KR20100135803A - 미토콘드리아로 전달되는 항암 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항암 화합물 및 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 한 측면에서, 본 발명은 반응성 산소 종을 생성하고 암성 세포의 세포자멸을 유도하는, 미토콘드리아로 전달되는 산화촉진 항암 화합물에 관한 것이다. 전달 잔기는 친지성 양이온일 수 있고, 산화촉진 잔기는 산화촉진 비타민 E 유사체, 예컨대 α-토코페릴 숙시네이트, α-토코페릴 말레에이트, α-토코페릴 말레일 아미드 또는 2,5,7,8-테트라메틸-2R-(4R,8R,12-트리메틸트리데실)-크로만-6-일옥시아세트산 (α-토코페릴옥시아세트산)일 수 있다.

Description

미토콘드리아로 전달되는 항암 화합물 {MITOCHONDRIALLY DELIVERED ANTI-CANCER COMPOUNDS}
본 발명은 특히 항암 화합물 및 암의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 반응성 산소 종을 생성하고 암성 세포의 세포자멸을 유도하는, 미토콘드리아로 전달되는 산화촉진 항암 화합물에 관한 것이다.
분자 의학에 있어서의 진보와 더불어 암의 개시, 진행 및 치료의 분자 생물학에 관한 이해가 개선되어 치료적 접근법이 더 나아졌다. 그러나, 신생물 세포는 염색체 불안정성을 갖는 탈분화된 정상 세포로 특징지어질 수 있기 때문에, 새로운 돌연변이가 발생하면 기존의 항암 약물이 무용지물이 된다. 악성 중피종 (MM)을 비롯한 특정의 악성종양은 현재로서는 치료될 수 없다 ([Robinson BW, Musk AW, Lake A (2005) Lancet 366, 397-408]). HER2-양성 유방 암종 ([Piccart-Gebhart MJ et al (2005) N Engl J Med 353, 1659-1672])과 같은 다른 악성종양은 상당한 심장독성을 나타내는 매우 고가의 헤르셉틴(Herceptine)™에 의존적이다. 따라서, 현행 치료 접근법의 합병증을 극복할 신규한 약물 및 전략이 요구된다.
미토콘드리아의 표적화가 유망하고 고도로 효과적인 항암 접근법으로서 점점 더 인식되는 새로운 개념이 대두되었다 ([Don AS, Hogg PJ (2004) Trends Mol Med 10, 372-378], [Armstrong JS (2007) Br J Pharmacol 151, 1154-1165]). 본 발명자들은 최근에 "미토칸(mitocan)"이라는 용어를 제안한 바 있는데, 이것은 암 세포 내의 미토콘드리아를 불안정화시켜서 세포자멸을 유도하는 항암 활성을 갖는 저분자를 지칭한다 ([Neuzil J, Wang XF, Dong LF, Low P, Ralph SJ (2006) FEBS Lett 580, 5125-5129], [Neuzil J et al (2007) J Bioenerg Biomembr 39, 65-72], [Neuzil J et al (2007) Mol Pharmacol 71, 1185-1199]). 하기 표 I ([Neuzil J et al (2007) Mol Pharmacol 71, 1185-1199])에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 이들 분자를 이것들의 작용 방식에 따라 군으로 나누었다:
[표 I] 미토칸의 분류
Figure pct00001
미토칸의 목록은 현재 7개 군을 포함하며, 이것 각각은 미토콘드리아 불안정화 및 이후 내재적 세포자멸 경로의 유도를 야기하는 상이한 활성을 갖는 작용제를 포함한다 ([Neuzil J et al (2007) Mol Pharmacol 71, 1185-1199]).
미토칸은 이들 화합물 중 일부가 정상 세포에는 거의 영향이 없는 강력하고 선택적인 항암제이기 때문에 암 치료에 있어서 매력적인 것으로 입증되고 있다 ([Neuzil J et al (2007) Mol Pharmacol 71, 1185-119], [Ko YH et al (2004) Biochem Biophys Res Commun 324, 269-275], [Bonnet S et al (2007) Cancer Cell 11, 37-51]). 이러한 약물의 주요 예는 암 세포의 선택적인 세포자멸을 유도하는 α-토코페릴 숙시네이트 (α-TOS) ([Neuzil J, Weber T, Gellert N, Weber C (2001) Br J Cancer 84, 87-89], [Neuzil J et al (2004) Curr Cancer Drug Targets 4, 267-284]) 및 또한 3-브로모피루베이트 (3BP) ([Ko YH et al (2004) Biochem Biophys Res Commun 324, 269-275], [Geschwind JF et al (2002) Cancer Res 62, 3909-3913]), 디클로로아세테이트 (DCA) ([Bonnet S et al (2007) Cancer Cell 11, 37-51]) 및 β-페닐에틸 이소티오시아네이트 (PITC) ([Trachootham D et al (2006) Cancer Cell 10, 241-252])를 포함한다.
3BP는 미토콘드리아의 외면에 우세하게 결합하는 해당 경로 효소인 헥소키나제를 억제하고, 또한 미토콘드리아의 효소 숙시네이트 데히드로게나제 (SDH)도 억제하여, 세포의 ATP 생성 및 미토콘드리아 호흡을 저해한다 ([Ko YH et al (2004) Biochem Biophys Res Commun 324, 269-275], [Xu RH et al (2005) Cancer Res 65, 613-621]).
DCA는 미토콘드리아의 피루베이트 데히드로게나제 키나제를 억제하여 암 세포를 선택적으로 표적화한다고 여겨진다 ([Bonnet S et al (2007) Cancer Cell 11, 37-51]). PITC는 미토콘드리아에 의한 반응성 산소 종 (ROS)의 생성을 야기하여 암 세포를 선택적으로 사멸시킨다 ([Trachootham D et al (2006) Cancer Cell 10, 241-252]). 미토칸의 이러한 모든 예는 실질적인 유망성을 갖는 새로 부상하는 군의 화합물 및 개선되고 고도로 선택적인 신규 항암 약물의 개발을 위한 새로운 방향을 반영한다.
미토칸의 한 군은 비타민 E의 산화촉진 유사체를 포함한다 ([Wang XF, Dong LF, Zhao Y, Tomasetti M, Wu K, Neuzil J (2006) Vitamin E analogues as anti-cancer agents: Lessons from studies with α-tocopheryl succinate. Mol Nutr Food Res 50:675-685]). α-TOS를 전형적인 예로 하는 산화촉진 비타민 E 유사체의 항암 약물로서의 높은 유망성은 실험적으로 고안된 암, 예컨대 누드 마우스에서 성장시킨 인간 이종이식편을 사용한 연구로부터 대두되었고, 여기서 이것들은 악성종양을 저해하는 것으로 나타났다 (문헌 [Neuzil J, Tomasetti M, Mellick AS, Alleva R, Salvatore BA, Birringer M, Fariss MW (2004) Vitamin E analogues: A new class of inducers of apoptosis with selective anti-cancer effects. Curr Cancer Drug Targets 4:355-372]에서 검토됨). 이러한 연구는 결장직장 암종 ([Neuzil J, Weber T, Gellert N, Weber C (2001) Selective cancer cell killing by α-tocopheryl succinate. Br J Cancer 84:87-89], [Neuzil J, Weber T, Schroder A, Lu M, Ostermann G, Gellert N, Mayne GC, Olejnicka B, Negre-Salvayre A, Sticha M, Coffey RJ, Weber C (2001) Induction of apoptosis in cancer cells by α-tocopheryl succinate: Molecular pathways and structural requirements. FASEB J 15:403-415], [Weber T, Lu M, Andera L, Lahm H, Gellert N, Fariss MW, Korinek V, Sattler W, Ucker DS, Terman A, Schroder A, Erl W, Brunk UT, Coffey RJ, Weber C, Neuzil J (2002) Vitamin E succinate is a potent novel anti-neoplastic agent with high tumor selectivity and cooperativity with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL, Apo2L) in vivo. Clin Cancer Res 8:863-869]) 및 폐 암종 ([Quin J, Engle D, Litwiller A, Peralta E, Grasch A, Boley T, Hazelrigg S (2005) Vitamin E succinate decreases lung cancer tumor growth in mice. J Surg Res 127:139-143]), 흑색종 ([Malafa MP, Fokum FD, Mowlavi A, Abusief M, King M (2002) Vitamin E inhibits melanoma growth in mice. Surgery 131:85-91]) 및 또한 중피종 ([Tomasetti M, Gellert N, Procopio A, Neuzil J (2004) A vitamin E analogue suppresses malignant mesothelioma in a pre-clinical model: A prototype of a future drug against a fatal neoplastic disease? Int J Cancer 109:641-642], [Stapelberg M, Gellert N, Swettenham E, Tomasetti M, Witting PK, Procopio A, Neuzil J (2005) α-tocopheryl succinate inhibits malignant mesothelioma by disruption of the FGF autocrine signaling loop: Mechanism and the role of oxidative stress. J Biol Chem 280:25369-25376])을 포함한다. α-TOS는 또한 유방암 휴면을 촉진하고 ([Malafa et al, 2000]), 간으로의 결장암 전이를 저해 ([Barnett KT, Fokum FD, Malafa MP (2002) Vitamin E succinate inhibits colon cancer liver metastases. J Surg Res 106:292-298])하는 것으로 나타난 바 있다.
비타민 E (α-토코페롤, α-TOH)가 세포에서 강력한 항-산화제로 작용하지만, 비타민 E의 에스테르화된 산화환원-침묵(redox-silent) 및 산화촉진 유사체인 α-TOS는 독특한 성질을 갖는다. α-TOH와는 반대로, α-TOS는 강력한 세포 스트레스인자로 작용하여 소정 범위의 여러 암 세포주에서 ROS의 신속한 생성을 야기한다 ([Neuzil J, Tomasetti M, Mellick AS, Alleva R, Salvatore BA, Birringer M, Fariss MW (2004) Vitamin E analogues: A new class of inducers of apoptosis with selective anti-cancer effects. Curr Cancer Drug Targets 4:355-372], [Weber T, Dalen H, Andera L, Negre-Salvayre A, Auge N, Sticha M, Lloret A, Terman A, Witting PK, Higuchi M, Plasilova M, Zivny J, Gellert N, Weber C, Neuzil J (2003) Mitochondria play a central role in apoptosis induced by α-tocopheryl succinate, an agent with anticancer activity. Comparison with receptor-mediated pro-apoptotic signaling. Biochemistry 42:4277-4291], [Wang XF, Witting PK, Salvatore BA, Neuzil J (2005) α-tocopheryl succinate induces apoptosis in HER2/erbB2-overexpressing breast cancer cells by signalling via the mitochondrial pathway. Biochem Biophys Res Commun 326:282-289], [Swettenham E, Witting PK, Salvatore BA, Neuzil J (2005) α-tocopheryl succinate selectively induces apoptosis in neuroblastoma cells: Potential therapy of malignancies of the nervous system? J Neurochem 94:1448-1456], [Stapelberg M, Gellert N, Swettenham E, Tomasetti M, Witting PK, Procopio A, Neuzil J (2005) α-tocopheryl succinate inhibits malignant mesothelioma by disruption of the FGF autocrine signaling loop: Mechanism and the role of oxidative stress. J Biol Chem 280:25369-25376]). α-TOS는 또한 Bcl-2/Bcl-xL에 결합하여 이것을 억제하는 능력을 갖는다 ([Dong LF, Wang XF, Zhao Y, Tomasetti M, Wu K, Neuzil J (2006) Vitamin E analogues as anti-cancer agents: the role of modulation of apoptosis signalling pathways. Cancer Therapy 4:35-46]). 현재까지의 증거는, α-TOS가 암 세포에 특이적이라는 특성이 있고 정상 세포에 대한 독성 효과가 없는 것은 정상 세포가 더 높은 항-산화 방어력 ([Allen RG, Balin AK (2003) Effects of oxygen on the antioxidant responses of normal and transformed cells. Exp Cell Res 289:307-316], [Safford SE, Oberley TD, Urano M, St Clair DK (1994) Suppression of fibrosarcoma metastasis by elevated expression of manganese superoxide dismutase. Cancer Res 54:4261-4265], [Church SL, Grant JW, Ridnour LA, Oberley LW, Swanson PE, Meltzer PS, Trent JM (1993) Increased manganese superoxide dismutase expression supresses the malignant phenotype of human melanoma cells. Proc Natl Acad Sci USA 90:3113-3117])을 갖고/갖거나 숙시네이트 잔기를 유리시켜서 α-TOS를 불활성화시키는 에스테라제를 높은 수준으로 함유하여 산화환원-활성을 가지며 세포자멸을 유도하지 않는 α-TOH를 생성 ([Fariss MW, Nicholls-Grzemski FA, Tirmenstein MA, Zhang JG (2001) Enhanced antioxidant and cytoprotective abilities of vitamin E succinate is associated with a rapid uptake advantage in rat hepatocytes and mitochondria. Free Radic Biol Med 31:530-541], [Neuzil J, Tomasetti M, Mellick AS, Alleva R, Salvatore BA, Birringer M, Fariss MW (2004) Vitamin E analogues: A new class of inducers of apoptosis with selective anti-cancer effects. Curr Cancer Drug Targets 4:355-372], [Neuzil J, Massa H (2005) Hepatic processing determines dual activity of vitamin E succinate. Biochem Biophys Res Commun 327:1024-1027)하기 때문임을 시사한다.
천연 발생 비타민 E는 크로마놀 고리의 메틸화 패턴에서 상이하고 (α-, β-, γ-, δ-토코페롤) 피틸 측쇄의 이중 결합 수가 상이한 (α-, β-, γ-, δ-토코트리엔올) 8종 화합물의 혼합물로 구성된다. 시험관내 및 생체내에서 친지성 항-산화제로서의 이들 분자의 역할은 널리 공인되어 있다. 추가로, VE 부류 구성원의 비-항-산화 성질 역시 조사된 바 있다 ([Azzi A, Ricciarelli R and Zingg JM (2002) Non-antioxidant molecular functions of α-tocopherol (vitamin E). FEBS Lett 519:8-10]).
비타민 E 분자는 3개의 상이한 도메인으로 나뉠 수 있다. 기능적 도메인 (I)은 크로마놀 고리의 위치 C6에서의 치환 패턴으로 인한 것이다. 비타민 E가 항-산화제로서 기능하기 위해서는 유리 히드록실기가 필수적이기 때문에, 이 위치는 상기 분자가 산화환원-활성으로 행동할 것인지 산화환원-침묵으로 행동할 것인지의 여부를 결정짓는다. 4종의 토코페롤 이성질체의 항-산화 성질이 문헌에 널리 기재되었기 때문에 이것들은 암의 임상 실험에 적용되었다. 이러한 연구 어느 것도 암 예방에 있어서 유리 토코페롤의 사용과 관련된 긍정적인 결과를 보여주지 못하였다 ([Pham DQ and Plakogiannis R (2005) Vitamin E supplementation in cardiovascular disease and cancer prevention: Part 1. Ann Pharmacother 39:1870-8]). 그러나, C6에서의 특정 화학적 변형은 강력한 항-신생물 작용제라는 것이 입증된 에테르 (RO-), 에스테르 (RCOO-) 및 아미드 (RCONH-)를 유도하였다. 하기 표 II를 참조한다:
[표 II]
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
a효과 없음; b세포 증식의 억제; cα-TOS보다 훨씬 더 세포독성임; d54보다 덜 효과적임; e에테르 유사체가 α-TOS 자체보다 덜 효과적임; fα-TOS와 유사함; gEC50 [㎍/mL]; hα-TOS보다 더 효율적임.
[표 III]
Figure pct00005
a효과 없음; b50 μM에서 약한 억제; c10 μM에서 82％ 억제.
[표 IV]
Figure pct00006
a0 내지 40 μM 범위에서 세포독성임; b매우 강력함; c완전한 억제; dα-TOS와 유사함; eγ- 토코트리엔올보다 2배 더 강력함; f세포 증식의 억제.
신호전달 도메인 (II)이라 불리는 두번째 도메인은 토코페롤의 항-산화 성질과 무관한 몇가지 활성을 나타낸다. 이러한 성질은 방향족 고리의 메틸화 패턴으로 인한 것이다. 예를 들어, α-토코페롤은 디아실글리세롤 (DAG) 수준을 감소시켜서 단백질 키나제 C (PKC)를 억제하지만, 유사한 항-산화 능력을 갖는 다른 토코페롤 (예를 들어, β-토코페롤)은 PKC를 억제하지 않는 것으로 보고되었다. 따라서, α-토코페롤의 PKC 억제 활성은 이것의 항-산화 능력과 무관하다 ([Tasinato A, Boscoboinik D, Bartoli GM, Maroni P and Azzi A (1995) d-α-tocopherol inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation occurs at physiological concentrations, correlates with protein kinase C inhibition, and is independent of its antioxidant properties. Proc Natl Acad Sci USA 92:12190-12194], [Kunisaki M, Bursell SE, Clermont AC, Ishii H, Ballas LM, Jirousek MR, Umeda F, Nawata H and King GL (1995) Vitamin E prevents diabetes-induced abnormal retinal blood flow via the diacylglycerol-protein kinase C pathway. Am J Physiol 269:E239-246]). 그러나, 일부 경우에는, 신호전달 도메인에서의 구조적 차이가 여러 토코페롤의 생물학적 활성에 영향을 미치며, 이것은 특정 종에 대한 이것들의 항-산화 활성에 사실상 큰 영향을 미친다. 예를 들어, γ-토코페롤은 α-토코페롤보다 반응성 질소 산화물 종 (예를 들어, 퍼옥시니트라이트)의 훨씬 더 우수한 제거제이다. 따라서, C5에 메틸기가 없는 γ-분자는 이 부위에서 쉽게 질화된다 ([Morton LW, Ward NC, Croft KD, Puddey IB. (2002) Evidence for the nitration of gamma-tocopherol in vivo: 5-nitro-gamma-tocopherol is elevated in the plasma of subjects with coronary heart disease. Biochem J. Jun 15;364(Pt 3):625-8], [Christen S, Woodall AA, Shigenaga MK, Southwell-Keely PT, Duncan MW, Ames BN. (1997) gamma-tocopherol traps mutagenic electrophiles such as NO(X) and complements alpha-tocopherol: physiological implications. Proc Natl Acad Sci U S A. Apr 1;94(7):3217-22]).
