-제시 세포가 T 세포를 관용이 되게 하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에서 항원-제시 세포를 호흡기 합포체 바이러스와 접촉시킴으로써 생성되고, 면역관용유도 항원-제시 세포는 세포 표면 마커인 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low를 발현시키는 것으로 특징지어지며, 면역관용유도 항원 제시 세포는 1:5 내지 1:100의 면역관용유도 항원 제시 세포 대 T 세포의 비율로 관용원성이다.
본 발명의 특징 및 이점에 대한 보다 완전한 이해를 위해, 첨부된 도면과 함께 본 발명의 상세한 설명이 참조된다.
도 1a는 급성 RSV 감염을 갖는 소아 환자 및 건강한 성인 공여자로부터 분리된 PBMC를 나타낸다. 건강한 공여자의 CFSE 표지된 CD4+ T-세포의 증식은, RSV 감염된 개체 또는 건강한 개체로부터의 조사된 PBMC와 6일 공동배양 후 유동 세포측정으로 평가되었다.
도 1b는 급성 감염된 영아의 코 점막 세척물로부터 CD11c+ HLA-DR+ 세포의 직접적인 분류에 의해 분리된 mDC를 나타낸다. 세포는 CFSE 표지된 CD4+ T-세포와 함께 배양되었으며, 증식은 유동 세포측정으로 평가되었다.
도 2a는 기술된 바와 같이 분리되고 18시간 동안 Flu 또는 RSV (MOI=1.0)에 노출되거나 노출되지 않으며 다수 세척된 혈액 mDC를 나타낸다. 이어서, CD4+ T-세포 증식을 촉진시키는 능력을 평가하였다.
도 2b는 24시간 동안 37℃에서 Flu 또는 RSV (MOI=1), 또는 UV-조사된 RSV (MOI=1)에 노출된 2x104 세포를 나타낸다. 1.5x105 CSFE 표지된 T 세포를 6일 동안 2.5x103 Flu, RSV, 또는 UV-RSV 처리된 mDC와 함께 항온배양하였다. 세포 증식을 CFSE 염료 희석으로 평가하였다.
도 2c는 6일 동안 GM-CSF 및 IL-4 또는 GM-CSF 및 IL-10 또는 GM-CSF 및 비타민 D3 또는 지시된 바와 같은 조합물의 존재하에 분화된 DC를 나타낸다. 6일에 약물 처리된 DC를 LPS의 존재 하에 2일 동안 항온배양하였다. 8일에 CD4+ T-세포 증식을 촉진시키는 DC의 능력을 티미딘 삽입에 의해 RSV DC와 비교하여 평가하였다.
도 2d는 도 1에 기술된 바와 같이 분리된 혈액 mDC를 나타낸다. CD4+ T-세포는 세포 분류에 의해 정제한 후, CSFE 표지하였다. 1.5x105 세포를 1 MOI의 Flu, RSV 또는 대조군 조건에 노출하였다. 이어서, 세포를 6일 동안 37℃에서 항-CD3, 항-CD28 마이크로비드의 존재 하에서 항온배양하였다. 이어서, 세포를 CD4 발현에 대해 염색하고 증식을 CFSE 염료 희석에 의해 평가하였다.
도 2e는 도 1에 개요된 방법을 이용하여 분리된 혈액 mDC (녹색 삼각형) 및 형질세포양 DC (plasmacytoid DC: pDC) (청색 X)를 나타낸다. 세포를 96-웰 플레이트에서 RSV (MOI=1)과 함께 항온배양하였다. Hela 세포 (적색 X)는 바이러스 복제에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. RSV를 음성 대조군으로 사용된 세포 (황색 원)의 부재 하에서 배양하였다. 감염성 바이러스 입자 생성을 7일 동안 24시간 마다 평가하였다. 새로이 해동된 RSV 바이러스 (암청색 다이아몬드)을 사용하여 조직 배양 감염 용량 (TCID50) 계산을 확인하였다.
도 2f는 도 1에 개요된 방법을 이용하여 분리된 혈액 mDC를 나타낸다. GM-CSF IL4 배양된 단핵구로부터 유도된 DC를 6일에 분리하였다 (GM/4 DC). 세포를 96-웰 플레이트에서 인플루엔자 바이러스 (MOI=1) 또는 RSV (MOI=1)와 함께 배양하였다. 24시간 후, 세포 생존성을 트립판 블루 염색으로 평가하였다. 자료는 4개의 독립적 연구에 대한 평균 및 표준편차를 나타낸다.
도 3a (패널 1)은 정제되고 18시간 동안 바이러스 비노출, RSV (청색) 노출 또는 Flu 바이러스 (적색) 노출된 mDC를 나타낸다. 18시간 후, 동종이계 CFSE-표지된 CD4+ T-세포를 비노출된 DC + 증가수의 RSV-노출된 또는 Flu 노출된 DC와 함께 공동배양하였다. 공동 배양 6일 후, CD4+ T-세포 증식을 유동 세포측정으로 평가하였다. 도 3a (패널 2)는 공여자 매치된 DC를 사용한 5개의 독립적 연구로부터의 결과를 나타낸다 (p=0.03 대응표본 t-시험).
도 3b는 도 3a에 기술된 바와 같이 제조된 mDC를 나타내며, 증가수의 비노출된 DC (원) 또는 RSV 노출된 (삼각형) DC를 직접적으로 (청색) 또는 0.3 uM 트랜스 웰을 가로질러 mDC/CD4+ T-세포 공동배양으로 적정하였다. CD4+ T-세포 증식은 상술된 바와 같이 평가하였다.
도 3c는 18시간 동안 바이러스 비노출 (대조군), RSV 또는 Flu 바이러스 노출된 혈액 mDC를 나타낸다. 이어서, 노출된 수지상 세포를 실온에서 30분 동안 CytoChex 고정 시약 (BD)을 사용하여 고정하고, 빙-냉각된 PBS로 3회 세척하였다. 유동 바이러스 노출 및 고정, 세포를 인 트랜스 동종 억제 검정 (in trans allo inhibition assay)에 사용하였다. 동종이계 CFSE-표지된 CD4+ T-세포를 비노출된 DC + 증가수의 RSV-노출된 DC 또는 Flu 노출된 DC (고정 또는 비고정)와 함께 공동배양하였다. 공동배양 6일 후, CD4+ T-세포 증식을 유동 세포측정으로 평가하였다.
도 3d는 도 1에 기술된 바와 같이 제조된 DC를 나타내나. 증가수의 바이러스적으로 또는 약리학적으로 조작된 DC를 mDC/CD4+ T-세포 공동배양물에 가하였다. CD4+ T-세포 증식을 상술된 바와 같이 평가하였다.
도 3e는 flu 또는 RSV (MOI=1)와 함께 또는 바이러스 없이 (대조군) 24시간 배양되고 수거된 혈액 mDC를 나타낸다. 대조군 mDC (바이러스 비노출)은 증가 농도의 flu 또는 RSV-노출된 DC의 존재 하에서 5.0 ug/ml 항-F 단백질 항체와 함께 또는 이 항체 없이 항온배양되고, 일정 농도의 1,250 대조군 mDC/100,000 CD4+ T-세포로 CFSE-표지된 동종이계 CD4+ T-세포와 함께 공동배양되었다. 6일 후, 세포를 CD4 발현에 대해 염색하고, 증식을 CFSE 염료 희석으로 평가하였다.
