KR20100137624A

KR20100137624A - 티모신 베타 4를 포함하는 신경세포 손상 억제 또는 치료제

Info

Publication number: KR20100137624A
Application number: KR1020090055759A
Authority: KR
Inventors: 문은이; 류종훈
Original assignee: 세종대학교산학협력단
Priority date: 2009-06-23
Filing date: 2009-06-23
Publication date: 2010-12-31
Also published as: KR101158047B1

Abstract

본 발명은 티모신 베타 4 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는 뇌혈류량 감소로 인한 질환과 연관된 신경세포 손상 억제 또는 치료제를 제공한다. 또한 본 발명은 티모신 베타 4를 발현하는 동물모델 및 상기 동물 모델을 이용한 신경세포 손상에 대한 치료 또는 진단 마커 선별 방법을 제공한다.

티모신 베타 4, 염증반응, 신경세포, 전뇌허혈

Description

티모신 베타 4를 포함하는 신경세포 손상 억제 또는 치료제 {Composition for preventing or treating neuronal cell damage}

본 발명은 뇌질환치료 분야에 관한 것으로, 구체적으로 티모신 베타 4를 이용한 뇌신경세포의 손상을 억제 또는 치료하는 새로운 용도 및 티모신 베타 4를 과발현하는 동물모델에 관한 것이다.

노인 인구의 증가로 허혈성 뇌손상과 알츠하이머병 환자가 급증하고 있으나, 이들 질환을 치료하기 위한 약물의 수와 치료효과는 매우 제한적이다. 따라서 국내외에서 이들 뇌질환을 위한 신약을 개발하기 위한 연구가 매우 활발히 진행되고 있다. 뇌졸중은 뇌혈관이 막히거나 (ischemia, stroke) 뇌혈관이 터져 뇌에 손상을 일으켜 뇌기능을 저하시키는 질환이다. 뇌경색은 뇌졸중의 약 80%를 차지하며, 뇌혈관이 막힘으로 인하여 뇌세포로의 혈액공급이 저하되거나 중단된다. 이러한 경우 뇌는 허혈상태 (ischemia state)에 있다고 하며, 뇌세포는 산소부족 상태에 있게 된다. 허혈상태의 시간이 길어질수록 뇌세포 손상은 더 심해진다. 이때 많은 뇌신경세포가 즉각적으로 사멸되고 일부는 손상을 입은 상태로 존재한다. 약물투여에 의해 혈액의 흐름이 개선되어도, 적절한 치료를 하지 않으면, 이들 세포들도 자연 사 (apoptosis)등의 과정을 거쳐 사멸하게 되어 뇌손상 정도가 더 심해진다. 이 과정에서 뇌세포들이 더 이상 사멸하는 것을 방지할 수 있는 신경세포 보호제 (neuroprotective agents)등에 대한 연구가 집중적으로 진행되고 있다.

최근까지 많은 국내외 제약회사들에 의해 알츠하이머병의 치료제를 개발하기 위한 노력이 있어 왔으나 현재 미국이 FDA에 의해 치료제로서 승인된 약품은 타크린(tacrine), 도네페스질(donepeszil), 리바스티그민(rivastigmine), 갈란타민(galantamine) 뿐이며, 이들은 모두 아세틸콜린 에스터라제 저해제이다. 최근에도 계속적으로 단독 혹은 복합제로 사용될 때 더 나은 효과를 나타내는 저해제를 개발하기 위한 연구가 국내외에서 진행 중이다. 하지만 이들 약물은 알츠하이머병에 의한 뇌손상을 근본적으로 차단하지는 못하기 때문에 그 사용에는 한계가 있다.

뇌졸중에 의해 발생하는 허혈성 뇌손상을 치료할 수 있는 치료제를 개발하기 위해 NMDA(N-Methyl D-Aspartic Acid) 수용체 길항제들을 개발하고자 많은 노력이 있어왔으나, 임상단계서 기대했던 만큼의 효과를 보지 못했다.

앞으로 뇌신경세포 손상을 억제하기 위한 연구개발은 분자생물학과 지놈프로젝트 유전정보를 활용한 연구가 가속화될 것으로 전망된다.

본 발명은 티모신 베타 4 단백질 또는 티모신 베타 4 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는, 뇌혈류량 감소로 인한 질환과 연관된 신경세포 손상 억제 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 뇌혈류량 감소로 인한 질환은 뇌경색 및 뇌출혈을 포함하는 뇌허혈, 치매인 신경세포 손상 억제 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 뇌혈류량 감소로 인한 질환은 국소 또는 전뇌허혈인 신경세포 손상 억제 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 티모신 베타 4 유전자를 포함하고 이를 발현하는 인간을 제외한 형질전환 동물모델을 제공한다.

본 발명은 또한 티모신 베타 4를 발현하는 동물모델을 이용한 뇌혈류량 감소로 인한 질환의 치료 또는 진단용 마커 선별방법을 제공하며, 상기 방법은 동물모델 및 정상 동물 각각에 허혈성 뇌손상을 유발하는 단계; 상기 허혈성 뇌손상이 유발된 각 동물로부터 일정 시간 후에 뇌조직을 추출하는 단계; 및 상기 뇌조직에서 RNA 또는 단백질을 추출한 후, 이를 상호 비교하여 발현의 변화가 있는 RNA 또는 단백질을 규명하는 단계를 포함한다.

티모신 베타 4(Thymosin Beta 4, Tβ4)는 1981년에 흉선에서 처음으로 발견되었으며, 41-43개의 아미노산으로 이루어져 있고 상이한 종간에 그 서열이 매우 잘 보존되어 있는 것으로 알려져 있다 (Low, TL, Hu, SK, and Goldstein, AL, (1981) PNAS 78:1162-1166). 이들 단백질은 대부분의 포유류 조직에서 발현되며 특히 혈소판, 호중구, 대식세포 림프세포에서 고농도로 발현된다. Tβ4는 동물세포에서 액틴격리(sequestering) 분자로서 그 기능이 처음 밝혀진 후 (Safer D. et al., (1991) J.Biol.Chem.;266(7):4029-4032), 면역조절, 상처치료 및 염증반응을 감소시키거나 혈관 생성을 촉진하는 등 생체내 다양한 기능에 관여하는 것으로 알려졌다(Malinda, KM, Sidhu, GS, Mani, H, Banaudha, K, Maheshwari, RK, Goldstein, AL, and Kleinman, HK (1999) J. Invest. Dermatol. 113:364-368; Malinda, KM, Goldstein, AL, and Kleinman, HK (1997) FASEB J. 11:474-481).

