KR20100138128A

KR20100138128A - 다공성 마이크로스피어 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20100138128A
Application number: KR1020090056511A
Authority: KR
Inventors: 김해원; 홍석정
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-06-24
Filing date: 2009-06-24
Publication date: 2010-12-31
Also published as: KR101178204B1

Abstract

본 발명은 다공성 마이크로스피어 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생체활성 세라믹을 포함하는 구형의 몸체의 표면 및 내부에 미세 기공이 형성되고, 상기 미세 기공이 상호 연결된 열린 기공 구조를 갖는 다공성 마이크로스피어 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

상기 다공성 마이크로스피어는 서로 잘 연결된 열린 기공구조를 가져 체내 이식시 세포의 부착과 증식이 활발하게 일어나므로 골 및 치주조직의 재생을 효과적으로 도모할 수 있다.

마이크로스피어, 생체활성 세라믹, 골조직, 골전도

Description

다공성 마이크로스피어 및 이의 제조방법{POROUS MICROSPHERE AND MANUFACTURING METHOD THEREOF}

본 발명은 골조직 재생을 위한 다공성 마이크로스피어 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서로 잘 연결된 열린 기공 구조를 가져 골세포가 부착되어 골전도 및 골재생을 할 수 있도록 넓은 표면적과 공간을 제공하는 다공성 마이크로스피어 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 척추동물의 뼈 조직이 외상, 종양, 기형 등에 의해 손상되는 경우 심한 통증과 함께 일상 활동에 제한을 받게 된다. 이에 손상된 부위에 골을 채워서 신생골을 생성시키는 치료법이 시행된다.

현재까지 알려진 치료방법으로 자신의 골을 이식하는 자가골 이식술, 다른 사람의 뼈를 이식하는 동종골 이식술, 동물의 뼈를 처리하여 이식하는 이종골 이식술 등이 있다.

상기 자가골 이식술은 환자의 정상부위에서 이미 생성되어 있는 뼈조직을 손상된 조직 부위에 이식하는 방법으로, 일부 환자에게서 성공을 거두었다. 그러나 정상 조직을 희생하는 셈이 되므로, 이러한 공여부에 새로운 통증이 생길 수 있는 등의 취약점이 있으며, 수술 후 통증, 골절, 출혈, 반흔을 비롯하여 재활이 더디게 이루어지는 등의 합병증이 발생할 수 있는 단점이 있다. 동종골 이식술은 면역 반응, 간염 등의 질환이 전염될 수 있는 위험이 있다. 한편 이종골 이식술은 면역 반응과 광우병 등의 위험이 있는 단점이 있다. 이에 생체 적합성이 우수한 골이식재로서의 생체 인공재료의 개발이 요구되고 있다.

인공 골이식재의 대표적인 물질로, 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite), 인산삼칼슘(tricalcium phosphate) 등의 인산칼슘계 세라믹, 생체활성유리 등이 널리 사용되고 있다. 이중 인산칼슘계 세라믹은 생체 적합성이 우수할 뿐만 아니라 안전성이 우수하여 골 이식재로 활발이 연구되고 있다.

한편, 마이크로스피어(microsphere)는 종래에는 방사선 진단약에 사용되었고, 최근에는 약물운반체로 널리 주목받고 있다. 이러한 마이크로스피어는 일반적으로 약물이 고분자 매트릭스에 용해 상태 또는 미결정 상태로 분산하고 있는 1 내지 2000㎛의 미립자계를 가리킨다.

마이크로스피어와 같은 마이크로입자는 약물, 단백질, 세포의 전달, 약물의 지연방출, 표적부위로의 송달, 유동성을 비롯한 물리적 특성의 개선 등의 다양한 목적으로 개발되고 있다(S. Freiberg, X.X. Zhu, Int. J. Pharm. 282, 1 (2004)). 피막소재로 사용되는 고분자, 무기물 및 이들의 혼합물은 상술한 용도를 위해 개발되었고, 시험관내(in vitro) 가능성 및 임상 성과를 보여주었다(K.J. Pekarek, J.S. Jacob, E. Mathiowitz, Nature 367, 258 (1994); M. Borden, M. Attawia, Y. Khan, C.T. Laurencin, Biomaterials 23, 551 (2002); H.J. Gu, H.H. Lee, H.W. Kim, Tissue Eng. 13, 965 (2007); Q.Q. Qiu, P. Ducheyne, P.S. Ayyaswamy, J. Biomed. Mater. Res. 52, 66 (2000); A.M. Rokstad, S. Holtan, B. Strand, B. Steinkjer, L. Ryan, B.Kulseng, G. Skjak-Braek, T. Espevik, Cell Transplant. 11, 313 (2002); D. Kato, M. Takeuchi, T. Sakurai, S. Furukawa, H. Mizokami, M. Sakata, C. Hirayama, M. Kunitake, Biomaterials 24, 4253 (2003); H. Maeda, T. Kasuga, Acta Biomater. 2, 403 (2006); H.W. Kim, B.H. Yoon, H.E. Kim, J. Mater. Sci. Mater. Med. 16, 1105 (2005); Q.Q. Qiu, P. Ducheyne, P.S. Ayyaswamy, Biomaterials 20, 989 (1999)). 유전자, 세포 또는 조직 수준에서 치료 효과를 이끌어내기 위하여 생체 활성 고분자를 유지하고 방출하는데 있어 마이크로 입자가 효과적임이 많은 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo) 연구 결과 밝혀졌다.

