KR20100135857A - 나노에멀젼의 제조를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

나노에멀젼의 제조를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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로버트 제이. 니코로시
퐁슈 쿠오
스리칸트 카쿠마누
칼 더블류. 로우톤
숀 코네스니
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유니버시티 오브 매사추세츠
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Abstract

본 명세서는 나노에멀젼의 제조방법 및 조성물에 관한 것으로, 나노에멀젼은, 예를 들면, 오일과 같은 친유성 성분과 배합된, 활성 성분, 물과 같은 친수성 성분, 및 비이온성 폴리에톡시화 계면활성제와 같은 온도-의존성 상 전환을 야기할 수 있는 하나 이상의 계면활성제를 함유한다. 활성 성분을 함유하는 나노에멀젼은, 고에너지 에멀젼 형성 방법(예를 들면, 미세 유동화)을 요구하지 않고 나노에멀젼을 형성하기 전에 특정 중량비(예를 들면, 3:1 이상)로 계면활성제와 오일을 배합하여 100nm, 50nm 또는 25nm 미만의 평균 오일 액적 크기로 생성될 수 있다.

Description

나노에멀젼의 제조를 위한 조성물 및 방법{Compositions and methods for the preparation of nanoemulsions}
관련된 출원
본 출원은 각각 미국 가특허 출원 제61/040,482호(2008년 3월 28일자로 출원함), 제61/144,237호(2009년 1월 13일자로 출원함) 및 제61/144,246호(2009년 1월 13일자로 출원함)으로부터의 우선권을 주장하며, 상기 출원은 본 명세서에 이의 전문이 참고로서 인용되어 있다.
본 명세서는 나노에멀젼을 함유하는 조성물 및 나노에멀젼을 제조하기 위한 방법 및 조성물을 포함하는, 나노에멀젼에 관한 것이다.
나노에멀젼은 각종 추가 성분, 예를 들면, 약제(pharmaceutical), 기능성 건강 식품 또는 약용화장품의 전달을 포함하는 다수의 용도로 연구되어 왔다. 예를 들면, 나노에멀젼은 난용성 약물의 제형을 대한 잠재적인 대체물을 제공한다. 나노에멀젼은 통상적으로, 약 100 내지 300nm 미만일 수 있는 직경을 갖는, 현탁 오일 또는 물 액적 또는 입자의 투명하거나 반투명한 동력학적으로 안정한 조성물이다(상이한 상으로 존재하는 성분들 상이의 열역학적 평형을 갖는 미세에멀젼과 반대). 수천 나노미터 크기의 입자를 가질 수 있는 통상적인 마이크로-크기의 에멀젼 제제와 비교하여, 더 작은 입자 크기와 증가된 안정성을 갖는 나노에멀젼 시스템은 소염제, 인슐린 및 기타 약물과 같은 다수의 생리활성 화합물을 전달하기 위한 증가된 생체이용률 및 효능을 제공할 수 있다.
나노에멀젼은 2개의 상이한 유형의 공정으로 형성될 수 있다: 고 에너지 유화 방법 및 저 에너지 상 전환 온도 방법. 고 에너지 에멀젼 형성 방법에서는, 나노에멀젼 성분들(예를 들면, 오일, 물, 계면활성제 및 임의의 약제, 기능성 건강 식품 또는 약용화장품)의 혼합물을 고압(예를 들면, 25,000psi 이상)에서 미세 유동화기(microfluidizer) 장치(예를 들면, Cook 등에 의해 1984년 2월 21일자로 출원된 미국 특허 제4,533,254호 및 1987년 5월 26일자로 출원된 제4,908,154호에 기재됨)를 사용하여 연속적인 난류를 겪게하여 나노에멀젼을 형성한다. 그러나, 고 에너지 에멀젼 형성 방법에 의해 형성된 나노에멀젼은 다양한 정도의 안정성과 비교적 비-균일한 또는 더 큰 입자 크기(예를 들면, 다수의 피크를 갖는 입자 크기 분포)를 가질 수 있다.
또한, 나노에멀젼은 미세유동화 공정없이 온도-의존성 상 전환(예를 들면, 비이온성 폴리에톡시화 계면활성제) 가능한 계면활성제와 기타 나노에멀젼 성분들(예를 들면, 오일, 물 및 임의의 약제, 기능성 건강 식품 또는 약용화장품)을 배합하여 저 에너지 "자가 조립(self-assembly)" 방법에 의해 형성될 수 있다. 나노에멀젼 성분들은 혼합되고 계면활성제의 상 전환 온도(Phase inversion temperature)(PIT)(즉, 상이한 상에 대한 계면활성제의 친화도가 변하는 온도) 초과의 온도로 가열된다. 예를 들면, 수중유(O/W) 매크로-에멀젼(macro-emulsion)은 PIT 초과의 온도에서 가역성의, 온도-의존성 전이 상 전환을 겪어 유중수(W/O) 에멀젼을 형성할 수 있다. W/O 에멀젼의 PIT 미만의 온도로의 후속적인 급속 냉각, 예를 들면 열 냉각 또는 물 첨가에 의해, 물 중에 현탁된 오일 액적(임의로, 약제, 기능성 건강식품 또는 약용화장품 함유함)의 동력학적으로 안정한 O/W 나노에멀젼 조성물의 형성을 야기할 수 있다. 나노에멀젼을 형성하기 위한 열 냉각은, 예를 들면, 빙욕 중에 W/O 에멀젼을 함유하는 용기를 배치하여 수행될 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, "급속 냉각"은 미세 유동화 없이 나노에멀젼을 형성하기에 적합한 속도의 냉각을 의미한다.
그러나, 감소된 오일 액적 크기 및/또는 개선된 액적 크기 균일성을 갖는 나노에멀젼의 제조방법 및 나노에멀젼 조성물에 대한 요구는 남아있다. 또한, 조성물의 기능으로서, 액적 크기의 예상 가능한 감소를 허용하는 나노에멀젼의 제조방법 및 조성물이 요구된다. 또한, 소비자 제품의 형성과 같이, 목적하는 용도에 적합하고 적용가능한 규제 기관 요건에 허용되는 수준의 계면활성제 및 20중량% 미만의 오일을 갖는 조성물로부터 나노에멀젼의 제형에 대한 요구가 있다.
또한, 활성 성분을 함유하고 상기 성분의 전달을 위한 작은 액적 크기를 갖는 나노에멀젼 제형을 형성하기 위한 방법에 대한 요구가 남아있다. 또한, 목적하는 용도에 허용되는 양의 계면활성제를 포함하고, 안정한 방식으로 이러한 나노에멀젼을 제형화하기 위한 방법에 대한 요구가 있다. 이러한 나노에멀젼은 나노에멀젼 중에 활성 성분의 전달을 위한 개선된 생체이용률을 갖는, 동력학적으로 안정한 전달 비히클을 제공할 수 있다.
요약
본 명세서는 약 100nm, 50nm 또는 25nm 미만의 평균 크기로, 친수성 성분(예를 들면, 오일의 평균 액적을 함유하는 수성 캐리어) 중에 현탁된, 목적하는 액적 크기의 친유성 성분을 갖는 나노에멀젼을 형성하기에 유용한 방법 및 조성물을 기술한다. 조성물은 오일, 물 및 유 상과 수 상 사이의 온도-의존성 상 전환을 가능하게 하는 계면활성제, 예를 들면, 비이온성 폴리에톡시화 계면활성제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 계면활성제의 온도-의존성 상 전환에 의해 나노에멀젼을 형성하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 계면활성제의 온도-의존성 상 전환에 의해 형성된 나노에멀젼은 또한 자가-조립 나노에멀젼(self-assembled nanoemulsions; "SANE")으로 지칭된다.
본 발명의 특정 양태는 나노에멀젼 중의 평균 액적 크기가 조성물 중의 친유성 성분의 양이 약 5중량% 미만으로 유지되는 경우 나노에멀젼을 형성하는데 사용되는 조성물 중의 2개의 성분(예를 들면, 오일과 계면활성제) 사이의 중량비를 변화시켜 조절될 수 있다(예를 들면, 100nm 미만으로 감소됨)는 발견에 기초를 둔다. 예를 들면, 계면활성제 대 오일의 중량비가 5:1 또는 7:1인 오일 약 2중량%를 갖는 조성물은 미세유동화 없이 약 25nm 이하의 평균 액적 또는 입자 크기를 갖는 에멀젼을 형성하는데 사용될 수 있다. 또한, 특정 나노에멀젼은 활성 성분(예를 들면, 약제, 기능성 건강 식품 및/또는 약용화장품)을 함유하는 조성물로부터 형성될 수 있다.
100nm 미만의 평균 액적 또는 입자 크기(50nm 및/또는 25nm 미만의 평균 입자 크기를 포함)를 갖는 SANE 조성물은 오일 5, 4 또는 3중량% 미만과 함께 제형화될 수 있다(오일 약 2중량%를 갖는 조성물 포함). 나노에멀젼 중의 친유성 성분의 액적 또는 입자 크기는, 제1 조성물 중의 Ros 비(친유성 성분과 계면활성제의 총 중량에 대한 총 친유성 성분의 중량비로서 정의)를 약 0.500 이하(예를 들면, 0.125 내지 0.500의 Ros 비)로 감소시킴으로써 감소될 수 있다. SANE 조성물은 하기 중량비 중의 하나 이상을 특징으로 할 수 있다: 약 0.500 이하(0.250, 0.167 또는 0.125 포함)의 오일/(오일+계면활성제) 비; 약 0.980 이하(0.979, 0.978 및 0.977의 비 포함)의 수/(수+오일) 중량비; 약 0.023 이하(0.022, 0.021 및 0.020 포함)의 오일/(오일+수) 중량비; 0.143 이하(0.102, 0.061 또는 0.020 포함)의 수/(수+계면활성제) 중량비. 또한, 계면활성제와 친유성 성분 사이의 중량비 및/또는 활성 성분, 계면활성제 및 친유성 성분의 배합은 100nm 이하의 평균 친유성 성분 액적 크기를 갖는 나노에멀젼을 형성하기 위해 선택될 수 있다. 이는 미세유동화 또는 기타 고 에너지 에멀젼 형성 과정 없이 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 몇몇 양태는, 특정 활성 성분들이 특정 친유성 성분, 친수성 성분 및 계면활성제의 조성물에 첨가되는 경우 SANE 조성물이 형성하지 않고, 다른 경우라면 추가의 활성 성분의 부재 하에 안정한 SANE 조성물을 형성한다는 발견을 기초로 한다. 특히, 몇몇 양태는, 부분적으로, 특정 활성 성분(예를 들면, 다카바진, 젬시타빈 또는 쿠마린)이 폴리에틸렌 글리콜 660 하이드록시스테아레이트 계면활성제(예를 들면, 솔루톨(Solutol®) HS15)와 배합한 쌀겨 오일 친유성 성분으로부터 안정한 SANE 조성물을 형성하지 않는 반면, 기타 활성 성분(예를 들면, 파클리탁셀, 토코트리에놀스, 또는 쿠마린)은 이러한 성분들과 SANE 조성물을 형성할 수 있다는 발견을 기초로한다. 또한, 본 발명의 기타 양태는, 부분적으로, 특정 활성 성분(예를 들면, 루테인, 토코트리에놀스)이 C20 에톡시화 모노글리세라이드 계면활성제(예를 들면, EMG-20)와 배합된 쌀겨 오일 친유성 성분으로부터 안정한 SANE 조성물을 형성하지 않는다는 발견을 기초로 한다.
한 양태에서, 본 명세서는, (a) 친유성 성분(예를 들면, 무독성 오일), 활성 성분, 친수성 성분(예를 들면, 물), 및 상기 친유성 성분과 친수성 성분 사이의 상 전환 온도(PIT)를 갖는 계면활성제를 제1 조성물로서 배합하는 단계(상기 제1 조성물은 친유성 성분 약 5중량%를 함유하고 약 0.5 이하의 계면활성제의 총 중량에 대한 친유성 성분의 중량비(Ros)를 갖는다), (b) 상기 제1 조성물을 혼합물의 적어도 일부가 상 전환을 겪어 제2 조성물을 형성하기에 충분한 시간 동안 계면활성제의 PIT 초과의 온도로 가열시키는 단계, (c)제2 조성물을 냉각시켜 친수성 성분 중에 현탁된 100nm 이하의 평균 액적 또는 입자 크기의 친유성 성분의 액적을 갖는 안정한 나노에멀젼을 형성하는 단계를 포함하는 자가-조립(self-assembled) 나노에멀젼의 형성 방법을 기재한다. 계면활성제는 계면활성제 PIT 이상의 온도에서 친유성 성분과 친수성 성분 사이의 온도 의존성 상 전환을 야기하기 위해 선택된다. 친유성 성분은 무독성 오일(예를 들면, 식물유, 코코넛 오일, 대두유, 아마씨유, 쌀겨 오일, 어유 등)을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 활성 성분(들)은 친유성 성분 중에 용해될 수 있다. 바람직하게 작은 액적 입자 크기(예를 들면, 50nm, 25nm 또는 그 이하)를 갖는 나노에멀젼은 친유성 성분에 대한 계면활성제의 중량비가 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1 또는 그 이상을 갖는 제형을 사용하여 수득될 수 있다. 또한, 계면활성제와 친유성 성분의 중량비, 및/또는 활성 성분, 계면활성제 및 친유성 성분의 배합물은 100nm 이하의 평균 친유성 성분 액적 크기를 갖는 나노에멀젼을 형성하기 위해 선택될 수 있다. 이는 미세유동화 또는 기타 고 에너지 에멀젼 형성 과정 없이 이루어질 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 명세서는 하나 이상의 활성 성분(예를 들면, 약제, 기능성 건강 식품 등)을 포함하는 자가-조립 나노에멀젼을 형성하는 방법 뿐만 아니라 이러한 SANE 조성물의 투여를 포함하는 치료 방법을 제공한다. 활성 성분은, 본원에 기재된 나노에멀젼 제조 과정 중 하나 이상의 단계 전에 또는 도중에 친유성 성분 중에 활성 성분을 배합(예를 들면, 용해)함으로써 나노에멀젼으로 혼입되는 생리활성 물질일 수 있다. 활성 성분은 친수성 성분과 배합하기 전에 친유성 성분 중에 용해될 수 있다. 생성된 나노에멀젼은 나노에멀젼 중의 친유성 성분의 액적 또는 입자 내에 친수성 성분을 포함할 수 있다. SANE 조성물은 수용성 화합물의 안정한 수 분산액 또는 나노에멀젼일 수 있다.
치료 방법은 치료학적으로 적합한 방식으로 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 투여를 포함할 수 있으며, 이는 나노에멀젼과는 별개의 활성 성분의 투여에 상응하는 방식으로의 투여를 포함할 수 있다. 활성 성분은 나노에멀젼이 아닌 담체로 전달되는 경우 보다 나노에멀젼으로 제형화되는 경우 더 적은 투여량으로 치료학적으로 유효할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당해 기술의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법과 물질은 본원 발명의 실시 또는 실험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 문헌은 이의 전문이 참조로서 인용된다. 갈등시, 정의를 포함하는 본 명세서가 조정할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시일 뿐 제한하고자 함은 아니다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 용어 "미세 유동화된", "미세 유동화하는", "미세 유동화" 또는 "미세 유동화기"는, 고압에서 난류를 이용하는 장치 또는 방법을 의미하는 것으로서, 균일한 나노에멀젼을 제조하는데 유용할 수 있는 미세 유동화기 등의 장치를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면, 미세 유동화를 통하여, 30초 이내의 시간에 걸쳐 예비 혼합물로부터 약제, 기능성 건강 식품 또는 약용화장품을 포함하는 균일한 나노에멀젼을 생산할 수 있다(통상적으로, 이 과정을 1회 통과 노출(single pass exposure) 과정이라 칭함). 통상적으로, 미세 유동화기는 약 25,000psi의 압력에서 작동하여 균일한 나노에멀젼을 생성할 수 있다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "활성 성분"은 본원에 기재된 나노-에멀젼의 제조 방법을 사용한 나노에멀젼에 사용될 수 있는 임의의 기능성 건강 식품, 약제 또는 약용화장품을 지칭한다. 기능성 건강 식품의 예는 폴리페놀(예를 들면, 커큐민), 플라베노이드(예를 들면, 케르세틴), 카로티노이드(예를 들면, 루테인), 토코페롤 및/또는 토코트리에놀(예를 들면, 비타민 E)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 활성 성분으로서 사용될 수 있는 약제는 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(selective estrogen receptor modulators; SERM)(예를 들면, 타목시펜), 알킬화제(예를 들면, 다카바진과 같은 치환된 이미다졸 화합물), 탁산 화합물(예를 들면, 파클리탁셀), 뉴클레오사이드 유사체(예를 들면, 젬시타빈), 스타틴(예를 들면, 로바스타틴, 아토바스타틴, 심바스타틴 등), 피리미딘 유사체(예를 들면, 5-플루오로우라실) 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 약용화장품은, 예를 들면, 주사용 벌킹제(bulking agent)(예를 들면, 화장품 용도의 콜라겐계 주사용 물질), 펜타펩티드, 주름 방지 제형, 예를 들면, 시스-레티노산, 및 하이드록시산을 포함한다.
달리 지시되지 않는 한, "평균 입자 크기"는 광자상관법(Photon correlation spectroscopy)으로도 불리는 동적 레이저 광산란(예를 들면, 멜버른 제타사이저-에스(Malvern Zetasizer-S) 장치, 멜버른 인스트루먼츠 인크.(Malvern Instruments Inc.), 사우스보러(Southborough), 매사추세츠주)에 의해 측정되는 z-평균 입자 또는 액적 직경을 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, z-평균 입자 크기는 애벌랜치 포토다이오드 검출기(avalanche photodiode detector; APD) 및 633nm의 파장에서 작동하는 4mW He-Ne 레이저를 갖춘 맬버른 제타사이저-에스 장치를 사용하여 측정하였다. z-평균 직경은 평균 수력학적 직경이고 다분산 지수(polydispersity index)는 분산 너비의 추정치이다. z-평균 직경과 다분산 지수("PDI")는 동적 레이저 광산란법의 국제 표준, ISO13321에 따라 계산된다.
본 발명의 기타 특성, 목적 및 이점은 상세한 설명, 도면 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1은 자가-조립 나노에멀젼의 제조방법을 예시하는 도표이다.
도 2는 상이한 양의 상이한 계면활성제 및 친수성 성분으로서의 물과 배합한, 친유성 성분으로서의 쌀겨 오일을 사용하여 제형화된 나노에멀젼의 평균 입자 크기를 플로팅한 그래프이다. S/O 비는 물을 가하기 전에 혼합된 쌀겨 오일에 대한 계면활성제의 초기 중량비를 지칭한다.
도 3은 친수성 성분으로서의 물과 상이한 양의 상이한 계면활성제가 배합되고, 친유성 성분으로서의 코코넛 오일을 사용하여 제형화된 나노에멀젼의 평균 입자 크기를 플롯팅한 그래프이다. S/O 비는 물을 가하기 전에 혼합된 코코넛 오일에 대한 계면활성제의 초기 중량비를 지칭한다.
도 4는 친수성 성분으로서의 물과 상이한 양의 상이한 계면활성제와 배합되고, 친유성 성분으로서의 대두유를 사용하여 제형화된 나노에멀젼의 평균 입자 크기를 플롯팅한 그래프이다. S/O 비는 물을 가하기 전에 혼합된 대두유에 대한 계면활성제의 초기 중량비를 지칭한다.
도 5는 친수성 성분으로서의 물과 상이한 양의 상이한 계면활성제와 배합되고, 친유성 성분으로서의 어유(예를 들면, 오메가-3 대구 간유)를을 사용하여 제형화된 나노에멀젼의 평균 입자 크기를 플롯팅한 그래프이다. S/O 비는 물을 가하기 전에 혼합된 어유에 대한 계면활성제의 초기 중량비를 지칭한다.
도 6은 물, 솔루톨® HS15 계면활성제 및 어유로부터 형성되고 5:1의 S/O 비를 갖는 3개의 자가-조립 나노에멀젼(즉, SANE 조성물)에 대한 입자 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 7은 물, 솔루톨® HS15 계면활성제 및 식물유로부터 형성되고 2:1의 S/O 비를 갖는 3개의 SANE 조성물에 대한 입자 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 8A는 결장암(CCL-2) 세포 흡수시 PIT 나노에멀젼을 통해 제형화되는 상이한 오일의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8B는 흑색종 암(Melma-3m) 세포 흡수시 PIT 나노에멀젼을 통해 제형화되는 상이한 오일의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 8C는 자궁경부암(CCL-2) 세포 흡수시 PIT 나노에멀젼을 통해 제형화되는 상이한 오일의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 9A 및 9B는 한 쌍의 투과전자현미경이다: (A) 커큐민의 DMSO 프렙의 TEM 이미지(덩어리지고 불규칙하게 체계적이지 않은 구조에 주의) 및 (B) 커큐민의 나노에멀젼(SANE) 제제(약 20nm의 작은 입자 크기 및 집단군의 균질성에 주의함).
도 9C는 SANE 조성물에 대한 오일/커큐민 액적 크기를 나타내는 입자 크기 분포 측정이다.
도 10A는 커큐민 SANE 조성물의 계면동전위의 플롯이다.
도 10B는 수 중의 커큐민의 제타 포텐셜(계면동전위)의 플롯이다.
도 11은 흑색종 암 세포에 대한 커큐민 나노에멀젼 및 커큐민-DMSO 혼합물 둘 다의 시험관내 활성을 나타내는 그래프이다.
도 12A는 2.5mM 5-FU SANE 조성물의 입자 크기 분포의 그래프이다.
도 12B는 10nM 5-FU SANE 조성물의 입자 크기 분포의 그래프이다.
도 13A는 결장암 세포주(CCL-221)의 세포 증식시 5-FU 나노에멀젼의 효과를 나타내는 그래프이다. 5-FU의 비-나노에멀젼과 비교하여, 5-FU 나노에멀젼은 24μM(-35%, p<0.001) 및 12μM(-25%, p=0.011)에서 CCL-221의 세포 증식을 방지했다. 모든 그룹에 있어, N=9이고 에러바는 SEM으로 표현되었다.
도 13B는 흑색종 암 세포주(Malme-3M)의 세포 증식시 5-FU 나노에멀젼의 효과를 나타내는 그래프이다. 비-나노에멀젼 5-FU와 비교하여, 5-FU 나노에멀젼은 24μM(p<0.001)에서 Malme-3M의 세포 증식을 24%까지 방지했다. 모든 그룹에 있어, N=9이고 에러바는 SEM으로 표현되었다.
도 13C는 자궁경부암 세포주(CCL-2)의 세포 증식시 5-FU 나노에멀젼의 효과를 나타내는 그래프이다. 모든 그룹에 있어, N=9이고 에러바는 SEM으로 표현되었다.
도 14는 다카바진 SANE 조성물에 대해 측정된 입자 크기 분포의 그래프이다.
도 15A는 결장암 세포주(CCL-221)의 세포 증식시 DTIC 나노에멀젼의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 15B는 피부암 세포주 Malme-3M의 세포 증식시 DTIC 나노에멀젼의 효과를 나타내는 그래프이다.
도 16A는 파클리탁셀을 포함하는 SANE 조성물의 입자 크기 분포의 그래프이다.
도 16B는 DMSO 중의 파클리탁셀의 혼합물에 대한 입자 크기 분포의 그래프이다.
도 16C는 PL-45 세포에 대한 DMSO 파클리탁셀 조성물 및 파클리탁셀 SANE 조성물의 억제율을 나타내는 그래프이다.
도 16D는 CCL-221 세포에 대한 블랭크 SANE 조성물 및 파클리탁셀 SANE 조성물의 억제율을 나타내는 그래프이다.
도 16E는 CCL-221 세포에 대한 DMSO 파클리탁셀 조성물 및 파클리탁셀 SANE 조성물의 억제율을 나타내는 그래프이다.
도 16F는 PL-45 세포에 대한 블랭크 SANE 조성물 및 파클리탁셀 SANE 조성물의 억제율을 나타내는 그래프이다.
