KR20110013726A - 열안정성 ＣｉＰ 변이체 단백질 - Google Patents
열안정성 ＣｉＰ 변이체 단백질 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20110013726A KR20110013726A KR1020090071330A KR20090071330A KR20110013726A KR 20110013726 A KR20110013726 A KR 20110013726A KR 1020090071330 A KR1020090071330 A KR 1020090071330A KR 20090071330 A KR20090071330 A KR 20090071330A KR 20110013726 A KR20110013726 A KR 20110013726A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- ser
- gly
- ala
- leu
- pro
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
- C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
- C12Y111/01007—Peroxidase (1.11.1.7), i.e. horseradish-peroxidase
Abstract
본 발명은 CiP(Coprinus cinereus peroxidase) 단백질의 이열성(thermolabile) 아미노산 잔기를 안정화시킴으로써 제조된 열안정성 CiP 변이체 단백질 및 이를 코딩하는 DNA에 관한 것이다. 본 발명의 CiP 변이체 단백질은 기존의 CiP 단백질에 비해 높은 열안정성을 나타내므로, 의료, 식품, 화학 등 단백질을 이용하는 각종 산업에 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 열안정성 CiP(Coprinus cinereus peroxidase) 변이체 단백질 및 이를 코딩하는 DNA에 관한 것이다.
천연 바이오 촉매는 화학 촉매 대비 1017배 이상의 높은 반응속도, 레지오(regio)- 및 스테레오(stereo)- 화학반응의 효과적인 조절, 및 환경 친화적인 메커니즘 및 산물 등과 같은 장점이 있다. 대부분의 산업 공정은 고온, 알칼리 또는 산성 조건 및 유기 용매와 같은 극도의 작업 환경에서 이루어진다. 특히, 산업적인 바이오 기술은 흔히 더 빠른 반응 속도, 용해도가 낮은 기질의 용해도 증가 및 오염 가능성의 감소를 위해 고온을 선호한다. 하지만, 고온은 효소의 불안정화 또는 불활성화를 유도할 수 있기 때문에, 천연 바이오 촉매는 산업적으로 좀처럼 이용되지 않는다. 따라서 산업 공정에서 단백질을 사용하는데 있어서의 상기와 같은 문제점을 극복하기 위해, 단백질 촉매의 열안정성을 증가시키기 위한 노력이 지속되어 왔다.
단백질 유연성(flexibility)은 단백질의 열안정성과 관련된 중요한 부정적 인자로 여겨지며, 많은 실험 및 분자 모델링 연구에서 단백질의 열안정성을 증가시키기 위해 유연성 영역을 돌연변이화할 수 있다고 보고되어 왔다(문헌[Vihinen M 등, Protein Engineering, 1987, 1:447-480] 참고). 유연성 잔기는 효소 촉매 작용, 리간드 결합, 단백질-단백질 상호작용과 같은 단백질의 촉매 활성에 중요한 역할을 하지만, 고온에 노출되면, 이들의 잠재적 가동 범위로 인해 이열성의 약점이 될 수 있으며, 이로 인해 단백질의 불안정화 또는 열적 불활성화를 야기할 수 있다.
한편, 코프리누스 시네레우스(Coprinus cinereus; 재먹물버섯)의 퍼옥시다제(peroxidase)인 CiP는 세척 사이클 동안 염색된 직물로부터 유출된 염료의 산화 및 페놀 중합체의 생산과 같은 산업적으로 중요한 공정에서 유용하게 사용된다. 그러나, 퍼옥시다제는 높은 pH, 고온 및 높은 퍼옥사이드 농도 등의 환경에서 불안정하기 때문에, 표백이나 화학적 합성 공정에 사용하는 것이 종종 제한되어 왔다(문헌[Cherry JR 등, Nature Biotechnology 1999; 379-384 (1999)]).
이에, 본 발명자들은 효소적 효율성은 그대로 유지하면서 산업적인 목적에 적합한 열안정성 CiP 변이체 단백질을 제조하기 위하여, CiP 단백질의 유연성 C-말단 루프에서의 특정 아미노산을 부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 기법을 이용하여 다른 아미노산으로 치환함으로써, 열안정성 CiP 변이체 단백질을 제조하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 열안정성 CiP 변이체 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 CiP 변이체 단백질을 코딩하는 DNA를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 CiP 단백질의 323번째 아미노산 잔기인 세린이 티로신으로 치환된 것, 328번째 아미노산 잔기인 글루탐산이 아스파르트산으로 치환된 것 또는 이 둘다 치환된 것인, 열안정성 CiP 변이체 단백질을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명에서는, 상기 CiP 변이체 단백질을 코딩하는 DNA를 제공한다.