상술한 하이드록시아파타이트로 제조된 작은 사이즈(수십 내지 수백 마이크로미터)의 과립은 치주낭 및 치조 뼈에 있는 결점을 채우고 증강하기 위하여 제조되었다(W. Paul, C.P. Sharma, J. Biomater. Appl. 17, 253 (2003); K.A. Al Ruhaimi, Int. J. Oral. Maxillofac Implants. 16, 105 (2001); P.C. Hobar, M. Pantaloni, H.S. Byrd, Clin. Plast. Surg. 27, 557 (2000); J.M. Schmitt, D.C. Buck, S.P. Joh, S.E. Lynch, J.O. Hollinger, J. Periodontol. 68, 1043 (1997)). 이러한 하이드록시아파타이트 과립은 자연적인 뼈의 무기물과 유사한 화학적 조성 때문에 많은 실험적인 모델에서 우수한 뼈 형성 능력이 보고된 바 있다. 생체내(in vivo) 치료효과와 조직 공학을 위한 생체외(ex vivo) 세포분화를 포함하는 특정한 생물학적 반응을 유도하기 위해, 단백질, 항생제 및 성장 인자와 같은 적절한 생체활성 신호가 하이드록시아파타이트 과립 및 스캐폴드와 함께 도입되었다(B.G. Santoni, G.E. Pluhar, T. Motta, D.L. Wheeler, Biomed. Mater. Eng. 17, 277 (2007); H.W. Kim, J.C. Knowles, H.E. Kim, J. Mater. Sci. Mater. Med. 16, 189 (2005); I. Ono, T. Yamashita, H.Y. Jin, Y. Ito, H. Hamada, Y. Akasaka, M. Nakasu, T. Ogawa, K. Jimbow, Biomaterials 25, 4709 (2004); H.W. Kim, H.E. Kim, J.C. Knowles, Biomaterials 25, 1279 (2004)).

다공성 블록과 비교하여, 마이크로스피어를 포함하는 과립형 하이드록시아파타이트는 복잡한 형상의 결손부위를 충진하기 위한 필러로서 뿐만 아니라 주입가능한 캐리어로 이용될 수 있다(M. Borden, M. Attawia, Y. Khan, C.T. Laurencin, Biomaterials 23, 551 (2002); H.J. Gu, H.H. Lee, H.W. Kim, Tissue Eng. 13, 965 (2007)). 이러한 마이크로스피어는 결손 조직에 직접 이식되었을 때 골원성 또는 줄기 세포의 소집 또는 생체외(ex vivo)에서 설계된 후 특성 세포의 전달에 있어서 유용한 벡터로 인지되고 있다(M. Borden, M. Attawia, Y. Khan, C.T. Laurencin, Biomaterials 23, 551 (2002); H.J. Gu, H.H. Lee, H.W. Kim, Tissue Eng. 13, 965 (2007); Q.Q. Qiu, P. Ducheyne, P.S. Ayyaswamy, J. Biomed. Mater. Res. 52, 66 (2000); A.M. Rokstad, S. Holtan, B. Strand, B. Steinkjer, L. Ryan, B. Kulseng, G. Skjak-Braek, T. Espevik, Cell Transplant. 11, 313 (2002); D. Kato, M. Takeuchi, T. Sakurai, S. Furukawa, H. Mizokami, M. Sakata, C. Hirayama, M. Kunitake, Biomaterials 24, 4253 (2003)). 고분자 마이크로입자를 사용한 세포의 배양 및 전달에 관한 최근 연구는 구형의 물질이 세포의 성장 및 군집에 효과적임을 보여준 바 있다(A.M. Rokstad, S. Holtan, B. Strand, B. Steinkjer, L. Ryan, B. Kulseng, G. Skjak-Braek, T. Espevik, Cell Transplant. 11, 313 (2002); D. Kato, M. Takeuchi, T. Sakurai, S. Furukawa, H. Mizokami, M. Sakata, C. Hirayama, M. Kunitake, Biomaterials 24, 4253 (2003)). 더욱이, 콜라겐-아파타이트 마이크로스피어가 쥐-유래 줄기세포의 성장 및 뼈-관련 유전자의 발현을 돕는데 있어 마이크로스피어의 잠재력을 보여준 바 있다(H.J. Gu, H.H. Lee, H.W. Kim, Tissue Eng. 13, 965 (2007)). 그러나, 대부분의 연구가 생체세라믹 입자의 약물 전달 또는 스피어 형성과 관련된 제어에 집중된 반면, 하이드록시아파타이트 마이크로스피어, 특히 세포 전달 및 조직 공학 매트릭스로서의 유용성에 대한 연구가 많이 이루어지지 않은 실정이다(Q.Q. Qiu, P. Ducheyne, P.S. Ayyaswamy, Biomaterials 20, 989 (1999); M.P. Ferraz, A.Y. Mateus, J.C. Sousa, F.J. Monteiro, J. Biomed. Mater. Res. A 81, 994 (2007); S.P. Victor, T.S. Kumar, J. Mater. Sci. Mater. Med. 19, 283 (2008)).

인산칼슘계 세라믹의 조직공학 매트릭스에 관한 연구의 일예로 대한민국 특허등록 제10-0498759호는 인산칼슘계 화합물을 산성 수용액에 용해시키고, 상기 수용액에 염기를 첨가하여 중성 또는 알칼리성으로 조절하고, 온도를 상승시켜, 하이드록시아파타이트를 재석출하는 하이드록시아파타이트 과립의 제조방법 제안하고 있다.

또한 대한민국 특허등록 제10-0498759호는 인산삼칼슘 전구체, 기공 전구체, 젤라틴 용액 및 분산매를 이용하여 구형의 다공성 β-인산삼칼슘 구형 과립을 제조하는 방법을 개시하고 있다.

그러나 상기 언급한 방법에 따라 제조된 인산칼슘계 과립의 경우 모두 닫힌 구조로서, 골전도 및 골재생을 할 수 있는 넓은 표면적과 공간을 제공할 수 없는 근본적인 문제점을 가지고 있어, 골이식재 또는 골세포지지체로서 골형성을 촉진하기에 어려운 한계가 있다.