본원은 마우스에서의 Tβ4의 과발현이 뇌로의 혈류량 감소시 신경세포 사멸을 감소시켜 신경세포 손상 및 염증반응을 억제하여 뇌신경세포 치료/보호효과를 가져오는 Tβ4의 새로운 용도 발견에 기초한 것이다.

따라서, 한 양태에서 본 발명은 티모신 베타 4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는, 뇌혈류량 감소로 인한 질환과 연관된 신경세포 손상 억제 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 Tβ4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은, 본 발명에 따른 신경세포 손상 억제 및 치료 효과를 나타낼 수 있는, 인간을 포함한 다양한 포유류 유래의 것 및 이와 기능적으로 동등한 변이체를 모두 포함하는 것이다. 한 구현예에서 인간 유래의 Tβ4 단백질 또는 핵산이 사용되나 이로 제한하는 것은 아니다. 인간 을 포함한 다양한 포유류 유래의 Tβ4 단백질 및 핵산 서열이 공지되어 있으며, 예를 들면 인간의 경우 Tβ4 단백질 및 이를 코딩하는 핵산은 각각 NCBI Accession No: NM_021109 및 NP_066932로 공지되어 있으며, 마우스(Mus musculus) 의 경우는 각각 NM_021278 및 NP_067253로 공지되어 있으며, 이들 모두 본 발명에 사용될 수 있으나 이로 한정하는 것은 아니다. 한 구현예에서 Tβ4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 인간유래의 것으로 각각 NM_021109 및 NP_066932에 기재된 서열이다.

용어 기능적으로 동등한 변이체란 특정 종 유래의 야생형 단백질 또는 이의 핵산 서열과 비교하여 변이가 있지만 본 발명에 따른 기능을 갖는 것을 말한다. 따라서, 예를 들면, 본 발명의 Tβ4단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 예를 들어 인간유래의 서열 NM_021109, NP_066932 및 이와 기능적으로 동등한 변이체를 포함한다. 이러한 것에는 예를 들어 상기 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 이를 암호화하는 돌연변이체(mutants), 유도체(derivatives), 대립유전자(alleles), 변형체(variants) 및 동질체 (homologues)를 포함한다. 아미노산 서열이 변화된 단백질을 암호화하는 유전자는 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어, 부위유도성 돌연변이법(site-directed mutagenesis, Kramer, W.& Fritz, H-J. Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplux DNA. Methods in Enzymology (1987) 154:350-367) 등에 의해 제조될 수 있다. 또한 염기서열의 변이에 의한 암호화하는 단백질의 아미노산 서열변이는 자연적 상태에서 도 발생된다. 나아가, 예를 들어, 염기서열 변이가 단백질 중의 아미노산의 변이를 수반하지 않는 경우(축중변이)가 존재하며, 이러한 축중변이체(degeneracy mutants)도 본 발명의 핵산에 포함된다.

본 발명의 Tβ4 단백질을 코딩하는 핵산은 Tβ4 단백질을 암호화하는 DNA, cDNA 및 화학합성 DNA 및 RNA를 포함한다. 또한 상기 핵산은 이중쇄 또는 단쇄일 수 있다. 지놈 DNA 및 cDNA는 당업계의 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다. 지놈 DNA는 예를 들어, Tβ4 유전자를 가지는 세포로부터 지놈 DNA를 추출하고 지놈 라이브러리(벡터는 예를 들면 플라스미드, 파지, 코스미드, BAC, PAC 등이 이용될 수 있다)를 제작하고 상기 라이브러리를 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 기초로 제작한 프로브를 이용하여 콜로니 또는 플라그 혼성화를 수행하거나, 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA (예를 들어 NP_066932로 공지된 서열)에 특이적인 프라이머를 제작하고, 이를 이용한 폴리머라제연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 행함으로써 제조할 수도 있다. cDNA는 예를 들어, Tβ4 유전자를 포함하는 세포에서 추출한 mRNA를 기초로 cDNA를 합성한 후 PCR을 수행하여 제조할 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 “뇌혈류량 감소로 인한 질환”은 뇌허혈성 질환을 일컫는 것으로 이는 크게 전(全)뇌허혈과 국소뇌허혈과 로 구분될 수 있다. 전자는 뇌의 대부분 또는 전체에 걸쳐 혈액 공급이 감소되는 경우에 나타나며, 후자는 특정한 부위로의 혈액 공급이 감소되는 경우에 나타나는 현상이다. 뇌허혈이 발생할 경우 신경세포 손상이 발생하여 기억력이 감퇴되며 염증반응이 증가하게 된다. 한 구현예에서 뇌혈류량 감소로 인한 질환은 전뇌허혈 및 국소뇌허혈을 모두 포함한 다. 다른 구현예에서, 뇌혈류량 감소로 인한 질환은 전뇌허혈을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 뇌혈류량 감소로 인한 질환은 뇌경색 및 뇌출혈을 포함하는 뇌허혈, 또는 치매를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

다른 양태에서, 본 발명은 또한 티모신 베타4를 과발현하는 형질전환 동물모델에 관한 것이다. 본 발명의 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 Tβ4를 과발현하는 형질전환 동물모델은 뇌로의 혈류량 감소 시에, 특히 전뇌허혈 유발시에 뇌조직, 예를 들면 해마 및 대뇌피질에서의 뇌신경세포 사멸이 감소되어, 신경세포 손상이 현저하게 억제된다. 나아가 염증반응이 감소되며, 소교세포에서 생성되는 iNOS 생성이 감소되어 있다.

특정 유전자를 과발현하는 동물모델은 상기 유전자의 생체내 기능을 규명하기 위해 사용된다. 따라서 본 발명의 동물모델은 Tβ4의 뇌신경세포 보호 작용 기전을 규명하는 도구로서 뿐만이 아니라, Tβ4를 통하여 작용하는 뇌혈류량 감소로 인한 질환의 치료 및 진단용 표적 마커 선별에 사용될 수 있다. 특히, Tβ4와 상호작용하여 뇌신경세포 보호 작용에 관여하는 단백질 또는 유전자를 규명하여 새로운 뇌신경세포 보호 타겟을 발굴하고 치료제를 개발하는 데 사용할 수 있다.