본 발명의 변이체 단백질은 기존의 CiP 단백질에 비해 높은 열안정성을 나타내므로, 의료, 식품, 화학 등 단백질을 이용하는 각종 산업에 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
본 발명에서는 343개의 아미노산으로 구성된 서열번호: 1의 야생형 CiP 단백질의 323번째 아미노산인 세린(Ser) 및/또는 328번째 아미노산인 글루탐산(Glu)이 다른 아미노산으로 치환됨으로써 열안정성이 증가된 CiP 변이체 단백질을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 CiP 변이체 단백질의 한 예인 S323Y 단백질은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖고, 야생형 CiP 단백질의 323번째 친수성 아미노산 잔기인 세린(Ser)이 소수성 잔기인 티로신(Tyr)으로 치환된 것이다.
본 발명의 CiP 변이체 단백질의 다른 한 예인 E328D 단백질은 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖고, 야생형 CiP 단백질의 328번째 아미노산 잔기인 글루탐산(Glu)이 아스파르트산(Asp)으로 치환된 것이다.
본 발명의 CiP 변이체 단백질의 또 다른 한 예인 S323Y:E328D 단백질은 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖고, 야생형 CiP 단백질의 323번째 친수성 아미노산 잔기인 세린(Ser)이 소수성 잔기인 티로신(Tyr)으로 치환되고, 328번째 아미노산 잔기인 글루탐산(Glu)이 아스파르트산(Asp)으로 치환된 것이다.
본 발명의 CiP 변이체 단백질들은 야생형 CiP에 비해 향상된 열안정성을 나타내며, 예를 들어, S323Y 및 E328D CiP 변이체 단백질들은 야생형에 비해 약 2℃나 향상된 T50 수치(주어진 시간 이내에 최초 퍼옥시다제 효소활성을 50%까지 감소 시키는데 요구되는 온도) 및 각각 4배 및 2.5배 증가된 열안정성을 나타낸다.
본 발명은 또한 상기 CiP 변이체 단백질을 코딩하는 DNA를 제공한다.
본 발명의 DNA의 한 예인 S323Y 단백질을 코딩하는 DNA는, 서열번호: 5의 염기 서열에서 967번째 내지 969번째 염기가 티로신을 코딩하는 코돈으로 치환된 것이며, 바람직하게는 서열번호: 6의 염기서열을 갖는다.
본 발명의 DNA의 다른 한 예인 E328D 단백질을 코딩하는 DNA는, 서열번호: 5의 염기 서열에서 982번째 내지 984번째 염기가 아스파르트산을 코딩하는 코돈으로 치환된 것이며, 바람직하게는 서열번호: 7의 염기서열을 갖는다.
그러나, 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인해서 또는 상기 DNA를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 DNA는 코딩 영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 DNA 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 DNA와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 DNA 및 그의 단편을 역시 포함하며, 이때 실질적으로 동일한 DNA란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 효모 발현 벡터의 제조 및 효모 변형
pPICZαA 벡터(인비트로젠, 미국)를 이용하여 CiP를 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 스트레인 X-33 세포(인비트로젠, 미국) 배양액의 상층액에서 발현시켰다. 구체적으로, 야생형 CiP의 cDNA(서열번호: 5)를 AOX1 프로모터, 분비용 α-요소 신호서열 및 Pichia 변형체를 직접 선별하기 위한 제오신(Zeocin) 저항성 유전자를 포함하는 pPICZαA의 다중클로닝 부위에 삽입하여 발현 벡터 pPICZα-rCiP를 제조하였다. 상기 발현벡터를 이용하여 문헌[Kim SJ 등, Process Biochemistry in press, 44:731-735 (2009)]에 기재된 전기 천공법으로 피치아 파스토리스 스트레인 X-33 세포(인비트로젠, 미국)를 형질전환시키고, 형질전환체들을 100 ㎍/mL의 제오신을 포함하는 YPDS 배지(1% 효모 추출물, 2% 펩톤, 2% 글루코스 및 1M 솔비톨)에서 배양하여 선별하였다.
실시예 2: 부위-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)
하기 표 1에 기재된 프라이머 및 상기 실시예 1에서 제조한 발현벡터 pPICZαA-rCiP를 PCR 주형으로 이용하여 문헌[Mackay GA 등, The Journal of Immunology, 2002; 168:1787-1795]에 기재된 바와 같이 스플라이스 오버랩 익스텐션법(Splice overlap extension)으로 CiP 변이체 S323Y 및 E328D를 각각 제조하였 다.