상술한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명의 목적은 서로 잘 연결된 열린 기공 구조를 가져 골세포가 부착되어 골전도 및 골재생을 할 수 있도록 넓은 표면적과 공간을 제공할 수 있는 골재생을 위한 다공성 마이크로스피어 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은

생체활성 세라믹을 포함하는 구형의 몸체의 표면 및 내부에 미세 기공이 형성되고, 상기 미세 기공이 상호 연결된 열린 기공 구조를 갖는 다공성 마이크로스피어를 제공한다.

또한 본 발명은

S1) 생체활성 세라믹; 유기용매; 분산제; 기공형성제; 및 결합제를 포함하는 세라믹 슬러리를 제조하는 단계;

S2) 친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조하는 단계;

S3) 상기 S2)에서 제조된 수상에 상기 S1)에서 제조된 세라믹 슬러리를 적하하는 단계;

S4) 상기 수상 중에 생성된 마이크로스피어를 수득하는 단계;

S5) 기공형성제를 승화시켜 마이크로스피어 몸체 및 내부에 기공을 형성하는 단계; 및

S6) 상기 S5)에서 수득한 기공이 형성된 마이크로스피어를 열처리하는 단계

를 포함하는 다공성 마이크로스피어의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 다공성 마이크로스피어는 외부와 연결된 열린 기공를 가지고, 이러한 기공은 서로 잘 연결되어 골세포가 부착되어 골전도 및 골재생을 할 수 있는 넓은 표면적과 공간을 제공한다. 따라서 본 발명에 따른 다공성 마이크로스피어는 골이식재 또는 골세포 지지체로 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 다공성 마이크로스피어는 생체활성 세라믹을 포함하는 구형의 몸체의 표면 및 내부에 미세 기공이 형성되고, 상기 미세 기공이 상호 연결된 열린 기공 구조를 갖는다.

이때 마이크로스피어의 재질은 생체활성 세라믹을 포함한다. 생체활성 세라믹은 뼈의 무기성분과 같이 체내에서 흡수 또는 잔류하며 뼈의 생성을 전도(conduct)할 수 있는 무기재료로서, 조직세포의 유착과 증식이 잘 일어나고 분화된 세포의 기능이 보전되며 체내 이식 후에도 주위 조직과 잘 융화되어 염증 반응을 유발하지 않는 생체적합성을 갖는 것이라면 어떠한 것이든 사용이 가능하다. 대표적으로 인산칼슘계 세라믹, 칼슘실리케이트계 세라믹, 생체활성유리 또는 이들의 혼합물 등이 가능하다. 일예로, 하이드록시아파타이트(Ca₁₀(PO₄)₆OH₂), 옥시 아 파타이트(Ca₁₀(PO₄)₆O), 인산일칼슘(Ca(H₂PO₄)₂), 인산이칼슘(CaHPO₄·2H₂O), 인산삼칼슘(Ca₃(PO₄)₂), 인산사칼슘(Ca₄(PO₄)₂O), 칼슘메타 포스페이트(Ca(PO₃)₂) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 인산칼슘계 세라믹; 트리칼슘 실리케이트(Ca₃SiO₅), 칼슘 오르소실리케이트(Ca₂SiO₄), 칼슘 디실리케이트(CaSi₂O₅), 트리칼슘 디실리케이트(Ca₃Si₂O₇), 월라스토나이트(CaSiO₃) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 칼슘실리케이트계 세라믹;실리카(SiO₂), 산화나트륨(Na₂O), 산화칼슘(CaO), 오산화인(P₂O₅) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 생체활성유리; 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.

이때 마이크로스피어는 기계적 물성 및 조직공학적 용도를 고려하여 평균입경이 바람직하게는 220 내지 260 ㎛, 더욱 바람직하게는 230 내지 250 ㎛이고, 미세기공의 직경이 20 내지 50 ㎛이다.

본 발명의 다공성 마이크로스피어는 미세 기공이 상호 연결된 열린 기공구조를 가지고 있어 골조직이 마이크로스피어 내로 성장되어 들어올 수 있다. 이에 따라, 골세포가 부착되어 골전도 및 골재생을 할 수 있는 넓은 표면적과 공간이 제공된다.

도 1은 본 발명에 따른 골조직 재생을 위한 다공성 마이크로스피어의 제조단계를 보여주는 모식도이다.

도 1을 참조하면, 전술한 바의 골조직 재생을 위한 다공성 마이크로스피어는

를 거쳐 제조한다.

먼저, 단계 S1)에서 생체활성; 유기용매; 분산제및 결합제를 포함하는 세라믹 슬러리를 제조한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 생체활성 세라믹은 전술한 바의 내용으로 대체한다. 이때 생체활성 세라믹의 함량은 다공성 마이크로스피어가 용이하게 형성될 수 있도록 세라믹 슬러리 중 5 내지 50 중량%인 것이 바람직하다.

상기 유기 용매는 생체활성 세라믹, 기공형성제, 분산제 및 결합제를 균일하게 용해시킬 수 있는 것이면 본 발명에서 특별히 제한되지 않는다. 바람직한 유기 용매로 소수성 및 휘발성이 강한 것을 사용할 수 있다. 일예로 디클로로메탄, 클로로포름, 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 아세토니 트릴, 테트라하이드로퓨란, 아세트산, 디메틸설폭사이드 및 이들의 혼합용매가 가능하다. 이때 유기 용매의 함량은 세라믹 슬러리 중 10 내지 93 중량%인 것이 바람직하다.