도 16G는 P10.05 세포에 대한 DMSO 파클리탁셀 조성물 및 파클리탁셀 SANE 조성물의 억제율을 나타내는 그래프이다.
도 16H는 P10.05 세포에 대한 블랭크 SANE 조성물 및 파클리탁셀 SANE 조성물의 억제율을 나타내는 그래프이다.
도 17A는 토코트리에놀을 포함하는 SANE 조성물의 입자 크기 분포의 그래프이다.
도 17B는 DMSO 중의 토코트리에놀의 혼합물에 대한 입자 크기 분포의 그래프이다.
도 17C는 물 중의 토코트리에놀의 혼합물에 대한 입자 크기 분포의 그래프이다.
도 18은 HepG 세포를 토코트리에놀을 포함하는 SANE 조성물, 토코트리에놀 및 DMSO의 혼합물 및 아무 처리도 하지 않은 HepG 세포에 노출시킬 경우 관찰되는 콜레스테롤의 억제를 나타내는 그래프이다.
도 19A는 siRNA를 포함하는 SANE 조성물의 입자 크기 분포의 그래프이다.
도 19B는 SANE 조성물의 냉각 및 융해 후 siRNA를 포함하는 SANE 조성물의 입자 크기 분포의 그래프이다.
도 19C는 SANE 조성물의 냉각 및 융해 후 siRNA를 포함하는 SANE 조성물의 입자 크기 분포의 그래프이다.
도 20은 siRNA SANE 조성물과 접촉한 후 트랜스펙션된 HeLa 세포의 형광 이미지이다.
도 21은 활성 성분으로서 인슐린을 포함하는 SANE 조성물의 투여 후 햄스터 혈당 수준을 나타내는 그래프이다.
도 22는 Malme 흑색종 세포, CCL-4 결장암 세포, HTB-20 세포, MCF-7 세포, PL-45 췌장 세포 및/또는 HeLa 자궁 세포 상의 타목시펜, 5-FU 및 커큐민을 포함하는 SANE 조성물의 시험관내 효과를 요약한 표이다.
도 23은 로바스타틴 SANE 조성물에 대해 측정된 HMG CoA 리덕타아제 효소 활성을 나타내는 그래프이다.
도 24는 쿠마린 6을 함유하는 SANE 조성물의 입자 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 25는 상이한 제형에서 쿠마린 6의 상대적인 형광 강도를 나타내는 그래프이다.
상세한 설명
본 명세서는 나노에멀젼의 제조방법을 기재한다. 나노에멀젼은, 예를 들면, 친유성 성분, 예를 들면, 치료용 또는 영양성 오일 및/또는 화장품을 전달하는데 유용하다. 예를 들면, 작은(예를 들면, 100nm 미만) 친유성 액적 또는 입자를 갖는 나노에멀젼은 친유성 물질의 개선된 균질성, 개선된 생흡수 또는 소화, 및/또는 비제한적으로 피부 또는 머리카락을 포함하는 조직으로의 친유성 물질의 개선된 침투수를 제공할 수 있다. 나노에멀젼은 영양 보충제(예를 들면, 오메가-3 어유 또는 비타민 보충제)로서 제형화되거나, 또는 크림, 액체, 젤 및 패치와 같은 담체-생리활성 화합물과 배합될 수 있다. 나노에멀젼은 친유성 액적 또는 입자의 조직을 통한 개선된 침투를 제공하여, 생성물의 효능을 개선시키고, 생성물을 조직으로 전달하는데 조절된 속도를 제공하고/하거나 생성물의 퇴화를 감소시켜 생성물의 저장 수명을 연장시킨다. 따라서, 안정한 나노에멀젼은 다양한 생성물에서 유용한 성분이다.
나노에멀젼은 또한 증가된 생체이용률을 갖는 난용성인 활성 화합물(약제, 기능성 건강 식품 또는 약용화장품을 포함)을 전달하기 위한 수단으로서 사용될 수 있다.
나노에멀젼의 형성
나노에멀젼, 특히 자가 조립 나노에멀젼(SANE)의 형성을 위한 조성물 및 방법이 본원에 제공된다. SANE 조성물을 형성하기에 적합한 조성물은 친유성 성분, 활성 성분, 친수성 성분, 및 친유성 및 친수성 성분에 대한 PIT를 특징으로하는 계면활성제를 포함할 수 있다. 활성 성분은 바람직하게는 친수성 성분보다 친유성 성분에 보다 가용성이다. 이러한 조성물은 친유성 성분 약 5중량% 이하를 포함하고, 계면활성제와 친유성 성분이 3:1 이상(예를 들면, 5:1 내지 7:1 이상)의 초기 중량비로 존재하여 친유성 성분의 액적 크기가 감소된 나노에멀젼을 제공할 수 있다.
활성 성분(들)은 SANE 조성물의 친유성 성분의 액적 중에 존재할 수 있다. 활성 성분(들)은 SANE 조성물의 친유성 성분의 액적에 존재할 수 있다. 나노에멀젼 중의 친유성 성분의 액적 또는 입자 크기는 제1 조성물 중의 Ros 비(친유성 성분 및 계면활성제의 총 중량에 대한 총 친유성 성분의 중량비로서 정의됨)를 0.500 이하(예를 들면, 0.125 내지 0.500의 Ros 비)로 감소시켜 감소될 수 있다. SANE 조성물은 또한 하기의 중량비 중 하나 이상을 특징으로 할 수 있다: 약 0.500 이하(0.250, 0.167 또는 0.125 포함)의 오일/(오일+계면활성제) 비; 약 0.980 이하(0.979, 0.978 및 0.977 비 포함)의 수/(수+오일) 중량비; 약 0.023 이하(0.022, 0.021 및 0.020 포함)의 오일/(오일+수) 중량비; 및/또는 0.143 이하(0.102, 0.061 또는 0.020 포함)의 수/(수+계면활성제) 중량비. 예를 들면, 100nm, 50nm 또는 25nm 이하의 평균 액적 크기를 갖는 SANE 조성물은 계면활성제와 친유성 성분(예를 들면, 무독성 오일)의 중량비가 3:1 또는 5:1("S/O 비")인 조성물을 사용하여 수득될 수 있다.
활성 성분(들)을 함유하는 친유성 성분 약 5중량% 이하를 갖는 조성물에서, 친유성 성분에 대한 계면활성제의 중량비를 약 3:1 초과로 증가시킴으로써 제1 조성물 중의 Ros 비(친유성 성분 및 계면활성제의 총 중량에 대한 총 친유성 성분의 중량비로 정의됨)가 약 0.500 이하(예를 들면, 0.125 내지 0.500의 Ros 비)인 SANE 조성물 중의 친유성 성분의 액적 크기를 감소시킬 수 있다. 초기 제형 중의 S/O 비를 1:1로부터 3:1로 증가시킴으로써 초기 제형으로부터 형성된 생성물 SANE 조성물 중의 친유성 오일 성분의 평균 액적 크기를 감소(예를 들면, 약 1,000nm에서 약 30 내지 319nm로)(예를 들면, 약 30 내지 97% 감소)시킬 수 있고; 추가로, 초기 제형 중의 S/O 비를 3:1로부터 5:1로 증가시킴으로써 본원에 기재된 방법에 따른 초기 제형으로부터 형성된 생성물 SANE 조성물 중의 평균 액적 크기를 추가로 감소(예를 들면, 약 21 내지 121nm로)(예를 들면, 70 내지 83% 감소)시킬 수 있다. 추가의 평균 액적 크기의 감소는 S/O 비를 5:1로부터 7:1로 증가시켜 SANE 조성물 중에서 수득할 수 있고, 이에 의해 평균 액적 크기는 약 15nm 내지 25nm로 될 수 있다.
나노에멀젼은 친유성 성분과 활성 성분의 혼합물을 가열시켜 친유성 성분 중에 활성 성분을 용해시킴으로써 형성될 수 있다. 다음에, 친유성 성분과 활성 성분의 용액은 가열되고, 친수성 성분 및 계면활성제와 혼합하고, 상기 계면활성제는 상기 계면활성제의 상 전환 온도("PIT") 이상의 온도에서 친유성 성분과 친수성 성분 사이의 온도-의존성 상 전환을 특징으로 하며, 이어서 상기 혼합물을 PIT 이하의 온도로 급속 냉각시켜(예를 들면, 용기의 내용물이 실온 또는 약 25℃가 될 때까지 가열-수행 용기 중의 혼합물을 빙욕에 배치시켜 냉각시킴) 나노에멀젼을 형성한다.
한 측면에서, 나노에멀젼은 친유성 성분, 친수성 성분 및 계면활성제로 이루어지거나 또는 이들로 본질적으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 나노에멀젼은 친수성 성분 중에 현탁된 친유성 성분의 액적 또는 입자와, 상기 성분 중 하나 또는 둘 다와 연관된 계면활성제와 함께 3-성분 시스템일 수 있다. 나노에멀젼은 나노에멀젼을 형성하는데 요구되지 않는 추가의 활성 성분(예를 들면, 추가의 약제, 기능성 건강 식품 또는 약용화장품 재료)의 부재 하에 형성될 수 있다. 나노에멀젼은, 나노에멀젼 성분에 고 에너지 에멀젼 형성 방법을 적용하지 않고(예를 들면, 미세유동화 없이) 형성된 자가-조립 나노에멀젼(SANE)으로서 형성될 수 있다.
예를 들면, 나노에멀젼은 도 1에 나타낸 단계들을 수행함으로써 형성될 수 있다: (a) 친유성 성분(예를 들면, 무독성 오일)과 계면활성제(10)를 배합하는 단계, (b) 친유성 성분을, 친유성 성분과 친수성 성분 사이의 온도 의존성 상 전환을 특징으로 하는 계면활성제(20)와 배합하는 단계, (c) 친유성 성분과 계면활성제의 혼합물을 친수성 성분(예를 들면, 물)(30)과 배합하여 수중유("O/W") 에멀젼을 형성하는 단계; (d) O/W 에멀젼을, 혼합물의 적어도 일부가 상 전환을 겪을 정도로 충분한 시간 동안 계면활성제(40)의 상 전환 온도 초과의 온도로 가열시켜 가역적으로 유중수("W/O") 에멀젼을 형성하는 단계; 및 (e) 제2 조성물을 냉각시켜, 친수성 성분 중에 현탁된 평균 액적 크기 100nm 이하의 친유성 성분의 액적을 갖는 나노에멀젼(50)을 형성하는 단계. 활성 성분 또는 재료(예를 들면, 약제, 기능성 건강 식품 및/또는 약용화장품)는, 예를 들면, 상기 단계 (a) 전 또는 도중에, 친유성 성분 중에 활성 성분을 용해시켜 나노에멀젼 중에 혼입되어 생리활성 SANE 조성물을 형성할 수 있다.
친유성 성분 및 계면활성제의 혼합물과 친수성 성분(30)의 배합은 혼합물을 (예를 들면, 교반바로) 교반시켜 계면활성제의 PIT 이하(예를 들면, 약 50 내지 65℃)의 온도로 상기 혼합물을 가열하면서 친수성 성분을 가함으로써 수행될 수 있다. 일단 형성되면, O/W 에멀젼은 샘플을 혼합하기에 충분간 시간 기간(예를 들면, 약 5 내지 15분) 동안 PIT 초과의 온도로 가열시키고(40) 교반될 수 있다. 계면활성제의 PIT 초과의 온도로 가열된, 친유성 성분, 친수성 성분 및 계면활성제를 포함하는 조성물(예를 들면, W/O 에멀젼)의 급속 냉각으로 나노에멀젼을 형성할 수 있다.
급속 냉각은 나노에멀젼을 형성하기에 충분한 속도로 조성물의 온도를 감소시키는 것, 예를 들면, 조성물을 함유하는 가열-수행 용기를 빙욕에 배치시키거나, 또는 조성물을 다량의 친수성 성분(예를 들면, 물)으로 빠르게 희석시켜 온도를 PIT 미만의 온도로 감소시킴을 포함해야 한다. 냉각은 반응 용기 중의 액체의 온도가 약 실온(예를 들면, 약 25℃)이 될때까지, 예를 들면, 가열-수행 용기를 빙수에 배치시키고 W/O 에멀젼에 실온의 물을 가함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, O/W 에멀젼의 온도는 빙욕 중에서, 또는 PIT 미만의 온도(예를 들면, 약 20 내지 30℃)에서 물을 조성물 용적의 약 20 내지 50%(20 내지 30% 포함)와 동일한 용적으로 가함으로써 충분한 속도로 감소될 수 있다.
활성 성분(들)을 포함하는 나노에멀젼 중의 친유성 성분의 액적 크기는, 계면활성제와 친유성 성분을 1:1 초과로 증가하는 중량비(예를 들면, 약 3:1, 5:1 또는 7:1의 S/O 중량비, 그 사이의 비-정수 분수 중량비 포함)로 배합하여 친유성 성분 약 5중량% 이하의 일정한 중량을 갖는 조성물에서 감소될 수 있다. 몇몇 양태에서, 약 5중량% 이하를 갖는 친유성 성분의 액적 크기 또는 입자 크기는 친유성 성분에 대한 계면활성제의 중량비를 약 3:1 이상(예를 들면, 약 3:1 내지 10:1, 3:1 내지 7:1 또는 3:1 내지 5:1)으로 증가시켜 감소되고, SANE 조성물 중의 친유성 성분의 액적 크기의 감소를 제공한다. 다른 양태에서, 약 5중량% 이하를 갖는 친유성 성분의 액적 크기 또는 입자 크기는 도 1의 단계(30)의 조성물 중에서 Ros 비(친유성 성분 및 계면활성제의 총 중량에 대한 총 친유성 성분의 중량비로 정의됨)를 약 0.500 이하(예를 들면, 0.125 내지 0.500의 Ros 비)로 감소시켜 감소된다.
도 2 내지 도 5는 상이한 오일 친유성 성분 및 상이한 계면활성제를 사용하여, 2중량% 오일로, 도 1에 대하여 기재된 방법에 따라 형성된 나노에멀젼에 대해 측정된 친유성 성분에 대한 계면활성제의 비("S/O 비")의 함수로서 평균 액적 크기(입자 크기로도 지칭함)를 나타내는 그래프이다. S/O 비는 도 1의 단계(20)에서 초기에 배합된 오일에 대한 계면활성제의 중량비를 지칭한다. 각각의 나노에멀젼은 도 1의 단계 (30)의 O/W 에멀젼을 고 에너지 에멀젼 형성 방법에 적용시키지 않고(즉, 미세유동화를 사용하지 않고) 제조된다.
몇몇 양태에서, 전체 시스템(오일+계면활성제+수)의 용적은 50㎖로 유지된다. 예를 들면, 오일 1g으로, 나노에멀젼(도 1의 단계(50)) 중의 오일의 액적 크기는 도 1의 단계 (20)의 조성물 중에서 계면활성제와 친유성 성분의 초기 중량비("S/O 비")를 약 1:1 초과로, 예를 들면, 2:1 내지 10:1, 3:1 내지 10:1, 5:1 내지 10:1, 7:1 내지 10:1, 3:1 내지 7:1, 3:1 내지 5:1 및 5:1 내지 7:1의 S/O 비(4:1, 5:1, 6:1 및 1:1과 10:1 사이의 모든 분수 비를 포함)를 사용하여 증가시킴으로써 감소될 수 있다. 친유성 성분 5중량% 이하 및 2:1, 3:1, 5:1 또는 7:1 내지 10:1 이상의 S/O 비(3:1, 5:1, 7:1의 비 및 1:1과 10:1 사이의 S/O 비 범위를 포함)를 갖는 SANE 조성물은 화장품 및 치료학적 조성물로서 제형화되거나 이들에 가해질 수 있다.
총 64개의 나노에멀젼을, 오일 2중량% 및 1:1, 3:1, 5:1 또는 7:1의 초기(즉, 도 1에서 단계 (40) 전) S/O 중량비로 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 각각의 나노에멀젼의 평균 입자 크기를 도 2 내지 도 5에 나타낸 그래프 중 하나에 플롯팅하였다. 이러한 나노에멀젼 각각에서, 나노에멀젼 중의 친유성 성분의 평균 액적 크기는, 계면활성제 대 오일의 초기 중량비가 1:1에서 3:1로, 및 3:1에서 5:1로 증가됨에 따라 감소되었다. 64개의 나노에멀젼 중 하나만 빼고 모두(즉, 도 5에서 일부 데이터를 수득하는데 사용되는 상표면 트윈(TWEEN®) 80으로 판매되는 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노올레에이트 계면활성제를 사용하는 SANE 조성물), 초기 S/O 중량비가 5:1로부터 7:1로 추가로 증가되면 5:1의 S/O 초기 중량비를 갖는 상응하는 나노에멀젼과 동일하거나 더 작은 친유성 성분 액적 크기를 갖는 나노에멀젼이 생성된다.
작은 평균 액적 크기(예를 들면, 25nm 미만)와 다분산도(예를 들면, 약 10nm 미만의 액적 크기 측정 피크 너비)를 갖는 나노에멀젼은 본원에 기재된 계면활성제와 친유성 성분의 특정 중량비(본원에 기재된 예시적인 중량비 사이의 비-정수 중량비 포함)를 사용하여 수득될 수 있다. 나노에멀젼 액적 크기 분포는 표준 방법 및 장치를 사용하여 광 산란에 의해 측정한다.
계면활성제는, 계면활성제의 상 전환 온도 이상에서 친유성 성분과 친수성 성분 사이의 온도 의존성 상 전환을 야기하기 위해 선택된다. 상 전환은, 친유성 물질과 친수성 물질 사이의 계면활성제의 상대적 친화도가 온도를 조절함으로써 변하는 경우, 고정된 양의 계면활성제, 친유성 물질 및 친수성 물질을 갖는 조성물에서 발생한다. 예를 들면, 계면활성제와 배합되는 친유성 물질과 친수성 물질의 수중유(O/W) 매크로에멀젼 조성물은 상 전환 온도(PIT) 초과의 온도에서 유중수(W/O) 에멀젼으로 상 전환을 겪을 수 있다. 상 전환은, 에멀젼이 PIT 미만의 온도로 급속히 냉각되어 비가역적으로 O/W 나노에멀젼을 형성하지 않으면, PIT 부근 온도의 함수로서 가역적일 수 있다.
계면활성제는, 계면활성제의 PIT 이상의 온도에서의 무독성 오일 친유성 성분과 수성 친수성 성분 사이의 온도 의존성 상 전환을 특징으로 하는 비이온성 폴리에톡시화 계면활성제일 수 있다. PIT는 친수-친유 밸런스(Hydrophilic-Lipophilic Balance)(HLB) 값에 따르는 계면활성제의 화학 구조의 함수이다. 계면활성제 분자는 비이온성이다. 비이온성 계면활성제는 약제, 기능성 건강식품 및 화장품 제품에서 광범위하게 적용되고 광범위한 pH 값에 걸쳐 사용가능하다. 일반적으로, 비이온성 계면활성제 HLB 값은 이들의 구조에 따라 1 내지 약 18의 범위를 갖는다. 친유성 상과 친수성 상 사이의 PIT에서의 상 전환을 야기하는 임의의 비이온성 계면활성제가 사용될 수 있다. 더 낮은 HLB 값은 보다 친유성 계면활성제에 해당하고; 더 높은 HLB 값은 보다 친수성 계면활성제에 해당한다. 2개 이상의 계면활성제가 조성물에 사용되어 나노에멀젼을 형성할 수 있다. 제1 계면활성제(A)의 x 중량% 및 제2 계면활성제의 y 중량%를 갖는 2개의 계면활성제의 혼합물의 HLB 값은 다음 식으로 주어진다: HLB(A+B) = (Ax + Bx)/(x+y). 시스템의 HLB 온도(THLB)는 하기에 주어진 쿠니에다 및 시노다(Kunieda and Shinoda)에 의해 개발된 수학식 1로부터 결정될 수 있다.
Figure pct00001
상기 수학식 1에서, K오일은 대부분의 알칸에 대해 대략 17℃/HLB 단위이고, N유은 주어진 오일에 대해 상수(탄화수소 분자량이 증가함에 따라 감소하는 오일값)이다. 상 전환에 의한 에멀젼의 형성 방법 및 PIT를 갖는 계면활성제에 대한 HLB 온도의 계산을 적용하는 것으로서 본원에서 참조로 인용되는 문헌[참조: Shinoda, K. and Saito, H., J. Colloid Interface Sci., 26, 70(1968); Shinoda, K. and Saito, H., J. Colloid Interface Sci., 30,258(1969); Shinoda, K. and Kunieda, H., in Encyclopedia of emulsion Technology, Becer, P., Ed., Marcel Dekker, New York, Vol. 1, pp. 337-367(1983)]을 참조한다.
나노에멀젼을 형성하는데 사용하기에 적합한 PIT를 갖는 계면활성제는 비이온성 폴리에톡시화 계면활성제를 포함한다. PIT를 갖는 적합한 계면활성제의 몇몇 예는, 친유성 성분 및 친수성 성분과 접촉하는 경우: 에톡시화 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드(예를 들면, C20 에톡시화 모노글리세라이드, 예를 들면, 상표명 EMG-20으로 판매되는 계면활성제), 하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르(예를 들면, 상표명 솔루톨® HS15로 판매되는 계면활성제와 같은 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레산 에스테르(예를 들면, 상표명 트윈® 80으로 판매되는 계면활성제와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트), 폴리소르베이트, 예를 들면, 소르비탄 모노올레에이트(예를 들면, 스판 80), 또는 폴리옥시에틸렌 오일(예를 들면, 상표면 크레모포 엘(CREMOPHOR EL®)로 판매되는 계면활성제와 같은 폴리옥시에틸렌 피마자유)를 포함한다.
친유성 성분은 실온(예를 들면, 25℃) 및/또는 계면활성제의 PIT에서 무독성 액체 오일일 수 있다. 오일은 포화 지방산 및/또는 단일불포화 또는 다불포화 지방산의 혼합물(예를 들면, 리놀렌산, 라우르산, 올레산, 스테아르산, 리놀레산, 미리스트산, 카프릴산, 아라키드산, 베헨산, 팔미트산 및/또는 오메가-3 지방산)을 함유할 수 있다. 예를 들면, 친유성 성분은 식물유, 쌀겨 오일, 어유(예를 들면, 대구간유), 코코넛 오일, 및/또는 대두유를 포함할 수 있다. 친유성 성분은 적어도 계면활성제 PIT에서 액체일 수 있다. 나노에멀젼의 친유성 성분을 제형화하는데 사용되는 오일은 목적하는 전달 방법에 적합한 조성물을 제공하기 위해 선택될 수 있다. 예를 들면, 코코넛 오일 및 팜핵유 중에 함유된 중쇄 지방산은 장쇄 지방산과 같이 수정에 대한 요건 없이 위장관으로부터 문맥계로 수동적으로 확산될 수 있다(더 긴 지방산은 림프계로 흡수된다). 따라서, 상이한 오일로 이루어진 에멀젼 전달 시스템은 상이한 전달 프로파일을 잠재적으로 포함한다. 친유성 성분에서 사용될 수 있는 오일은 예를 들면, 대두유, 옥수수유, 홍화유, 면실유, 쌀겨 오일, 아마씨유, 어유 및 이들의 배합물을 포함한다.
친유성 성분은 실온 또는 계면활성제의 PIT에서 액체이고, 계면활성제의 PIT 초과의 온도에서 친유성 성분보다 계면활성제에 대해 더 높은 친화도를 갖도록 선택될 수 있다. 친수성 성분은 친유성 성분보다 더 낮은 옥탄올-수 분배계수를 가질 수 있으며, 여기서 분배계수는 옥탄올과 수 상 사이의 이온화되지 않은 화합물의 농도비이다. 이온성 용질의 분배계수를 측정하기 위하여, 수성 상의 pH는, 화합물의 지배적인 형태가 이온화되지 않도록 조절된다. 친수성 성분은, 예를 들면, 물, 알코올 또는 하나 이상의 수-용해성 물질과 물의 용액이거나 이들을 포함할 수 있다. 친수성 성분과 친유성 성분은 주어진 온도에서 계면활성제에 대한 목적하는 친화도를 갖도록 선택될 수 있다. 친수성 성분은 나노에멀젼의 수성 상일 수 있고, 적당한 백분율(q.s.p)로 탈염수 또는 증류수를 포함하여 나노에멀젼의 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 식(fomula)의 100%를 달성할 수 있다.