비타민 E 이성질체의 친지성 측쇄는 포화 이소프레닐 단위를 갖는 토코페롤과 불포화 이소프레닐 단위를 갖는 토코트리엔올을 구별한다. 소수성 도메인 (III)은 그 분자가 지단백질 및 막 각각에 결합할 수 있는지, 또는 I상 효소에 의해 분해될 수 있는지 여부를 결정짓는다 ([Birringer M, Pfluger P, Kluth D, Landes N and Brigelius-Flohe R (2002) Identities and differences in the metabolism of tocotrienols and tocopherols in HepG2 cells. J Nutr 132:3113-3118], [Neuzil J, Massa H (2005) Hepatic processing determines dual activity of vitamin E succinate. Biochem Biophys Res Commun 327:1024-1027]).
변형된 히드록실기를 갖는 많은 토코페롤 유도체가 이것들의 전-세포자멸(pro-apoptosis) 활성에 대해 시험되었다 (표 II). 시험된 가장 두드러진 유도체는 크로마놀 고리의 위치 C6에서 숙시닐에스테르를 보유하는 α-TOS (엔트리 1)였다. 낮은 pKa (< 6)로 인해 α-TOS는 생리적 조건하에서 완전히 탈양성자화되어, 미토콘드리아 막을 불안정화시키고 복합체 II에 영향을 주는 계면활성제-유사 분자가 된다. 토코페롤의 디카르복실산 에스테르는 구조-활성 관계 (SAR)에 대해 가장 잘 연구된 화합물이다. 강력한 세포자멸유도제는 α-토코페롤 숙시네이트 (1), 옥살레이트 (10) 및 말로네이트 (11)를 포함하며, 후술한 2가지는 B16-F1 흑색종 세포를 접종한 마우스에서 비-선택적인 세포독성을 유도하였다 ([Kogure K, Manabe S, Suzuki I, Tokumura A and Fukuzawa K (2005) Cytotoxicity of α-tocopheryl succinate, malonate and oxalate in normal and cancer cells in vitro and their anti-cancer effects on mouse melanoma in vivo. J Nutr Sci Vitaminol 51:392-397]). 훨씬 더 높은 전-세포자멸 활성은 불포화 디카르복실산, 예컨대 α-토코페릴 말레에이트 (3) ([Birringer M, EyTina JH, Salvatore BA and Neuzil J (2003) Vitamin E analogues as inducers of apoptosis: Structure-function relationship. Br J Cancer 88:1948-1955]) 및 α-토코페릴 푸마레이트에서 관찰되었다. 글루타르산 (5), 메틸화된 글루타르산 (6, 7, 8) ([Birringer et al, 2003]) 및 활성을 전혀 나타내지 않은 피멜산 (24) ([Kogure K, Hama S, Kisaki M, Takemasa H, Tokumura A, Suzuki I and Fukuzawa K (2004) Structural characteristic of terminal dicarboxylic moiety required for apoptogenic activity of α-tocopheryl esters. Biochim Biophys Acta 1672:93-99])의 경우에서 나타난 바와 같이, 디카르복실산의 사슬 길이 증가는 활성의 감소를 야기하였다
α-TOS의 완전한 세포자멸 유도 활성에는 온전한 α-TOS 분자가 필요하다는 것이 확립되었다 ([Birringer M, EyTina JH, Salvatore BA and Neuzil J (2003) Vitamin E analogues as inducers of apoptosis: Structure-function relationship. Br J Cancer 88:1948-1955]). 유리 카르복실기의 에스테르화는 전-세포자멸 활성이 없는 대전되지 않은 유도체 (9, 25)를 생성한다. 지방족 카르복실산 에스테르, 예컨대 토코페릴 아세테이트 및 프로피오네이트 (19) 각각은 불활성이었고, 메틸 에테르 (18)도 마찬가지였다. α-TOS의 경구 투여는 이 화합물이 장의 에스테라제에 의해 절단되기 때문에 효과적이지 않다 ([Wu Y, Zu K, Ni J, Yeh S, Kasi D, James NS, Chemler S and Ip C (2004) Cellular and molecular effects of α-tocopheryloxybutyrate: lessons for the design of vitamin E analog for cancer prevention. Anticancer Res 24:3795-3802], [Cheeseman KH, Holley AE, Kelly FJ, Wasil M, Hughes L and Burton G (1995) Biokinetics in humans of RRR-α-tocopherol: the free phenol, acetate ester, and succinate ester forms of vitamin E. Free Radic Biol Med 19:591-598]). 에스테르 결합 절단의 문제를 해결하기 위해서, 에스테르 결합을 가수분해에 저항성이 있는 에테르 결합으로 대체한 화합물 (20, 21) 및 측쇄-말단절단(truncation) 유도체 (42)가 합성된 바 있다 ([Wu Y, Zu K, Ni J, Yeh S, Kasi D, James NS, Chemler S and Ip C (2004) Cellular and molecular effects of α-tocopheryloxybutyrate: lessons for the design of vitamin E analog for cancer prevention. Anticancer Res 24:3795-3802], [Nishikawa K, Satoh H, Hirai A, Suzuzki K, Asano R, Kumadaki I, Hagiwara K and Yano T (2003) α-tocopheryloxybutyric acid enhances necrotic cell death in breast cancer cells treated with chemotherapy agent. Cancer Lett 201:51-56], [Shun MC, Yu W, Gapor A, Parsons R, Atkinson J, Sanders BG and Kline K (2004) Pro-apoptotic mechanisms of action of a novel vitamin E analog (α-TEA) and a naturally occurring form of vitamin E (δ-tocotrienol) in MDA-MB-435 human breast cancer cells. Nutr Cancer 48:95-105], [Shiau CW, Huang JW, Wang DS, Weng JR, Yang CC, Lin CH, Li C, Chen CS (2006) alpha-Tocopheryl succinate induces apoptosis in prostate cancer cells in part through inhibition of Bcl-xL/Bcl-2 function. J Biol Chem 281:11819-11825]). 에테르 결합을 메틸렌기로 대체하는 것이 세포자멸 가속화에 충분하다는 것에 주목해야 한다 (22) ([Sanders G., et al (2001) Preparation of tocopherols, tocotrienols, other chroman and side chain derivatives that induce cell apoptosis for therapeutic use as antiproliferative agents. 2001: PCT 국제 출원 WO 2001058889. 제120면]).
에스테르 결합을 아미드 결합으로 대체한 경우에 세포자멸유도(pro-apoptosis) 활성의 추가 증진이 관찰되었다 (12, 13, 37, 38) ([Tomic-Vatic A, EyTina JH, Chapmann JM, Mahdavian E, Neuzil J and Salvatore BA (2005) Vitamin E amides, a new class of vitamin E analogues with enhanced pro-apoptotic activity. Int J Cancer 117:118-193]). 다시, 불포화 아미드 (13, 38)는 포화 아미드보다 우수하였다. 에스테르 대신에 아미드 결합을 도입하는 것에 대한 합리성은, 아닐린계 아미드가 상응하는 페놀계 에스테르보다 가수분해되는 경향이 훨씬 덜하다는 널리 확립된 사실을 기초로 한다. 이들 토코페릴 에스테르 유도체의 안정성 증진은 이들 분자를 생체내 보호하여, 이것들을 더 오래 무손상 상태로 유지시켜서 이것들의 생체이용률을 증가시킨다. 또한, 에스테르를 아미드로 동배체(isosteric) 대체하면, 상기 연결기가 효소에 의해 가수분해되는 경향이 약해진다. 장의 점막 세포 및 혈액에는 여러가지 비-특이적 에스테라제가 존재한다. 반대로, 펩티다제는 훨씬 더 좁은 특이성을 나타낸다. 예를 들어, 아미드 연결기로 아미노산을 갖는 전구약물은 장 및 혈액에서 그것의 상응하는 에스테르 유사체보다 더 안정하다 ([Sugawara M, Huang W, Fei Y-J, Leibach FH, Ganapathy V and Ganapathy ME (2000) Transport of valganciclovir, a ganciclovir prodrug, via peptide transporters PEPT1 and PEPT2. J Pharm Sci 89:781-789]).
마지막 군의 화합물은 양으로 대전된 N-말단을 갖는 일련의 라이신 α-토코페릴 에스테르 (15 내지 17)로 구성된다. 친수성 암모늄 관능기는 그의 카르복실레이트 대응물과 유사한 세포자멸유도 효과를 발휘하였는데, 이는 친지성 측쇄 및 친수성 헤드기로 구성된 일반적인 모티프가 활성에 필요하다는 것을 시사한다. 그러나, 장쇄 지방족 알콜 (예를 들어, 피톨 및 올레올)의 숙시닐 에스테르는 어떠한 활성도 나타내지 않았다 ([Birringer M, EyTina JH, Salvatore BA and Neuzil J (2003) Vitamin E analogues as inducers of apoptosis: Structure-function relationship. Br J Cancer 88:1948-1955]).
표 II에 나타낸 데이타로부터 일반적인 SAR이 도출될 수 있다:
1. 높은 산화촉진 및 세포자멸유도 활성을 얻기 위해서는, 기능적 도메인 I의 변형에 해리된 산 또는 대전된 암모늄기로 구성된 친수성 헤드기가 필요하였다.
2. 기능적 도메인의 사슬 길이 및 불포화도가 세포자멸유도 활성을 결정하였다. 형태적 제한은 상기 활성을 강화시킨다고 여겨졌다.
3. 기능적 도메인의 화학적 연결기는 에스테르로 제한되지 않으며, 다른 관능기는 유도체의 효소적 분해를 방지하였다.
일반적으로, 크로마놀 고리의 치환 패턴은 단지 토코페롤의 항-산화 성질과만 관련이 있는 것이 아니다 ([Azzi A, Ricciarelli R and Zingg JM (2002) Non-antioxidant molecular functions of α-tocopherol (vitamin E). FEBS Lett 519:8-10]). 여러가지 생화학적 관찰은 신호전달 및 대사 과정에 있어서 α-토코페롤의 역할을 강조한다. 따라서, α-토코페롤은 α-토코페롤에 대하여 다른 토코페롤 및 토코트리엔올보다 높은 친화도를 갖는 32 kDa 단백질인 α-토코페롤 전달 단백질 (α-TTP)에 의해 간에서 선택적으로 인식된다. α-TTP에 대한 상대적 친화도는 크로마놀 고리의 메틸화 손실에 따라 감소된다 (α-토코페롤 100％, β-토코페롤 38％, γ-토코페롤 9％ 및 δ-토코페롤 2％) ([Hosomi A, Arita M, Sato Y, Kiyose C, Ueda T, Igarashi O, Arai H and Inoue K (1997) Affinity for α-tocopherol transfer protein as a determinant of the biological activities of vitamin E analogs. FEBS Lett 409:105-108]). 최근에 발견된 토코페롤 연합 단백질 (TAP)은 토코페롤 결합에 있어서 유사한 우선성을 나타낸다 ([Yamauchi J, Iwamoto T, Kida S, Masushige S, Yamada K and Esashi T (2001) Tocopherol-associated protein is a ligand-dependent transcriptional activator. Biochem Biophys Res Commun 285:295-299]). 내피 세포에서, 트롬빈-유도된 PKC 활성화 및 엔도텔린 분비는 α-토코페롤에 의해서는 억제되지만 β-토코페롤에 의해서는 억제되지 않는다 ([Martin-Nizard F, Boullier A, Fruchart JC and Duriez P (1998) α-tocopherol but not α-tocopherol inhibits thrombin-induced PKC activation and endothelin secretion in endothelial cells. J Cardiovasc Risk 5:339-345]). α-토코페롤은 전사 수준에서 α-트로포미오신 발현의 상향 조절 ([Aratri E, Spycher SE, Breyer I and Azzi A (1999) Modulation of α-tropomyosin expression by α-tocopherol in rat vascular smooth muscle cells. FEBS Lett 447:91-94]) 및 LDL 제거제 수용체 SR-A 및 CD36의 하향 조절을 야기하지만, β-토코페롤은 효과적이지 않다 ([Ricciarelli R, Zingg JM and Azzi A (2000) Vitamin E reduces the uptake of oxidized LDL by inhibiting CD36 scavenger receptor expression in cultured aortic smooth muscle cells. Circulation 102:82-87], [Devaraj S, Hugou I and Jialal I (2001) α-Tocopherol decreases CD36 expression in human monocyte-derived macrophages. J Lipid Res 42:521-527]). 추가로, 세포 배양시에 γ- 및 δ-토코페롤이 α- 또는 β-토코페롤보다 훨씬 더 신속하게 분해되기 때문에 상기 치환 패턴은 측쇄 분해율과도 관련이 있을 수 있다 ([Birringer M, Drogan D and Brigelius-Flohe R (2001) Tocopherols are metabolized in HepG2 cells by side chain ω-oxidation and consecutive β-oxidation. Free Radic Biol Med 31:226-232]). 4종의 토코페롤 이성질체의 숙시닐화는 화합물 1, 32, 33 및 35를 생성한다. 이것들 중 α-TOS (1)가 세포자멸유도 활성 시험에서 가장 높은 활성을 보유했고, 그 다음은 β-TOS (32), γ-TOS (33) 및 δ-TOS (35) (효과가 가장 적음)라는 것은 놀라운 일이 아니다 ([Birringer M, Drogan D and Brigelius-Flohe R (2001) Tocopherols are metabolized in HepG2 cells by side chain ω-oxidation and consecutive β-oxidation. Free Radic Biol Med 31:226-232]). 일반적으로는 토코페롤 부류 중 보다 고도로 메틸화된 구성원이 가장 강력하지만, 이러한 경향은 토코트리엔올의 경우에는 역전된다 (하기 참조).
짧아진 측쇄를 갖는 수용성 비타민 E 유도체인 트롤록스(Trolox)의 숙시닐화는 세포자멸유도 활성의 완전한 손실을 야기한다. 말단절단된 피톨 측쇄를 보유하는 여러가지 토코페롤 숙시네이트 (표 III, 43, 44, 45)의 SAR 실험은, 측쇄 길이가 2개의 이소프레닐 단위인 유도체 (43, 44)의 경우에 전립선암 세포에서 가장 높은 수준의 세포자멸유도 활성이 달성되었음을 밝혀냈다. 컴퓨터 보조 분자 모델링 및 동시-면역침전 실험은 Bcl-xL 및 Bcl-2에 대한 Bak BH3 펩티드의 결합이 토코페롤 유사체에 의해 억제되었음을 보여주었다 ([Shiau CW, Huang JW, Wang DS, Weng JR, Yang CC, Lin CH, Li C, Chen CS (2006) alpha-Tocopheryl succinate induces apoptosis in prostate cancer cells in part through inhibition of Bcl-xL/Bcl-2 function. J Biol Chem 281:11819-11825]). 항-신생물 활성에 중추적인 요건은 크로마놀 고리의 숙시닐화 및 1개의 이소프레닐 단위의 최소 사슬 길이였다 (42, 46). 또한, 에테르/에스테르 연결된 도메인 III 측쇄를 갖는 일련의 토코페릴 라이신 에스테르 역시 사슬 길이와 IC50 사이의 부정적인 상관관계를 나타냈다 (47 내지 50) ([Arya P, Alibhai N, Qin H, Burton GW, Batist G, You SX and Alaoui-Jamali MA (1998) Design and synthesis of analogues of vitamin E: antiproliferative activity against human breast adenocarcinoma cells. Bioorg Med Chem Lett 8:2433-2438]).
토코트리엔올은 효율적인 항암제이고, 이것의 세포자멸유도 성질은 Ras 부류 단백질의 불활성화와 관련이 있을 수 있다. 토코트리엔올은 기능적 도메인의 변형 없이 이것의 세포자멸유도 활성을 나타낸다. 신호전달 도메인에서의 개념 역시 역전되어, δ-토코트리엔올 (59)이 뮤린(murine) B16-F10 흑색종 세포 모델에서 가장 강력한 작용제가 되게 하고, 그 다음은 γ-토코트리엔올 (56) 및 α-토코트리엔올 (53)이다 (표 IV, [He L, Mo H, Hadisusilo S, Qureshi AA and Elson CE (1997) Isoprenoids suppress the growth of murine B16 melanomas in vitro and in vivo. J Nutr 127:668-674]). 흥미롭게도, 모든 방향족 메틸기가 없는 데스메틸 토코트리엔올 (60)은 훨씬 더 높은 활성을 나타내며 IC50이 0.9 μM이다. 이 화합물은 쌀겨에서 단리되었다 ([Qureshi AA, Mo H, Packer L and Peterson DM (2000) Isolation and identification of novel tocotrienols from rice bran with hypocholesterolemic, antioxidant, and antitumor properties. J Agric Food Chem 48:3130-3140]). Ras 단백질의 막 고정 시스테인 잔기가 공통적인 구조 요소인 파르네실 사슬에 의해 변형되기 때문에 토코트리엔올의 직접적인 억제 작용이 제안된 바 있다. 따라서, Ras 파르네실화 및 RhoA 프레닐화는 활성화 ras 돌연변이를 함유하는 인간 폐 선암종 세포주인 A549 세포에서 토코트리엔올에 의해 억제되었다 ([Yano Y, Satoh H, Fukumoto K, Kumadaki I, Ichikawa T, Yamada K, Hagiwara K and Yano T (2005) Induction of cytotoxicity in human lung adenocarcinoma cells by 6-O-carboxy-propyl-α-tocotrienol, a redox-silent derivative of α-tocotrienol. Int J Cancer 115:839-846]). 토코트리엔올의 짧은 생체내 반감기를 연장시키기 위해 기능적 도메인이 도입되었다. 이러한 변형은 상기 분자의 항-증식 활성도 증진시켰다 (54, 57, 58). 측쇄의 절단 역시 화합물 55에 대해 발견된 것과 유사하게 활성을 개선시켰다.