도 4a는 본 발명의 방법을 이용하여 분리되고 Flu 또는 RSV (MOI=1)와 함께 배양된 mDC를 나타낸다. 24시간 후, 세포를 CD40, CD83, CD86, 및 CD80에 대해 염색하고, 유동 세포측정으로 분석하였다. 분홍색 히스토그램은 동일 마커에 대해 염색된 비노출 mDC를 나타낸다. 녹색 히스토그램은 RSV와 함께 배양된 mDC를 나타내고 청색 히스토그램은 인플루엔자와 함께 배양된 mDC를 나타낸다.
도 4b는, 16시간 동안 Flu 또는 RSV (MOI=1.0)에 노출 또는 비노출한 후, RNA 추출하고, 표지한 후, U133 2 플러스 칩 (Affymetrix)에 하이브리드화된, mDC (3 공여자)의 결과를 나타낸다. 감별 분석은 Gene Spring 6.2 소프트웨어 패키지 (Silicon Genetics)를 사용하여 수행하였다. 15개 탐침의 발현 패턴이 flu 또는 RSV 노출 또는 비노출된 mDC로부터의 관용원성 DC와 연관된다.
도 4c는 Flu 또는 RSV에 18시간 동안 노출한 후 유동 세포측정으로 평가된 ITIM 수용체 및 리간드의 발현을 나타낸다.
도 4d는, 비노출 mDC와 비교하여, Flu 또는 RSV (MOI=1)에 18시간 동안 노출한 후의 mDC (3 공여자)에서 IFN 람다 및 IFN 알파 패밀리 구성원의 발현을 나타낸다.
도 4e는 도 1에 기술된 바와 같이 분리된 혈액 mDC로부터의 결과를 나타낸다. DC는 24시간 동안 37℃에서 비처리 (대조군), Flu (MOI=1)로 처리, RSV (MOI=1)로 처리, 또는 IFN-알파 ((500 pg/ml), 및 INF-람다 및 IL-29 (1 또는 5 ng/ml)로 처리되었다. 이어서, 동종이계 CFSE-표지된 CD4+ T-세포는 6일 동안 37℃에서 각 처리의 DC와 함께 공동배양되었다. 사이토킨 처리된 DC의 경우, IFN-람다, IFN-알파 및 IL-29 농도는 T-세포 공동배양 동안 유지되었다. 공동배양 6일 후, CD4+ T-세포 증식을 유동 세포측정 (상단 패널)로 평가하였다. 재조합 IFN-람다 및 IL-29의 생물활성을 노출된 GM-CSF/IL-4 단핵구 유도된 DC에서 STAT-1 인산화를 모니터링함으써 평가하였다. 단핵구 유도된 DC를 각각 0, 10, 30 및 60분 동안 5 ng/ml IFN-람다 및 IL-29에 노출하였다. 이어서, STAT-1 인산화 (P-STAT1) 정도를, 총 STAT-1 단백질과 비교하여, 전체 새포 용해물에서 웨스턴 블롯으로 평가하였다. 500 pg/ml IFN-알파로 60분 동안 처리된 단핵구 유도된 DC가 STAT-1 인산화에 대한 양성 대조군으로 사용되었다 (하단 패널).
도 5a는 18시간 동안 1 MOI의 Flu 또는 RSV에 노출된 mDC로부터의 결과를 나타낸다. 세포 배양 상청액을 IL-10 루미넥스 멀티플렉스 분석 (Luminex Multiplex Analysis)을 이용하여 발현에 대해 분석하였다. 자료는 11개의 독립적 연구에 대한 평균 및 SD를 나타낸다.
도 5b는 바이러스 노출 30분 전 (패널 2) 또는 RSV 노출 18시간 후 (패널 4) 이소타입 대조군 (패널 1 및 3) 또는 IL-10 및 IL-10 수용체에 대한 차단 항체 (패널 2 및 4)와 함께 항온배양된 mDC로부터의 결과를 나타낸다. 이어서, CD4+ T-세포 동종 증식을 유도하는 이들 세포의 능력을 평가하였다 (n=4).
CFSE 표지된 동종이계 CD4+ T-세포를 비노출, flu 또는 RSV 노출된 mDC와 함께 항온배양하였다.
도 6a는, 각 조건으로부터의 제1 및 제2 세대 CD4+ T-세포군 (CFSE high)이 DC 공동배양 5일 후 세포 분류에 의해 분리되었다는 것을 나타낸다. 이어서, 비노출, flu 또는 RSV 노출된 mDC 공동배양물로부터 분류된 1,500 CD4+ T-세포를 1,250 비노출 mDC 및 500,000 표지된 CD4+ T-세포로 이루어진 MLR에 첨가하였다. 이어서, CD4+ T-세포 동종 증식을 유도하는 비노출된 DC의 능력을 평가하였다.
도 6b 및 도 6c는 3개의 독립적 연구로부터의 자료를 나타낸다.
도 6d는 연구 과정의 도식을 나타낸다.
도 1a는 급성 RSV 감염을 갖는 소아 환자 및 건강한 성인 공여자로부터 분리된 PBMC를 나타낸다. 건강한 공여자의 CFSE 표지된 CD4+ T-세포의 증식은, RSV 감염된 개체 또는 건강한 개체로부터의 조사된 PBMC와 6일 공동배양 후 유동 세포측정으로 평가되었다.
도 1b는 급성 감염된 영아의 코 점막 세척물로부터 CD11c+ HLA-DR+ 세포의 직접적인 분류에 의해 분리된 mDC를 나타낸다. 세포는 CFSE 표지된 CD4+ T-세포와 함께 배양되었으며, 증식은 유동 세포측정으로 평가되었다.
도 2a는 기술된 바와 같이 분리되고 18시간 동안 Flu 또는 RSV (MOI=1.0)에 노출되거나 노출되지 않으며 다수 세척된 혈액 mDC를 나타낸다. 이어서, CD4+ T-세포 증식을 촉진시키는 능력을 평가하였다.
도 2b는 24시간 동안 37℃에서 Flu 또는 RSV (MOI=1), 또는 UV-조사된 RSV (MOI=1)에 노출된 2x104 세포를 나타낸다. 1.5x105 CSFE 표지된 T 세포를 6일 동안 2.5x103 Flu, RSV, 또는 UV-RSV 처리된 mDC와 함께 항온배양하였다. 세포 증식을 CFSE 염료 희석으로 평가하였다.
도 2c는 6일 동안 GM-CSF 및 IL-4 또는 GM-CSF 및 IL-10 또는 GM-CSF 및 비타민 D3 또는 지시된 바와 같은 조합물의 존재하에 분화된 DC를 나타낸다. 6일에 약물 처리된 DC를 LPS의 존재 하에 2일 동안 항온배양하였다. 8일에 CD4+ T-세포 증식을 촉진시키는 DC의 능력을 티미딘 삽입에 의해 RSV DC와 비교하여 평가하였다.
도 2d는 도 1에 기술된 바와 같이 분리된 혈액 mDC를 나타낸다. CD4+ T-세포는 세포 분류에 의해 정제한 후, CSFE 표지하였다. 1.5x105 세포를 1 MOI의 Flu, RSV 또는 대조군 조건에 노출하였다. 이어서, 세포를 6일 동안 37℃에서 항-CD3, 항-CD28 마이크로비드의 존재 하에서 항온배양하였다. 이어서, 세포를 CD4 발현에 대해 염색하고 증식을 CFSE 염료 희석에 의해 평가하였다.
도 2e는 도 1에 개요된 방법을 이용하여 분리된 혈액 mDC (녹색 삼각형) 및 형질세포양 DC (plasmacytoid DC: pDC) (청색 X)를 나타낸다. 세포를 96-웰 플레이트에서 RSV (MOI=1)과 함께 항온배양하였다. Hela 세포 (적색 X)는 바이러스 복제에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. RSV를 음성 대조군으로 사용된 세포 (황색 원)의 부재 하에서 배양하였다. 감염성 바이러스 입자 생성을 7일 동안 24시간 마다 평가하였다. 새로이 해동된 RSV 바이러스 (암청색 다이아몬드)을 사용하여 조직 배양 감염 용량 (TCID50) 계산을 확인하였다.
