KR20100104105A - 설포라페인을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 설포라페인을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 설포라페인 성분은 phase 2 효소의 활성을 증가시켜 연골세포 및 연골조직에서 사이토카인들에 의해 유도된 연골 기질의 분해 및 연골 파괴 효소들의 활성을 탁월히 억제하여 관절을 보호하는 효과가 있고, 류마티스 관절염 활막세포의 세포사멸을 유도하는 효과가 있으며, 항원 반응성 T 림프구의 증식을 억제하고, 전염증성 사이토카인의 생성 수치를 감소시켜 관절염의 증상을 현저하게 완화시킬 수 있는 효과가 있을 뿐만 아니라 항원 특이적인 면역억제를 유도하여 자가면역성 관절염의 증상도 개선할 수 있는 효과를 나타냄으로써, 관절염의 예방 및 치료에 유용한 약학적 조성물로 이용될 수 있다.

설포라페인, 관절염, 연골세포, 활막세포, 림프구, 사이토카인

Description

설포라페인을 유효성분으로 함유하는 관절염 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising sulforaphane as an effective component for preventing and treating arthritis}

본 발명은 설포라페인을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

관절염이란 세균이나 외상과 같은 다양한 원인에 의해 관절 내에 염증성 변화로 유발되는 질환을 말하는 것으로서 관절염의 발생 빈도는 60세 이상 인구의 약 30% 정도로 추산되고 있고, 외국 통계에 따르면 심장 질환 다음으로 많이 발생하고 있는 질병으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 최근 보건사회 연구원의 조사에 따르면 우리나라의 경우 50세 이후를 대상으로 당뇨병과 고혈압을 제치고 관절염이 가장 높은 발병율을 보이는 질병으로 보고된 바 있다. 따라서 많은 연구자들은 암이나 심혈관계 질환과 더불어 21세기의 인류의 삶의 질을 저해할 수 있는 가장 중요한 질환으로 관절염이 대두될 것으로 예상하고 있다.

한편, 관절염은 크게 비 염증성 관절염과 염증성 관절염으로 나눌 수 있는데, 비 염증성 관절염으로는 골 관절염을, 염증성 관절염으로는 류마티스 관절염을 대표적으로 들 수 있다.

골 관절염은 일명 퇴행성 관절염(degenerative arthritis)이라고도 불리며, 발병원인은 아직 분명 하지 않으나 유전, 외상, 비만, 노화, 대사이상 등과 같은 유발 인자들에 대해 연골세포의 부적절한 방어 혹은 방어 실패가 일어날 때 발생한다고 알려져 있으며(Pelletier JP 등, Arthritis Rheum., 2001, 44, 1237~47), 특히, 연골세포(chondrocyte)에서 공격인자와 방어인자 간의 균형이 깨지게 되면 연골파괴가 촉진되고 연골이 마모되면서 더 이상 충격흡수의 역할을 수행하지 못하게 되며, 이때 관절에 가해지는 과도한 힘이 그대로 뼈와 그 주변 구조물에 전달되면서 골극(osteophyte), 연부조직 신장(stretching)등과 같이 골 관절염에 특징적인 병리학적 변화가 생기게 되고 이로 인해 환자는 통증을 느끼게 되고 관절운동에 제한이 생기게 된다.

또한, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis; RA)은 관절이나 힘줄의 활막에 비세균성 염증 반응이 만성적으로 나타나며, 이로 인해 활막이 증식되고 활액의 양이 증가하여 관절의 부종과 동통을 초래하는 질환이다. 류마티스 관절염은 전신성 염증반응으로 인체 내 많은 조직과 기관(피부, 혈관, 심장 폐, 근육)들에 영향을 주며, 특히 관절에 영향을 주어 비가역적인 증식성 활막염을 일으키며 이는 관절연골의 파괴와 관절의 강직으로 진행된다. 류마티스 관절염의 원인은 아직 밝혀지지 않았으나 자가면역반응이 이 질환의 만성화와 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, 염증성 매개체들과 사이토카인(cytokine)의 국소적인 방출과 함께 T 세포가 중요한 역할을 하여 결과적으로 관절을 파괴하는 지속적인 자가 면역반응으로서 주요 증상으로는 피로, 무력감, 동통 등이며, 관절염이 진행되면서 발열 및 체력쇠약을 동반한다. 또한 염증이 일어난 관절 부근에 근육강직(muscle atrophy)과 근육경축(muscle spasm)이 나타나 관절의 움직임에 영향을 준다.

따라서 관절염을 치료하기 위한 목적은 관절의 통증과 염증을 감소시키고, 관절의 변형을 방지할 뿐만 아니라 보다 근본적으로는 관절염을 유발하는 세포내 작용 메카니즘을 밝히고 그 기작을 제어하는데 있다. 한편, 지금까지 알려진 관절염 치료제로는 적당한 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs), 금제제, 페니실라민(penicillamine), 스테로이드(steroid)성 호르몬제 등이 있다. 그러나 이러한 치료제는 장기간 복용시 부작용이 따르는 문제점이 있다. 이에 최근에는 염증 기전의 중심 역할을 하는 TNF(tumor necrosis factor)의 수용성 수용체를 유전자 재조합 기술로 생산하여 치료제로 개발하려는 노력이 있었으나, 염증, 부종, 비정상적인 신혈관 생성, 골 및 연골조직의 침식 등 예상치 못했던 부작용이 발생하는 문제점이 있다. 그러므로 생체내 적용시 비교적 부작용이 적으며 관절염의 증상을 완화시킬 수 있는 효과가 뛰어난 새로운 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 생체이물(Xenobiotics)은 미생물로부터 합성되거나 화학적으로 합성될 수 있는 물질로서 포유류의 체내에서 만들어지는 단백질과는 다른 구조를 가지며, 생체 내에서 독성 물질로 작용하여 유전자 변이, 암의 유발과 염증 반응의 유발 등 다양한 생물학적 반응을 유발시킨다. 반면, 이러한 생체이물의 대사를 조절하는 효소로는 크게 두 군으로 나눌 수 있는데, 그 중 하나가 Phase 1 효소로서 대표적으로 사이토크롬 P450 계의 효소들을 포함하며 산화-환원 단백질에 새로운 기능을 부 여하거나 단백질의 독성을 제거하는 역할을 한다. 다른 효소로는 Phase 2 효소로서 대표적으로 퀴놀린 리덕타제, 헴 옥시게나제(heme oxygenase) 및 글루타치온 S 트랜스퍼라제(glutathione S transferase)가 포함되며, phase 1 효소에 의해 전환된 단백질을 글루타치온, 글루타민산, 설페이트 등과 같은 내인성 리간드들과 결합시키는 역할을 한다. 특히, phase II 효소 중 QR(quinolone reductase)은 quinone류 자체에 대한 보호효과가 있고 항암 작용이 있는 화합물에 의해 유도되어지기 때문에 암 예방 물질 탐색의 지표가 되는 대표적인 효소로 많이 이용되고 있다. 이러한 Phase 2 효소를 유도하는 물질은 자연적으로 섭취하는 식이에도 포함되어 있으며, 특히 녹황색 채소의 항암 및 항염 작용의 상당한 효과가 Phase 2 효소의 유도에 의한 것으로 간주되고 있으며(Myzak MC 등, Cancer Res., 2004, Aug., 15, 64(16), 5767~74), Phase 2 효소의 유도 성분을 브로콜리 등의 채소에서 분석한 결과, 설포라페인(sulforaphane) 성분이 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다,