기능적 도메인에 변형이 가해진 수많은 화합물은 항-증식 활성을 나타내고, 추가의 특수한 성질을 제공한다. 예를 들어, α-토코페릴 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트 (23)는 약물 전달 시스템을 위한 비히클로서 사용되었다. 이 화합물은 누드 마우스에서 이식된 인간 폐 암종 세포에 대해 항암 활성을 갖는 것으로 나타났다. 상기 화합물의 세포자멸 유도 효능은 세포로의 이것의 흡수 증가 때문이 아니라 반응성 산소 종을 생성하는 능력이 증가했기 때문이었다 ([Youk HJ, Lee E, Choi MK, Lee YJ, Chung JH, Kim SH, Lee CH and Lim SJ (2005) Enhanced anticancer efficacy of α-tocopheryl succinate by conjugation with polyethylene glycol. J Control Release 107:43-52]). α-토코페릴 포스페이트 (30)는 토코페롤-관련 신호전달 동안 일어나는 대사로 생성된다고 여겨진다 ([Negis Y, Zingg JM, Ogru E, Gianello R, Libinaki R and Azzi A (2005) On the existence of cellular tocopheryl phosphate, its synthesis, degradation and cellular roles: a hypothesis. IUBMB Life 57:23-25]). 30 및 디-α-토코페릴 포스페이트 (31)의 혼합물은 랫트 대동맥 평활근 세포 및 인간 THP-1 단핵구성 백혈구 세포에서 증식을 억제하였다 ([Munteanu A, Zingg JM, Ogru E, Libinaki R, Gianello R, West S, Negis Y and Azzi (2004) Modulation of cell proliferation and gene expression by α-tocopheryl phosphates: relevance to atherosclerosis and inflammation. Biochem Biophys Res Commun 318:311-316]). 상기 저자들은 토코페릴 숙시네이트 및 토코페릴 말레에이트가 토코페릴 포스페이트를 모방하고 대체하여 세포 신호의 영구적인 활성화를 야기함으로써 암 세포에서 작용할 수 있다고 제안하였다.
올-트랜스(all-trans) 레티노산 (28) 및 9-시스 레티노산 (29) 각각의 2가지 실험적 α-토코페릴 에스테르가 급성 전골수구성 백혈병 세포의 증식을 감소시키는데 사용되었다 ([Makishima M, Umesono K, Shudo K, Naoe T, Kishi K and Honma Y (1998) Induction of differentiation in acute promyelocytic leukemia cells by 9-cis retinoic acid α-tocopherol ester (9-cis tretinoin tocoferil). Blood 91:4715-4726]). 레티노이드 수용체 반응성 리포터 구축물을 사용한 트랜스-활성화 실험은 이들 화합물 2가지 모두가 레티노산 수용체 (RAR)에 대한 작용제로 작용함을 밝혀 내었다. 흔히 소변으로 분비되는 것으로 발견된 γ-토코페롤 분해 생성물인 γ-카르복시에틸 히드록시크로만 (52)은 사이클린 D1 발현을 억제하여 PC-3 전립선암 세포의 세포 증식을 감소시킬 수 있다 ([Galli F, Stabile AM, Betti M, Conte C, Pistilli A, Rende M, Floridi A and Azzi A (2004) The effect of α- and γ-tocopherol and their carboxyethyl hydroxychroman metabolites on prostate cancer cell proliferation. Arch Biochem Biophys 423:97-102]).
정상 세포 미토콘드리아와 비교하여 암 세포에서 공통적으로 관찰될 수 있는 차이는 미토콘드리아 내막의 막횡단 전위 (ΔΨm,i)가 암 세포에서 더 높다는 점이다. 예를 들어, 암 세포 및 이것의 미토콘드리아 내부에서 발생하는 대사 변화로 인해, ΔΨm,i는 암종 세포에서 더 큰 음의 값으로 증가 (-150 내지 -170 mV, 기질 내부에서 음의 값)되며 ([Summerhayes, I.C., Lampidis, T.J., Bernal, S.D., Nadakavukaren, J.J., Nadakavukaren, K.K., Shepherd, E.L. and Chen, L.B. (1982) Unusual retention of rhodamine 123 by mitochondria in muscle and carcinoma cells. Proc Natl Acad Sci USA 79:5292-5296], [Lampidis, T.J., Bernal, S.D., Summerhayes, I.C. and Chen, L.B. 1983. Selective toxicity of rhodamine 123 in carcinoma cells in vitro. Cancer Res. 43:716-720], [Chen, L.B. 1988. Mitochondrial membrane potential in living cells. Annu Rev Cell Biol. 4:155-181], [Modica-Napolitano, J.S. and Aprille, J.R. 1987. Basis for the selective cytotoxicity of rhodamine 123. Cancer Res. 47:4361-4365], [Modica-Napolitano, J.S. and Aprille, J.R. 2001. Delocalized lipophilic cations selectively target the mitochondria of carcinoma cells. Adv Drug Deliv Rev. 49:63-70]) MIM을 사이에 두고 약 60 mV 차이가 있다. 이러한 막 전위 차이에 대한 이유를 설명하기 위해 여러가지가 제안되었다. 분자 수준에서, 이것은 미토콘드리아 호흡 효소 복합체, 전자 수송자, ATPase, ANT 및/또는 막 지질 대사에서의 변화에 있어서의 차이를 포함한다. 암 세포에서의 미토콘드리아 막 전위 증가에 대한 다른 제안은 전자 전달 활성, 양성자 전좌 및 이용, 또는 전도도에 있어서의 변경을 포함한다. 예를 들어, 간세포 암종으로부터 단리된 미토콘드리아는 커플링방지제(uncoupler)-자극된 ATP 가수분해의 감소, 호흡-연계 ATP 합성률의 감소 및 정상 간 세포와 비교되는 인산화 능력의 감소를 나타낸다 ([Pedersen, P.L. and Morris, H.P. 1974. Uncoupler stimulated adenosine triphosphatase activity. Deficiency in intact mitochondria from Morris hepatomas and ascites tumor cells. J Biol Chem. 249:3327-3334], [Capuano, F., Varone, D., D'Eri, N., Russo, E., Tommasi, S., Montemurro, S., Prete, F. and Papa, S. 1996. Oxidative phosphorylation and F0F1 ATP synthase activity of human hepatocellular carcinoma. Biochem Mol Biol Int. 38:1013-1022], [Capuano, F., Guerrieri, F. and Papa, S. 1997. Oxidative phosphorylation enzymes in normal and neoplastic cell growth. J Bioenerg Biomembr. 29:379-384], [Cuezva, J.M., Ostronoff, L.K., Ricart, J., Lopez de Heredia, M., Di Ligero, C.M. and Izquierdo, J.M. 1997. Mitochondrial biogenesis in the liver during development and oncogenesis. J Bioenerg Biomembr. 29:365-377]).
효소 기능, 특히 ATPase에 있어서의 뚜렷한 변화는 암 세포 미토콘드리아에서 발생하는 것으로 나타났다. 따라서, 암종으로부터 단리된 ATPase 제제는 최대 속도의 감소, 미토콘드리아 ATPase F1 성분의 β 서브유닛의 면역검출가능한 수준의 감소 및/또는 ATPase 억제제 단백질 (IF1)의 과발현을 나타낸다 ([Pedersen, P.L. and Morris, H.P. 1974. Uncoupler stimulated adenosine triphosphatase activity. Deficiency in intact mitochondria from Morris hepatomas and ascites tumor cells. J Biol Chem. 249:3327-3334], [Capuano, F., Varone, D., D'Eri, N., Russo, E., Tommasi, S., Montemurro, S., Prete, F. and Papa, S. 1996. Oxidative phosphorylation and F0F1 ATP synthase activity of human hepatocellular carcinoma. Biochem Mol Biol Int. 38:1013-1022], [Capuano, F., Guerrieri, F. and Papa, S. 1997. Oxidative phosphorylation enzymes in normal and neoplastic cell growth. J Bioenerg Biomembr. 29:379-384], [Cuezva, J.M., Ostronoff, L.K., Ricart, J., Lopez de Heredia, M., Di Ligero, C.M. and Izquierdo, J.M. 1997. Mitochondrial biogenesis in the liver during development and oncogenesis. J Bioenerg Biomembr. 29:365-377] (문헌 [Modica-Napolitano, J.S. and Singh, K. 2002. Mitochondria as targets for detection and treatment of cancer. Expert Rev Mol Med. 2002:1-19]에서 검토됨). ATP 생성을 위해 양성자 구배를 사용하는 능력의 감소 및 이로 인한 MIM 내 양성자 축적이 종양 미토콘드리아에 존재하는 더 높은 ΔΨm,i를 설명한다. 암 세포 내 더 높은 ΔΨm,i를 설명할 수 있는 또다른 가능성은, 아세토인에서 ATP 의존적 반응이 일어나면서 종양 세포에서 거의 2배의 반응 속도로 시트레이트가 생성되고 ([Baggetto, L.G. and Lehninger, A.L. 1987. Isolated tumoral pyruvate dehydrogenase can synthesize acetoin which inhibits pyruvate oxidation as well as other aldehydes. Biochem Biophys Res Commun. 145:153-159], [Baggetto, L.G. and Testa-Parussini, R. 1990. Role of acetoin on the regulation of intermediate metabolism of Ehrlich ascites tumor mitochondria: its contribution to membrane cholesterol enrichment modifying passive proton permeability. Arch Biochem Biophys. 283:241-248]), 이후에 이것이 트리카르복실레이트 또는 시트레이트 수송자 (CIC)에 의해 시토졸로 배출되어 여기서 옥살로아세테이트 및 아세틸-coA로 절단되는 것이다. 이것의 순 효과는 스테롤 생합성을 위한 세포질 아세틸-coA 전구체를 높은 수준으로 제공하며, 특히 이미 증가된 암 세포 콜레스테롤 생성 촉진을 돕는다 ([Baggetto, L.G. and Testa-Parussini, R. 1990. Role of acetoin on the regulation of intermediate metabolism of Ehrlich ascites tumor mitochondria: its contribution to membrane cholesterol enrichment modifying passive proton permeability. Arch Biochem Biophys. 283:241-248]). 이로 인한 내막 MIM에서의 콜레스테롤 축적은 이것들의 수동적인 양성자 투과성을 수배 감소시키면서, 암 세포 내 더 높은 막횡단 전위의 확립을 돕는다 ([Baggetto, L.G. and Testa-Parussini, R. 1990. Role of acetoin on the regulation of intermediate metabolism of Ehrlich ascites tumor mitochondria: its contribution to membrane cholesterol enrichment modifying passive proton permeability. Arch Biochem Biophys. 283:241-248], [Baggetto, L.G. 1992. Deviant energetic metabolism of glycolytic cancer cells. Biochimie. 74:959-974]).
매우 높은 에너지 요구로 인해 증진된 해당 활성은 암 세포에서 락트산 생성의 세포질 수준을 증가시킨다. 시토졸의 중성 pH를 유지하기 위해서, 이들 세포는 원형질막 양성자 펌프를 활성화하여 세포외 산성화를 야기한다. 전형적으로, 정상 조직 간질의 pH가 중성인 반면에 종양 간질의 pH는 6.2 내지 6.5이다 ([Gerweck, L.E. 2000. The pH difference between tumor and normal tissue offers a tumor specific target for the treatment of cancer. Drug Resist Updat. 3:49-50], [Gerweck, L.E., Vijayappa, S. and Kozin, S. 2006. Tumor pH controls the in vivo efficacy of weak acid and base chemotherapeutics. Mol Cancer Ther. 5:1275-1279]). 암 세포가 그의 중성 시토졸 pH를 유지하기 위해 사용하는 주요한 유형의 양성자 펌프는 클래스 V ATPase이다 ([Sennoune, S.R., Luo, D. and Martinez-Zaguilan, R. 2004. Plasmalemmal vacuolar-type H+-ATPase in cancer biology. Cell Biochem Biophys. 40:185-206]). 상기 ATPase는 비-악성 세포에서는 상대적으로 낮은 활성을 갖지만, 암 세포에서는 이것의 활성이 증가된다 ([Izumi, H., Torigoe, T., Ishiguchi, H., Uramoto, H., Yoshida, Y., Tanabe, M., Ise, T., Murakami, T., Yoshida, T., Nomoto, M. and Kohno, K. 2003. Cellular pH regulators: potentially promising molecular targets for cancer chemotherapy. Cancer Treat Rev. 29:541-549], [Bowman, E.J. and Bowman, B.J. 2005. V-ATPases as drug targets. J Bioenerg Biomembr. 37:431-435]). 이러한 관찰로 인해, ATPase의 양성자 펌핑 활성을 억제하여 암 세포 시토졸을 산성화시켜서 세포를 사멸시키는 새로운 항암 전략이 개발되었다. 예를 들어, 콘드롭신 화합물 ([Bowman, E.J., Gustafson, K.R., Bowman, B.J. and Boyd, M.R. 2003. Identification of a new chondropsin class of antitumor compound that selectively inhibits V-ATPases. J Biol Chem. 278:44147-44152]) 및 ATPase 서브유닛 ATP6L을 표적화하는 siRNA ([Lu, X., Qin, W., Li, J., Tan, N., Pan, D., Zhang, H., Xie, L., Yao, G., Shu, H., Yao, M., Wan, D., Gu, J. and Yang, S. (2005) The growth and metastasis of human hepatocellular carcinoma xenografts are inhibited by small interfering RNA targeting to the subunit ATP6L of proton pump. Cancer Res. 65:6843-6849])가 암 세포 사멸에 성공적으로 이용된 바 있다. 시토졸 pH의 다른 중요 조절자는 Na+/H+ 역방향수송자(antiporter) ([Slepkov, E.R., Rainey, J.K., Sykes, B.D. and Fliegel, L. 2007. Structural and functional analysis of the Na+/H+ exchanger. Biochem J. 401:623-633]), H+/락테이트 동일방향수송자(symporter) ([Cardone, R.A., Casavola, V. and Reshkin, S.J. 2005. The role of disturbed pH dynamics and the Na+/H+ exchanger in metastasis. Nat Rev Cancer. 5:786-795]), 및 Na+-의존적 Cl-/HCO3- 교환자 ([Lee, A.H. and Tannock, I.F. 1998. Heterogeneity of intracellular pH and of mechanisms that regulate intracellular pH in populations of cultured cells. Cancer Res. 58:1901-1908])이다. V-클래스 ATPase와 유사하게, 이들 수송자는 항암 약물을 위한 표적으로 제안된 바 있다 ([Izumi, H., Torigoe, T., Ishiguchi, H., Uramoto, H., Yoshida, Y., Tanabe, M., Ise, T., Murakami, T., Yoshida, T., Nomoto, M. and Kohno, K. 2003. Cellular pH regulators: potentially promising molecular targets for cancer chemotherapy. Cancer Treat Rev. 29:541-549], [Cardone, R.A., Casavola, V. and Reshkin, S.J. 2005. The role of disturbed pH dynamics and the Na+/H+ exchanger in metastasis. Nat Rev Cancer. 5:786-795], [Harguindey, S., Orive, G., Luis Pedraz, J., Paradiso, A. and Reshkin, S.J. 2005. The role of pH dynamics and the Na+/H+ antiporter in the etiopathogenesis and treatment of cancer. Two faces of the same coin - one single nature. Biochim Biophys Acta. 1756:1-24]).
암 세포 원형질막을 가로지르는 pH 구배 차이를 이용하여, pKa 값 < 6를 갖는 약산으로 분류될 수 있고 전형적으로 중성 pH에서는 탈양성자화되지만 종양 간질의 pH에서는 양성자를 받는 약물 부류가 디자인된 바 있다 ([Gerweck, L.E., Vijayappa, S. and Kozin, S. 2006. Tumor pH controls the in vivo efficacy of weak acid and base chemotherapeutics. Mol Cancer Ther. 5:1275-1279]). 이러한 약물의 원형 예는 약산 클로르암부실이다 ([Skarsgard, L.D., Chaplin, D.J., Wilson, D.J., Skwarchuk, M.W., Vinczan, A. and Kristl, J. 1992. The effect of hypoxia and low pH on the cytotoxicity of chlorambucil. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 22:737-741]). 클로르암부실의 상대적으로 선택적인 흡수 및 항암 효능은 실험적 종양이 있는 마우스에게 글루코스를 주사하여 증진될 수 있고, 이에 의해 추가로 종양 세포의 해당 활성을 촉진시키고 종양 간질 pH를 저하시키지만 종양 세포 시토졸의 pH에는 영향을 주지 않는다는 것이 보고되었다 ([Kozin, S.V., Shkarin, P. and Gerweck, L.E. (2001) The cell transmembrane pH gradient in tumors enhances cytotoxicity of specific weak acid chemotherapeutics. Cancer Res. 61:4740-4743]).