활성 성분의 혼입
추가 성분은 나노에멀젼 중에, 예를 들면, 하나 이상의 약제, 약용화장품 또는 기능성 건강 식품 물질 중에 임의로 포함되어 생리활성 SANE 조성물을 형성할 수 있다. 이러한 성분들은 친유성 성분과 초기에 배합될 수 있다. 예를 들면, 활성 성분, 예를 들면, 약제학적 성분은 후속적으로 적합한 계면활성제 및 친수성 성분과 배합되는 오일 중에 용해될 수 있다. 나노에멀젼의 후속적인 형성을 허용하는 친유성 성분 중에 용해도를 갖는 임의의 약제, 약용화장품 또는 기능성 건강식품이 사용될 수 있다.
활성 성분 또는 재료(예를 들면, 약제, 기능성 건강식품 및/또는 약용화장품)는, 예를 들면, 상기 단계 (a) 전에 또는 도중에 친유성 성분 중에 활성 성분을 용해시킴으로써 나노에멀젼 중에 혼입되어 생리활성 SANE 조성물을 형성할 수 있다. 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 생리활성 SANE 조성물은 하기 단계들 중 임의의 수를 포함하는 방법에 따라 제조될 수 있다:
(a) 특정량(예를 들면, 1g, 2중량%)의 친유성 성분을 칭량한다. 친유성 성분의 유형(예를 들면, 오일)은 제형화(예를 들면, 활성 성분의 용해도 및 조성물의 목적하는 용도)되는 활성 성분(예를 들면, 영양소/약물)에 좌우된다. 오일 및 활성 성분의 배합의 구체적인 예는 본원에 기재된다.
(b) 친유성 성분에 대해 목적하는 양의 하나 이상의 활성 성분을 가하여 친유성 혼합물을 형성하거나 또는 친유성 성분 중의 활성 성분을 용해시킨다.
(c) 활성 성분이 오일 중에 용해된 것으로 시각적으로 보여질 때까지(예를 들면, 50 내지 60℃까지 가열) 활성 성분을 친유성 성분 중에서 목적하는 방법(예를 들면, 핫 플레이트 상의 자석 교반기를 사용)으로 목적하는 시간(예를 들면, 5분) 동안 가열하고 교반시킨다.
(d) PIT를 특징으로 하는 계면활성제(예를 들면, 에톡시화 비이온성 계면활성제)의 특정량을 친유성 성분과의 목적하는 중량비(예를 들면, 5g, 10중량%)로 가한다. PIT(HLB 온도로도 불리움)는 계면활성제 화학 구조에 의존하고, 계면활성제의 HLB 값(친수-친유 밸런스)에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, PIT는 HLB 값이 증가되면 증가한다.
(e) 계면활성제, 친유성 성분 및 활성 성분을 포함하는 조성물을 PIT 미만의 온도(예를 들면, 50 내지 60℃)에서 목적하는 기간(예를 들면, 5분) 동안 3개의 성분들이 균질한 혼합물을 형성할 때까지 가열하고 교반시킨다.
(f) 계면활성제, 친유성 성분 및 활성 성분을 포함하는 조성물에 증류수를 가하고, O/W 매크로에멀젼을 형성할 때까지 혼합 및 가열을 지속한다. 물은 계면활성제, 친유성 성분 및 활성 성분의 혼합물의 온도(예를 들면, 60℃)로 가열될 수 있다. 예를 들면, O/W 매크로에멀젼은 약 50㎖의 에멀젼의 총 용적을 가질 수 있다.
(g) 단계 (f)로부터의 O/W 매크로에멀젼을 계면활성제의 PIT 온도로, 이어서 PIT 초과의 온도로 가열한다. 가열 동안, 계의 PIT(또는 HLB 온도)(65 내지 70℃, 상 전환 구역)에 도달하면; 계면활성제는 유 상 및 수 상과 평형화된다. O/W 매크로에멀젼을 교반시키면서 PIT 초과의 온도로 가열하여 계를 W/O 에멀젼으로 전환한다. 이 스테이지에 도달하면, 가열과 교반을 중단한다.
(h) 단계 (g)에서의 W/O 에멀젼은 PIT 미만의 온도, 예를 들면, 실온(예를 들면, 25 내지 30℃)으로 급속 냉각시켜(예를 들면, 온도가 실온 또는 약 25로 감소될 때까지 W/O 에멀젼을 함유하는 용기를 빙수 중에 배치시킴으로써) O/W 나노에멀젼(동력학적으로 안정한 SANE 조성물)을 수득한다.
본원에 기재된 나노에멀젼은, 예를 들면, 난용성 약물의 경구 흡수를 향상시키는데 유용할 수 있다. 친수성 약물은 이러한 계에 용해될 수 있어, 소수성 약물이 경구 투여를 위한 단위 투여 형태로서 캡슐화되게 한다. 예시적인 나노에멀젼 제형은 활성 성분을 위장(GI)관으로 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 방식으로 투여되는 약물은 위장관 내에서 용액으로 유지되고, 이는 결정성 상태로부터 소수성 약물의 흡수율을 제한할 수 있는 용해 단계를 피하게 한다. 나노에멀젼은 GI 부작용 뿐만 아니라 유리 약물 농도의 감소를 예방하고, 따라서 장 흡수율을 감소시키는 수준의 계면활성제와 함께 제형화될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 나노에멀젼을 제조하기 위한 방법 및 조성물은 감소된 오일 액적 크기 및 증가된 액적 크기 균일성(예를 들면, 감소된 평균 액적 크기 및 감소된 다분산 지수)을 갖는 나노에멀젼을 제공할 수 있다. 나노에멀젼은 다수의 상이한 파라미터로 확인될 수 있다. 예를 들면, 나노에멀젼은 초기 W/O 혼합물 중의 (수)/(수+오일)의 중량비의 100배로서 정의된 수/오일 비의 견지에서 기재될 수 있다[참조: Anton et al., "Design and production of nanoparticles formulated from nano-emulsion templates - A review," Journal of Controlled Release, 128, 185-199(2008)].
바람직하게는, 나노에멀젼은 약 20중량% 미만의 오일보다 더 많은 중량%의 계면활성제를 함유한다. 이즈퀴에르도(Izquierdo) 등은 오일(예를 들면, 데칸, 도데칸, 테트라데칸, 헥사데칸 및 이소헥사데칸) 20중량% 이상과 물 및 비이온성 계면활성제(예를 들면, 3.5중량%)의 혼합물을 함유하는 조성물을 계면활성제의 PIT 초과의 온도로 가열시켜(여기서, 오일에 대한 계면활성제의 중량비는 1.0 미만이다) 나노에멀젼을 형성하는 것에 대해 보고되어왔다[참조: Izquierdo et al., "Formation and Stability of Nano-Emulsions Prepared Using the Phase Inversion Temperature Method," Langmuir 18, 26-30 (2002); Izquierdo et al., "Phase Behavior and nano-emulsion Formation by the Phase Inversion Temperature Method," Langmuir 20, 6594-6598(2004)]. 반대로, 특정의 나노에멀젼 제조방법은 친유성 성분에 대한 계면활성제의 중량비를 1.0 이상으로 친유성 성분과 계면활성제를 배합하는 것을 포함할 수 있다.
특정의 나노에멀젼 제조방법은 비이온성 계면활성제 3.5중량% 미만(예를 들면, 3.0% 미만)을 갖는 나노에멀젼 조성물을 제조하는 것을 포함한다. 나노에멀젼의 기타 예는 0.2 미만(예를 들면, 0.02 내지 0.20, 0.02 내지 0.03, 0.02 내지 0.05, 0.02 내지 0.10 및 0.02 내지 0.15 포함)의 오일/(수+오일)의 중량비로 확인된다. 나노에멀젼은 또한 0.67 미만(0.50 미만을 포함하여(예를 들면, 0.10 내지 0.5, 0.2 내지 0.5, 0.3 내지 0.5 및 0.4 내지 0.5) )의 오일/(오일+계면활성제)의 중량비("Ros 값")를 가질 수 있다. 반대로, 모레일스(Morales) 등은 오일/(수+오일) 중량비가 0.2인, 광유, 물 및 비이온성 계면활성제(헥사에틸렌 글리콜 모노헥사데실 에테르)의 조성물로부터, 상기 혼합물을 계면활성제의 상 전환 온도 초과의 온도로 가열하여 나노에멀젼을 형성하는 것을 보고한다[참조: Morales et al., "A Study of the Relation Between Bicontinuous Microemulsions and Oil/Water Nanoemulsion Formation," Langmuir 19, 7196-7200(2003)]. 그러나, 이러한 에멀젼의 액적 크기는, 오일/(오일+계면활성제)의 비가 증가되거나 0.67 미만으로 감소되는 경우와 같이 꾸준히 증가했다[참조: Morales et al., id, 7199쪽]. 예를 들면, 약 75nm의 보다 큰 액적 크기는 더 낮은 Ros 값 0.4를 갖는 조성물 중에서 보고되었다[참조: id, 7199쪽]. 이러한 연구는 오일 약 20중량% 이상 및 1.0 미만의 계면활성제에 대한 오일의 중량비를 갖는 나노에멀젼의 제형을 기재한다.
하나의 예에서, 나노에멀젼은 쿠마린(벤조피론) 또는 이의 유도체, 예를 들면, 브로디파쿰, 브로마디올론, 쿠마푸릴 및/또는 디페나쿰, 엔사쿨린, 와파린 및/또는 펜프로쿠몬(마쿠마)를 포함한다. 예를 들면, 나노에멀젼은 의학용 영상화 염료 제형(예를 들면, 자기 공명 영상화를 위한 형광 염료 또는 조영제) 중에 쿠마린 6을 포함할 수 있다. 쿠마린 6을 함유하는 나노에멀젼은 예를 들면, 비정상적 세포 증식을 추적(예를 들면, 초기 및 진행 전이암의 추적)하는데 유용한, 형광 영상화 염료(예를 들면, 황반변성의 영상화용)일 수 있다. 나노에멀젼 이외의 염료 제형과 비교하여, 쿠마린 6 나노에멀젼 염료는 (a) 개선된 안정성 및 감소된 수준의 광분해, (b) 더 적은 노이즈를 갖는 증가된 형광 강도(예를 들면, 저농도의 쿠마린 6을 사용하여 병리학적 방법의 추적을 용이하게하여 부작용을 감소시킨다) 및 (c) 증가된 수용성을 가질수 있다. 실시예 2는 쿠마린 나노에멀젼의 제조를 예시한다. 나노에멀젼은 대두유, 코코넛 오일, 대구 간유 또는 기타 어유 및/또는 쌀겨 오일으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 친유성 성분 중에 쿠마린을 포함할 수 있다. 쿠마린 나노에멀젼은 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 예를 들면, 솔루톨® HS15를 포함할 수 있고, 이는 친유성 성분과의 S/O 중량비가 1:1 내지 5:1이며, 이는 약 3:1 내지 5:1 또는 약 5:1일 수 있다.
쿠마린 6 나노에멀젼의 형광 강도는 덱스트란과 같은 폴리사카라이드 중합체를 SANE 제형에 가함으로써 증가될 수 있다. 실시예 2에 기재된 바와 같이, 형광 염료 쿠마린 6 SANE 조성물은는 임의로 덱스트란을 함유하여 SANE 염료 조성물의 형광 강도를 증가시킬 수 있다. 실시예 2는 중합체 덱스트란을 첨가하여 또는 이를 첨가하지 않고 쿠마린 6 SANE 염료 제형을 제조하는 것을 기재한다. 실시예 2는 또한 (a) DMSO 쿠마린 6 제조, (b) 덱스트란 부재하의 쿠마린 6의 나노에멀젼의 제조, 및 (c) 덱스트란과 함께 쿠마린 6의 나노에멀젼의 샘플들에서 측정된 입자 크기, 안정성 및 형광 강도를 기재한다. 도 24 및 도 25, 및 표 2에 나타낸 데이터는 덱스트란의 존재 또는 부재하의 나노에멀젼의 안정한 수 분산이 약 25nm 이하의 입자 크기로 제형화될 수 있다는 것을 나타낸다.
도 24에 보여지는 바와 같이, 분자량 1500을 갖는 덱스트란(쌀겨 오일 0.5g, 솔루톨® HS15 계면활성제 2.5g 및 물 22㎖와 함께 덱스트란 75mg)의 혼입은 25nm의 평균 입자 크기(Z-평균 입자 크기 25.15nm, 피크 너비 5.644 및 PDI 0.312)를 갖는 나노에멀젼을 생성하였다. 도 25는 형광 염료 쿠마린 6의 형광 강도의 증가를 보여준다. 표 2는 쿠마린 제제의 안정성을 기재한다. 표 2의 데이터에 나타낸 바와 같이, 3일 기간에 걸쳐, 이러한 쿠마린 6의 SANE 제제는 DMSO 쿠마린 6 제제에 비해 3일 이상 동안 실온에서 안정하였다(입자 크기 변화에 의해 결정됨). 최종적으로, 덱스트란을 함유하는 쿠마린 6 나노에멀젼의 제제는 덱스트란 중합체가 없는 나노에멀젼 및 DMSO에 비해 형광 강도의 급격한 증가를 보였다.
또 다른 실시예에서, 나노에멀젼은 폴리페놀, 예를 들면, 커큐민(즉, (1E,6E)-1.7-비스(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-1,6-헵타디엔-3,5-디온, CAS 458-37-7)을 포함한다. 실시예 3은 커큐민 나노에멀젼의 제조 및 각종 암 세포주에 대한 커큐민 나노에멀젼의 활성을 예시한다. 나노에멀젼은 대두유, 코코넛 오일, 대구 간유 또는 기타 어유 및/또는 쌀겨 오일으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 친유성 성분 중에 커큐민과 같은 폴리페놀을 포함할 수 있다. 커큐민 나노에멀젼은 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 예를 들면, 솔루톨® HS15를 포함할 수 있고, 이는 친유성 성분과의 S/O 중량비가 1:1 내지 5:1이며, 약 3:1 내지 5:1 또는 약 5:1일 수 있다.
기타 실시예에서, 나노에멀젼은 피리미딘 또는 피리미딘 유사체, 예를 들면, 5-플루오로우라실을 포함한다. 실시예 4는 5-플루오로우라실(5-FU)을 사용한 이러한 나노에멀젼의 제조를 예시한다. 나노에멀젼은 대두유, 코코넛 오일, 대구 간유 또는 기타 어유 및/또는 쌀겨 오일으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 친유성 성분 중에 피리미딘 또는 피리미딘 유사체를 포함할 수 있다. 피리미딘 또는 피리미딘 유사체 나노에멀젼은 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 예를 들면, 솔루톨® HS15를 포함할 수 있고, 이는 친유성 성분(예를 들면, 어유)과의 S/O 중량비가 1:1 내지 5:1이며, 약 3:1 내지 5:1 또는 약 5:1일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 나노에멀젼은 이미다졸 또는 이미다졸 유사체, 예를 들면, 5-(3,3-디메틸-1-트리아제닐)이미다졸-4-카복스아미드("다카바진")를 포함한다. 실시예 5는 다카바진을 사용한 이러한 나노에멀젼의 제조를 예시한다. 나노에멀젼은 어유, 예를 들면, 대구 간유 중에 이미다졸 또는 이미다졸 유사체를 포함할 수 있다. 나노에멀젼이 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제, 예를 들면, 솔루톨® HS15를 포함하는 경우, 친유성 성분은 쌀겨 오일의 부재 하에 제형화될 수 있다. 이미다졸 또는 이미다졸 유사체 나노에멀젼은 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 예를 들면, 솔루톨® HS15를 포함할 수 있고, 이는 어유 친유성 성분과의 S/O 중량비가 1:1 내지 5:1이고, 약 3:1 내지 5:1 또는 약 5:1일 수 있다. 이러한 나노에멀젼은, 예를 들면, 악성 흑색종, 호지킨 림프종, 육종 및 췌장의 섬세포암종과 같은 각종 암의 치료에 사용되는 항신생물제 화학요법 약물 치료를 위한 투여에 유용하다.
친유성 성분으로서 쌀겨 오일 중에 다카바진, 물 및 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 솔루톨® HS15를 포함하는 제형은 도 1에 도시된 방법에 따라 안정한 나노에멀젼을 형성하지 않았지만, 친유성 성분 중의 쌀겨 오일 대용으로 어유를 사용한 비교 제형은 동일한 방법으로 안정한 나노에멀젼을 형성하였다. 따라서, 다카바진 나노에멀젼에는 적어도 실질적으로 쌀겨 오일이 없을 수 있다. 쌀겨 오일은 어유보다 더 높은 백분율로(약 4%) 비-비누화성(nonsaponifiable) 성분을 갖는다. 다카바진 나노에멀젼은 오메가-3 또는 오메가 6 지방산을 포함하는 오일로 제형화될 수 있다. 다카바진을 포함하는 제형은 약 4% 미만의 비-비누화성 성분을 특징으로 하는 오일과 함께 친유성 성분을 포함할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 나노에멀젼은 탁산 화합물, 예를 들면, 파클리탁셀(CAS 33069-62-4)를 포함한다. 실시예 6은 파클리탁셀을 사용한 나노에멀젼의 제조를 예시한다. 나노에멀젼은 대두유, 코코넛 오일, 대구 간유 또는 기타 어유 및/또는 쌀겨 오일으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 친유성 성분 중에 탁산 화합물을 포함할 수 있다. 피리미딘 또는 피리미딘 유사체 나노에멀젼은 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 예를 들면, 솔루톨® HS15를 포함할 수 있고, 이는 친유성 성분(예를 들면, 쌀겨 오일)과의 S/O 중량비가 1:1 내지 5:1이며, 예를 들면, 약 3:1 내지 5:1 또는 약 4:1 내지 5:1, 또는 약 5:1일 수 있다.
또 다른 실시예에서, 나노에멀젼은 토코페롤, 예를 들면, 비타민 E 및/또는 토코트리에놀 화합물(알파-, 베타-, 감마- 및 델타-토코트리에놀 포함)을 포함한다. 실시예 7은 토코트리에놀 이성체들의 혼합물을 사용한 상기 나노에멀젼의 제조를 예시한다. 나노에멀젼은 쌀겨 오일 중에 토코페롤 및/또는 토코트리에놀 화합물(들)을 포함할 수 있다. 나노에멀젼이 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제, 예를 들면, 솔루톨® HS15를 포함하는 경우, 친유성 성분은 쌀겨 오일을 포함할 수 있다. 특히, 토코페롤 및/또는 토코트리에놀 나노에멀젼은, S/O 중량비를 1:1 내지 5:1, 및/또는 약 3:1 내지 5:1 또는 약 5:1로 하여 쌀겨 오일 친유성 성분과 함께 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 예를 들면, 솔루톨® HS15를 포함할 수 있다. 이러한 나노에멀젼은, 예를 들면, 산화방지제로서의 투여에 유용하다.
친유성 성분으로서 쌀겨 오일 중의 토코트리에놀, 물 및 C20 에톡시화 모노글리세라이드, 예를 들면, EMG-20을 포함하는 제형은 도 1에 도시된 방법에 따라 안정한 나노에멀젼을 형성하지 않는 반면, EMG-20 대용으로 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제, 솔루톨® HS15를 포함하는 비교 제형은 동일한 방법에 의해 안정한 나노에멀젼을 형성하였다. 토코페롤 및/또는 토코트리에놀 나노에멀젼, 특히 쌀겨 오일을 함유하는 나노에멀젼은 C20 에톡시화 모노글리세라이드, 예를 들면, EMG-20을 적어도 실질적으로 함유하지 않을 수 있다.
또 다른 실시예에서, 카로티노이드(크산토필 화합물 및/또는 제아잔틴 화합물 포함), 예를 들면, 4-[18-(4-하이드록시-2,6,6-트리메틸-1-사이클로헥세닐)-3,7,12,16-테트라메틸옥타데카-1,3,5,7,9,11,13,15,17-노나에닐]-3,5,5-트리메틸-사이클로헥스-2-엔-1-올("루테인")을 포함한다. 실시예 8은 루테인을 사용한 상기 나노에멀젼의 제조를 예시한다. 나노에멀젼은 친유성 성분으로서 쌀겨 오일 중에 루테인을 포함할 수 있다. 루테인 나노에멀젼은, S/O 중량비를 5:1 내지 1:1, 및 약 5:1 내지 3:1 또는 약 5:1로 하여 쌀겨 오일 친유성 성분과 함께 C20 에톡시화 모노글리세라이드, 예를 들면, EMG-20을 포함할 수 있다. 이러한 나노에멀젼은, 예를 들면, 약제, 기능성 건강식품, 식품 또는 동물 사료 제형에 사용되는 항신생물제 화학요법 약물의 치료를 위한 투여에 유용하다.
그러나, 친유성 성분으로서 쌀겨 오일 중 루테인, 물 및 C20 에톡시화 모노글리세라이드 EMG-20을 포함하는 제형은 도 1에 도시된 방법에 따라 안정한 나노에멀젼을 형성하지 않는 반면, 쌀겨 오일 대용으로 친유성 성분 중에 대두유를 포함하는 비교 제형은 동일한 방법에 의해 안정한 나노에멀젼을 형성하였다. 루테인 나노에멀젼은, 계면활성제가 C20 에톡시화 모노글리세라이드 EMG-20인 경우 적어도 실질적으로 쌀겨 오일을 함유하지 않을 수 있다.
또 다른 실시예에서, 나노에멀젼은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드 화합물(siRNA 화합물 포함)을 포함한다. 본원에 기재된 SANE 조성물은 단백질을 암호화하는 전령 RNA(mRNA) 또는 DNA의 기능의 안티센스 조절(modulation)에서의 사용을 위한 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며, 목적하는, 상기 조절 그리고 궁극적인 조절은 상기 단백질의 양을 조절하기 한 것이다. 안티센스 올리고뉴크레오타이드와 이의 mRNA 표적의 혼성화는 mRNA의 정상적인 역할을 방해하고 세포 내의 이의 기능의 조절을 야기한다. 방해되는 mRNA의 기능은 RNA의 단백질 해독의 위치로의 전위, RNA로부터의 단백질의 실제 유전암호해독, 하나 이상의 mRNA 종들을 수득하기 위한 RNA의 스플라이싱, mRNA의 붕괴 또는 전환(turnover)및 RNA에 의해 결합될 수 있는 가능한 독립적인 촉매 활성과 같은 모든 중요한 기능을 포함한다. 상기 mRNA 기능의 방해의 전체적인 영향은 단백질의 발현의 조절이다.
본 발명의 맥락에서, "조절"은 유전자의 발현에서의 증가(자극) 또는 감소(억제)를 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 억제는 유전자 발현의 조절의 한 형태이고, mRNA는 하나의 표적이다. 안티센스 화합물을 포함하는 SANE 조성물은 연구용 시약 진단 조제, 및 치료제로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 특이성을 갖는 유전자 발현을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특정 유전자의 기능을 밝히기 위해 사용될 수 있다. 안티센스 화합물은 또한, 예를 들면, 생물학적 경로의 각종 구성원의 기능들을 구별하기 위해 사용된다.