이러한 설포라페인(sulforaphane) 성분은 각종 채소류에 존재하는 화학 성분으로서 체내에 흡수되어 생체내 이물질 대사에 관여하는 phase 1 효소는 유도하지 않고, phase 2 효소만을 선택적으로 유도하는 단기능 유도체로 작용하여 항암 물질의 독성을 제거하고, 항암 물질의 활성을 억제할 뿐만 아니라 세포주기 억제와 세포사멸 유도를 통해 암세포의 증식을 억제하는 작용을 한다는 내용이 밝혀진 바 있고(Wu L., Proc Natl Acad Sci USA., 2004, May, 4,101(18), 7094~9), 나아가 헬리코박터 파이로리균을 억제하는 작용을 함으로써 위암의 치료에 효과적이라는 내용이 보고된 바 있다(대한민국 등록특허 제0773901호). 그러나 아직까지 설포라페인 성분이 관절염의 증상을 완화시키고 예방할 수 있는 효과가 있다는 내용은 밝혀진 바 없다.

이에 본 발명자들은 부작용이 적으며 관절염을 예방 및 치료할 수 있는 효과가 우수한 관절염 치료제를 개발하던 중, 설포라페인 성분이 phase 2 효소의 활성을 증가시켜 연골세포 및 연골조직에서 사이토카인들에 의해 유도된 연골 기질의 분해 및 연골 기질 분해 효소들의 활성을 탁월히 억제하여 관절을 보호하는 효과가 있고, 류마티스 관절염 활막세포의 세포사멸을 유도하는 효과가 있으며, 항원 반응성 T 림프구의 증식을 억제하고, 전염증성 사이토카인의 생성 수치를 감소시켜 관절염의 증상을 현저하게 완화시킬 수 있는 효과가 있을 뿐만 아니라 항원 특이적인 면역억제를 유도하여 자가면역성 관절염의 증상도 개선할 수 있는 효과가 있음을 처음으로 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 설포라페인의 투여로 인해 관절염의 증상을 완화시킬 수 있는 설포라페인의 신규한 용도를 제공하는 것으로서, 설포라페인을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 설포라페인을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 설포라페인 성분은 phase 2 효소의 활성을 증가시켜 연골세포 및 연골조직에서 사이토카인들에 의해 유도된 연골 기질의 분해 및 연골 기질 분해 효소들의 활성을 탁월히 억제하여 관절을 보호하는 효과가 있고, 류마티스 관절염 활막세포의 세포사멸을 유도하는 효과가 있으며, 항원 반응성 T 림프구의 증식을 억제하고, 전염증성 사이토카인의 생성 수치를 감소시켜 관절염의 증상을 현저하게 완화시킬 수 있는 효과가 있을 뿐만 아니라 항원 특이적인 면역억제를 유도하여 자가면역성 관절염의 증상도 개선할 수 있는 효과를 나타냄으로써, 관절염의 예방 및 치료에 유용한 약학적 조성물로 이용할 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 설포라페인을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에 따른 조성물에 포함된 유효성분인 설포라페인은 채소, 특히 녹황색 채소에 많이 함유된 성분으로서 항암물질의 독성을 제거하는 효과 및 세포주기 억제와 세포사멸을 통해 암세포의 증식을 억제하는 효과가 있음이 밝혀진 바 있다. 한편, 본 발명자들은 설포라페인 성분이 phase 2 효소를 유도하여 연골세포 또는 연골조직의 손상을 억제하고, 활막세포의 증식을 억제하며, 나아가 활막세포의 사멸을 유도함으로써 관절염을 예방 및 치료할 수 있음을 처음으로 발견하였다. 본 발명에서 사용된 상기 설포라페인 성분은 시중에서 판매되고 있는 것이라면 모두 사용가능 하지만, 바람직하게는 녹황색 채소로부터 분리된 것, 더욱 바람직하게는 브로컬리에서 추출된 것을 사용할 수 있다. 상기 녹황색 채소로부터 설포라페인 성분을 추출 또는 분리하는 방법은 당업계에 공지된 식물의 추출물을 수득하는 방법이라면 모두 사용할 수 있으며, 예컨대, 열수추출 또는 유기용매 추출법 등을 사용할 수 있고, 추가로 상기 방법으로 수득한 추출물을 다시 특정 성분만을 분리하는 공정, 예컨대, 크로마토그래피 등을 통해 설포라페인 성분을 분리할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 포함된 설포라페인은 phase 2 효소의 활성 유도하는 특징이 있다.

phase 2 효소는 일반적으로 약물대사 효소로 알려져 있으며, 항암 작용이 있는 화합물에 의해 유도되어지기 때문에 암 예방 물질 탐색의 지표로 이용되고 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명의 설포라페인 성분이 phase 2 효소를 유도하는지를 확인한 결과, phase 2 효소의 활성이 설포라페인 농도 의존적으로 증가함을 확 인할 수 있었다(도 1b 및 1c 참조). 또한, 본 발명에서 설포라페인에 의해 활성이 유도되는 phase 2 효소로는 이에 제한되지는 않지만, 글루쿠로노실트랜스퍼라제(glucuronosyltransferase), 글루타치온 S 트랜스퍼라제(glutathione S transferase) 및 NADPH 퀴논 옥시도리덕타제-1(NADPH quinone oxidoreductase-1)일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물에 포함된 설포라페인은 매트릭스 메탈로프로테이즈(matrix metalloproteinase, MMP)의 합성을 억제하는 특징이 있다.

일반적으로 골 관절염의 경우, 주된 발병원인은 연골 조직의 손상이라고 할 수 있는데, 특히 MMP 단백질은 연골 분해를 주로 야기하는 단백질로 알려진 바 있다. 따라서 MMP 단백질의 활성을 억제하거나 또는 합성을 억제할 수 있는 물질은 연골 분해를 감소시킬 수 있으므로 관절염의 치료제로 사용할 수 있다.