도 2f는 도 1에 개요된 방법을 이용하여 분리된 혈액 mDC를 나타낸다. GM-CSF IL4 배양된 단핵구로부터 유도된 DC를 6일에 분리하였다 (GM/4 DC). 세포를 96-웰 플레이트에서 인플루엔자 바이러스 (MOI=1) 또는 RSV (MOI=1)와 함께 배양하였다. 24시간 후, 세포 생존성을 트립판 블루 염색으로 평가하였다. 자료는 4개의 독립적 연구에 대한 평균 및 표준편차를 나타낸다.
도 3a (패널 1)은 정제되고 18시간 동안 바이러스 비노출, RSV (청색) 노출 또는 Flu 바이러스 (적색) 노출된 mDC를 나타낸다. 18시간 후, 동종이계 CFSE-표지된 CD4+ T-세포를 비노출된 DC + 증가수의 RSV-노출된 또는 Flu 노출된 DC와 함께 공동배양하였다. 공동 배양 6일 후, CD4+ T-세포 증식을 유동 세포측정으로 평가하였다. 도 3a (패널 2)는 공여자 매치된 DC를 사용한 5개의 독립적 연구로부터의 결과를 나타낸다 (p=0.03 대응표본 t-시험).
도 3b는 도 3a에 기술된 바와 같이 제조된 mDC를 나타내며, 증가수의 비노출된 DC (원) 또는 RSV 노출된 (삼각형) DC를 직접적으로 (청색) 또는 0.3 uM 트랜스 웰을 가로질러 mDC/CD4+ T-세포 공동배양으로 적정하였다. CD4+ T-세포 증식은 상술된 바와 같이 평가하였다.
도 3c는 18시간 동안 바이러스 비노출 (대조군), RSV 또는 Flu 바이러스 노출된 혈액 mDC를 나타낸다. 이어서, 노출된 수지상 세포를 실온에서 30분 동안 CytoChex 고정 시약 (BD)을 사용하여 고정하고, 빙-냉각된 PBS로 3회 세척하였다. 유동 바이러스 노출 및 고정, 세포를 인 트랜스 동종 억제 검정 (in trans allo inhibition assay)에 사용하였다. 동종이계 CFSE-표지된 CD4+ T-세포를 비노출된 DC + 증가수의 RSV-노출된 DC 또는 Flu 노출된 DC (고정 또는 비고정)와 함께 공동배양하였다. 공동배양 6일 후, CD4+ T-세포 증식을 유동 세포측정으로 평가하였다.
도 3d는 도 1에 기술된 바와 같이 제조된 DC를 나타내나. 증가수의 바이러스적으로 또는 약리학적으로 조작된 DC를 mDC/CD4+ T-세포 공동배양물에 가하였다. CD4+ T-세포 증식을 상술된 바와 같이 평가하였다.
도 3e는 flu 또는 RSV (MOI=1)와 함께 또는 바이러스 없이 (대조군) 24시간 배양되고 수거된 혈액 mDC를 나타낸다. 대조군 mDC (바이러스 비노출)은 증가 농도의 flu 또는 RSV-노출된 DC의 존재 하에서 5.0 ug/ml 항-F 단백질 항체와 함께 또는 이 항체 없이 항온배양되고, 일정 농도의 1,250 대조군 mDC/100,000 CD4+ T-세포로 CFSE-표지된 동종이계 CD4+ T-세포와 함께 공동배양되었다. 6일 후, 세포를 CD4 발현에 대해 염색하고, 증식을 CFSE 염료 희석으로 평가하였다.
도 4a는 본 발명의 방법을 이용하여 분리되고 Flu 또는 RSV (MOI=1)와 함께 배양된 mDC를 나타낸다. 24시간 후, 세포를 CD40, CD83, CD86, 및 CD80에 대해 염색하고, 유동 세포측정으로 분석하였다. 분홍색 히스토그램은 동일 마커에 대해 염색된 비노출 mDC를 나타낸다. 녹색 히스토그램은 RSV와 함께 배양된 mDC를 나타내고 청색 히스토그램은 인플루엔자와 함께 배양된 mDC를 나타낸다.
도 4b는, 16시간 동안 Flu 또는 RSV (MOI=1.0)에 노출 또는 비노출한 후, RNA 추출하고, 표지한 후, U133 2 플러스 칩 (Affymetrix)에 하이브리드화된, mDC (3 공여자)의 결과를 나타낸다. 감별 분석은 Gene Spring 6.2 소프트웨어 패키지 (Silicon Genetics)를 사용하여 수행하였다. 15개 탐침의 발현 패턴이 flu 또는 RSV 노출 또는 비노출된 mDC로부터의 관용원성 DC와 연관된다.
도 4c는 Flu 또는 RSV에 18시간 동안 노출한 후 유동 세포측정으로 평가된 ITIM 수용체 및 리간드의 발현을 나타낸다.
도 4d는, 비노출 mDC와 비교하여, Flu 또는 RSV (MOI=1)에 18시간 동안 노출한 후의 mDC (3 공여자)에서 IFN 람다 및 IFN 알파 패밀리 구성원의 발현을 나타낸다.
도 4e는 도 1에 기술된 바와 같이 분리된 혈액 mDC로부터의 결과를 나타낸다. DC는 24시간 동안 37℃에서 비처리 (대조군), Flu (MOI=1)로 처리, RSV (MOI=1)로 처리, 또는 IFN-알파 ((500 pg/ml), 및 INF-람다 및 IL-29 (1 또는 5 ng/ml)로 처리되었다. 이어서, 동종이계 CFSE-표지된 CD4+ T-세포는 6일 동안 37℃에서 각 처리의 DC와 함께 공동배양되었다. 사이토킨 처리된 DC의 경우, IFN-람다, IFN-알파 및 IL-29 농도는 T-세포 공동배양 동안 유지되었다. 공동배양 6일 후, CD4+ T-세포 증식을 유동 세포측정 (상단 패널)로 평가하였다. 재조합 IFN-람다 및 IL-29의 생물활성을 노출된 GM-CSF/IL-4 단핵구 유도된 DC에서 STAT-1 인산화를 모니터링함으써 평가하였다. 단핵구 유도된 DC를 각각 0, 10, 30 및 60분 동안 5 ng/ml IFN-람다 및 IL-29에 노출하였다. 이어서, STAT-1 인산화 (P-STAT1) 정도를, 총 STAT-1 단백질과 비교하여, 전체 새포 용해물에서 웨스턴 블롯으로 평가하였다. 500 pg/ml IFN-알파로 60분 동안 처리된 단핵구 유도된 DC가 STAT-1 인산화에 대한 양성 대조군으로 사용되었다 (하단 패널).
도 5a는 18시간 동안 1 MOI의 Flu 또는 RSV에 노출된 mDC로부터의 결과를 나타낸다. 세포 배양 상청액을 IL-10 루미넥스 멀티플렉스 분석 (Luminex Multiplex Analysis)을 이용하여 발현에 대해 분석하였다. 자료는 11개의 독립적 연구에 대한 평균 및 SD를 나타낸다.
도 5b는 바이러스 노출 30분 전 (패널 2) 또는 RSV 노출 18시간 후 (패널 4) 이소타입 대조군 (패널 1 및 3) 또는 IL-10 및 IL-10 수용체에 대한 차단 항체 (패널 2 및 4)와 함께 항온배양된 mDC로부터의 결과를 나타낸다. 이어서, CD4+ T-세포 동종 증식을 유도하는 이들 세포의 능력을 평가하였다 (n=4).