SANE 조성물은 또한, 이에 제한되지는 않지만 올리고뉴클레오타이드 모방체(mimetics)를 포함하는 기타의 올리고머성 안티센스 화합물을 포함한다. 안티센스 화합물은 SANE 조성물 중의 활성 성분일 수 있고, 약 8 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 염기(즉, 약 8개 내지 약 30개의 연결된 염기)를 갖지만, 더 긴 서열과 더 짧은 서열 모두 본 발명에서의 사용을 발견할 수 있다. 예를 들면, 상기 안티센스 활성 성분은 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 예를 들면, 약 12개 내지 약 25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
짧은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA)를 포함하는 나노에멀젼을 제조하였다. siRNA는 전사의 서열-선택적 억제제로서 사용될 수 있다. 실시예 9는 전사의 서열-선택적 억제제인 siRNA 화합물을 사용한 상기 나노에멀젼의 제조를 예시한다. 나노에멀젼은 젤라틴과 같은 친유성 성분 중에 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드 화합물(들)을 포함할 수 있다. 특히, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드 나노에멀젼은 약 1:1을 포함하는 5:1 내지 1:1의 S/O 중량비로 젤라틴 친유성 성분과 함께 에톡시화 모노글리세라이드(예를 들면, EMG-20) 계면활성제 및/또는 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제(예를 들면, 솔루톨® HS15)를 포함할 수 있다. SANE 조성물은 선택된 표적에 결합하도록 선택적으로 스크리닝되는 핵산 분자를 포함하는 활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 스크리닝은 셀렉스(SELEX)로 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 기본 SELEX 과정은 미국 특허 제5,475,096호 및 제5,270,163호(이의 전문이 참조로서 본원에 인용됨)에 기재되어 있다. SELEX 과정은, 각각 특이적으로 목적하는 표적 화합물 또는 분자에 결합하는 특성을 갖는 고유의 서열로 핵산 분자를 식별하기 위해 이용될수 있다.
또 다른 실시예에서, 나노에멀젼은 인슐린을 포함한다. 실시예 10은 경피 투여를 위해 제형화된 인슐린을 사용한 상기 나노에멀젼의 제조를 예시한다. 나노에멀젼은 대두유와 같은 친유성 성분 중에 인슐린, 폴리소르베이트 80(트윈® 80으로도 공지됨) 및 소르비탄 모노올레에이트(스판 80)의 배합물을 포함하는 계면활성제 및 물을 포함할 수 있다.
소비자 제품 SANE 조성물
SANE 조성물은 각종 소비자 제품으로 제형화될 수 있다. 특히, 친유성 성분, 친수성 성분 및 계면활성제로 본질적으로 이루어지는 SANE 조성물은 SANE 조성물 내에 추가의 활성 성분을 포함하지 않고(예를 들면, SANE 조성물의 제형에 요구되지 않거나 관여되지 않는 약제, 기능성 건강식품 또는 약용화장품 재료가 없는 SANE 조성물) 소비자 제품에 첨가될 수 있다. 이러한 3 성분 SANE 조성물은 이의 의도하는 사용 중 친유성 성분의 생체이용률, 흡수 또는 유효성을 증가시키는 형태로 소비자 제품에 친유성 성분을 첨가하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 친유성 성분의 나노에멀젼은 어유 보충제의 흡수율을 증가시키거나, 붕대를 감거나 상처치료로부터 비타민 친유성 성분의 피부로의 침투율을 증가시키거나, 또는 보습제 또는 샴푸로 피부 또는 모발에 적용되는 화장품 중의 친유성 성분의 목적하는 반응성 및 반응 표면 영역을 증가시킬 수 있다.
SANE 조성물은 수성 성분, 오일 성분 및 계면활성제 혼합물 성분을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 수성 성분은 증류수, 탈이온수, 식염수, 인산완충식염수 및 이들의 혼합물로부터 선택된다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 SANE 조성물은 화장품, 기능성 건강식품 또는 치료학적 제형에 포함하기 위한 것이다. 또는 제형들은 상기 제품에 적합한 기타 물질과 배합된 성분으로서 SANE 조성물을 포함하여 제공된다.
SANE 조성물은 소비자 제품 제제, 예를 들면, 세테아레스(ceteareth)-20, 세테아레스-12, 글리세릴 스테아레이트, 세테아릴 알코올 및 세틸 팔미테이트(예를 들면, 제형의 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 1.0 내지 2.5중량%)에 사용되는 담체와 배합될 수 있다. SANE 조성물을 포함하는 화장품 제형의 추가 성분은 에멀진(Emulgin®) B2(세테아레스-20) 및 에멀게이드(Emulgade®) SE를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 수성 성분은 나노에멀젼 제형의 대략 0.1 내지 35%를 구성한다. 기타 양태에서, 수성 성분은 나노에멀젼 제형의 대략 1 내지 20%(예를 들면, 수성 성분은 나노에멀젼 제형의 대략 2 내지 10%, 2 내지 5% 또는 6% 미만을 구성함)를 구성한다.
또 다른 예에서, SANE 조성물은 필모제닉 제제(filmogenic agent), 유연제, 용매 및/또는 스킨 컨디셔너로서 또는 이와 함께 제형화된다. SANE 조성물에 가해지거나 이와 배합될 수 있는 실리콘의 몇몇 예는 휘발성 및 비-휘발성 실리콘 오일, 예를 들면, 사이클로메티콘, 알킬디메티콘, 디메티콘코폴리올, 디메티코놀, 페닐 트리메티콘, 카프릴릴 트리메티콘, 아미노관능성 실리콘, 페닐 변형된 실리콘, 페닐 트리메티콘, 알킬 변형된 실리콘, 디메틸 및 디에틸 폴리실록산, C1 내지 C30 혼합된 알킬 폴리실록산, α-메틸-ω-메톡시폴리메틸실록산, 폴리옥시디메틸실릴렌, 폴리디메틸 실리콘 오일 및 이들의 배합물, 또는 실리콘 엘라스토머, 예를 들면, 사이클로메티콘 교차중합체 및 디메티콘, 비닐 디메티콘 교차중합체 및 디메티콘, 디메티콘 교차중합체 및 디메티콘 및 사이클로펜타실록산 교차중합체 및 디메티콘을 포함한다.
또 다른 예에서, SANE 조성물은 유연제 조성물로서 또는 유연제 조성물과 함께 제형화된다. 화장품 조성물에서의 유연제의 기능은 지질 및 천연 오일을 피부에 가하거나 교체하기 위한 것이다. 존재하는 SANE 조성물에 가해지거나 이에 배합되는 연화제로서, 통상적인 지질, 예를 들면, 오일, 왁스, 및 기타 수용성 성분, 및 예를 들면, 하이드록시, 카보닐 그룹 등과 같은 친수성 단위로 지질을 에스테르화하여 물중의 이들의 용해성을 증가시키기 위한 변형된 지질인 극성 지질을 사용할 수 있다. 연화제로서 사용될 수 있는 몇몇 화합물은 천연 오일, 예를 들면, 에센셜 오일 및 식물 유도체, 에스테르, 실리콘 오일, 다불포화지방산, 라놀린 및 이의 유도체이다. 사용될 수 있는 몇몇 천연 오일은 인스티티아 자두(damson), 패션 푸르트, 브라질넛(para-nut), 카라프 넛(carap nut), 쿠푸아수, 참깨, 대두, 땅콩, 코코넛, 올리브, 코코아, 아몬드, 아보카도, 카나우바(carnauba), 목화씨, 쌀겨, 피치 스톤, 망고 스톤, 호호바, 마카다미아, 커피, 포도씨, 호박씨 등, 및 이들의 혼합물로부터 유도된다. 추가로, 다수의 천연 화합물은, 예를 들면, 미정질 왁스, 카나우바 왁스, 시어 버터, 비(bee)-왁스, 오조케리 왁스 등 및 왁스 및/또는 오일의 혼합물로서 사용될 수 있다.
또 다른 예에서, SANE 조성물은 보습제 및/또는 습윤제와 같은 소비자 제품으로서 또는 이와 함께 제형화된다. 보습제는 피부 중의 수 보유를 촉진시키기 위해 SANE 조성물과 함께 제형화될 수 있다(예를 들면, 수분을 피부에 보충 및/또는 피부로부터의 수분 손실을 방지할 수 있는 조성물). 습윤제는 추가로 연화제의 효율을 증가시키고, 피부 박피를 감소시키고, 피부의 감각 특성(부드러움, 반드러움)을 향상시키는 것을 돕는다. 본 발명의 나노에멀젼에 가해지거나 이와 배합될 수 있는 습윤제의 몇몇 예는: 글리세린, 글리세레스-26, PET-4 디라우레이트, 폴리하이드록실 알코올, 알킬렌 폴리올 및 이의 유도체, 글리세롤, 에톡시화 글리세롤, 프로폭시화 글리세롤, 소르비톨, 하이드록시프로필 소르비톨 등, 젖산 및 락테이트 염, 디올 및 C3-C6 트리올, 임의의 형태, 예를 들면, 젤 형태의 알로에 베라 추출물, 설탕 및 전분 및 이의 유도체, 예를 들면, 알콕시화 글루코스, 히알루론산 글리콜산, 젖산, 글리콜산 및 살리실산, 판테놀 및 우레아이다. 임의로, SANE 조성물은 임의의 적합한 물질들로부터 선택되는 향수 또는 방향제를 포함하거나 이와 함께 배합될 수 있다. 예를 들면, 나노에멀젼은 소비자 제품, 예를 들면, 발한 억제제 제형 또는 세탁 세제로 혼입되기 위해 제형화될 수 있다.
SANE 조성물을 포함하는 소비자 제품 제형은 유사한 화장품 용도를 위해 사용되는 친유성 또는 친수성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 기타 성분은, 예를 들면, 해초, 팔미토일 하이드록시프로필 트리모늄 아미노펙틴, 글리세린 교차중합체, 레시틴 및 포도-씨 추출물의 배합물, 비스아볼롤(소염 활성), D-판텐올(컨디셔닝 활성), 토코페롤(비타민 E), 레티놀(비타민 A), 아스코르브산(비타민 C), 에로칼시페롤(비타민 D) 및 국부 또는 모발 사용을 위한 제품의 조성물에 통상적으로 가해지는 선스크린; 염료; 에틸렌디아미노테트라아세트산(EDTA) 및 이의 염으로서의 킬레이팅제; 트리에탄올아민과 같은 pH 조절제; DMDM 하이단토인과 같은 방부제; 식물 추출물, 예를 들면, 카모마일, 로즈마리, 백리향, 금잔화, 당근 추출물, 일반적인 주니퍼 추출물, 용담 추출물, 오이 추출물; 스킨 컨디셔닝 제제; 친유성 성분; 부틸 하이드록시톨루엔(BHT), 부틸 하이드록시아니솔(BHA)과 같은 산화방지제; SANE 조성물을 포함하는 염기 조성물과 함께 상용성인 기타의 상업적으로 허용되는 성분을 포함할 수 있다.
SANE 조성물을 포함하는 제형의 기타 예는 영양 보충제, 음료, 뉴트리언트 바(nutrient bars) 및 기타 음식, 보습제, 선스크린, 샴푸, 화장품, 주입가능한 벌킹제 및 치약을 포함한다. 하나의 예에서, SANE 조성물은 피부, 점막, 두피 및 모발의 케어, 보호 및 메이크업을 위한 화장품 제형으로서 제형화되거나 이에 가해질 수 있다. 본원에 기재된 제조방법에 따라 제조된 나노에멀젼은 피부, 점막 및 모발에 걸쳐 적용되기 위한 최종 생성물로서 사용될 수 있거나, 또는 첨가제로서 작용하는 미리 제조된 화장품 조성물에 혼힙될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 화합요법 활성 성분을 포함하는 SANE 조성물 및 1차 유방암 종양 및 전이에 화학요법 화합물(즉, 다카바진)을 전달하는 방법을 제공하며, 이는 나노에멀젼 없이 활성 성분을 투여하는 것보다 화학요법 화합물의 종양 세포로의 보다 효율적인 흡수를 제공한다. SANE 조성물은 50nm 또는 25nm 미만의 평균 액적 크기를 갖는 피부용(예를 들면, 무독성 오일)으로 제형화될 수 있으며, 전신계로, 경피적으로 또는 쉐이빙 크림 또는 에프터쉐이브 조성물로 제형화되는 비타민 오일 나노에멀젼 주입에 의해 또는 경피 투여(예를 들면, 패치 또는 붕대 중의 비타민 오일 나노에멀젼)에 의해 투여될 수 있다.
또 다른 예에서, SANE 조성물은 물 중에 친유성 나노입자 또는 액적과 함께 제형화될 수 있다(예를 들면, 쥬스, 예를 들면, 오렌지, 포도, 사과, 체리, 망고, 복숭아, 블루베리 또는 석류 쥬스 또는 탄산 또는 무-탄산 소프트 드링크 또는 기타 음료와 같은 음료에의 첨가용). 또 다른 예에서, SANE 조성물은 선스크린에 혼입되기 위해 제형화될 수 있다.
몇몇 양태에서, SANE 조성물의 성분 및 목적하는 활성 성분 제제는 사용 중 추후의 혼합을 위한, 특정 용도에 바람직할 수 있는, 개별적인 제형(예를 들면, 개별적인 바이알)으로 분리될 수 있다. 이러한 성분들은 진단 또는 치료 용도용 키트에 유리하게 배치될 수 있다. 몇몇 양태에서, 상기 키트는 본 발명의 나노에멀젼 제형을 통해 생물학적 제제를 의도하는 작용 부위로 전달하는데 요구되는 모든 필수적인 물질 및 시약을 함유한다.
약제학적 SANE 조성물
하나 이상의 활성 성분을 포함하는 SANE 조성물은 치료 방법에 사용되기 위한 의학적으로 적합하고 치료학적으로 유효한 방식으로 제형화될 수 있다. SANE 조성물 중에 제형화된 활성 성분의 치료학적으로 유효량은 나노에멀젼으로서 투여되지 않는 활성 성분의 치료학적으로 유효량 미만일 수 있다.
SANE 조성물은 또한 하나 이상의 활성 성분에 대한 담체로서 작용할 수 있다. 이러한 활성 성분은 나노에멀젼을 제조하기 전에 친수성 상 또는 친유성 상에 가해질 수 있다. 활성 성분은 오일 입자에 부착되고/부착되거나 그 속에 혼입되고/혼입되거나 용해되도록 제조될 수 있다. 활성 성분을 함유하는 SANE 조성물은, 나노에멀젼이 활성 성분으로서 치료학적 투여에 적합한 고체 또는 액체 비히클과 혼합되는, 약제 및/또는 기능성 건강식품 제제의 제조를 위해 이용될 수 있다. 활성 성분 및 기타 담체 성분을 포함하는 SANE 조성물의 혼합물은 앰플, 특히 멸균 주사 및 주입액; 용액(예를 들면, 나노에멀젼 이외에 각종 물질을 함유할 수 있는 경구 액체, 점안액 및 비강액); 에어로졸 및 투여 에어로졸(예를 들면, 나노에멀젼 이외에 분사제 가스 및/또는 안정화제를 추가로 포함); 나노에멀젼을 함유하는 친수성 및 소수성 겔 및 연고; 나노에멀젼을 함유하는 o/w 또는 w/o 크림; 나노에멀젼을 함유하는 로션 및 페이스트로서 제형화되고 제공될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 따라 제조된 나노에멀젼은, 나노에멀젼에, 예를 들면, 천연 아미노산, 살충제, 소량의 트랜스페린 및 임의로 글루코스를 가함으로써 세포 배양을 위한 배양액의 제조에 유리하게 이용될 수 있다. 이러한 배약액에서, 나노에멀젼은 에너지 전달제로서 제공되고, 통상적인 배양액, 예를 들면, 송아지 혈청으로부터 제조된 배양액에서 사용되는 단백질을 적어도 일부 대체시킬 수 있다. 활성 성분(예를 들면, 100nm, 50nm 또는 25nm 미만의 평균 입자 크기로 친유성 성분의 액적으로 캡슐화됨)을 포함하는 SANE 조성물은 이에 제한되지는 않지만, 경구, 경피, 정맥내, 복강내, 근육내, 종양내 또는 피하 경로를 포함하는 임의의 의료학적으로 적합한 투여 경로를 위해 제형화되거나 이를 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 활성 성분을 포함하는 균일한 SANE 조성물의 투여는 화학요법 화합물을 표적 세포로 세포내 전달하거나(예를 들면, 개체 내의 전이된 종양 세포), 활성 성분을 개체로 전달하는 개선된 막 침투 특성(예를 들면, 경피 전달 도중)을 제공할 수 있다.
본원에 기재된 SANE 조성물을 포함하는 제형은 기타 보조 생물학적 제제, 예를 들면, 약제학적으로 허용된 담체, 또는 희석액을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용된 담체의 예는 이에 제한되지는 않지만, 액체, 크림, 소포, 로션 또는 젤을 포함하고, 추가적으로 유기 용매, 유화제, 겔화제, 보습제, 안정화제, 습윤제, 방부제, 지연제 및 소량의 보습제, 격리제, 염료, 향수 및 약제학적 조성물에 통상적으로 사용되는 기타 성분을 포함할 수 있다.
하나의 양태에서, 본 명세서는 화학요법 활성 성분을 포함하는 SANE 조성물 및 1차 유방암 종양 및 전이에 화학요법 화합물(즉, 다카바진)을 전달하는 방법을 제공하는데, 이는 나노에멀젼 없이 활성 성분을 투여하는 것보다 화학요법 화합물의 종양 세포로의 보다 효율적인 흡수를 제공한다. 50nm 또는 25nm 미만의 평균 액적 크기를 갖는 친유성 성분의 액적 또는 입자(예를 들면, 무독성 오일) 내에 하나 이상의 화학요법 화합물(즉, 예를 들면, 다카바진 및/또는 타목시펜)을 포함하는 SANE 조성물은 전신계로, 경피적으로 또는 주입에 의해 투여될 수 있다.
SANE 조성물의 투여
본 발명의 나노에멀젼 제형은 임의의 허용되는 방식으로 투여될 수 있다. 몇몇 양태에서, 본 발명의 나노에멀젼 제형은 비경구적 투여에 의해 개체에 전달된다. 비경구 투여는 정맥 내로, 근육 내, 피하의, 피내의, 복강내, 흉강내 또는 협막내 투여를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
몇몇 양태에서, 본원에 기재된 SANE 조성물은 비주사형(non-parenteral) 투여 경로에 의해 개체로 전달된다. 비주사적 투여는 직접적으로 또는 그렇지 않더라도, 통상적으로 시린지 및 니들의 사용을 수반하지 않는 비침습성 방법을 통한 본 발명의 나노에멀젼 제형의 투여를 지칭한다. 비주사적 투여는 직접적으로, 또는 그렇지 않더라도, 동물의 소화관, 피부, 눈, 폐 도관(pulmonary tract), 요도 또는 질의 전체 또는 일부와 접촉함을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 비주사적 투여의 구체적인 예는 협측, 설하, 내시경, 경구, 직장, 경피, 비강, 기관내, 폐, 요도, 질, 눈 및 국부를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 SANE 제형은 입에서부터 항문까지, 및 임의의 및 모든 이의 일부 또는 부분(예를 들면, 구강, 식도, 위, 소장, 대장 및 결장 뿐만아니라 위장관과 같은 이의 화합물 부분)을 흐르는, 음식의 소화 및 흡수 및 음식 잔여물의 제거에서 기능하는 동물의 위장관, 관형 통로를 통해 개체로 전달 될 수 있다. 따라서, 위장관으로의 전달은 이에 제한되지는 않지만, 경구 투여, 직장 투여, 내시경 투여 및 설하/협측 투여를 포함하는 여러 경로의 투여를 포함한다.
몇몇 양태에서, 본원에 기재된 SANE 조성물의 비주사형 투여는 이온삼투요법(전기장의 영향 하에 생체막을 통해 이온성 용질의 전달), 음성영동법 또는 초음파영동법(sonophoresis)(생체막, 특히 피부 및 각막으로의 각종 치료제의 흡수를 촉진시키기 위한 초음파의 사용)을 포함할 수 있다. 이러한 기술들은 나노에멀젼 제형 중의 생물학적 제제가 치료학적 효과를 가질 수 있도록 본 발명의 나노에멀젼 제형의 수송을 촉진시키는데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 SANE 조성물의 전달은 협측 투여 및 설하 투여의 경우와 같이 구강 점막을 통해 발생할 수 있다. 이러한 투여 경로는, 경구 전달을 통한 경우 보다, 많은 경우, 생물학적 제제의 혈장 농도의 보다 빠른 증가를 포함하는, 여러 가지의 목적하는 특징을 갖는다. 추가로, 입으로부터의 정맥 배류는 상대 정맥으로 가기 때문에, 이러한 경로는 또한 간에 의한 빠른 일차통과 대사를 우회한다.
내시경 시술은 본원에 기재된 SANE 조성물의 위장관의 내부 부분으로 직접 전달을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 내시경역행담췌관조영술(endoscopic retrograde cystopancreatography; ERCP)은 확대된 위내시경 검사의 이점을 가지며 담도 및 췌도로의 선택적 접근을 허용한다. 본 발명의 나노에멀젼 제형은 내시경 수단을 통해 위장관의 일부(예를 들면, 십이지장 또는 위점막하층)로 직접 전달될 수 있다. 위세척 장치 및 경피적 내시경 식이 장치는 또한 SANE 조성물의 직접적인 위장관 전달을 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 SANE 조성물은 하측 장관 경로(예를 들면, 항문을 통해 직장 또는 하측 창자로)에 의해 투여될 수 있다. 직장 좌제, 정체 관장 또는 직장 카테터(rectal catheters)는 이러한 목적으로 사용될 수 있다(소아 환자, 노인 환자 또는 무의식 환자).
본원에 기재된 SANE 조성물은 개체에 국소적(국부적)으로 전달된다. 나노에멀젼 제형의 국소적 적용은 주로 국부적 효과를 생성한다. 국소적 적용의 예는 점막, 피부, 눈 또는 기관 표면(시험관내 이식 기관 또는 생체내 기관)으로의 국소적 적용을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 한 가지 국소적 투여 경로는 피부를 통하는 것이다. 본원에 기재된 SANE 조성물의 국소적 전달은 나노에멀젼 제형 중의 생물학적 제제를 질병의 국한된(confined) 부위(예를 들면, 임상적으로 활성 피부 병변)로 향하게 하는 이점을 가질 수 있다. 본 발명의 나노에멀젼 제형의 국소적 적용은, 예를 들면, 경피 패치의 형태로 되거나, 흡수성 물질, 예를 들면, 봉합사, 붕대 및 거즈로 가득 스며들거나, 또는 고체상 물질의 표면상에 피복될 수 있다. 본원에 기재된 SANE 조성물은 개체의 피부에 비자극적인 제형에 투여될 수 있다.
본원에 기재된 SANE 조성물은 점막을 통해 전달될 수 있다. 점막에 적용되는 나노에멀젼 제형은 주로 국소적인 효과를 제공하기 위해 제형화될 수 있다. 이러한 투여 경로는 결막, 비강인두, 구강인두, 질, 결장, 요도 및 방광의 점막으로의 나노에멀젼 제형의 적용을 포함한다. 본원에 기재된 SANE 조성물의 안구 전달은 눈 감염 또는 눈의 이상의 국소적 치료에 유용하다. 나노에멀젼 제형은 점적주입 및 각막을 통해 발생하는 흡수를 통해 투여된다. 따라서, 각막(comeal) 감염 또는 외상은 보다 빠른 흡수를 야기한다.
몇몇 양태에서, SANE 조성물의 성분 및 목적하는 활성 성분 제제는 사용 도중 추후 혼합을 위해, 특정 용도에 바람직할 수 있는 개별적인 제형(예를 들면, 개별적인 바이알)으로 분리될 수 있다. 이러한 성분은 진단 또는 치료학적 용도를 위한 키트에 유리하게 배치될 수 있다. 몇몇 양태에서, 이러한 키트는 본 발명의 나노에멀젼 제형을 통해 생물학적 제제를 이들의 의도하는 작용 부위에 전달하는데 필요한 모든 필수적인 물질 및 제제를 함유한다.
상기 키트는 또한 상업적 판매를 위한 꽉 밀폐된 바이알을 함유하기 위한 수단(예를 들면, 목적하는 바이알이 보관되는, 주입 또는 취입 성형된 플라스틱 컨테이너)을 포함할 수 있다. 컨테이너의 수 또는 유형에 상관없이, 본 발명의 키트는 또한 개체 상에 또는 개체 내에 나노에멀젼 제형의 투여 또는 배치를 보조하기 위한 장치를 포함하거나 이와 함께 포장될 수 있다. 이러한 장치의 예는 흡입기, 시린지, 피펫, 겸자, 계량 스푼, 점안기, 면봉, 패치 또는 임의의 상기 의료학적으로 승인된 전달 비히클을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
실시예
본 발명은 특허청구범위에 기재된 발명의 범위를 제한하지 않고, 하기 실시예에서 추가로 기재된다. 나노에멀젼의 제조 방법, 분석 및 특징적인 일부 양상은 하기에 기재된다.
