KR20110016912A - 표적 뉴클레오티드 서열의 전기화학적 동정방법 - Google Patents

표적 뉴클레오티드 서열의 전기화학적 동정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 뉴클레오티드 서열의 전기화학적 동정방법 및 동정 어셈블리에 관한 것이다. 이 방법은 다음의 단계들: 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있는 생물학적 샘플의 공급 단계; 복제된 표적 뉴클레오티드 서열을 형성하기 위한, 유리 뉴클레오티드를 포함하는 활성 가능한 증폭 수단의 공급 단계; 복제 중에, 복제된 표적 서열을 형성하는 뉴클레오티드 사이에 삽입될 수 있는 산화-환원성 화합물의 공급 단계; 그리고 활성 가능한 증폭 수단을 활성화하고, 산화-환원성 화합물을 활성화하기 위해 전기장을 샘플에 적용하는 단계로 구성된다. 그러고 나서 상기 복제된 표적 서열은 삽입된 산화-환원성 화합물의 전기화학적 활성의 억제를 야기하고, 그리고 전류가 감소할 경우 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 존재 여부가 결정된다.

Description

표적 뉴클레오티드 서열의 전기화학적 동정방법{Method for Electrochemically Identifying Target Nucleotide Sequences}
본 발명은 표적 뉴클레오티드 서열의 전기화학적 동정방법 및 어셈블리(assembly)에 관한 것이다.
구상된 출원의 한 분야는 특히 박테리아 또는 바이러스, 그리고 좀 더 일반적으로는 어느 핵산을 함유할 수 있는 생물학적 샘플의 빠른 분석의 분야이다.
알려진 전기화학적 검출법은 이미 표적 핵산 서열의 입증을 가능하게 한다. 일부에선 예를 들어 PCR(중합효소 연쇄반응) 유형의 핵산 증폭법 및 순환 전압전류법 두 가지 모두를 사용한다. 이들 방법 중 하나에 따르면, 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열을 보이는 핵산을 함유하는 생물학적 샘플이 제공되고, 이 생물학적 샘플에 표적 서열의 뉴클레오티드 염기 중 적어도 하나를 산화시킬 수 있는 산화제가 첨가된다. 증폭 수단(amplication means)은 산화될 수 있는 뉴클레오티드 염기를 포함하는 유형의 뉴클레오티드를 포함하고, 물론 이 뉴클레오티드는 복제 핵산 서열을 생성하기 위해 증폭 프로세스를 실행하는 동안 소비될 예정이다. 이와 동시에, 또는 각각의 증폭 단계 후에, 전기장이 산화제와 산화될 수 있는 뉴클레오티드 염기의 반응을 일으키기 위해 상기 샘플에 적용되고, 그 결과 샘플을 통과하는 전류가 측정된다. PCT/FR2007/000373 문헌에 좀 더 구체적으로 기술된 이 방법에 따르면, 미리 정해진 표적 서열의 존재 여부 및 이것의 최초 양은, 증폭 과정 중에 전류가 감소할 때, 결정된다. 이것은 증폭 과정 중에, 증폭 수단인 유리 뉴클레오티드가 합성 핵산에 병합됨으로써, 그 수가 감소하기 때문이다. 산화제는 그러고 나서 점점 제한된 양의 유리 뉴클레오티드와만 반응할 수 있다. 결과적으로, 산화 반응에 기인한 전자 이동(electron transfer)이 점점 더 드물게 발생하고, 전류는 감소한다.
그러므로 이러한 방법은 어느 생물학적 샘플에서 주어진 핵산의 존재를 신속하게 검출 및 정량화하는 것을 가능하게 한다.
본 발명이 해결하려고 하는 발생 과제는 생물학적 샘플에 있는 표적 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출 가능하게 하는 또 다른 전기화학적 검출법을 제공하는 것뿐만 아니라 또한 표적 뉴클레오티드 서열의 특성을 동정하고 그 양을 정량화하는 것이다.
이 과제를 해결하려는 목적으로, 제1면에 따라, 본 발명은 표적 뉴클레오티드 서열을 전기화학적으로 동정하는 방법을 제안한다. 상기 방법은 미리 정해진 표적 뉴클레오티드를 함유할 수 있는 생물학적 샘플을 제공하는 동시에 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 복제 및 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 형성(formation)을 야기하기 위해 유리 뉴클레오티드를 함유하는 활성 가능한(activatable) 증폭 수단을 제공하는 유형이다. 이 방법에 따르면, 상기 뉴클레오티드와 반응할 수 있는 산화-환원성 화합물이 또한 제공되고, 상기 산화-환원성 화합물은 상기 생물학적 샘플과 접촉하게 된다. 그러면 상기 활성 가능한 증폭 수단이 활성화되고, 전기장이 상기 샘플에 적용되어 상기 산화-환원성 화합물을 활성화하고, 상기 샘플을 통과하는, 상기 산화-환원성 화합물의 전기화학적 활성을 대표하는 전류가 측정된다. 그러므로 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 존재는, 전류가 감소할 때, 결정된다. 본 발명에 따르면, 복제하는 동안, 상기 복제된 표적 서열을 형성하는 뉴클레오티드 사이에 삽입될 수 있는 산화-환원성 화합물이 제공되고, 상기 복제된 표적 서열은, 전류가 감소함에 의해, 상기 삽입된 산화-환원성 화합물의 전기화학적 활성의 억제를 야기한다.
활성 가능한 증폭 수단은, 유리 뉴클레오티드뿐만 아니라, 검출될 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 특이적이고 상보적인 올리고뉴클레오티드인 프라이머 및 중합효소를 포함한다. 게다가, 아래에 상세히 설명하는 대로, 전기장은, 전극을 상기 샘플에 접촉시키고 그리고 이들 전극 간에 전위차를 적용함에 의해, 상기 샘플에 적용된다.
그러므로 본 발명의 한 가지 특징은, 상기 선행기술 문헌의 사례와 같이, 샘플에 있는 유리 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 염기를 산화시키지 않고 복제된 표적 서열을 형성하는 뉴클레오티드 사이에 삽입될, 산화-환원성 화합물을 제공한다는 것이다.
바람직하게는, 상기 활성 가능한 증폭 수단은 연속적인 증폭 사이클에 따라 활성화되고, 각각의 증폭 사이클에서 상기 복제된 표적 서열은 듀플리케이트(duplicate)된다. 그러고 나서, 산화-환원성 화합물은 상기 복제된 표적 서열들을 형성하는 뉴클레오티드들 사이에 삽입되고, 적용된 전기장과 관련하여 그것의 산화-환원성 활성을 잃는다. 따라서, 증폭 사이클 과정에 걸쳐 측정되는 전기 신호가 감소된다.