본 발명에서“ Tβ4 과발현”이란 동물모델에 사용되는 동물에 존재하는 상응하는 내인성 단백질보다 높은 수준으로 발현되는 것이다. 이러한 과발현은 예를 들면 과발현 대상 유전자를 적절한 프로모터, 예를 들면 비조절성 (constitutive) 프로모터에 연결하여 상기 유전자가 계속적으로 발현하게 하는 것이다. 다른 방법으로는 상기 과발현 대상 유전자를 강력한 유도성 프로모터에 연결하여 필요에 따 라 과발현하는 방식이 있다. 한 구현예에서 과발현은 내인성과 비교하여 약 1배 이상, 약 10배 이상, 약 100배 이상, 약 500배 이상, 약 1000 배 이상이다.

동물모델에 사용되는 동물은 인간을 제외한 다양한 포유류를 포함하며, 이로 제한하는 것은 아니나, 소, 돼지, 양, 토끼, 설취류가 사용될 수 있다. 한 구현예에서는 상기 동물은 쥣과 (murine)동물, 예를 들면 레트(Mus musculus), 마우스이다. 다른 구현예에서는 마우스 (Mus musculus)이다. 또다른 다른 구현예에서 마우스는 C57BL/6이다.

본 발명에 따른 동물모델은 적어도 하나의, Tβ4 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하고 이를 발현하며, 내인성 Tβ4 좌위에 상동 (homologous)적으로 또는 비상동(non-homologous)적으로, 체세포 또는 생식세포, 또는 체세포 및 생식세포의 유전체에 삽입되어 있다. 상기 Tβ4 단백질을 코딩하는 핵산은 앞서 언급한 종류의 것이 사용될 수 있다. 한 구현예에서 상기 Tβ4 는 인간유래의 것이다. 상기 핵산 서열은 동물조직에서의 발현에 효과적인 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있으며, 이로 인해 Tβ4가 과발현된다. 상기 핵산 서열의 발현에 적합한 다양한 진핵세포용 프로모터가 사용될 수 있다. 한 구현예에서 상기 프로모터는 베타엑틴 프로모터 또는 이와 실질적으로 동등한 발현양상을 가져오는 프로모터가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서, 본 발명의 형질전환 동물모델은 베타엑틴 프로모터의 조절 하에 인간 Tβ4를 발현하는 마우스이며, 상기 Tβ4를 코딩하는 핵산은 비상동적으로 상기 마우스의 체세포 및 생식세포의 유전체에 삽입되어 있다.

특정 유전자를 과발현하는 형질전환 동물모델을 제작하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로 상기 형질전환 동물은 외인성 유전자를 포함하는 표적벡터를 수정난 또는 배아줄기세포 (Embryonic Stem Cell, ES 세포)에 미세주입법, 전기천공법, 리포펙션 또는 유전자총(Biolistics)을 이용해 전달한다. 예를 들면 WO 2005/089539; Nagy et al., Manipulating the Mouse Embryo: A laboratory manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1986, 1994, 2002); 및 Wang et al.,(2005) Journal of Hepatology 43:836844에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면 본 발명의 형질전환동물은, 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 Tβ4 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 유전자를 수정란 또는 배아줄기세포에 전달하는 단계, 가임신된 동물을 준비하는 단계, 상기 수정란을 상기 가임신된 동물의 자궁에 이식하는 단계, 상기 수정란이 새끼로 태어나도록 동물을 기르는 단계, 자손을 수득하여 Tβ4 발현여부를 선별 하는 단계를 수행하여 수득할 수 있다. 상기 수정란 또는 배아줄기세포에 외인성 유전자를 전달하는 단계는 상기 문헌 등에 공지되어 있으며, 선별 방법 또한 당업계에 공지된 RT-PCR 및 면역학적 방법으로 수행될 수 있다. 외인성 유전자를 과발현하는 마우스는 통상적으로 반접합성 (hemizygous)이다.

다른 양태에서 본 발명은 티모신 베타 4를 과발현하는 동물모델을 이용한 뇌혈류량 감소로 인한 질환의 치료 또는 진단용 마커 선별 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 따른 동물모델 및 정상 동물 각각에 허혈성 뇌손상을 유발하는 단계; 상기 허혈성 뇌손상이 유발된 각 동물로부터 일정 시간 후에 뇌조직을 추출하 는 단계; 및 상기 뇌조직에서 RNA 또는 단백질을 추출한 후, 이를 상호 비교하여 발현의 변화가 있는 RNA 또는 단백질을 규명하는 단계를 포함한다.

동물에서 전뇌허혈성 또는 국소뇌허혈을 유발하는 방법은 공지되어 있으며, 예를 들면 Kim JY, Ahn HJ, Ryu JH, Suk K and Park JH (2004) J.Exp. Med 199:113-124 에 기재된 방법을 사용할 수 있다. 또한 예를 들면 전뇌허혈 유발에는 본 실시예에 기재된 바와 같은 총경동맥 결찰법이 사용될 수 있으며, 국소뇌허혈 유발에는 김영태 등, 2003년 The Korean J. Anat. 35(6):543-550 에 기재된 방법이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 뇌허혈 유발 후 즉시 또는 일정시간 경과 후에 상기 동물에서 뇌조직, 예를 들면 해마 및 대뇌피질 등을 추출한다. 일정시간이란 뇌허혈 후에 관심있는 뇌손상을 유발할 수 있는 적절한 시간을 의미하여, 허혈 후 10일 이내, 특히 9일 이내, 8일 이내, 7일 이내, 6일 이내를 의미하나 상기 범위를 벋어나는 것을 배제하는 것은 아니다. 뇌조직 추출 후 RNA, 특히 mRNA 또는 단백질을 공지의 방법 (참조: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley &Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985))대로 추출하여 이들의 발현량을 Tβ4를 과발현하지 않는 동물 유래의 조직과 비교한다. RNA 발현량 비교는 노던블롯, 마이크로어레이 방법 등을 사용할 수 있으며, 단백질 발현량의 비교는 2-D 단백질 전기영동, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 의 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들면 상기 문헌(Sambrook et al., ibid and Ausubel et al., ibid)에 기재된 것을 참조할 수 있다. 상기와 같은 방법을 통해 Tβ4를 과발현하지 않으나 허혈이 유발된 동물모델과 비교하여 발현의 변화 (증가 또는 감소)가 있는 단백질 또는 유전자를 규명한다. 이러한 유전자는 Tβ4와 상호작용하여 뇌신경세포 보호 작용에 관여하는 단백질 또는 유전자로서 새로운 뇌신경세포 보호 타겟을 발굴하고 진단 또는 치료제를 개발하는 데 사용될 수 있다.