이에 본 발명의 일실시예에서는, 설포라페인이 연골분해 효소인 MMP를 억제할 수 있는 효과가 있는지를 확인한 결과, 배양된 연골 세포에 전염증성 사이토카인인 인터루킨-1과 TNF-a를 처리하기 전에 설포라페인을 처리하였을 경우, 설포라페인을 처리하지 않은 경우에 비해 MMP 단백질들, 즉, MMP-1, MMP-3, MMP-13의 분비가 억제되었고, 상기 MMP들의 mRNA 합성도 감소된 것을 확인할 수 있었으며(도 2a 및 2b 참조), 연골 조직의 경우, 설포라페인에 의해 연골 기질의 분해도 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 4a, 4b 및 4c 참조).

한편, MAP 키나아제(mitogen activated protein kinase: MAP kinase) 패밀리, 예컨대, p38 MAP 키나아제, 세포외 신호-조절 단백질 키나아제(extracellular signal-regulated protein kinase: ERK) 및 c-Jun N-말단 키나아제(c-Jun N-terminal kinase: JNK)등의 활성화(즉, 인산화)는 연골세포의 세포사멸을 매개한다.

따라서 MAP 키나아제들의 활성화, 즉 인산화를 억제할 수 있다면 관절염을 예방 또는 치료할 수 있다는 판단 하에 본 발명자들은 설포라페인 성분이 MAP 키나아제들의 활성을 억제할 수 있는지를 조사하였다. 그 결과, 설포라페인 성분이 MAP 키나아제들 중 특히 JNK의 활성을 억제한다는 사실을 확인하였으며, JNK에 의해 조절되어지는 NF-kB 또한 그 활성이 억제됨을 확인할 수 있었다(도 3a 및 3b). 그러므로 본 발명의 설포라페인은 관절염 유발 경로 중, JNK 및 NF-kB의 신호 전달을 효과적으로 억제함으로써 관절염을 치료할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물에 포함된 설포라페인은 활막세포의 증식을 억제하고, 활막세포의 세포사멸을 유도하는 특징이 있다.

류마티스 관절염의 주된 발병원인 중 하나는 활막세포(fibroblast-like synoviocyte, FLS)의 비정상적인 증식으로 인해 만성 염증을 유발하고 관절이 파괴됨에 있다. 한편, 본 발명의 설포라페인은 농도 의존적으로 활막세포의 증식을 억제하고, 세포사멸을 유도한다. 또한, 설포라페인에 의한 활막세포의 세포사멸 기전은 세포사멸 유도단백질의 활성화 및 세포사멸 억제단백질의 불활성화에 기인하다. 본 발명의 일실시예에 따르면, 류마티스 관절염의 활막세포에 설포라페인을 처리하였을 경우, 농도 의존적으로 활막세포의 세포사멸이 증가하였고(도 5a 및 5c 참조), 더불어 설포라페인에 의해 세포사멸 유도단백질인 Bax의 발현은 증가된 반 면, 세포사멸 억제단백질 Bcl-1의 발현은 감소되었으며, Bcl-1/Bax 신호 전달계의 상위 조절자인 Akt도 활성이 억제된 것으로 나타났다(도 6a 내지 6d 참조). 또한, 류마티스 관절염은 활막세포의 비정상적인 증식 이외에도 단핵구 및 T 림프구를 포함한 다양한 면역세포의 침윤이 원인이 되어 발생하기도 한다. 이들 세포는 다양한 사이토카인, 특히 인터루킨-17(IL-17) 및 TNF-a의 생성을 통해 염증반응을 증폭시키고, 자가 항체의 생성뿐만 아니라 활막세포의 상호접촉을 통해 증식을 유도함으로써 관절염을 유발시키는 것으로 알려져 있다.

따라서 단핵구 또는 T 림프구 등의 면역세포 유래의 사이토카인 분비를 억제할 수 있다면 관절염을 예방 및 치료할 수 있으므로 본 발명자들은 본 발명의 일실시예에서 설포라페인 성분이 면역세포 유래의 사이토카인 양을 조절할 수 있는지를 분석하였다. 그 결과, 본 발명의 설포라페인이 PHA 또는 항-CD3+항-CD28로 자극시킨 단핵구에서 IL-17 및 TNF-a의 생성을 감소시켰고(도 7a 내지 7e 참조), PHA 또는 항-CD3+항-CD28로 자극한 T 림프구의 증식을 억제하였다(도 7f 참조).

나아가 본 발명자들은 본 발명의 설포라페인에 의한 활막세포의 세포사멸 유도 및 면역세포, 특히, 단핵구 및 T 림프구의 활성 조절이 phase 2 효소의 활성 유도에 의한 것임을 확인함으로써 관절염 유발 신호 전달 기작에 있어서 phase 2 효소의 기능을 처음으로 규명하였다.

즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 류마티스 관절염의 활막세포에서 설포라페인 처리시 활막세포의 사멸이 촉진된 반면, phase 2 효소인 NADPH 퀴놀린 리덕타아제 1(NQO1)의 억제제인 커큐민(curcumin)을 처리 시 활막세포의 세포사멸이 감 소되고(도 8a 및 8b 참조), 염증성 사이토카인인 IL-17 및 TNF-a의 생성이 증가되었다(도 9a 및 9b 참조). 또한, NQO1에 대한 siRNA를 처리함으로써 세포내에서 NQO1의 발현을 억제하였을 경우, NQO1의 siRNA를 처리하지 않은 대조군에 비해 활막세포의 세포사멸 정도가 월등히 감소된 것으로 나타났다(도 10a 및 10b 참조). 따라서 본 발명의 설포라페인 성분에 의한 활막세포의 세포사멸 유도 및 면역세포, 특히, 단핵구 및 T 림프구의 활성 조절은 설포라페인이 phase 2 효소의 활성유도를 통해 이루어진다.

또한, 본 발명에 따른 조성물에 포함된 설포라페인은 생체내에서 다른 부작용을 초래하지 않으면서 관절염의 증상과 통증을 완화시킬 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는, 콜라겐 II형(CII; bovine type II collagen)을 투여하여 콜라겐에 의해 유도된 관절염(CIA)을 유도한 쥐에 설포라페인을 투여하여 관절염 증상 정도를 관찰한 결과, 설포라페인이 투여된 관절염 마우스에서 관절염의 증상이 완화되었고, 조직 내에서 관절 활액의 과다생성, 판누스(pannus) 형성 및 관절파괴가 감소되었으며(도 11a 내지 11e 참조), 전염증성 사이토카인인 IL-17, IL-6, IFN-r 및 TNF-a의 양은 감소된 반면, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 양은 증가하였다. 또한 CII에 반응하는 항체의 생성도 감소되어 항원 특이적 반응, 특히 자가면역 반응이 억제됨을 알 수 있었다(도 12a 내지 도 13c 참조).