1차 PCR(PCR-I)은 다음과 같이 수행하였다: 100 ng 주형, 각 1 μL의 뮤타제닉 프라이머(50 pmol)(서열번호: 8 및 9; 또는 서열번호: 10 및 11), 1 μL 5' 또는 3' 플랭킹 프라이머(50 pmol)(서열번호: 12 및 13), 12 μL 염화마그네슘(25 mL), 10μL 반응 완충액(10x), 2.5 μL 데옥시뉴클레오티드(2.5 mM), 및 0.5 μL 태그(Taq) DNA 폴리머라제(5 유닛/μL)(로슈 어플라이드 사이언스, 미국)에 최종 부피 100 μL이 되도록 물을 첨가하고, 상기 혼합물을 마이사이클러(MycyclerTM; 바이오라드, 미국)를 이용하여 95℃에서 5분 동안 1싸이클; 95℃에서 30초 동안, 54℃에서 30초 동안(어닐링), 72℃에서 1분 동안(연장) 30싸이클(변성) 및 70℃에서 10분간 1싸이클에 적용하였다. 수득된 2종의 PCR-I 산물을 퀴아젠(Quigen) PCR 정제키트를 이용하여 정제하였다.
2차 PCR(PCR-II)에서는 주형으로서 각 5 ng의 상기 2종의 PCR-I 산물과 1μL의 플랭킹 프라이머쌍(50 pmol)을 사용한 것을 제외하고는 PCR-I과 동일한 방식으로 PCR을 수행하였다. 생산된 PCR-II 산물을 정제하고, EcoRI 및 Not1을 이용하여 절단한 후 pPICZαA 벡터의 멀티클로닝 부위에 삽입하였다. 모든 PCR 및 부위-특이적 돌연변이 산물들은 제한 맵핑(restriction mapping) 및 DNA 서열분석(솔젠트, 한국)을 통해 확인하였다.
실험예 1: 퍼옥시다제 활성에 대한 온도의 영향
퍼옥시다제의 활성에 대한 온도의 영향을 알아보기 위하여, CiP 야생형, CiP 변이체 S323Y 및 E328D의 수용액을 40 내지 60℃의 범위의 온도에서 1시간 동안 배양하고, 얼음상에서 10분간 냉각시킨 후 잔여 퍼옥시다제 활성을 측정하였다. 퍼옥시다제의 활성은 효소 시료 0.1 mg를 2 mL의 ABTS-H2O2(0.5 mM 2,2-아지노비스(에틸벤즈티아졸린-6-설포네이트(2,2-azinobis(ethylbenzthiazoline-6-sulfonate; ABTS) 및 2.9 mM H2O2, pH 5.0)와 석영 큐빗 내에서 혼합하고, 25℃에서 UV-Vis 분광 광도계(시마주, 일본)를 이용하여 420nm에서의 흡광도(ABTS의 몰흡광계수; 34,700 M-1cm-1)를 측정함으로써 분석하였다. 40℃에서 배양한 경우의 퍼옥시다제 활성을 100%로 하였을때의 상대 퍼옥시다제 활성을 도 1에 나타내었다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 60분 내에 퍼옥시다제 활성을 50% 감소시키는 온도(T50 60)가 야생형의 경우 51.5℃인데 반해, 본 발명의 CiP 변이체 S323Y 및 E328D는 각각 52℃ 및 53.5℃로, 2℃ 정도 향상되었음을 알 수 있었다.
실험예 2: 퍼옥시다제의 열안정성
본 발명의 CiP 변이체들의 열안정성을 알아보기 위하여, 1.0 mL의 CiP 야생형, CiP 변이체 S323Y 및 E328D 시료를 각각 50 mM 인산칼륨 완충액(pH 6)에 희석시켜 25℃ 및 50℃의 온도에서 각각 1시간 동안 배양한 후, 상기 실험예 1에서와 같이 잔여 퍼옥시다제 활성을 측정하였다. 퍼옥시다제 잔여 활성을 A50/A25(%)로서 분석하여 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 CiP 변이체 S323Y 및 E328D가 야생형에 비해 각각 4배 및 2.5배나 증가된 잔여 퍼옥시다제 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
실험예 3: 퍼옥시다제의 동력학(kinetics)
퍼옥시다제의 야생형 및 변이체들의 동력학적 성질을 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, 100 μM H2O2 및 최종 농도가 0 내지 100 μM인 다양한 농도의 ABTS를 포함하는 반응 혼합물 2.0 mL에 5 μL의 CiP 야생형(WT) 및 변이체 S323Y 및 E328D 시료를 각각 첨가하여 반응을 개시하였다. 모든 시약들은 50 mM 인산-시트르산 완충액(pH 5.0)에서 용해시켰다. 각 시료의 흡광도를 실험예 1에서와 같이 측정하여 라인위버-버크 플롯(Lineweaver-Burk plot)을 작성하고 이로부터 최대 반응속도(V max), 미카엘리스-멘텐 상수(Michaelis-Menten constant; K m) 및 비 상수(Specificity constant; V max/K m) 값을 얻어 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2에 나타난 바와 같이, 야생형 CiP의 K m 지수는 10.70 μM이고, V max는 0.606 μMS-1였으며, CiP 변이체 S323Y 및 E328D의 K m 및 V max값 역시 야생형과 거의 일치하였다. K m 및 V max 값에서 야생형과 비교하여 돌연변이로 인한 수치 차이가 거의 없었고, S323Y 및 E328D의 효소적 효율성을 나타내는 V max/K m 값 역시 변화되지 않았다. 이러한 결과를 통해, CiP 변이체 S323Y 및 E328D는 퍼옥시다제의 효소적 활성이 거의 그대로 보존되면서도 열안정성이 증가된 것임을 알 수 있다.