본 발명자들은 pKa 5.6의 화합물인 미토칸 α-토코페릴 숙시네이트 (α-TOS)에서 유사한 효과를 관찰한 바 있다 ([Neuzil, J., Zhao, M., Ostermann, G., Sticha, M., Gellert, N., Weber, C., Eaton, J.W. and Brunk, U.T. 2002 α-Tocopheryl succinate, an agent with in vivo anti-tumour activity, induces apoptosis by causing lysosomal instability. Biochem J. 362:709-715]). 비타민 E 유사체는 약산이고, 이것의 약 98％는 중성 pH에서 탈양성자화되는데, 종양 간질의 pH 6.2 내지 6.4의 산성 pH에서는 양성자화된 형태가 10배 내지 15배 더 높은 백분률이다. α-TOS와 같은 화합물에 대한 수송자는 알려진 것이 없기 때문에, 이것은 세포 내부로의 자유 확산을 통해 원형질막을 가로질러서 그의 세포자멸유도 활성을 나타내는 것으로 추정된다. 따라서, 본 발명자들은 조직 배양 배지의 pH가 보다 산성 (pH 약 6.2)인 경우에는 pH 7.2의 배지에 비하여 T 림프종 세포에 대항한 α-TOS의 세포자멸유도 효능이 약 3배 더 높아진다는 것을 발견하였다. 이에 관한 가능한 이유는, 배지의 pH가 7.4인 경우에 비해 pH 6.2에서는 α- TOS가 약 2배 많이 흡수되기 때문에 pH가 낮을 수록 화합물의 흡수가 더 신속하기 때문이다 ([Neuzil, J., Zhao, M., Ostermann, G., Sticha, M., Gellert, N., Weber, C., Eaton, J.W. and Brunk, U.T. 2002 α-Tocopheryl succinate, an agent with in vivo anti-tumour activity, induces apoptosis by causing lysosomal instability. Biochem J. 362:709-715]). 따라서, 종양 원형질막을 가로지르는 pH 차등성은 특정 항암제가 악성 조직에 대한 선택성을 나타내게 하는, 표적화된 전달을 위한 중요한 패러다임일 수 있다.
표 I에 기재된 6번째 부류의 미토칸은 세포의 세포질에서보다 미토콘드리아 기질(matrix)에서 훨씬 더 높은 농도로 축적되는 편재되지 않는 친지성 양이온인 분자를 포함한다 ([Smith, R.A., Porteous, C.M., Gane, A.M. and Murphy, M.P. 2003. Delivery of bioactive molecules to mitochondria in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 100:5407-5412]). 이러한 제제(agent)는 암 세포의 미토콘드리아 기질 내에 선택적으로 축적되는데, 이는 비-악성 세포에서보다 원형질막을 가로지르는 막횡단 전위가 더 높을 뿐만이 아니라 미토콘드리아가 더 분극화되어서 훨씬 더 높은 Δψm,i를 갖기 때문이다 ([Davis, S., Weiss, M.J., Wong, J.R., Lampidis, T.J. and Chen, L.B. 1985. Mitochondrial and plasma membrane potentials cause unusual accumulation and retention of rhodamine 123 by human breast adenocarcinoma-derived MCF-7 cells. J Biol Chem. 260:13844-13850], [Lampidis, T.J., Hasin, Y., Weiss, M.J. and Chen, L.B. 1985. Selective killing of carcinoma cells "in vitro" by lipophilic-cationic compounds: a cellular basis. Biomed Pharmacother. 39:220-226], [Ralph, S.J., Low, P., Dong, L., Lawen, A. and Neuzil, J. 2006. Mitocans: mitochondrial targeted anticancer drugs as improved therapies and related patent documents. Recent Patents Anti-cancer Drug Discovery 1:327-346]).
친지성 양이온-기재의 미토칸에 대한 표적은 ATPase의 억제 결합 부위 중 하나일 수 있다 ([Gledhill, J.R. and Walker, J.E. 2005. Inhibition sites in F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Biochem J. 386:591-598]). 이러한 부류의 화합물 중 항암 활성이 확인된 가장 초기 구성원 중 하나는 로다민-123이었다 ([Bernal, S.D., Lampidis, T.J., Summerhayes, I.C. and Chen, L.B. 1982. Rhodamine-123 selectively reduces clonal growth of carcinoma cells in vitro. Science 218:1117-1119], [Bernal, S.D., Lampidis, T.J., McIsaac, R.M. and Chen, L.B. 1983. Anticarcinoma activity in vivo of rhodamine 123, a mitochondrial-specific dye. Science 222:169-172]). 이것은 최근에 전립선암에 대한 제I상 임상 실험에 들어갔고, 1개월씩의 간격에서 부작용이 최소이고 안전한 투여가 이루어지며 환자의 혈청 중에 검출가능한 약물 축적이 없다는 것이 밝혀졌다 ([Jones, L.W., Narayan, K.S., Shapiro, C.E. and Sweatman, T.W. 2005. Rhodamine-123: therapy for hormone refractory prostate cancer, a phase I clinical trial. J Chemother. 17:435-440]). 관련 화합물인 로즈 벵갈(Rose Bengal)은 로다민-123과 유사한 방식으로 작용하고, 로즈 벵갈 역시 최근에 전이성 흑색종 및 재발성 유방암을 위한 요법으로서의 임상 실험에 들어가 일부 환자에서 완전한 차도를 유도하였다 (Provectus PV-10-MM-01, www.ClinicalTrials.gov).
약물 F16은 이러한 미토칸 부류 중 기계적으로 보다 잘 특징규명된 예이고, ROS 생성을 증가시키고 약한 양성자단으로서 미토콘드리아를 탈분극화하며 Δψm,i를 붕괴시켜서 마이크로몰 농도 범위로 적용시에 암 세포의 미토콘드리아 투과성 전이를 야기하고 암 세포의 선택적 세포자멸을 일으키는 것으로 나타났다 ([Fantin, V.R., Berardi, M.J., Scorrano, L., Korsmeyer, S.J. and Leder, P. (2002) A novel mitochondriotoxic small molecule that selectively inhibits tumor cell growth. Cancer Cell 2:29-42]). F16은 또한 상기 연구에서 마우스에서의 유방 종양의 성장을 억제하는 것으로 보고되었다. 로도시아닌 염료 유사체인 MKT-077은 제I상 임상 실험에 들어간 이러한 유형의 미토칸의 또다른 예이지만, 이러한 실험은 신장 독성으로 인해 종결되었다 ([Britten, C.D., Rowinsky, E.K., Baker, S.D., Weiss, G.R., Smith, L., Stephenson, J., Rothenberg, M., Smetzer, L., Cramer, J., Collins, W., Von Hoff, D.D. and Eckhardt, S.G. 2000. A phase I and pharmacokinetic study of the mitochondrial-specific rhodacyanine dye analog MKT 077. Clin Cancer Res. 6:42-49]).
이것은 많은 클래스 VI 미토칸에서 독성 문제를 증가시켰다. 주의깊게 평가되어야 하는 독성 가능성의 조심스러운 예는 약물 MPTP (1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘)에 의한 파킨슨-유사 효과의 생성으로, 흑질선조체의 도파민성 뉴론의 선택적 파괴에 의해 야기된다. 이러한 독성은 이들 세포에서 도파민 수송자에 의한 선택적 흡수 및 또한 도파민성 뉴론에서 고도로 발현되는 효소인 모노아민 옥시다제 B의 작용으로 형성되는 대사물질에 의한 것이었다. 도파민성 뉴론의 이러한 2가지 독특한 성질로 인해서, 복합체 I의 NADH-유비퀴논 옥시도리덕타제 부위를 차단함으로써 미토콘드리아 호흡의 억제제로서 작용하는 미토콘드리아독성 약물 MPP+ (1-메틸-4-페닐피리디늄)이 생성된다. MPP+는 Δψm,i를 붕괴시켜서 세포 파괴를 야기하는 양성자단일 수도 있다 ([Davey, G.P., Tipton, K.F. and Murphy, M.P. 1992. Uptake and accumulation of 1-methyl-4-phenylpyridinium by rat liver mitochondria measured using an ion-selective electrode. Biochem J. 288:439-443], [Albores, R., Neafsey, E.J., Drucker, G., Fields, J.Z. and Collins, M.A. 1990. Mitochondrial respiratory inhibition by N-methylated β-carboline derivatives structurally resembling N-methyl-4-phenylpyridine. Proc Natl Acad Sci USA 87:9368-9372]). 이것은 또다른 친지성 양이온 및 공지의 미토콘드리아 독인 데쿠알리늄 클로라이드 ([Gamboa-Vujicic, G., Emma, D.A., Liao, S.Y., Fuchtner, C. and Manetta, A. 1993. Toxicity of the mitochondrial poison dequalinium chloride in a murine model system. J Pharm Sci. 82:231-235])와 관련된 비-선택적 세포 독성과 더불어 흡수 및 세포 독성의 면에서 암 세포-특이적인 클래스 VI 미토칸 동정의 중요성을 증가시키며, 이는 Trapp, S. 및 Horobin, R.W. 에 의한 이것의 구조를 기초로 한 예측 모델에서 최근 기재된 바와 같다 [2005. A predictive model for the selective accumulation of chemicals in tumor cells. Eur Biophys J. 34:959-966].
양친매성 및 양으로 대전된 α-나선 세포자멸유도 펩티드 (KLAKLAK)2 역시 편재되지 않는 친지성 양이온으로서 이러한 부류의 미토칸에 포함되었다. 그러나, 상기 펩티드는 표면 수용체 결합 및 암 세포로의 흡수를 위해서 표적화된 전달 시스템에 먼저 커플링되어야 미토칸으로 기능할 수 있다 ([Ellerby, H.M., Arap, W., Ellerby, L.M., Kain, R., Andrusiak, R., Rio, G.D., Krajewski, S., Lombardo, C.R., Rao, R., Ruoslahti, E., Bredesen, D.E. and Pasqualini, R. 1999. Anti-cancer activity of targeted pro-apoptotic peptides. Nat Med. 5:1032-1038], [Fantin et al. 2005]). 이러한 클래스의 미토칸의 다른 구성원과 마찬가지로, 상기 펩티드는 Δψm,i를 소멸시켜서 세포자멸을 야기하는 것으로 나타났고, 이것은 동물 모델에서 종양 부하를 효율적으로 감소시켰다 ([Fantin, V.R., Berardi, M.J., Babbe, H., Michelman, M.V., Manning, C.M. and Leder, P. 2005. A bifunctional targeted peptide that blocks HER-2 tyrosine kinase and disables mitochondrial function in HER-2-positive carcinoma cells. Cancer Res. 65:6891-6900]).
발명의 요약
본 발명에 이르러, 본 발명자들은 암성 세포의 미토콘드리아 내에 축적되고 상기 세포의 사멸을 유도하는 경향이 있는 항암 화합물을 개발하였다. 한 실시양태에서, 이러한 화합물은 미토콘드리아 전달 잔기에 부착된 산화촉진 잔기를 포함한다. 산화촉진 잔기는 암성 세포의 미토콘드리아 내에 반응성 산소 종을 생성하고 상기 세포의 사멸을 유도한다. 또다른 실시양태에서, 이러한 화합물은 미토콘드리아 전달 잔기에 부착된 세포자멸유도 잔기를 포함한다. 세포자멸유도 잔기는 상기 세포의 사멸을 유도한다.
도 1. 연구에 사용된 화합물.
사용된 화합물은 α-TOH, α-TOS, VE11S (이하, "VES"라고 지칭함), MitoVE3S, MitoVE5S, MitoVE7S, MitoVE9S 및 MitoVE11S (이하, "MitoVES"라고 지칭함), MitoVE11AE (이하, "MitoVEAE"라고 지칭함), MitoVE11F [나타내지 않음] (이하, "MitoVEF"라고 지칭함), MitoVE11M [나타내지 않음] (이하, "MitoVEM"이라고 지칭함) 및 VES4TPP였다. α-TOH 및 α-TOS는 시그마(Sigma)로부터 구하였고, VES, MitoVES, MitoVEAE, MitoVEF, MitoVEM 및 VES4TPP는 '일반적인 재료 및 방법'이라는 제목의 섹션에 기재한 바와 같이 하여 합성하였다.
도 2. MitoVES 는 악성 세포에서 세포자멸을 선택적으로 야기함.
주캐트(Jurkat) (A, G), HCT-116 (B), MCF-7 (C), MDA-MB-453 (D) 및 Meso-2 세포 (E)를 1 내지 50 μM 농도의 MitoVES (A 내지 F) 또는 50 μM의 VES4TPP 또는 α-TOS (B)에 노출시켰다. 나타낸 시점에 상기 세포를 수거하여 세포자멸에 대해 평가하였다. 패널 H는 A014578 및 나타낸 시간 동안의 40％ 전면성장을 보여주며, 세포자멸에 대해 평가하였다. 패널 J는 대조군 주캐트 세포 또는 50 μM α-TOS 또는 5 μM MitoVES에 노출시킨 세포의 TEM을 보여준다 (위쪽 패널은 더 낮은 배율이고, 아래쪽 패널은 더 높은 배율임). 나타낸 세포자멸 데이타는 3회의 독립적인 실험으로부터 도출된 것이고 평균 값±S.D.로 제시하였으며, 현미경사진은 3회 이상의 독립적인 실험에서 얻은 대표적인 영상이다.
도 3. MitoVES 에 의해 촉발된 세포자멸은 ROS 및 내재적 경로에 의존적임.
3A - 전자 상자성 공명 분광법 (EPR) (좌측 패널)로 측정하고 형광 염료 지시자 DMPO (우측 패널)를 사용하여 측정한, MitoVES에 의해 유도된 산소 라디칼의 생성.
3B - 모, Bax-/- 및 Bax-/-/Bak-/- 주캐트 세포를 50 μM의 α-TOS (T) 및 5 μM의 MitoVES (M)에 노출시키고 세포자멸을 평가함.
도 4. MitoVES 는 미토콘드리아 내막에 축적되고 복합체 II 의 조효소 Q 결합 부위를 방해함.
4A - Ras-형질전환된 B1, B9 및 B10 차이니스 햄스터 폐 섬유아세포 세포주의 hSDHC 및 chSDHC mRNA 발현에 관한 RT-PCR.
4B - 나타낸 단백질 발현 수준을 검출하기 위한 관련 항체를 사용한, B1, B9 및 B10 차이니스 햄스터 폐 섬유아세포 세포주의 웨스턴 블럿팅 분석. 이 결과는 Ras 및 GFP 융합 단백질 발현에 양성인 클론 선별된 Ras 형질전환된 B1Ras 및 B9Ras-SDHC 하위집단 세포주에서 얻은 것이고, 형질전환되지 않은 모 B1, B9 및 B10 세포로부터의 샘플과 비교하였다.
4C - 복합체 II 표적화 약물 TTFA 또는 MitoVES를 처리한 지 24시간 후, Ras 형질전환된 B1 및 B9 세포를 안넥신 V(Annexin V) 결합 방법을 이용하여 세포자멸에 대해 평가하였다.
도 5. 복합체 II 에서 MitoVES 결합의 분자 모델링 .
오토도크(AutoDock) ([Morris G M, Goodsell DS, Halliday RS, Huey R, Hart W E, Belew RK, Olson AJ (1998) Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and empirical binding free energy function. J Comp Chem 19:1639-1662]) 및 아스텍스 뷰어(Astex Viewer) ([Hartshorn MJ (2002) AstexViewer™: An aid for structure-based drug design. J Computer Aided Mol Des 16:871-881])를 사용하여 생성한, MitoVES (막대 그림 구조로 나타냄)를 갖는 복합체 II의 공간 충전 모델. 복합체 II의 사슬 B (철-황 단백질)의 표면 및 사슬 C 및 D (막횡단 부분)의 표면을 나타내었으나, 사슬 A (플라빈단백질-숙시네이트 리덕타제)는 나타내지 않았다.
도 6. MitoVES 는 ROS 의 축적으로 인해 증식 중인 내피 세포에서는 세포자멸을 야기하지만 정지된 내피 세포에서는 그렇지 않음.
모 EAhy926 세포는 철야 회복 이후에 약 50％ 또는 100％ 전면성장이 되도록 24웰 플레이트에 접종하였으나, 이것의 ρ0 대응물은 50％ 전면성장되도록 접종하였다. 이어서, 증식 중인 세포 및 전면성장 세포를 나타낸 농도의 MitoVES에 나타낸 시간 동안 노출시키고, 안넥신 V-결합 방법을 통해 세포자멸 수준에 대해 평가 (A)하고, 형광 프로브 DHE를 사용하여 ROS 축적에 대해 평가 (B)하였다. 패널 A에서의 삽입도는 증식 중인 EAhy926 세포 및 전면성장 EAhy926 세포에서의 세포 주기 교란을 보여준다. 패널 C는 EPR 분광법을 이용하여 증식 중인 EAhy926 세포 및 전면성장 EAhy926 세포에서의 ROS 축적을 보여준다.
도 7. MitoVES 는 혈관신생을 시험관내 억제함.