그러므로 본 발명은 설포라페인을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 관절염은 골 관절염 또는 류마티스 관절염 일 수 있다.

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

연골세포 및 활막세포의 배양

본 발명에 따른 설포라페인 성분이 관절염의 증상을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있는지를 확인하기 위해 가톨릭 메디칼 센터에 입원중인 관절염 환자들로부터 연골세포 및 활막세포를 수득하여 이를 배양하였다.

먼저 연골세포는 골관절염 수술시 환자의 동의하에 수득한 연골조직을 조직절편으로 만든 후 이를 잘게 썬 다음, 6시간 동안 트립신-콜라게나제로 처리하여 연골세포를 분리하였고, 이때 분리된 세포를 함유한 배양액을 원심분리하여 연골세포를 얻은 후 직경이 10cm인 플레이트에서 배양한 후, 1주일이 지난 다음 세포가 가득차면 이를 96웰, 24웰 또는 6cm인 플레이트로 옮겨 계대배양 하였으며, 하기에서 수행하는 실험들은 첫 번째 계대 배양한 세포를 사용하였다. 또한 연골조직은 골관절염 연골에서 비교적 병변이 적은 원위 대퇴의 외측분위에서 육안으로 병변이 없는 부위를 골라 연골을 채취하였으며, 이를 절제하여 절편들을 만들었고, 각각의 절편의 무게를 측정한 후 48웰 배양기에서 조직배양 함으로써 배양된 연골조직을 수득하였다.

활막세포는 류마티스 관절염(RA) 및 골관절염 환자로부터 환자의 동의하에 활막조직을 채취한 후, 수득한 조직을 잘게 절단하고 콜라게나제(collagenase)로 처리한 후 원심분리하여 활막세포를 분리하였다. 분리된 활막세포 및 상기 연골세포는 5% FBS, 100U/ml 페니실린, 100ug/ml 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민이 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였으며, 배양된 세포들을 하기 실험들에서 사용하였다.

< 실시예 2>

연골세포에서 설포라페인에 의한 phase 2 효소의 활성 유도

설포라페인 성분이 phase 2 효소의 활성을 유도하는지를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였으며, 이때 하기 실험에 앞서 10uM의 농도인 설포라페인이 종양세포에서 세포고사를 일으키는 것으로 알려져 있어서 연골세포의 세포고사를 일으키지 않는 농도범위를 정하기 위해 각 농도별(0, 1, 2, 5, 10, 20, 50uM)의 설포라페인을 연골세포에 처리한 후 24시간 지난 다음 MTT 어세이를 통해 세포사멸을 관찰하였다. 그 결과, 설포라페인을 50uM의 농도로 처리하였을 경우, 연골세포가 사멸되는 것을 확인할 수 있었다(도 1a). 이에 본 발명자들은 설포라페인의 사용 농도를 연골세포가 사멸되지 않는 범위인 1 내지 20uM의 범위로 정한 다음 하기의 실험을 수행하였다.

설포라페인에 의한 phase 2 효소의 활성 유도 측정을 위해 연골세포에 설포라페인을 0, 1, 2, 5, 10, 20uM로 각각 처리하여 24시간 배양한 다음, 각 세포에서의 phase 2 효소인 퀴논옥시도리덕테이즈 1(quinone oxidoreductase 1:NQO1)의 활성을 측정하였다. 또한, 설포라페인에 의해 NQO1의 활성이 언제부터 유도되어지는지 확인하기 위해, 96웰에 배양된 연골세포에 10uM의 설포라페인을 처리 후 24시간 배양한 다음, NQO1의 활성을 측정하였다(Prochaska HJ 등, Anal Biochem, 1988, 169, 328~36 참조).

그 결과, 설포라페인 성분은 phase 2 효소인 NQO1의 활성을 농도 의존적으로 유도시킨다는 것을 확인할 수 있었으며(도 1b), 특히 10uM의 농도로 설포라페인을 처리할 경우, 처리 후 약 4시간 이후부터 NQO1의 활성을 유도시키는 것을 확인할 수 있었다(도 1c).

< 실시예 3>

설포라페인에 의한 MMP 단백질의 억제활성 측정

MMP(matrix metalloproteinase)는 염증 매개 물질 또는 연골 파괴 효소로서 연골을 분해하는 역할을 하는 단백질로 알려져 있으며, 또한, 연골파괴를 촉진하는 가장 강력한 물질로 전염증성 사이토카인인 IL-1 및 TNF-a 가 알려진 바 있다. 이에 본 발명자들은 설포라페인 성분이 연골을 분해하는 작용을 억제하는 효과가 있는지를 확인하기 위해 상기 실시예 1에서 배양된 연골세포에 각 농도별(0, 1, 2, 5, 10, 20uM)로 설포라페인을 처리한 후, 1시간 후에 IL-1 및 TNF-a를 각각 1ng/ml 및 10ng/ml로 처리한 다음, 4시간 후에 ELISA(Yoo SA 둥, J. Immunol, 2006, 177, 2681~90 참조) 및 RT-PCR을 통해 MMP 단백질의 분비량 및 합성량을 측정하였다. 이때, 상기 RT-PCR은 10uM의 설포라페인을 처리 후 사이토카인들을 처리한 세포를 6시간 배양한 한 다음, RNeasy mini 키트(Qiagen사)를 이용하여 총 RNA를 추출한 후, 수퍼스크립^TM first-strand 합성 시스템(인비트로젠)을 이용하여 RT-PCR을 수행하여 cDNA를 합성하였으며, 합성된 cDNA는 다시 하기의 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행함으로써 MMP-1, 3 및 13의 발현된 mRNA의 양을 측정하였다. 이때, 상기 PCR은 2.5mM의 dNTP, 2.5U의 Taq 폴리머라제 및 0.25uM의 하기 프라이머들을 각각 혼합한 반응액을 하기 표에 기재된 온도에서 어닐링하는 과정을 포함하는 일반적인 PCR 방법으로 수행하였다. 또한, 대조군으로는 GAPDH를 이용하였다.

