KR20100105519A - 폴리감마글루탐산을 포함하는 천식 또는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리감마글루탐산(poly-gamma-glutamate)을 포함하는 천식 또는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료제를 제공한다. 본 발명의 폴리감마글루탐산을 포함하는 천식 또는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 기도과민성 억제, 기관지 및 폐조직에의 호산구 및 대식세포의 침윤 억제, 기관지 내 배상세포(goblet cell)의 증식 억제, 혈청 내 IgE 항체의 역가 감소, 폐조직에서 천식질환의 원인이 되는 IL-13 사이토카인의 발현을 억제 등의 기전을 매개함으로써, 천식 또는 알레르기성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폴리감마글루탐산을 포함하는 천식 또는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING ASTHMA OR ALLERGIC DISEASES COMPRISING POLY-GAMMA-GLUTAMATE}

본 발명은 폴리감마글루탐산을 포함하는 천식 또는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 부작용 및 독성이 적고 천식질환의 발병원인 및 기전에 입각한 천식 또는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.

천식은 주로 기도의 만성 염증 질환에 의하여 일어나며, 비특이적 자극에 대한 기도과민성(airway hyperresponsiveness) 및 기도개형을 특징으로 한다. 도움 T(Th) 세포 아형간의 불균형이 천식의 발병 원인으로 작용한다. 기도가 알레르겐에 노출되면 림프조직에서 제 2 형 도움 T(Th2) 세포의 발생이 유도되어 이들이 폐와 기도로 침윤하여, 기도 과민성, 호산구와 대식세포를 포함한 면역세포 침윤, 평활근세포와 배상세포(goblet cells)의 증식 등과 같은 병적 소견을 매개한다.

천식을 치료하는 대표적인 방법은 항염증 작용을 갖는 치료제나 기관지확장 효과를 갖는 치료제를 이용하는 것이다. 상기 항염증 작용을 갖는 대표적인 치료제는 글루코콜티코이드(glucocorticoid), 루코트리엔 모디파이어(leukotriene modifiers), 데오필린(theophylline) 등이 있다.

상기 글루코콜티코이드(glucocorticoid)는 항염 효과 면에서는 강력하나 다양한 세포 및 조직에 광범위하게 작용하며 모든 면역반응과 항염증반응을 억제하여 심각한 약물부작용이 문제가 된다. 상기 루코트리엔 모디파이어(leukotriene modifiers)는 부작용은 적지만 효과면에서 한계가 있어 다른 치료제에 보조적으로 사용되는 문제점이 있다. 상기 데오필린(theophylline)은 효과 면에서도 뛰어나지 못하며 부작용의 우려가 있다.

따라서 효과가 뛰어나고 부작용이 적은 치료제의 개발이 절실히 필요하다. 또한 증상을 완화하는 대증요법의 한계를 극복하기 위하여 천식의 발병원인 및 기전에 입각한 치료제가 필요하다.

이런 필요성에서 최근 Th2 면역반응을 억제하는 새로운 면역치료요법에 대한 관심이 집중되고 있다. 그 한 예로 수용성 IL-4 수용체, 수용성 IL-13 및 항 IL-5 항체 등의 천식치료제가 개발 중이다. 하지만 이런 단백질 치료제는 체내에서의 짧은 반감기, 잠재적 항원성(antigenecity), 변성이 용이함(냉장보관 요함), 고가라는 한계가 있다.

따라서, 천식의 발병원인을 원천적으로 제어할 수 있으며, 부작용이 적으면서도 체내에서 체류기간이 상대적으로 길어 천식 또는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 면역 치료제의 개발이 필요하다.

본 발명자들은 폴리감마글루탐산이 기도과민성 억제, 기관지 및 폐조직에서의 호산구 및 대식세포의 침윤 억제, 기관지 내 배상세포의 증식 억제, 혈청 내 IgE 항체의 역가 감소, 폐조직에서 천식질환의 원인이 되는 IL-13 사이토카인의 발현을 억제한다는 것을 발견하고 그 효능 및 치료제로서의 사용가능성을 검증하여 본 발명을 완성하였다.

이하에서는 본 발명을 더 상세하게 설명한다.

본 발명의 한 양태에서는 폴리감마글루탐산을 포함하는 천식 또는 알레르기성 질환의 예방 및 치료제를 제공한다.