창상 치유 활성 (A 내지 F) 및 튜브 형성 활성 (G, H)을 EC EAhy926 세포를 사용하여 평가하였다. 창상 치유 활성의 경우, 상기 세포를 35 mm 페트리(Petri) 디쉬에 접종하고 100％ 전면성장에 도달하게 하였다. 이어서, '상해'를 가하여 0.4 내지 0.5 mm의 틈을 두고 벗겨지게 했다. 세포 증식 및 상기 벗겨진 영역으로의 세포 이동을 기초로 하여 격자 및 디지탈 카메라가 장착된 광학 현미경을 사용하여, 대조군 세포 및 1, 5 또는 10 μM MitoVES가 보충된 세포에서의 창상 치유 활성을 평가하였다 (A). 패널 B는 상해 20시간 후 대조군 배양물 및 10 μM MitoVES에 노출시킨 세포에 대하여 고정된 EC 영역에서의 세포 형태를 보여준다. 패널 C에서는, 상해를 가한 대조군 세포 및 10 μM MitoVES를 처리한 세포에 대하여 상이한 시점에서의 대표적인 영상을 제시한다. 패널 D는 패널 A의 개개의 곡선의 기울기로부터 유도한, 상이한 조건에 대한 치유율을 보여준다. 패널 E에서는, 상해 20시간 후 대조군 배양물 및 MitoVES에 노출시킨 세포에 대한 세포자멸의 수준을 보여준다. EAhy926 세포를 매트리겔(Matrigel)-코팅된 24웰 플레이트에서 웰 1개 당 약 105개로 접종하고, 24시간 동안 MitoVES 없이 또는 MitoVES 존재하에 튜브가 형성되도록 하였다. 개개의 다각형 점을 연결하는 완전한 모세관의 수 (일반적인 재료 및 방법 참조)를 0.16 mm2의 구역마다 계수하고 튜브-형성 활성을 결정하였다 (F). 패널 G는 대조군 세포 및 20시간 동안 5 μM MitoVES를 처리한 세포의 매트리겔 배양물의 대표적인 영상을 보여준다. 처리하고 20시간이 지난 후에 상기 세포를 매트리겔로부터 회수하고, 안넥신 V 결합 방법을 이용하여 세포자멸에 대해 평가하였다 (H). 모 EAhy926 세포 및 이것의 ρ0 대응물을 페트리 디쉬에 전면성장 상태로 접종하여 상기한 바와 같은 '상해'를 가하고, 창상 치유 활성을 10 μM MitoVES (MVES) 없이 또는 이것의 존재하에 평가하였다 (I) (패널 L의 위쪽에 나타낸 부호 참조). 패널 I에서의 기울기로부터 치유율을 추정하고, mmol/시간으로 플롯팅하였다 (J). 제20시간에, 세포를 세포자멸 수준에 대해 평가하였다 (K). 패널 L은 5 μM MitoVES 없이 또는 이것의 존재하에 매트리겔에서 ρ0 EAhy 926 세포의 튜브 형성 활성을 보여준다. 나타낸 데이타는 3회의 독립적인 실험으로부터 도출된 것이고 평균 값±S.D.로 제시하였으며, 현미경사진은 3회 이상의 독립적인 실험의 대표적인 영상이다.
도 8. MitoVES 는 암 줄기 세포가 풍부한 인간 유방암 세포주 MCF7 의 집단을 사멸시키는데 있어서 고도로 효과적인 약물임.
부착성 MCF7 세포 및 상응하는 맘모스피어(mammosphere) 세포 (MS)를 배양하고, 현미경을 사용하여 형태적 변화를 평가하고 (A), RT-PCR (B) 및 유동세포계측법 (C)으로 "줄기성(stemness)"의 지시자로서의 마커의 발현 수준을 평가하였고, CD44 및 CD24의 발현 (D)을 포함시켰다. 부착성 MCF7 세포 (E) 및 MS 세포 (F)에 5 μM MitoVES, 50 μM α-TOS 또는 10 μM 파르테놀리드를 처리하고, 약물 유도된 세포 사멸에 대한 이것들의 감응성을 평가하였다. 패널 G는 MitoVES에 노출시킨 MS 세포에서 세포자멸에 의한 세포 사멸의 초기 수준을 보여주고, 패널 H는 5 μM MitoVES에 3시간 동안 노출시킨 후에 안넥신 V-FITC 결합에 대해 분석한 MS 세포의 히스토그램 분석을 보여준다. 부착성 MCF7 세포 (I) 및 MS 세포 (J)에 α-TOS (50 μM) 또는 상이한 길이의 지방족 측쇄를 함유하는 MitoVES 동족체 (각각 5 μM씩. 길이: 11개, 7개 또는 5개 탄소의 쇄)를 3시간 동안 처리하고, 상기 처리된 세포를 유동세포계측법으로 반응성 산소 종 (ROS)의 생성에 대해 평가하였다.
도 9. MitoVES 처리는 트랜스제닉 FVB /N c- neu 마우스에서 자발적인 도관 유방 암종을 형성하는 유방암 종양의 진행을 완전히 차단함.
자발적인 작은 유방 암종을 갖는 트랜스제닉 FVB/N c-neu 암컷 마우스에게 마우스 1 마리 당 1회 투여마다 3 μmol의 MitoVES를 처리하였고, 종양 부피를 반복적인 초음파 영상화, 수주에 걸친 종양 성장의 모니터링으로 평가하였다.
본 발명의 제1 측면에 따라,
(i) 암성 세포의 미토콘드리아 내에서 반응성 산소 종을 생성하고 (ii) 암성 세포의 세포자멸을 유도하는 산화촉진 잔기, 및
산화촉진 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
를 포함하는, 암성 세포의 사멸 유도 화합물이 제공된다.
본 발명의 제2 측면에 따라,
(i) 암성 세포의 미토콘드리아 내에서 반응성 산소 종을 생성하고 (ii) 암성 세포의 세포자멸을 유도하는 산화촉진 잔기, 및
산화촉진 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
를 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위한 화합물이 제공된다.
본 발명의 제3 측면에 따라,
(i) 암성 세포의 미토콘드리아 내에서 반응성 산소 종을 생성하고 (ii) 암성 세포의 세포자멸을 유도하는 산화촉진 잔기, 및
산화촉진 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
를 포함하는 치료 유효량의 화합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암성 세포의 사멸 유도 방법이 제공된다.
본 발명의 제4 측면에 따라,
(i) 암성 세포의 미토콘드리아 내에서 반응성 산소 종을 생성하고 (ii) 암성 세포의 세포자멸을 유도하는 산화촉진 잔기, 및
산화촉진 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
를 포함하는 치료 유효량의 화합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 제5 측면에 따라, 암성 세포의 사멸을 유도하는 의약의 제조에 있어서,
(i) 암성 세포의 미토콘드리아 내에서 반응성 산소 종을 생성하고 (ii) 암성 세포의 세포자멸을 유도하는 산화촉진 잔기, 및
산화촉진 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
를 포함하는 화합물의 용도가 제공된다.
본 발명의 제6 측면에 따라, 암을 예방하거나 치료하는 의약의 제조에 있어서,
(i) 암성 세포의 미토콘드리아 내에서 반응성 산소 종을 생성하고 (ii) 암성 세포의 세포자멸을 유도하는 산화촉진 잔기, 및
산화촉진 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
를 포함하는 화합물의 용도가 제공된다.
본 발명의 제7 측면에 따라, 본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 염, 및 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 또는 수의학적 조성물이 제공된다.
상기 화합물은 단리된 형태, 정제된 형태, 실질적으로 정제된 형태, 합성 또는 재조합 형태일 수 있다.
임의의 적합한 유형의 전달 잔기가 사용될 수 있다. 전달 잔기는 산화촉진 잔기를 미토콘드리아의 막 사이 공간, 내막 또는 미토콘드리아 기질로 표적화할 수 있지만, 전달 잔기는 산화촉진 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아 기질로 전달하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 전달 잔기는 암성 세포의 높은 막 전위로 인해 암성 세포의 미토콘드리아 기질 내에 선택적으로 축적되는 친지성 양이온이다. 특히 바람직한 친지성 양이온은 국제 특허 출원 제PCT/NZ98/00173호 및 동 제PCT/NZ02/00154호의 명세서 및 문헌 [James AM, Cocheme HM, Smith RA, Murphy MP. (Interactions of mitochondria-targeted and untargeted ubiquinones with the mitochondrial respiratory chain and reactive oxygen species. Implications for the use of exogenous ubiquinones as therapies and experimental tools. J Biol Chem. 2005 Jun 3;280(22):21295-312. Epub 2005 Mar 23.] (이것들의 전체 내용은 본원에 상호 참조로 포함됨)에 기재된 트리페닐포스포늄 양이온이다.
테트라페닐포스포늄 양이온은 적합한 전달 잔기의 또다른 예이다.
적합한 전달 잔기의 다른 예는 Barnard 등의 간행물 [Barnard PJ, Baker MV, Berners-Price SJ, Day DA. Mitochondrial permeability transition induced by dinuclear gold(I)-carbene complexes: potential new antimitochondrial antitumour agents. J. Inorg. Biochem. 2004 Oct;98(10):1642-7] (이것의 전체 내용은 본원에 상호 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 금-포스핀 또는 금-카빈 착체를 잠재적으로 포함한다.
적합한 전달 잔기의 다른 예는 문헌 [Hoye, Adam T., Davoren, Jennifer E., Wipf, Peter, Fink, Mitchell P., and Kagan, Valerian E., (Targeting Mitochondria, Acc. Chem. Res., 41, 1, 87-97, 2008)]에 기재되어 있다.
임의의 적합한 유형의 산화촉진 잔기가 사용될 수 있고, 상기 잔기는 임의의 적합한 방식으로 반응성 산소 종을 생성할 수 있다. 바람직한 산화촉진 잔기 (미토칸)의 예는 상기 표 I에 기재되어 있다.
화합물은 1개 초과의 산화촉진 잔기를 가질 수 있고, 상기 잔기는 호흡 연쇄의 상이한 영역/성분을 파괴/표적화할 수 있다.
바람직하게는, 산화촉진 잔기는 미토콘드리아 복합체 II와 상호작용한다. 더욱 바람직하게는, 산화촉진 잔기는 복합체 II의 유비퀴논-결합 부위에 결합하고, 천연 기질 유비퀴논, 유비세미퀴논 또는 유비퀴놀 (조효소 Q), 또는 복합체 II와 우선적으로 상호작용하는 다른 퀴논 또는 관련 화합물을 쉽게 대체할 수 있다. 이러한 기질은 예를 들어 하기 문헌에 명시되어 있다: ([Briere JJ, Schlemmer D, Chretien D, Rustin P. (2004) Quinone analogues regulate mitochondrial substrate competitive oxidation. Biochem Biophys Res Commun. Apr 16;316(4):1138-42], [Tan AK, Ramsay RR, Singer TP, Miyoshi H. (1993) Comparison of the structures of the quinone-binding sites in beef heart mitochondria. J Biol Chem. Sep 15;268(26):19328-33] 및 [Esposti MD, Ngo A, Ghelli A, Benelli B, Carelli V, McLennan H, Linnane AW (1996) The interaction of Q analogs, particularly hydroxydecyl benzoquinone (idebenone), with the respiratory complexes of heart mitochondria. Arch Biochem Biophys. Jun 15;330(2):395-400]).
암성 세포의 미토콘드리아 내 반응성 산소 종의 수준 증가만으로 세포자멸이 발생할 수도 있고, 또는 산화촉진 잔기, 전달 잔기 또는 전체 화합물이 세포 내에서 미토콘드리아-의존적 세포 사멸 신호전달 경로를 활성화시켜서 추가로 세포자멸유도를 일으킬 수도 있다. 바람직하게는, 산화촉진 잔기가 복합체 II에 결합하여 반응성 산소 종을 생성하고, 미토콘드리아-의존적 세포 사멸 신호전달 경로를 활성화시켜서 추가로 세포자멸유도를 일으킨다.
바람직하게는, 상기 화합물은 비-암성 세포에서는 산화촉진 활성이 없는 무해한 형태로 절단되거나 프로세싱되거나 다른 방식으로 대사된다.
바람직하게는, 산화촉진 잔기는 산화촉진 비타민 E 유사체이다. 본 발명자들은 산화촉진 비타민 E 유사체가 복합체 II에 결합하고 유비퀴논으로의 전자 전달을 방해할 수 있다는 것을 이미 발견한 바 있다. 이러한 내용은 국제 특허 출원 제PCT/AU2007/001371호의 명세서 (이것의 전체 내용은 본원에 상호 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 본 발명자들은 또한 산화촉진 비타민 E 유사체가 세포자멸유도를 일으킨다는 것을 이미 발견한 바 있다. 추가로, 본 발명의 발명자들은 산화촉진 비타민 E 유사체가 비-암성 세포에서 무해한 항-산화제 형태로 프로세싱될 수 있다는 것을 이미 발견한 바 있다.
본원에서, "산화촉진 비타민 E 유사체"는 암성 세포의 미토콘드리아 내에 위치하는 경우에 산화환원-침묵이고 복합체 II의 유비퀴논 결합 부위에 결합할 수 있으며 세포에 손상을 야기할 수 있는 대사의 산소 부산물 생성을 촉발하는 비타민 E 유사체로 정의된다. 산화촉진 비타민 E 유사체의 예는 α-토코페릴 숙시네이트 (α-TOS)이다.
한편, "항-산화 비타민 E 유사체"는 암성 세포의 미토콘드리아 내에 위치하는 경우에 항-산화 (산화환원) 활성을 갖는 비타민 E 유사체, 예를 들어 α-토코페롤 (α-TOH)이다. 따라서, 산화촉진 비타민 E 유사체 및 항-산화 비타민 E 유사체의 생물학적 활성은 완전히 상반된다.
트리페닐포스포늄 양이온을 기재로 하는 바람직한 화합물 (화학식 I이라 지칭됨)을 하기 나타낸다:
<화학식 I>
Figure pct00007
트리페닐포스포늄 양이온 및 α-TOS를 기재로 하는 특히 바람직한 화합물 (화학식 II라 지칭됨)을 하기 나타낸다:
<화학식 II>
Figure pct00008
다른 바람직한 화합물은 본 명세서의 도 1에서 찾을 수 있다.
상기 화합물은 대상체에서 예를 들어 폐, 간, 신장, 뇌, 전립선, 유방, 난소, 림프양, 피부, 눈, 결장, 위, 구강의 편평 세포 및 조혈계의 임의의 유형의 암성 세포의 사멸을 유도하는데 사용될 수 있다.
본 발명자들은 α-TOS가 erbB2가 낮은 수준이거나 높은 수준의 암 세포를 효율적으로 사멸시킨다는 것을 이미 발견한 바 있다. 본 발명자들은 또한 α-TOS가 중피종을 치료한다는 것을 이미 발견한 바 있다. 이러한 내용은 국제 특허 출원 제PCT/AU2007/001371호의 명세서에 기재되어 있다.
본 발명의 발명자들은 α-TOS가 정상 산소 암성 세포와 저산소 암성 세포 두경우 모두의 사멸을 유도한다는 것을 이미 발견한 바 있다. 따라서, α-TOS는 대상체에서 초기 단계 및 후기 단계 종양 두경우 모두의 사멸을 유도하는데 사용될 수 있다는 이점을 갖는다.
치료할 대상체는 인간, 포유동물 또는 동물일 수 있다. 바람직하게는, 상기 대상체는 인간 또는 다른 유형의 포유동물이다.
화합물은 이것의 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 유도체로서 조성물 중에 포함될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 화합물의 "유도체"는 염, Mn2 + 및 Zn2 +와 같은 금속 이온과의 배위결합 착물, 생체내 가수분해가능한 에스테르와 같은 에스테르, 유리 산 또는 염기, 수화물 또는 전구약물을 포함한다. 포스페이트 또는 술페이트와 같은 산성 기를 갖는 화합물은 알칼리 물질 또는 알칼리성 토금속, 예컨대 Na, K, Mg 및 Ca, 및 유기 아민, 예컨대 트리에틸아민 및 트리스 (2-히드록시에틸) 아민과 염을 형성할 수 있다. 염은 또한 아민과 같은 염기성 기를 갖는 화합물과 무기 산, 예컨대 염산, 인산 또는 황산, 또는 유기 산, 예컨대 아세트산, 시트르산, 벤조산, 푸마르산 또는 타르타르산 사이에서 형성될 수도 있다. 산성 기와 염기성 기를 둘다 갖는 화합물은 분자내 염(internal salt)을 형성할 수 있다.
에스테르는 당업자에게 널리 공지된 기술을 이용하여 화합물 내에 존재하는 히드록실 또는 카르복실산의 기와 적절한 카르복실산 또는 알콜 반응 파트너 사이에서 형성될 수 있다.
조성물은 고려하는 특정 상황에 필요한 예방 유효량 또는 치료 유효량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 조성물 중 화합물의 실제 양 및 조성물의 투여율 및 투여 시간은 치료할 암의 특성 및 중증도 또는 필요한 예방 정도에 따라 달라질 것이다. 치료 처방, 예컨대 투여량 등에 관한 결정은 대상체의 건강을 담당하는 의료 전문인 또는 수의사의 기술 내일 것이다. 그러나, 인간 대상체에게 투여할 조성물은 전형적으로 체중 1 kg 당 화합물 약 0.01 내지 100 mg, 더욱 바람직하게는 체중 1 kg 당 화합물 약 0.1 내지 10 mg을 포함할 것이다. α-토코페릴 숙시네이트 또는 다른 유사체를 포함하는 화합물이 인간 대상체에게 경피 적용되는 경우, 상기 화합물의 혈청 수준은 그의 IC50 값 부근, 대략적으로 40 내지 50 μM인 것이 바람직하다.
조성물은 비경구 투여, 국소 투여, 경구 투여, 흡입 분무에 의한 투여, 직장 투여, 비측(鼻側) 투여, 협측(頰側) 투여, 질 투여 또는 이식된 저장고를 통한 투여를 비롯한 임의의 적합한 방식으로 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
담체는 임의의 적합한 희석제, 보조제, 부형제, 완충제, 안정화제, 등장화제, 보존제 또는 항-산화제를 포함할 수 있다. 담체는 비-독성이어야 하고 화합물의 효능을 방해하지 않아야 한다는 것을 이해할 것이다. 담체 또는 조성물에 대한 임의의 다른 첨가제의 정확한 성질은 투여 경로 및 요구되는 치료 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 문헌 ([Alfonso R. Gennaro. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams ＆ Wilkins, 2000] 및 [Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, NY]) (이것들의 전체 내용은 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 약학적 조성물은 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당제-제조, 연화처리(levigation), 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 공정을 이용하여 생성될 수 있다.
주사가능한 멸균 형태의 조성물은 수성 또는 유성 현탁액제일 수 있다. 이러한 형태는 당업자에게 공지되어 있다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사하거나 치료를 원하는 부위에 주사하기 위해서, 조성물은 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액의 형태일 수 있다.