프라이머 서열

	프라이머 서열	어닐링 온도	서열목록
MMP1 -F	5'- CTGTTCAGGGACAGAATGTGCT-3'	60	1
MMP1 -R	5'- TTGGACTCACACCATGTGTT-3'	60	2
MMP3 -F	5'- TGCGTGGCAGTTTGCTCAGCC-3'	55	3
MMP3 -R	5'- GAATGTGAGTGGAGTCACCTC-3'	55	4
MMP13-F	5'- GGCTCCGAGAAATGCAGTCTTTCTT-3'	64	5
MMP13-R	5'- ATCAAATGGGTAGAAGTCGCCATGC-3'	64	6
GAPDH-F	5'- GCTCTCCAGAACATCATCCCTGCC-3'	60	7
GAPDH-R	5'- CGTTGTCATACCAGGAAATGAGCTT-3'	60	8

그 결과, 농도 의존적으로 설포라페인을 전처리한 연골세포에서는 IL-1 또는 TNF-a와 같은 사이토카인의 처리에도 불구하고 MMP-1, 3 및 13의 분비가 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 특히, MMP 단백질의 발현 억제는 연골세포에 2uM의 설포라페인을 처리하였을 경우부터 관찰되었다(도 2a). 또한, MMP 단백질의 발현 억제는 사이토카인(IL-1 또는 TNF-a)을 먼저 처리한 후 설포라페인을 나중에 처리한 경우에서도 동일한 결과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다(결과 미도시). 나아가 RT-PCR의 결과에서도 설포라페인을 처리한 세포에서의 MMP의 발현양이 처리하지 않은 세포에 비해 월등히 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 2b).

따라서 본 발명자들은 설포라페인 성분이 세포의 이화작용을 자극하는 물질인 전염증성 사이토카인에 의한 MMP 단백질의 합성 및 발현을 억제할 수 있는 효과가 있음을 확인함으로써 설포라페인 성분이 연골분해를 억제하여 연골손상에 따른 관절염의 증상을 예방 및 치료하는 효과가 있을 것으로 예상할 수 있었다.

<실시예 4>

설포라페인에 의한 JNK 및 NF-kB의 억제활성 측정

본 발명자들은 상기 실시예 3을 통해 설포라페인 성분이 IL-1 또는 TNF-a과 같은 사이토카인에 의해 자극된 연골세포에서 MMP 단백질의 합성 및 발현을 억제하는 작용을 한다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명자들은 MMP 단백질 생성의 조절이 설포라페인에 의한 NF-kB의 조절에 의한 것인지를 확인하기 위해 NF-kB의 활성을 조절하는 것으로 알려진 MAPK(mitogen-activated protein kinase)들인 p38, ERK, SAPK/JNK 및 NF-kB의 활성 변화를 측정하였다.

먼저 MAPK들의 활성 측정을 위해 연골세포에 10uM의 설포라페인을 처리한 후 한 시간 후에 IL-1 또는 TNF-a을 처리한 다음, 15분이 경과하면 각 세포들로부터 단백질을 추출하였다. 단백질 추출은 상기 각 세포들을 4℃의 용해버퍼(50mM 소듐아세테이트, pH 5.8, 10%(v/v) SDS, 1mM Na₂EDTA, 1mM PMSF, 1ug/ml 아프로티닌, 1mM 소듐플루오라이드 및 1mM 소듐오르소바나데이트)로 용해시킨 후 BCA 방법으로 각 세포당 추출된 단백질의 양을 정량한 다음 동일 양을 12% SDS겔에 전기영동한 다음, p38, ERK 및 SAPK/JNK의 인산화된 형태를 검출할 수 있는 항체들을 이용하여 웨스턴 블럿하였다. 이때 상기 항체들은 산타크루즈 사에서 구입하여 사용하였다. 또한, NF-kB의 활성 측정은 연골세포에 10uM의 설포라페인을 처리한 후 한 시간 후에 IL-1 또는 TNF-a을 처리한 다음, 30분이 경과되면 각 세포들로부터 핵 및 세포질 추출물을 분리하였다(Schreiber M 등, Nuc Acid Res., 1989, 17, 6419 참조). 이후 추출된 핵 추출물(nuclear extract)은 전기적 이동 변이 분석방법(EMSA:electrophoretic mobility shift assay)을 수행하였는데, 즉 상기 추출물을 겔 결합 버퍼(프로메가사)와 반응시킨 후, 감마-[³²P]-아데노신-5-트리포스페이트로 말단 표지된 이중 가닥의 NF-kB 프로브(100,000 cpm/샘플당)를 첨가하여 20분간 반응시켰다. 이후 상기 반응물을 4%의 비변성 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동한 다음, 오토레디오그래피(autoradiography)를 사용하여 활성화된 NF-kB를 측정하였다.

그 결과, 연골세포에 IL-1 또는 TNF-a만을 처리하였을 경우, 세포내에서 MAPK들인 p38, ERK 및 JNK가 모두 인산화되어 활성화된 것을 확인할 수 있었고, 반면 이러한 사이토카인과 함께 설포라페인을 처리한 경우에 SAPK/JNK의 인산화는 감소된 것을 확인할 수 있었다. 한편, p38 및 ERK의 활성화에는 설포라페인이 유의적인 영향을 미치지 못하는 것을 알 수 있었다(도 3a). 또한, NF-kB 역시 IL-1 또는 TNF-a에 의해 활성화된 형태(인산화)가 설포라페인 처리시 감소하는 것을 알 수 있었다(도 3b).

< 실시예 5>

설포라페인에 의한 기질 분해 억제활성 측정

상기 실시예 3에서 본 발명의 설포라페인 성분이 연골분해 효소를 억제하는 활성이 있음을 확인함으로써 설포라페인 성분이 실질적으로 연골조직에서 사이토카인에 의해 유발되는 기질(matrix) 분해 작용을 억제할 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해 상기 실시예 1에서 수득한 연골조직에 설포라페인을 각각 10 및 20uM의 농도로 처리하여 배양한 후, 여기에 IL-1, TNF-a 및 IL-1/oncostatin M을 각각 처리하여 조직을 자극시킨 후, 각 조직별 기질 분해 정도를 프로테오글리칸(proteoglycan) 및 타입 II 콜라겐의 수준에서 측정하였으며, 상기 측정 방법은 당업계에 공지된 연골 기질 분해 정도를 측정하는 방법으로 수행하였다.

그 결과, IL-1 또는 TNF-a만으로 자극시킨 연골조직에서는 프로테오글리칸의 분해가 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 월등히 증가된 것을 확인할 수 있었으나, 설포라페인 처리 후 사이토카인으로 자극시킨 연골조직에서는 IL-1 또는 TNF-a만을 처리한 연골조직에 비해 프로테오글리칸의 분해 정도가 감소되는 것으로 나타났다(도 4a 및 4b). 또한, IL-1/oncostatin M을 처리한 경우에도 IL-1/oncostatin M에 의해 분해된 타입 II 콜라겐의 분해 정도가 설포라페인을 처리하였을 경우 현저하게 감소되는 것으로 나타났다(도 4c).