달리 지시되지 않는 한, 쌀겨 오일은 1TBSP에 이용가능한 지방 14 g 중 다불포화 지방(5.5 g), 단일 불포화 지방(6 g) 및 포화 지방(2.5 g)을 함유한다. 달리 지시되지 않는 한, 어유는 7%의 총 지방을 갖는 대구 간유 4.6g(3% 포화 지방 0.5g, 다불포화 지방 1.6g 및 단일 불포화 지방 2.5g을 포함), 콜레스테롤 25mg(8%), EPA 500mg 및 DHA 500mg을 함유한다. 계면활성제 솔루톨® HS15는 주사용 비이온성 가용화제로서 폴리에틸렌 글리콜 660 하이드록시스테아레이트에 대한 상표명(제조원: 바스프 아크티엔게젤샤프트(BASF Aktiengesellschaft))이다. 달리 지시되지 않는 한, EMG 20은 카라반 인그레디언츠(Caravan Ingredients)(제조원: 레넥사(Lenexa), KS)로부터 수득한 에톡시화 모노- 및 디글리세라이드이고, 트윈® 80 및 크레모포 계면활성제는 시그마로부터 입수하였다. 크레모포는 폴리에톡시화 피마자유 버젼에 대한 바스프 코포레이션의 등록 상표인 크레모포 엘(CREMOPHOR EL®) 제품일 수 있다. 이는 에틸렌 옥사이드 35mol과 캐스터 오일 각각의 mol을 반응시켜 제조된다.
미세 유동화 기술을 이용하여 형성된 일부 나노에멀젼과 반대로(즉, 다중 피크를 갖는 입자 또는 액적 크기 분산을 갖는 에멀젼을 생성할 수 있는 고압 에멀젼 형성 기술), SANE 조성물은 약 25nm 이하의 평균 크기(Z-평균)를 갖는 단일 피크 입자 크기 분산과 같은, 친수성 성분 중에 현탁된 친유성 성분의 액적 크기의 단일 피크 분산을 가질 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, "단일 피크 입자 크기 분산"은 측정된 입자 또는 액적 크기의 히스토그램이 다중 피크와는 반대로 단일 피크를 갖는 에멀젼을 지칭한다.
하기 실시예에 지시된 모든 제형의 입자 크기는 멜버른 제타사이저-에스(Malvern Zetasizer-S) 장치(멜버른 인스트루먼츠 인코포레이티드, 사우스보러 매사추세츠주)를 사용하여, 관자상 관측정법으로도 불리는 동적 레이저 광산란법에 의해 측정하였다. 각각의 샘플을, 다중 광 산란 효과를 피하기 위해 증류수로 측정하기 바로 직전에 희석시켰다. 이전 보고서는, 샘플을 희석에 의해 입자 크기 분포가 변화되지는 않는다고 지적하였다(참조: Muller et al., 2002). 브라운 운동으로 인한 입자 확산(병진 확산)은 파라미터의 크기와 관련된 장치로 측정하였다. 평균 유체역학적 직경(DH)은 스트로크-아인슈타인(Stroke-Einstein) 방정식으로부터 계산된다. 제타사이저로 측정될 수 있는 입자 크기의 범위는 0.6 내지 6000nm이다.
본 실시예에 기재된 여러 나노에멀젼의 시험관내 활성은 CCL-221, Malme 3M 및/또는 CCL-2 암세포주로 시험하였다. 각각의 실시예에서, 배양된 인간 암세포주 CCL-221, Malme 3M 및 CCL-2는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC)(제조원: 매너서스, 버지니아주)로부터 입수하였다. CCL-221은 1977 내지 197년도 기간동안 D.L. 덱스터(Dexter) 및 그의 동료에 의해 분리된 샘암종 세포주이다. CCL-221은 소 태아 혈청과 함께 ATCC-제형화된 RPMI-1640 배지에서 최종 농도 10%로 배양하였다. 43세 남성으로부터 얻은 악성 흑색종, Malme-3M을 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)에서 배양하고 소 태아 혈정 10%로 보충하였다. 31세 여성으로부터의 자궁 경부 상피 선암종(Cervix epithelial adenocarcinoma) 세포주, CCL-2는 소 태아 혈청 10%로 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium)에서 배양하였다. 모든 배지는 또한 페니실린 100units, 1㎖ 당 스트렙토마이신 100㎍ 및 피브루산나트륨 1mM으로 보충하였다. 세포는 제조자에 의해 지시된 바와 같이 계대배양 후, 95%의 O2; 5%의 CO2의 인큐베이터에서 37℃에서 배양하였다.
실시예 1: 추가의 활성 성분 없이 자가-조립 나노에멀젼을 제조하기 위한 방법 및 조성물
활성 성분이 없는 일련의 나노에멀젼("블랭크 나노에멀젼")을, 각종 오일 및 상이한 계면활성제 농도를 사용하여 제조하였다. 간단하게, 대두유, 코코넛 오일, 어유 및 쌀겨 오일을 포함하는 오일 1g(2중량%)를 칭량하고, 각각 비커에 놓았다. 후속적으로, 하기 에톡시화 비-이온성 계면활성제 중 하나를 1g(2중량%), 3g(6중량%), 5g(10중량%) 및 7g(14중량%)으로 각각의 조성물에 가하였다: 총 64 나노에멀젼에 대해, C20 에톡시화 모노글리세라이드(EMG-20), 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르(솔루톨® HS15), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(트윈® 80) 및 폴리옥시에틸렌 피마자유. 계면활성제를 오일에 가하고, 혼합물을 2개의 성분이 시각적으로 균질한 혼합물을 형성할 때까지 자석 교반기를 사용하여 5분 동안 가열 및 교반시켰으며, 이 때 온도는 50 내지 60℃였다. 이어서, 혼합물을 60℃에서 교반시키면서 증류수(총 용적=50㎖)를 가하였다. 이 단계에서, O/W 에멀젼을 형성하였다. 가열하는 동안, 시스템의 PIT(또는 HLB 온도)(65 내지 70℃, 상 전환 구역)에 도달했을 때, 계면활성제는 유 상 및 수 상과 평형 상태를 이루었다. 가열 및 교반은 PIT 초과 80℃ 이하까지 지속하였다. 이 온도에서, 시스템은 W/O 에멀젼으로 전환한다. 상기 에멀젼을 실온에서 냉각시켜 O/W 에멀젼을 수득하였다.
블랭크 나노에멀젼은 대두유, 코코넛 오일, 쌀겨 오일 및 어유를 포함하는 여러 상이한 유형의 오일을, 계면활성제/오일(S/O 비)의 상이한 초기 중량비로 사용하여 제조하였다. 각각의 나노에멀젼 중의 평균 오일 액적("입자") 크기의 측정은 도 2 내지 도 5에 보여진다. 상기 데이터는, S/O 비가 1:1로부터 3:1로 증가되는 경우, 평균 오일 액적 크기가 극적으로 감소되고, 초기 S/O 비가 3:1초과 내지 5:1 및 7:1로 증가됨으로써 추가로 평균 오일 액적 크기가 감소되어, 입자 크기가 S/O 비에 극적으로 영향을 받는 것을 보여준다(도 2 내지 도 5). 따라서, 25nm 미만의 평균 오일 액적 크기를 갖는 다중 나노에멀젼을 제조하였고, 이는, (a) EMG20, 솔루톨® HS15 또는 크레모포 엘® 계면활성제와의 5:1의 S/O 초기 중량비를 사용하여 수 중 쌀겨 오일의 나노에멀젼(도 2); (b) EMG20, 솔루톨® HS15, 트윈® 80 또는 크레모포 엘® 계면활성제와의 S/O 초기 중량비 5:1을 사용한 수중 코코넛 오일의 나노에멀젼(도 3); (c) EMG20, 솔루톨® HS15, 트윈® 80 또는 크레모포 계면활성제와의 S/O 초기 중량비 5:1을 사용한 수중 대두유의 나노에멀젼(도 4); 및 (d) EMG20, 솔루톨® HS15 또는 트윈® 80 계면활성제와의 S/O 초기 중량비 5:1을 사용한 수중 어유의 나노에멀젼(도 5)을 포함한다.
나노에멀젼의 형성은 S/O 비가 5:1일 때 높은 단일분산성과 안정성을 나타냈다. 오메가-3 어유와의 S/O 비를 5:1로 하여 제형화된 블랭크 나노에멀젼의 입자 크기는 대략 20nm이고 10nm 미만의 너비(즉, 약 5.26nm의 너비와 약 19.8nm의 평균 액적 크기)를 갖는 입자 크기 분산은 도 6의 그래프에 보여진다.
도 7은 식물유 및 솔루톨® SH15 계면활성제를 초기 S/O 중량비 2:1(솔루톨® HS15 2g, 식물유 1g 및 물 47㎖)로 사용하여 실시예 1에 기재된 방식의 자가-조립 방법에 의해 형성된 블랭크 나노에멀젼에 대한 액적 입자 분산을 나타낸다. 오일 액적 입자 크기 분산은 약 27nm의 평균 크기 및 10nm 미만의 너비를 갖는다(27.4nm의 Z-평균 입자 크기, 9.69nm의 입자 크기 피크 너비). 각각의 SANE 제형에 대한 각종 중량비는 표 1에 작성된다. 하기 표 1은 상이한 유형의 오일(대두유, 코코넛 오일, 어유 및 쌀겨 오일) 및 상이한 비이온성 폴리에톡시화 계면활성제(EMG-20, 솔루톨® HS15, 트윈® 80 및 크레모포)를 사용하여 실시예에 따라 제조된 4개의 SANE 제형을 요약한다. 생성된 SANE 조성물 중의 오일의 평균 액적 크기는 도 2 내지 도 5에 보여진다.
조성물 대략의 물 중량(g) 오일 중량(g) 계면활성제 중량(g) S/O 중량비 W/(W+O) 중량비 O/(W+O) 중량비 O/(O+S) 중량비 W/(W+S) 중량비 S/(S+W+O) 중량% 물 중량%
1 48.0 1.00 1.00 1.00 0.980 0.020 0.500 0.020 2.0% 96.0%
2 46.0 1.00 3.00 3.00 0.979 0.021 0.250 0.061 6.0% 92.0%
3 44.0 1.00 5.00 5.00 0.978 0.022 0.167 0.102 10.0% 88.0%
4 42.0 1.00 7.00 7.00 0.977 0.023 0.125 0.143 14.0% 84.0%
실시예 2: 쿠마린을 포함하는 SANE 조성물
활성 성분으로서 쿠마린(벤조피론, CAS 91-64-5)을 포함하는 나노에멀젼을 실시예 1에 기재된 자가-조립 방법으로 제조하였다. 쿠마린 활성 성분을 하기 기재된 바와 같이 오일 친유성 성분과 배합하였다. 쿠마린은, 예를 들면, 살서제, 여러 항응고제의 전구체(예를 들면, 와파린) 및 몇몇 염료 레이저 중의 이득 배지(gain medium)로서 사용될 수 있다.
일련의 0.01mM의 쿠마린 나노에멀젼을, 대두유, 코코넛 오일, 어유 및 쌀겨 오일으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 오일 1g(2중량%)를 우선 제공하여 제조하고, 칭량하고 비커에 놓았다. 쿠마린을 각각의 비커에 첨가하고, 쿠마린이 시각적으로 오일에 용해된 것으로 보일때까지 가열 및 교반시켰다. 후속적으로, 에톡시화 비이온성 계면활성제, 솔루톨® HS15(12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르) 5g(10중량%)을 가하고, 2 성분이 시각적으로 균질한 혼합물을 형성할 때까지 자석 교반기를 이용하여 혼합물을 5분 동안 가열 및 교반시켰으며, 이 때의 온도는 50 내지 60℃였다. 이어서, 혼합물을 60℃에서 교반시키면서 증류수(총 용적=50㎖)를 가하였다. 이 스테이지에서, O/W 에멀젼을 형성하였다. 가열하는 동안, 시스템의 PIT(또는 HLB 온도)(65 내지 70℃, 상 전환 구역)에 도달했을 때, 계면활성제는 유 상 및 수 상과 평형 상태를 이루었다. 가열 및 교반을 계면활성제의 PIT 초과 80℃ 이하까지 지속하였다. 이 온도에서, 시스템은 W/O 에멀젼으로 전환하였다. 상기 에멀젼을 실온에서 냉각하여 자가-조립 O/W 나노에멀젼을 수득하였다.
이번 연구에서, 쿠마린 세포 흡수가 어유 처리된 세포를 포함하는 나노에멀젼 중에서 상당히 높은 것을 발견하였다. 고농도의 오메가-3 지방산은 나노에멀젼 제형의 투여 후 흡수, 생체이용률 및 뇌 흡수를 촉진시킬 수 있다. 다불포화 지방산(오메가-3 및 오메가-6)과 함께 제조된 나노에멀젼은 구강 생체이용률 및 효과적인 뇌 전달을 촉진시킬 수 있다. CCL-221, Malme-3M 및 CCL-2를 적절한 세포 배지에서 배양시키고, 컨플루언시(confluency)로 성장시키고, 쿠마린을 함유하는 나노에멀젼을 1:50의 비로 하여 배양 배지로 가하고, 3시간 동안 추가로 배양하였다. 배양 후, 세포 배지를 흡인 제거하고, PBS를 사용하여 세포를 3회 세척하였다. 세척 후, 200㎕ RIPA(용해 완충액)를 가하고, 이어서 세포를 플레이트로부터 수집하였다. PBS 1㎖를 에펜도르프(eppendorf)로 세포를 수집하는데 사용될 것이다. 수집된 세포는 형광분광광도계를 사용하여 각각의 나노에멀젼 처리된 세포의 형광 강도를 측정하였다.
도 8A는 결장암(CCL-221) 세포 흡수시 PIT 나노에멀젼을 통해 제형화되는 상이한 오일의 효과를 나타내는 그래프이다; 도 8B는 흑색종 암(Malme-3M) 세포 흡수시 PIT 나노에멀젼을 통해 제형화되는 상이한 오일의 효과를 나타내는 그래프이다; 도 8C는 자궁경부암(CCL-2) 세포 흡수시 PIT 나노에멀젼을 통해 제형화되는 상이한 오일의 효과를 나타내는 그래프이다. 이러한 결과는 종양 세포 배양(CCL-221, Malme-3M 및 CCL-2)이 상이한 오일로 제형화된 나노에멀젼에서 유사한 패턴의 쿠마린 흡수를 나타내는 것을 보여주었다. CCL-221 및 Malme-3M 종양 세포 배양 연구에서, 쿠마린의 세포 흡수는 어유 및 코코넛 오일을 포함하는 나노에멀젼으로 처리한 세포에 비해, 대두유 및 쌀겨 오일으로 처리된 세포를 포함하는 나노에멀젼에서 비교적 낮았다(대략 40% 미만)(도 8A 및 도 8B).
CCL-2 종양 세포 배양 실험에 있어서, 결과는 쿠마린의 세포 흡수 또한 대두유 및 쌀겨 오일으로 처리된 세포를 포함하는 나노에멀젼에서 더 낮았다는 것을 보여주었다(도 8C). 따라서, 하나의 실시예에서, 세포 흡수를 위한 SANE 조성물은 어유 또는 코코넛 오일을 포함하는 친유성 성분을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 하기 조성물을 제조하였다: (1) 쌀겨 오일(1g), 덱스트란(25mg)+솔루톨® HS15 계면활성제(5gm) 탈이온수(44㎖) 및 쿠마린(11mg)의 혼합물로부터의 SANE(제형 1), (2) 쌀겨 오일(1g), 솔루톨® HS15 계면활성제(5gm) 탈이온수(44㎖) 및 쿠마린 6(11mg)의 혼합물로부터의 SANE(제형 2), 및 (3) 일반적인 용매 DMSO 중의 쿠마린 6의 혼합물. 제형 1 및 제형 2는 하기에 의해 제조된 나노에멀젼이었다:
1. 쌀겨 오일(1g) 및 덱스트란(25mg)의 혼합물을 가열하고, 이어서 쿠마린 6(11mg)을 가하는 단계;
2. 혼합물을 가열하면서 혼합하여, 쌀겨 오일, 덱스트란 및 쿠마린 6의 용액을 가열하면서 형성하는 단계;
3. 솔루톨® HS15 5gm을 가하고 가열하면서 혼합시키는 단계;
4. 물 44㎖를 가하고, PIT 초과의 온도로 가열하면서 매우 잘 혼합시키는 단계; 및
5. 실온으로 가져와 나노에멀젼을 형성시키는 단계.
제형 1 내지 3의 형광을 측정하였다(형광 스펙트럼, Abs/EM = 458/503nm). 이러한 제형들에서 쿠마린 6의 상대적인 형광 강도: 822(제형 3), 1108(제형 2) 및 2448(제형 3). 상기 데이터는 도 24에 보여진다. 분자량 1500의 덱스트란을 혼입하여 25nm의 평균 입자 크기를 갖는 나노에멀젼을 생성하였다. 도 25는 형광 염료 쿠마린 6의 형광 강도의 증가를 보여준다. 표 2는 쿠마린 제제의 안정성을 보여주는 데이터를 제공한다. 형광 강도는 쿠마린 6의 나노-에멀젼을 제조함으로써 35% 증가하였다. 형광 강도는 덱스트란 중합체와 함께 쿠마린 6의 나노-에멀젼을 제조함으로써 198% 증가하였다. 중합체 덱스트란을 가함으로써, 덱스트란이 없는 나노에멀젼 쿠마린 6에 비해 형광 강도를 121% 증가시켰다.
실온에서 수일에 걸쳐 저장된 쿠마린 제제의 안정성
DMSO 쿠마린 나노-쿠마린 나노쿠마린(덱스트란)
시간(hrs) 크기 PDI 크기 PDI 크기 PDI
0 1373 0.457 20 0.127 21 0.085
72 1373 0.857 20 0.123 21 0.085
96 2142 0.857 20 0.1 21 101
120 6000 0.857 20 0.1 22 0.175
144 6000 0.857 28 0.278 22 0.175
240 6000 0.857 28 0.278 22 0.175
PDI=다분산 지수
실시예 3: 커큐민을 포함하는 SANE 조성물
폴리페놀 화합물 커큐민(즉, (1E,6E-1,7-비스(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-1,6-헵타디엔-3,5-디온, CAS 458-37-7)을 포함하는 자가-조립 나노에멀젼을 평균 오일 액적 입자 크기 20nm 미만 및 입자 크기 분산 너비 5nm 미만으로 하여 제조하였다. 커큐민은 흑색종 암 세포주에서 세포 증식을 억제하는 보고된 항암 특성을 갖는 기능성 건강식품이다. 커큐민을 칭량하고 어유와 α-토코페롤의 혼합물 1g과 7:3의 비로서 혼합하고, 크레모포 엘 5g을 용액(즉, 5:1의 계면활성제:오일의 비)에 가하였다. 이어서, 용액의 혼합물을 교반시키고 65℃로 가열시켰다. 이어서 물(44㎖)를, 용액이 완전히 투명해질 때까지 몇 방울로 가하였다. 혼합물을 O/W로부터 W/O 에멀젼으로 전환시키기에 충분한 시간동안 계면활성제의 PIT 초과의 온도로 가열하여 커큐민 SANE 조성물을 형성하고, 실온 이하로 냉각시켜 나노에멀젼을 형성하였다. 생성된 SANE 조성물은 물 중에 현탁된 액적을 형성하는 친유성 성분 중에 캡슐화되는 커큐민을 포함하였다. 액적 입자 크기는 대략 20nm의 크기로 조밀하게 한정된 분산 피크를 가졌다.
비교를 위해, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 물 및 커큐민의 혼합물(즉, 나노에멀젼이 아님)을 또한 제조하였다. 도 9A 및 도 9B는 2개의 투과전자현미경을 보여준다: (A) 커큐민의 DMSO 프렙의 TEM 이미지(덩어리지고 불규칙하게 비조직화된 구조임을 주의) 및 (B) 커큐민의 나노에멀젼(SANE) 제조(약 20nm의 작은 입자 크기 및 집단군들의 균질성을 주의함). 도 8에서의 TEM 이미지들은 모두 각각의 이미지에서 182.093 pix/마이크론 해상도 및 500nm의 스케일에 상응하는 솔리드 바(solid bar)를 특징으로 한다. 도 9C는 0.052의 PDI와 함께 약 18.7nm의 평균 액적 입자 크기 및 약 4.94nm의 피크 너비를 갖는 SANE 조성물에 대한 오일/커큐민 액적 크기를 보여준다.
커큐민 나노에멀젼의 계면동전위("제타-전위")를 측정하고(도 10A) 수 중 커큐민에 대해 상응하는 계면동전위와 비교하였다(도 10B). 콜로이드성 시스템의 제타 전위는 미끄럼면의 위치 대 계면으로부터 떨어진 다량의 유체에서의 점에서의 계면 이중층(double layer; DL)에서의 전기 전위(즉, 분산된 입자에 부착된 유체의 고정층과 분산 배지 간의 전위차)에 해당한다. 작은 입자(예를 들면, 나노에멀젼)에 있어서, 고 제타 전위는 콜로이드성 분산액의 더 높은 안정성에 해당하고, 입자/액적 응집에 저항하기 위한 분산액 중의 인접하는 입자들 사이의 높은 정도의 척력을 나타낸다. -23.5의 제타 전위(-50.3의 벽(wall) 제타 전위)는 수 중 커큐민에 대해 -2.53의 10mv에서의 제타 벽 전위와 비교하여(도 10B), 커큐민 나노에멀젼에 대해 측정하였다(도 10A).
도 11은 흑색종 암세포에 대한 커큐민 나노에멀젼 및 커큐민-DMSO 혼합물 둘 다의 시험관내 활성을 보여준다. 커큐민 나노에멀젼은, 젤라틴 및 EMG-20 또는 젤라틴 및 솔루톨® HS15를 중량비 1:1로 배합하여 제조하였다. 블랭크 나노에멀젼의 세포 억제 활성, 30μM의 DMSO-커큐민 혼합물, 0.030μM의 DMSO-커큐민 혼합물 및 0.03μM의 커큐민 나노에멀젼을 흑색종 암 세포주와 접촉시켰다. Malme-3M 세포를 60 내지 80% 컨플루언시로 성장시키고, 상기 언급된 커큐민 제형에 노출시키고, MTS 분석 R을 사용하여 72시간 후 세포 컨플루언시를 시험하였다. 도 11을 참조하면, 30μM 농도의 DMSO 중의 커큐민은 흑색종 암 세포 증식을 억제하지만, DMSO 중의 커큐민의 농도가 0.03μM로 감소하는 경우, 흑색종 암 세포에 대한 효능을 상실한다. 반대로, 커큐민 나노에멀젼은 0.03μM의 농도에서 흑색종 암 세포에 대한 억제 활성을 보유한다. 이러한 결과는 도 22의 표로도 요약된다. SANE 시스템 중에 캡슐화된 커큐민은 동일한 농도에서의 DMSO-커큐민 제제에 비해 1000배 이하로 더 높은 흑색종 세포 성장 억제를 보여주었다.