실험예 4: 퍼옥시다제의 열역학(thermodynamics)
퍼옥시다제의 야생형 및 변이체들의 열적 불활성화를 측정하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
50 mM 인산칼륨 완충액(pH 5.0)에 용해된 효소의 용액을 55℃에서 배양하면서 일정 시간 간격으로 시료를 분취하여 실험예 1에서와 같이 효소 활성을 측정하였다. 데이터를 1차 플롯(first-order plot)에 적용하고(도 3 참고), ln(V) 대 배양시간(t)의 선형 회귀분석으로 측정한 1차 반응 속도 상수(K d) 및 하기 수학식에 의해 산출된 열역학 데이터와 함께 분석하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다:
상기 식에서,
R은 대기 상수(gas constant; 1.987 cal·K-1·mol-1)이고,
T는 절대 온도(298K)이며,
k d mut 및 k d wt은 각각 효소 ABTS 산화에 대한 돌연변이 CiP 및 야생형 CiP의 반응 속도 상수이며,
야생형(wt) CiP의 불활성화에 대한 전이상태 자유에너지(△△ G‡)를 기준 값으로서 사용하였다.
상기 표 3에 나타난 바와 같이, S323Y 및 E328D 변이체는 55℃에서 야생형에 비해 낮은 K d 지수, 몇 배 증가된 불활성화 반감기(t1/2)를 나타낸다. 열역학적 분석은 상기 변이체들이 불활성화에 대한 전이상태 자유에너지(△△ G‡)를 133.79 및 109.29 cal·mol-1만큼 증가시켰음을 보여주며, 이러한 결과를 통해, 본 발명의 변이체가 야생형 CiP에 비해 열에 의한 불활성화에 대해 더 높은 에너지 장벽을 갖고 있으며, 열역학적으로 더욱 안정하다는 것을 알 수 있다.
도 1은 CiP 야생형 및 변이체 단백질의 온도에 따른 상대 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 CiP 야생형 및 변이체 단백질을 25℃ 및 50℃에 1시간씩 노출시킨 후의 잔여 활성의 비율을 나타낸 것이다.
도 3은 CiP 야생형 및 변이체 단백질의 55℃에서의 시간경과에 따른 잔여효소 활성을 나타낸 것이다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY
<120> Thermostable coprinus cinereus peroxidase mutation protein
<130> FPD/200907-0026
<160> 13
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 343
<212> PRT
<213> Coprinus cinereus peroxidase
<400> 1
Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Cys Pro Gly Gly Gln Ser
1 5 10 15
Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys Val Trp Phe Asp Val Leu Asp Asp Leu
20 25 30
Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly Ser Lys Cys Glu Ser Pro Val Arg Lys
35 40 45
Ile Leu Arg Ile Val Phe His Asp Ala Ile Gly Phe Ser Pro Ala Leu
50 55 60
Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Ile Ile
65 70 75 80
Ala His Ser Asn Ile Glu Leu Ala Phe Pro Ala Asn Gly Gly Leu Thr
85 90 95
Asp Thr Val Glu Ala Leu Arg Ala Val Gly Ile Asn His Gly Val Ser
100 105 110
Phe Gly Asp Leu Ile Gln Phe Ala Thr Ala Val Gly Met Ser Asn Cys
115 120 125
Pro Gly Ser Pro Arg Leu Glu Phe Leu Thr Gly Arg Ser Asn Ser Ser
130 135 140
Gln Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ile Pro Gly Pro Gly Asn Thr Val Thr
145 150 155 160
Ala Ile Leu Asp Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ser Pro Asp Glu Val
165 170 175
Val Asp Leu Leu Ala Ala His Ser Leu Ala Ser Gln Glu Gly Leu Asn
180 185 190
Ser Ala Ile Phe Arg Ser Pro Leu Asp Ser Thr Pro Gln Val Phe Asp
195 200 205
Thr Gln Phe Tyr Ile Glu Thr Leu Leu Lys Gly Thr Thr Gln Pro Gly
210 215 220
Pro Ser Leu Gly Phe Ala Glu Glu Leu Ser Pro Phe Pro Gly Glu Leu
225 230 235 240
Arg Met Arg Ser Asp Ala Leu Leu Ala Arg Asp Ser Arg Thr Ala Cys
245 250 255
Arg Trp Gln Ser Met Thr Ser Ser Asn Glu Val Met Gly Gln Arg Tyr
260 265 270
Arg Ala Ala Met Ala Lys Met Ser Val Leu Gly Phe Asp Arg Asn Ala
275 280 285
Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Ser Ala Val Ser Asn Asn Ala
290 295 300
Ala Pro Val Ile Pro Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Ile Glu Val Ser
305 310 315 320
Cys Pro Ser Glu Pro Phe Pro Glu Ile Ala Thr Ala Ser Gly Pro Leu
325 330 335
Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro
340
<210> 2
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Coprinus cinereus peroxidase mutation protein, S323Y
<400> 2
Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Cys Pro Gly Gly Gln Ser
1 5 10 15
Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys Val Trp Phe Asp Val Leu Asp Asp Leu
20 25 30
Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly Ser Lys Cys Glu Ser Pro Val Arg Lys
35 40 45
Ile Leu Arg Ile Val Phe His Asp Ala Ile Gly Phe Ser Pro Ala Leu
50 55 60
Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Ile Ile
65 70 75 80
Ala His Ser Asn Ile Glu Leu Ala Phe Pro Ala Asn Gly Gly Leu Thr
85 90 95
Asp Thr Val Glu Ala Leu Arg Ala Val Gly Ile Asn His Gly Val Ser
100 105 110
Phe Gly Asp Leu Ile Gln Phe Ala Thr Ala Val Gly Met Ser Asn Cys
115 120 125
Pro Gly Ser Pro Arg Leu Glu Phe Leu Thr Gly Arg Ser Asn Ser Ser
130 135 140
Gln Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ile Pro Gly Pro Gly Asn Thr Val Thr
145 150 155 160
Ala Ile Leu Asp Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ser Pro Asp Glu Val
165 170 175
Val Asp Leu Leu Ala Ala His Ser Leu Ala Ser Gln Glu Gly Leu Asn
180 185 190
Ser Ala Ile Phe Arg Ser Pro Leu Asp Ser Thr Pro Gln Val Phe Asp
195 200 205
Thr Gln Phe Tyr Ile Glu Thr Leu Leu Lys Gly Thr Thr Gln Pro Gly
210 215 220
Pro Ser Leu Gly Phe Ala Glu Glu Leu Ser Pro Phe Pro Gly Glu Leu
225 230 235 240
Arg Met Arg Ser Asp Ala Leu Leu Ala Arg Asp Ser Arg Thr Ala Cys
245 250 255
Arg Trp Gln Ser Met Thr Ser Ser Asn Glu Val Met Gly Gln Arg Tyr
260 265 270
Arg Ala Ala Met Ala Lys Met Ser Val Leu Gly Phe Asp Arg Asn Ala
275 280 285
Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Ser Ala Val Ser Asn Asn Ala
290 295 300
Ala Pro Val Ile Pro Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Ile Glu Val Ser
305 310 315 320
Cys Pro Tyr Glu Pro Phe Pro Glu Ile Ala Thr Ala Ser Gly Pro Leu
325 330 335
Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro
340
<210> 3
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Coprinus cinereus peroxidase mutation protein, E328D
<400> 3
Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Cys Pro Gly Gly Gln Ser
1 5 10 15
Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys Val Trp Phe Asp Val Leu Asp Asp Leu
20 25 30
Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly Ser Lys Cys Glu Ser Pro Val Arg Lys
35 40 45
Ile Leu Arg Ile Val Phe His Asp Ala Ile Gly Phe Ser Pro Ala Leu
50 55 60
Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Ile Ile
65 70 75 80
Ala His Ser Asn Ile Glu Leu Ala Phe Pro Ala Asn Gly Gly Leu Thr
85 90 95
Asp Thr Val Glu Ala Leu Arg Ala Val Gly Ile Asn His Gly Val Ser
100 105 110
Phe Gly Asp Leu Ile Gln Phe Ala Thr Ala Val Gly Met Ser Asn Cys
115 120 125
Pro Gly Ser Pro Arg Leu Glu Phe Leu Thr Gly Arg Ser Asn Ser Ser
130 135 140
Gln Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ile Pro Gly Pro Gly Asn Thr Val Thr
145 150 155 160
Ala Ile Leu Asp Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ser Pro Asp Glu Val
165 170 175
Val Asp Leu Leu Ala Ala His Ser Leu Ala Ser Gln Glu Gly Leu Asn
180 185 190
Ser Ala Ile Phe Arg Ser Pro Leu Asp Ser Thr Pro Gln Val Phe Asp
195 200 205
Thr Gln Phe Tyr Ile Glu Thr Leu Leu Lys Gly Thr Thr Gln Pro Gly
210 215 220
Pro Ser Leu Gly Phe Ala Glu Glu Leu Ser Pro Phe Pro Gly Glu Leu
225 230 235 240
Arg Met Arg Ser Asp Ala Leu Leu Ala Arg Asp Ser Arg Thr Ala Cys
245 250 255
Arg Trp Gln Ser Met Thr Ser Ser Asn Glu Val Met Gly Gln Arg Tyr
260 265 270
Arg Ala Ala Met Ala Lys Met Ser Val Leu Gly Phe Asp Arg Asn Ala
275 280 285
Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Ser Ala Val Ser Asn Asn Ala
290 295 300
Ala Pro Val Ile Pro Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Ile Glu Val Ser
305 310 315 320
Cys Pro Ser Glu Pro Phe Pro Asp Ile Ala Thr Ala Ser Gly Pro Leu