본 발명에서 사용되는 폴리감마글루탐산은 글루탐산이 감마-아마이드(γ-amide) 결합으로 연결된 고분자 폴리머이다. 이 물질은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균에 의하여 콩이 발효되는 과정 중에 생성되며, 콩발효식품인 청국장 또는 낫또의 점액성분의 약 80%를 차지하는 천연화합물이다. 본 발명에서 사용되는 폴리감마글루탐산의 분자량은 특별히 제한되지 않는다. 더 바람직하게는 상기 폴리감마글루탐산의 분자량은 1~2000kDa 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 조성물에는 약제학적으로 허용되는 담체가 임의로 포함될 수 있다. "약제학적으로 허용되는 담체"란 인간 또는 다른 척추동물에게 투여하기에 적합한 1종 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전재, 희석제 또는 캡슐화제를 의미한다. "담체"는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 의미하며, 활성 성분의 적용을 용이하게 하기 위해 활성 성분과 배합된다. 또한, 약학 조성물의 성분들은 목적하는 약학적 효능을 손상시키는 상호 작용이 없는 방식으로 본 발명의 폴리감마글루탐산과 서로 혼합될 수 있다. 담체의 선택은 투여방식, 용해도 및 안정성에 대한 담체의 영향, 투여형의 특성과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다.

담체로 사용될 수 있는 물질은 당업계에 널리 알려져 있다. 전분, 당, 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트, 규산 유도체와 같은 충전제 및 증량제, 미세결정질 셀룰로스, 당, 폴리에틸렌 글라이쿨, 천연 및 합성 고무, 전젤라틴화 전분, 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로오스 등의 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 폴리비닐 피롤리돈과 같은 결합제, 락토오즈, 만니톨, 자일리톨, 덱스트로오즈, 수크로오즈, 솔비톨, 미세결정질 셀룰로스, 전분, 이염기성 인산칼슘 다이하이드레이트와 같은 희석제, 활석, 스테아린산 칼슘 또는 마그네슘, 수소화 피마자유, 고상 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 나트륨 전분 글라이콜레이트, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 칼슘 카복시메틸 셀룰로스, 나트륨 크로스카멜로스, 크로스포비돈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 저급 알킬-치환된 하이드록시프로필 셀룰로스, 전분, 나트륨 알기네이트와 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 글리세롤 모노스테아레이트 등과 같은 계면활성제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 용도 및 용법에 따라 소화관 내 투여 또는 소화관 외 투여될 수 있으며, 소화관내 투여는 경구 투여, 설하 투여, 직장/질내 투여 등을 포함하며, 소화관 외 투여는 혈류내, 근육내 및 내부 장기 내로 주사, 흡입, 기관내 투여, 피부 및 점막에 국소 적용 등을 포함한다.

본 발명의 한 양태에서 본 발명의 조성물은 흡입에 의하여 투여된다. 흡입을 위한 장치는 당업계에 공지되어 있는 어떤 수단도 사용할 수 있다. 계량 흡입기 (Metered dose inhalers), 회전 흡입기 (Spinhaler(rotohaler)), 응급상황에서 일반적으로 사용하는 소형 분무기　(Small-volume nebulizer) 등이 일반적으로 사용된다.

천식은 Th1 또는 Th2 가 분비하는 사이토카인 간의 불균형에 의해 유발된다. 본 발명에서 폴리감마글루탐산이 Th1 세포와 Th2 세포 기전에 작용하여 IFN-γ의 발생을 촉진하고, IL-4, IL-13의 발현을 억제한다는 사실을 밝혔으며, 기도과민성 억제, 기관지 및 폐조직에의 호산구 및 대식세포의 침윤 억제, 기관지 내 배상세포의 증식 억제, 혈청 내 IgE 항체의 역가 감소의 효과가 있다는 것을 실험을 통해 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 폴리감마글루탐산이 Th1과 Th2의 발생을 조절하여 알레르겐에 대한 천식 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있음을 보였다. 그러므로 폴리감마글루탐산은 발병원인을 원천적으로 제어할 수 있으며, 식품에 포함된 천연화합물로 체내 부작용 및 독성이 적은 새로운 치료제로 유용하다.

또한, 단백질 계통의 천식치료제가 가지고 있는 짧은 반감기, 잠재적 항원성, 변성이 용이함, 고가라는 단점을 극복할 수 있는 새로운 치료제로 유용하다.

본 발명의 다른 양태에서 폴리감마글루탐산은 Th1 및 Th2 세포에 작용하여 분비되는 사이토칸을 조절하는 기전에 의한 것으로, 천식뿐 아니라 알레르기성 피부염, 만성 폐쇄성질환 등 알레르기성 질환의 예방 및 치료제로 유용하다. 특히, 알레르기성 질환 중 Th 매개성 질환에 유용하다.