조성물의 경구적으로 허용가능한 투여 형태는 캡슐제, 정제, 환제, 산제, 리포좀제, 과립제, 구형 제제, 당제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액제 등을 포함한다. 적합한 경구 형태는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 정제는 고체 담체, 예컨대 젤라틴, 또는 보조제 또는 불활성 희석제를 포함할 수 있다. 액체 약학적 조성물은 일반적으로 액체 담체, 예컨대 물, 석유, 동물 또는 식물성 오일, 광유 또는 합성 오일을 포함한다. 생리적 염수 용액, 또는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜이 포함될 수 있다. 일반적으로, 이러한 조성물 및 제제는 주어진 담체 중 화합물의 용해도에 따라 화합물을 0.1 wt％ 이상, 바람직하게는 최대 약 25 wt％로 함유할 것이다.
특히, 치료 표적이 눈, 피부 또는 하부 장관의 암을 비롯하여 국소 적용에 의해 쉽게 접근가능한 영역 또는 장기를 포함하는 경우에, 조성물은 국소 투여될 수 있다. 조성물은 용액제, 현탁액제, 유화액제, 연고제, 크림제, 로션제, 페이스트제, 겔제, 발포제 또는 에어로졸제의 형태로 적용될 수 있다. 적합한 국소 형태는 당업자에게 공지되어 있을 것이다.
조성물은 화합물을 특정 장기, 특정 조직 또는 특정 유형의 암에 전달하고/하거나 화합물이 생물학적 효능의 손실 없이 예를 들어 피부를 통해 흡수되거나 소화관을 통해 섭취될 수 있도록 하기 위한 전달 비히클을 포함할 수 있다. 전달 비히클은 예를 들어 지질, 중합체, 리포좀, 유화액, 항체 및/또는 단백질을 포함할 수 있다. 리포좀은 예를 들면 중피종 치료를 위해서 화합물을 피부를 통해 전달하는데 특히 바람직하다.
조성물은 서방형 시스템, 예컨대 화합물을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트리스를 사용하여 전달될 수 있다. 다양한 서방형 물질이 이용가능하며, 당업자에게 널리 공지되어 있다. 서방형 캡슐제는 이것의 화학적 성질에 따라 화합물을 약 1주 내지 20주 동안 방출한다.
화합물은 전구약물의 형태일 수 있다. 전구약물은 조성물 투여시에, 예를 들면 경구 투여시에 화합물의 활성이 저하되지 않도록 하는 보호기를 가질 수 있다. 전구약물은 활성 화합물을 특정 장기 또는 세포 유형으로 전달할 수 있다. 적합한 전구약물 형태 및 보호기는 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 바람직하게는, 수용체 티로신 키나제, erbB2를 과발현하는 암 세포를 표적화하기 위해서 α-TOS의 부가물이 헵타펩티드 LTVSPWY에 연결된다.
대상체에게는 화합물을 포함하는 조성물이 최적의 예방 또는 치료 효과를 달성하기 위한 1종 이상의 다른 활성물질과 함께 투여될 수 있다. 활성물질은 예를 들어 알킬화제, 혈관신생 억제제, 항-안드로겐, 항-에스트로겐, 항-대사물질, 세포자멸제, 아로마타제 억제제, 세포 주기 조절제, 세포 스트레스인자, 세포독성제, 세포보호제, 호르몬제, 면역요법제, 키나제 억제제, 모노클로날 항체, 백금 작용제, 호흡 억제제, 레티노이드, 신호 도입 억제제, 탁산 및 토포이소머라제 억제제일 수 있다. 특히 바람직한 작용제는 해당 억제제, 예컨대 2-데옥시글루코스 및 3-BP를 포함한다. 다른 특히 바람직한 작용제는 TRAIL 및 Akt1 억제제, 및 또한 문헌 ([Ralph SJ, Dong LF, Low P, Lawen A, and Neuzil J (2006) Mitocans: mitochondria targeted anti-cancer drugs as improved therapies and related patents. Recent Pat Anticancer Drug Discov 1:305-326], [Neuzil J, Dong LF, Ramanathapuram L, Hahn T, Chladova M, Wang XF, Zobalova R, Prochazka L, Gold M, Freeman R, Turanek J, Akporiaye ET, Dyason JC, Ralph SJ. (2007) Vitamin E analogues as a novel group of mitocans: Anti-cancer agents that act by targeting mitochondria. Mol Aspects Med. Feb 23] 및 [Neuzil J, Tomasetti M, Zhao Y, Dong LF, Birringer M, Wang XF, Low P, Wu K, Salvatore BA, Ralph SJ. (2007) Vitamin E analogs, a novel group of "mitocans," as anticancer agents: the importance of being redox-silent. Mol Pharmacol. May;71(5):1185-99]) (이것들의 전체 내용은 본원에 상호 참조의 방식으로 포함됨)에서 검토된 바와 같은 다른 미토칸을 포함한다.
본 발명자들은 예를 들어 α-TOS 및 3-BP의 조합물 (또한, 다른 약물 조합물의 사용시도 마찬가지임)에 의해서 암 세포가 상기 약물이 단독으로 사용된 경우에 비해 사멸에 대해 보다 높은 감수성을 갖게 된다는 것을 이미 발견한 바 있다.
바람직하게는, 조성물은 비경구 또는 국소 투여된다. 특히 바람직한 산화촉진 비타민 E 유사체 잔기는 α-토코페릴 숙시네이트, α-토코페릴 말레에이트, α-토코페릴 말레일 아미드 및 2,5,7,8-테트라메틸-2R-(4R,8R,12-트리메틸트리데실)-크로만-6-일옥시아세트산 (α-토코페릴옥시아세트산)이다. 에스테르 α-토코페릴 숙시네이트, α-토코페릴 말레에이트 및 α-토코페릴 말레일 아미드에 바람직한 담체는 경피 적용가능한 크림, 예컨대 리포좀-기재의 크림인 "리포덤(Lipoderm)"이다. 가수분해가능하지 않은 에테르 유사체인 α-토코페릴옥시아세트산은 경구 전달되는 것이 바람직하다.
본 발명의 제8 측면에 따라,
암성 세포의 세포자멸을 유도하는 세포자멸유도 잔기, 및
세포자멸유도 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
를 포함하는, 암성 세포의 사멸 유도 화합물이 제공된다.
본 발명의 제9 측면에 따라,
암성 세포의 세포자멸을 유도하는 세포자멸유도 잔기, 및
세포자멸유도 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
를 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위한 화합물이 제공된다.
본 발명의 제10 측면에 따라,
암성 세포의 세포자멸을 유도하는 세포자멸유도 잔기, 및
세포자멸유도 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
를 포함하는 치료 유효량의 화합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암성 세포의 사멸 유도 방법이 제공된다.
본 발명의 제11 측면에 따라,
암성 세포의 세포자멸을 유도하는 세포자멸유도 잔기, 및
세포자멸유도 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
를 포함하는 치료 유효량의 화합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 제12 측면에 따라, 본 발명의 제8 또는 제9 측면에 따른 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 염, 및 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 또는 수의학적 조성물이 제공된다.
상기 화합물은 단리된 형태, 정제된 형태, 실질적으로 정제된 형태, 합성 또는 재조합 형태일 수 있다.
임의의 적합한 유형의 전달 잔기가 사용될 수 있다. 전달 잔기는 상기한 바와 같을 수 있다.
임의의 적합한 유형의 세포자멸유도 잔기가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 세포자멸유도 잔기는 상기한 바와 같은 산화촉진 잔기이다. 바람직한 산화촉진 잔기 (미토칸)의 예는 상기 표 I 및 또한 표 II 내지 IV 및 도 1에 기재되어 있다.
실시예
본 발명을 보다 잘 이해할 수 있게 하기 위해서 하기 실시예를 기재한다. 이러한 실시예는 단지 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
일반적인 재료 및 방법
세포 배양: 달리 명시하지 않는다면, 본 연구에서 사용된 하기 세포주는 ATCC에서 구하였다: 인간 T 림프종 세포 주캐트, 인간 중피종 세포 Meso-I, MM-BI, Ist-Mes, Ist-Mes-2 ([Pass, H.I. et al. Characteristics of nine newly derived mesothelioma cell lines. Ann. Thorac. Surg. 59, 835-844 (1995)]), 인간 유방암 세포 MCF-7 (낮은 수준의 erbB2) 및 MDA-MB-453 (높은 수준의 erbB2), 인간 결장직장 세포 HCT-116, 인간 간암종 세포 Huh-7, 마우스 중피종 세포 AE17 ([Jackaman, C. et al. IL-2 intratumoral immunotherapy enhances CD8+ T cells that mediate destruction of tumor cells and tumor-associated vasculature: a novel mechanism for IL-2. J. Immunol. 171, 505150-505163 (2003)]), 인간 비-악성 중피 세포 Met-5A, 랫트 심실 근세포-유사 세포 HL-1 ([Claycomb, W.C. et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2979-2984 (2001)]) 및 H9c2, 및 인간 내피-유사 세포 EAhy926 ([Edgell, C.J., McDonald, C.C. ＆ Graham, J.B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3734-3737 (1983)]). 주캐트 세포는 RPMI 배지 중에서 성장시켰고, 다른 악성 세포주 및 Met-5A 세포의 경우에는 DMEM을 사용하였으며, 10％ FCS 및 항생제를 보충하였다. 피브로넥틴/젤라틴-코팅된 디쉬에서 유지시킨 HL-1 세포는 노르아드레날린이 보충된 클레이컴(Claycomb) 배지 중에서 성장시켰고 ([Claycomb, W.C. et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2979-2984 (2001)]), EAhy926 세포는 HAT가 보충된 완전 DMEM 중에서 성장시켰다 ([Edgell, C.J., McDonald, C.C. ＆ Graham, J.B. Permanent cell line expressing human factor VIII-related antigen established by hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3734-3737 (1983)]). mtDNA가 결여된 세포 (ρ0 표현형)는 문헌 [Weber, T. et al. (Mitochondria play a central role in apoptosis induced by α-tocopheryl succinate, an agent with anticancer activity. Comparison with receptor-mediated pro-apoptotic signaling. Biochemistry 42, 4277-4291 (2003)]에 상술된 바와 같이 하여 제조하였다. ρ0 표현형의 획득은 mtDNA-코딩되는 시토크롬 c 옥시다제 서브유닛 II (COXII)의 세포 발현 결여로 확인되었다 (나타내지 않음). 복합체 I이 결여된 차이니스 햄스터 폐 섬유아세포 (B10 세포) ([Seo, B.B. et al. Molecular remedy of complex I defects: rotenone-insensitive internal NADH-quinone oxidoreductase of Saccharomyces cerevisiae mitochondria restores the NADH oxidase activity of complex I-deficient mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 9167-9171 (1998)]) 및 복합체 II가 결여된 차이니스 햄스터 폐 섬유아세포 (CybL-/-, B9 세포) ([Oostveen, F.G., Au, H.C., Meijer, P.J. ＆ Scheffler, I.E. A Chinese hamster mutant cell line with a defect in the integral membrane protein CII-3 of complex II of the mitochondrial electron transport chain. J. Biol. Chem. 270:26104-26108 (1995)]) 및 또한 모 세포 (B1 세포) ([Oostveen, F.G., Au, H.C., Meijer, P.J. ＆ Scheffler, I.E. A Chinese hamster mutant cell line with a defect in the integral membrane protein CII-3 of complex II of the mitochondrial electron transport chain. J. Biol. Chem. 270:26104-26108 (1995)])는 10％ FCS, 항생제, 10 mg/mL 글루코스 및 비-필수 아미노산이 보충된 DMEM 중에서 성장시켰다.
VE 유사체의 합성: 하기 화합물 (대개는 도 1에 나타낸 것임)은 일반적으로 국제 특허 출원 제PCT/NZ98/00173호 및 동 제PCT/NZ02/00154호의 명세서에 기재된 방법에 따라 합성되었다: MitoVE11S, S-MitoVE11S, R-MitoVE11S, MitoVE9S, MitoVE7S, MitoVE5S, MitoVE3S, MitoVE11AE, MitoVE11F 및 VES4TPP.
IC 50 , 세포자멸 및 미토콘드리아 전위의 평가: 암 세포에 대한 α-TOS, VE11S ("VES"), MitoVE3S, MitoVE5S, MitoVE7S, MitoVE9S, MitoVE11S ("MitoVES"), MitoVE11AE ("MitoVEAE"), MitoVE11F ("MitoVEF"), MitoVE11M ("MitoVEM") 및 VES4TPP의 독성을 문헌 [Turanek, J., et al. (2008). Liposomal formulation of vitamin E analogs as an efficient and selective anti-cancer treatment. Clin. Cancer Res.] (제출함)에서 상술된 바와 같이 하여 IC50을 기초로 평가하였다. 세포자멸은 안넥신 V 방법 ([Weber, T. et al. Mitochondria play a central role in apoptosis induced by α-tocopheryl succinate, an agent with anticancer activity. Comparison with receptor-mediated pro-apoptotic signaling. Biochemistry 42, 4277-4291 (2003)])을 이용하여 평가하였고, 미토콘드리아 내막 막횡단 전위의 소실은 다색성 프로브 JC-1 (몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes))을 사용하여 추정하였다 ([Weber, T. et al. Mitochondria play a central role in apoptosis induced by α-tocopheryl succinate, an agent with anticancer activity. Comparison with receptor-mediated pro-apoptotic signaling. Biochemistry 42, 4277-4291 (2003)]).
세포 증식, 및 세포 주기 분포의 평가: 세포 증식을 ELISA 비색 키트 (로쉐(Roche))로 측정하여, 제조사의 프로토콜을 이용한 5-브로모-2-데옥시유리딘 (BrdUrd)의 DNA 혼입률을 기초로 하여 세포 주기의 S기에 있는 세포의 수를 결정하였다. 세포 주기 분석을 위해서, 세포를 24-웰 플레이트에 플레이팅하여 이것들이 24시간의 회복 이후에 약 50％, 70％ 및 100％ 전면성장에 도달하도록 하였다. 이어서, 세포를 수거하여 시트르산나트륨 (1％), 트리톤(Triton) X-100 (0.1％), RNase A (0.05 ㎍/mL) 및 5 ㎍/mL 요오드화프로피듐을 함유하는 완충제 중에 재현탁하고, 암실에서 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하고 유동세포계측법으로 분석하였다.
SDH 활성의 평가: 미토콘드리아 제제에 의한 복합체 II 기질 2,6-디클로로페놀 인도페놀 (DCIP)의 환원에 소요되는 시간을 1 mL 반응 부피 (ε600 = 21×103 M-1cm-1)를 함유하는 1 cm 큐벳에서 600 nm에서의 흡광도를 측정하여 확인하였다. 반응 성분은 0.5 mM NADH, 5 mM 숙시네이트, 10 mM KCN, 50 μM DCIP 및 50 μM 페나진 메토술페이트 (PMS)를 포함하였다. 각 검정 시점에서, 샘플 단백질 0.5 mg을 사용하였고, α-TOS를 정해진 대로 100 또는 300 μM로 첨가하였다. DCPIP의 흡광도 변화를 분광광도계 (유비콘 엑스엘(UVIKON XL), 세코맘(Secomam))로 측정하고, 샘플을 반복적으로 검정하였다 (n = 3). 복합체 I 측정의 경우 (NADH 데히드로게나제 활성)에는 PMS를 생략하였다. α-TOS가 없는 대조군 반응의 경우에는 희석제 DMSO를 최종 농도 < 0.1％ (v/v)가 되도록 첨가하였다.
ROS 축적 평가: 세포의 ROS는, 도면의 부호설명에 기재된 바와 같이 세포에 α-TOS를 처리한 후에 유동세포계측법으로 간접 검출하고 전자 상자성 공명 (EPR) 분광법으로 직접 검출하였다. 일부 실험에서는, 세포에 2 μM 미토콘드리아 표적화 조효소 Q (MitoQ) ([Kelso, G.F., et al. Selective targeting of a redox-active ubiquinone to mitochondria within cells: antioxidant and antiapoptotic properties. J. Biol. Chem. 276, 4588-45896 (2001)])를 1시간 동안 사전 처리하거나, 또는 세포를 1 mL 당 750 유닛의 수퍼옥시드 디스뮤타제 (SOD, 시그마 S4636, EC 1.15.1.1)와 동시 인큐베이션하였다. 간접 평가를 위해서, 세포에 α-TOS를 처리하고 디히드로디클로로플루오레세인 디아세테이트 (DCF, 몰레큘라 프로브즈)와 30분 동안 반응시켜서 높은 형광을 갖는 세포를 유동세포계측법으로 스코어링하였고, 이것을 평균 형광 강도에서의 증가를 기초로 평가하였다. ROS 생성의 EPR 분광 분석은 라디칼 포획체 5,5-디메틸-1-피롤린 N-옥시드 (DMPO, 시그마)의 사용을 기초로 하였다. 간략하게 설명하면, 세포를 T25 플라스크에 플레이팅하고, 60％ 내지 70％ 전면성장 (플라스크 1개 당 약 5×106개 세포)에 이르게 하였다. 세포를 세척하여 PSS 배지 ([Thomas, S.R., Chen, K., ＆ Keaney, J.F. Hydrogen peroxide activates endothelial nitric-oxide synthase through coordinated phosphorylation and dephosphorylation via a phosphoinositide 3-kinase-dependent signaling pathway. J. Biol. Chem. 277, 6017-6024 (2002)])로 덮고, 10 mM DMPO 첨가 후에 50 μM α-TOS와 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. DMPO 부가물의 분석은 세포 현탁액 및 또한 세포-조건화 배지로부터의 샘플을 평평한 석영 셀 (윌마드(Wilmad))로 옮겨 수행하였다. 이어서, 상기 석영 셀을 하기하는 분광계 파라미터를 갖고 293 K로 설정된 브루커(Bruker) EMX 벤치-탑(bench-top) 분광계의 공동에 넣었다: 필드 스위프(field sweep) 10 mT, 극초단파 파워 20 mW, 극초단파 주파수 100 kHz, 조정 크기 0.1 mT, 스위프 시간 83.9초. 동일 조건하에서 안정적인 니트록시드 (TEMPO)의 검출 한계는 약 50 nM이었다.