그러면 전류 감소에 상응하는 증폭 사이클의 횟수는 유리하기는, 상기 샘플에서 상기 표적 뉴클레오티드 서열의 농도를 결정하기 위해, 기록된다. 이것은 측정된 신호의 감소가 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 양에 비례하기 때문이다. 이 비례로부터 상기 샘플에 애초에 존재했던 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 양을 추정하는 것이 가능하다. 그러므로 상기 활성 가능한 증폭 수단의 활성은 이와 같이 증폭 사이클의 정해진 횟수에 따라 반복되고, 전류가 감소될 때 상기 증폭 수단의 사이클의 횟수가, 샘플에서 상기 표적 뉴클레오티드 서열의 농도를 결정하기 위해, 기록된다. 구체적으로 보면, 생물학적 샘플에 함유된 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열이 많을수록, 전류 강도를 하강시키는 데 필요한 증폭 사이클의 횟수는 줄어든다. 반대로, 샘플에 함유된 미리 정해진 표적 서열이 적을수록, 증폭 사이클의 횟수는 늘어난다. 이런 식으로, 본 명세서의 나머지 부분에서 좀 더 상세히 기술되는 바대로, 이 방법은 또한 생물학적 샘플에 있는 미리 정해진 표적 서열의 농도의 정량화를 가능하게 한다.
용어 "산화-환원성 화합물"은 산화환원 화합물뿐만 아니라, 특정 조건 하에서 산화될 수 있고, 다른 조건 하에서 환원될 수 있는 화합물을 또한 의미하는 것임을 명시한다.
본 발명의 특히 유리한 한 구현예에 따르면, 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열이 증폭된 후, 상기의 사이에 놓인 산화-환원성 화합물의 방출을 야기하기 위해 상기 샘플에 또한 열 에너지가 제공되고, 동시에 상기 샘플을 통과하는 전류의 변화들을 기록하기 위해 상기 샘플에 전기장이 제공된다. 그러고 나서 기록되는 전류의 최대 변화에 상응하는 열 에너지 Q의 양은, 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 성질을 동정하기 위해 측정된다. 유리하기는, 상기 샘플의 온도의 점차적인 상승을 야기하기 위한 방법으로 상기 샘플에 열 에너지가 공급된다. 그러므로, 제공된 열 에너지의 함수로서, 또는 좀더 구체적으로, 주어진 범위에 걸친 온도의 함수로서 전류의 변화가 기록된다. 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 성질은 주어진 온도에서 전류의 최대 변화로부터 동정된다. 이것은, 증폭된 표적 서열의 성질에 따라, 주어진 온도에서의 전류의 최대 변화가 상기 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 특징이기 때문이다.
그러므로 샘플에 그리고, 결과적으로, 복제된 표적 뉴클레오티드 서열에 충분한 열 에너지가 공급될 때, 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 이중 가닥이 두 개의 단일 가닥으로 분리되고, 결과적으로 중간에 놓인 산화-환원성 화합물이 방출되어, 이어서 원래의 전기화학적 활성이 회복되는 경향이 있다. 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 이중 가닥은, 주어진 양의 열 에너지가 샘플에 주어질 때, 주어진 열 교란(thermal agitation) 동안, 즉, 주어진 온도에서, 서로 분리되고, 이어서 전극에서 생성된 전류를 수단으로 측정되는 산화-환원성 화합물의 방출은, 사실상 별개의 방식으로, 즉 좁은 온도 범위에 걸쳐 갑자기 발생한다.
유리하기는, 열 에너지는 상기 샘플에 상기 샘플의 온도를 예를 들어 40~98℃까지 점차로 증가시키는 방식으로 공급된다. 이 온도 범위에서, 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 이중 가닥은, 복제된 표적 서열의 각각의 뉴클레오티드 염기들이 상보적 방식으로 결합돼 있는 짝 지은 상태(paired state)로부터, 각각의 복제된 표적 서열이 결국 단일 가닥이 되는 해리된 상태로, 점진적으로 변할 것이다. 그렇기 때문에 이중 가닥 상태로부터 단일 가닥 상태로의 변화는 좁은 온도 범위 내에서 일어나고, 이는 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 성질의 특징인, 일반적으로 Tm으로 알려진 "해리(dissociation)" 온도로 특징 된다.
게다가, 상기 산화-환원성 화합물의 전기화학적 활성을 대표하는 전류는 바람직하게는 상기 샘플의 예정된 온도에서 측정되고, 이 온도에서 형성되었거나 형성되는 과정에 있는 다른 분자들은, 예를 들어 프라이머 다이머와 같은 산화-환원성 화합물을 억제하지 않는다. 유리하기는, 상기 예정된 온도는 예정된 양의 열 에너지 Q에 상응하는 상기 샘플의 온도보다 현저히 낮고, 그럼에도 상기 샘플의 온도에 가까워서, 이 높은 온도에서, 복제된 표적 뉴클레오티드 서열보다 크기가 작은 다른 모든 분자들은 탈혼성화(dehybridized)되는 반면, 복제된 표적 뉴클레오티드 서열은 온전히 유지된다. 이 방식에서, 다양한 프라이머 다이머에 의한 상기 산화-환원성 화합물의 방출로부터, 또는 이미 공급된 열 에너지가 해리를 가능하게 한, 더 작은 다른 분자들로부터 생성된 전류의 양은 측정된 전류로부터 차감된다.
바람직하기는, 전압-전류법이 전류 또는 전류의 상기 변화를 측정하고 기록하기 위해 사용된다. 이 동전위법(potentiodynamic method)은, 본 명세서의 나머지 부분에서 더 상세히 설명하는 바대로, 두 전극 사이에서, 시간 경과에 따라 변화하는 전위를 적용하고, 이어서 이로써 생기는 전류의 변화를 기록하는 것으로 구성된다. 바람직하기는, 구형파 전압-전류법이 사용된다. 물론 예를 들어 차등 펄스 전압-전류법, 선형 또는 순환 스캔 전압-전류법, 그 밖에 전류채취(sampled current) 전압-전류법 또는 교류 전압-전류법과 같은 다른 전기화학적 기법들이 잠재적으로 적용 가능하다.
특히 본 발명의 유리한 한 구현예에 따르면, 제공된 상기 산화-환원성 화합물은 전이 금속, 예를 들어 멘델레예프 주기율표의 VIIIA 열의 금속, 좀 더 구체적으로는 오시뮴의 착물이다. 게다가, 이 산화-환원성 화합물은 유리하게는 적어도 하나의 핵산-서열 삽입성 리간드를 가지고 있고, 이것은 예를 들어 복제된 표적 뉴클레오티드 서열들에 의해 형성된 짝 지은 가닥들 사이에 삽입될 수 있는 디피리도페나진 리간드이다.
