KR20110027659A

KR20110027659A - 림프관의 안정화제

Info

Publication number: KR20110027659A
Application number: KR1020107025947A
Authority: KR
Inventors: 켄타로 카지야; 마사히로 오타
Original assignee: 가부시키가이샤 시세이도
Priority date: 2008-06-18
Filing date: 2009-06-17
Publication date: 2011-03-16
Also published as: EP2319537A1; CN102056630A; CN102813689A; EP2526955A1; JP4970594B2; KR20160032272A; EP2526955B1; ES2536418T3; TWI532490B; HK1152866A1; JP5221783B2; US20110091584A1; KR101784645B1; JP2012107041A; CN102813689B; TW201233402A; EP2319537B1; CN102056630B; EP2319537A4; TW201010740A

Abstract

Tie2 활성화제로 이루어진 림프관의 안정화제를 제공한다. Tie2 활성화제는, 바람직하게는 안지오포이에틴-1(Ang-1), 육계(Cinnamomum)속 식물의 추출물, 시베리아 인삼(Siberian Ginseng) 추출물 및 시린가레시놀로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다.

Description

림프관의 안정화제{STABILIZER FOR LYMPH VESSEL}

본 발명은 Tie2 활성화(인산화)제로 이루어진 림프관의 안정화제를 제공한다.

혈액은, 심장으로부터 보내져 모세혈관ㆍ정맥을 거쳐 심장으로 되돌아간다. 이 혈관계와는 별개로 조직액의 배수로를 형성하는 것이 림프관이다. 림프관은, 말초 조직에서 혈관으로부터 누출된 간질액, 단백질, 지방, 세포 등을 혈관계로 환류함으로써 혈액량을 일정하게 유지하여, 폐쇄 순환계를 유지한다. 피부에 존재하는 모세혈관에서는, 내피 세포의 외측을 기저막이 둘러싸고, 또한 주피 세포가 부착되어 있다. 한편, 모세 림프관에서는, 내피 세포의 밖에는 기저막이 거의 없고, 주피 세포의 부착도 없다. 이 구조가, 효율적으로 간질로부터 체액이나 세포를 도입하는 것에 도움이 되고 있다(비특허문헌 1). 지금까지, 티로시나제형 수용체 VEGFR(vascular endothelial growth factor receptor)-3이 림프관 내피 세포에 특이적으로 발현하는 것이 나타나고, 그 리간드인 VEGF-C 및 VEGF-D가 림프관의 신생을 유도하는 것이 나타났다. 또, VEGF-A는 림프관 내피 세포에 발현하는 VEGFR2를 통해 림프관 신생을 유도하고 있는 것이 분명해졌다(비특허문헌 2). 또한, 림프관의 기능에 관해서는 이하의 보고가 있다. VEGF-A를 발현하는 아데노 바이러스를 감염시킨 마우스의 귀에서는, 현저한 림프관 신생이 보였지만, 구조적인 이상과 함께, 콜로이달카본을 귀에 주입한 실험에서, 림프관의 회수 기능도 현저히 저해되어 있는 것이 분명해졌다(비특허문헌 3). 즉, 림프관의 기능에는 림프관 내피 세포가 적절하게 배치되어 뒷받침되어 있는 것이 필요하다고 생각된다. 이것을 우리는 "림프관의 안정화"로 정의한다.

피부에 대한 물리적 또는 화학적 자극은 혈관 신생이나 VEGF-A 등에 의한 혈관 투과성을 유도하고, 그 결과 조직액의 저류와 부종이 생긴다. 한편, 이러한 자극은 직접적으로 림프관의 신생ㆍ확장을 유도하는 것도 알려져 있다. 지금까지, 자외선 염증에 의해 림프관의 확장이 관측되고, 염료를 주입한 실험에서 림프관의 기능이 장해받고 있는 것이 분명해졌다. 혈관 확장에 따른 수분의 진피내로의 누출에 따라, 림프관은 확장하여 간질액을 회수하려 한다고 생각된다. 그러나, 림프관의 과잉 확장은 그 회수 기능을 역으로 저하시켜 부종을 지연한다고 생각되었다(비특허문헌 4). 즉, 조직간액의 신속한 회수에는, 림프관의 과잉 확장을 유도하지 않는 "림프관의 안정화"가 필요한다고 생각된다.