세포 형질감염: B9 세포를 CybL 유전자 ([Slane BG, Aykin-Burns N, Smith BJ, Kalen AL, Goswami PC, Domann FE, Spitz DR. (2006). Mutation of succinate dehydrogenase subunit C results in increased oxidative stress, and genomic instability. Cancer Res 66:7615-7620])를 보유하는 Topo pCR3.1 Uni 플라스미드를 사용하여 형질감염시키고 문헌 [Weber T, Dalen H, Andera L, Negre-Salvayre A, Auge N, Sticha M et al. (2003). Mitochondria play a central role in apoptosis induced by α-tocopheryl succinate, an agent with anticancer activity. Biochemistry 42:4277-4291]에 기재된 바와 같이 하여 선별하였다. 안정적으로 형질감염되고 siRNA 처리된 세포를 SDH 활성 및 SDHC 발현에 대해 평가하였다. 항-β-액틴 IgG (산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)를 로딩 대조군으로 사용하고 항-SDHC 이뮤노글로불린 G (IgG) (클론 3E2, 노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals))를 이용하여 문헌 [Wang XF, Birringer M, Dong LF, Veprek P, Low P, Swettenham E et al. (2007). A peptide adduct of vitamin E succinate targets breast cancer cells with high erbB2 expression. Cancer Res 67:3337-3344]에 기재된 바와 같이 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. RT-PCR은 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 공개된 인간 CybL ([Slane BG, Aykin-Burns N, Smith BJ, Kalen AL, Goswami PC, Domann FE, Spitz DR. (2006). Mutation of succinate dehydrogenase subunit C results in increased oxidative stress, and genomic instability. Cancer Res 66:7615-7620]) 및 차이니스 햄스터 글리세르알데히드 3-포스페이트 데히드로게나제 프라이머 ([Sever et al., 2004])를 사용하였다.
혈관신생의 시험관내 평가: EAhy926 세포의 창상 치유 활성에 대한 α-TOS의 효과를 평가하기 위해서, 상기 세포를 3.5 mm 페트리 디쉬에 접종하여 완전한 전면성장에 이르게 하였다. 멸균된 황색 피펫 팁을 사용하여 0.4 내지 0.5 mm의 폭으로 가로질러서 벗겨지도록 세포를 제거하여 세포 단층에 '창상'을 가하였다. 접안렌즈에 격자가 장착된 현미경에서 α-TOS 또는 α-TEA 존재하에서의 세포의 재성장 (창상 치유)을 상기 벗겨진 틈이 좁아지는 역학에 따라 평가하고, '틈이 채워지는 속도'로서의 치유율을 ㎛/시간으로 표현하였다.
EAhy926 세포의 튜브 형성 활성을 위해, 본질적으로 문헌 [Albini, A., et al. Inhibition of angiogenesis and vascular tumor growth by interferon-producing cells: A gene therapy approach. Am. J. Pathol.156, 1381-1393 (2000)]에 기재된 바와 같이 하여 3차원 설정에서 모세관-유사 구조의 형성을 평가하였다. 간략하게 설명하면, 차가운 매트리겔 (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)) 300 ㎕를 차가운 팁을 이용하여 24웰 플레이트의 각 웰로 옮겼다. 인큐베이터에서 고화시킨 후, HAT 보충물을 포함하는 완전한 세포 배지 200 ㎕가 5×105개 세포와 함께 각 웰에 첨가되도록, 증식 중인 배양물로부터 트립신 처리하여 수득한 EAhy926 세포의 현탁액을 상기 매트리겔의 표면에 부드럽게 덮었다. 인큐베이터에서 1시간 내지 2시간이 지난 후, EAhy926 모세관 네트워크로 만들어진 다각형 구조가 확립되었다. 웰로 옮기기 직전에 상기 세포 현탁액에 MitoVES를 첨가하거나 튜브가 확립된 후에 MitoVES를 첨가하여 세포를 처리하였다. 튜브 형성 활성은 광학 현미경 내 선택된 구역에서 다각형 구조의 개개의 점을 서로 연결하는 완전한 모세관의 수를 계수하여 추정하였다. 모든 웰에서 각 웰마다 중앙 영역의 3개 구역을 무작위로 선택하였다. 대조군 배양물 중 이러한 모세관의 수를 100％로 하였다. 처리된 배양물의 경우, 실험 개시후 다양한 시점에 완전한 모세관의 수를 계수하여 EAhy926 세포의 튜브 형성 활성 억제에 관한 역학을 구하였다.
투과 전자 현미경: 투과 전자 현미경으로 확인할 배양물은 이전에 기재된 바와 같이 하여 제조하였다 ([Weber, T. et al. Mitochondria play a central role in apoptosis induced by α-tocopheryl succinate, an agent with anticancer activity. Comparison with receptor-mediated pro-apoptotic signaling. Biochemistry 42, 4277-4291 (2003)]). 간략하게 설명하면, 주캐트 세포의 배양물을 0.1 M 수크로스-나트륨 카코딜레이트-HCl 완충제 (pH 7.2, 시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 중 2％ 글루타르알데히드 (아가 사이언틱(Agar Scientic), 영국 에섹스 소재) 첨가로 고정시키고, 오스뮴 (존슨 매티 케미칼스(Johnson Matthey Chemicals), 영국 로이스톤 소재) 중에서 후고정시켰다. 이후, 세포를 2％ 한천 중에 펠렛화한 후에 탈수시켜 우라닐 아세테이트 (시그마)로 염색하고 에폰-812(Epon-812) (플루카 아게(Fluka AG), 스위스 부후스 소재) 중에 매립하였다. 다이아몬드 나이프 (다이아톰(DIATOME), 스위스 빈네 소재)를 사용하여 치유된 부분을 얇은 절편으로 절단하여 납-시트레이트 (시그마)로 염색하고, 100 kV의 JEOL 1230-EX 전자 현미경 (일본 도쿄 소재)에서 조사하고 사진을 찍었다.
분자 모델링 - 복합체 II 및 MitoVES: 돼지 심장으로부터의 미토콘드리아 호흡 막 단백질 복합체 II의 결정 구조를 브룩하벤 프로테인 데이타뱅크(Brookhaven Protein Databank)에서 구하였다 (코드 1ZOY) ([Sun F, Huo X, Zhai Y, Wang A, Xu J, Su D, Bartlam M, Rao Z. 2005. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell 121:1043-1057]). 상기 복합체는 4종의 단백질을 함유한다. 이 복합체에서 철-황 단백질 (사슬 B), 대형 막횡단 단백질 (사슬 C) 및 소형 막횡단 단백질 (사슬 D)의 3개 서브유닛이 UbQ에 대한 결합에 관여한다. NCBI 웹사이트로부터의 BLAST 검색은, 돼지 복합체 II와 인간 복합체 II 사이의 서열 동일성이 매우 높다는 것을 밝혀내었고, 상기 철-황 단백질의 경우에는 97％, 대형 막횡단 단백질의 경우에는 90％, 소형 막횡단 단백질의 경우에는 94％였다.
오토도크 툴즈(AutoDock Tools) ([Sanner MF (1999) Python: a programming language for software integration and development, J Mol Graphic Mod 17:57-61])를 사용한 도킹(docking)을 위해서 우선 헤테로원자를 제거한 단백질 구조를 제작하였다. 상기 구조에 극성 수소를 부가하고, 단백질 원자에 콜만 유나이티드 아톰(Kollman United Atom) 전하를 사용하였다. UbQ5는 인사이트II(InsightII) ([Accelrys, 2001])를 사용한 결합된 UbQ의 결정 구조 좌표 (1ZOY)로부터 제작하였다. MitoVE11S는 다시 인사이트II를 사용하여 α-TOS의 고리계에 대한 하위구조 검색을 실시하여 캠브릿지 스트럭처럴 데이타베이스(Cambridge Structural Database)로부터 구한 결정 구조 MOPHLB01로부터 제작하였다 ([Allen FH (2002) The Cambridge Structural Database: a quarter of a million crystal structures and rising. Acta Crystallogr B 58(Pt 3 Pt 1):380-388]). 이후, 2종의 리간드 모두를 오토도크 툴즈에 의한 도킹을 위해 제작하였고, 이것은 비-극성 수소의 조합, 가스테이거(Gasteiger) 전하의 배치 및 회전가능한 결합의 규정을 포함하였다.
도킹은 오토도크 3.0.5.에서 시행되는 바와 같은 라마르키안 제네틱 알고리즘(Lamarckian Genetic Algorithm)을 사용하여 수행하였다 ([Morris G M, Goodsell DS, Halliday RS, Huey R, Hart W E, Belew RK, Olson AJ (1998) Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and empirical binding free energy function. J Comp Chem 19:1639-1662]) - 2가지 도킹 격자를 제조하였다. 둘다 격자 폭 0.375 Å의 126×126×126개 점이었고, 먼저 것은 QP 부위의 Tyr173 (사슬 B)에 중심을 두고, 두번째 것은 QD 부위의 Trp134 (사슬 D)에 중심을 두었다. 디폴트 파라미터를 사용하였으나 다음은 제외하며, 이것은 관심 리간드 내에 존재하는 회전가능한 결합의 상대적으로 높은 수 (UbQ5 = 16, α-TOS = 17)로 인해 증가되었다: ga_run = 250, ga_pop_size = 250, ga_num_evals = 10,000,000. 또한, 파라미터 rmstol을 2.5로 증가시켜서 계산의 분석 단계 동안 보다 잘 다루어질 수 있는 클러스터를 생성하였다. 각각의 도킹 계산에는 2 GHz G5 PowerPC 매킨토시(Macintosh)를 사용하여 단지 49시간만이 소요되었다. 결과 분석은 오토도크에서 제공되는 스크립트를 사용하여 수행하였고, 도킹된 구조는 아스텍스 뷰어 ([Hartshorn MJ (2002) AstexViewer™: An aid for structure-based drug design. J Computer Aided Mol Des 16:871-881])를 사용하여 가시화하였다.
실시예 1 - MitoVES 는 암성 세포를 선택적으로 사멸시킴
도 2는 비타민 E의 미토콘드리아로 표적화된 산화환원-침묵 유사체가 이것의 표적화되지 않은 α-TOS 대응물에 비해 암 세포에 대한 세포자멸유도 효과 및 항암 활성이 상당히 더 높으면서도 암 세포에 대한 선택성은 유지한다는 것을 보여준다. 특히, MitoVE11S (Mito-α-TOS)는 암 세포에서 원형 α-TOS보다 최대 50배 더 높은 세포자멸유도성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
하기 표 V에는 여러가지 악성 및 비-악성 세포에 대한 α-TOS, VES4TPP 및 MitoVE11S ("MitoVES"라고 표시함)의 IC50 값을 나타냈다:
[표 V]
Figure pct00009
a주캐트 세포는 1 mL 당 0.5×106개로 하여 처리하였고, 다른 세포주 (EAhy926 세포 제외)는 약 60％ 전면성장시에 처리하였다.
bIC50 값은 MTT 생존성 검정을 이용한 생존성 곡선으로부터 도출하였고, μmol/L로 표현하였다.
cEAhy926 세포는 100％ 전면성장시에 처리 (윗줄)하거나 약 50％ 전면성장시에 처리 (아랫줄)하였다.
하기 표 VI에는 여러가지 다른 MitoVES 유사체 및 화합물에 대한 IC50 값을 나타냈다:
[표 VI]
Figure pct00010
a주캐트 세포는 1 mL 당 0.5×106개로 하여 처리하였고, EtOH 용액으로서 첨가한 나타낸 유사체에 노출시켰다.
bIC50 값은 MTT 생존성 검정을 이용한 생존성 곡선으로부터 도출하였고, μmol/L로 표현하였다.
도 2의 세포자멸 검정은 MitoVE11S가 악성 세포에서는 세포자멸을 선택적으로 야기하지만 분열 중인 내피 세포를 제외한 정상적인 균등한 세포 유형에서는 그렇지 않음을 보여준다.
패널 J에서 α-TOS- 및 MitoVE11S-처리된 주캐트 세포의 현미경사진은 세포자멸의 전형적인 특징적 징후를 보여준다.
흥미롭게도, 도 3B의 세포자멸 검정은 인간 주캐트 T-림프종 세포의 MitoVE11S 처리가 주로 미토콘드리아 경로를 통해 세포자멸을 유도했음을 보여주었는데, 이는 Bax/Bak 이중 넉아웃(knockout) 세포주는 MitoVE11S에 대해 극도의 내성을 갖는다는 것이 입증되었고 이들 BH3 2가지 모두가 내재적 경로를 통한 세포자멸 동안의 미토콘드리아 외막 투과화에 필요하다고 공지된 유일한 단백질이기 때문이다.
또한, 도 3B의 세포자멸 검정으로부터, MitoVE11S가 미토콘드리아 경로를 통한 사멸을 표적화하는 보다 강력하고 특이적인 항암 약물이라는 것을 알 수 있다. 비교하자면, α-TOS는 Bax.Bak 이중 결여 세포에서 여전히 어느 정도 수준의 사멸을 매개하며, 이는 α-TOS가 세포자멸을 위한 미토콘드리아 경로에 추가하여 다른 경로에 의해서도 사멸을 유도할 수 있음을 시사한다.
표 V 및 VI의 결과는, 림프종, 중피종, 유방암 및 결장암을 비롯한 소정 범위의 암세포 유형의 사멸에 있어서는 MitoVES의 역가가 훨씬 더 높지만 정상 세포에서는 그렇지 않다는 것을 강조한다. 추가로, 상기 결과는 MitoVES의 사슬 길이가 아마도 UbQ 결합 복합체 II 부위 내로의 접근성 때문에 중요하다는 것을 시사한다. TPP 잔기를 TOS 잔기로부터 분리하는 탄소 쇄의 길이는 활성에 매우 중요하고, 이것은 분명히 복합체 II의 UbQ 부위로의 진입에 충분한 정도로 미토콘드리아 막에 깊게 삽입되는 TOS기의 능력을 반영한다.
실시예 2 - MitoVES 는 증식 중인 내피 세포에서는 세포자멸을 야기하지만 정지된 내피 세포에서는 그렇지 않음
도 6의 결과는 MitoVES (MitoVE11S)가 ROS의 축적으로 인해 증식 중인 내피 세포에서는 세포자멸을 야기하지만 정지된 내피 세포에서는 그렇지 않음을 보여주며, 따라서 강력한 항-혈관신생제로서의 이것의 가능성을 밝히고 있다. 따라서, MitoVE11S는 혈관신생의 효과적인 억제제이며, 암 세포를 세포자멸을 통해 사멸시키는 직접적인 항암 효과를 갖는다.
실시예 3 - MitoVES 는 혈관신생을 시험관내 억제함
도 7의 창상 치유, 튜브 형성 및 세포자멸 검정은 MitoVES (MitoVE11S)가 혈관신생을 시험관내 억제한다는 것을 보여주며, 따라서 강력한 항-혈관신생제로서의 이것의 가능성을 다시 확인시켜 준다.
α-TOS 사용시와 마찬가지로, MitoVE11S는 증식 중인 내피 세포를 표적화하고 사멸시키는 매우 강력한 항-혈관신생 활성을 갖는다. 그러나, MitoVE11S는 놀랍게도 5배 더 높은 항-혈관신생 약물로서의 역가를 보여준다. 동일한 내피 세포 유형에 대해 약 25 내지 50 마이크로몰 농도의 α-TOS와 유사한 수준의 효과를 위해서는 약 5 내지 10 마이크로몰 농도의 MitoVE11S가 필요하다 (α-TOS 수준은 문헌 [Lan-Feng Dong, Emma Swettenham, Johanna Eliasson, Xiu-Fang Wang, Mikhal Gold, Yasmine Medunic, Marina Stantic, Pauline Low, Lubomir Prochazka, Paul K. Witting, Jaroslav Turanek, Emmanuel T. Akporiaye, Stephen J. Ralph, and Jiri Neuzil, Vitamin E Analogues Inhibit Angiogenesis by Selective Induction of Apoptosis in Proliferating Endothelial Cells: The Role of Oxidative Stress, Cancer Res 2007; 67:(24). December 15, 2007]에 기재된 값임).
실시예 4 - 복합체 II 가 유전적으로 결여된 돌연변이체 암 세포주는 MitoVES 에 반응하지 않음
본 발명의 발명자들에 의한 이전의 연구는 α-TOS가 복합체 II의 호흡 연쇄에서 UbQ 부위를 방해하여 ROS를 유도한다는 것을 보여주었다. 본 실시예는 복합체 II가 유전적으로 결여된 돌연변이체 암 세포주는 MitoVES에 반응하지 않는다는 것을 보여주며, 따라서 MitoVES (MitoVE11S)가 복합체 II의 호흡 연쇄에서 UbQ 부위를 방해하여 ROS를 유도한다는 것을 확인시켜 준다.