게다가, 이 산화-환원성 화합물은 적어도 하나의 비피리딘 리간드를 갖고, 유리하기는 이런 유형의 리간드 두 개를 갖는다. 하나의 수반하는 디피리도페나진 리간드 또는 두 개의 수반되는 비피리딘 리간드를 갖는 오시뮴 착물은 본 명세서의 나머지 부분에서 더 상세히 기술될 것이다. 아울러, 일부 완전한 유기 산화-환원성 화합물이 또한 이롭게 사용될 수 있음이 관찰될 것이다; 예를 들어 메틸렌 블루의 경우가 그렇다.
본 발명의 바람직한 한 구현예에 따르면, 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 복제 및 핵산 이중 가닥 형태의 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 형성이 초래된다. 그러므로 상기 활성 가능 증폭 수단은 PCR 유형이다.
제2면에 따라, 본 발명은 표적 뉴클레오티드 서열의 전기화학적 동정을 위한 어셈블리를 제안한다. 상기 어셈블리는 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있는 생물학적 샘플을 수용하기 위한 수단 및 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 복제 및 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 형성을 야기하기 위한 유리 뉴클레오티드를 포함하는 활성 가능한 증폭 수단을 포함한다. 게다가, 이 어셈블리는 상기 뉴클레오티드와 반응할 수 있는 산화-환원성 화합물을 포함하고, 상기 산화-환원성 화합물은 상기 생물학적 샘플과 접촉하게 된다. 활성화 수단은 상기 활성 가능한 증폭 수단의 활성화를 가능하게 하고, 상기 산화-환원성 화합물을 활성화하기 위한 방식으로 상기 샘플에 전기장을 적용하는 것을 가능하게 하고, 동시에 측정 수단(measuring means)은 상기 샘플을 통해 흐르는, 상기 산화-환원성 화합물의 전기적 활성을 대표하는 전류를 측정하는 것을 가능하게 한다. 마지막으로, 결정 수단(determining means)은 전류가 감소할 경우, 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 존재를 결정하는 것을 가능하게 한다. 본 발명에 따라, 상기 산화-환원성 화합물은, 복제되는 동안 상기 복제된 표적 서열을 형성하는 뉴클레오티드 사이, 다시 말해, 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 이중 가닥에 삽입될 수 있는 화합물들로부터 선택되고, 상기 복제된 표적 서열들은 전류가 감소됨으로써 상기 삽입된 산화-환원성 화합물의 전기화학적 활성의 억제를 야기한다.
이에 더하여, 그리고 하나의 유리한 한 구현예에 따르면, 이 동정 어셈블리는, 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 존재 여부를 확인하기 위하여, 상기 삽입된 산화-환원성 화합물의 방출을 야기하기 위한 방법으로 상기 샘플에 열 에너지를 공급하는 수단과, 샘플에 접촉하게 된 전극들로 인해, 온도의 함수로서, 상기 샘플을 통하는 전류의 변화를 동시에 기록할 수 있는 방식으로 상기 샘플에 전기장을 적용하는 수단, 그리고 또한 기록되는 전류의 최대 변화에 상응하는 열 에너지의 양을 결정하는 수단을 포함한다. 이러한 수단들은, 기록된 전류의 최대 변화를 근거로, 검출될 표적 뉴클레오티드 서열의 존재의 특징인 분리 온도(Tm)를 결정한다. 본 발명에 따른 방법의 실현을 가능하게 하는 위에서 언급된 전기화학적 동정 어셈블리는 이후에 명세서에서 더 상세히 설명될 것이다. 특히, 각각의 증폭 사이클에서 상기 복제된 표적 서열을 듀플리케이트하기 위해 연속적인 증폭 사이클에 따라 상기 활성 가능한 증폭 수단을 유리하게 활성화할 수 있는 활성화 수단이 더욱 기재될 것이다. 게다가, 본 발명에 따른 동정 어셈블리는 상기 샘플에 있는 상기 표적 뉴클레오티드 서열의 농도를 결정하기 위한 방식으로 전류의 감소에 상응하는 증폭 사이클의 횟수를 기록하는 기록 수단을 포함한다.
또한, 본 발명의 다른 특이사항과 이점들은, 첨부된 도면을 참조하여 이후에 제공되는 본 발명의 특정 구현예의 설명에 의해 드러날 것이며, 이것으로 제한하려는 것은 아니다:
-도 1은 본 발명에 따른 전기화학적 동정 어셈블리의 개략적인 평면도이고;
-도 2a~2c는, 한 변형 구현예에 따른, 도 1에 표현된 동정 어셈블리의 한 구성요소의 개략적인 평면도이고;
-도 3a 및 3b는 도 1에서 표현된 동정 어셈블리를 사용하여 얻은 강도/전위 도표이고;
-도 3c는 도 3a 및 3b에서 나타낸 도표로부터 추정하여 얻은 도표이고;
-도 4는 도 3c의 도표와 유사한 유형의 도표이고;
-도 5a는 도 1과 첫 단계에서 표현된 증폭 어셈블리에 의해 얻은 강도/온도 도표를 나타내고;
-도 5b는 도 5a에서 나타낸 도표의 전위(transposition)에 의해 두 번째 단계에서 얻은 도표를 나타내고;
-도 6은 특정 응용에서 도 5b에 표현된 유형의 도표를 나타낸다.
본 발명에 따른 전기화학적 동정방법은, 한편으로는 우선 기술될 제어 및 측정 수단을 포함하고, 다른 한 편으로는 특이적 생물학적 및 화학적 구성성분들을 포함하는 전기화학적 동정 어셈블리의 사용을 필요로 한다. 그러므로 본 발명에 따른 전기화학적 동정 기구(10)를 도 1에 도식적으로 표현하였다. 도 1은 이후에 정의될 특징들을 갖는 생물학적 샘플을 내부에서 수용하는 데 적합한 두 개의 마이크로큐벳(microcuvette)(12와 14)를 나타낸다. 선행 기술에 의해 이미 잘 알려진 마이크로큐벳(12와 14)은, 각각 바닥들(16과 18)을 갖고 있고, 그 위에는 전극(20)과 대립 전극(22), 그리고 도표에 표현되지 않은 참조 전극이 존재하고, 이들 전극들은 예를 들어 스크린 프린트에 의해 얻어지고, 각각은 도선(26과 28)에 의해 전위기(potentiostat)(24)에 연결된다. 게다가, 이들은 이들을 지지하는 펠티에 효과(Pelletier-effect) 모듈(32)과 히팅캡(30) 사이에 놓이고, 이것은 발전기(34)에 연결된다. 이후에 설명하는 바와 같이, 펠티에 효과 모듈(32)은 정해진 열 에너지 양을 마이크로큐벳(12와 14)의 내용물에 전달하는 것을 가능하게 한다. 더불어, 발전기(34)와 전위기(24)는, 컴퓨터 프로그램 및 기록 수단을 갖는 마이크로컴퓨터 (36)에 의해 제어된다.