상기 결합제는 생체활성 세라믹 분말의 결합을 위해 첨가되는 것으로, 바람직하게는 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐부티럴 및 이들의 혼합물을 사용한다. 이때 결합제의 함량은 세라믹 슬러리 중 0.1 내지 10 중량%인 것이 바람직하다.

본 발명의 기공형성제는 최종 제조되는 다공성 마이크로스피어에 열린 기공 구조를 부여하기 위해 첨가되는 것으로, 대기 조건에서 승화에 의해 제거될 수 있는 것으면 특별히 한정하지 않는다. 바람직하게는 20 내지 60 ℃의 융점을 가진 것을 사용한다. 대표적으로 캄펜, 캠포르, 나프탈렌, 멘톨, 티몰, 쿠마린, 바닐린, 살리실아미드, 2-아미노피리딘, t-부탄올, 트리클로로- t-부탄올, 이미다졸, 디메틸설폰, 우레아, 2-아미도피리딘이 가능하다. 바람직하기로는 캄펜을 사용한다. 이때 기공형성제의 함량은 세라믹 슬러리 중 1 내지 70 중량%인 것이 바람직하다.

생체활성 세라믹 분말의 응집을 억제하고 고르게 분산시켜 균일한 특성을 갖는 세라믹 슬러리를 제조하기 위해 분산제를 첨가한다. 상기 분산제는 생체활성 세라믹 분말이 균일하게 분산될 수 있는 것이라면, 특별하게 한정하지 않는다. 그러나, 생체활성 세라믹 분말의 우수한 분산효과를 주는 올리고머 폴리에스터(oligomeric polyester)가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 올리고머 폴 리에스터로서 KD4(Hypermer; UniQuema)를 사용할 수 있다. 이때 분산제의 함량은 세라믹 슬러리 중 0.1 내지 10 중량%인 것이 바람직하다.

다음으로, 단계 S2)에서는 친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조한다.

상기 친수성 용매는 바람직하게는 증류수를 사용한다.

본 발명의 수상은 슬러리 방울과 친수성 용매 사이의 계면을 조정하기 위해 계면활성제를 포함할 수 있다. 상기 계면활성제는 HLB(hydrophilic-lipophilic balance) 값이 10 이상인 것이면 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 일예로 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐부티럴, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐에테르 및 이들의 혼합물 등이 가능하다. 계면활성제의 사용량은 제조되는 다공성 마이크로스피어의 입경을 고려하여 수상 중 0.1 내지 10 중량%가 바람직하다.

이어서, 단계 S3)에서는 상기 S2)에서 제조된 수상에 상기 S1)에서 제조된 세라믹 슬러리를 적하한다.

수상에 세라믹 슬러리를 한 방울씩 떨어뜨리게 되면 생체활성 세라믹이 결합하여 구형의 입자가 형성된다. 이어, 고상화(soldificiation)가 진행되고, 구형의 입자는 안정적인 형상을 유지하게 된다. 이때 휘발성이 강한 유기 용매는 교반에 의해 휘발한다.

슬러리 적하시 균일한 구조를 갖는 다공성 마이크로스피어의 제조를 위해 100 내지 2,000 rpm의 교반속도로 10 분 내지 24 시간 충분히 교반하여 제조한다. 만약 교반 속도가 너무 빨라 지면 입자의 형성이 어렵고, 깨지는 문제점이 있으며, 이와 반대로 교반 속도가 너무 느리면 입자들의 초기 형성시 응집에 의한 마이크로스피어의 입경이 커지는 문제점이 있기 때문이다. 교반시간은 유기용매가 충분히 증발하고 마이크로스피어가 고상화하는데 필요한 시간으로서 마이크로스피어의 재질, 교반속도, 유기용매의 종류에 따라 상기 범위 내에 변경될 수 있다.

다음으로 단계 S4)에서는 상기 수상 중에 생성된 마이크로스피어를 수득한다.

유기용매 증발 후 고상화가 완전히 이루어져 경화된 마이크로스피어를 수득한다. 이때 여과공정, 세척공정, 건조공정 등의 통상적으로 알려진 방법이 수행된다.

이어서, 단계 S5)에서는 기공형성제를 승화시켜 마이크로스피어 몸체 및 내부에 기공을 형성한다.

본 발명에서 사용되는 기공형성제는 제조공정에서 사용되는 용액의 융점 이상의 온도로 가열하지 않아도 대기 조건에서 승화에 의해 쉽게 제거된다. 이러한 기공형성제에 승화에 의해 마이크로스피어는 미세 기공이 서로 연결된 열린 기공 구조를 갖는다.

이러한 기공 형성 단계는 대기조건 상온에서 10분 내지 100 시간 동안 수행 한다. 이때 기공 형성 시간이 상기 범위 미만이면 충분한 기공을 형성할 수 없고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하더라도 더 이상의 효과가 없어 비경제적이다.

마지막으로 단계 S6)에서는 기공이 형성된 마이크로스피어를 열처리한다.

이러한 열처리 단계를 통해 표면에 잔류하고 있는 결합제, 계면활성제, 미반응 물질 등이 제거되며, 생체활성 세라믹 등이 치밀화되어 결정화됨으로써 안정적 구조를 갖게 된다.

이때 열처리는 600 내지 1500 ℃에서 10 분 내지 5 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

이러한 열처리 단계는 0.1 내지 5 ℃/min의 승온 속도로 수행하는 것이 바람직하다.

이때 열처리 온도 및 시간이 상기 범위 미만이면 생체활성 세라믹의 충분한 결정화가 이루어지지 않고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하여 수행하면 마이크로스피어의 직경 및 이에 형성된 기공의 크기가 감소되므로 상기 범위내에서 적절히 수행되어야 한다.