도 1은 γ-PGA가 Th1, Th2세포에 미치는 영향을 세포내 사이토카인 유세포 분석을 통해 나타내는 도면이다.
도 2는 γ-PGA가 Th1, Th2세포에 미치는 영향을 효소결합 면역흡착법을 통해 을 통해 나타내는 도면이다.
도 3은 알부민을 이용한 천식동물모델의 제작과 γ-PGA를 투여하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 4는γ-PGA가 천식동물모델의 기도과민성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 5는 γ-PGA가 천식동물모델의 기관지 염증세포에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 6은 γ-PGA가 천식동물모델의 기관지 배상세포의 증식에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 7은 γ-PGA가 천식동물모델의 기도 내 대식세포, 호산구, 호중구 및 림프구의 숫자에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 8은 γ-PGA가 혈중 IgE 농도에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 9는 γ-PGA가 천식동물모델의 폐에서 IL-13 발현에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하려는 의도는 아니다.

<실시예>

실시예 1: 폴리감마글루탐산(γ-PGA)의 Th1, Th2 세포 분화 조절 효능

본 실시 예에서 시험관 내 CD4⁺ T 세포 배양실험을 실시하여 γ-PGA의 CD4⁺ T 세포 분화 조절 효능을 확인하였다. 실험동물로는 6~8주령의 수컷 C57BL/6 생쥐를 사용하였다. 생쥐의 CD4⁺ T 세포를 효과(effector)T 세포로 분화시키기 위하여 다음과 같은 방법으로 세포를 배양하였다. 생쥐를 희생하여 지라와 림프절을 확보하였다. 지라와 림프절을 10% 우태혈청(fetal bovine serum; FBS), 100unit/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 0.05mM 2-메르캅토에탄올(mercaptoethnol), 2mM L-글루타민이 첨가된 RPMI1640(이하 'RPMI/10F'로 표시함) 배지에 넣고 갈아서 세포를 추출한 후 적혈구세포와 조직 찌꺼기를 제거하고 단세포 부유액(single cell suspension)을 얻었다. 이 세포 부유액에서 자성 비드-활성화 세포 분류(magnetic bead-activated cell sorting; MACS) 방법을 사용하여 CD4⁺ T 세포를 양성 선별하였다. 이때 CD4⁺ T 세포를 제외한 나머지 세포들은 따로 모아서 γ-방사선(3000rad)을 조사하여 항원제시세포(APC)로 사용하였다. 순수 분리한 CD4⁺ T 세포를 1㎍/㎖ 항-CD3 항체가 깔린 플레이트에 4x10⁶/웰 로 넣고 같은 수의 APC와 20U/㎖ IL-2를 첨가하였다 (중성적 조건). 이러한 중성적 조건 이상으로, Th1 세포로 분화시키기 위하여 10ng/㎖ 생쥐의 IL-12와 5㎍/㎖ 항-IL-4 항체를 첨가하였고, Th2 세포로 분화시키기 위하여 10ng/㎖ IL-4, 5㎍/㎖ 항-IFN-γ 항체와 5㎍/㎖ 항-IL-12 항체를 첨가하였다. 이때 일부 웰에는 50kDa γ-PGA를 0.04~1mg/ml 농도로 추가하였다. 각각의 플레이트는 RPMI/10F 배지(2㎖/well)에서 4일 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 4일 후 배양된 세포를 취하여 세척하고 재자극한 후 세포의 분화 양상을 세포내 사이토카인 유세포분석(intracellular cytokine FACS)과 ELISA로 조사하였다.

1. 세포내 사이토카인 유세포분석

4일 동안 배양하여 얻어진 세포에서 10⁶ 세포를 취해 20ng/㎖ PMA와 1μM ionomycin, 0.7㎕/㎖ Golgi-stop로 5시간 동안 재자극하였다. 세포를 세척한 후 항-CD4-PerCP로 염색하였다. 세포를 BD Cytofix/Cytoperm buffer를 이용하여 고정하고 침투성(permeabilization)을 증가하였다. 이 세포에 항-IL-4-PE, 항-IL-17-PE, 항-IFN-γ-FITC 항체를 처리하여 세포내 염색을 한 후에 유세포분석기로 형광염색된 세포의 비율을 조사하였다. 도 1에 도시한 바와 같이, γ-PGA은 Th1 조건하에서 IFN-γ를 생성하는 Th1 세포의 발생을 증가시키고, Th2 조건하에서 IL-4 을 생성하는 Th2 세포의 발생을 감소시킨다.