그러므로 이러한 마이크로큐벳(12와 14)은, 생물학적 샘플을 수용할 수 있는 수용 수단(receiving means)으로 이루어지고, 이 생물학적 샘플은 핵산 서열, 특히 DNA를 포함할 수 있고, 이것은 검출되어야 하는 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 게다가, 펠티에 효과 모듈(32), 그리고 마이크로컴퓨터(36)로 제어될 수 있는 발전기(34)는 활성 가능한 증폭 수단인 제1부, 생물학적 물질 및 화학적 화합물로 구성된 제2부로 이루어진다.
물론, 도시되지 않은 다른 잘 알려진 수용 수단은 생물학적 샘플이 놓이는 곳의 바닥으로 관입하는 튜브를 갖는다. 이어서 튜브에는 생물학적 샘플에 잠길 수 있고 전위기에 연결될 수 있는 전극이 장착된다. 이어서 이 튜브는, 미리 정해진 시간 주기에 따라 생물학적 샘플을 예정된 온도로 올리기 위한 열 순환기(thermocycler)에 설치될 예정이다. 도 2a~2c에 나타난 또 다른 수용 수단은 생물학적 샘플의 수용을 가능하게 한다. 이들은 작은 치수의 용기(11)와 예를 들어 도 2에서 나타낸, 예를 들면 1㎕~1㎖를 함유할 수 있는 튜브 캡 및 개방된 상층부(13)를 포함한다. 이것은 반응 혼합물의 수용이 가능하다. 이어서 세 개의 연결되지 않은 전극(17, 19 및 21)이 스크린 프린트되어 있는 필름(15)에 의해 용봉된다. 전극(17, 19 및 21)은 용기(11)의 내부를 향해 있고, 이들 전극은 거기서부터 용기의 테두리와 필름(15) 사이의 접촉지점에서 드러난다. 그런 다음, 필름(15)이 제공된 용기(11)는 이어서 펠티에-효과 모듈을 지탱할 수 있도록 뒤집고, 그 결과 애초에 용기(11)의 바닥에 있던 반응 혼합물이 상기 혼합물에 담긴 전극(17, 19 및 21)과 접촉하게 된다.
여기서 사용되는 증폭법은 "PCR" 법이다. 그러므로 펠리에-효과 모듈(32)로 인해, 마이크로큐벳(12와 14)의 내부는, 미리 정해진 시간의 기간 동안 그리고 다음의 프로토콜에 따라 미리 정해진 온도에 도달될 수 있다: 프로토콜은 중합효소의 유형에 따라 1~15분의 첫 단계로 시작하고, 여기서 마이크로큐벳(12와 14)의 내부는 94~95℃의 온도로 유지되고; 그런 다음, 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 검출을 위해 요구되는 증폭에 따른 온도의 특정 횟수의 연속적인 사이클, 전통적으로 10~50회의 사이클이, 각 사이클 당 4개의 연속 단계(일반적으로 94~95℃의 온도에서 1~60초 동안의 첫 번째 "변성" 단계; 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열에 특이한 프라이머를 특징으로 하는, 일반적으로 40~72℃의 온도에서 1~60초 동안의 두 번째 "프라이머 어닐링" 단계; 일반적으로 72℃에서 1~60도 동안의 세 번째 "신장(elongation)" 단계; 그리고 40~95℃의 온도에서 2~3초 동안 유지되는 마지막 단계)에 따라 마이크로큐벳(12와 14)에 적용되고, 이것은 전기화학적 측정에 필요한 시간에 의해 결정된다. 이러한 첫 번째 증폭-수단 부분을 실시하기 위한 조건은, 이후에, 특히 생물학적 물질과 화학적 화합물을 포함하는 두 번째 부분이 기술된 뒤 기술될 것이다.
본 발명의 목표 중 하나가 복제에 의해 핵산 서열을 증폭하고 증폭 과정 중에 매질에서의 핵산 서열의 존재를 전기화학적으로 측정하는 것이기 때문에, 무엇보다 우선 이 증폭을 가능하게 하는 생물학적 물질을 갖는 것이 바람직하다. PCR 기법을 실행하기 위해서, 증폭될 핵산과 중합효소, 한 쌍의 프라이머 그리고 4가지 유리 뉴클레오티드(DNA를 구성하는 dGTP(디옥시구아노신 삼인삼염), dATP(디옥시아데노신 삼인삼염), dTTP(디옥시싸이미딘 삼인산염) 및 dCTP(디옥시사이토신 삼인산염))를 접촉시키는 것이 바람직하다. 디옥시-디아자-구아노신 삼인산염처럼, 디옥시리보-뉴클레오티드 삼인산염 유형의 염기의 유사체가 또한 사용될 수 있다.
그러므로 본 출원의 첫 번째 실시예에 따르면, 검사할 생물학적 샘플 및 283개 염기쌍의 표적 핵산 서열을 함유하는 사이토메갈로 바이러스 DNA의 추출물뿐만 아니라, DNA 중합효소, 즉 효소와 프라이머 그리고 4가지 유형의 뉴클레오티드가 마이크로큐벳(12) 중 하나에 도입되고, 이들 전체는 물론 액체이고 완충된 반응 혼합물을 형성한다. 게다가, 전기 신호의 강도를 측정하기 위해, 산화-환원성 화합물이 이 반응 혼합물에 첨가되고, 상기 산화-환원성 화합물은, 이 경우에는, 오시뮴 착물: 비스(2,2'-비피리딘)디피리도[3,2-a:2',3'-c]페나진 오시뮴(II)이고, 이것의 CAS번호는 3555395-37-8이고, 본 발명의 경우에 이것은 [OsII(bpy)2DPPZ]2+ 이고, 화학식 I는 다음과 같다:
Figure pct00001
다른 산화-환원성 화합물이 구상 가능하고, 특히 오시뮴 대신 루테늄을 사용할 수 있다. 다른 리간드 역시 사용될 수 있다. 디피리도페나진 리간드의 이점은 표적 핵산 서열을 형성하는 뉴클레오티드 사이에 삽입될 수 있는 능력에 있다. 구상할 수 있는 다른 리간드로서, 예를 들어 DPPX:(7,8-(디메틸)디피리도[3,2-a:2,3-c]페나진); PTDB:(3-(피리딘-2-일)-5,6-디페닐-아스-트리아진); 또는 DPT:(3-(피라진-2-일)-아스-트리아지노[5,6-f]페난쓰렌; 또는 PHI(페난쓰렌퀴논 디이민)와 같이, 퀴논 작용기를 갖는 그 밖의 리간드가 언급된다.