CFSE 표지된 동종이계 CD4+ T-세포를 비노출, flu 또는 RSV 노출된 mDC와 함께 항온배양하였다.
도 6a는, 각 조건으로부터의 제1 및 제2 세대 CD4+ T-세포군 (CFSE high)이 DC 공동배양 5일 후 세포 분류에 의해 분리되었다는 것을 나타낸다. 이어서, 비노출, flu 또는 RSV 노출된 mDC 공동배양물로부터 분류된 1,500 CD4+ T-세포를 1,250 비노출 mDC 및 500,000 표지된 CD4+ T-세포로 이루어진 MLR에 첨가하였다. 이어서, CD4+ T-세포 동종 증식을 유도하는 비노출된 DC의 능력을 평가하였다.
도 6b 및 도 6c는 3개의 독립적 연구로부터의 자료를 나타낸다.
도 6d는 연구 과정의 도식을 나타낸다.
본 발명의 다양한 양태의 구성 및 이용이 하기에서 상세히 논의되지만, 본 발명은 매우 다양한 특정 상황에서 구체화될 수 있는 많은 적용가능한 창의적인 발상을 제공할 것이라는 것을 알아야 한다. 본원에서 논의되는 구체적인 양상은 단지 본 발명을 구성하고 이용하기 위한 구체적인 방식을 설명하고자 하는 것으로서 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 발명의 이해를 쉽게 하기 위해서, 다수의 용어가 하기에서 정의된다. 본원에서 사용된 용어는 본 발명의 관련 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. '하나'와 같은 용어는 단지 단독의 실체를 언급하고자 하는 것이 아니며, 구체적인 예가 설명을 위해 사용될 수 있는 일반적 부류를 포함한다. 본원에서의 전문용어는 본 발명의 구체적 양태를 설명하기 위해 사용되는 것으로서, 이의 사용이, 특허청구범위에서 개요되는 바를 제외하고는, 본 발명을 제한하지 않는다.
호흡기 합포체 바이러스 (Respiratory Syncytial Virus: RSV) 감염은 탄생 첫해의 입원에 대한 주요 원인이다. 본 발명자는 영아에서의 자연 감염 과정 동안 RSV가 수지상 세포 (dendritic cell: DC)의 항원 제시 기능을 차단한다는 것을 제시한다. RSV 노출된 사람 DC는 미감작 (naive) CD4+ T-세포를 활성화시킬 수 없으며, IL-10을 분비하고, 억제 분자인 PDL-1, ILT-4, 및 HLA-G를 발현한다. RSV 노출된 DC는 혼합 백혈구 반응에서 세포 접촉 의존적 기작에 의해 동종이계 (allogenic) T-세포 증식을 억제한다. 또한, RSV 노출된 DC와 함께 공동배양된 미감작 T-세포는 조절 T-세포 기능을 수득한다. RSV가 관용원성 (tolerogenic) 표현형 및 기능을 위한 DC 성숙을 벗어나게 (skewing) 함으로써 항바이러스 면역을 억제한다는 것이 밝혀졌다.
일본쇄 RNA 파라믹소바이러스인 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)는 전세계의 영아 및 어린 아동에서 선두적인 호흡기 병원체이다. RSV 감염은 어린이가 동일한 스트레인의 바이러스로 재감염될 수 있는 바와 같이1 불완전 면역을 이끌며, 면역적격 성인은 재발성 RSV 감염을 경험한다2 -4. RSV와 관련된 심각한 및 장기 이환률 때문에 효과적인 백신이 매우 필요하다. 불행하게도, 백신 개발의 초기 시도는 RSV의 이례적인 제시를 제안하는 RSV에 대한 감작화 대신에 적응 면역계에 대한 것이었다5 -7.
수지상 세포 (DC)는 적응 면역 반응의 전개 및 분극화를 이끄는 주요한 항원 제시 세포 (APC)이다8. 이들 세포는 또한 바이러스 감염 도피 기작의 주요 표적물이다9 ,10. DC는 일차적 면역 반응을 유도하고 T-세포 무반응 (anergy)과 조절 T-세포의 생성을 통해 면역 관용을 조절하는 독특한 능력을 갖는다11. 초기에는 미성숙 DC의 독점적 범위로 이론화되었지만12, 최근 연구에서는 부분적으로 또는 심지어 전체 성숙 DC가 생체내애서 면역 관용을 유도하는 중추적 역할을 할 수 있다고 보고되고 있다1 3 -18. RSV에 대한 예방적 면역 반응을 개시하는 면역적격 개체의 제한된 능력 때문에, 실제 바이러스 감염 동안 APC의 상태를 조사하고 DC의 RSV 감염에 대한 반응을 분석하게 되었다2 ,4.
혼합 백혈구 반응. PBMC를 급성 RSV 감염을 갖는 소아 및 건강한 성인 공여자로부터 밀도 원심분리에 의해 분리하였다. 건강한 "반응자"로부터의 PBMC는 CFSE로 표지되었으며, RSV 환자 또는 건강한 공여자로부터의 다양한 농도의 "자극자" 조사된 PBMC와 함께 500k/ml의 농도로 6일 동안 배양하였다. 반응자 PBMC 배양물에서 CD4+ T-세포 증식을 자극하는 RSV 환자 대 비-감염된 공여자로부터의 PBMC의 능력을 0:500k, 125:500k, 250:500k, 및 500:500k의 자극자:반응자 PBMC 비율에서 측정하였다. 건강한 반응자 PBMC에서의 CD4+ T-세포의 증식을 RSV 감염된 개체 또는 건강한 개체로부터의 조사된 PBMC와 6일의 공동배양 후 유동 세포측정 (CFSE 염료 희석)에 의해 평가하였다.
기도 mDC. 코 세척 샘플을 급성 RSV 또는 인플루엔자 감염을 갖는 입원 어린이로부터 코인두 흡인에 의해 수득하였다. 이들 샘플로부터의 세포를 LINEAGE-FITC (항-CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, 및 CD56을 포함한 FITC-접합된 항체의 칵테일), CD123-PE, HLA-DR-PerCP, 및 CD11c-APC (BD Biosciences, San Jose, CA)로 표지하였다. 이어서, mDC를 FACS ARIA에서 직접적 분류에 의해 LINEAGE-음성, HLA-DR+, CD11c+ 세포로서 분리하였다.
혈액 mDC. 백혈구-농축 혈액 샘플을 지방 혈액 은행으로부터 구입하였다. PBMC를 Ficoll 구배 (밀도 원심분리)를 이용하여 수득하였다. 이어서, PBMC를 항-CD3, 항-CD14, 항-CD16, 항-CD19, 및 항-CD56에 접합된 자석 마이크로비드와 함께 항온배양한 후, 자성 컬럼 상에 통과시켰다. 음성 분획을 수집하고, LINEAGE-FITC, CD123-PE, HLA-DR-PerCP, 및 CD11c-APC에 대해 염색하였다. 이어서, 염색된 세포를 FACS ARIA 세포 분류기 상에서 분류하였다. mDC를 LINEAGEneg, HLA-DR+, CD11c+ 세포라 정의하였다. 분리된 mDC의 순도는 평균 97%였다.