325 330 335
Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro
340
<210> 4
<211> 343
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Coprinus cinereus peroxidase mutation protein, S323Y:E328D
<400> 4
Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Cys Pro Gly Gly Gln Ser
1 5 10 15
Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys Val Trp Phe Asp Val Leu Asp Asp Leu
20 25 30
Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly Ser Lys Cys Glu Ser Pro Val Arg Lys
35 40 45
Ile Leu Arg Ile Val Phe His Asp Ala Ile Gly Phe Ser Pro Ala Leu
50 55 60
Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly Ser Ile Ile
65 70 75 80
Ala His Ser Asn Ile Glu Leu Ala Phe Pro Ala Asn Gly Gly Leu Thr
85 90 95
Asp Thr Val Glu Ala Leu Arg Ala Val Gly Ile Asn His Gly Val Ser
100 105 110
Phe Gly Asp Leu Ile Gln Phe Ala Thr Ala Val Gly Met Ser Asn Cys
115 120 125
Pro Gly Ser Pro Arg Leu Glu Phe Leu Thr Gly Arg Ser Asn Ser Ser
130 135 140
Gln Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ile Pro Gly Pro Gly Asn Thr Val Thr
145 150 155 160
Ala Ile Leu Asp Arg Met Gly Asp Ala Gly Phe Ser Pro Asp Glu Val
165 170 175
Val Asp Leu Leu Ala Ala His Ser Leu Ala Ser Gln Glu Gly Leu Asn
180 185 190
Ser Ala Ile Phe Arg Ser Pro Leu Asp Ser Thr Pro Gln Val Phe Asp
195 200 205
Thr Gln Phe Tyr Ile Glu Thr Leu Leu Lys Gly Thr Thr Gln Pro Gly
210 215 220
Pro Ser Leu Gly Phe Ala Glu Glu Leu Ser Pro Phe Pro Gly Glu Leu
225 230 235 240
Arg Met Arg Ser Asp Ala Leu Leu Ala Arg Asp Ser Arg Thr Ala Cys
245 250 255
Arg Trp Gln Ser Met Thr Ser Ser Asn Glu Val Met Gly Gln Arg Tyr
260 265 270
Arg Ala Ala Met Ala Lys Met Ser Val Leu Gly Phe Asp Arg Asn Ala
275 280 285
Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Ser Ala Val Ser Asn Asn Ala
290 295 300
Ala Pro Val Ile Pro Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Ile Glu Val Ser
305 310 315 320
Cys Pro Tyr Glu Pro Phe Pro Asp Ile Ala Thr Ala Ser Gly Pro Leu
325 330 335
Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro
340
<210> 5
<211> 1032
<212> DNA
<213> DNA base sequence encoding Coprinus cinereus peroxidase
<400> 5
caaggtcctg gtggtggtgg atctgttact tgtccaggag gtcaaagcac atcaaattct 60
cagtgctgtg tttggtttga tgtactggac gatcttcaaa ccaacttcta ccaagggtca 120
aaatgcgaat cacctgtcag aaaaatcttg cgtatcgtct tccatgatgc catcggattt 180
agtccagctt taacggctgc cggtcaattc ggtggaggtg gtgcggatgg atctattatc 240
gcccattcta acatcgaact tgcattccct gcaaacggtg gattgaccga tacagtagaa 300
gcattacgtg cagtcggtat taatcacggt gtctctttcg gtgatttaat ccagttcgct 360
accgcggttg gtatgtccaa ttgtccgggt tcacccagat tagaatttct gaccggaaga 420
agtaactcgt cccaaccatc acctccgagt ctgatcccag gtcctggtaa tacggttact 480
gccattctag acaggatggg cgatgctgga ttttctcccg atgaggtcgt cgatttgcta 540
gcagcacatt ctttagcgtc tcaagagggt ttgaacagtg ccatatttag gtccccgttg 600
gatagtaccc cccaggtatt cgacacacag ttctatatcg aaaccctgtt gaagggtact 660
actcaacccg gtccttcatt gggttttgca gaagaattgt ctccgttccc tggagaattg 720
agaatgagat cggatgctct tttggcaaga gactccagaa ctgcgtgtag gtggcaatcc 780
atgacttcaa gtaacgaggt tatgggtcaa aggtatagag cagccatggc gaaaatgtca 840
gtgttgggtt tcgacagaaa tgcgttgaca gattgctccg acgttatccc ttcggccgtt 900
agtaataacg ctgctccagt cattccagga ggtttgactg tcgatgatat agaggtatct 960
tgcccgtctg aaccatttcc agaaatcgcc actgcatccg gtccattgcc atcacttgct 1020
cctgctccat aa 1032
<210> 6
<211> 1032
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA base sequence encoding S323Y
<400> 6
caaggtcctg gtggtggtgg atctgttact tgtccaggag gtcaaagcac atcaaattct 60