지금까지, 림프관의 기능 부전이 관여하는 병의 용태로는, 선천성 림프 부종과 함께, 필라리아, 수술, 악성 종양, 염증에 따른 이차성의 림프 부종이 알려져 있다. 선천성 림프 부종으로는 Milroy병, Meige병, lymphedema-distichiasis 증후군이 있다. Milroy병에서는 림프관의 무형성이나 저형성이 보고되어 있고, 한편 lymphedema-distichiasis 증후군에서는 림프관의 과형성이 보고되어 있다. 이러한 점에서도, 림프관의 신생뿐만 아니라 림프관의 안정화에 의해 회수 기능을 유지하는 것이 필요하다고 생각된다(비특허문헌 5).

비특허문헌 1 : 실험의학 Vol. 24, No. 18 (2006), pp. 133-138

비특허문헌 2 : Jussila L and Alitalo K, (2006) Vascular growth factors and lymphangiogenesis. Phisiol Rev 82:673-700

비특허문헌 3 : Nagy et al., (2002) Vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor induces lymphangiogenesis as well as angiogenesis. J Exp Med 196: 1497-1506

비특허문헌 4 : Kajiya K., Hirakawa S., and Detmar M., (2006) VEGF-A mediates UVB-induced impairment of lymphatic vessel function. Am J Pathol 169: 1496-1503

비특허문헌 5 : 실험의학 Vol. 24, No. 18 (2006), pp. 139-143

비특허문헌 6 : Kajiya K., et al., (2005) Hepatocyte growth factor promotes lymphatic vessel formation and function. EMBO J 24:2885-95

비특허문헌 7 : 실험의학 Vol. 20, No.8 (2002), pp. 52-57

본 발명의 과제는, 림프관의 안정화를 도모하여, 림프관의 회수 기능을 유지ㆍ항진하는 데 유효한 약제의 제공에 있다.

VEGF가 분자 클로닝된 것을 시초로 혈관 형성에 특이적으로 작용하는 인자로서 VEGF 패밀리와 안지오포이에틴(angiopoietin; Ang) 패밀리의 분자가 잇달아 확인되어 왔다. VEGF와 그 수용체는 맥관 형성이라고 불리는 혈관의 초기 발생으로부터 그 후의 혈관 신생에 이를 때까지 매우 광범위한 혈관 형성에 관여한다. 한편, Ang는 맥관 형성후, 혈관 내피 세포에 의한 발아, 분지, 감입, 퇴축 등의 세포 현상을 수반한 관강 형성에서 기능한다. Ang는 혈관 내피 세포에 발현하는 수용체형 티로신키나제 Tie(tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain)-2를 통하여, 혈관 내피 세포와, 주피 세포(페리사이트)나 혈관 평활근 세포와 같은 혈관벽 세포와의 접착을 제어하여, 혈관의 구조적 안정화에 기능하고 있는 것까지는 이해되지만(비특허문헌 7), Tie2와 림프관의 관계에 관해서는 충분하게 해명되어 있지는 않다.

본 발명자는 Ang-1과, 림프관 내피 세포에 발현하는 Tie2의 관계에 주목하여 조사한 결과, Ang-1이 Tie2의 활성화를 통해 림프관의 회수 기능을 촉진하는 것을 발견하여, 이하의 발명을 완성하기에 이르렀다:

(1) Tie2 활성화제로 이루어진 림프관의 안정화제.

(2) 상기 Tie2 활성화제가, 안지오포이에틴-1(Ang-1), 육계(Cinnamomum)속 식물의 추출물, 시베리아 인삼(Siberian Ginseng) 추출물 및 시린가레시놀로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 (1)의 림프관의 안정화제.