유동 세포측정 분석을 위한 세포 염색. PBMC 또는 정제된 mDC를 4℃에서 30분 동안 5μl의 플루오로크롬-접합된 항-사람 항체와 함께 항온배양하고, PBS로 세정한 후, 5분 동안 1200 rpm으로 원심분리시키고, 1% 파라포름알데하이드에 재현탁시켰다. 이어서, 샘플을 FACSCalibur 또는 FACS ARIA에서 수득하고, Cellquest 소프트웨어 (BD Biosciences, San Jose, CA) 또는 FloJo 소프트웨어 (Tree Star Inc., Ashland, OR)로 분석하였다. 하기 플루오로크롬-접합된 항-사람 항체가 사용되었다: (정제된 mDC 연구에 대해) CD83-FITC, HLA-DR-Per-CP, CD86-Alexa-405, CD80-FITC, 및 CD40-PE 및 (PBMC 연구에 대해) CD8PE, CD3-PerCP, 및 CD4-APC.
CFSE 염색. 세포를 10분 동안 1.25 μM 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스테르 (CFSE) 중 1 내지 5x106 세포/0.5 ml의 농도로 항온배양하고, 5분 동안 1200 rpm에서 원심분리한 후, 4℃에서 1 ml의 RPMI 1640/10% 사람 AB 혈청 용액으로 세척하였다. 원심분리 및 세척 단계를 2회 반복한 후, 세포를 1640 RPMI/10% 사람 AB 혈청과 함께 재현탁하였다. 세포 증식을 염색된 CD4+ T-세포 상에서 CFSE의 염료 희석을 모니터링함으로써 평가하였다. 일부 연구에서, CFSE는 1회 또는 2회 분열되었던 T-세포군을 확인하는데 사용되었다. 이어서, 이들 세포군을 분류하고, 본원에 기술된 T-세포 증식 검정에 사용하였다.
바이러스 증식의 정량. RSV 복제를 조직 배양 감염 용량 (tissue culture infectious dose: TCID50)으로 평가하였다. TCID50은 접종된 감수성 HeLa 세포 배양물의 50%가 감염되는 검정 샘플의 희석으로 정의된다. 간단히 설명하면, TCID50 값: -m = log10 출발 희석 -[p-0.5] x d (여기서, m은 log10 TCID50 (반복 배양물당 접종된 단위 용적당)이고, d는 log10 희석 계수이며, p는 바이러스 감염에 대해 양성인 웰의 비율이다).
mDC의 시험관내 바이러스 노출. 정제된 혈액 mDC를 18 내지 24시간 동안 25,000 mDC/200 μl의 농도로 96-웰 플레이트에서 인플루엔자 A 바이러스 (A/PR/8/34 H1N1, 공급처: Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA) 또는 RSV A2 (HeLa 세포에서 생성되고, 슈크로즈 구배를 통해 정제됨)와 함께 1의 감염 다중성 (MOI)으로 배양하였다.
관용원성 DC의 제조. PBMC를 Ficoll-Hypaque 원심분리에 의해 사람 말초 혈액으로부터 정제하였다. 단핵구를 부착에 의해 정제하고, GM-CSF 및 IL-4 (DC GM+IL-4) 또는 GM-CSF 및 IL-10 (100ng/ml, R&D) (DC GM+IL-10) 또는 GM-CSF 및 비타민 D3 (100nM, Calbiochem)) (DC GM+Vit D3)의 존재 하에서 6일 후 moDC로 분화시켰다. 6일에, DC를 세척하고, GM-CSF 또는 GM-CSF 및 덱사메타손 (10nM, Sigma-Aldrich) 또는 GM-CSF 및 비타민 D3의 존재 하에 2일 동안 재배양하였다. DC를 2회 세척하고, 2500 DC를 5일 동안 5% AB 배지에서 96-웰 U-바닥에서 105 동종이계 T 림프구와 함께 배양하였다 (삼중). 1 uCi [3H]-티미딘을 배양의 마지막 18시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 Tomtec Harvester 96에서 수거하고, 증식을 Wallac MicroBeta TriLux-u-Scintillant Counter (PerkinElmer, Wellesly, MA, USA)에서 검출하였다.
RSV 감염된 환자로부터의 APC는 동종이계 T-세포를 활성화시키지 않는다. 항원 제시 능력의 측정으로서, RSV로 급성 감염된 환자로부터의 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 CFSE 염료의 희석을 평가함으로써 동종이계 CD4+ T-세포 (혼합된 백혈구 반응 또는 MLR)를 촉진시키는 능력에 대해 시험하였다. 도 1a에 도시된 바와 같이, 급성 RSV 감염을 겪는 환자로부터의 PBMC (적색선)는 2명의 건강한 개체로부터의 CD4+ T-세포의 증식을 촉진하지 못하였다. 이러한 CD4+ T-세포는 건강한 개체로부터의 PBMC에 노출되는 경우 (녹색선 및 청색선) 증식할 수 있었다. RSV 복제는 주로 상부 기도에서 일어나므로, 본 발명자는 급성 감염된 RSV 환자의 코 점막으로부터 DC를 분리하였다. 정제된 DC는 동종이계 CD4+ T-세포 증식을 촉진할 수 없었다 (도 1b 중간 패널)19. 이와는 대조적으로, 인플루엔자 환자의 점막으로부터 분리된 mDC (CD11c+ HLA-DR high)는 동종이계 T-세포의 강력한 자극자였다 (도 1b, 좌측 패널). 이는 RSV로 감염된 6명의 환자 및 인플루엔자로 감염된 3명의 환자로부터 분리된 세포에서 관측되었다 (p<0.05) (도 1b, 우측 패널). RSV 감염을 해결한 지 1 개월 후에 이들 환자들로부터 분리된 mDC는 동종반응성 (alloreactivity)를 유도할 수 있었으며, 이는 RSV의 APC 기능에 대한 차단 효과가 일시적이라는 것을 제시한다 (자료 제시되지 않음). 따라서, 급성 RSV 감염을 겪는 환자로부터의 DC를 포함한 항원 제시 세포는 효과적으로 동종항원을 제시하지 않는다.
RSV에 노출된 혈액 mDC는 동종반응을 유도하지 못한다. RSV가 DC의 항원 제시 능력을 변형시키는 기작을 이해하기 위해서 일련의 시험관내 연구를 수행하였다. 세포 분류에 의해 말초 혈액으로부터 분리된 사람 mDC (CD11c (+) HLA-DR (+) LIN)를 18시간 동안 인플루엔자 (Flu) 또는 호흡기 합포체 바이러스 (RSV)에 노출시켰다. RSV 노출된 DC (RSV-DC)는 CSFE 표지된 동종이계 CD4+ T-세포의 증식을 촉진시킬 수 없었으나, Flu 노출된 DC는 비노출된 DC보다 효과적이었다 (도 2a). 증식의 결여는, 바이러스 노출된 CD4+ T-세포가 항-CD3/28에 대한 반응에서 증식하였으므로, RSV 유도된 T 세포 때문이 아니었다 (도 2d). mDC 노출 전 UV 조사는 동종이계 T 세포 자극을 차단하는 점에서 바이러스를 불활성화시켰으며, 이는 바이러스 복제 또는 비구조 단백질 합성에 필요하다는 것을 나타낸다 (도 2b). 감염성 입자 생성의 분석 결과, RSV는 일차적 사람 DC에서 복제하지 않는다는 것을 나타내었다 (도 2e). 일차적 mDC의 생존성은 노출된 세포와 비처리된 세포간에 동등하였으므로, RSV의 억제 효과는 세포 사멸 때문이 아니었다. 시험관내에서 생성된 GM-CSF/IL-4 단핵구에 대한 RSV의 영향에 대해 대립되는 보고가 있다20 ,21. 일차적 사람 mDC와는 달리, RSV에 노출된 단핵구 유도된 DC의 큰 분획은 24시간 내에 사멸한다 (도 2f).