모 (B1), 복합체 II 결함 (B9) 및 복합체 I 결함 돌연변이체 (B10) 차이니스 햄스터 폐 섬유아세포 세포주에 대한 MitoVE11S 처리의 효과를 비교하였다. 추가로, v-하비(v-Harvey) Ras를 발현하는 플라스미드 벡터를 사용하여 상기 세포주를 악성종양 상태로 형질전환시켰다. 따라서, B1, B9 및 B10 세포주는 pEGFP-C3-H-Ras 플라스미드 ([Baysal BE, Ferrell RE, Willett-Brozick JE, Lawrence EC, Myssiorek D, Bosch A, van der Mey A, Taschner PE, Rubinstein WS, Myers EN, Richard CW 3rd, Cornelisse CJ, Devilee P, Devlin B. Mutations in SDHD, a mitochondrial complex II gene, in hereditary paraganglioma. Science. 2000 Feb 4;287(5454):848-51])를 사용한 안정적인 형질감염에 의해 GFP-H-Ras를 갖도록 형질전환되었다. Ras-형질전환된 B9 세포주에서의 복합체 II는 pEFIRES-Puro 플라스미드로 클로닝된 인간 (h) CybL ([Albayrak T, Scherhammer V, Schoenfeld N, Braziulis E, Mund T, Bauer MK, Scheffler IE, Grimm S. The tumor suppressor cybL, a component of the respiratory chain, mediates apoptosis induction. Mol Biol Cell. 2003 Aug;14(8):3082-96])로 형질감염시켜 재구축하였다. RT-PCR은 B9 유래의 세포주에 차이니스 햄스터 SDHCmRNA 발현이 없고, B9SDHC를 발현하는 형질전환체 세포에는 hSDHC 단백질이 존재함을 보여주었다 (도 4A 참조). 이어서, 상기 형질감염된 세포를 가장 높은 수준의 H-Ras-EGFP를 발현하는 것에 대하여 클론 선별하였다 (도 4B 참조). 이어서, 여러가지 ras-형질전환된 세포주를 MitoVES 유사체 MitoVE11S에 노출시키고, 세포자멸 효능, ROS 축적 경향 및 SDH 활성에 대해 평가하였다.
도 4C에서, 미토콘드리아에 결함이 있는 복합체 II를 갖는 Ras-형질전환된 B9 세포가 야생형 복합체 II 발현 및 활성을 갖는 Ras-형질전환된 B1 세포주에 비해 복합체 II 표적화 약물 TTFA 또는 MitoVE11S에 대한 감응성이 훨씬 낮다는 것을 명백히 알 수 있다. 추가로, 인간 SDHC 단백질을 발현하도록 형질감염된 Ras-형질전환된 B9 세포에서 복합체 II 기능의 재구축은 복합체 II 억제제인 TTFA 또는 MitoVE11S에 대한 세포주의 감응성을 회복시켰다. 따라서, 상기 증거는 이러한 암 세포에서의 세포자멸 유도에 있어서 복합체 II가 MitoVE11S 및 TTFA 활성 둘다에 대한 표적 부위임을 명백하게 확인시켜 준다.
실시예 5 - MitoVES 는 복합체 II 의 UbQ -결합 포켓을 표적화함
MitoVES가 UbQ-결합 부위를 통해 복합체 II와 상호작용한다는 결과를 합리화하기 위해서, 본 발명의 발명자들은 오토도크 ([Morris G M, Goodsell DS, Halliday RS, Huey R, Hart W E, Belew RK, Olson AJ (1998) Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and empirical binding free energy function. J Comp Chem 19:1639-1662])를 사용한 분자 모델링 연구를 수행하였다. 돼지 심장 미토콘드리아 CII의 결정 구조가 보고된 바 있다 ([Sun F, Huo X, Zhai Y, Wang A, Xu J, Su D, Bartlam M, Rao Z. 2005. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell 121:1043-1057]). 이것은 인간 CII와의 높은 서열 동일성 (개개의 서브유닛에 대해 95％ 내지 97％)을 나타내기 때문에, 본 발명의 발명자들은 상기 구조 (1ZOY) 및 억제제 TTFA가 결합된 관련 구조 (1ZP0)를 모델링 연구를 위한 기초로서 사용하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 도킹 실험은 복합체 II의 공간 충전 모델에서 나타난 바와 같이 막대 그림 구조로 표시한 MitoVE11S를 갖는 결합된 구조를 생성하였다. 복합체 II의 사슬 B (철-황 단백질)의 표면 및 사슬 C 및 D (막횡단 부분)의 표면을 나타내었으나, 사슬 A (플라빈단백질-숙시네이트 리덕타제)는 나타내지 않았다.
MitoVE11S의 예측되는 위치를 막대로 나타내었고, 반투명한 회색 박스를 도시하여 막 이중층이 존재하는 위치가 대략적으로 표시되도록 하였다. 상기 모델은 복합체 II의 Qp 유비퀴논 부위로의 MitoVE11S 결합 및 도킹에 대해 제안된 위치를 확인시켜 주며, 트리페닐포스포늄 이온은 바깥쪽 SDH 효소 헤드기 구조의 아래쪽 근처에서 미토콘드리아 매트릭스 내에 존재하여 막 표면에서 돌출되어 있다.
실시예 6 - MitoVES 는 유방암 줄기 세포를 사멸시키는데 효율적인 약물임
암 요법에 있어서 최근의 중요한 발견은 종양 재생의 근원일 수 있는 암 줄기 세포가 존재한다는 것이었다. 종양 덩어리는 사멸시키지만 줄기 세포는 신체 내에 살아있는 채로 두는 임의의 치료법은 종양의 재성장으로 인해 실패할 것이기 때문에, 이것은 또한 암 치료의 어려움을 강조한다 ([Lou and Dean, Oncogene 2007]). 또한, 화학치료 약물이 암 줄기 세포 내에 축적되지 않도록 하는데 관여하는 다중 약물 내성 (MDR)/ABC 수송자 당단백질을 세포 막에 발현하는 암 줄기 세포는 일반적으로 요법에 내성이 있고 ([O'Brien et al. 2008, Li et al., 2008]) 약물 내성이 있어서 매우 유의한 표적이다. 암 줄기 세포는 또한 DNA 손상 복구 능력이 더 높기 때문에 방사선조사에도 내성이 있는 것으로 밝혀졌다 ([Neuzil et al., 2007 BBRC], [Eyler and Ricj, 2008]).
훽스트(Hoechst) 33342와 같은 염료를 배출하여 형광 활성화 세포 분류로 게이팅할 때 세포의 "사이드 집단(side population)"을 제공하는 경향을 기초로 하는 정제를 비롯한 선택적인 방법으로 암 줄기 세포를 풍부하게 해 왔다 ([Patrawala L et al 2005, Wu and Alman 2008]). 암 줄기 세포 집단을 풍부하게 하는 또다른 수단은 종양 세포로부터의 구상체 배양에서의 성장을 포함한다. 이 방법은 이러한 배양물 내에 방사선 내성 ([Phillips TM et al., 2007])을 비롯한 암 줄기 세포의 많은 성질을 갖는 종양 개시 세포를 더 높은 비율(％)로 풍부하게 하는 것으로 나타났다 ([Grimshaw et al., 2008]). 암 줄기 세포 풍부 집단에서의 유전자 발현 및 단백질 마커 발현의 분석을 기초로 하여, 이들 세포 유형을 보다 더 특징규명하였다. 마커 유전자 및 암 줄기 세포에 의해 발현되는 단백질 중에서도, Notch/wnt/베타-카테닌 신호전달 경로, ABC 수송자, CD133, CD44의 수준은 증가하고 CD24 표면 마커의 수준은 감소된다. 또한, 이들 세포는 그의 마커 발현을 기초로 할 때 공격적으로 치명적인 악성종양으로부터 단리하고 유전자 발현 프로파일링으로 분석한 보다 "기본적인" 종양 세포 표현형과 밀접한 상관관계가 있다 (예를 들어, 문헌 [Sorlie T et al., PNAS, 2001] 참조. 문헌 [Sotiriou and Pusztai, 2008]에서 검토됨).
암 줄기 세포 또는 종양 개시 세포의 성질에 관한 이해를 기초로 할 때, 이들 세포 유형을 표적화하여 이것을 사멸시켜서 종양 재성장을 예방하는 약물을 발견하는 것이 더 중요해진다. 이러한 약물은 선택적이고 정상 줄기 세포 또는 다른 정상 세포 유형에는 유의한 영향을 미치지 않는 것이 바람직하다. 기재된 바 있는 이러한 약물 중 하나는 피버퓨(Feverfew) 식물에서 유래된 세스퀴테르펜 락톤인 파르테놀리드이며, 이것은 백혈병 줄기 세포를 선택적으로 사멸시키는 것으로 밝혀진 바 있다 ([Guzman ML et al., 2005]). 또다른 유사한 약물은 화합물 4-벤질, 2-메틸, 1,2,4-티아디아졸리딘, 3,5-디온 (TDZD-8, [Guzman, ML et al., 2007])이다. 그러나, 이들 화합물은 충실성 종양과 같은 다른 유형의 암에 대해서는 매우 효과적이지는 않은 것으로 입증되었다.
본 발명자들은, 배양시에 맘모스피어 (MS)로서 성장하여 암 줄기 세포가 풍부한 인간 유방암 세포주 MCF7의 집단을 사멸시키는데 있어서 MitoVES가 매우 효과적인 약물이라는 놀라운 사실을 발견하였다. 도 8에서의 결과는 부착성 MCF7 세포 및 상응하는 MS 세포의 형태 및 또한 암 줄기 세포의 수많은 마커의 발현에 관한 분석을 보여준다. 본 발명의 발명자들은 부착성 MCF7 세포가 α-TOS에 의한 사멸에 감응성이 있긴 하지만 약물 MitoVES에 더 높은 감응성이 있다는 것을 밝혀냈다. 그러나, 이들 세포는 암 줄기 세포, 특히 백혈병 줄기 세포를 사멸시키는 것으로 예전에 보고된 작용제인 파르테놀리드에는 반응하지 않았다. 추가로, MCF7 세포에서 유래된 MS 세포는 파르테놀리드에 대한 감응성을 낮은 수준으로 나타냈고 α-TOS에 내성이 있었다. 그러나, 줄기성 (암 줄기 세포 마커에 의해 나타남) 수준이 높은 MS 세포는 약물 MitoVES에 대한 감응성이 놀라울 만큼 높았으며, 상기 약물을 MS 세포에 첨가한 후 5시간 내지 6시간 이내에 > 90％ 세포자멸이 일어났다. 본 발명자들은 또한 α-TOS가 부착성 MSF7 세포에서는 ROS의 유의한 생성을 야기하지만 MS 세포에서는 그 수준이 훨씬 더 낮다는 것을 밝혀냈다. 그러나, MitoVES는 부착성 MCF7 세포에서 α-TOS보다 더 높은 ROS 축적을 야기하였고 MS 세포에서는 그 수준이 훨씬 더 높았다. 추가로, MitoVES의 사슬 동족체는 쇄가 짧을 수록 부착성 MCF7 세포 및 상응하는 MS 배양물 둘다에서 ROS 축적 촉진에 있어서 MitoVE11S보다 덜 효율적이었다. 이러한 발견은 인간 유방암 세포주 MCF7로부터 유래된 MS 배양물에 대해 나타난 바와 같이 MitoVE11S가 암 줄기 세포를 사멸시키는 경향이 매우 높은 화합물임을 확인시켜 준다.
본 발명자들은 또한 MitoVES가 생체내에서 매우 효과적인 항암 약물임을 밝혀냈다. 이러한 목적을 위해서, 종양유전자 HER2를 높은 수준으로 발현하여 자발적인 도관 유방 암종을 형성하는 트랜스제닉 FVB/N c-neu 마우스를 암 모델로 사용하였다. 본 발명의 발명자들은 MitoVES 처리가 이들 동물에서 발생한 유방암 종양의 진행을 α-TOS의 상응하는 활성에 필요한 농도보다 약 10배 더 낮은 농도에서 완전히 차단함을 밝혀냈다 (도 9). 중요한 것은, 처리된 동물 어느 것에서도 명백한 독성 징후는 관찰되지 않았다는 점이다.
본 발명자들은, 표적화되지 않은 미토칸에 이것을 아마도 미토콘드리아 내막의 내강 면(luminal leaflet)에 고정시켜서 이것의 활성을 최대화시키는 양이온 기를 부가하여 상기 미토칸을 변형시킬 수 있다는 것을 보여주었다. 이것의 전형적인 예가 종양 개시 세포를 포함하는 암 세포에 대한 세포자멸유도 효과 및 항암 활성이 표적화되지 않은 대응물보다 상당히 더 높으면서 암 세포에 대한 선택성은 유지하는 비타민 E의 미토콘드리아 표적화 유사체이다.
특히, 실험 예는 다음을 나타낸다:
(1) MitoVES (MitoVE11S)의 역가는 α-TOS보다 놀라울 만큼 훨씬 더 높으며, α-TOS보다 암 세포를 선택적으로 사멸시키는데 있어서 암 세포에 약 최대 50배 더 활성임,
(2) 상기 (1)의 결과로, MitoVES는 특이성이 개선되어 정상 세포에 대한 독성이 훨씬 덜할 것임,
(3) MitoVES는 세포 사멸을 위한 미토콘드리아 경로 유도에 있어서 α-TOS보다 더 특이적임,
(4) α-TOS 사용시와 마찬가지로, MitoVES는 증식 중인 내피 세포를 표적화하고 사멸시키는데 있어서 매우 강력한 항-혈관신생 활성을 갖지만, MitoVES (MitoVE11S)는 α-TOS보다 놀랍게도 5배 더 높은 항-혈관신생 약물로서의 역가를 보여줌,
(5) MitoVES는 중피종, 유방암, 결장암, 림프종 세포주 및 암 줄기 세포를 사멸시킨다는 측면에서 암 요법에 있어 매우 넓은 용도를 가질 수 있음.
전술한 실시양태는 본 발명의 원리를 단지 예시하기 위한 것이며, 당업자라면 다양한 변형 및 변화를 쉽게 가할 것이다. 본 발명은 다양한 방법 및 다른 실시양태로 실시 및 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 설명 목적을 위한 것임을 이해해야 하며, 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
본원에서, 용어 "포함한다" 및 상기 용어의 변형형태, 예컨대 "포함하고" 또는 "포함하는"은 언급된 정수(들)을 포함한다는 것을 나타내기 위해 사용되지만, 문맥이나 사용에 있어서 상기 용어의 배제적인 해석이 필요한 경우가 아니면 임의의 다른 정수(들)을 배제하지 않는다.
본 명세서에서 인용된 간행물에 대한 임의의 언급은 본 개시내용이 오스트레일리아 또는 다른 국가에서의 통상의 일반적인 지식을 구성한다는 것을 인정하는 것이 아니다.
표 II 내지 IV 및 실시예 6에 관한 참고문헌의 목록
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014

Claims (25)

  1. (i) 암성 세포의 미토콘드리아 내에서 반응성 산소 종을 생성하고 (ii) 암성 세포의 세포자멸을 유도하는 산화촉진 잔기, 및
    산화촉진 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
    를 포함하는, 암성 세포의 사멸 유도 화합물.
  2. (i) 암성 세포의 미토콘드리아 내에서 반응성 산소 종을 생성하고 (ii) 암성 세포의 세포자멸을 유도하는 산화촉진 잔기, 및
    산화촉진 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
    를 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위한 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 전달 잔기가 산화촉진 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아 기질로 전달하는 화합물.
  4. 제3항에 있어서, 전달 잔기가 친지성 양이온인 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 친지성 양이온이 트리페닐포스포늄 양이온인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 산화촉진 잔기가 미토콘드리아 복합체 II와 상호작용하는 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 산화촉진 잔기가 복합체 II의 유비퀴논-결합 부위에 결합하는 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 산화촉진 잔기가 복합체 II에 결합하여 반응성 산소 종을 생성하고, 추가로 미토콘드리아-의존적 세포 사멸 신호전달 경로의 활성화에 의하여 세포자멸유도성(pro-apoptotic)인 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 산화촉진 잔기가 산화촉진 비타민 E 유사체인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 산화촉진 비타민 E 유사체 잔기가 α-토코페릴 숙시네이트, α-토코페릴 말레에이트, α-토코페릴 말레일 아미드 및 2,5,7,8-테트라메틸-2R-(4R,8R,12-트리메틸트리데실)-크로만-6-일옥시아세트산 (α-토코페릴옥시아세트산)으로 구성된 군에서 선택된 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 산화촉진 비타민 E 유사체가 α-토코페릴 숙시네이트 (α-TOS)인 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 염, 및 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 또는 수의학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 산화촉진 비타민 E 유사체 잔기가 α-토코페릴 숙시네이트, α-토코페릴 말레에이트 및 α-토코페릴 말레일 아미드로 구성된 군에서 선택되고, 담체가 경피 적용가능한 크림인 약학적 또는 수의학적 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 산화촉진 비타민 E 유사체 잔기가 α-토코페릴옥시아세트산이고, 담체가 경구 투여에 적합한 약학적 또는 수의학적 조성물.
  15. 치료 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항의 약학적 또는 수의학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암성 세포의 사멸 유도 방법.
  16. 치료 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항의 약학적 또는 수의학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
  17. 암성 세포의 사멸을 유도하는 의약의 제조에 있어서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  18. 암을 예방하거나 치료하는 의약의 제조에 있어서, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
  19. 암성 세포의 세포자멸을 유도하는 세포자멸유도 잔기, 및
    세포자멸유도 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
    를 포함하는, 암성 세포의 사멸 유도 화합물.
  20. 암성 세포의 세포자멸을 유도하는 세포자멸유도 잔기, 및
    세포자멸유도 잔기를 암성 세포의 미토콘드리아에 전달하는 전달 잔기
    를 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위한 화합물.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 전달 잔기가 트리페닐포스포늄 양이온인 화합물.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 세포자멸유도 잔기가 α-토코페릴 숙시네이트 (α-TOS)인 화합물.
  23. 제21항 또는 제22항의 화합물 또는 생리적으로 허용가능한 그의 염, 및 생리적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 또는 수의학적 조성물.
  24. 치료 유효량의 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제23항의 약학적 또는 수의학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암성 세포의 사멸 유도 방법.
  25. 치료 유효량의 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항의 화합물 또는 제23항의 약학적 또는 수의학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
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