한편 본 발명의 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함하나, 상기 범위 이하 또는 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항 체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술 분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 정맥내 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양하다. 전형적으로 투약단위체는 예를 들어 0.001 내지 1000 μg를 포함하나 (또는 상기 범위내의 단백질 발현을 가져올 수 있는 DNA의 양), 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 1μg 내지 10mg 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물을 마우스에 정맥 내 주사에 의하여 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단된다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 달리 언급이 없는 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술, 면역학의 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 다음의 책 및 문헌을 참조할 수 있다. 분자생물학 및 생화학에 관한 일반적인 방법에 관해서는 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley &Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et al., eds.); 및 Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press)등을 참조할 수 있다. 또한 Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley &Sons 1996); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle &Griffiths, John Wiley &Sons 1998)을 참조할 수 있다. 본 명세서에 기술된 시약, 클로닝 벡터 및 키트는 BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, and ClonTech 등과 같은 회사에서 구입할 수 있다. 세포배양 및 배지에 관한 일반적 기술에 관하여는 Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); and Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251)를 참조할 수 있다.

실시예 1: Tβ4를 과발현하는 마우스의 제작

① Tβ4 발현 벡터의 제작

정상인으로부터 말초혈액을 채취하여 즉시 헤파린 (10U/ml)으로 항응고 처리하고 이 중 5ml을 Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden)에 중층하고 1500rpm에서 30분간 농도구배원심분리를 수행하여 단핵구와 혈장을 분리하였다. 분리된 단핵구를 Hank Balanced Salt solution으로 세척후 1ml의 Trizol(Invitrogen, USA)을 처리하여 제조자의 권고방법대로 총 RNA를 분리한 후 올리고-dT18 프라이머 및 다음의 프라이머를 사용하여 RT-PCR을 수행하여 Tβ4 cDNA를 수득하였다. Forward: 5'-CGG GAT CCA TGT CTG ACA AAC CCG ATA TGG C-3’, Reverse: 5'-GGA ATT CTT ACG ATT CGC CTG CTT GCT TC-3’/ PCR 조건 95^oC 30sec, 58^oC 30sec,72^oC 30sec, 총 30 cycle. 수득한 Tβ4 cDNA는 이어서 pCMV-FLAG (2B)(Stratagene, USA) 백터의 BamHI / EcoRI 부위에 클로닝하여 pCMV-FLAG (2B)-Tβ4를 수득하였다.

이어서 상기 벡터를 주형으로 하여 Flag-Tβ4 특이적 프라이머 Forward: 5'-TAT GAA TTC GCC GCC ACC ATG GAT-3' 및; Reverse: 5'-AGC TTG ATA TCG AAT TCT TA-3'를 사용하여 PCR (조건 95^oC 30sec, 58^oC 30sec,72^oC 30sec, 총 45 cycle)을 수행하여 수득한 단편을 베타액틴의 프로모터를 가지고 있는 형질전환 마우스의 생산을 위한 표적벡터인 pCAGGS (Niwa et al. Gene 108, 193-199 (1991))의 EcoRI 부위에 클로닝하여 pCAGGS- Tβ4를 수득하였다. 이 중 8개의 클론을 선택하여 벡터를 공지의 방법대로 분리하였다. 분리된 벡터의 염기서열을 분석하여 Tβ4가 베타엑틴 프로모터의 조절하에서 발현될 수 있도록 클로닝 된 것을 확인 후 이를 형질전환 마우스의 제작에 사용하였다.

② Tβ4 발현 형질전환 마우스의 제작

형질전환마우스는 문헌 Wang et al., (2005) Journal of Hepatology 43:836844 에 기재된 방법에 따라 제작하였다. 요약하면 상기 제작된 pCAGGS- Tβ4 플라즈미드를 제한효소(HindIII, HincII 및 ApaLI)로 선형화 한 후 벡터서열 일부를 제거한 후 정제(Qiagene DNA extraction kit, USA)하여 본 실시예에 사용하였다. 암컷 마우스 C57BL/6 (대한바이오링크, 5주령)에 호르몬인 PMSG(pregnant mare serum gonadotropin;50 IU/mL) 및 HCG(human chorionic gonadotropin 25μ/mL)을 주사한 후 이를 수컷 C57BL/6 마우스와 교배시켰다. 다음날 마우스 수정란이 M2 배지(Sigma, USA)에 방출되도록 한 후, 여기에 히알루로니다제(hyaluronidase 1mg/mL)을 처리하여 수정란을 둘러싸고 있는 세포를 제거하였다. 이어서 남아있는 히알루로니다제 성분을 세척한 뒤 M16 배지(Sigma-Aldrich, USA)로 옮기고 37^oC의 CO₂배양기에서 안정화하였다. 이어 고배율의 현미경하에서 수정란의 전핵(pronuclei)에 상기 DNA를 미세주입한 후 수정란을 37^oC의 CO₂ 배양기에서 배양하였다. 다음날 2 세포로 분화된 수정란만을 선별해, 정관 결찰된 수컷과 교배하여 가임신된 대리모(ICR, 6주령, 대한바이오링크)의 난관에 이식하였다. 요약하면 대리모를 마취 후, 등 중앙부의 털을 제거하고 신장부근의 피부 및 근육을 절개한 뒤, 난소, 난관 및 자궁의 일부를 노출시킨 후, 이를 덮고 있는 난소낭을 찢어 난관을 노출시켰다. 이어 이식용 파이펫에 수정란 10~20개 정도를 흡입하여 상기 노출된 난관내에 삽입하여 천천히 주입하였다. 이식후, 근육층과 피부를 원래대로 봉합하였다.

그 결과 총 8 마리의 대리모로부터 56마리의 한배새끼를 확보하였고, 아래와 같이 PCR 방법으로 유전자형을 분석하여 확인한 결과 다섯 주 (TG-1, TG-2, TG-3, TG-4, TG-5)의 Tβ4 발현 마우스를 확보하였다 (도 1). 상기 PCR을 위해 3주령 마우스의 꼬리로부터 DNA 추출키트 (Qiagen, USA)를 사용하여 유전체 DNA를 추출하고, 다음의 프라이머를 (forward: 5'-ACC ATG TTC ATG CCT TCT TCT T-3'와 reverse: 5'-GTT CAA TCG TTT CTT TGG AAG G-3')를 사용하여 PCR을 수행 (95℃ 30sec, 58℃ 30sec,72℃ 30sec 총 31cycle)하여 Tβ4 유전자 혼입여부를 확인하였다. 유지 중에 TG-5 주는 사망하였으며, 나머지 TG-2, TG-3, TG-4 주는 동조주이고 TG-1 주는 하이브리드 주이다. 하기의 실험은 TG-3 주 (8주령)을 이용한 것이다.