상술한 열처리를 거치면서 결합제, 미반응 물질 등의 소멸에 의한 중량 감소와 생체활성 세라믹 분말이 소결되어 다공성 마이크로스피어의 크기가 감소하게 된다.

선택적으로, 상기 S5)에서 수득한 기공이 형성된 마이크로스피어를 생체유사 용액에 침지하는 단계를 더욱 수행할 수 있다. 이러한 침지단계를 수행하는 경우 고형물에 칼슘 포스페이트 침전이 형성되어, 최종 열처리 후 하이드록시아파타이트 결정을 얻을 수 있게 된다. 특히, 생체활성 세라믹으로 칼슘실리케이트계 세라믹을 사용하는 경우 생체유사용액 침지하여 열처리하게 되면, 하이드록시아파타이트-월라스토나이트 이중 결정 구조를 갖는 다공성 마이크로스피어를 얻을 수 있게 된다. 이때 침지단계는 상온에서 1 내지 1000 시간 동안 수행한다. 만약 침지시간이 상기 범위 미만이면, 마이크로스피어 표면에 칼슘 포스페이트 침전 형성이 미미하고, 이와 반대로 상기 범위를 초과하면 용액 내에서 칼슘 이온과 결정을 형성하여 침전물이 형성되어 고형물 표면에 침전이 형성되지 못하는 문제점이 있다.

상기 생체유사용액은 반응 시약급의 NaCl, NaHCO₃, Na₂SO₄, KCl, K₂HPO₄, MgCl₂·6H₂O, 및 CaCl₂·2H₂O를 탈이온 증류수에 용해시킴으로써 제조할 수 있다. 가장 바람직하기로 2.5 mM Ca²⁺, 142 mM Na⁺, 1.5 mM Mg²⁺, 5.0 mM K⁺, 125.0 mM Cl^-,7.0 mM HCO₃ ^-, 1.0 mM HPO₄ ^2-및 0.5 mM SO₄ ^2- 를 포함하는 pH 7.4의 생체유사용액(SBF)을 사용한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 하이드록시아파타이트 다공성 마이크로스피어 제조

1.1 하이드록시아파타이트 분말의 제조

전구체인 Ca(NO₃)₂·4H₂O와 (NH₄)₂HPO₄를수용액으로 하는 습식반응에 의해 하이드록시아파타이트 분말을 제조하였다. 각각의 화합물은 증류수에 용해하였고, 화학양론적으로 Ca/P의 몰비가 1.67이 되도록 혼합하였다. 반응은 37 ℃에서 24시간 공기중에서 진행되었고, pH는 Tris-HCl 버퍼를 사용하여 9.0으로 조정하였다. 반응후 침전을 여과하고, 세척한 후 건조하였다. 건조된 분말은 700 ℃에서 3시간 동안 하소(calcine)하여 하이드록시아파타이트 분말을 얻었다.

1.2 세라믹 슬러리의 제조

수득한 하이드록시아파타이트 분말과 캄펜(C₁₀H₁₆, 시그마-알드리치)을 1:8의 중량비로 혼합한 뒤 50 ℃에서 볼밀링하였고, 여기에 0.75 중량%로 계면활성제 KD4를 첨가하여 슬러리 혼합물을 제조하였다. 디클로로메탄에 10 중량% 폴리비닐부티럴이 용해된 용액을 10 부피%로 슬러리 혼합물에 첨가하였다. 이와 같이 제조된 혼합물을 24시간 동안 볼밀링하여 균질화하여 슬러리를 제조하였다.

1.3 다공성 마이크로스피어의 제조

제조된 슬러리를 2% PVA 함유 증류수가 담긴 수상에 750 rpm으로 교반하면서 한 방울씩 떨어뜨렸다. 슬러리를 30 분 동안 고화한 후 여과하고 얼음으로 냉각한 증류수로 세척하였다. 세척된 마이크로스피어는 -20 ℃에서 10 분 동안 보관한 후 알루미나 도가니에 모아둔 다음 대기조건에서 하룻밤 동안 건조하여 캄펜을 승화시켰다. 이때 승화 시간에 따른 마이크로스피어의 중량변화를 측정하였다. 수득한 마이크로스피어를 승온 속도 2 ℃/분으로 1400 ℃까지 가열하여 3시간 동안 열처리하였고, 노 안에서 공기 중 냉각하였다.

실시예 2: 아파타이트-월라스토나이트 다공성 마이크로스피어의 제조

2.1 칼슘 실리케이트 분말의 제조

생체활성 세라믹 마이크로스피어를 위한 전구체로서 칼슘 실리케이트 분말을 제조하였다.

구체적으로, 촉매로 수산화나트륨을 사용하여 Ca(NO₃)₂·4H₂O와 테트라에틸 오르소실리케이트(TEOS)를 1:1의 몰분율로 하여 에탄올과 함께 혼합하였다. 혼합된 용액을 교반한 다음 용액을 겔 상태로 될 때까지 40 ℃에 그대로 둔 뒤, 70 ℃에서 건조하였다. 건조된 분말을 분쇄한 다음 500 ℃에서 시간 동안 하소(calcine)하여 칼슘 실리케이트 분말을 얻었다.

2.2 세라믹 슬러리의 제조

하이드록시아파타이트 분말 대신 칼슘 실리케이트 분말을 사용한 것을 제외하고는 상기 1.2와 동일하게 수행하여 세라믹 슬러리를 제조하였다.

