KR20100108793A - 애기뿔소똥구리로부터 분리된 항진균 활성을 가지는 코프리신 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 딱정벌레목에 속하는 애기뿔소똥구리(Copris tripartitus)로부터 분리된 항진균 활성을 가지는 코프리신 펩타이드(코프리신 유전자의 성숙단백질 영역의 43개 아미노산)에 관한 것이다.

본 발명에 의한 상기 항진균 펩타이드는 세포 독성이 없고 탁월한 항진균 활성을 나타냄과 동시에 인체에 안전하므로 항진균제를 포함하는 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 보존제 등으로 사용할 수 있다.

Description

애기뿔소똥구리로부터 분리된 항진균 활성을 가지는 코프리신 펩타이드 및 그의 용도{Antifungal coprisin peptide derived from Copris tripartitus and its use}

본 발명은 딱정벌레목에 속하는 애기뿔소똥구리(Copris tripartitus)로부터 분리된 항진균 활성을 가지는 코프리신 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 의한 상기 항진균 펩타이드는 세포 독성이 없고 탁월한 항진균 활성을 나타냄과 동시에 인체에 안전하므로 항진균제를 포함하는 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 보존제 등으로 사용할 수 있다.

병원성 미생물의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 병원성 미생물의 항생제 저항성 (resistance)이 야기되었다.

실제로, 병원성 미생물이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빠르다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 아루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등의 병원성 미생물 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다(Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998).

항생제에 대한 내성 (tolerance)은 항생제에 대한 저항성 (resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스 (Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다(Tomasz et al., Nature, 227, 138-140, 1970).

내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재 하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 상기 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신(autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소(endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료 시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.

병원성 미생물이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 내성 미생물을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다(Handwerger and Tomasz, Rev . Infec . Dis., 7, 368-385, 1985).

아울러 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행 조건이라고 간주되며, 이것은 항생제 치료에도 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제적으로 모든 저항성을 보이는 병원성 미생물들 은 내성도 가지는 것으로 알려져 있으므로(Liu and Tomasz, J. Infect . Dis., 152, 365-372, 1985), 이러한 항생제 저항성을 가지는 병원성 미생물을 죽일 수 있는 신규의 항생제의 개발은 시급한 실정이다.

상기 살펴본 바와 같이, 항생제에 저항성을 나타내는 병원성 미생물들에 의한 피해를 막기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 아울러 오토라이신 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다. 또한, 그러한 새로운 항생제를 병원성 미생물의 감염을 효과적으로 치료하기 위한 약물학적 조성물을 제공하는 것이 필요하다.

한편, 생물체의 항상성(homeostasis)을 유지하기 위한 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 물질들 중 일부가 각종 생물체 유래의 생리 활성 물질이다.

지금까지 수많은 생리 활성 물질에 대해 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중, 각종 생물체에서 분리된 항균 펩타이드는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스에 이르기까지 다양하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다 (Boman, H. G., Cell, 65, 205, 1991; Boman, H. G., Annu. Rev . Microbiol., 13, 61, 1995).

따라서 본 발명은 딱정벌레목에 속하는 애기뿔소똥구리(Copris tripartitus)로부터 분리된 항진균 활성을 가지는 코프리신 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것으로 세포 독성이 없고 탁월한 항진균 활성을 나타냄과 동시에 인체에 안전하므로 항진균제를 포함하는 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 보존제 등으로 사 용할 수 있다.

본 발명의 목적은 인체의 진균성 질환 예방 및 치료에 천연 항생제로 유용하게 사용될 수 있는 애기뿔소똥구리로부터 분리된 항진균 활성을 가지는 코프리신 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 항생제로 이용할 수 있는 세포 독성이 없고 우수한 항진균 활성을 가지는 코프리신 펩타이드 및 그의 용도를 제공하는 것이다.

전술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 애기뿔소똥구리로부터 분리된 항진균 활성을 가지는 서열번호 1로 표현되는 펩타이드(코프리신 유전자의 성숙 단백질 영역인 43개 아미노산)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 항진균 활성을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 하는 항진균 약학 조성물을 제공한다.