따라서 상기 결과를 통해 설포라페인 성분이 연골세포에서 전염증성 사이토카인에 의해 유발되는 연골 분해 효소의 활성 및 연골 기질 분해를 현저하게 감소시킬 수 있음을 알 수 있었고, 특히 관절염의 발병 메카니즘에 있어서, JNK의 활성화를 억제시키는 과정을 통해 NF-kB의 활성을 감소시킴으로써 관절염의 발병을 감소시키고 나아가 관절염을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

설포라페인에 의한 활막세포의 세포사멸 유도

활막세포(fibroblast-like synoviocyte, FLS)의 비정상적인 증식은 류마티스 관절염의 주요 발병 원인 중 하나이다. 이에 본 발명자들은 설포라페인 성분이 활막세포의 사멸을 유도하여 비정상적인 증식을 억제할 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해 상기 실시예 1에서 류마티스 관절염 환자로부터 수득하여 배양한 활막세포(24웰 각 플레이트 당 2 x 10⁴ 세포수)에 0, 5, 10, 20, 50, 100uM의 설포라페인을 각각 처리한 후, 24시간 또는 48시간 반응시킨 다음, 각 세포에 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드(MTT, 시그마)를 첨가한 후 2시간 동안 반응시켰다. 이후 상기 MTT용액을 제거한 다음, 마이크로플레이트 리더(Molecular devices, Palo Alto, 카나다)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정함으로써 세포들의 사멸 정도를 확인하였다. 또한, 세포 사멸시의 세포들의 모양은 APOPercentage 시약으로 염색된 세포들을 디지털 이미지로 찍어서 확인하였으며, 세포사멸의 정량분석은 요오드화 프로피듐(propidium iodide)을 이용한 flow cytometry 방법을 통해 측정하였는데, 즉, 설포라페인 및 MTT 용액으로 반응시킨 세포들을 200g로 10분 동안 원심분리하여 세포를 수득한 다음, 여기에 50ug/ml의 요오드화 프로피듐을 함유하는 저장성 형광색소 용액 500ul로 용해한 다음, 분석 전까지 얼음 상에서 15분간 방치하였다. 상기 분석은 FACScan cytometer(Becton Dickinson, San Jose, 카나다)를 이용하였다.

그 결과, 다양한 농도별로 설포라페인을 처리하였을 경우 류마티스 관절염의 활막세포에서 세포사멸이 유도되는 것을 확인할 수 있었고, 특히 100uM의 설포라페인 처리시에는 50%의 세포사멸이 유도되는 것으로 나타났으며(p<0.05)(도 5a), 50uM의 설포라페인 처리시 세포막의 “flip-flop" 현상이 일어나 세포사멸이 유도되는 것을 확인할 수 있었다(도 5b). 또한, flow cytometry를 통해서도 설포라페인 처리로 인해 사멸된 활막세포의 수가 증가한 것을 확인할 수 있었다(도 5c).

< 실시예 7>

설포라페인에 의한 세포사멸 관련 단백질들의 발현 조절

설포라페인 성분이 류마티스 관절염 활막세포의 세포사멸을 초래하는 것을 확인함으로써 본 발명자들은 이와 같은 현상이 설포라페인에 의한 세포사멸 유도 단백질의 발현 또는 활성 촉진에 의한 것인지를 확인하는 실험을 수행하였다. 상기 실험은 상기 실시예 6과 같이 다양한 농도(0, 5, 10, 50, 100uM)의 설포라페인이 처리된 활막세포를 시간별로 배양한 다음, 상기 세포에서 발현되는 사멸억제 단백질인 Bcl-2와 사멸유도 단백질인 Bax 및 p53의 발현정도 및 상기 Bcl-2/Bax의 상위 타겟이 되는 Akt의 인산화 정도를 웨스턴 블럿 방법을 통해 수행하였다. 웨스턴 블럿 방법은 먼저 배양된 세포들을 PBS로 두 번 세척한 다음, 세포들을 용해버퍼로 용해시킨 후, 세포 내의 단백질들을 10% SDS-PAGE로 전기 영동한 다음, 분리된 단백질들을 니트로셀룰로오스 막으로 이동시키고, anti-Bcl-2 항체, anti-Bax 항체, anti-p53 항체 및 anti-pAkt 항체(Ser473)를 이용하여 면역반응을 수행하였으며, 이때 상기 항체들은 모두 산타크루즈 사에서 구입하여 사용하였다. 또한, 발현된 총 단백질 양은 공정한 비교를 위해 상기 항체들과 반응시킨 막을 다시 스트립한 다음, 대조군으로 anti-베타 actin 항체를 반응시켜 면역반응을 수행하였다. 상기 면역반응은 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출 시스템(GE Healthcare, Piscataway, NJ)을 사용하여 측정하였다.

그 결과, 설포라페인이 처리된 활막세포에서 사멸억제 단백질인 Bcl-2는 설포라페인의 처리 농도가 증가될수록, 또한 처리 시간이 길어질수록 발현양이 감소되는 것으로 나타났고, 반면, 사멸유도 단백질인 Bax 및 p53은 발현양이 점점 증가되는 것으로 나타났다(도 6a 및 6b). 또한, Bcl-2/Bax의 상위조절 단백질인 Akt의 경우, 설포라페인의 처리 농도가 증가할수록 인산화 정도가 감소되는 것으로 나타났다(도 6c).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 설포라페인에 의한 활막세포의 세포사멸 현상은 pAkt의 감소를 통해 사멸억제 단백질의 발현은 감소되고 사멸유도 단백질의 발현은 증가됨을 통해 일어난다는 것을 확인할 수 있었으며(도 6d), 나아가 설포라페인 성분이 세포사멸 기작을 조절할 수 있는 역할을 한다는 점을 확인함으로써 류마티스 관절염 치료에 매우 효과적으로 사용될 수 있음을 예상할 수 있었다.

< 실시예 8>

류마티스 단핵구에서 설포라페인의 면역조절 효과 측정

<8-1> 류마티스 단핵구의 배양

류마티스 단핵구는 가톡릭 병원에 입원중인 류마티스 환자의 헤파린 처리된 말초 혈액을 Ficoll-Hypaque 상에서 밀도구배 원심분리하여 분리하였다. 분리한 말초혈액 단핵구(PBMC) 또는 CD4(+) 세포는 anti- CD4 마이크로비드(Milteny Biotec, Auburn, CA)를 이용하여 수집한 후, 이들 세포를 10% FBS(Gibco BRL, Grand Island, NY), 100U/ml 페니실린, 100ug/ml 스트렙토마이신 및 2mM L-글루타민이 함유된 RPMI 1640 배지로 현탁시킨 후, 각 세포들을 96웰 플레이트에 옮겨 37℃ 5% 이산화탄소 조건하에서 배양하였다.