2.3 다공성 마이크로스피어의 제조

제조된 슬러리를 2% PVA 함유 증류수가 담긴 수상에 750 rpm으로 교반하면서 한 방울씩 떨어뜨렸다. 슬러리를 30 분 동안 고화한 후 여과하고 얼음으로 냉각한 증류수로 세척하였다. 세척된 마이크로스피어는 -20 ℃에서 10 분 동안 보관한 후 알루미나 도가니에 모아둔 다음 대기조건에서 하룻밤 동안 건조하여 캄펜을 승화시켰다. 이후, 생체유사용액인 SBF 용액(2.5 mM Ca²⁺, 142 mM Na⁺, 1.5 mM Mg²⁺, 5.0 mM K⁺, 147.8 mM Cl^-,4.2 mM HCO₃ ^-, 1.0 mM HPO₄ ^2-및 0.5 mM SO₄ ^2- )에 상온에서 24 시간 동안 침지한 다음 마이크로스피어를 승온 속도 2 ℃/분으로 1400 ℃까지 가열하여 3시간 동안 열처리하였고, 노 안에서 공기 중 냉각하였다.

실험예 1: 주사전자현미경 분석

상기 실시예 2에서 제조된 다공성 마이크로스피어의 표면 형상 및 미세 구조를 알아보기 위해 Pt 코팅후 다공성 마이크로스피어를 주사전자현미경(Scanning electron microscopy)으로 분석하였고, 얻어진 결과를 도 2 (A) 및 (B)에 나타내었다.

도 2의 (A)는 실시예 2에서 제조된 다공성 마이크로스피어의 표면을 300배, (B)는 1500배 확대한 주사전자현미경 사진이다.

도 2를 참조하면, 20 내지 50 ㎛ 직경의 미세 기공이 마이크로스피어 전체에 거쳐 잘 형성되고, 형성된 미세 기공은 열리 구조를 가짐을 확인할 수 있다.

실험예 2: 다공성 마이크로스피어의 평균 입경 분석

상기 실시예 2에서 제조한 다공성 마이크로스피어의 사이즈 분포를 알아보기 위해 입경을 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3을 참조하면, 다공성 마이크로스피어는 수십 내지 수백 ㎛ 입경을 갖는 크기로, 평균 입경이 241 ㎛임을 알 수 있다. 이러한 평균 입경은 세포 전달 및 조직 공학적 적용에 적절한 크기로 판단된다.

실험예 3: 중량 변화 분석

본 발명의 제조방법에서 기공 형성제로 사용된 캄펜의 승화에 따른 마이크로스피어의 중량변화를 측정하고, 이를 도 4에 나타내었다.

도 4는 실시예 2에서 승화 시간에 따른 다공성 마이크로스피어의 중량변화를 그래프로 나타낸 것이다.

도 4를 참조하면, 캄펜의 승화는 빠르게 진행되어 거의 6 시간 이내에 완료됨을 알 수 있다.

실험예 4: XRD 분석

본 발명의 제조방법이 출발물질인 인산칼슘계 세라믹의 결정화에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 실시예 1에서 출발물질로 사용한 하이드록시아파타이트 분말과 실시예 1에서 제조된 중공형 마이크로스피어를 X-선 회절분석기(X-Ray Diffraction, XRD)를 이용하여 측정하였으며, 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5의 (A)는 실시예 1의 하이드록시아파타이트 다공성 마이크로스피어의 X-Ray 회절 분석 스펙트럼, (B)는 열처리 온도에 따른 실시예 2의 아파타이트-월라 스토나이트 다공성 마이크로스피어의 X-Ray 회절 분석 스펙트럼이다.

도 5의 (A)를 참조하면, 출발물질인 하이드록시아파타이트 분말(1)과 달리 다공성 마이크로스피어의 경우(2), 특징적인 하이드록시아파타이트 결정의 피크가 관찰되어, 본 발명의 제조방법을 통해 출발물질인 하이드록시아파타이트가 결정화 되었음을 확인할 수 있다.

도 5의 (B)를 참조하면, 다공성 마이크로스피어의 치밀화와 관련된 기계적 강도 수준을 제공하기 위해 1200 ℃ 이상의 온도에서 열처리가 필요하며, 최초의 출발 물질인 칼슘 실리케이트가 생체유사용액 침치 및 열처리에 의해 하이드록시아파타이트(A)와 월라스토나이트(wollastonite, W)의 결정구조로 바뀌었음을 알 수 있다. 이러한 아파타이트-월라스토나이트 이중상은 A-W 유리 세라믹에서 일반적으로 관찰되는 주요한 결정상이다. 더욱이, in vitro와 in vivo에서 표면에 골 미네랄과 유사한 상을 형성하는 것이 골 활성이 있다고 보고되었으며(Yamamuro T, World Scientific; 1993. p. 89.103; Nakamura T, J Biomed Mater Res 1985;19:685.9), 이와 같이 표면에 골 미네랄과 유사한 상이 형성된 골이식재를 사용하는 경우 골형성(osteogenic) 반응을 조절하고, 경조직에 직접 결합할 수 있는 결과를 얻을 수 있다.

실험예 5: in vitro 생체 활성 확인 실험

in vitro 활성을 확인하기 위해, 생체유사용액인 SBF 용액(2.5 mM Ca²⁺, 142 mM Na⁺, 1.5 mM Mg²⁺, 5.0 mM K⁺, 147.8 mM Cl^-,4.2 mM HCO₃ ^-, 1.0 mM HPO₄ ^2-및 0.5 mM SO₄ ^2- )에 상기 실시예 2에서 제조한 다공성 마이크로스피어를 인큐베이트하였다(Kokubo T. Biomaterials 1991;12:155.63)

구체적으로, 폴리에틸렌튜브에 다공성 마이크로스피어 100 mg을 넣고, 10 ml의 SBF 용액에 침지하여 37 ℃에서 120 rpm으로 교반하면서 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후, 증류수와 에탄올로 세척하고 오븐에서 건조한 다음 중량 변화를 측정하였다. 다공성 마이크로스피어의 표면 물성은 주사전자현미경 사진으로 관찰하여 마이크로스피어 표면에 유도된 침전을 확인하고, 에너지 분산 스펙트로스코피(EDS)로 침적물의 원소를 분석하였다.