이어서 Tβ4 단백질의 발현 확인을 위해 상기 마우스의 대뇌피질과 해마에서 총 RNA를 Trizol(Invitrogen, USA) 을 제조자의 권고대로 사용하여 분리한 후 RT-PCR를 이용하여 확인하였다 (도 2참조). RT-PCR를 위해, 올리고-dT18을 사용하여 cDNA를 합성 한 후, 이어 상기와 동일한 프라이머 및 조건을 사용하여 Tβ4 DNA를 합성하였다. 결과는 도2에 기재되어 있다. 다섯 주에서 250bp의 Tβ4 DNA 밴드를 확인 할 수 있었으며, 형질전환되지 않은 대조군 마우스에서는 밴드가 나타나지 않았다. GAPDH는 RNA가 모든 웰에 동량으로 로딩되었음을 보여주는 대조군이다.

본 발명 전반에 걸쳐 실험에 사용된 마우스는 사료와 물은 낮 동안에 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 동물 사육실의 온도는 20-25℃, 습도는 40-45%로 유지하였다. 또한 12시간 마다 낮과 밤이 반복되도록 사육실내 명암주기(light-dark cycle)를 조절하였다.

통계 분석은 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test (MW test)로 Windows 용 SPSS (Release 6.1.3., SPSS Inc., USA)를 이용하여 수행하였다.

실험예 1: Tβ4를 과발현하는 마우스에서 전뇌허혈 ( cerebral global ischemia )에 의한 신경세포 손상 억제 확인

① 전뇌허혈 ( cerebral global ischemia ) 모델 동물 제작

오리엔트바이오 (경기, 한국)에서 구입하고 실험실에 적응시킨 C57BL/6 마우스 (야생형 마우스로 사용) 및 TG-3 마우스에 마취가스 (O₂: 30%, N₂O: 70%, Isoflurane: 2.0%) 챔버에서 마취를 유도한 다음 수술대에 등이 바닥에 닿게 위치시켰다. 앞발과 중앙선이 만나는 지점부터 위로 약 1.5 cm 피부를 절개한 뒤 조직이 상하지 않도록 양측 총경동맥을 노출시켰다. 이어 경동맥에 붙어있는 조직 및 신경을 분리하고 양측 총경동맥을 클립으로 20분간 결찰하였다. 이때, 직장 체온계로 마우스의 체온을 측정하고 37 ± 0.5 ℃로 유지시켜 주었다. Sham 대조군은 위와 같이 실험하되 총경동맥을 결찰하지 않은 군을 말한다.

② 전뇌허혈에 의한 공간 단기기억 ( spatial short - term memory ) 손상에 대한 Tβ4 과발현 효과

Tβ4 과발현이 전뇌허혈에 의한 기억 감퇴에 미치는 영향을 확인하기 위해 전뇌허혈 유발 시술 후 7일째 되는 날 Y-미로를 이용하여 단기 공간 기억(spatial short term memory)을 측정하였다. 시험에 사용된 총 마우스는 10 마리이다. Y-미로시험에 이용되는 기구는 3개의 가지로 구성되어 있으며 각 가지 (arm)의 길이는 42 cm, 넓이는 3 cm, 높이는 12 cm이고 세 가지가 접하는 각도는 120도였다. 모든 실험 장치는 검정색의 폴리비닐 플라스틱으로 구성되어 있다. 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 마우스를 조심스럽게 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 마우스가 들어간 가지를 기록하였다. 이때 꼬리까지 완전히 들어갔을 경우에 한하며, 입장했던 가지에 다시 들어간 경우에도 기록하였다. 세 개의 서로 다른 가지에 차례로 들어간 경우 1점 (실제 변경, actual alternation)씩 부여하였다. 변경 행동력 (alternation behavior)은 3가지 모두에 차례로 들어가는 것으로 정의되며, 다음의 수학식에 의해 계산된다:

변경행동력 (%) = 실제변경 (actual alternation)/최대변경 (maximum alternation) x 100.

상기 식에서 최대변경은 총 가지 입장회수-2로 정의된다.

정상상태에서는 야생형 마우스와 TG 마우스 간의 공간단기 기억에는 차이가 없음을 관찰하였다 (도 3 참조). 반면 전뇌허혈이 유발된 경우, 기억력 감퇴가 나타난 야생형 마우스에 비하여 TG 마우스에서는 기억력 감퇴가 나타나지 않았다(도 4).

③ 전뇌허혈에 의한 신경세포 손상에 대한 Tβ4 과발현 효과

Tβ4 과발현이 전뇌허혈에 의한 신경세포 손상 억제에 대한 효과를 확인하기 위해 뇌조직에 대한 니슬(Nissl) 염색을 실시하였다. 염색에 필요한 뇌조직을 얻기 위해 Y-미로 시험 실시 후 실험동물에 펜토바비탈 소디움 (60 mg/kg, i.p.)을 복강투여하여 마취시킨 후 흉강을 열고 좌심실을 통하여 0.1M PBS(Phosphate Buffered Saline,pH(7.4))를 이용하여 심장관류를 실시하고 이후 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 관류고정을 실시하였다. 관류 고정 후 뇌를 적출한 다음 고정액에 담아서 4℃에서 12시간 후고정을 실시하였다. 고정된 뇌 조직은 30% 슈크로스용액에서 2일간 침지시킨 후 Cryostat (American Optica, USA)를 이용하여 30두께의 연속관상 절편을 제작하였다.

마우스당 4장의 뇌조직을 젤라틴으로 코팅된 슬라이드 글라스에 붙이고 2시간을 건조시킨 후 슬라이드를 자일렌에 30분, 100%, 95%, 70% EtOH 순으로 각각 5분씩 담그고 증류수로 세척하였다. 이후 0.1% 크레실 바이올렛 용액에 2분 동안 담근 후 증류수, 70%, 90%, 95% EtOH에 각각 3분, 이후 100% EtOH, 자일렌에 각각 5분씩 담근 후 커버 글라스를 Permount (Polysciences, USA)를 이용해 봉입하였다. Permount가 건조된 후 Leica Microsystems (AG, Wetzlar, Germany)을 이용하여 해마 CA1, CA2 및 대뇌피질 영역의 세포 수를 측정하였다 (도 5 A 및 B). 도 5에서 보는 바와 같이, 전뇌허혈이 유발된 TG 마우스에서는 Sham 과 비교하여 CA1, CA2 및 대뇌피질에서 신경세포의 손상이 거의 일어나지 않은 반면, 전뇌허혈이 유발된 야생형 마우스에서는 Sham 과 비교하여 신경세포가 현저하게 줄어들었음을 보여준다.