<8-2> 류마티스 단핵구에서 설포라페인에 의한 면역조절 효과

상기 <8-1>에서 배양된 단핵구에 0.01 내지 100uM의 농도범위로 설포라페인을 처리한 다음, 24시간 또는 48시간 배양 후, 단핵구 세포들의 사멸정도를 앞서 기술된 바와 같은 MTT 어세이를 통해 측정하였다. 또한 일부 세포들에 대해서는 상기와 같은 농도 범위의 설포라페인 처리와 함께 상기 단핵구 세포를 피토헤마글루티닌(PHA, 시그마)(5ug/ml), 리포폴리사라카이드(LPS, 시그마)(1ug/ml), anti-CD3+anti-CD28 항체(BD Bioscience)(1ug/ml) 또는 TNF-a로 처리하여 단핵구에서 생성되는 IL-17 및 TNF-a의 양을 ELISA 방법을 통해 확인하였다. 또한, 일부세포에 대해서는 anti-CD3 및 설포라페인을 처리한 후 상기 세포에서 발현되는 RORrt, T-bet 및 GATA-3의 발현양을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 상기 RT-PCR은 시약들이 처리된 각 세포들을 RNAzol B(Biotex laboratories, San Antonio, TX)을 사용하여 2ug 씩의 RNA를 추출한 후, 역전사 효소(RevertAid Moloney murine lukemia virus reverse transcriptase, Fermentas사) 및 하기 기재된 프라이머들을 사용하여 PCR을 수행함으로써 cDNA를 합성하였고, 합성된 cDNA를 SYBR 그린 믹스(스트라타진)에 혼합하고 Mx 3000 PCR 기기를 이용하여 발현양을 측정하였다. 이때 수행한 PCR의 조건은 95℃에서 30초간 변성, 55℃ 또는 60℃에서 프라이머 어닐링, 72℃에서 30초간 연장반응 시켰고, 이러한 과정을 40회 반복수행 하였다.

프라이머 목록

	프라이머 서열	서열목록
IL-17 F	5'- TGGAGGCCATAGTGAAGG-3'	9
IL-17 R	5'- GGCCACATGGTGGACAAT-3'	10
TNF-a F	5'- CTGTAGCCCATGTTGTAGCAAAC-3'	11
TNF-a R	5'- GACCTGGGAGTAGATGAGGTACAG-3'	12
RORrt F	5'- TTTTC-CGAGGATGAGATTGC-3'	13
RORrt R	5'- CTTTCCACATGCTGGCTACA-3'	14
T-bet F	5'- AGAAAGTCTTGGGCATGAAG-3'	15
T-bet R	5'- TCAGGGATTAACACACATGC-3'	16
GATA-3 F	5'- AGGAGCAGTATCATGAAGCC-3'	17
GATA-3 R	5'- TCAGTGGTTGGAACACA-GAC-3'	18
beta actin F	5'- GAATCTCCGACCACCACTAC-3'	19
beta actin R	5'- AAGGTGCTCA-GGTCATTCTC-3'	20

그 결과, 류마티스 단핵구 세포에서도 활막세포에서와 동일하게 설포라페인의 처리농도가 높을수록, 처리시간이 길수록 세포사멸이 더 증가하는 것으로 나타났으나, 활막세포와는 달리 50uM 이하의 설포라페인을 처리시 24시간 배양동안에는 거의 세포사멸이 유도되지 않는 것으로 나타났다(도 7a). 따라서 세포사멸을 유도하지 않는 농도의 설포라페인을 단핵구 세포에 처리하고, PHA, anti-CD3 + anti-CD28 항체 또는 LPS로 상기 세포를 자극한 뒤, 세포로부터 생성되는 IL-17 및 TNF-a의 양을 측정한 결과, PHA 및 anti-CD3 + anti-CD28 항체를 처리하였을 경우에는 설포라페인의 처리 농도가 높아질수록 세포로부터 분비되는 IL-17 및 TNF-a의 양이 감소되는 것으로 나타났으나(도 7b 및 7d), LPS 처리 시에는 세포로부터 분비되는 TNF-a의 양에 아무런 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 7c). 따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 설포라페인 성분이 마크로파지/모노사이트로부터 유래되는 사이토카인 조절에는 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.

나아가 mRNA 수준에서 설포라페인에 의한 IL-17 및 TNF-a의 발현양을 RT-PCR을 통해 확인한 결과, anti-CD3 + anti-CD28 항체로 세포를 자극하였을 경우, IL-17 및 TNF-a의 발현은 감소되는 것으로 나타났고, 특히 10uM의 설포라페인 농도에서 IL-17은 거의 발현되지 않는 것으로 나타났다(도 7e).

한편, RORrt, T-bet 및 GATA-3 단백질은 T 세포(T_H17) 계보의 분화를 조절하는 단백질로 보고된 바 있으며(Dong C., Nat Rev Immunol, 2008, 8, 337~48), 특히 RORrt 및 T-bet의 발현은 선천적인 T 세포를 자가면역 관절염을 유도하는 T_H17 또는 Th1 세포로의 분화에 필수적이다. 따라서 이러한 단백질의 발현이 설포라페인에 의해 조절되는지를 조사한 결과, T 세포에서 anti-CD3에 의해 발현이 증가된 RORrt 및 T-bet는 설포라페인의 처리 농도가 높을수록 발현양이 감소되는 것으로 나타난 반면, GATA-3의 발현에는 거의 아무런 영향을 주지 않는 것으로 나타났다(도 7f). 이로써 본 발명자들은 T 세포에서 설포라페인 성분에 의한 IL-17 생성의 억제는 설포라페인 성분이 RORrt의 발현을 억제함으로써 이루어진다는 사실을 알 수 있었다.

<8-3> 설포라페인에 의한 류마티스 단핵구의 증식 조절 효과

설포라페인 성분이 관절염의 증상을 완화시키기 위해 T 세포의 증식을 억제할 수 있는지를 조사하기 위하여, 앞서 관절염 환자로부터 수득한 96웰 플레이트 상에서 배양된 단핵구 세포(5x 10⁵ cells/well)에 대하여 각 농도별(0.1, 1, 5, 10uM)로 설포라페인을 처리하고 상기 세포를 PHA(5ug/ml) 또는 anti-CD3+anti-CD28 항체(BD Bioscience)(1ug/ml)로 자극한 후 24시간 또는 48시간 배양하였다. 그런 뒤, 각 웰에 대하여 1uCi/well의 [H³]-티미딘(NEN, 보스톤)을 첨가하였고, 16시간 뒤 세포들을 모아 유리 섬유 필터로 옮긴 다음, Matrix 96 direct ionization β-counter를 이용하여 세포증식 정도를 측정하였다(Kim WU 등, Artiritis Rheum., 2002, 46, 1109~20). 이때 결과는 분당 카운트수(c.p.m.)로 나타내었다.