(3) 상기 추출물이 육계나무종 식물(Cinnamomum cassia Blume) 유래인 (2)의 림프관의 안정화제.

(4) 상기 추출물이 계지 또는 계피 유래인 (2)의 림프관의 안정화제.

(5) 상기 추출물이 물추출물인 (2)∼(4) 중 어느 하나의 림프관의 안정화제.

(6) (1)∼(5) 중 어느 하나의 림프관의 안정화제를 적용하는 것으로 이루어진, 부종을 개선 또는 예방하기 위한 미용학적 방법.

본 발명에 따른 림프관의 안정화제를 사용함으로써, 붓고 등의 개선ㆍ예방이 가능해진다.

도 1은 Ang-1에 의한 림프관에서의 회수 기능의 변화를 시감 판정 스코어에 의해 수치화한 도면.
도 2는 계피 추출물에 의한 Tie2 인산화의 결과를 나타낸다.
도 3은 시베리아 인삼 추출물에 의한 Tie2 인산화의 결과를 나타낸다.

Tie2의 활성화제는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 안지오포이에틴-1 등, Tie2를 활성화하는 활성을 갖는 것이 주지된 것이나, 육계(Cinnamomum)속 식물 유래의 추출물, 시베리아 인삼(Siberian Ginseng) 추출물 또는 시린가레시놀과 같은, 본 발명자가 그 활성을 갖는 것을 새롭게 발견한 것을 들 수 있다. 여기서 말하는 Tie2의 활성화란 Tie2를 인산화함으로써 그 활성체(인산화 Tie2)로 변환할 수 있는 능력을 말한다.

육계속은 녹나무목(Lauraceae), 녹나무과(Lauraceae)의 식물이고, 300 이상의 종이 존재하며, 예를 들어 육계나무(Cinnamomum cassia Blume), 녹나무(C. camphora), 환엽 육계(C. daphnoides), 시바(柴) 육계(C. doederleinii), 야부(藪) 육계(C. japonicum), 오가사와라야부(小笠原藪) 육계(C. pseudo-pedunculatum), 육계(C. sieboldii), 시바야부(柴藪) 육계 실론 육계(C. verum), 시나몬(C. zeylanicum)이 알려져 있다. 본 발명에서의 Tie2 활성화제로서 바람직하게는 계(Cinnamomum cassia Blume), 특히 계의 어린 가지인 계지(桂枝) 또는 계피(桂皮) 유래의 추출물이 사용된다. 계의 나무 껍질인 계피에서 유래하는 추출물은, 예를 들어 육모제의 유효 성분으로서 유용하다는 것은 알려져 있지만(일본 특허 공개 평 10-265350호 공보), 그것이 림프관의 안정화 활성을 갖는 것은 전혀 알려져 있지 않다.

시베리아 인삼(Siberian Ginseng) 추출물은 전통적으로 자양강장에 좋다고 한다. 취약, 극도의 피로, 집중력 저하 등의 정신ㆍ신체능력의 저하, 병후의 회복에 있어서 우수한 효능을 나타낸다. 미국에서는 다이어트 서플리먼트로서 사용되고 있다.

상기 추출물은 통상의 방법으로 얻을 수 있고, 예를 들어 그 기원이 되는 식물을 추출 용매와 함께 상온 또는 가열하여 침지 또는 가열 환류한 후 여과하고, 농축하여 얻을 수 있다. 추출 용매로는, 통상 추출에 이용되는 용매라면 임의로 이용할 수 있고, 예를 들어 수성 용매, 예를 들어 물, 생리식염수, 인산 완충액, 붕산 완충액, 또는 유기 용매, 예를 들어 에탄올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린 등의 알콜류, 함수 알콜류, 클로로포름, 디클로로에탄, 사염화탄소, 아세톤, 아세트산에틸, 헥산 등을, 각각 단독으로 또는 조합하여 이용할 수 있다. 바람직하게는, 용매로서 물이 사용된다. 상기 용매로 추출하여 얻어진 추출물을 그대로, 또는 예를 들어 동결 건조 등에 의해 농축한 엑기스를 사용할 수 있고, 또한 필요하다면 흡착법, 예를 들어 이온 교환 수지를 이용하여 불순물을 제거한 것이나, 다공성 폴리머(예를 들어 앰버라이트 XAD-2)의 컬럼으로 흡착시킨 후, 원하는 용매로 용출하고, 농축한 것도 사용할 수 있다.