조절 기능을 갖는 DC가 GMCSF 및 IL-4의 존재 하에서 단핵구 전구체로부터의 분화 동안 약리학적 조작에 의해 시험관내에서 생성될 수 있다는 것이 보고되었다. RSV 노출된 DC 및 단핵구 유도된 DC의 조절 활성을 비교하기 위해서, 본 발명자는 GM-CSF 및 덱사메타손22 ,23, IL-1024 1알파,15-디하이드록시비타민-D(3) (VitD3)25 또는 이의 배합물의 존재 하에서 후자를 생성하였으며, 이들을 동종이계 CD4+ T-세포를 자극하는데 사용하였다. 이들 세포 제제 각각은, CD14 고수준 (high) 및 DC-SIGN 양성 (positive)이었던 GM-CSF IL-10 배양된 DC를 제외하고는 (자료 제시되지 않음), CD11c, MHC 제II형 및 만노즈 수용체 (CD206) 및 저수준의 CD14를 포함하는 DC 분화의 표현형 마커를 나타내었다. 이들 약리학적으로 조작된 DC는, GM-CSF 및 IL-4로 생성된 DC와 비교하여, MLR 유도시 덜 효과적이었다. 그러나, 모든 경우에서 이들 DC는, RSV-DC와 비교하여, 상당히 높은 MLR을 유도하였다 (도 2c).
RSV DC는 MLR의 강력한 억제자이다. 관용원성 T 세포를 자극하는 RSV DC의 무능력에 기인하여, 본 발명자는 RSV 노출된 mDC가 비노출된 mDC에 의한 T-세포 동종증식의 촉진을 억제할 수 있다고 간주하였다. 따라서, 공여자 A로부터의 증가수의 RSV 또는 flu 노출된 mDC를 공여자 A로부터의 1,250 비노출된 mDC 및 공여자 B로부터의 100,000 표지된 CD4+ T-세포로 이루어진 MLR에 가하였다. 도 3a 패널 1 및 2 (청색선)에 도시되는 바와 같이, 25 내지 50과 같이 적은 RSV 노출된 mDC가 85%의 초과로 비노출된 mDC 유도된 동종반응을 억제하였으며 (패널 3, n=5 p<0.05), 이에 반해 Flu 노출된 DC는 효과가 없었다 (도 3a 패널 1, 적색선. 흥미롭게도, RSV 감염된 DC는 DC와 비관련된 공여자로부터의 T-세포 사이의 MLR을 차단할 수 있었다 (자료 제시되지 않음). 이러한 억제는 바이러스 노출된 mDC에 의존적이었으며, RSV 융합 단백질 (F)에 대한 차단 항체의 첨가가 RSV-DC의 억제 능력을 막을 수 없었으므로 (도 3e), 배양 시스템에 RSV를 끌어들이는 것 때문이 아니었다. RSV-DC에 의해 유도된 MLR의 억제는, 0.3 um 트랜스웰의 상단 챔버에 첨가된 RSV-DC가 하단 웰에서의 동종증식 반응을 억제하지 않았으므로, 직접적인 세포 대 세포 접촉을 필요로 하였다 (도 3b, 청색선 대 녹색선). 또한, RSV-DC는 파라포름알데하이드 고정 후 이들의 억제 능력을 보유하였다 (도 3c). 약리학적으로 생성된 관용원성 DC 중 단지 VitD3 및 VitD3 덱사메타손 분화된 DC만이 인 트랜스 (in trans) 동종반응을 억제할 수 있었으며, 이들의 억제 능력은 RSV-DC보다 훨씬 덜하였다 (도 3d). 따라서, RSV DC는, 동종반응 억제에 의해 측정 시, 가장 강력한 면역원성 DC이다.
RSV DC는 독특한 표현형을 나타낸다. 보다 초기의 연구는 관용원성 DC가 저수준의 공동자극 분자 CD80 및 CD86을 발현한다고 기술하였다12 ,22,23,25. 이와는 대조적으로, RSV-DC는 고수준의 CD80 및 CD86을 발현하였다 (도 4a). CD40의 수준은 Flu-DC보다 RSV-DC에 대해 일관되게 높았으며, 반면에 CD83의 수준은 Flu-DC에서 보다 높았다 (도 4a). 이러한 결과는 RSV 노출 후 관측된 mDC의 기능에 대한 선택적 억제가 공동자극을 제공하는 능력을 차단하기 때문이 아니라는 것을 나타낸다. DC에 대한 바이러스 노출의 효과를 더욱 이해하기 위해서, 본 발명자는 RSV 또는 Flu에 16시간 동안 노출된 mDC의 RNA 전사물 프로필을 분석하였다 (도 4b). RSV 특이적 유전자 발현 프로필에 대한 놀라운 특징은 억제 기능과 연관된 분자의 상향 조절이었다. 이들 분자는 2개의 주요 부류, ITIM 함유 억제 수용체 및 다운 스트림 전환 (transducing) 분자로 나뉘었다. 억제성 제I형 면역수용체인 ILT4, ILT5 및 ILT6이 DC의 관용원성 기능과 연관되었다26 ,27. ITIM 함유 수용체인 LAIR1 및 LAIR2는 DC 분화를 억제한다28. ITIM 함유 수용체 SLAMF1은 관용원성 DC 및 IL-10 처리된 단핵구에서 상향조절된다29 ,30. 사이토킨 시그널링의 억제자인 SOCS2는 DC 염증성 사이토킨 생성의 음성 조절자이다31. STAT3은 IL-10 시그널링의 매개자이며, 이의 활성화는 이의 많은 면역억제 특성에 필요하다32. 마찬가지로, 단백질 타이로신 포스파타제 PTPN2는 염증 시그널링에 대한 중요한 음성 조절자이다33. 후속해서 일부 ITIM 함유 억제 수용체 및 리간드의 발현이 RSV 노출 24시간 후 mDC의 표면에서 확인되었다 (도 4c). RSV-DC는 표면 PD-L1에 대한 상당히 증가된 발현을 나타내었다. PD-L1의 T-세포 인식은 IL-2 생성을 억제하고 자가 항원의 CD4+ T-세포 관용을 매개한다34 ,35. 또한, 수지상 세포에 대한 PD-L1의 개입은 DC IL-10 생성을 직접적으로 유도하는 것으로 밝혀졌다36 ,37. 흥미롭게도, RSV 노출은 ILT-4 및 이의 고친화성 리간드 HLA-G 모두의 발현을 유도하였다. 이들 분자 각각은 IL-10 유도성이며, 관용원성 수지상 세포 기능과 연관된다26 ,27,38,39.
자가분비 IL-10이 관용원성 전환에 필요하다. 시험관내에서 GMCSF/ IL-4 단핵구 유도된 DC의 RSV에의 노출이, IFN-알파, IFN-람다 및 IL-29를 포함한, 다수의 잠재적으로 억제성인 인자를 유도하는 것으로 보고되었다40. 그러나, 이들 인자는 일차적 사람 mDC에서는 RSV 노출에 반응하여 발현되지 않았다 (도 4d). 오히려, Flu는 IFN-알파, IFN-람다 및 IL-29의 강력한 유도자였으며, Flu-노출된 DC는 강력한 동종자극 능력을 보유하였다 (도 4d). 또한, 이들 인자의 동종 증식 검정에의 첨가는 CD4+ T-세포 증대를 억제하지 못했다 (도 4e). IL-10 전사 (도 4b) 및 분비 (도 5a)를 유도하는 RSV의 능력 (Flu는 아님) 때문에, 본 발명자는 이것이 mDC의 관용원성 전환에 수반되는 지의 여부를 조사하였다. 동종 증식 검정 동안 (IL-10 및 IL-10 수용체에 대한 항체로) IL-10 수용체 시그널링의 차단으로 동종이계 CD4+ T-세포를 증식시킬 수 없었다 (도 5b 패널 4). 그러나, 바이러스 노출 동안 IL-10 수용체 시그널링의 차단은 RSV-노출된 mDC의 동종 자극 능력을 부분적으로 회복할 수 있다 (도 5b 패널 2). 이들 결과는, mDC의 RSV 매개된 성숙 동안 자가분비 IL-10 생성이 관용원성 전환에 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다. 또한, 이들 결과는 mDC가 바이러스에 노출된 후에는 IL-10이 RSV-DC 동종-억제 효과에 그다지 중요하지 않다는 것을 나타낸다.