DNA-사이에 삽입된 산화-환원성 유기 화합물은 또한 본 발명의 주제인 본 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 에티디움 브로마이드, 아크리딘 그리고 이들의 유도체, 아크리돈 유도체, 또는 그 밖의 페나진 유도체가 언급된다.
실험 및 제어의 목적으로, 검사할 생물학적 샘플을 제외하고 위에서 언급된 동일한 요소들이 다른 마이크로큐벳(14)에 도입된다. 한 예시적 구현예에 따라, 마이크로큐벳(12 및 14)에 도입된 다양한 요소들의 농도를 아래 표1에 나타내었다.
표 1
Figure pct00002
그러므로 두 개의 마이크로큐벳(12 및 14)에 담긴 반응 혼합물은, 펠티에-효과 모듈(32)로 인해, 마이크로컴퓨터 36에 의해 제어되어, 미리 정해진 시간의 기간 동안 여러 온도로 변화한다. 반응 혼합물은 일단 15분 동안 95℃의 온도로 유지되는 예비 단계 후, 반응 혼합물은 제1단계로 표적 핵산 서열이 탈혼성화되도록, 즉, 표적 핵산 서열의 상보적인 이중 가닥이 해리되도록, 30초 동안 94℃의 온도로 유지되고; 이어서, 제2단계로, 각 프라이머가 해리된 DNA 가닥에 혼성화되도록 60초 동안 53℃의 온도로 유지되고; 그러고 나서, 제3단계로, 중합효소가 상보적 가닥을 합성하고 그럼으로써 앰플리콘(amplicon)을 형성하고 여기에 포함된 복제된 표적 서열을 형성하도록 하기 위해 60초 동안 72℃의 온도로 유지된다. 마지막으로, 반응 혼합물은 제4단계로, 10초 동안 85℃의 온도로 유지되고, 이 시간 동안 전위기(24)의 사용은 마이크로컴퓨터(36)에 의해 제어된다.
앞서 정의된 본 출원의 첫 실시예에 따르면, 앞서 정의된 4가지 단계 및 10초라는 기간 동안, 산화-환원성 화합물의 표준 전위를 구성하는 전위 영역에서 강도/전위 곡선이 전위기(24)를 사용하여 구형파 전압-전류법에 의해 기록된다. 이와 같이 전위차가 전극(20) 및 대립 전극(22) 사이에 적용되고, 이 전위차는 구형파 프로파일에 따라 변한다. 동시에, 이들 전극을 통과하는 전류가 측정되고, 강도/전위 곡선이 피크의 형태로 얻어지고, 여기서 기준 값을 차감한 후 최대 전류 값은 용액에 존재하는 삽입되지 않은 산화-환원성 화합물의 농도를 대표한다.
무엇보다, 도 3a 및 3b이 참조 되고, 그런 다음 도 3c가 참조 된다. 구체적으로, 복제 사이클(31)이 마이크로큐벳(12 및 14)에 담긴 생물학적 샘플에 적용되었다. 도 3a는 조사 대상인 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 생물학적 샘플의 경우, 사이클의 함수로서 강도/전위 곡선의 변화를 나타내고, 도 3B는 표적 서열이 전혀 없는 반응 혼합물의 경우, 사이클의 함수로서 강도/전위 곡선의 변화를 표현한다. 도 3a에서, 곡선의 정점(33)이 현저히 감소하고, 즉 산화-환원성 화합물의 소비가 18번째 사이클(31)에서 시작되는 것이 주목할 만하고, 22번째 사이클에서 중간 높이(35)에 도달한다. 사이클(31)에서 곡선(37)은 사실상 평평해지고, 이 곡선의 정점은 초기 사이클들의 정점의 5% 미만의 강도 수치에 도달한다. 그러므로 산화-환원성 화합물은 형성된 이중-가닥 DNA 분자들에 병합되어 있다. 이것은 조사 대상인 표적 뉴클레오티드 서열이 생물학적 샘플에 실제로 존재했음을 의미한다.
반대로, 도 3b에서 가장 높이 올라간 곡선(39)은, 이전의 곡선과 비교할 때, 31번째 사이클 때까지 실질적으로 일정한 값을 유지하는데, 그것은 이 샘플의 경우에 조사 대상인 표적 뉴클레오티드 서열이 존재하지 않기 때문이다. 그럼에도,, 이것은 특히 반응 혼합물에서 프라이머 다이머의 형성 때문에 약간 감소한다.
그러므로 상기 방법에 대해 어떤 생물학적 샘플에서든 조사 대상인 표적 뉴클레오티드 서열의 존재가 빠르게 검출된다.
피크 전류 값은 이것을 첫 증폭 사이클 중, 즉 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 양이, 예를 들어 5번째 사이클에서, 측정된 피크 전류의 현저한 감소를 일으키기게 아직 충분하지 않을 때 얻은 피크 전류의 이동에 대해 보정된 평균값으로 나눔으로써, 표준화된다는 것이 관찰될 것이다.
각각, 조사 대상인 생물학적 샘플과 복제를 계획 중인 생물학적 물질 그리고 또한 산화-환원성 화합물을 포함하는, 그리고 그와 달리 산화-환원성 화합물을 포함한 생물학적 물질만 포함하는 마이크로큐벳(12 및 14)에 대해, 위에서 언급한 2개의 일련의 곡선들로부터 발췌한 곡선들을 나타내고 그리고 실시된 사이클의 횟수의 함수로서 표준화된 피크 전류의 값을 나타내는 도 3c가 참조 될 것이다.
그러므로, 최대 25번째 사이클까지, 두 개의 마이크로큐벳(12 및 14)의 반응 혼합물을 통과하는 전류의 값은 대략 유사하고, 비교적 일정하다. 반면에, 25번째 사이클부터 30번째 이상의 사이클에서는, 조사 대상인 생물학적 샘플을 포함하고 있는 마이크로큐벳(12)을 통과하는 전류 값이, 미리 정해진 표적 핵산 서열이 전혀 없는 다른 마이크로큐벳(14)을 통과하는 전류와 비교하여, 급격히 떨어진다는 것이 관찰되었다. εc 함수(c는 사이클 번호이고 ε는 2에 가까운 증폭 강도다)에 따르면, 이와 같은 급격하고 기하급수적인 전류의 감소는 프라이머가 특이적인 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 증폭 및 그로 인한 복제된 표적 서열의 생성을 증명한다. 구체적으로, 복제된 표적 핵산 서열 분자의 생성은, 상기 화합물이 복제된 핵산 서열의 형성된 이중 가닥 사이에 삽입을 통해, 위에서 언급된 산화-환원성 화합물의 비활성화를 야기한다. 이와 같이 비활성화된 산화-환원성 화합물은 더 이상 전극( 20 및 22)의 표면과 전하를 교환할 수 없고, 결과적으로 더 이상 전기화학적으로 검출될 수 없다. 이것은 전기 신호의 감소를 가져오고, 이것은 이어서 조사된 생물학적 샘플에서, 특이적 프라이머의 사용에 의한 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 형성을 알려준다.