시린가레시놀은 식물에 특유의 항산화 물질 리그난류 화합물이며, 고혈압증의 개선 효과나 피로리균 억제 효과를 갖기 때문에, 식품, 음료나 의약품에 이용되고 있다(예를 들어, 일본 특허 공개 평 8-268887호 공보, 일본 특허 공개 제2004-352652호 공보 등). 시린가레시놀은 이하의 화학 구조를 갖는다:

시린가레시놀은 공지의 화합물이며, 녹나무목(Laurales), 녹나무과(Lauraceae)의 계(Cinnamomum cassia Blume), 특히 그 어린 가지(계지) 또는 나무 껍질(계피)에 함유된다. 림프관의 안정화나 Tie2 활성화 등의 효과를 갖는 것등은 전혀 알려져 있지 않다. 시린가레시놀은 계지 또는 계피 등의 천연 기원으로부터 추출된 것이어도 좋고, 또는 합성된 것이라도 좋다.

시린가레시놀은 무기염 또는 유기염이어도 좋다. 염으로는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 무기염으로는, 염산염, 황산염, 인산염, 브롬화수소산염, 나트륨염, 칼륨염, 마그네슘염, 칼슘염, 암모늄염 등을 들 수 있다. 유기염으로는, 아세트산염, 젖산염, 말레산염, 푸마르산염, 타르타르산염, 시트르산염, 메탄술폰산염, p-톨루엔술폰산염, 트리에탄올아민염, 디에탄올아민염, 아미노산염 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 림프관 안정화제는 림프관의 구조의 불안정화를 원인으로 하는 림프액의 누출에 의한 여러가지 피부 질환, 예를 들어 부종(붓기)의 치료ㆍ예방에 유효한 의약품 또는 화장품으로서 이용할 수 있다. 부종에는, 예를 들어 자외선 조사, 필라리아, 수술, 악성 종양, 염증에 따른 이차성의 림프 부종이나, 선천성 림프 부종, 예를 들어 밀로이병(Milroy disease), 메이지병(Meige disease), 림프부종-이열첩모(lymphedema-distichiasis) 증후군이 있다.

본 발명에 따른 림프관 안정화제는 또한, 붓기나 아이백의 경감ㆍ예방을 위한 미용학적 방법에도 이용된다. 이 미용학적 방법은, 예를 들어 본 발명에 따른 림프관 안정화제를 붓기 등이 있는 부위에 적용하여, 그대로 방치하거나 또는 예를 들어 림프관이 흐르는 방향에 맞춰 맛사지 등을 하여, 림프관액의 흐름을 촉진하거나 하여 행할 수 있다. 이 방법의 적용 부위로는, 안면, 목, 수족 등, 전신의 모든 부위를 들 수 있다.

본 발명에 따른 림프관 안정화제는, 그 사용 목적에 맞춰 용량, 용법, 제형을 적절하게 결정하는 것이 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 림프관 안정화제의 투여 형태는 특별히 제한되는 것은 아니고, 경구, 비경구, 외용 등이어도 좋지만, 바람직하게는 외용제이다. 제형으로는, 예를 들어 연고, 크림, 유액, 로션, 팩, 목욕용제 등의 외용제, 주사제, 점적제 또는 좌제 등의 비경구 투여제, 또는 정제, 가루제, 캡슐제, 과립제, 엑기스제, 시럽제 등의 경구 투여제를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 림프관 안정화제에 관해, 기능성 식품 등으로서의 용도도 들 수 있다.