④ 전뇌허혈에 의해 유발되는 소교세포 활성화에 대한 Tβ4 과발현 효과

Tβ4 과발현의 전뇌허혈에 의한 염증 발현에 대한 효과를 확인하기 위해 소교세포(microglia)의 면역염색을 실시하였다. 상기 뇌조직 절편을 50mM PBS로 세척한 후 0.5% Triton X-100에 15분 동안 반응시킨 후 1% 과산화수소 (H₂O₂)에 15분간 반응 시켜 내인성 퍼옥시다제를 억제시켰다. H₂O₂를 세척한 후 자유부유(free-floating)법을 사용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. 항체와 반응하기 전에 50mM PBS에 10% 말(horse) 혈청과 1% Bovine Serum Albumin(BSA)를 함유한 차단용액으로 한 시간 동안 반응시켰다. 이후 동일 용액에 모노클론 항-CD11b(OX-42) 항체(BD Biosciences, USA)를 1:1000의 비율로 희석한 용액에 하루 동안 반응시켰다. 이어 시료를 50mM PBS로 세척한 후 1% BSA를 함유하는 50mM PBS에 2차 항체로서 Biotin이 결합된 항-마우스 IgG 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., USA)를 1:500의 비율로 희석하여 1시간 반 동안 반응시키고, 다시 50mM PBS로 세척한 후 Avidin-Biotin-Peroxidase Complex (ABC) 용액에 1시간 반응을 시켰다. 3,3'-디아미노 벤지딘 테트라하이드로클로라이드(diamino benzidine tetrahydrochloride, DAB, DN Liquid DAB Substrate kit, Dinona Inc., 한국)을 제조사의 사용법에 따라 발색을 시킨 후 상기 니슬 염색에서와 같은 방법으로 세포 수를 측정하였다 (도 6 참조). 도 6에서 보는 바와 같이 전뇌허혈 후에 통상적으로 발생하는 활성화된 소교세포의 수가 전뇌허혈의 발생 후에도 TG 마우스의 해마 및 대뇌에서는 야생형 마우스와 비교하여 현저하게 감소하였음을 보여준다.

실험예 2: Tβ4를 과발현하는 마우스에서 염증반응의 감소를 확인

① Lipopolysaccharide ( LPS )로 인한 생존율에 대한 Tβ4 과발현 효과

각각 5 마리의 야생형 마우스와 TG 마우스에 E. coli 055:0B로부터 분리된 LPS를 100 mg/kg의 농도로 복강투여한 후 1시간 간격으로 마우스를 관찰하였다. 시간별로 사망하는 마우스의 개체를 기록한 후 생존율을 그래프로 나타내었다 (도 7 참조). 도 7에서 보는 바와 같이 TG 마우스의 생존률이 야생형 마우스와 비교하여 현저하게 높음을 알 수 있다.

② LPS 로 인한 신경세포 사멸에 대한 Tβ4 과발현 효과

각각 2마리의 야생 마우스와 TG 마우스에 E. coli 055:0B로부터 분리된 LPS를 20 mg/kg의 농도로 복강투여하고 24시간 후에 뇌조직을 적출하여 10% 포름알데하이드에 고정하였다. 뇌조직 절편을 제작하고 50 mM PBS에서 3분씩 3번 세척하였다. 세척 후 조직 절편은 먼저 조직 내에 존재하는 내인성 퍼옥시다제를 비활성화 시키기 위해서 메탄올에 0.05 %로 희석된 과산화수소에 담가 15분간 실온에서 반응시켰다. 반응시킨 조직은 다시 50 mM PBS로 세척한 후, 항원인 PDE4B2를 회복시키기 위하여 0.01 M 시트레이트 완충액(citrate buffer, pH 6.0)에 슬라이드를 넣고 마이크로웨이브(microwave, RE-454A, 700W, 삼성전자, 한국)에 5분씩 3번 가열하였다. 완충액의 증발을 방지하기 위하여 5분 후 1분씩 쉬고 완충액을 조금 더 첨가해 주었다. 이후 TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 분석을 위해 TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase)효소를 이용하여 디그옥시제닌으로 표지된 UTP (uridine truphosphate)를 DNA 절편과 반응시킨다. 반응이 끝난 다음, 조직을 50mM PBS에서 3분씩 3번 세척한 후, 바이오틴이 결합된 항-마우스 (biotin-conjugated anti-Mouse) 디그옥시제닌 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., USA)와 실온에서 반응시켰다. 50mM PBS에서 3분씩 3회 세척한 후, 스트렙트아비딘이 결합된 HRP 복합체 (streptavidin-conjugated HRP complex)를 100 ㎕에 넣고 20분 동안 실온에서 반응시켰다(Universal Detection kit, LSAB, Dinona Inc., 한국). 반응이 끝난 조직은 3,3'-디아미노 벤지딘 테트라하이드로클로라이드 (diamino benzidine tetrahydrochloride, DAB, DN Liquid DAB Substrate kit, Dinona Inc., 한국)를 이용하여 상온에서 7분간 발색시키고, 수돗물로 10분간 세척하였다. 대조염색으로 마이어의 헤마톡실린(Mayer's hematoxylin)으로 7분간 발색시키고, 수돗물에서 10분간 표백(Blueing)하였다. 조직의 탈수를 위하여 에탄올의 농도를 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %로 단계적으로 높여가며 각 1분씩 침지 하였으며, 자일렌으로 투명화시켜 캐나다 발삼(Canada balsam)으로 봉입하고 건조 시킨 후, 광학현미경(E-600, Nikon, 일본)으로 관찰하였다 (도 8 참조). TUNEL 분석에서 양성인 세포는 사멸된 세포를 나타내며, 도 8에서 화살표로 표시되어있다. 도 8에서 보는 바와 같이 TG 마우스에서는 야생형 마우스와 비교하여 LPS 염증 유 도후 사멸된 세포가 현저하게 감소하였음을 보여준다.