2. 효소결합 면역흡착법(Enzyme-linked immunosorbent assays;ELISA)

상기한 바와 같이 4일 동안 배양하여 얻어진 세포에서 5X10⁵ 세포를 취해 10㎍/㎖ 항-CD3 항체와 1㎍/㎖ 항-CD28 항체로 48시간 동안 재자극하였다. 배양된 상등액을 취하여 IFN-γ와 IL-4 농도를 R&D Duoset ELISA development system (R&D Systems)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 측정하였다. 도 2는 γ-PGA가 Th1 조건하에서 IFN-γ 생성을 증가하며 Th2 조건하에서 IL-4 생성을 저하하는 능력이 있음을 보였다.

실시예 2 : 천식동물모델에서 폴리감마글루탐산(γ-PGA)의 천식치료 효능

본 실시 예에서 실시예 1을 바탕으로 천식동물모델에서 γ-PGA가 면역조절을 통해 천식치료 효능을 확인하였다.

알부민(ovalbumin)을 이용하여 사람의 천식과 같은 기전을 가지는 동물 모델을 제작하고, γ-PGA을 기도 흡입하여 천식 치료 효과를 기도반응성, 조직 병리학적, 기관지 폐포 세척액에서 염증세포의 수, 혈중 IgE 농도 및 RT-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통하여 확인하였다.

정상대조군은 알부민과 γ-PGA 대신에 PBS (phosphate buffered saline)을 투여한 군이며, 천식군은 알부민만 투여한 군이다. 실험군은 알부민과 γ-PGA를 같이 투여하였다.

1. 알부민으로 유도한 천식 동물모델의 준비 및 γ-PGA 투여

생후 6 내지 7주령의 암컷 BALB/c 생쥐를 사용하였으며, 각 군당 6 내지 7마리를 사용하여 SPF (specific pathogen-free) 조건에서 사육 하였다. 알부민 75㎍과 알럼(aluminum hydroxide gel) 2㎎ 혼합액을 복강 내로 투여하고, 7일 후에 같은 조건의 농도로 복강주사 하였다. 실험 14, 15일째에 알부민 50㎍을 기도흡입하고, 실험 21, 22일째에 같은 조건의 농도로 기도 흡입하여 감작 시켰다. γ-PGA는 알부민을 주기 10분전에 기도흡입을 통해 투여했으며 실험 날짜는 12, 14, 15, 19, 21, 22이고 50㎕씩 총 6번 흡입시켰다. 실험 23일째에 메타콜린에 대한 기도반응성을 측정하고, 24일째에 생쥐를 희생시켰다. 도 3은 투여 프로토콜을 나타내는 도면이다.

2. γ-PGA가 기도과민성에 미치는 효과

실험 22일째 알부민을 기도흡입하고, 24시간 후에 생쥐를 동물용 체용적 변동기록기에 넣어 기본 Penh 값을 2분간 측정하였다. 기본 Penh 측정 후 메타콜린을 6.25, 12.5, 25 및 50㎎/㎖의 농도로 각각 30초간 흡입시킨 후 2분 동안의 Penh 값을 구한 뒤 평균을 내었다. 메타콜린에 대한 기도반응성은 체용적 변동기록기를 이용하여 Penh (enhanced pause)를 측정하였다. 도 4는 메타콜린에 대한 기도반응성을 나타내는 도면으로서, 4a는 1% γ-PGA의 분자량별 효과를, 4b는 50kDa γ-PGA의 용량별 효과를 나타낸다.

3. γ-PGA가 천식에 미치는 조직병리학적 효과

실험 23일째에 메타콜린에 대한 기도반응성을 측정하고 실험 24일째에 쥐를 희생한 뒤 기관지 폐포 세척이 끝난 폐 조직을 4% 포르말린(formalin) 용액에 넣어 고정하였다. 고정이 되면 파라핀으로 포매(embedding)한 다음 6㎛의 두께로 절편을 만들고 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin)으로 폐 조직 내에 있는 염증 세포의 침윤을 관찰하였다. 도 5는 그 결과를 나타내는 그림이다. 같은 방법으로 6㎛의 두께로 절편을 만들고 과요오드산쉬프시약(periodic acid schiff reagent)으로 폐 조직의 점액질을 염색하여 천식의 치료 효과를 관찰하였다. 도 6은 그 결과를 나타내는 그림이다.