실시예 4: 5- 플루오로우라실(5-FU)을 포함하는 SANE 조성물
5-플루오로우라실의 나노에멀젼은, 쿠마린 대신 활성 성분 5-FU, 어유 친유성 성분, 물 친수성 성분 및 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르를 포함하는 계면활성제(예를 들면, 솔루톨® HS15)를 사용하여 실시예 2의 방법에 따라 제조하였다. 활성 성분 5-FU를 친유성 성분에 용해시켰다: 5-FU 0.065g을 칭량하고 어유 1g과 혼합하였다. 5-FU와 어유의 혼합물을 에톡시화 비이온성 계면활성제, 솔루톨® HS15(12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르) 5g(10중량%)과 배합하고, 혼합물을 가열하고, 2 성분이 시각적으로 균질한 혼합물을 형성할 때까지 자석 교반기를 이용하여 5분 동안 교반시켰으며, 이때의 온도는 50 내지 60℃였다. 이어서, 지속적인 가열과 함께 혼합물을 교반시키면서 증류수를 가하였다(상기 에멀젼의 총 용적=50㎖). 이 스테이지에서, O/W 에멀젼을 형성하였다. 가열하는 동안, 시스템의 PIT(또는 HLB 온도)(65 내지 70℃, 상 전환 구역)에 도달하였을 때, 계면활성제는 유 상 및 수 상과 평형 상태를 이루었다. 가열 및 교반은 PIT 초과 80℃ 이하까지 지속하였다. 이 온도에서, 시스템은 W/O 에멀젼으로 전환하였다. 이 스테이지에 도달하면, 가열 및 교반을 멈추었다. 상기 에멀젼을 실온에서 냉각시켜 O/W 에멀젼을 수득하였다. 상기 에멀젼을 PIT 미만의 온도 25 내지 30℃에서 냉각시켜 동력학적으로 안정한 O/W 에멀젼을 수득하였다.
친유성 성분 중에 5-FU/어유, 솔루톨® HS15 계면활성제 및 물을 포함하는 2가지 농도의 5-FU 나노에멀젼을, 동적 레이저 광 산란 입자 크기 분석에 의해 측정했을 때, 약 19nm의 평균 입자 크기로 제조하였다. 도 12A는 19.9nm의 평균 액적 크기 및 4.94nm의 크기 분포 피크 너비 및 0.052의 PDI를 갖는 2.5mM의 5-FU SANE 조성물의 입자 크기 분포를 나타낸다; 도 12B는 19.5nm의 평균 액적 크기 및 4.94nm의 크기 분포 피크 너비 및 0.025의 PDI를 갖는 10nM의 5-FU SANE 조성물의 입자 크기 분포를 나타낸다. 5-FU 나노에멀젼은 투명한 것으로 나타나고 실온에서 2달 동안이나 그대로 유지된다. 2.5mM 및 10mM 농도에서의 5-FU SANE 제형에 대해 측정한 입자 크기 분포는 각각, 5FU 농도가 4배 상이함에도 불구하고 거의 동일한 입자 크기와 균질성을 예시하였다. 5FU SANE 조성물의 TEM 이미지는 5FU와 DMSO의 혼합물에서 관찰되는 크고 불규칙한 입자 크기와 비교하여 비교적 균일하고 균질한 형태를 나타냈다.
5-FU 나노에멀젼의 시험관내 활성을 세포증식 분석(MTS Assay)을 사용하여 3개의 암 세포주(CCL-221, Malme-3M 및 CCL-2)에 대해 측정하였다. MTS 분석은 테트라졸륨 화합물(MTS)를 사용하고, 전자 커플링제(PES)는 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)(피츠버그, 펜실베니아주)로부터 구입하였다. 테트라졸륨 화합물(MTS)은 대사 세포 중에서 탈수소효소에 의해 착색된 포르마잔 생성물로 생리감소(bioreduced)될 수 있다. 포르마잔은 수용성 화합물이고 배양 배지에 용해될 수 있고, 490nm에서 흡수에 의해 측정된 포르마잔 생성물의 양은 배양 중 살아있는 세포 수에 직접적으로 비례하였다.
MTS 분석의 수행을 위해, 각각의 암 세포주(CCL-221, Malme-3M 및 CCL-2) 대략 4000개의 세포/웰을 세고, 100㎕의 세포 배양 배지를 96 웰 플레이트에 배치하였다. 5시간 동안의 배양 후, 세포를 웰의 바닥에 부착하고, 이어서 희석된 나노에멀젼을 가하고, 48시간 동안 배양하였다. 후속적으로, 배지를 흡인 제거하고, 100㎕의 새로운 페놀 비함유 세포 배양 배지를 피펫팅하고, 20㎕의 MTS 시약을 각각의 웰에 가하였다. 플레이트를 습한, 5%의 CO2 대기하에 37℃에서 2시간 동안 배양하고, 96-웰 플레이트 리더를 사용하여 490nm에서의 흡광도를 측정하였다. 본 연구에서 제조된 5-FU 나노에멀젼은 20nm의 평균 입자 크기를 가졌다.
도 13A는 결장암 세포주(CCL-221)의 세포 증식시 5-FU 나노에멀젼의 효과를 나타내는 그래프이다. 비-나노에멀젼 5-FU와 비교하여, 5-FU 나노에멀젼은 24μM(-35%, p<0.001) 및 12μM(-25%, p=0.011)에서 CCL-221의 세포 증식을 방지했다. 모든 그룹에 대해, N=9이고 에러 바는 SEM으로 나타냈다. 도 13B는 흑색종 암 세포 주(Malme-3M)의 세포 증식시 5-FU 나노에멀젼의 효과를 나타내는 그래프이다. 비-나노에멀젼 5-FU와 비교하여, 5-FU 나노에멀젼은 24μM(p<0.001)에서 Malme-3M의 세포 증식을 24% 이하로 방지하였다. 모든 그룹에 대해, N=9이고 에러 바는 SEM으로 나타냈다. 도 13C는 자궁경부암 세포 주(CCL-2)의 세포 증식시 5-FU 나노에멀젼의 효과를 나타내는 그래프이다. 모든 그룹에 대해, N=9이고 에러 바는 SEM으로 나타냈다.
흑색종 암 세포(Malme-3M) 및 결장암 세포(CCL-221)를 10mM의 5-FU 나노에멀젼의 적합한 희석액으로 처리하고, 5-FU 나노에멀젼의 효능을 96μM, 48μM, 24μM 및 12μM의 비-캡슐화 5-FU와 비교하였다. 5-FU 나노에멀젼은 비-캡슐화 5-FU와 비교하여, 24μM(-35%, p<0.001) 및 12μM(-25%, p=0.011)에서 CCL-221의 세포 증식을 방지하는데 보다 나은 효능을 갖는 것으로 발견되었다(도 13A). 추가적으로, Malme-3M 세포 증식은 24μM(p<0.001)에서 5-FU 나노에멀젼에 의해 24%까지 효과적으로 억제(도 13B)된 반면, 비-캡슐화 5-FU(즉, 나노에멀젼으로 제형화되지 않은 5-FU)는 동일한 농도에서 효과적이지 않았다. 자궁 경부암(CCL-2) 세포주에 있어서, 5-FU 나노에멀젼은 비-캡슐화 5-FU와 동일한 트렌드로 수행하였다(도 13C).
세포 배양 실험은, 5-FU 나노에멀젼이 나노에멀젼에 혼입되지 않은 5-FU보다 낮은 농도에서 흑색종 암 세포(Malme-3M) 및 결장암 세포(CCL-221)에 대해 증가된 효능을 제공한다는 것을 입증하였다. 결과는, 5-FU 나노에멀젼이 Malme-3M 및 CCL-221 암 세포주 모두에 대해 5-FU의 효능을 향상시키는 5-FU 전달 비히클을 제공할 수 있다. 이는 나노에멀젼이 없이 통상적인 투여에 효과적인 5-FU의 투여량이 나노에멀젼 제형으로서 투여되는 경우 감소될 수 있다는 것을 제안한다. 이는 특히, 낮은 수준의 화학요법제를 사용하는 것이 일반적으로 더 안전하고, 매우 적은 이상 부작용과 연관되기 때문에 환자에게 유리하다. 나노에멀젼이 Malme-3M 및 CCL-221 암 세포주 둘 다에서 5-FU의 효능을 효과적으로 향상시키는 것으로 밝혀졌지만, 5-FU가 CCL-2 암 세포에 대한 나노에멀젼으로서 전달되는 경우 덜 향상되거나 또는 향상되지 않은 효과가 관찰되었다. 이는 특정 암 세포주에 대한 약물 특이성에 인한 것일 수 있다. 에멀젼의 물리화학적 특성(예를 들면, 안정성 및 방출 특성)은 에멀젼이 함유하는 유화된 액적의 크기에 크게 좌우될 수 있다.
도 22는 Malme 흑색종 세포, CCL-4 결장암 세포, HTB-20 세포, MCF-7 세포, PL-45 췌장 세포 및/또는 헬라 자궁 세포(HeLa Uterine Cells)에 대한 타목시펜, 5-FU 및 커큐민을 포함하는 SANE 조성물의 시험관내 효과를 요약하는 표이다.
이 연구는 활성 성분 5-FU를 포함하는 SANE 조성물이 나노에멀젼으로 제형화되지 않은 5-FU보다 흑색종 암 세포(Malme-3M) 및 결장암 세포(CCL-221)에 대해 적은 용량으로 더 높은 효능을 갖는다는 것을 지시한다. 이러한 결과는 5-FU SANE 조성물이, SANE 조성물이 아닌 5-FU 제형에 일반적으로 요구되는 것보다 적은 치료학적으로 유효한 용량으로 제형화될 수 있다는 것을 지시한다. 따라서, 적은 치료학적으로 유효한 용량으로 화학요법 약물을 포함하는 SANE 조성물은, SANE 조성물 이외의 동일한 화학요법 약물 제형보다 더 안전하고, 극히 적은 이상 부작용을 수반할 수 있다.
실시예 5: 다카바진을 포함하는 SANE 조성물
본 실시예는 20nm 이하의 입자 크기를 갖는 지용성 항-흑색종 약물 다카바진을 캡슐화하는 SANE 조성물의 형성을 기재한다. DAC(10mM) 0.091g을 어유 1g과 각각 혼합하고, 이어서 에톡시화 비이온성 계면활성제, 솔루톨® HS15(12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르)를 가하여 생체내 적은 독성을 갖는 세포독성 항신생물 암 약물 다카바진(즉, 5-(3,3-디메틸-1-트리아제닐)이미다졸-4-카복스아미드, CAS 4342-03-4)를 제조하였다. 생성된 혼합물을 가열하고, 2 성분이 시각적으로 균질한 혼합물을 형성할 때까지 자석 교반기를 이용하여 5분 동안 교반시켰으며, 이 때의 온도는 50 내지 60℃이어야 한다.
이어서, 혼합물을 가열 및 교반시키면서, 증류수를 상기 혼합물에 가하였다(상기 에멀젼의 총 용적=50㎖). 이 스테이지에서, O/W 에멀젼을 형성하였다. 가열하는 동안, 시스템의 PIT(또는 HLB 온도)(65 내지 70℃, 상 전환 구역)에 도달했을 때, 계면활성제는 유 상 및 수 상과 평형 상태를 이루었다. 가열 및 교반은 PIT 초과 80℃ 이하까지 계속하였다. 이 온도에서, 상기 시스템은 W/O 에멀젼으로 전환하였다. 이 스테이지에 도달했을 때, 가열 및 교반을 멈추었다. 상기 에멀젼을 실온에서 냉각시켜 O/W 나노에멀젼을 수득하였다. 상기 나노에멀젼은 PIT 미만의 온도 25 내지 30℃에서 냉각시켜 동력학적으로 안정한 O/W 디카바진 나노에멀젼을 수득하여야 한다. 생성된 다카바진 나노에멀젼은 20.13nm의 평균 어유 액적 크기 및 약 6.96nm의 액적 크기 분포 너비 및 0.089의 PDI를 가졌다(도 14). 이 과정을 어유 대신 비슷한 양의 쌀겨 오일을 사용하여 반복한 경우, 안정한 나노에멀젼이 형성되지 않았다.
다카바진-어유-솔루톨® HS15 나노에멀젼의 시험관내 활성을 10mM DAC 나노에멀젼의 적당한 희석액으로 처리한 결장암 세포(CCL-221) 및 흑색종 암 세포(Malme-3M)에 대하여 시험하고, DAC 나노에멀젼의 효능은 96μM, 48μM, 24μM 및 12μM의 5-FU(나노에멀젼으로 제형화되지 않음)와 비교하였다. 비교를 위해, DMSO 중의 5% 다카바진의 혼합물의 활성 또한 대조군으로서 시험하였다. "나노블랭크" 데이터는 어유 1g, 솔루톨® HS15 5g 및 물 50㎖ 이하의 혼합물로부터 수득하였다. 결과는 도 15A(결장암 세포주 CCL-221의 세포 증식시 DTIC 나노에멀젼의 효과) 및 도 15B(피부암 세포주 Malme-3M의 세포 증식시 DTIC 나노에멀젼의 효과)에 나타내었다. DAC 나노에멀젼은 48μM에서 CCL-221의 세포 증식을 방지하는 향상된 효능을 갖는 것으로 발견되었다.
실시예 6: 파클리탁셀을 포함하는 SANE 조성물
향상된 수 용해성, 생체이용률 및 효능을 갖는, 파클리탁셀을 포함하는 약제학적으로 허용되는 나노에멀젼 제형을 제조하였다. 파클리탁셀의 나노에멀젼 제형은, 파클리탁셀이 계면활성제와의 배합 전에 친유성 성분 중에 용해되는 것을 제외하고는 상기 도 1에 대해 기재된 방법에 따라 제조하였다. 생성된 파클리탁셀 나노에멀젼은 약 20nm의 평균 입자 크기를 가졌다. 이러한 제형은, 예를 들면, 암 화학요법(예를 들면, 폐암, 난소암, 유방암 및 두경부암 환자를 치료하기 위해)에 사용되는 유사분열 억제제로서 유용할 수 있다.
결장암 및 췌장암의 증식율에 대한 자가 조립된 나노에멀젼의 효과를 연구하는데 추가로 사용되는, 계면활성제 및 오일의 자가-조립 나노에멀젼(SANE) 중의 파클리탁셀을 제형화하였다. 파클리탁셀은 시그마(카탈로그 넘버: 417017)사로부터 구입하였다. 쌀겨 오일 및 솔루톨® HS15를 각각 셀렉트 오리진스사 및 바스프사로부터 구입하였다. 사용된 세포주는 ATCC로부터 구입하였다. 모든 기타 시약들은 분석용 품질 이상이었고, 상업적 출처로부터 수득하였다.
특정량의 오일을 용기 내에서 칭량하였다. 혼합물을, 파클리탁셀이 시각적으로 오일 중에 용해되는것으로 나타날 때까지 약 50 내지 60℃에서 자석 교반기를 이용하여 5분 동안 가열 및 교반시켰다. 특정량의 에톡시화 비이온성 계면활성제를 가하였다. PIT(HLB 온도로도 지칭됨)는 계면활성제의 HLB 값(친수-친유 밸런스)을 기준으로 하여 확인되었다. PIT는 HLB 값이 증가함에 따라 증가한다. 3 성분이 균질한 혼합물을 형성할 때까지 혼합물을 약 50 내지 60℃에서 5분 동안 다시 가열 및 교반시켰다. 약 60℃에서 혼합물을 교반시키면서 증류수(총 용적=50㎖)를 가하였다. 이 스테이지에서 혼합물은 O/W 에멀젼을 형성하였다. 가열하는 동안, 시스템의 PIT(또는 HLB 온도)(65 내지 70℃, 상 전환 구역)에 도달했을 때, 계면활성제는 유 상 및 수 상과 평형 상태를 이루었다. 가열 및 교반은 PIT 초과 80℃ 이하까지 계속하였다. 이 온도에서, 상기 시스템은 W/O 에멀젼으로 전환하였다. 상기 에멀젼을 실온으로 냉각시켜 파클리탁셀을 포함하는 O/W 나노에멀젼을 수득하였다. 도 16A는 각각 약 20nm의 평균 오일 액적 크기를 갖는, 3개의 별개의 파클리탁셀 나노에멀젼의 입자 크기 분포를 나타낸다. 도 16B는 약 1㎛(1,000nm) 이상의 평균 입자 크기를 갖는, 파클리탁셀과 DMSO의 혼합물 3개에 대한 입자 크기 분포를 나타낸다.
파클리탁셀 나노에멀젼의 시험관내 활성은 4개의 인간 암 세포주 PL-45(도 16C), CCL-221(도 16E) 및 P10.05(도 16G)에 대해 시험하였고, (a) 이 제형이 각종 암 세포주에서의 세포 증식을 억제하는데 있어 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 같이 유효하고, (b) 유방암의 화학요법 치료에 통상적으로 사용되는 파클리탁셀의 나노에멀젼 제형이 췌장암 세포주에서의 세포 증식의 현저한 억제를 입증한다는 것을 지시하였다. 비교를 위해, 비슷한 블랭크 나노에멀젼(즉, 임의의 활성 성분 없는 동일한 SANE 조성물) 및 DMSO와 파클리탁셀의 혼합물의 억제 활성을 PL-45(도 16D), CCL-221(도 16F) 및 P10.05(도 16H) 세포주의 억제에 대해 시험하였다. 파클리탁셀 SANE 조성물은 모든 3개의 세포주에 대해 0.01 내지 0.03μM 농도에서 DMSO 중의 파클리탁셀의 혼합물보다 더 높은 억제 효과를 나타내었다. 추가로, 0.003μM의 파클리탁셀 용량을 갖는 SANE 조성물은 DMSO 중의 파클리탁셀의 동일한 용량보다 PL-45 및 P10.05 세포에 대해 보다 효과적이었다(도 16C, 도 16E 및 도 16G).
도 16C는 쌀겨 오일 및 솔루톨® HS15로 이루어진 나노에멀젼 중의 파클리탁셀 및 DMSO 중의 파클리탁셀의, 48시간의 치료 후 PL-45 세포에 대한 용량-의존성 항암 활성을 나타내는 그래프이다. 상기 그래프는, DMSO 중의 파클리탁셀 및 나노에멀젼 중의 파클리탁셀로 각각 치료되는 경우 44% 및 40%의 성장 억제를 지시한다. 파클리탁셀의 현탁액과 비교하여, 파클리탁셀의 나노에멀젼은 세포 증식에 대해 비슷한 효과를 가졌다. 에러 바는 이중으로 수행된 실험을 위한 평균의 표준 에러를 나타낸다. 따라서, 이는 (a) 이러한 제형이 디메틸 설폭사이드(DMSO) 가용화제로서 유효하고(이의 독성 때문에 인간에게는 사용될 수 없다), (b) 유방암 및 난소암의 화학요법 치료에 통상적으로 사용되는 파클리탁셀의 나노에멀젼 제형이 췌장암 세포주에서의 세포 증식의 현저한 억제를 입증한다는 것을 지시하였다. 도 16D는 파클리탁셀의 나노에멀젼 제조에 대해 대조군으로 빈 나노에멀젼과 비교하며, 이는 0.3uM 파클리탁셀의 세포 억제 활성이 나노에멀젼 자체가 아니라 나노에멀젼 중의 약물로부터 유래되고, 세포의 증가된 성장 억제가 빈 나노에멀젼이 아니라 나노에멀젼 중에 캡슐화된 파클리탁셀의 활성으로 인한 것이라는 것을 지시한다.
도 16E는 처리 48시간 후, 쌀겨 오일 및 솔루톨® HS15로 이루어진 나노에멀젼 중의 파클리탁셀 및 디메틸 설폭사이드(DMSO) 중의 파클리탁셀의, CCL-221에 대한 용량-의존성 항암 활성을 입증한다. 그래프는 DMSO 중의 파클리탁셀 및 나노에멀젼 중의 파클리탁셀 각각으로 처리된 경우 60% 및 52%의 성장 억제를 지시한다. 파클리탁셀의 현탁액과 비교하여, 나노-파클리탁셀은 세포 증식에 대해 비슷한 효과를 가졌다. 에러 바는 이중으로 실시된 실험에 대한 평균의 표준 에러를 나타낸다. 따라서, 이는 (a) 이 제형이, 독성 때문에 사람에게 사용되지 못하는 가용화제, DMSO와 같이 유효하고, (b) 유방암 및 난소암의 화학요법 치료에 통상적으로 사용되는 파클리탁셀의 나노에멀젼 제형이 결장암 세포주에서의 세포 증식의 현저한 억제를 입증한다는 것을 지시한다. 도 16F는 파클리탁셀의 나노에멀젼 제제에 대해 대조군으로 빈 나노에멀젼과 비교하며, 이는 0.3uM 파클리탁셀의 세포 억제 활성이 나노에멀젼 자체가 아니라 나노에에멀젼 중의 약물로부터 유래되고 세포의 증가된 성장 억제가 빈 나노에멀젼이 아니라 나노에멀젼 중에 캡슐화된 파클리탁셀의 활성으로 인한 것이라는 것을 지시한다.
도 16G는 처리 48시간 후, 쌀겨 오일 및 솔루톨® HS15로 이루어진 나노에멀젼 중의 파클리탁셀 및 DMSO 중의 파클리탁셀의, P10.05 세포에 대한 용량-의존성 항암 활성을 입증한다. 그래프는 DMSO 중의 파클리탁셀 및 나노에멀젼 중의 파클리탁셀 각각으로 처리했을 경우 60% 및 52%의 성장 억제를 지시한다. 파클리탁셀의 현탁액과 비교하여, 나노파클리탁셀은 세포 증식에 대해 비슷한 효과를 가졌다. 에러 바는 이중으로 실시된 실험에 대한 평균의 표준 에러를 나타낸다. 따라서, 이는 (a) 이 제형이 이의 독성 때문에 사람에게 사용할 수 없는 가용화제, DMSO와 같이 유효하고, (b) 유방암 및 난소암의 화학요법 치료에 통상적으로 사용되는 파클리탁셀의 나노에멀젼 제형이 췌장암 세포주에서의 세포 증식의 현저한 억제를 입증한다는 것을 지시한다. 도 16H는 파클리탁셀의 나노에멀젼 제제에 대한 대조군으로 빈 나노에멀젼과 비교하며, 이는 0.3uM 파클리탁셀의 세포 억제 활성이 나노에멀젼 자체가 아니라 나노에멀젼 중의 약물로부터 유래되고 세포의 증가된 성장 억제가 빈 나노에멀젼이 아니라 나노에멀젼 중에 캡슐화된 파클리탁셀의 활성으로 인한 것이라는 것을 지시한다.
또한, 0.01μM의 파클리탁셀을 갖는 저용량의 파클리탁셀 SANE 조성물은 동일한 용량의 DMSO 중의 파크리탁셀과 비교하여 P10.05 세포의 더 큰 억제를 나타내는 반면(도 16G), 0.1μM의 파클리탁셀 수준을 갖는 고용량의 파클리탁셀 SANE 조성물은 동일한 용량의 DMSO 중의 파크리탁셀과 비교하여 CCL-221 세포의 더 큰 억제를 나타냈다(도 16E). 결과적으로, 각종 암으로부터의 확립된 세포주를 사용하였을 때, 20nm의 입자 크기를 갖는 파클리탁셀의 수용성 나노에멀젼 제형이 세포 증식을 억제하는데 매우 효과적이었다.
실시예 7: 토코트리에놀을 포함하는 SANE 조성물
활성 성분으로서 쿠마린 대신에 토코트리에놀을 사용하는 것을 제외하고, 친유성 성분으로서 쌀겨 오일과 계면활성제로서 솔루톨® HS15(매크로골 하이드록시스테아레이트)를 사용하여 실시예 2의 방법에 따라 토코트리에놀을 포함하는 나노에멀젼을 제조하였다. 토코트리에놀(제조원: 이스트만 케미칼 컴파니(Eastman Chemical Co.))을 고밀도 오일 형태로 사용하였다. 토코페롤과 함께 비타민 E의 성분을 형성한다. 천연 토코트리에놀은 4개의 상이한 형태 또는 이성체, 일명 알파-, 베타-, 감마-, 델타-토코트리에놀로 존재하고, 상이한 수의 메틸 그룹을 크로만올 환 상에 포함한다. 간단하게, 토코트리에놀(5mg)을 쌀겨 오일(1g) 중에 가열하면서 용해시켜 친유성 성분을 형성하고, 이어서 솔루톨® HS15 계면활성제(5g)와 배합하여 제1 조성물을 형성하였다. 상기 제1 조성물을 물(44㎖)로 희석시켜 O/W 매크로에멀젼을 형성시키고, 계면활성제의 PIT 초과의 온도로 가열시켜 W/O 에멀젼을 형성하였다. 상기 W/O 에멀젼을 실온으로 급속 냉각시켜 토코트리에놀 나노에멀젼을 형성하였다. 또한 계면활성제 대 쌀겨 오일의 초기 중량비가 1:1 내지 5:1인 기타 토코트리에놀 나노에멀젼을 형성하였으며, 5:1의 S/O 중량비가 안정한 제형을 제공한다. 토코트리에놀 나노에멀젼은, 예를 들면, 고콜레스테롤을 처리하는데 유용할 수 있다. 계면활성제로서 솔루톨® HS15 대신 비슷한 양의 에톡시화 모노글리세라이드 EMG-20을 사용하여 상기 방법을 반복한 경우, 안정한 나노에멀젼을 형성하지 않았다. 비교 시험을 위해, DMSO 50㎖와 토코트리에놀(5mg)의 혼합물 또한 제형화하였다.