RSV 노출된 DC는 Treg를 유도한다. 비노출된 mDC에 의해 유도되는 동종이계 CD4+ T-세포 증식을 억제하는 소수의 RSV-노출된 mDC의 능력은 본 발명자로 하여금 이들이 조절 T-세포의 분화를 유도할 수 있다고 생각하게 하였다. 따라서, CFSE 표지된 동종이계 CD4+ T-세포를 비노출된 mDC, flu 또는 RSV 노출된 mDC와 함께 배양하였다. 조절 T-세포는 제한된 증식 능력을 갖는 것으로 보고되었기 때문에, 단지 1회 또는 2회 분열된 동종이계 CD4+ T-세포군을 DC 공동배양 5일 후 세포 분류에 의해 분리하였다41 ,42. 이어서, 비노출된 mDC, flu 또는 RSV 노출된 mDC 공동배양으로부터 분류된 1,500 CD4+ T-세포를 1,250 비노출된 mDC 및 500,000 표지된 CD4+ T-세포로 이루어진 MLR에 첨가하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, RSV 노출된 mDC로부터 유도된 T-세포는 그들 스스로 비노출된 mDC 유도된 동종반응을 억제한다. 이와는 대조적으로, 비노출 DC 또는 Flu 노출된 DC로부터 유도된 T-세포는 어떠한 억제 효과도 나타내지 않았다 (도 6). 따라서, RSV 노출된 DC는 조절 T-세포에 대한 강력한 유도자이다.
RSV와 DC의 상호작용에 대한 이들 연구로부터, 사람에서 RSV에 대한 적응 면역 반응이 비효과적이며 개체의 일생을 통해 반복 감염이 일어나는 이유를 설명할 수 있는 2가지 주요한 결론을 얻는다. 첫 번째로, RSV 감염은 천연 감염 동안 APC 기능을 차단한다. 급성 RSV 감염으로 혈액 APC에 대한 동종 항원 제시 능력에 심각한 결함이 생긴다. 마찬가지로, 감염 부위로부터 분리된 mDC도 동종증식 반응을 개시할 수 없다. 본 발명자에 의한 시험관내 연구는, 환자에서 관측된 면역 억제가 DC에 대한 RSV의 직접적 영향의 결과일 수 있다는 것을 입증한다.
이러한 연구로부터 유도되는 두 번째 주요 결론은, RSV가 DC로 하여금 강력한 관용원성 기능을 발달시키도록 유도한다는 것이다. 실제로, 아주 소수의 RSV-DC가 인 트랜스 동종증식 반응을 억제할 수 있다. 이러한 억제 기능은 이전에 기술된 약리학적으로 생성된 관용원성 수지상 세포보다 강력하다. 조절 T-세포를 유도하는 RSV-노출된 mDC의 능력은 이러한 억제 시그널을 증대시키는데 있어서 이들 세포의 역할을 지시한다. 실제로, RSV-DC 자체를 사용하는 것과 같이, RSV-DC에 노출되었던 극히 소수의 (1500) T-세포가 100,000 T-세포로 수행된 동족반응을 억제할 수 있다.
비록 다양한 억제 수용체 및 리간드가 RSV에 의해 상향조절되나, 관용원성 DC 억제의 기작은 여전히 확실하지 않다. 세포 대 세포 접촉의 필요성 및 고정된 세포의 억제 능력은 이러한 억제에서 IL-10 또는 IFN-람다와 같은 가용성 억제 인자의 직접적 역할을 배제한다. 관용원성 DC에 대한 RSV 매개된 유도가 RSV 특이적 면역의 비효과적인 생성을 설명할 수 있다. RSV는 자가분비 IL-10을 필요로 하는 기작을 통해 DC 성숙을 빗나가게 함으로써 관용원성 DC를 유도한다. 이어서, 이러한 DC는 조절 CD4+ T-세포의 분화를 유도할 수 있다. 면역 파괴에 대한 이러한 효과적인 기작은 RSV 백신 고안뿐만 아니라 자가-면역 질환 및 기관 이식과 같은 과다-면역 장애의 치료시에도 영향을 끼친다.
본원에서 논의되는 임의의 양태는 본 발명의 어떠한 방법, 키트, 시약 또는 조성물에 대해서도 수행될 수 있을 것이며, 역 또한 같다. 또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 특정 양태는 설명을 위한 것이지, 본 발명을 제한하고자 제시된 것이 아니라는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 주요 특징은 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서, 다양한 양태로 사용될 수 있다. 당업자는 통상적인 수준의 실험을 사용하여 본원에 기재된 구체적 방법과 등가적인 수많은 방법을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 본 발명의 범위에 속하며, 특허청구범위에 의해 보호되는 것으로 여겨진다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가의 기술 수준을 나타내는 것이다. 모든 간행물 및 특허 출원은, 개개의 간행물 또는 특허 출원 각각이 구체적으로, 개별적으로 참조로서 인용되는 것임을 나타내는 것과 같은 정도로 본원에 참조로 인용된 것이다.
특허청구범위 및/또는 명세서에서 "포함하는"이란 용어와 함께 사용된 부정관사는 "하나"를 의미할 수도 있으나, "하나 또는 이상", "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 의미일 수도 있다. 특허청구범위 중에 사용된 "또는"이란 용어는, 비록 본원이 단지 양자택일 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 지지하더라도, 명시적으로 양자택일을 말하거나, 양자택일이 상호 간에 배제되는 경우가 아닌 한, "및/또는"을 의미하기 위하여 사용된 것이다. 본원 전반에 걸쳐서, "약"이란 용어는, 수치 값이 당해 수치를 측정하기 위하여 사용되는 장치 및 방법에 대한 오차의 고유 편차 또는 연구 대상 중에 존재하는 편차를 포함한다는 것을 나타내기 위하여 사용된 것이다.
본 명세서 및 특허청구범위에 사용된, 용어들, "포함하는" (및 "포함한다"와 같은 "포함하는"의 모든 형태), "갖는" (및 "갖는다"와 같은 "갖는"의 모든 형태), 또는 "함유하는" (및 "함유한다"와 같은 "함유하는"의 모든 형태)는 포괄적이거나 개방적이며, 인용되지 않은 추가적 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본원에 사용된 "이의 조합"이란 용어는, 당해 용어에 선행하는 열거된 사항의 모든 순열 및 조합을 말하는 것이다. 예를 들면, "A, B, C, 또는 이의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC 중의 하나 이상을 포함하고자 하는 것이며, 만일 순서가 중요한 경우에는, BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC 또는 CAB을 또한 포함하고자 하는 것이다. 상기 예에서, 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복, 예를 들어 BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, 등을 함유하는 조합도 명백히 포함된다. 당업자는, 달리 명시되지 않는 한, 통상적으로, 모든 조합 중에 항목 또는 용어의 수에 제한이 없음을 이해할 것이다.