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 딱정벌레목에 속하는 애기뿔소똥구리 (Copris tripartitus)로부터 분리된 항진균 활성을 가지는 코프리신 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 의한 상기 항진균 펩타이드는 세포 독성이 없고 탁월한 항진균 활성을 나타냄과 동시에 인체에 안전하므로 항진균제를 포함하는 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 보존제 등으로 사용할 수 있다.

이하 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상적인 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다. 또한 비록 구체적인 실시예로 제시되지는 않았지만, 항진균 작용이 있는 본 발명에 의한 항진균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항진균제용 약학적 조성물이 가능함이 당업자에게 당연할 것이다.

[실시예 1] 항진균 펩타이드의 합성 및 분리 정제

본 실시예 1에서는 애기뿔소똥구리에서 유래하는 항진균 펩타이드를 합성 및 분리 정제하였다. 이 때, 상기 항진균 펩타이드는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

[표 1]

펩타이드	아미노산 서열
코프리신	VTCDVLSFEAKGIAVNHSACALHCIALRKKGGSCQN-GVCVCRN

먼저, 항진균 펩타이드를 합성하기 위하여, 본 발명자들은 Fmoc 아미노기 보호용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하여(Merrifield, RB., J. Am . Chem . Soc., 85, 2149, 1963) 항균 펩타이드를 제조하였다. 상기 항균 펩타이드 합성의 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노산의 Nα-amino group의 보호기(protecting group)로 사용하는 고상법(solid phase method)으로 합성하였다. 구체적으로, 카르복실 말단이 -NH₂ 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장(elongation)은 N-hydroxybenzo- triazole(HOBt)-dicyclo-hexylcar-bodiimide(DCC)법에 의하였다. 각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(NMP) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 디클로로메탄 (DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다. 여기에 TFA(trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-H₂O-triisop-ropylsilane(85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다. 이렇게 하여 얻은 조(crude) 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도 구배(acetonitrile gradient)로 하여 정제형 역상-HPLC(reverse phase-HPLC) column(Delta Pak, C18 300Å, 15μ, 19.0 mm×30 ㎝, Waters)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6 N-HCl로 110 ℃에서 24시간 동안 가수분해한 후, 얻어진 잔사를 감압농축 한 뒤, 0.02 N-HCl에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다. 또한 합성된 펩타이드의 시퀀스(sequence)를 바탕으로 분자량을 계산하였고, MALDI 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)을 이용하여 정확한 분자량을 측정하였다. 그 결과 측정된 분자량과 계산된 분자량이 일치하므로 정확한 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

[실시예 2] 코프리신(Coprisin)의 병원성 진균에 대한 항진균 활성 조사

상기 실시예 1에서 제조된 항균 펩타이드의 항진균 활성을 조사하기 위하여 하기와 같이 수행하였다. 이때 꿀벌로부터 분리된 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴을 본 발명에서 양성 대조구로 사용하였다. 본 발명에서 항진균 펩타이드는 -20℃에 보관하며, 멸균된 3차 증류수에 녹여서 사용하였다.

[항진균 활성 측정]

본 항진균 펩타이드의 항진균 활성의 측정을 위하여 병원성 진균인 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 푸미가터스(Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 파라시티커스(Aspergillus parasticus), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 마라세지아 펄펄(Malassezia furfur), 트라이코스포론 베이겔리(Trichosporon beigelii), 트라이코파이톤 루브룸(Trichophyton rubrum)을 YPD배지, PD배지 및 1% 올리브 오일(olive oil)이 첨가된 YM배지에 배양하였다. 각 진균의 배양에 사용된 배지로 2×103 세포/1㎖의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100㎕씩 분주한 후, 항진균 펩타이드의 용액을 단계적으로 희석한 농도로 처리했다.

이어서 28℃ 배양기에서 24시간 동안 진탕 배양한 후, MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액 [5㎎ of MTT/㎖ of PBS (pH 7.4)]을 각각의 웰에 넣고, 37 ℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 이어서 MTT에 의하여 생성된 포르마잔(Formazan)들을 용해하기 위해 0.02N HCl이 포함된 20% SDS를 20㎕를 넣은 후, 37℃에서 16시간 반응시켰다.