전류는 프라이머 다이머 및/또는 구체적으로는 증폭되지 않은 다른 DNA 서열의 "해리" 온도보다 높은 온도에서 기록된다. 측정이 수행되는 온도의 선택은 거짓-양성 및 진짜-양성 샘플을 구별하기 위한 필수적인 요소이다.
게다가, 이제 도 4에 나타낸 그래프가 출원의 두 번째 실시예에 따라, 주어진 샘플에서 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 정량화 원칙을 기술하기 위해, 참조 될 것이다.
그래프의 x축(51)에 증폭 수단의 복제 사이클 번호가 있고, y축(53)에 도 3a에서 설명된 구현예에 따른 각각의 사이클에서 기록된 최대 전류의 표준화 값이 있다.
도 4의 그래프에는 우측에서부터 좌측으로 9개의 보정 곡선(70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84 및 86)이 표시되어 있고, 이들 곡선은 서로 대략 평행하고 수직에 가까운 방향으로 중간 부분을 나타낸다. 이러한 곡선들은 각각, 9개 곡선 중 첫 번째 곡선(70)의 경우 사이토메갈로바이러스 게놈에 함유된 표적 서열의 103개의 카피, 그리고 아홉 번째 곡선(86)의 경우 1011개의 카피를 포함하는 생물학적 샘플로부터 시작하여 얻은 다양한 플롯들에 상응한다. 첫 번째 곡선(70)부터 마지막 곡선(86)까지, 다음 곡선의 경우, 카피 수는 10배씩 증가한다.
그러므로 생물학적 샘플에 함유된 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 양이 많을수록, 전극을 통과하는 전류가 사이클의 횟수의 함수로서 더 일찍 감소한다는 것을 기록한다. 이것은 출발 시 샘플에 함유된 미리 정해진 표적 서열과 병합하는 핵산이 많을수록, 복제에 의해 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열과 등량을 생성하기 위해 필요한 사이클의 횟수가 적어지고, 결과적으로 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 이중 가닥 사이에 산화-환원성 화합물이 삽입됨으로 인한 전류의 감소가 더 일찍 발생하기 때문이다. 이런 식으로, 샘플을 통과하는 전류의 양이 하강하는 시점의 사이클의 횟수를 결정함으로써 표적 서열과 병합하는 핵산의 양을 측정하는 것이 가능함을 알 수 있다. 게다가, 도 4의 첫 번째 곡선(70)은 표적 서열의 존재가 초기에 상기 표적 서열이 샘플에 오로지 1000개의 카피가 존재할 때에도 여전히 검출가능하다는 것을 나타낸다.
애초에 미리 정해진 표적 핵산 서열의 농도를 갖는 추출물을 이와 같이 검사했고, 이것의 곡선(88)은 표적 서열의 104개의 카피에 상응하는 두 번째 보정 곡선(72)을 따라 점선처럼 보인다.
그러므로 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있는 생물학적 샘플에 적용된 본 발명에 따른 방법은 이중-가닥 DNA 사이에 삽입된 산화-환원성 시약의 증폭 및 전기화학적 측정 방법을 실시함으로써, 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 존재 여부를 밝힐 수 있을 뿐만 아니라, 선행 기술에 따른 다른 전기화학적 방법에 비해 개선된 신호 진폭과 복제 능력 및 민감성으로 표적 서열을 정량화할 수 있다. 이 방법은 이중 가닥을 형성하는 핵산 서열의 사이에 삽입되는 시약의 산화-환원 특성을 이용하는데, 이 방법은 종래의 증폭법에서 표적 핵산 서열의 존재 여부를 밝히기 위해 전혀 사용되지 않았다.
검출법의 개선을 목표로, 특히 증폭된 표적 서열의 동정의 특이성의 관점에서, 삽입된 산화-환원성 화합물을 방출하기 위해 샘플의 온도를 점진적으로 증가시킴으로써, 증폭 마지막에, 모든 복제된 표적 서열의 점진적 탈혼성화가 초래된다. 그러면 이 산화-환원성 화합물이 다시 전기화학적으로 검출가능해지기 때문에, 방출된 산화-환원성 화합물의 양을 대표하고 결과적으로는 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 성질 및 그로 인해 길이를 나타내는 전기 신호를 한 번 더 전극에 공급할 수 있다.
이러한 탈혼성화는 DNA 분자를 적절한 온도 간격에 따라, 모든 이중 가닥이 쌍을 이루는 온도, 즉 약 40℃로부터 모든 이중 가닥이 해리되는 온도, 즉 약 98℃까지 점진적으로 가열함으로써 수행되고, 위에서 언급된 펠티에-효과 모듈(32)은 이를 위해 바람직한 수단을 구성한다. 사실 후자는 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 탈혼성화를 일으키고, 결과적으로 상기 삽입된 산화-환원성 화합물의 방출을 야기하기 위해, 도 1에 표현된 마이크로큐벳(12 및 14)에 함유된 반응 혼합물에 열에너지를 공급하는 것을 가능하게 한다. 게다가, 전위기(24)에 의해 그리고 마이크로컴퓨터(36)를 써서, 전극(20) 및 대립 전극(22) 사이에 전위차가 적용되고, 이 전위차는 위에서 언급된 구형파 프로파일에 따라 변한다. 이들 전극을 통과하는 전류가 측정되고, 이런 식으로 피크 전류가 결정된다.
그러므로 펠티에-효과 모듈(32)에 의해, 반응 혼합물의 온도는, 예를 들어 70~95℃까지 1℃씩 증가한다. 이와 동시에, 반응 혼합물의 온도가 1℃ 증가하자마자, 전극(20 및 22) 사이에 전위차가 적용되고, 위에서 언급된 전압-전류법에 따라 이들 전극을 통과하는 전류가 측정된다.
이제 본 출원의 세 번째 실시예에 따라, 하나는 조사 대상인 표적 뉴클레오티드 서열과 함께 반응 혼합물을 함유하고, 다른 하나는 이 표적 서열 없이 반응 혼합물만 함유하는 두 개의 마이크로큐벳(12 및 14)에 대해, 온도의 함수로서 얻은 피크 전류의 도표를 나타내는 도 5a를 참조할 것이다.