도 6의 (A)는 실시예 2에서 제조된 다공성 마이크로스피어를 SBF 용액에 1일, (B)와 (C)는 7일 동안 인큐베이트한 후 표면을 관찰한 주사전자현미경 사진이다.

도 6의 (A)를 참조하면, 1일 침전 후 다공성 마이크로스피어의 표면 대부분에 작은 침전물이 형성된 것을 알 수 있고, (B)를 참조하면, 1일 침전 후 형성되었던 나노결정들이 더욱 켜졌음을 알 수 있으며, 현미경 상으로는 기공 크기와 마이크로스피어의 형성에 큰 변화는 없는 것으로 관찰되었다.

도 7의 (A)와 (B)는 에너진 분산 스펙트럼을 나타낸 그래프, (C)는 인큐베이션 시간에 따른 중량변화를 나타낸 그래프이다.

도 7을 참조하면, SBF 용액에 침적하기 전의 경우(A)와 비교하여, 7일 인큐 베이션 후 인(P)이 존재하고, 규소(Si)에 비해 칼슘(Ca)의 강도가 더 높다는 것은칼슘 포스페이트가 침전되었음을 의미한다. Ca/P의 비율은 1.53 이하고 측정되었고, 이는 화학양론적으로 하이드록시아파타이트(1.67)과 유사하지만 작은 값으로, 칼슘이 부족한 하이드록시아파타이트가 형성되었음을 나타낸다.

또한, 도 7의 (C)를 참조하면, 침적 시간이 증가할 수록 마이크로스피어의 중량이 증가하였고, 이는 칼슘 포스페이트가 침전되었음을 알 수 있다. 비록 마이크로스피어로부터 이온이 용해(칼슘, 실리콘)되지만 칼슘 포스페이트의 침전이 우세하여 마이크로스피어의 중량이 증가한 것으로 보인다.

실험예 6: 전조골세포 배양 실험

상기 실시예 2에서 제조한 중공형 마이크로스피어의 생체활성도를 알아보기 위해 전조골세포(preosteoblast)인 쥐-유래 MC3T3-E1 세포를 배양하여 마이크로스피어 표면 및 내부에서 자란 세포의 형상을 관찰하였으며, MTS (CellTiter 96 AQueous One solution cell proliferation assay : promega) 분석을 이용하여 세포 증식률을 측정하였다.

세포를 시딩하기 전에 마이크로스피어를 무혈청 배지로 두 번 세척하였고, 10 mg씩 96-웰 플레이트의 각 웰에 넣었다. 이후 70 ㎕ 세포 부유액(cell suspension, 세포농도 6×10⁴ cells/mL(저밀도), 5×10⁵ cells/mL(고밀도))을 각각의 웰에 씨딩하였다. 95% CO₂ 인큐베이터에서 6시간 동안 배양한 후, 골 분화(osteoblastic differentiation)를 유도하기 위해 125 ㎕ 배지당 50 ㎍/ml 아스크로브산 나트륨, 10 mM β-글리세롤 포스페이트 및 10 nM 덱사메타손을 첨가하였다. 6 시간 배양 후 150 ㎕ 배지를 각각의 웰에 추가하였고, 그 다음 3, 7, 10일 동안 배양하였다.

마이크로스피어 표면 및 내부에서 자란 세포 형상은 시료를 글루타르알데히드로 고정하고, 에탄올(50%, 70%, 90%, 95% 및 100%)로 탈수화한 다음 헥사메틸 디실라잔으로 처리하고 Pt로 코팅하여 주사전자현미경(Scanning electron microscopy)으로 분석하였고, 얻어진 결과를 도 8의 (A) 내지 (C)에 나타내었다.

세포 증식률은 MTS ((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethonyphenol)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)) 분석에 의해 정량되었고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

각각의 배양기간(1, 5, 및 15일) 별로, 배지를 분리하여, CellTitero 96 AQueous One 용액 반응제(Promega, Madison)를 각각의 샘플에 첨가하고, 37 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 490 nm 흡광도는 Elisa Plate Reader로 측정하였다. 각 조건에 대한 5개의 시료로 분석하였고, 실험결과는 평균± SD로 나타내었다.

도 8의 (A)는 실시예 2에서 제조된 다공성 마이크로스피어를 이용하여 골형성세포인 MC3T3-E1을 5일(고밀도), (B)는 15일(고밀도) (C)는 15일(저밀도) 동안 배양한 후 표면을 확대한 주사전자현미경 사진이다.

도 8의 (A)를 참조하면, 고밀도로 세포가 시딩된 경우, 마이크로스피어 표면에 세포가 잘 부착하여 5일 동안 표면의 빈 공간을 서로 가교함을 알 수 있었다. 도 8의 (B)를 참조하면, 배양시간이 길어져 15일 동안 배양된 경우 세포는 더욱 활성화되어 다공성 마이크로스피어의 표면을 거의 덮었다. 도 8의 (C)를 참조하면, 세포가 저밀도로 시딩된 경우, 표면에 세포가 잘 부착하였고, 배양시간이 지나갈수록 세포가 증가하였으나, 15일 기간 배양되었음에도 마이크로스피어 표면 전체를 덮지는 못하였다.