다음으로 ELISA 판독기로 570㎚의 파장 하에서의 각 웰의 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도 (MIC)를 측정하였으며, 얻어진 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2] 항진균 펩타이드의 병원성 진균에 대한 최소 생육 저지 농도 (MIC)

진균	병원성 미생물에 대한 MIC(μM)
	코프리신	멜리틴
아스퍼질러스 플라버스	10	2.5
아스퍼질러스 푸미가터스	5	2.5
아스퍼질러스 파라시티커스	10	5
캔디다 알비칸스(TIMM 1768)	5-10	2.5
캔디다 알비칸스 (ATCC 90028)	10	5
캔디다 파랍실로시스	10	5
마라세지아 펄펄	5	1.25
트라이코스포론 베이겔리	10	2.5
트라이코파이톤 루브룸	20	5

MIC: 병원성 미생물의 생육이 전혀 안 되는 항진균 펩타이드의 농도

[항진균 활성]

상기 표 2를 참조하면, 본 항진균 펩타이드의 항진균 활성 측정의 결과, 병원성 진균에 대해서 5~20μM의 최소 생육 저지 농도(MIC)를 나타내었다. 이는 대조군으로 사용된 강력한 항진균제인 멜리틴보다는 조금 약하나 비교적 강력한 항진균 활성으로, 본 항균 펩타이드가 강력한 항진균 활성을 나타냄을 의미한다.

[실시예 3] 코프리신(Coprisin)의 병원성 진균의 이형성에의 활성 조사

항진균 펩타이드의 병원성 진균의 이형성(dimorphism)에의 활성을 조사하기 위하여 다음과 같이 수행하였다. 이때 꿀벌로부터 분리된 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴을 본 발명에서 양성 대조구로 사용하였다. 본 발명에서 항균 펩타이드는 -20℃에 보관하며, 멸균된 3차 증류수에 녹여서 사용하였다.

[병원성 진균의 이형성에의 활성 측정]

대상 균주로는 대표적인 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)를 사용하였으며 병원성을 획득하게 하기 위하여 20%의 FBS(fetal bovine serum)을 첨가하여 hyphae를 형성하게 하였다. 이렇게 병원성을 가지는 진균에 펩타이드를 처리하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 현미경 하에서 관찰하였다.

도 1을 참고하면 (A)는 yeast 형태의 진균이고 (B)는 FBS로 병원성을 띄게 한 것이며 (C)는 병원성을 가지는 진균에 펩타이드를 처리하여 세포가 aggregation되므로 항진균 활성을 가시화시켜주는 것이다.

[실시예 4] 코프리신(Coprisin)의 항진균 활성의 기작 조사

코프리신의 항진균 활성을 가지는 기작을 조사하기 위하여 다음과 같이 수행하였다. 이때 꿀벌로부터 분리된 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴을 본 발명에서 양성 대조구로 사용하였다. 본 발명에서 항균 펩타이드는 -20℃에 보관하며, 멸균된 3차 증류수에 녹여서 사용하였다.

[항진균 활성을 가지는 기작의 조사]

대상 균주는 대표적인 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)를 사용하였으며 펩타이드를 처리한 후 YPD agar plate에 시간별로 도말하여 28℃에서 24 시간 동안 배양한 후 콜로니 수(Colony forming units, CFUs)를 측정하여 항진균 활성을 가지는 기작이 cidal(사멸) 또는 static(정균)인지 판단하였다.

[사멸기작을 통한 항진균 활성]

도 2를 참조하면 코프리신은 양성 대조구로 사용된 멜리틴과 마찬가지로 효과적으로 사멸(cidal)시키는 것을 알 수 있다. 이는 본 항진균 펩타이드가 강력한 항진균 활성을 가진다는 것을 보여준다.