본 발명의 림프관 안정화제 중의 Tie2 활성화제의 배합량은, 용도에 따라서 적절하게 결정할 수 있지만, 일반적으로는 제의 총량중 0.0001∼20.0 몰%, 바람직하게는 0.0001∼10.0 몰%이다.

또, 본 발명의 림프관 안정화제에는, Tie2 활성화제 이외에, 예를 들어, 통상의 식품이나 의약품에 사용되는 부형제, 방습제, 방부제, 강화제, 증점제, 유화제, 산화방지제, 감미료, 산미료, 조미료, 착색료, 향료 등, 화장품 등에 통상 이용되는 미백제, 보습제, 유성 성분, 자외선 흡수제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말 성분, 색제, 수성 성분, 물, 각종 피부 영양제 등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다.

또한, 본 발명의 림프관 안정화제를 피부 외용제로서 사용하는 경우, 피부 외용제에 관용인 조제, 예를 들어 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속 봉쇄제, 카페인, 탄닌, 베라파밀, 트라넥삼산 및 그 유도체, 감초 추출물, 글라브리딘, 모과나무의 과실의 열수 추출물, 각종 생약, 아세트산 토코페롤, 글리시리진산 및 그 유도체 또는 그의 염 등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산 등의 미백제, 글루코오스, 프룩토오스, 만노오스, 자당, 트레할로오스 등의 당류, 레티노산, 레티놀, 아세트산레티놀, 팔미트산레티놀 등의 비타민 A류 등도 적절하게 배합할 수 있다.

실시예

다음으로, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 본 발명은 이에 의해 한정되지 않는다. 배합량은 질량%이다.

실험 방법

림프드레나쥐 분석

8주령 마우스의 귓바퀴부에 해밀턴 시린지(Hamilton, Reno, NV)로, 마우스 유래 안지오포이에틴-1(Ang-1) 유전자를 AdenoX 벡터에 삽입한 아데노 바이러스를 감염시켰다(1×10⁹ ifu/마우스). 컨트롤로서 AdenoX 벡터만을 삽입한 아데노 바이러스를 감염시켰다. 감염 4주후 귓바퀴부 말단으로부터, 1 ㎕의 콜로이드 카본 용액(Kamei Co., Ltd, Japan)을 해밀턴 시린지로 주입하여 림프의 흐름의 시간 경과에 따른 변화를 해석했다. 그 결과, Ang1 고발현 마우스의 귀에서는 림프관의 회수 기능이 촉진되는 것이 보였다(데이터는 나타내지 않음). 또, 림프관에서의 회수 기능의 변화는 시감 판정을 하여, 5단계로 수치화(5 : 잉크가 모두 림프관에 머문 상태, 1 : 잉크가 모두 회수되어 림프관에서 없어진 상태)하고 비교하여, 그 결과를 도 2에 나타낸다. 이 도면에서, Tie2의 활성화제인 Ang-1의 발현에 의해, 컨트롤과 비교하여, 림프관의 회수 기능이 현저한 항진이 보여, Tie2의 활성화에 의해 림프관의 안정화가 도모되는 것을 알 수 있다.

또, 마취에 의한 안락사후, 동시에 귀부위를 회수하여, 액체 질소 중에서 분쇄하고, 단백질을 Phosphosafe 추출 시약(Phosphosafe Extracton Reagent, Novagen, Madison, WI)으로 추출했다. 총단백량을 RC DC 단백질 분석 키트(RC DC Protein Assay Kit, BIO-RAD, Hercules, CA)로 정량하고, 이하와 같이 웨스턴 블로팅하여 검출했다. 등량의 총단백량을 15% 아크릴아미드겔(NPU-7.5L, ATTO, Japan)로 SDS-PAGE를 행하고, Ang-1의 단백질 발현은, Ang-1 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 이용하여, ECL 키트에 의해 발색시킴으로써 확인했다.