4. 알부민으로 유도한 천식 동물모델에서 염증세포 관찰

실험 23일째에 메타콜린에 대한 기도반응성을 측정하고 실험 24일째에 쥐를 희생한 뒤 카테터를 통하여 직접 기관지에 PBS 용액 1㎖을 투여하고 기관지 폐포 세척액을 얻었다. 그 후 세척액을 사이토스핀(cytospin)을 사용하여 슬라이드 글라스에 도포한 뒤, 딥 퀵(Diff-Quick) 염색법으로 염색하고 광학 현미경으로 세포를 종류별로 계수하여 전체 기관지폐포 세척액에 포함된 대식세포, 호산구, 호중구 및 림프구의 숫자를 계산하였다. 도 7은 딥 퀵 염색 후 대식세포, 호산구, 호중구 및 림프구의 숫자를 계산한 도면이다.

5. γ-PGA가 혈 중 IgE 농도에 미치는 영향

실험 23일째에 메타콜린에 대한 기도반응성을 측정하고 실험 24일째에 쥐를 희생한 뒤 심장에서 혈액을 얻은 후 혈액으로부터 혈청을 얻었다. 혈 중 IgE 농도는 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 법을 이용하여 측정 하였다. ELISA 측정 방법은 다음과 같다. IgE 포획 항체(capture antibody)를 96-웰 플레이트에 코팅하여 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척 완충액 (0.05% Tween-20을 포함한 PBS)로 3회 세척하고, 비 특이적 결합을 막기 위해 차단 완충액 (세척 완충액 + 3% BSA)으로 37℃에서 2시간동안 배양하였다. 세척 완충액으로 3회 세척하고, 준비된 혈청을 1/100 비율로 희석하여 각 웰에 50㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 세척 완충액으로 3회 세척하고, 바이오틴화된 IgE 검출 항체(detection antibody)를 각 웰에 넣어 37℃에서 2시간동안 배양하였다. 세척 완충액으로 3회 세척하고, 스트렙토아비딘-HRP(streptoavidin-HRP)을 1/1000으로 희석한 후 각 웰에 분주하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다. 세척 완충액으로 6회 세척하고, 기질 시약(substrate reagent)을 각 웰 당 70㎕씩 분주하여 30분 동안 반응시켰다. 2N 황산(H₂SO₄) 용액을 각 웰 당 50㎕씩 분주하여 반응을 중지시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 8은 그 결과를 나타내는 그림이다.

6. RNA 준비 및 RT-중합효소 연쇄반응

실험 23일째에 메타콜린에 대한 기도반응성을 측정하고 실험 24일째에 쥐를 희생한 뒤 기관지 폐포 세척이 끝난 폐 조직을 트리졸 시약(TRIzol reagent)을 이용하여 RNA를 준비하였다. 트리졸 시약으로 얻은 RNA 2㎍은 역전사 효소(reverse transcriptase), 1mM dNTP 및 랜덤 핵사머(ramdom hexamer) 5㎍/㎖를 이용하여 cDNA를 얻었고 PCR 분석에 사용되었다. 반응은 cDNA (2㎕), 올리고 프라이머(1μM), DNA 중합효소(0.06unit), 반응 완충액, dNTP (0.25mM)을 포함하는 25㎕ 내에서 수행하였다. 반응은 94℃에서 5분 동안 초기 변성 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초로 30싸이클 수행하였다. PCR 생산물은 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 되었으며, 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색한 후 자외선으로 검출하였다. 도 9는 RT-중합효소 연쇄반응을 통해 얻은 결과 도면으로서, 9a는 아가로서 젤 사진을, 9b는 9a의 이미지를 정량하여 도식화한 것이다.

상기 결과는 γ-PCA가 사이토카이의 분비를 조절하여 기도과민성 억제, 기관지 및 폐조직에의 호산구 및 대식세포의 침윤 억제, 기관지 내 배상세포의 증식 억제, 혈청 내 IgE 항체의 역가 감소, 폐조직에서 천식질환의 원인이 되는 IL-13의 발현억제를 매개함으로써 천식에 유용하다는 것을 알 수 있다.

Claims (6)

1. IL-4 또는 IL-13의 발현을 억제하는 분자량 1~2000kDa의 폴리감마글루탐산 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 Th 매개성 천식 예방 또는 치료용 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리감마글루탐산의 분자량은 40~60kDa 인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 천식은 Th2 매개성 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, 천식 예방 또는 치료용 조성물은 경구용인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제 1 항에 있어서, 천식 예방 또는 치료용 조성물은 비경구용인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 1 항에 있어서, 천식 예방 또는 치료용 조성물은 흡입용인 것을 특징으로 하는 조성물.

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