[실시예 5] 코프리신(Coprisin)의 인간 적혈구 세포에 대한 세포 독성 조사

인간 적혈구 세포에 대한 세포 독성의 측정은 다음과 같이 실시하였다.

적혈구 세포(Human erythrocytes)를 인산-염화나트륨 완충액, pH 7.4(PBS)로 세 번 세척한 후, 인산-염화나트륨 완충액으로 희석하여, 8.0 %의 적혈구 세포 용액을 제조하였다. 그런 후, 8.0 % 적혈구 세포 용액을 96-웰 플레이트에 100㎕씩 분주한 후에 본 항균 펩타이드의 단계적으로 희석한 용액을 섞어주었다.

이어서 모든 웰에 총액의 양이 200㎕가 되도록 생리 식염수(Saline 0.85 % NaCl)을 넣어주고, 37℃ 배양기에서 90분 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝난 후, 원심 분리기에서 1500rpm의 회전 속도로 10분간 원심 분리하여 상등액을 옆 웰로 옮겼다.

적혈구 세포에 대한 파괴능은 ELISA 판독기로 414㎚의 파장 하에서의 흡광도를 측정하여 파괴능을 분석하였다. 그리고 대조군으로 0.1% 트리톤 X-100으로 처리하였을 경우의 값을 100 % 파괴능으로 계산하였으며, 적혈구 세포만을 넣은 경우를 0 % 파괴능으로 계산하였다. 이때 항균 펩타이드의 파괴능은 하기 수학식 1에 의하여 계산하였으며, 얻어진 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[식 1]

[표 3] 인간 적혈구 세포(Human erythrocytes)에 대한 본 항균 펩타이드의 세포 독성의 측정

	% 인간 적혈구 파괴능
	펩타이드 농도(μM)
	100	50	25	12.5	6.25	3.13
코프리신	0	0	0	0	0	0
멜리틴	100	100	100	100	98	98

% 인간 적혈구 파괴능: 인간에 대한 세포 독성은 인간 적혈구 세포에 대한 항균 펩타이드의 파괴능으로 측정

상기 표 3을 참조하면, 본 항진균 펩타이드는 고농도에서도 전혀 세포 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 그에 비해 강력한 항균 펩타이드인 멜리틴의 경우에는 낮은 농도에서도 세포 독성이 매우 높게 나타냄을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명에서 발견된 항진균 펩타이드는 인간의 신체에 피해가 없이 인간에 대해 사용할 수 있음을 의미한다.

도 1은 애기뿔소똥구리로부터 분리된 항진균 활성을 가지는 코프리신 펩타이드(코프리신 유전자의 성숙 단백질 영역인 43개 아미노산)이 대표적인 병원성 진균인 캔디다 알비칸스 (Candida albicans)의 hyphae를 효과적으로 aggregation시킴을 보여주는 것이다.

도 2는 애기뿔소똥구리로부터 분리된 항진균 활성을 가지는 코프리신 펩타이드가 양성대조구로 사용된 벌독 유래의 멜리틴 (Melittin)과 마찬가지로 병원성 진균인 캔디다 알비칸스 (Candida albicans)를 사멸시키는 활성을 가짐을 보여주는 것이다.

<110> Republic of Korea <120> Antifungal coprisin peptide derived from Copris tripartitus and its use <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 43 <212> PRT <213> Copris tripartitus <400> 1 Val Thr Cys Asp Val Leu Ser Phe Glu Ala Lys Gly Ile Ala Val Asn 1 5 10 15 His Ser Ala Cys Ala Leu His Cys Ile Ala Leu Arg Lys Lys Gly Gly 20 25 30 Ser Cys Gln Asn Gly Val Cys Val Cys Arg Asn 35 40

Claims (2)

1. 애기뿔소똥구리(Copris tripartitus)로부터 분리된 항진균 활성을 가지는 서열번호 1로 표현되는 펩타이드.
2. 애기뿔소똥구리(Copris tripartitus)로부터 분리된 항진균 활성을 가지는 서열번호 1로 표현되는 펩타이드를 유효성분으로 하는 항진균 약학 조성물.

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