cagtgctgtg tttggtttga tgtactggac gatcttcaaa ccaacttcta ccaagggtca 120
aaatgcgaat cacctgtcag aaaaatcttg cgtatcgtct tccatgatgc catcggattt 180
agtccagctt taacggctgc cggtcaattc ggtggaggtg gtgcggatgg atctattatc 240
gcccattcta acatcgaact tgcattccct gcaaacggtg gattgaccga tacagtagaa 300
gcattacgtg cagtcggtat taatcacggt gtctctttcg gtgatttaat ccagttcgct 360
accgcggttg gtatgtccaa ttgtccgggt tcacccagat tagaatttct gaccggaaga 420
agtaactcgt cccaaccatc acctccgagt ctgatcccag gtcctggtaa tacggttact 480
gccattctag acaggatggg cgatgctgga ttttctcccg atgaggtcgt cgatttgcta 540
gcagcacatt ctttagcgtc tcaagagggt ttgaacagtg ccatatttag gtccccgttg 600
gatagtaccc cccaggtatt cgacacacag ttctatatcg aaaccctgtt gaagggtact 660
actcaacccg gtccttcatt gggttttgca gaagaattgt ctccgttccc tggagaattg 720
agaatgagat cggatgctct tttggcaaga gactccagaa ctgcgtgtag gtggcaatcc 780
atgacttcaa gtaacgaggt tatgggtcaa aggtatagag cagccatggc gaaaatgtca 840
gtgttgggtt tcgacagaaa tgcgttgaca gattgctccg acgttatccc ttcggccgtt 900
agtaataacg ctgctccagt cattccagga ggtttgactg tcgatgatat agaggtatct 960
tgcccgtacg aaccatttcc agaaatcgcc actgcatccg gtccattgcc atcacttgct 1020
cctgctccat aa 1032
<210> 7
<211> 1032
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA base sequence encoding E328D
<400> 7
caaggtcctg gtggtggtgg atctgttact tgtccaggag gtcaaagcac atcaaattct 60
cagtgctgtg tttggtttga tgtactggac gatcttcaaa ccaacttcta ccaagggtca 120
aaatgcgaat cacctgtcag aaaaatcttg cgtatcgtct tccatgatgc catcggattt 180
agtccagctt taacggctgc cggtcaattc ggtggaggtg gtgcggatgg atctattatc 240
gcccattcta acatcgaact tgcattccct gcaaacggtg gattgaccga tacagtagaa 300
gcattacgtg cagtcggtat taatcacggt gtctctttcg gtgatttaat ccagttcgct 360
accgcggttg gtatgtccaa ttgtccgggt tcacccagat tagaatttct gaccggaaga 420
agtaactcgt cccaaccatc acctccgagt ctgatcccag gtcctggtaa tacggttact 480
gccattctag acaggatggg cgatgctgga ttttctcccg atgaggtcgt cgatttgcta 540
gcagcacatt ctttagcgtc tcaagagggt ttgaacagtg ccatatttag gtccccgttg 600
gatagtaccc cccaggtatt cgacacacag ttctatatcg aaaccctgtt gaagggtact 660
actcaacccg gtccttcatt gggttttgca gaagaattgt ctccgttccc tggagaattg 720
agaatgagat cggatgctct tttggcaaga gactccagaa ctgcgtgtag gtggcaatcc 780
atgacttcaa gtaacgaggt tatgggtcaa aggtatagag cagccatggc gaaaatgtca 840
gtgttgggtt tcgacagaaa tgcgttgaca gattgctccg acgttatccc ttcggccgtt 900
agtaataacg ctgctccagt cattccagga ggtttgactg tcgatgatat agaggtatct 960
tgcccgtctg aaccatttcc agatatcgcc actgcatccg gtccattgcc atcacttgct 1020
cctgctccat aa 1032
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1-F mutagenic forward primer
<400> 8
atagaggtat cttgcccgta cgaaccattt ccagaaatc 39
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1-R mutagenic reverse primer
<400> 9
gatttctgga aatggttcgt acgggcaaga tacctctat 39
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M2-F mutagenic forward primer
<400> 10
ccgtctgaac catttccaga tatcgccact gcatccggt 39
<210> 11
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M2-R mutagenic reverse primer
<400> 11
accggatgca gtggcgatat ctggaaatgg ttcagacgg 39
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EcoRI flanking primer
<400> 12
gcgcgaattc caaggtcctg gtggtggtgg atctg 35
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NotI flanking primer
<400> 13
gcgcgcggcc gcttatggag caggagcaag tgatggc 37
Claims (9)
- 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 CiP 단백질의 323번째 아미노산 잔기인 세린이 티로신으로 치환된 것, 328번째 아미노산 잔기인 글루탐산이 아스파르트산으로 치환된 것, 또는 이 둘다 치환된 것인, 열안정성 CiP 변이체 단백질.