③ 전뇌허혈에 의해 유도되는 iNOS 발현에 대한 Tβ4 과발현 효과

Tβ4 과발현이 전뇌허혈에 의한 염증 발현에 미치는 효과를 확인하기 위해 iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인하였다. 마우스 뇌에서 해마, 대뇌피질을 분리 하여 PBS로 세척후 균질화 완충액 (20 mM Tris-HCl [pH 7.4, 0.32 M sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10μg/ml aprotinin, 15μg/ml leupeptin, 10μg/ml bacitracin, 10μg/ml pepstatin, 15 μg/ml trypsin inhibitor, 50 mM NaF, 및 1 mM sodium orthovanadate)에서 세포를 붕해시켰다. 10분간 얼음에 방치 후 4℃, 14000rpm으로 20분간 원심분리를 하였다. 상층액을 새로운 시험관에 옮겨 단백질 정량 후(Quick Start Bradford Protein assay kit, Bio-Rad, USA) 시료로 사용하였다. 상기 시료를 웰당 15μg 로 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)-폴리아크릴아마이드 젤에 로딩하여 100V로 2시간 동안 전기영동한 후 PVDF(Polyvinylidene Fluoride) 막에 전이 완충액(25 mM Tris, 192 mM glycine, 10% v/v methanol)를 이용하여 400mA로 2시간동안 이전하였다. 상기 막을 TBST(Tris Buffered Saline containing Tween)(Millipore, USA)로 5분씩 10회 세척하고 5% 탈지유 용액에서 2시간동안 차단한 후 항-iNOS 항체(1:1000, Upstate, USA)를 2% 탈지유 용액에 희석하여 1차 항체로 하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 1차 항체에 맞는 퍼옥시다제와 결합된 2차 항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)를 1:10000으로 1% 탈지유 용액에 희석하여 1시간 반응시킨 후 화학발광 키트 (chemiluminescence kit)(Amersham Life Science, USA)를 이용하여 발색시켜 필름에 인화하였다. 필름의 음영계측(densitometry)은 Quantity One Image Analysis System version 4.6.3 (Bio-Rad Laboratories, CA, USA)를 이용하여 측정하였다 (도 9 참조). 도 9에서 보는 바와 같이 TG 마우스에서 iNOS의 발현이 야생형 마우스와 비교하여, 전뇌허혈이 발생하지 않은 대조군 수준으로 감소되었음을 보여준다.

실험예 3: Tβ4를 과발현하는 마우스에서 신경세포 증식 증진 확인

Tβ4가 과발현이 신경세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 Tβ4가 과발현된 마우스와 야생형 마우스에 BrdU를 50 mg/kg의 용량으로 2시간 간격으로 투여를 하고 최종 투여 2시간 후 관류 고정하여 상기와 같은 방법으로 뇌 조직 절편을 확보 하였다. 이후 상기 뇌조직 절편을 50mM PBS로 세척한 후 0.5% Triton X-100에 15분 동안 반응시킨 후 1% 과산화수소에 15분간 반응시켜 내인성 퍼옥시다제를 억제시켰다. 이후 과산화수소를 50mM PBS로 세척한 후 자유부유(free-floating)법을 사용하여 면역조직화학 염색을 시행하였다. 2N HCl을 이용하여 37℃에서 30분 동안 반응 시키고 0.1M boric acid로 25 ℃에서 10분간 중화반응을 유도하였다. PBS로 세척 후 항체와 반응하기 전에 50mM PBS에 10% 말 혈청과 1% BSA를 함유한 차단용액으로 한 시간 동안 반응시켰다. 이후 동일 용액에 모노클론 항-BrdU 항체(BD Biosciences, USA) 를 1:500의 비율로 희석한 용액에 하루 동안 반응 시켰다. 50mM PBS로 세척한 후 1% BSA를 함유하는 50mM PBS에 2차 항체인 Biotin이 결합된 항-마우스 IgG 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., USA)를 1:500의 비율로 희석하여 1시간 반 동안 반응 시키고, 다시 50mM PBS로 세척한 후 ABC 용액에 1시간 반응을 시켰다. Ni-DAB를 이용하여 발색을 시킨 후 상기 니슬 염색에서와 같은 방법으로 염색하고 (도 10 A) 해마 치이랑에서 세포 수(도 10 B)를 측정하였다 (도 10 참조). 증식되는 세포는 BrdU 양성으로 나타난다. 도 10에서 보는 바와 같이 TG 마우스에서의 신경세포 증식이 야생형 마우스와 비교하여 2배 이상 증가된 것을 보여준다.

실험예 4: Tβ4 과발현에 의한 Erk 활성화를 확인

Tβ4가 과발현된 마우스와 야생형 마우스에 대하여, 정상상태에서 혹은 전뇌허혈 유도 후 해마에서의 ERK(Extracellular signal regulated kinase)의 활성화를 확인하기 위해 폴리클론 항-pERK (Cell Signaling Technology, USA), 폴리클론 항-ERK 항체(Cell Signaling Technology, USA)를 이용하여 상기와 같은 방법으로 웨스턴 블롯과 면역염색법을 실시하였다 (도 11 및 12 참조). 도 11은 전뇌허혈 전 및 후에 나타나는 야생형 마우스와 TG 마우스에서의 인산화된 ERK의 발현량을 나타내는 해마 및 대뇌피질 조직의 웨스턴블롯의 결과이다. 정상상태에서는 TG 마우스의 해마 및 대뇌피질에서 인산화된 ERK의 발현량이 현저하게 증가되어 있음을 보여주고 있으며, 전뇌허혈 후에는 야생형 마우스에서는 발현량이 증가하나, TG 마우스에서는 변화가 없음을 보여준다. 도12는 전뇌허혈 전 및 후에 나타나는 야생형 마우스와 TG 마우스에서의 인산화된 ERK의 발현량을 나타내는 해마 및 대뇌피질 조직에 대한 면역염색 결과이다. 정상상태에서는 TG 마우스에서 해마 및 대뇌피질에서 인 산화된 ERK의 발현량이 현저하게 증가되어 있음을 보여주고 있으며, 전뇌허혈 후에는 야생마우스에서는 발현량이 증가하지만 TG 마우스에서는 TG 마우스에서는 변화가 없음을 보여준다.