림프관 내피 세포의 웨스턴 블로팅

림프관 내피 세포는, 인간 신생아 포피로부터 CD31 양성 CD34 음성 CD45 음성 세포로서 단리했다(비특허문헌 6). 림프관 내피 세포는 첨가 인자를 더한 EBM-2(Cambrex; Verviers, Belgium)로 배양하고, 각종 약제(Ang-1, 계피 추출물, 시베리아 인삼 추출물 및 시린가레시놀) 존재하에 단백질을 Phosphosafe 추출 시약(Novagen, Madison, WI)으로 추출했다. 컨트롤로서 DMSO를 첨가한 세포도 조정했다.

계피 추출물 및 시린가레시놀은 이후에 나타내는 대로 하여 조제했다. 시베리아 인삼 추출물(아스크 약품)은 시베리아 인삼의 뿌리를 30% 에탄올로 추출한 것을 사용했다. 이 추출물에는 시린가레시놀을 1.01 질량% 함유되는 것이 HPLC에서 확인되었다. 이 추출물을 DMSO로 용해하여, 각 시험 시료로 했다. 총단백량을 RC DC 단백질 분석 키트(BIO-RAD, Hercules, CA)로 정량하고, 이하와 같이 웨스턴 블로팅하여 검출했다. 등량의 총단백량을 7.5% 아크릴아미드겔(NPU-7.5 L, ATTO, Japan)로 SDS-PAGE를 행하고, Tie2 및 인산화 Tie2의 단백질 발현은, Ang-1 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)를 이용하여, ECL 키트에 의해 발색했다. 도 2는 계피 추출물이 Ang-1과 동일하게 Tie2를 인산화, 즉 활성화하는 것을 나타낸다. 도 3은 시베리아 인삼 추출물이 Ang-1과 동일하게 Tie2를 인산화, 즉 활성화하는 것을 나타낸다. 시린가레시놀에 관해서도 데이터는 나타내지 않지만, Ang-1과 동일하게 Tie2를 활성하는 것이 확인되었다.

계지 열수 추출 건조 잔분의 조제

계지(Cinnamomum cassia Blume) 400.7 g에 물 2 L를 첨가하고, 3시간 가열 추출을 하여, 여과했다. 얻어진 잔사에 물 2 L를 첨가하고, 동일한 조작을 반복, 가열 추출을 2회 더 행했다. 얻어진 여과액을 동결 건조시켜, 39.7 g의 열수 추출 건조 잔분을 얻었다.

열수 추출 건조 잔분의 분획 및 단리

열수 추출 건조 잔분 31.0 g을 Sephadex LH-20(Amersham Pharmacia Biotech AB)를 이용하여 조분획을 행했다. 물 용출 획분(2.7 g), 50% 메탄올 용출 획분(8.5 g), 메탄올 용출 획분(4.9 g), 아세톤 용출 획분(0.5 g) 및 미용출 획분(7.4 g)을 얻었다. 메탄올 용출 획분에 관해 앰버라이트 XAD2(오르가노(주)) 컬럼에 의해 분획하고, 이어서 HPLC 분취(컬럼: Capcell Pak C18 AQ (주)시세이도 제조, 검출: UV 210 nm, 이동층: CH₃CN/H₂O 혼합계)에 의해 시린가레시놀(2.08 mg)을 단리했다.

Claims

Tie2(tyrosine kinase with Ig and EGF homology domain 2) 활성화제로 이루어진 림프관의 안정화제.
제1항에 있어서, 상기 Tie2 활성화제가, 안지오포이에틴-1(Ang-1), 육계(Cinnamomum)속 식물의 추출물, 시베리아 인삼(Siberian Ginseng) 추출물 및 시린가레시놀로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 림프관의 안정화제.
제2항에 있어서, 상기 추출물이 육계나무종 식물(Cinnamomum cassia Blume) 유래인 림프관의 안정화제.
제2항에 있어서, 상기 추출물이 계지 또는 계피 유래인 림프관의 안정화제.
제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물이 물 추출물인 림프관의 안정화제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 림프관의 안정화제를 적용하는 것으로 이루어진, 부종을 개선 또는 예방하기 위한 미용학적 방법.