도 9는 본 발명의 실시예 2에서 제조한 다공성 마이크로스피어 표면에서 골형성 세포의 증식률을 MTS 방법으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9를 참조하면, 배양 시간이 길어짐에 따라 세포의 양이 지속적으로 증가하였음을 보여주고, 이는 본 발명의 마이크로스피어가 세포가 부착하여 증식하기에 바람직한 지지체라는 것을 의미한다. 또한, 배양시간에 따라, 세포 증식율은 유의한 차이(P<0.05)를 보였다. 첫날 세포 접착단계에서의 초기 차는 그 이후부터의 세포 증식기간동안 줄곧 유지되는 것으로 확인되었다. 세포 성장속도에 근거해보면, 적은 농도로 접종하는 경우, 마이크로스피어 전체 면적을 커버하기 위하여 보다 더 긴 배양시간이 필요할 수 있다. 이러한 결과로 미루어 볼 때, 마이크로스피어를 세포 전달 수단과 조직 공학 매트릭스로 사용할 경우, 초기 세포 접종 농도는 조심스럽게 조절해야한다. 3차원 기재에서의 세포의 밀도와 합류 시간은 골생성 분화의 조절 및 세부 외부 매트릭스의 특성 조절을 위한 적정 조건을 찾는데 굉장히 중요하다. 예비 세포 배양 연구에 근거하면, 초기 접합과 세포성장을 위한 적정 스캐폴드 조건을 제공하면, 다공성 생물활성 마이크로스피어는 골아세포에 대하여 양호한 반응을 보였다.

본 발명에 따른 다공성 마이크로스피어는 세포친화성 및 골전도성이 우수하여 골 및 치주 조직의 재생을 위한 조직공학용 지지체로 이용되어 치과 및 정형외과 분야에 효과적으로 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 마이크로스피어의 제조단계를 보여주는 모식도이다.

도 3은 본 발명의 실시예 2에서 제조된 중공형 마이크로스피어의 사이즈 분포도를 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 실시예 2에서 승화 시간에 따른 다공성 마이크로스피어의 중량변화를 그래프로 나타낸 것이다.

도 5의 (A)는 실시예 1의 하이드록시아파타이트 다공성 마이크로스피어의 X-Ray 회절 분석 스펙트럼, (B)는 열처리 온도에 따른 실시예 2의 아파타이트-월라스토나이트 다공성 마이크로스피어의 X-Ray 회절 분석 스펙트럼이다.

도 9는 본 발명의 실시예 2에서 제조한 다공성 마이크로스피어 표면에서 골 형성 세포의 증식률을 MTS 방법으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.

Claims

생체활성 세라믹을 포함하는 구형의 몸체의 표면 및 내부에 미세 기공이 형성되고, 상기 미세 기공이 상호 연결된 열린 기공 구조를 갖는 다공성 마이크로스피어.
제1항에 있어서, 상기 생체활성 세라믹은

하이드록시아파타이트, 옥시 아파타이트, 인산일칼슘, 인산이칼슘, 인산삼칼슘, 인산사칼슘, 칼슘메타 포스페이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 인산칼슘계 세라믹; 트리칼슘 실리케이트, 칼슘 오르소실리케이트, 칼슘 디실리케이트, 트리칼슘 디실리케이트, 월라스토나이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 칼슘실리케이트계 세라믹; 실리카, 산화나트륨, 산화칼슘, 오산화인 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 생체활성유리; 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 다공성 마이크로스피어.
제1항에 있어서, 상기 마이크로스피어의 평균입경은

220 내지 260 ㎛인 것을 특징으로 하는 다공성 마이크로스피어.
제1항에 있어서, 상기 미세 기공의 직경은

20 내지 50 ㎛인 것을 특징으로 하는 다공성 마이크로스피어.
S1) 생체활성 세라믹; 유기용매; 분산제; 기공형성제; 및 결합제를 포함하는 세라믹 슬러리를 제조하는 단계;

S2) 친수성 용매 및 계면활성제를 포함하는 수상을 제조하는 단계;

S3) 상기 S2)에서 제조된 수상에 상기 S1)에서 제조된 세라믹 슬러리를 적하하는 단계;

S4) 상기 수상 중에 생성된 마이크로스피어를 수득하는 단계;

S5) 기공형성제를 승화시켜 마이크로스피어 몸체 및 내부에 기공을 형성하는 단계; 및

S6) 상기 S5)에서 수득한 기공이 형성된 마이크로스피어를 열처리하는 단계

를 포함하는 다공성 마이크로스피어의 제조방법.
제5항에 있어서,

상기 S5)에서 수득한 기공이 형성된 마이크로스피어를 생체유사용액에 침지하는 단계를 더욱 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 생체활성 세라믹은

하이드록시아파타이트, 옥시 아파타이트, 인산일칼슘, 인산이칼슘, 인산삼칼슘, 인산사칼슘, 칼슘메타 포스페이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 인산칼슘계 세라믹; 트리칼슘 실리케이트, 칼슘 오르소실리케이트, 칼슘 디실리 케이트, 트리칼슘 디실리케이트, 월라스토나이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 칼슘실리케이트계 세라믹; 실리카, 산화나트륨, 산화칼슘, 오산화인 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 생체활성유리; 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 유기용매는

디클로로메탄, 클로로포름, 디메틸포름아미드, 에틸 아세테이트, 에탄올, 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, 테트라하이드로퓨란, 아세트산, 디메틸설폭사이드 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 분산제는

올리고머폴리에스터(oligomeric polyester)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 기공형성제는

캄펜, 캠포르, 나프탈렌, 멘톨, 티몰, 쿠마린, 바닐린, 살리실아미드, 2-아미노피리딘, t-부탄올, 트리클로로- t-부탄올, 이미다졸, 디메틸설폰, 우레아, 2-아미도피리딘로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 결합제는

폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐부티럴 및 이들의 혼합물로 이 루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 계면활성제는

폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리비닐메틸에테르, 폴리비닐에테르, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 열처리는

600 내지 1500 ℃에서 10 분 내지 5 시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 제조방법.