도 17A는 토코트리에놀을 포함하는 하기 3개의 SANE 조성물에 대해 측정한 입자 크기 분포의 그래프이다: 토코트리에놀 5mg, 쌀겨 오일 0.5g, 솔루톨® HS15 계면활성제 2.5g 및 탈이온수 22㎖. 이러한 3개의 토코트리에놀 SANE 조성물 중의 Z-평균 입자 크기는 65.16nm이고, 39.31nm의 피크 너비 및 0.190의 PDI를 갖는다. 도 17B는 DMSO(㎖) 중의 토코트리에놀 1mg의 혼합물에 대한 입자 크기 분포의 그래프이다. 이러한 3개의 혼합물의 Z-평균 입자 크기는 23.89nm이고, 8.04nm의 피크 너비 및 0.102의 PDI를 갖는다. 도 17C는 물 10㎖ 중의 토코트리에놀 5mg의 혼합물 3개에 대한 입자 크기 분포의 그래프이다. 이러한 3개의 혼합물의 Z-평균 입자 크기는 338.6nm이고, 146.9nm의 피크 너비 및 0.235의 PDI를 갖는다. 도 17A에 대한 데이터를 수득하기 위해 측정한 토코트리에놀 SANE 조성물은 도 17B에서 측정된 DMSO-토코트리에놀 조성물 또는 도 17C에서 측정된 수-토코트리에놀 조성물보다 작은 평균 입자 크기를 나타냈다.
HepG 세포에서 콜레스테롤을 억제하는 토코트리에놀 나노에멀젼의 효과를 HepG 세포상의 DMSO-토코트리에놀 혼합물의 효과와 비교하였다. HepG 세포주(Atcc.org로부터 구입)는 콜레스테롤 합성과 관련된 HMGCoA 리덕타제를 발현한다. HepG 세포를 DMSO 토코트리에놀, 나노 토코트리에놀 및 처리하지 않은(NT)의 제형들에 노출시켰다(각각의 제형에 10ul 가함). 세포를 임의의 성장 인자 또는 인슐린에 노출시키지 않았다. 세포를 (제형들과 함께) 72시간 동안 실험 조건으로 성장시키고, 그 다음 72시간은 새로운 배지로 제형 없이 성장시키고, 이어서 콜레스테롤 분석을 위해 RIPA 완충액으로 용해시켰다. 데이터는 UV-VIS 측정으로부터의 상대 흡수 단위로 하기 표 3 및 도 18에 나타내었다. HepG 세포를 토코트리에놀에 노출시켰을 때, DMSO-토코트리에놀 혼합물로의 억제율 0%에 비해 47%의 콜레스테롤 억제가 관찰되었다. 하기 표에서, 0.33 UV-VIS 흡수 단위의 판독은 88mg 콜레스테롤/dl; 0.17의 판독은 45mg 콜레스테롤/dl에 해당한다.
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실시예 8: 루테인을 포함하는 SANE 조성물
활성 성분으로서 쿠마린 대신에 루테인 에스테르를 사용하는 것을 제외하고는, 친유성 성분으로서 대두유 및 계면활성제로서 C20 에톡시화 모노글리세라이드 EMG-20을 사용하여 실시예 2의 방법에 따라 루테인 에스테르(Xangold; Cognis, Cincinnati, OH)를 포함하는 나노에멀젼을 제조하였다. 간단하게, 루테인 에스테르(7.57mg)를 가열하면서 대두유(1g) 중에 용해시켜 친유성 성분을 형성하고, 이어서 C20 에톡시화 모노글리세라이드(EMG-20) 계면활성제(5g)와 배합하여 제1 조성물을 형성하였다. 상기 제1 조성물을 물(44㎖)로 희석시켜 O/W 매크로에멀젼을 형성시키고, 계면활성제의 PIT 초과의 온도로 가열시켜 W/O 에멀젼을 형성하였다. 상기 W/O 에멀젼을 실온으로 급속 냉각시켜 루테인 나노에멀젼을 형성하였다. 안정한 루테인 나노에멀젼(예를 들면, 2일 후)은 EMG20 계면활성제 대 대두유의 초기 중량비가 5:1 내지 6:1인 제형을 사용하여 도 1에 대해 논의된 방법에 의해 형성하였다. 친유성 성분으로서 대두유 대신 비슷한 양의 쌀겨 오일을 사용하여 상기 방법을 반복한 경우, 최대 온도 약 70℃로 가열된, 계면활성제 대 오일의 비를 3:1, 4:1, 5:1 또는 6:1로 갖는 제형으로부터 안정한 나노에멀젼을 형성하지 않았다. 이는, 대두유에서 다불포화 지방이 더 높다는 것(쌀겨 오일에서 약 39%에 비해 대두유에서 약 58%) 및/또는 이중결합을 갖는 산화된 카로티노이드인 루테인의 구조로 인한 것일 수 있다. 루테인 나노에멀젼은 친유성 성분으로서 대두유 및 루테인을 포함하고, 계면활성제와 오일 사이의 초기 중량비를 약 5:1로 하여, 물 또는 기타 수성 친수성 성분 및 에톡시화 모노글리세라이드 계면활성제를 포함할 수 있다.
(비교) 실시예 9: siRNA 를 포함하는 SANE 조성물
친유성 성분 중의 젤라틴(1gm)(동물상 젤라틴, 제조원: 시그마) 및 siRNA(siGlo, 라밈 A/C의 형광 형태), 에톡시화 모노글리세라이드(EMG-20)계면활성제(1gm) 및 증류수/탈이온수 48㎖의 제형으로부터 도 1에 기재된 방법에 따라 일련의 siRNA 나노에멀젼을 제조하였다. siRNA는 다마콘(Dharmacon)(2650 크레센트 드라이브, #100 라파예테, 콜로라도주)으로 불리는 회사로부터 입수하였다(예를 들면, Thermo Fisher Scientific Catalog Number D-001620-02-05; target accession number NM_170708(Human)). 본 실시예에 사용되는 siRNA는 다마콘사로부터 입수하였고, 이는 siGLO Lamin A/C Control siRNA(Human) Cat#D-001620-02-05이다. 나노에멀젼은 젤라틴 1g을 칭량하고 지속적으로 교반시키면서 용융시켜 제조되었다. 이어서, 저열(low heat)로 혼합물을 지속적으로 혼합하면서 EMG 1gm을 가하고, 지속적으로 혼합하면서 20μM의 대조군 siRNA의 50㎕를 혼합물에 가하였다. 저열로 지속적으로 혼합하면서 증류수 48㎖를 가하여 총 용적을 50㎖로 만들었다. 에멀젼을 20분 동안 교반시켰다.
생성된 나노에멀젼 중에 실온에서 형성된 제1 siRNA/젤라틴 입자의 입자 크기는, 약 4.1nm의 피크 너비와 0.117의 PDI와 함께 12.1nm의 평균 크기를 가졌다(도 19A). 일련의 3개의 siRNA 나노에멀젼을 -4℃ 또는 -20℃의 온도에서 저장하고, 이어서 해동시키고, 해동된 나노에멀젼 중의 각각의 siRNA/젤라틴의 입자 크기는 약 3.7nm의 피크 너비와 0.211의 PDI와 함께 12.1nm의 평균 크기로 측정되었다(도 19B). 도 19B는 siRNA와 함께 젤라틴 1g, EMG-20 계면활성제 1g 및 물 48㎖을 각각 함유하는 3개의 시험 샘플의 입자 크기 분포를 나타낸다. 그러나, -4℃(도 19B) 및 -20℃에서 저장되고, 3시간에 걸쳐 실온에서 해동되거나 50℃로 가열하였을 때, siRNA 나노에멀젼들은 안정하게 유지된다.
또 다른 일련의 siRNA 나노에멀젼은, 친유성 성분 중의 젤라틴(1gm) 및 siRNA, 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 예를 들면, 솔루톨® HS15 계면활성제(1gm) 및 증류수/탈이온수 48㎖의 제형으로부터 도 1에 대해 기재된 방법에 따라 제조하였다. 생성된 나노에멀젼 중에 실온에서 형성된 제1 siRNA/젤라틴 입자의 입자 크기는, 약 3.6nm의 피크 너비와 0.088의 PDI와 함께 12.8nm의 평균 크기를 가졌다(도 19C). 솔루톨® HS15를 사용하는 siRNA SANE 조성물은 계면활성제로서 EMG-20를 사용하는 siRNA SANE 조성물보다 더 안정하였다.
그러나, siRNA 나노에멀젼은 헬라 세포에 의한 siRNA의 흡수를 야기하지 않았다. 간단하게, siRNA 5mmol을 PBS 250㎕ 중에 희석시켜 20μM의 스톡(stock)을 제조하였다. siRNA SANE 제조는 상기 기재된 바와 같이 사용되고, 20μM의 siRNA 100㎕를 나노 제형(젤라틴계 제형) 25㎖에 가하였다. 하기 siRNA SANE 조성물 트렌스펙션 프로토콜은 세포 평판 배양(Cell Plating)을 위해 수행되었다(헬라 세포는 하기 실험에 사용되었다):
1. 트립신 처리하고 세포를 센다.
2. DharmaFECT 1로 트렌스펙션하기 위해 항생제-비함유 배지에서 세포를 5.0x104세포/㎖의 평판 배양 농도로 희석시킨다.
3. 세포 100㎕를 96-웰 플레이트의 각각의 웰로 플레이팅한다.
4. 37℃에서 5%의 CO2로 밤새 세포를 배양한다.
하기 프로토콜은 트렌스펙션을 위해 수행되었다(siRNA 100nM)(3중으로 실험하는 것이 권장된다. 모든 계산은 96-웰 포맷으로 3중 샘플에 대해 나타낸다. 피펫팅 중의 손실에 대해 계산하기 위해, 모든 용적을 3.5배한다.):
1. 1X siRNA 완충액 또는 또 다른 적합한 RNase-비함유 용액 중의 2μM의 siRNA 용액을 제조한다.
2. 개별 튜브에서, 2μM의 siRNA(튜브 1) 및 DharmaFECT 1(튜브 2)를 혈청-비함유 배지로 희석시킨다. 예를 들면, 하기와 같이 제조한다:
a. 튜브 1 - 2μM의 siRNA 17.5㎕를 혈청-비함유 배지 17.5㎕에 가한다. 총 용적은 35㎕이다.
b. 튜브 2 - DharmaFECT 1 1.4㎕를 혈청-비함유 배지 33.6㎕에 가한다. 총 용적은 35㎕이다.
3. 각각의 튜브의 내용물을 아래위로 조심스럽게 피펫팅하여 부드럽게 혼합시키고 실온에서 5분 동안 배양시킨다.
4. 튜브 1의 내용물을 튜브 2에 가한다. 본 실시예에서, 총 용적은 70㎕이다. 아래위로 조심스럽게 피펫팅하여 혼합시키고 실온에서 20분 동안 배양시킨다.
5. 충분한 항생제-비함유 완전 배지를 가하여 목적하는 트렌스펙션 용적을 위해 단계 4에서 혼합한다. 본 실시예에서, 350㎕의 총 용적에 대해 280㎕를 가한다.
6. 96-웰 플레이트의 웰로부터 배양 배지를 제거하고 적합한 트렌스펙션 혼합물 100㎕를 각각의 웰에 가한다.
7. 세포를 5% CO2에서 (mRNA 분석을 위해) 24 내지 48시간 또는 (단백질 분석을 위해) 48 내지 96시간 동안 배양시킨다.
8. 세포 독성이 24시간 후에 관찰되는 경우, 트렌스펙션 배지를 완전 배지로 대체하고 배양을 계속한다. 세포 생존력은 alamarBlue®, MTT 또는 대사 활성용 기타 분석으로 측정될 수 있다.
9. 이어서 세포를 형광 현미경 하에 관찰하였다.
세포 플레이트를 제이스(Zeiss) 형광 현미경 하에 관찰하였다. 특히, 변형된 형광 RNA 이중나선은 트렌스펙션 성공의 확실한 시각적 평가를 제공한다. 형광 신호는 흡수 효율에 대한 틀림없는 표시로서 헬라 세포의 핵으로 국재화하였다.
초기 데이터는, 형광 신호가 세포의 핵으로 국재화되고 100nM의 siRNA의 농도를 사용하는 대조군에서 검출되었다고 밝혀졌다. 반대로, 나노에멀젼 중에 캡슐화된 siRNA에 대해 헬라 세포로 혼입된 동일한 강도의 형광 신호는 1nM의 농도에서 성취되었으며, 이는 비-나노에멀젼 대조군과 비교하여 나노에멀젼이 전달된 siRNA에 대해 세포 흡수가 100배 증가하는 것을 나타낸다.
후속적인 시험에서, 핵에 국재화된 형광 신호는 대조군 뿐만 아니라 나노에멀젼에 캡슐화된 siRNA를 함유하는 플레이트에서도 검출되었다. siRNA의 출발 양은 50㎖중 20μM이었다. 이는 0.4μM/㎖의 출발 농도를 제공할 것이다. 이어서, 샘플을 200배 및 400배로 희석시켰다. 따라서, 세포에 사용된 최종 농도는 1nM 및 2nM인 반면, 대조군의 출발 농도는 100nM이었다. 이 경우 형광 검출은 표현형 종말점이다. 결과는 또한 웨스턴 블롯(western blot)에 의해 확인될 수 있다. 이 실험에 사용된 siRNA는 라민A/C 단백질의 발현을 억제(knockdown)시킬 수 있다. 웨스턴 블롯은 라민A1C 항체를 사용하여 세팅될 수 있다.
도 20은 siRNA SANE 조성물과 접촉시킨 후 트렌스펙션된 헬라 세포의 형광 이미지이며, 이는 siRNA 조성물의 실질적인 양이 헬라 세포로 받아들여지지 않는 것을 나타낸다. 흡수 효율은 세포 핵에서의 형광 신호의 흡수에 의해 측정된다. siRNA 흡수가 유효한 경우, 형광 태그가 핵에서 보일 수 있다. 그러나, siRNA가 나노에멀젼을 형성하더라도, 도 20은 형광이 세포막을 따라 관찰되었다는 것을 나타내고, 이는 나노에멀젼 제형 중의 siRNA가 세포에 의해 받아들여지지 않는다는 것을 지시한다.
실시예 10: 인슐린을 포함하는 SANE 조성물
본 실시예는 약 20nm 이하의 입자 크기를 갖는 캡슐화된 단밸질, 예를 들면, 인슐린 및 알부민의 나노에멀젼의 형성을 기재한다. 인슐린은 경피적으로 전달되어, 경구 섭식 후 혈당의 증가를 예방하는 효능을 가질 수 있다. 수용성 단백질, 예를 들면 인슐린을 대략 20nm 직경의 입자 크기를 갖는 SANE 조성물로 캡슐화하였다. SANE 조성물은 폴리소르베이트 80(트윈® 80으로도 공지됨)과 소르비탄 모노올레이트(스판 80)의 (1:1) 배합물, 대두유 및 물을 사용하여 제조하였고, 글루코스의 경구 섭식 후 혈당 수준을 감소시키기 위해 경피적으로 햄스터의 혈류로 전달시켰다. 이러한 인슐린 SANE 시스템은 또한 수용성 호르몬 인슐린을 경피적으로 전달될 수 있어 햄스터에 글루코스 부하용량의 섭식 후 혈당의 상승을 막는 충분한 효능을 갖는다(도 21). 도 21은 글루코스 섭식 후 수용성 단백질 호르몬 인슐린의 경피적 SANE 전달 후 햄스터 내의 혈당 수준을 나타내는 그래프이다. 특히, 낮은 혈당 수준이 글루코스 섭식 바로 직후 SANE-함유 인슐린의 경피적 전달 후 관찰되었다.
실시예 11: 로바스타틴을 포함하는 SANE 조성물
본 실시예는 시험관내 세포 배양 시스템에서의 효능을 눈에 띄게 증가시키는 나노에멀젼을 형성하기 위한, 지용성 활성 제제를 함유하는 SANE 조성물의 형성을 기재한다. 따라서, 지용성 활성 제제는 안정한 수 분산액으로서 제형화될 수 있다. 생성된 생리활성 SANE 조성물은 활성 제제 단독에 비해 증가된 효능을 가져, SANE 조성물 외의 치료학적으로 유효량의 활성 제제를 성취하는데 요구되는 농도보다 낮은 농도로 활성 제제를 함유하는 치료학적으로 유효한 SANE 조성물의 제제를 허용한다. 그 결과, SANE 조성물은 SANE 조성물 외의 활성 제제와 연관된 이상 부작용이 감소된 활성 제제를 전달하는 데 사용될 수 있다.
특히, 본 실시예는 활성 제제로서 지용성 콜레스테롤-저하 HMG-CoA 리덕타아제 억제제(스타틴)를 함유하는 SANE 조성물의 형성을 기재한다. 스타틴 함유 SANE 조성물은 HEP G2 세포 내에서 시험관내 HMG-CoA 리덕타아제 활성 및 콜레스테롤 축적을 감소시키는 것으로 관찰되었다.
이러한 실험의 결과는 하기 표 3 및 표 4, 및 도 23에 나타내었다. 각각의 SANE 조성물은 친수성 성분으로서 탈이온수(제조원: 밀리 큐, 베드포드, 매사추세츠주, 미국) 44㎖와 함께, 친유성 성분으로서 쌀겨 오일(제조원: 셀렉트 오리진스, 일본) 및 계면활성제로서 솔루톨® HS15(제조원: 바스프, 미국)을 함유하는 조성물의 상 전환 온도(PIT) 방법으로 제조하였다. 로바스타틴을 디메틸 설폭사이드(DMSO, 제조원: 시그마(세인트 루이스, 미주리주, 미국))에 직접 용해시켜 약물 없이 비교를 위한 나노-블랭크 제형을 형성하였다. 평균 액적 크기, 너비 및 다분산 지수는 멜버른 나노-S 장치(제조원: 멜버른 인스트루먼츠, 사우스보러, 매사추세츠주, 미국)로 측정하였다.
표 4 및 표 5, 및 도 23의 데이터를 수득하기 위해서, 하기 조성물을 제조하였다: (a) 실시예 1에서 SANE 방법에 의해 형성된, 쌀겨 오일(0.5gm), 솔루톨® HS15 계면활성제(2.5gm), 및 물(22㎖)을 갖는 블랭크 나노에멀젼; (b) 활성 성분으로서 로바스타틴 5mg으로 대체하여 실시예 2에 따라 SANE 조성물로서 제조된 조성물(a) 중의 블랭크 나노에멀젼을 제조하기 위해 사용된 조성물에 로바스타틴 5mg을 가하여 제조한 로바스타틴 나노에멀젼; 및 (c) DMSO 중의 로바스타틴의 용액(DMSO 5㎖ 중의 로바스타틴 5mg). Hep 02 세포를 갖는 세포 배양 실험은 조성물 (a), (b) 각각 10㎕ 및 조성물 (c) 5㎕를 사용하여 수행하여 동일한 약물 농도(450nM)로 만들고, 처리하지 않은(NT) 대조 실험을 수행하였다.
하기 표 4 및 표 5, 및 도 23의 데이터를 참조하면, 콜레스테롤 분석 및 HMG CoA 리덕타아제 분석을 하기와 같이 수행하였다: Hep 02 세포(ATCC, 매너서스(Manassas), 버지니아주)를 70mm 플레이트에 플레이팅하고, 60 내지 70% 컨플루언시로 성장시켰다. MEM(minimal essential medi(제조원: ATCC, 매너서스, 버지니아주), 10% FBS(오에미니 바이오 프로덕츠(Oemini bio products), 미국), 5% CO2를 37℃에서 사용하여 세포 성장 조건을 유지시켰다. 제형 10㎕에 인슐린(제조원: 시그마(세인트 루이스, 미주리주, 미국)) 2ul 가하였다. 72시간의 배양 후, 세포 용해물을 제조하고 -80℃에서 보관하였다. 세포 내 콜레스테롤 양을, 미국의 와코 케미칼스로부터 구입한 콜레스테롤 E CHOD-DOAS 방법을 사용하여 측정하였다. HMO CoA 리덕타제 활성은, 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich)(세인트 루이스, 미주리주, 미국)로부터 수득한 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 브래트포드(Bradford) 및 MTT 분석을 수행하기 위해, (a) 세포의 출발 수가 모든 상이한 실험 조건에 대해 유사하다는 것을 확인하고, (b) 상기 제형들이 세포 각각에 대해 무-독성이라는 것을 보여주기 위해 측정을 수행하였다. 브래드포드 및 MTT 분석 키트는 시그마 알드리히(세인트 루이스, 미주리주, 미국)로부터 구매하였다.
Figure pct00003
Figure pct00004
기타 양태
본 발명은 이의 상세한 설명과 관련하여 기재되었고, 상기 기재는 첨부된 특허청구범위의 범위로 제한된 발명의 범위를 설명하려는 것이지 제한하려는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 기타 측면, 이점 및 변형은 하기 특허청구범위의 범위 내에 있다.