이렇게 해서 얻은 더 낮은 곡선(40)은 표적 뉴클레오티드 서열 및, 결과적으로는 다량의 복제된 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 반응 혼합물에 상응한다. 그러므로 70~88℃에서의 반응 혼합물의 온도 상승이 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자에 어떤 영향도 미치지 않음이 관찰된다. 반면에 88~92℃에서, 피크 전류는 7배 증가한다. 그런데 이 피크 전류는 방출된 산화-환원성 화합물의 양, 그리고 결과적으로 이 경우에 염기쌍이 283개인, 미리 정해진 표적 핵산 서열의 성질 및 그로 인한 길이에 비례한다.
미리 정해진 표적 핵산 서열이 전혀 없는 반응 혼합물에 상응하는 상위 곡선(42)의 경우, 측정된 전기 신호가 70~85℃에서 두 배 증가하는 것이 관찰될 것이다. 이것은 프라이머 다이머가 비특이적으로 합성되고 미리 정해진 표적 핵산 서열보다 작은 다른 이중 가닥 사이에 삽입된 결과이다.
조사 대상인 표적 뉴클레오티드 서열을 조명하는 것은, 도 5a에 표현된 곡선의 각각이 점을 이 점에서의 유도체의 값으로 전이할 때, 더 많은 증거를 제공한다. 이런 식으로, 도 5b에 표현된 융합 곡선이 얻어진다.
그러므로 표적 서열을 포함하는 반응 혼합물에 상응하는 낮은 곡선(40)은 90℃의 온도에서 의미 있는 피크(46)를 갖는 전형적인 곡선(44)으로 전환된다. 물론, 이 의미 있는 피크(46)는 낮은 곡선(40)의 경우, 도 5a에서 관찰되는 피크 전류의 갑작스러운 변화에 해당한다. 이 의미 있는 피크(46)는 이것이 나타난 온도를 통해 미리 정해진 표적 서열의 성질 그리고 그로 인한 길이를 나타낸다. 구체적으로, 조사 대상인 표적 서열이 대부분 길면 길수록, 등량의 앰플리콘의 경우 상당히 분명한 것이지만, 앰플리콘에 포함된 산화-환원성 화합물의 양이 많아진다. 그러므로 산화-환원성 화합물의 분자를 방출하기 위해서, 미리 정해진 표적 서열에 의해 형성된 이중 가닥을 탈혼성화하는 데 더 많은 열에너지를 제공할 필요가 있을 것이다. 따라서, 이 탈혼성화가 발생하는 온도는 훨씬 더 높을 것이다. 게다가, 앰플리콘에 포함된 산화-환원성 화합물이 분자량이 더 크므로, 이것이 일단 방출되고 나면, 기록되는 전기 신호 또한 그에 따라 더 많아질 것이다.
결과적으로, 본래 길이가 긴 조사 대상 표적 뉴클레오티드 서열이 많을수록, 의미 있는 피크(46)는 더 높아지고 이것은 고온 쪽으로 더욱 이동된다.
반면에 도 5a에 표현된 상위 곡선(42)과 관련하여, 도 5b에 표현된 유도된 곡선(48)으로의 전환은 75~80℃의 온도에서 넓은 피크(50)를 보여준다. 이 넓은 피크(50)는 프라이머 다이머 및 비특이적으로 합성되고 미리 정해진 표적 핵산 서열보다 작은 다른 이중 가닥의 탈혼성화에 아주 단순히 상응하고, 이 탈혼성화는 이어서 산화-환원 화합물의 방출을 야기한다. 이 넓은 피크(50)는 의미 있는 피크(46)의 온도보다 낮은 온도에서 나타나고 그리고 훨씬 분산되어 있음이 관찰될 것이다.
본 출원의 네 번째 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 동정방법에 의해 동일한 생물학적 샘플에서 적어도 두 개의 다른 표적 뉴클레오티드 서열의 존재를 검출할 수 있음이 나타난다.
그러기 위해서, 도 1에 도시된 동정 어셈블리가 아주 명확히 사용되고, 위에서 기술된 출원의 실시예들에 따라 세 차례 연속 측정이 실시된다. 이 경우, 동일한 생물학적 샘플에서, 표적 뉴클레오티드 서열의 크기가 100개 염기쌍인 박테리아, 아크로모박터 자일로속시단(achromobacter xylosoxidans), 및 표적 뉴클레오티드 서열의 크기가 283개 염색쌍으로 이전에 사용된 인간 사이토메갈로바이러스의 존재를 동정할 수 있음을 보이는 것이 관건이다. 제1차 연속 측정은 인간 사이토메갈로바이러스에 상응하고, 위에서 기술된 조건과 동일한 조건 하에서 실시된다. 제2차 연속 측정은 정확히 박테리아 아크로모박터 자일로속시단에 상응하고, 따라서 증폭 물질은 그에 상응하는 표적 서열에 특이적인 프라이머를 포함한다. 아울러, 제3차 연속 측정은 인간 사이토메갈로바이러스와 박테리아 아크로모박터 자일로속시단의 혼합물에 상응하고, 따라서 이 경우의 증폭 물질은 혼합물 중의 상응하는 두 개의 특이적 프라이머를 포함한다.
그러고 나서, 세 차례 연속 측정에 대한 융합 곡선이 본 출원의 세 번째 실시예에 따라 생성된다.
그렇게 얻은 세 개의 곡선을 도 6에 나타내었고, 더 분명히 하기 위해, 이들 곡선이 y축을 따라 서로에 대해 이동되어 있다. 그러므로 인간 사이토메갈로바이러스와 관련되고, 도 5b에 나타낸 전형적인 곡선(44)에 상응하는 첫 번째 곡선(50)이 도 6에서 발견된다. 그러므로 첫 번째 의미 있는 피크 52는 90℃에 상당하는 온도 값에서 발견된다. 또한, 박테리아 아크로모박터 자일로속시단과 관련되고, 제2차 연속 측정에 상응하는 융합 곡선(54)은 약 85℃의 온도 값에서 두 번째 의미 있는 피크(56)를 특징으로 한다.
또한, 마지막으로, 제3차 연속 측정은 각각 90℃와 85℃에 상당하는 온도 값에서 세 번째 의미 있는 피크(60)와 네 번째 의미 있는 피크(62)를 나타내는 세 번째 곡선(58)을 가져온다. 이들 값은 박테리아 단독의 값과 인간 사이토메갈로바이러스 단독의 값에 정확히 상응한다.
본 발명에 따른 동정방법에 의해 동일한 생물학적 샘플에서 다수의 표적 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있는 가능성은 이와 같이 본 출원의 네 번째 실시예에 의해 증명된다.