본원에 개시되고 청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본원에 개시된 내용에 근거하여 과도한 실험 없이 제조하고 실행할 수 있다. 비록 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위를 벗어나지 않으면서, 당해 조성물 및 방법, 및 본원에 기재된 조성물 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있다는 것은 당업자에게는 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 치환 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 의해 한정된 바와 같은 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 속하는 것으로 여겨진다.
참고문헌
Claims (23)
- 분리된 항원 제시 세포를 이를 감염시키기에 충분한 유효량의 호흡기 합포체 바이러스 (respiratory syncytial virus: RSV) 또는 이의 일부로 감염시키고;
CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 다를 RSV-감염된 항원 제시 세포와 접촉시켜, 상기 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 다를, 혼합 백혈구 반응에 의해 시험관내에서 측정시, 관용원성이 되게 함을 포함하여,
항원 제시 세포를 사용하여 면역관용을 유도하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 RSV-감염된 항원 제시 세포가 말초 혈액 단핵 세포, 미성숙 수지상 세포, 성숙 수지상 세포 또는 랑게르한스 세포인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RSV-감염된 항원 제시 세포가 1:1 내지 1:100의 관용원성 항원 제시 세포 대 T 세포의 비율로 관용원성인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RSV-감염된 세포가 상기 T 세포와의 접촉 전에 고정되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RSV-감염된 항원 제시 세포가 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RSV-감염된 항원 제시 세포가, Flu 감염된 항원 제시 세포와 비교하여, CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RSV-감염된 항원 제시 세포가 조절 T 세포의 증식을 유도하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RSV-감염된 항원 제시 세포가 IL-10을 분비하고, 비처리된 항원 제시 세포에 비해 증가된 SIGLEC-1, PDL-1, ILT-4, HLA-G, SLAM 및 LAIR 발현을 갖는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 RSV-감염된 항원 제시 세포가 비처리된 항원 제시 세포에 비해 증가된 IL-10, LAIR2, SOCS2, PTPN2, ILT-6, AQP9, PTX3 및 SLAMF1 유전자 발현을 갖는 방법.
- 수지상 세포를 유효량의 호흡기 합포체 바이러스로 감염시켜 IL-10 의존적 관용원성 면역 기능을 발달시키고, 이때 호흡기 합포체 바이러스는, 동종이형 CD4+ T-세포를 면역관용이 되게 하고 억제제 T-세포 증식을 일으키며 IL-10을 분비하고 억제 분자인 PDL-1, ILT-4 및 HLA-G를 발현하는 수지상 세포의 능력을 증가시키며, 감염 수지상 세포는 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low임을 포함하여,
수지상 세포를 면역관용이 되게 하는 방법. - 제10항에 있어서, 동종이형 CD4+ T-세포를 활성화시키는 수지상 세포의 능력의 억제가 수지상 세포간의 세포-대-세포 접촉을 필요로 하는 방법.
- 분리된 수지상 세포를 유효량의 호흡기 합포체 바이러스로 감염시켜 IL-10 의존적 관용원성 면역 기능을 발달시키고, 이때 호흡기 합포체 바이러스는, 환자에 재도입시, 동종이형 CD4+ T-세포를 활성화시키고 미감작 (naive) T-세포 조절 반응을 유도하며 IL-10을 분비하고 억제 분자인 PDL-1, IKT-4, 및 HLA-G를 발현하는 수지상 세포의 능력을 억제함을 포함하여,
피험자에서 수지상 세포의 항바이러스성 면역을 억제하는 방법. - 제12항에 있어서, 동종이형 CD4+ T-세포를 활성화시키는 수지상 세포의 능력의 억제가 수지상 세포간의 세포-대-세포 접촉을 필요로 하는 방법.
- CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low인 분리된 수지상 세포를 포함하는 관용원성 수지상 세포.
- 말초 혈액 단핵 세포를, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포 둘 다를, 혼합 백혈구 반응에 의해 시험관내에서 측정시, 관용원성이 되게 하기에 충분한 유효량의 호흡기 합포체 바이러스 또는 이의 일부로 감염시키는 방법에 의해 제조되는 관용원성 수지상 세포로서, CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low인, 관용원성 수지상 세포.
- T 세포를, CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low 중 하나 이상의 표면 발현을 유도하기에 충분한 양의 RSV 또는 이의 일부로 감염된 수지상 세포와 접촉시킴으로써, 관용원성 T 세포-매개된 면역 반응을 촉진하는 방법.
- 분리된 항원 제시 세포 (APC)를, 이를 감염시키고 세포 표면 마커 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low 중 하나 이상의 표면 발현을 유도하기에 충분한 양의 RSV와 함께 항온배양하고;
RSV-감염된 항원 제시 세포를, 혼합 백혈구 반응에 의해 시험관내에서 측정시 T 세포를 면역관용이 되게 하는 조건 하에서, T 세포와 접촉시킴을 포함하여,
무반응 (anergic) T 헬퍼 세포를 유도하는 방법. - 분리된 수지상 세포를, 세포 표면 마커 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low 의 세포 표면 발현을 유도하는 조건 하에서, 수지상 세포를 감염시키기에 충분한 양의 호흡기 합포체 바이러스와 함께 항온배양함을 포함하여,
분리된 관용원성 수지상 세포를 생성하는 방법. - RSV로 미리 감염되고 세포 표면 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low를 갖는 분리된 관용원성 수지상 세포를 포함하는, 포유동물 숙주에서 관용원성을 증진시키기 위한 키트.
- 항원 제시 세포 (APC)를 수지상 세포를 감염시키기에 충분한 양의 호흡기 합포체 바이러스로 감염시키고;
세포 표면 마커 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low를 발현시켜 관용원성 APC를 생성함을 포함하여,
관용원성 항원 제시 세포 (APC)를 생성하는 방법. - 포유동물 피험자에게 관용원성 항원 제시 세포 (APC)를 투여하고, 이때 RSV로 미리 감염되고 세포 표면 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low를 갖는 관용원성 수지상 세포를 자가면역 질환을 감소 또는 제거하거나 이의 발생 또는 재발을 방지하기에 유효한 양으로 투여함을 포함하여,
포유동물 피험자의 자가면역 질환을 치료하는 방법. - 제21항에 있어서, 상기 자가면역 질환이 인슐린-의존적 당뇨병, 다발성 경화증, 자가면역 뇌척수염, 류마티스 관절염, 자가면역 관절염, 중증근무력증, 갑상선염, 포도막망막염 (uveoretinitis), 하시모토 갑상선염 (Hashimoto's thyroiditis), 원발성 점액수종, 갑상선중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축위염, 애디슨 질환 (Addison's disease), 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군 (Goodpasture's syndrome), 심상성 천포창, 유사천포창, 건선 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구감소증, 원발성 담관경화증, 활성적 만성 간염, 잠복 경화증, 궤양성 결장염, 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome), 공피증, 베게너 육아종증, 폴리/피부근염, 원반상 홍반성 루푸스 또는 전신 홍반성 루푸스인 방법.
- 항원에 대한 면역 반응의 조절이 필요한 환자에게, 면역 반응을 조절하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에서, 분리된 면역관용유도 항원 제시 세포를 투여하고, 이때 항원-특이적 항원-제시 세포는, 항원-제시 세포가 T 세포를 관용이 되게 하기에 충분한 시간 동안 및 조건 하에서 항원-제시 세포를 RSV와 접촉시킴으로써 생성되고, 상기 면역관용유도 항원-제시 세포는 세포 표면 마커인 CD80high, CD86high, CD40high 및 CD83low를 발현시키는 것으로 특징지어지며, 상기 면역관용유도 항원 제시 세포는 1:5 내지 1:100의 면역관용유도 항원 제시 세포 대 T 세포의 비율로 관용원성임을 포함하여,
항원에 대한 면역 반응을 조절하는 방법.
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