- 제1항에 있어서,서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 열안정성 CiP 변이체 단백질.
- 제1항에 있어서,서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 열안정성 CiP 변이체 단백질.
- 제1항에 있어서,서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 열안정성 CiP 변이체 단백질.
- 제1항의 열안정성 CiP 변이체 단백질을 코딩하는 DNA.
- 제5항에 있어서,서열번호: 5의 염기 서열에서 967번째 내지 969번째 염기가 티로신을 코딩하는 코돈으로 치환된 DNA.
- 제5항에 있어서,서열번호: 6의 염기 서열을 갖는 DNA.
- 제5항에 있어서,서열번호: 5의 염기 서열에서 982번째 내지 984번째 염기가 아스파르트산을 코딩하는 코돈으로 치환된 DNA.
- 제5항에 있어서,서열번호: 7의 염기 서열을 갖는 DNA.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020090071330A KR101098873B1 (ko) | 2009-08-03 | 2009-08-03 | 열안정성 ＣｉＰ 변이체 단백질 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020090071330A KR101098873B1 (ko) | 2009-08-03 | 2009-08-03 | 열안정성 ＣｉＰ 변이체 단백질 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20110013726A true KR20110013726A (ko) | 2011-02-10 |
| KR101098873B1 KR101098873B1 (ko) | 2011-12-26 |
Family
ID=43773164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020090071330A KR101098873B1 (ko) | 2009-08-03 | 2009-08-03 | 열안정성 ＣｉＰ 변이체 단백질 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101098873B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
-
2009
- 2009-08-03 KR KR1020090071330A patent/KR101098873B1/ko active IP Right Grant
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR101098873B1 (ko) | 2011-12-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gakh et al. | Mitochondrial processing peptidases | |
| JP6868662B2 (ja) | ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法および測定キット | |
| Pasternack et al. | Bacterial pro‐transglutaminase from Streptoverticillium mobaraense: Purification, characterisation and sequence of the zymogen | |
| JP4880469B2 (ja) | 洗剤中で改良された安定性を有するプロテアーゼ | |
| DK2756076T3 (en) | ENZYM VARIETIES WITH IMPROVED PROPERTIES | |
| EP2989201B1 (en) | Novel glucose oxidase variants | |
| KR20130038914A (ko) | 글루코스 탈수소효소 | |
| WO2006101239A1 (ja) | 補酵素結合型グルコース脱水素酵素及びこれをコードするポリヌクレオチド | |
| WO2009087929A1 (ja) | 新規なグルコースデヒドロゲナーゼ | |
| JP2020141690A (ja) | 糖化ペプチドに作用するアマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃ測定法 | |
| CN107893060A (zh) | 一种海洋细菌来源热稳定耐盐sgnh家族水解酶及应用 | |
| CN109971734A (zh) | 一种pH不敏感高温耐受性HSL家族脂类水解酶及应用 | |
| WO2009037253A2 (en) | Polypeptides having tyrosinase activity and polynucleotides encoding same | |
| JP6843740B2 (ja) | 比活性が向上したアマドリアーゼ | |
| KR101098873B1 (ko) | 열안정성 ＣｉＰ 변이체 단백질 | |
| Hajji et al. | Gene cloning and expression of a detergent stable alkaline protease from Aspergillus clavatus ES1 | |
| EP2173873B1 (en) | Protein and dna sequence encoding a cold adapted subtilisin-like activity | |
| De Pascale et al. | PhAP protease from Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125: gene cloning, recombinant production in E. coli and enzyme characterization | |
| Ji et al. | Gene cloning, sequence analysis and heterologous expression of a novel cold-active lipase from Pseudomonas sp. PF16 | |
| JP5234474B1 (ja) | 新規ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ｌ−リジンの測定方法、キット及び酵素センサ | |
| US20050164350A1 (en) | Heat-resistant thioredoxin and related enzymes | |
| CN108342370B (zh) | 一种新型果糖基肽氧化酶及其应用 | |
| RU2412998C1 (ru) | Мутантная оксидаза d-аминокислот | |
| ODA et al. | Cloning and rational mutagenesis of kexstatin I, a potent proteinaceous inhibitor of Kex2 proteinase | |
| Karakaş | Alanine scanning on the active site of a novel esterase |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140922 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20161006 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20181218 Year of fee payment: 8 |