비록 이 명세서에 제시되지는 않았으나 본 발명의 특히 유리한 한 구현예에 따르면, 서열에 확실한 차이를 가질 수 있는 표적 서열을 증폭하고, 위에서 정의된 대로, 융합 곡선에 의해 이러한 차이의 존재 여부를 동정하는 것이 가능함이 구상된다.

Claims (20)

  1. 표적 뉴클레오티드 서열의 전기화학적 동정방법으로, 상기 방법은 하기에 따른 유형이고:
    - 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있는 생물학적 샘플이 제공되고;
    - 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 복제 및 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 형성을 야기하기 위해 유리 뉴클레오티드를 포함하는 활성 가능한 증폭 수단이 제공되고;
    - 상기 뉴클레오티드와 반응할 수 있는 산화-환원성 화합물이 제공되고 그리고 상기 산화-환원성 화합물이 상기 생물학적 샘플과 접촉되고;
    - 상기 활성 가능한 증폭 수단이 활성화되고;
    - 전기장이 상기 산화-환원성 화합물을 활성화하기 위해 상기 샘플에 적용되고 상기 샘플을 통과하는, 상기 산화-환원성 화합물의 전기화학적 활성을 대표하는 전류가 측정되고; 그리고
    - 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 존재가, 전류가 감소하는 경우 결정되고;
    복제 중에 상기 복제된 표적 서열을 형성하는 뉴클레오티드 사이에 놓일 수 있는 산화-환원성 화합물이 제공되고, 상기 복제된 표적 서열은 전류의 감소로 인해, 상기 사이에 놓인 산화-환원성 화합물의 전기화학적 활성의 억제를 야기하는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 활성 가능한 증폭 수단이 연속적인 증폭 사이클에 따라 활성화되고, 각각의 증폭 사이클에서 상기 복제된 표적 서열이 듀플리케이트되는 것을 특징으로 하는 것인 동정방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 샘플에서 상기 표적 뉴클레오티드 서열의 농도를 결정하기 위해, 전류 감소에 상응하는 증폭 사이클의 회수가 기록되는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 단계를 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 동정방법:
    - 상기 샘플에 상기 삽입된 산화-환원성 화합물의 방출을 야기하기 위해 열 에너지가 공급되고, 전기장이 상기 샘플을 통과하는 전류의 변화를 동시에 기록하기 위해 상기 샘플에 적용되는 단계; 및
    - 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 성질을 동정하기 위해, 기록되는 전류의 최대 변동량에 상응하는 열 에너지량 Q를 측정하는 단계.
  5. 제4항에 있어서, 상기 샘플의 온도를 점진적으로 상승시키기 위해 상기 샘플에 열 에너지가 공급되는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  6. 제5항에 있어서, 온도의 점진적 상승이 40~98℃ 사이에서 일어나는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산화-환원성 화합물의 전기화학적 활성을 대표하는 전류가 상기 샘플의 미리 정해진 온도에서 측정되는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정해진 온도가 미리 정해진 열 에너지량 Q에 상응하는 상기 샘플의 온도보다 현저히 낮은 것을 특징으로 하는 동정방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 전압-전류법이 상기 전류를 측정하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  10. 제9항에 있어서, 구형파 전압-전류법이 사용되는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제공된 상기 산화-환원성 화합물이 전이금속의 착물인 것을 특징으로 하는 동정방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 산화-환원성 화합물이 최소한 한 개의 핵산-서열- 삽입성 리간드를 갖는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  13. 제11항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산화-환원성 화합물이 디피리도페나진 리간드를 갖는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산화-환원성 화합물이 최소한 한 개의 비피리딘 리간드를 갖는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 복제 및 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 핵산 이중 가닥 형태의 형성이 야기되는 것을 특징으로 하는 동정방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 가능한 증폭 수단이 PCR 유형인 것을 특징으로 하는 동정방법.
  17. 표적 뉴클레오티드 서열의 전기화학적 동정을 위한 어셈블리로, 상기 어셈블리는 다음을 포함하고:
    - 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있는 생물학적 샘플을 수용하기 위한 수단(12 및 14);
    - 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 복제 및 복제된 표적 뉴클레오티드 서열의 형성을 야기하기 위해 유리 뉴클레오티드를 포함하는 활성 가능한 증폭 수단;
    - 상기 뉴클레오티드와 반응할 수 있는 산화-환원성 화합물(상기 산화-환원성 화합물은 상기 생물학적 샘플과 접촉하게 된다);
    - 상기 활성 가능한 증폭 수단을 활성화하기 위한 활성화 수단(32, 34, 36)
    - 상기 산화-환원성 화합물을 활성화하기 위해 상기 샘플에 전기장을 적용하기 위한 수단(20, 22, 24, 26, 28, 36) 및 상기 샘플을 통과하는, 상기 산화-환원성 화합물의 전기화학적 활성을 대표하는 전류를 측정하기 위한 수단; 및
    -전류가 감소하는 경우, 상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 존재를 결정하기 위한 수단(24, 36); 그리고,
    상기 산화-환원성 화합물은 복제 중에 상기 복제된 표적 서열을 형성하는 뉴클레오티드 사이에 삽입될 수 있는 화합물로부터 선택되고, 상기 복제된 표적 서열은 전류의 감소에 의해 상기 삽입된 산화-환원성 화합물의 전기화학적 활성의 억제를 야기하는 것을 특징으로 하는 동정 어셈블리.
  18. 제17항에 있어서, 상기 활성화 수단(32, 34, 36)은, 각각의 증폭 사이클에서 상기 복제된 표적 서열을 듀플리케이트하기 위해, 연속 증폭 사이클에 따라 상기 활성화 가능 증폭 수단을 활성화하기에 적합한 것을 특징으로 하는 동정 어셈블리.
  19. 제18항에 있어서, 어셈블리는 또한 상기 샘플의 상기 표적 뉴클레오티드 서열의 농도를 결정하기 위해, 전류의 감소에 상응하는 증폭 사이클의 횟수를 기록하기 위한 기록 수단(36)을 포함하는 것을 특징으로 하는 동정 어셈블리.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 어셈블리는 다음을 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 동정 어셈블리:
    -상기 삽입된 산화-환원성 화합물의 방출을 야기하기 위해 상기 샘플에 열 에너지를 공급하기 위한 수단(32) 및 상기 샘플을 통과하는 전류의 변화를 동시에 기록하기 위해 전기장을 상기 샘플에 적용하기 위한 수단(20, 22, 24, 26, 28, 36); 그리고
    -상기 미리 정해진 표적 뉴클레오티드 서열의 성질을 동정하기 위해 기록되는 전류의 최대 변화에 상응하는 열 에너지량을 측정하기 위한 수단.
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