Claims (27)

  1. 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법으로서, 상기 방법이
    a. 친유성 성분, 활성 성분, 친수성 성분 및 계면활성제를 제1 조성물로서 배합하는 단계[여기서, 상기 제1 조성물이 상기 계면 활성제의 상 전환 온도 이상에서의 상기 친유성 성분과 상기 친수성 성분 사이의 온도 의존성 상 전환을 특징으로 하고, 여기서,
    (i) 상기 제1 조성물이 상기 친유성 성분 약 5중량% 미만을 함유하고,
    (ii) 상기 제1 조성물 중의 계면활성제의 총 중량에 대한 상기 친유성 성분의 중량비(Ros)가 약 0.5 이하이며,
    (iii) 상기 제1 조성물이 100nm 이하의 평균 친유성 성분 액적 크기를 갖는 나노에멀젼을 형성하기 위해 선택된, 친유성 성분과 계면활성제 사이의 중량비를 갖고,
    (iv) 상기 활성 성분, 계면활성제 및 친유성 성분은 나노에멀젼을 형성하기 위해 선택된다];
    b. 상기 제1 조성물을, 상기 제1 조성물의 적어도 일부가 상 전환을 겪어 제2 조성물을 형성하도록 하기에 충분한 시간 동안 상기 계면활성제의 상 전환 온도 초과의 온도로 가열시키는 단계; 및
    c. 상기 제2 조성물이 상기 친유성 성분의 액적을 갖는 나노에멀젼을 형성하도록 하는 단계를 포함하는, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 조성물이 친유성 성분 약 2중량% 이하를 포함하고, 상기 제1 조성물 중의 계면활성제와 친유성 성분 사이의 중량비가 약 3:1 이상인, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 조성물의 Ros 비가 약 0.25 이하이고, 제1 조성물 중의 계면활성제와 친유성 성분 사이의 중량비가 약 3:1 이상인, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조성물이 친유성 성분 약 2중량% 이하를 포함하고, 상기 제1 조성물의 Ros 비가 약 0.25 이하인, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 성분이 비-비누화성(nonsaponifiable) 성분 약 4% 이상을 갖는 오일을 포함하고, 상기 계면활성제가 하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르이고, 상기 활성 성분이 탁산 또는 벤조피론인, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제가 C20 에톡시화 모노글리세라이드이고, 상기 제2 조성물이 나노에멀젼을 형성하도록 하여 상기 제2 조성물의 미세유동화 없이 나노에멀젼을 형성하는데 유효한 속도로 상기 제2 조성물을 냉각시킴을 포함하는, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제가 에톡시화 모노- 또는 디글리세라이드, 하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레산 에스테르, 폴리소르베이트, 인지질 및 폴리옥시에틸렌 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 성분이 대두유, 코코넛 오일, 식물유, 쌀겨 오일 및 어유로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조성물을 형성하기 전에 활성 성분을 상기 친유성 성분 중에 용해시키는 단계를 추가로 포함하는, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 성분이 벤조피론 또는 벤조피론 유도체, 폴리페놀, 피리미딘 또는 피리미딘 유사체, 이미다졸 또는 이미다졸 유사체, 탁산, 토코페롤, 토코트리에놀, 카로티노이드, 폴리누클레오타이드, 폴리펩티드, 루테인 및 인슐린 중 하나 이상을 포함하는, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 성분이 쿠마린, 커큐민, 5-플루오로우라실, 다카바진, 파클리탁셀, 비타민 E, 루테인, 스타틴 및 인슐린 중 하나 이상을 포함하는, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조성물이
    a. 쿠마린을 포함하는 활성 성분, 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제, 및 대두유, 어유, 쌀겨 오일 및 코코넛 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 오일을 포함하는 친유성 성분;
    b. 커큐민을 포함하는 활성 성분, 폴리옥시에틸렌 피마자유 계면활성제, 및 대두유, 어유, 쌀겨 오일 및 코코넛 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 오일을 포함하는 친유성 성분;
    c. 5-플루오로우라실을 포함하는 활성 성분, 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제, 및 대두유, 어유, 쌀겨 오일 및 코코넛 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 오일을 포함하는 친유성 성분;
    d. 다카바진을 포함하는 활성 성분, 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제, 및 대두유, 어유 및 코코넛 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 오일을 포함하는 친유성 성분;
    e. 파클리탁셀을 포함하는 활성 성분, 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제, 및 대두유, 어유, 쌀겨 오일 및 코코넛 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 오일을 포함하는 친유성 성분;
    f. 토코트리에놀을 포함하는 활성 성분, 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제, 및 대두유, 어유, 쌀겨 오일 및 코코넛 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 오일을 포함하는 친유성 성분;
    g. 루테인을 포함하는 활성 성분, C20 에톡시화 모노글리세라이드 계면활성제, 및 대두유, 어유 및 코코넛 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 오일을 포함하는 친유성 성분; 및
    h. 인슐린을 포함하는 활성 성분, 폴리소르베이트 80과 소르비탄 모노올레에이트의 배합물을 포함하는 계면활성제, 및 대두유, 쌀겨 오일, 어유 및 코코넛 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택된 오일을 포함하는 친유성 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  13. 친수성 성분 중에 현탁된 친유성 성분의 액적 및 상기 친유성 성분에 대해 3:1 내지 10:1의 총 중량비로 존재하는 계면활성제를 포함하는 나노에멀젼 조성물로서, 상기 친유성 성분이 상기 조성물의 총 중량의 약 5% 미만이고, 상기 나노에멀젼 조성물이 약 0.5 이하의 계면활성제의 총 중량에 대한 친유성 성분의 중량비(Ros)를 가지며, 상기 친유성 성분의 액적이 약 25nm 이하의 평균 크기를 갖는 단일 피크 입자 크기 분포를 특징으로 하고, 여기서, 상기 조성물이 하기 중 하나를 추가로 특징으로 하는 나노에멀젼 조성물:
    a. 상기 활성 성분이 탁산 또는 벤조피론인 경우, 상기 친유성 성분이 쌀겨 오일을 포함하고, 상기 계면활성제가 하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르를 포함하는 비이온성 계면활성제이고;
    b. 상기 활성 성분이 카로티노이드를 포함하는 경우, 상기 친유성 성분이 대두유이고, 상기 계면활성제가 C20 에톡시화 모노글리세라이드를 포함하는 비이온성 계면활성제이며;
    c. 상기 활성 성분이 벤조피론, 피리미딘 및 이미다졸로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경우, 상기 친유성 성분이 오메가-3 오일을 포함하고, 상기 계면활성제가 하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르를 포함하는 비이온성 계면활성제이다.
  14. 제13항에 있어서, 상기 계면활성제가 에톡시화 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드, 하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레산 에스테르, 폴리소르베이트, 인지질 및 폴리옥시에틸렌 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 나노에멀젼 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 상기 친유성 성분이 대두유, 코코넛 오일, 식물유, 쌀겨 오일 및 어유로 이루어진 그룹으로부터 선택된 오일인, 나노에멀젼 조성물.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 성분의 액적의 측정이 약 20nm 이하의 너비를 갖는 액적 크기 분포의 단일 피크를 특징으로 하는, 나노에멀젼 조성물.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계면활성제가 비이온성 폴리에톡시화 계면활성제이고, 상기 나노에멀젼이 상기 친유성 성분 중에 활성 성분을 추가로 포함하는, 나노에멀젼 조성물.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하기 중 하나 이상을 특징으로 하는, 나노에멀젼 조성물.
    a. 쿠마린을 포함하는 활성 성분 및 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제;
    b. 커큐민을 포함하는 활성 성분 및 폴리옥시에틸렌 피마자유 계면활성제;
    c. 5-플루오로우라실을 포함하는 활성 성분 및 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제;
    d. 다카바진을 포함하는 활성 성분 및 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제;
    e. 파클리탁셀을 포함하는 활성 성분 및 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제;
    f. 토코트리에놀을 포함하는 활성 성분 및 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 계면활성제;
    g. 루테인을 포함하는 활성 성분 및 C20 에톡시화 모노글리세라이드 계면활성제; 및
    h. 인슐린을 포함하는 활성 성분 및 폴리소르베이트 80과 소르비탄 모노올레에이트의 배합물을 포함하는 계면활성제.
  19. 나노에멀젼 조성물을 포함하는 약제(pharmaceutical)를 제형화하는 방법으로서, 상기 방법이
    a. 친유성 성분, 활성 성분, 친수성 성분 및 계면활성제를 제1 조성물로서 배합하는 단계[여기서, 상기 제1 조성물은 상기 계면 활성제의 상 전환 온도 이상에서의 상기 친유성 성분과 상기 친수성 성분 사이의 온도 의존성 상 전환을 특징으로 하고, 여기서
    (i) 상기 제1 조성물이 상기 친유성 성분 약 5중량% 미만을 함유하고,
    (ii) 상기 제1 조성물 중에서 계면활성제의 총 중량에 대한 친유성 성분의 중량비(Ros)가 약 0.5 이하이며,
    (iii) 상기 제1 조성물이 100nm 이하의 평균 친유성 성분 액적 크기를 갖는 나노에멀젼을 형성하기 위해 선택된, 친유성 성분과 계면활성제 사이의 중량비를 갖고,
    (iv) 상기 활성 성분, 계면활성제 및 친유성 성분이 나노에멀젼을 형성하기 위해 선택된다];
    b. 상기 제2 조성물을, 상기 혼합물의 적어도 일부가 상 전환을 겪도록 하기에 충분한 시간 동안 상 전환 온도를 초과하는 온도로 가열시켜 제3 조성물을 형성하는 단계;
    c. 상기 제3 조성물을, 상기 친유성 성분 중에 현탁된 100nm 이하의 평균 액적 크기의 친유성 성분의 액적을 갖는 나노에멀젼을 형성하기에 유효한 속도로 냉각시키는 단계; 및
    d. 상기 나노에멀젼을 약제로서 제형화하는 단계를 포함하는, 나노에멀젼 조성물을 포함하는 약제를 제형화하는 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    a. 상기 계면활성제가 에톡시화 모노글리세라이드 또는 디글리세라이드, 하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레산 에스테르, 폴리소르베이트, 인지질 및 폴리옥시에틸렌 오일로 이루어진 그룹으로부터 선택되고;
    b. 상기 친유성 성분이 대두유, 코코넛 오일, 식물유, 쌀겨 오일 및 어유로 이루어진 그룹으로부터 선택되며;
    c. 상기 활성 성분이 벤조피론 또는 벤조피론 유도체, 폴리페놀, 피리미딘 또는 피리미딘 유사체, 이미다졸 또는 이미다졸 유사체, 탁산, 토코페롤, 토코트리에놀, 카로티노이드, 폴리누클레오타이드, 폴리펩티드, 루테인 및 인슐린으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 물질인, 나노에멀젼 조성물을 포함하는 약제를 제형화하는 방법.
  21. 제1항에 있어서,
    a. 친유성 활성 성분을 무독성 오일 친유성 성분 중에 용해시켜 활성 성분이 약제, 기능성 건강식품 또는 약용화장품(cosmaceutical)인 활성 성분 조성물을 형성하는 단계;
    b. 상기 활성 성분 조성물을 상기 친수성 성분 및 상기 계면활성제와 배합하여 제1 조성물을 형성하는 단계로서, 상기 활성 성분이 친수성 성분보다 친유성 성분에 보다 용해성이며;
    c. 상기 제2 조성물을, 상기 제2 조성물의 미세유동화 없이, 친수성 성분 중에 현탁된 100nm 이하의 평균 액적 크기의 친유성 성분의 액적을 갖는 나노에멀젼을 형성하기에 유효한 속도로 냉각시키는 단계;
    d. 상기 제2 조성물로부터 형성된 상기 나노에멀젼을 약제로서 제형화하는 단계; 및
    e. 약제를 필요로하는 대상에 투여하기 위한 치료학적으로 유효량의 약제를 포장하는 단계를 추가로 포함하는, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
  22. 나노에멀젼의 형성방법으로서, 상기 방법이
    a. 친유성 성분, 친수성 성분 및 계면활성제를 제1 조성물로서 배합하는 단계[여기서, 상기 제1 조성물이 상기 계면 활성제의 상 전환 온도 이상에서의 상기 친유성 성분 및 상기 친수성 성분 사이의 온도 의존성 상 전환을 특징으로 하고, 여기서
    (i) 상기 제1 조성물이 상기 친유성 성분 약 5중량% 미만을 함유하고,
    (ii) 상기 제1 조성물 중에서 계면활성제의 총 중량에 대한 친유성 성분의 중량비(Ros)가 약 0.5 이하이며, 및
    (iii) 상기 제1 조성물이 미세유동화 없이 100nm 이하의 평균 친유성 성분 액적 크기를 갖는 나노에멀젼을 제공하기 위해 선택된, 친유성 성분과 계면활성제 사이의 중량비를 갖는다];
    b. 상기 제1 조성물을, 상기 제1 조성물의 적어도 일부가 상 전환을 겪도록 하기에 충분한 시간 동안 상기 계면활성제의 상 전환 온도 초과의 온도로 가열시켜 제2 조성물을 형성하는 단계; 및
    c. 상기 제2 조성물을 미세유동화시키지 않고 상기 친유성 성분의 액적을 갖는 나노에멀젼을 형성하기 위해 제2 조성물에 대해 유효한 속도로 냉각시키는 단계를 포함하는, 나노에멀젼의 형성방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 친유성 성분 대 상기 계면활성제의 비가 5:1 이상이고, 상기 나노에멀젼이 25nm 이하의 평균 액적 크기를 갖는 친유성 성분의 액적크기의 단일 분포를 가지며, 여기서, 상기 제1 조성물이
    a. 쌀겨 오일 및 코코넛 오일 중 하나 이상을 포함하는 친유성 성분, 및 C20 에톡시화 모노글리세라이드, 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 및 폴리옥시에틸렌 피마자유로 이루어진 그룹으로부터 선택된 계면활성제;
    b. 대듀유를 포함하는 친유성 성분, 및 C20 에톡시화 모노글리세라이드, 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 계면활성제;
    c. 어유를 포함하는 친유성 성분, 및 C20 에톡시화 모노글리세라이드 및 12-하이드록시스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르로 이루어진 그룹으로부터 선택된 계면활성제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 나노에멀젼의 형성방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 친수성 성분이 물이고, 상기 조성물이 하기 중 하나 이상을 특징으로 하는, 나노에멀젼의 형성방법.
    a. 5:1 내지 7:1의 친유성 성분 대 계면활성제의 비;
    b. 약 0.980 이하의 수/(수+오일) 중량비;
    c. 약 0.023 이하의 오일/(수+오일) 중량비; 및
    d. 약 0.143 이하의 수/(수+계면활성제) 중량비.
  25. 친수성 성분 중에 현탁된 친유성 성분의 액적 및 상기 친유성 성분에 대해 3:1 내지 10:1의 총 중량비로 존재하는 비이온성 폴리에톡시화 계면활성제를 포함하는 나노에멀젼 조성물로서, 상기 친유성 성분이 상기 조성물의 총 중량의 약 5% 미만이고, 상기 나노에멀젼 조성물이 약 0.5 이하의 계면활성제의 총 중량에 대한 친유성 성분의 중량비(Ros)를 가지며, 상기 친유성 성분의 액적이 약 25nm 이하의 평균 크기를 갖는 단일 피크 입자 크기 분포를 특징으로 하는, 나노에멀젼 조성물.
  26. 친수성 성분 및 계면활성제를 포함하는 나노에멀젼 중의 친유성 성분의 액적 또는 입자 크기를 감소시키는 방법으로서, 상기 방법이
    a. 비이온성 폴리에톡시화 계면활성제를 추가로 포함하고 상 전환 온도를 갖는 제1 조성물 중의 상기 계면활성제와 친유성 성분의 총 중량에 대한 상기 친유성 성분의 중량비(Ros)를 감소시키는 단계;
    b. 상기 제1 조성물을, 상기 제1 조성물의 적어도 일부가 상 전환을 겪도록 하기에 충분한 시간 동안 상기 제1 조성물의 상 전환 온도를 초과하는 온도로 가열시켜 제2 조성물을 형성하는 단계; 및
    c. 상기 제2 조성물을 미세유동화없이 나노에멀젼을 형성하기에 유효한 속도로 냉각시키는 단계(여기서, 상기 나노에멀젼은 상기 친수성 성분 중에 현탁된 100nm 이하의 평균 액적 크기의 친유성 성분의 액적을 갖는다)를 포함하는, 친수성 성분 및 계면활성제를 포함하는 나노에멀젼 중의 친유성 성분의 액적 또는 입자 크기를 감소시키는 방법.
  27. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성 성분이 로바스타틴, 쿠마린, 파클리탁셀, 플루오로우라실, 다카바진, 토코트리에놀 또는 인슐린 중 하나 이상을 포함하는, 활성 성분을 포함하는 나노에멀젼의 형성방법.
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KR1020107024177A KR20100135857A (ko) 2008-03-28 2009-03-30 나노에멀젼의 제조를 위한 조성물 및 방법

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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160005182A (ko) * 2014-07-03 2016-01-14 건국대학교 산학협력단 시나몬 오일을 포함하는 나노 에멀젼 및 이의 제조방법
US9320801B2 (en) 2012-04-30 2016-04-26 Huons Co., Ltd Cyclosporine-containing non-irritative nanoemulsion ophthalmic composition
KR20160107343A (ko) * 2014-01-29 2016-09-13 코스모 테크놀러지스 리미티드 하나 이상의 염료를 함유하는 직장 투여용 에멀젼 또는 마이크로에멀젼 형태의 액체 조성물, 및 s상 결장 및/또는 직장의 내시경 진단 절차에서의 이의 용도
KR101714618B1 (ko) * 2017-01-25 2017-03-22 루안코리아 주식회사 Pit 시스템에 의해 제조되는 수중유형 나노입자 에멀션 화장료 조성물 및 그의 제조방법
KR101719811B1 (ko) * 2017-03-02 2017-03-24 루안코리아 주식회사 피부 흡수율이 향상된 수중유형 나노입자 에멀션 화장료 조성물
KR20180093813A (ko) * 2017-02-13 2018-08-22 단디바이오사이언스 주식회사 이미다조퀴놀린계열 물질을 포함하는 나노에멀젼 및 이의 용도
KR20190131962A (ko) * 2018-05-18 2019-11-27 강원대학교산학협력단 열용융압출법을 이용하여 제조된 구리 나노콜로이드 분산체 및 이의 용도

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5368793B2 (ja) 2005-07-18 2013-12-18 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ ロウエル ナノエマルジョンを製造および使用するための組成物および方法
US20090306198A1 (en) * 2005-09-16 2009-12-10 Robert Nicolosi Anti-Oxidant Synergy Formulation Nanoemulsions to Treat Caner
US9486408B2 (en) 2005-12-01 2016-11-08 University Of Massachusetts Lowell Botulinum nanoemulsions
TR201901443T4 (tr) 2005-12-01 2019-02-21 Univ Massachusetts Lowell Botulinum nanoemülsiyonları.
US20100183726A1 (en) * 2006-08-02 2010-07-22 Robert Nicolosi Compositions and methods for treating cancer with dacarbazine nanoemulsions
BRPI0719732A2 (pt) 2006-12-01 2017-05-16 Anterios Inc nanopartículas de peptídeo e usos para as mesmas
EP2494958A1 (en) 2006-12-01 2012-09-05 Anterios, Inc. Amphiphilic Entity Nanoparticles
ES2660906T3 (es) 2007-05-31 2018-03-26 Anterios, Inc. Nanopartículas de ácido nucleico y usos de las mismas
JP2012510466A (ja) * 2008-12-01 2012-05-10 ライラ ファーマシューティカルズ ピーブイティ．エルティディ． 炎症、皮膚異常及び粘膜異常並びに他の皮膚疾病及び粘膜疾病の治療のための局部用製剤
WO2010109482A2 (en) * 2009-03-23 2010-09-30 Laila Pharmaceuticals Pvt. Ltd. Curcuminoids and its metabolites for the application in allergic ocular/nasal conditions
KR20110056042A (ko) * 2009-11-20 2011-05-26 주식회사유한양행 종양세포 표적지향을 위한 나노 입자 및 이의 제조방법
CA2798180A1 (en) 2010-05-03 2011-11-10 Teikoku Pharma Usa, Inc. Non-aqueous taxane pro-emulsion formulations and methods of making and using the same
CN103124592B (zh) 2010-07-01 2015-05-27 科瓦里斯股份有限公司 使用聚焦声制备用于纳米递送之纳米制剂和系统的组合物和方法
CN104159570A (zh) * 2011-12-29 2014-11-19 陈献 稳定的胰高血糖素纳米乳液
AU2013311059B2 (en) 2012-08-26 2017-04-06 Lycored Ltd. Hue-controlled beta-carotene formulations
JO3685B1 (ar) 2012-10-01 2020-08-27 Teikoku Pharma Usa Inc صيغ التشتيت الجسيمي للتاكسين غير المائي وطرق استخدامها
US9504754B2 (en) 2013-03-15 2016-11-29 South Dakota Board Of Regents Curcuminoid complexes with enhanced stability, solubility and/or bioavailability
CA2945323A1 (en) * 2014-04-08 2015-10-15 University Of Massachusetts Food matrices and methods of making and using
CO7060228A1 (es) * 2014-09-02 2014-09-19 Ortiz Cesar Augusto Vargas Nano y microemulsiones que comprenden aceites esenciales o fijos y tensioactivo no iónico gras (generalmente reconocido como seguro)
WO2016053809A1 (en) * 2014-09-29 2016-04-07 Barrie Tan Non-synthetic emulsion-based lipid formulations and methods of use
WO2016069409A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Latitude Pharmaceuticals, Inc. Parenteral glucagon formulations
US20190117530A1 (en) * 2015-10-09 2019-04-25 Fernando Thome Kreutz Nanoemulsion compositions and methods
US20190175680A1 (en) * 2016-09-07 2019-06-13 Nanosmart Fruit, Llc Compositions comprising nanoparticles derived from whole fruit
KR102487144B1 (ko) 2016-11-21 2023-01-12 에이리온 테라퓨틱스, 인코포레이티드 큰 물질의 경피 전달
WO2018122598A2 (en) * 2016-12-30 2018-07-05 Universidad De Chile Curcumin-loaded nanoemulsions, method of manufacture, and method of preventive treatment using the same
JP7421499B2 (ja) 2018-05-15 2024-01-24 アメリカ合衆国 腫瘍転移および腫瘍発生の予防および治療のための製剤および方法
CN110638753A (zh) * 2018-06-25 2020-01-03 中国科学院宁波工业技术研究院慈溪生物医学工程研究所 一种磁性载药纳米胶束、其制备方法及应用
CA3081963A1 (en) 2019-05-31 2020-11-30 American River Nutrition, Llc Compositions comprising quillaja extract and methods of preparations and use thereof
WO2021062065A1 (en) * 2019-09-25 2021-04-01 OVR Tech, LLC Nano emulsion process for scented liquids
CN113952292B (zh) * 2021-10-28 2023-11-03 河南中医药大学 一种迷迭香精油纳米乳凝胶、制备方法及其应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2094688B1 (es) * 1994-08-08 1997-08-01 Cusi Lab Manoemulsion del tipo de aceite en agua, util como vehiculo oftalmico y procedimiento para su preparacion.
US6835395B1 (en) * 1997-05-14 2004-12-28 The University Of British Columbia Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles
FR2788007B1 (fr) * 1999-01-05 2001-02-09 Oreal Nanoemulsion a base de copolymeres blocs d'oxyde d'ethylene et d'oxyde de propylene, et ses utilisations dans les domaines cosmetique, dermatologique et/ou ophtalmologique
US7763663B2 (en) * 2001-12-19 2010-07-27 University Of Massachusetts Polysaccharide-containing block copolymer particles and uses thereof
US7476393B2 (en) * 2002-11-29 2009-01-13 L'oreal Process for the preparation of a cationic nanoemulsion, and cosmetic composition
WO2006123354A2 (en) * 2005-02-02 2006-11-23 Mega Lifesciences Pvt. Ltd. Oral pharmaceutical composition
JP5368793B2 (ja) * 2005-07-18 2013-12-18 ユニバーシティ オブ マサチューセッツ ロウエル ナノエマルジョンを製造および使用するための組成物および方法
US20090306198A1 (en) * 2005-09-16 2009-12-10 Robert Nicolosi Anti-Oxidant Synergy Formulation Nanoemulsions to Treat Caner
CA2628964A1 (en) * 2005-11-09 2007-09-07 Hormos Medical Ltd. Formulations of fispemifene
US20100183726A1 (en) * 2006-08-02 2010-07-22 Robert Nicolosi Compositions and methods for treating cancer with dacarbazine nanoemulsions
EP2494958A1 (en) * 2006-12-01 2012-09-05 Anterios, Inc. Amphiphilic Entity Nanoparticles
BRPI0719732A2 (pt) * 2006-12-01 2017-05-16 Anterios Inc nanopartículas de peptídeo e usos para as mesmas

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9320801B2 (en) 2012-04-30 2016-04-26 Huons Co., Ltd Cyclosporine-containing non-irritative nanoemulsion ophthalmic composition
KR20160107343A (ko) * 2014-01-29 2016-09-13 코스모 테크놀러지스 리미티드 하나 이상의 염료를 함유하는 직장 투여용 에멀젼 또는 마이크로에멀젼 형태의 액체 조성물, 및 s상 결장 및/또는 직장의 내시경 진단 절차에서의 이의 용도
KR20160005182A (ko) * 2014-07-03 2016-01-14 건국대학교 산학협력단 시나몬 오일을 포함하는 나노 에멀젼 및 이의 제조방법
KR101714618B1 (ko) * 2017-01-25 2017-03-22 루안코리아 주식회사 Pit 시스템에 의해 제조되는 수중유형 나노입자 에멀션 화장료 조성물 및 그의 제조방법
KR20180093813A (ko) * 2017-02-13 2018-08-22 단디바이오사이언스 주식회사 이미다조퀴놀린계열 물질을 포함하는 나노에멀젼 및 이의 용도
KR101719811B1 (ko) * 2017-03-02 2017-03-24 루안코리아 주식회사 피부 흡수율이 향상된 수중유형 나노입자 에멀션 화장료 조성물
KR20190131962A (ko) * 2018-05-18 2019-11-27 강원대학교산학협력단 열용융압출법을 이용하여 제조된 구리 나노콜로이드 분산체 및 이의 용도

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US20110206739A1 (en) 2011-08-25

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