실시예 2: 마우스 동물모델을 이용한 뇌혈류량 감소로 인한 질환의 치료 및 진단용 마커 선별

상기 실시예 1에서 제작된 마우스 및 야생형 마우스에 실험예 1-②에 기술된 바와 같이 전뇌허혈을 유발한다. 전뇌허혈 유발 7일 후에 각 마우스의 뇌조직으로부터 대뇌피질 및 해마를 분리한다. 분리된 조직을 PBS로 세척후 균질화 완충액 (20 mM Tris-HCl [pH 7.4, 0.32 M sucrose, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM PMSF, 10μg/ml aprotinin, 15μg/ml leupeptin, 10μg/ml bacitracin, 10μg/ml pepstatin, 15 μg/ml trypsin inhibitor, 50 mM NaF, 및 1 mM sodium orthovanadate)에서 세포를 붕해시킨다. 10분간 얼음에 방치 후 4℃, 14000rpm으로 20분간 원심분리를 한다. 상층액을 새로운 시험관에 옮겨 단백질 정량(Quick Start Bradford Protein assay kit, Bio-Rad, USA) 후 시료로 사용한다. 상기 시료를 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)-폴리아크릴아마이드 젤에서 100V로 2시간 동안 전기영동한 후 방향을 90도 전환하여 pH 농도구배를 적용하여 IEF(isoelectric focusing)에 따른 2차 단백질 분리를 수행한다. 전기 영동 후 상기 젤에 실버염색을 공지의 방법대로 수행한 후 건조하고 2D 젤 분석용 소프트웨어(Delta 2D, ImageMaster, http://www.expasy.ch/ch2d/ 등)를 사용하여 분석한다.

도 1은 다섯 주(line)(TG1,TG2, TG3, TG4 및 TG5)의 Tβ4를 과발현하는 마우스를 유전자형 분석을 통하여 확인한 결과이다.

도 2는 Tβ4를 과발현하는 마우스의 해마와 대뇌피질에서 Tβ4가 안정적으로 과발현되고 있는 것을 나타내는 RT-PCR 결과이다.

도 3은 정상 상태에서 Tβ4를 과발현하는 마우스(TG)와 야생형 마우스(WT)간의 기억 능력에는 차이가 없음을 Y-미로 시험을 통해 확인한 결과이다.

도 4는 TG 마우스에서는 전(全)뇌허혈에 의한 기억력 감퇴가 발생되지 않음을 Y-미로 시험을 통해 확인한 결과이다.

도 5는 전뇌허혈 후에 해마 및 대뇌피질에서의 신경세포 사멸을 보여주는 조직염색 결과 (A) 및 살아있는 세포수의 측정결과(B)이며, 전뇌허혈이 유발된 야생형 마우스와 비교하여 TG 마우스에서 살아 있는 세포수가 유의성 있게 많음을 보여준다. 막대(bar)의 길이는 50μm이다.

도 6은 전뇌허혈 후에 해마 및 대뇌피질에서의 활성화된 소교세포를 보여주는 염색결과 (A) 및 소교세포 수의 측정결과 (B)이며, 전뇌허혈이 유발된 야생형 마우스와 비교하여 TG 마우스에서 활성화된 소교세포 수가 현저하게 감소하고 있음을 보여준다. 막대의 길이는 50μm이다.

도 7은 염증유발에 사용되는 리포폴리사카라이드(LPS)를 복강투여 하였을 때 TG 마우스의 생존율이 야생형 마우스와 비교하여 증가해 있음을 보여준다.

도 8은 LPS를 복강투여한 후 해마에서 신경세포의 사멸을 터넬분석을 통하여 확인한 염색 (A) 및 터넬양성 세포수(B)를 측정한 결과이며 야생형 마우스와 비교하여 TG 마우스에서 터넬-양성세포가 감소해 있음을 보여준다.

도 9는 전뇌허혈 전 후 iNOS의 발현 변화 변화를 나타내는 웨스턴 블롯 (A) 및 이를 판독한 결과(B)로, 야생형 마우스와 비교하여 TG 마우스에서 iNOS의 발현이 전뇌허혈이 발생하지 않은 대조군 수준으로 감소되었음을 보여준다.

도 10은 야생형 마우스와 비교시 TG 마우스에서 정상상태에서 일어나는 신경세포 분화가 해마의 치이랑(dentate gyrus)에서 현저하게 증가되어 있음을 보여주는 조직염색 (A) 및 BrdU 양성 세포수(B)를 측정한 결과이다. 막대의 길이는 100μm이다.

도 11은 전뇌허혈 전 및 후의 야생형 마우스와 TG 마우스에서의 인산화된 ERK의 발현량을 나타내는, 해마 및 대뇌피질 조직의 웨스턴블롯(A) 및 이를 판독한 결과(B)이다. 정상상태에서는 TG 마우스의 해마 및 대뇌피질에서 인산화된 ERK의 발현량이 현저하게 증가되어 있음을 보여주고 있으며, 전뇌허혈 후에는 야생형 마우스에서는 발현량이 증가하나, TG 마우스에서는 변화가 없음을 보여준다.

도 12는 전뇌허혈 전 및 후에 나타나는 야생형 마우스와 TG 마우스에서의 인산화된 ERK의 발현량을 나타내는, 해마 및 대뇌피질 조직에 대한 면역염색 결과이다. 정상상태에서는 TG 마우스에서 해마 및 대뇌피질에서 인산화된 ERK의 발현량이 현저하게 증가되어 있음을 보여주고 있으며, 전뇌허혈 후에는 야생형 마우스에서는 발현량이 증가하지만 TG 마우스에서는 변화가 없음을 보여준다. 막대의 길이는 50μm이다.

Claims

티모신 베타 4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산을 포함하는, 뇌혈류량 감소로 인한 질환과 연관된 신경세포 손상 억제 또는 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 티모신 베타 4 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산은 인간 유래인, 신경세포 손상 억제 또는 치료용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 뇌혈류량 감소로 인한 질환은 뇌경색 및 뇌출혈을 포함하는 뇌허혈 또는 치매인, 신경세포 손상 억제 또는 치료용 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 뇌혈류량 감소로 인한 질환은 국소 또는 전뇌허혈인, 신경세포 손상 억제 또는 치료용 조성물.
티모신 베타 4 유전자를 포함하고 이를 발현하는 인간을 제외한 형질전환 동물모델.
제 5 항에 있어서, 상기 티모신 베타 4 유전자는 인간유래인 형질전환 동물모델.
제 5 항에 있어서, 상기 동물모델은 설취류 유래인, 형질전환 동물모델.
제 7 항에 있어서, 상기 동물모델은 마우스인, 형질전환 동물모델.
하기를 포함하는 티모신 베타 4를 발현하는 동물모델을 이용한 뇌혈류량 감소로 인한 질환의 치료 또는 진단용 마커 선별방법:

제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 동물모델 및 정상 동물 각각에 허혈성 뇌손상을 유발하는 단계;

상기 허혈성 뇌손상이 유발된 각 동물로부터 일정 시간 후에 뇌조직을 추출하는 단계;

상기 뇌조직에서 RNA 또는 단백질을 추출한 후, 이를 상호 비교하여 발현의 변화가 있는 RNA 또는 단백질을 규명하는 단계.