그 결과, 도 7g에 나타낸 바와 같이, 설포라페인 성분은 PHA 또는 anti-CD3+anti-CD28 항체로 자극시킨 T 세포에서 세포의 증식 및 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었으며, 나아가 세포사멸을 유도하지 않는 0.1 내지 30uM의 농도 범위에서 설포라페인을 류마티스 T 세포에 처리하였을 경우, G1 상에서 세포 주기의 진행이 점진적으로 정지되는 것을 확인할 수 있었다(결과 미도시).

<실시예 9>

류마티스 활막세포에서 설포라페인에 의한 phase 2 효소 활성 및 세포사멸 유도 측정

본 발명자들은 암세포와 림프구 등에서 세포사멸을 유도하거나 또는 세포주기를 조절하는 기능이 있다고 알려진 phase 2의 효소인 NADPH quionone oxidoreductase 1(NQO1)에 대하여, 류마티스 활막세포의 세포사멸 및 T 세포에서의 사이토카인 생성이 설포라페인에 의한 NQO1의 활성으로 유도되는 것인지를 조사하였다. 이를 위해 앞서 기술된 류마티스 환자로부터 수득한 활막세포(1x10⁵ cells/well)에 설포라페인을 각 농도별(0, 1, 10, 20uM)로 처리 후 12시간 배양한 다음, 각 세포들을 용해하여 NQO1 효소활성을 측정하였다. 이때 상기 효소활성 측정은 Prochaska HJ 등에 의해 1988년에 보고된 Anal Biochem 문헌(169, 328~36)에 기술된 방법대로 수행하였다. 또한, 류마티스 활막세포(5x10⁴ cells/well)에 대하여 20uM의 농도로 설포라페인을 처리하여 72시간 배양시, NQO1의 억제제로 알려진 커큐민(curcumin)을 농도별(0, 0.1, 1, 10, 20uM)로 처리하였고, 이들에 의한 세포사멸 정도는 MTT 어세이를 통해 측정하였다.

그 결과, 류마티스 활막세포에 설포라페인을 처리하였을 경우, 농도 의존적으로 NQO1 효소의 활성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 8a). 또한, 설포라페인에 의해 유도되는 활막세포의 세포사멸은 NQO1 억제제인 커큐민을 처리하였을 경우, 세포사멸이 억제되는 것을 확인할 수 있었으며, 처리한 커큐민의 농도가 높아질수록 세포사멸의 억제는 점점 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 8b).

<실시예 10>

류마티스 단핵구 세포에서 설포라페인에 의한 phase 2 효소 활성에 따른 T 림프구의 활성 조절

류마티스 환자로부터 수득한 단핵구 세포(1x10⁶ cells/well)에 설포라페인(1 또는 10uM) 및 anti-CD3(1ug/ml)+anti-CD28(1ug/ml)를 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 또한 동시에 상기 세포에 NQO1의 억제제인 커큐민을 0.1 또는 1uM의 농도로 처리하여 배양한 다음, 상기 세포로부터 생성되는 IL-17 및 TNF-a양을 측정하였다. 측정은 상기 실시예 <8-2>에 기재된 방법으로 수행하였다.

그 결과, anti-CD3+anti-CD28로 자극된 류마티스 단핵구 세포에서 생성되는IL-17 및 TNF-a양은 설포라페인 처리 시 생성양이 감소한 반면, NQO1의 억제제인 커큐민을 처리하였을 경우, 감소된 IL-17 및 TNF-a의 생성양이 다시 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 9a 및 9b). 따라서 상기 결과로 설포라페인에 의한 T 림프구의 활성 조절은 phase 2 효소, 특히 NQO1의 활성유도를 통해 이루어진다는 사실을 알 수 있었다.

<실시예 11>

NQO1의 siRNA를 이용한 류마티스 활막세포에서의 세포사멸 감소 효과 상기 실시예 9 및 10을 통해 본 발명의 설포라페인에 의한 류마티스 활막세포의 세포사멸 및 T 림프구의 활성은 phase 2 효소인 NQO1의 활성에 의한 것임을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 상기 결과를 보다 확실히 하기 위해 NQO1의 siRNA를 제작하여 이를 활막세포에 주입한 후, 설포라페인 처리시 NQO1의 siRNA에 따른 활막세포의 세포사멸에 대한 영향을 조사하였다. 이를 위해 류마티스 환자로부터 수득한 활막세포에 리포펙타민(인비트로젠)을 이용하여 100pM의 NQO1 siRNA(산타크루즈)을 트랜스팩션 하였다. 이때 대조군으로는 스크램블 서열을 갖는 RNA(산타크루즈)을 동일한 방법으로 트랜스팩션 하였다. 24시간 이후, 세포들을 모은 다음, NQO1의 mRNA 및 단백질 발현 정도는 RT-PCR 및 anti-NQO1 단일항체를 이용한 웨스턴 블럿 방법으로 측정하였다. NQO1의 mRNA 측정을 위한 RT-PCR은 NQO1에 특이적인 프라이머인 정방향 프라이머(NQO1-F, 5'-GAGGACGTCCTTCAACTATGCC-3'; 서열목록 21) 및 역방향 프라이머(NQO1-R 5'-CCTTTGTCATACATGGCAGCG-3'; 서열목록 22)를 이용하였고, PCR 조건은 94℃에서 30초 변성, 57℃에서 60초 어닐링 및 72℃에서 30초 연장시키는 과정을 28회 반복하였다. 또한 세포 사멸 정도는 앞서 기술한 바와 같은 MTT 어세이를 통해 수행하였다. 여기서 설포라페인에 의한 활막세포의 세포사멸이 NQO1에 의한 것인지를 확인하려는 상기 실험에 있어서, 설포라페인은 NQO1 siRNA를 트랜스팩션 한 세포 또는 트랙스팩션하지 않은 세포에 대하여 각 농도별(10 내지 50uM)로 48시간 동안 처리하였다.

그 결과, 활막세포에 NQO1 siRNA를 트랜스팩션 한 경우, RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 통해 발현된 NQO1의 mRNA 및 단백질 양이 대조군에 비해 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 10a). 또한, MTT 어세이를 통해 활막세포에 설포라페인을 농도별로 처리하였을 경우, 농도 의존적으로 세포사멸이 증가한 반면, NQO1 siRNA을 트랜스팩션 하였을 경우, 대조군에 비해 세포사멸 정도가 월등히 감소된 것을 확인할 수 있었다(도 10b). 따라서 설포라페인 성분에 의한 류마티스 활막세포의 세포사멸은 phase 2 효소인 NQO1의 활성유도를 통해 이루어짐을 알 수 있었다.

< 실시예 12>

설포라페인에 의한 콜라겐-유도 관절염의 억제

설포라페인 성분이 in vivo 상에서 관절염의 진행을 늦출 수 있는지를 조사하였다. 이를 위해 7 내지 8주령의 수컷 DBA/1 마우스(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)를 bovine 타입 II 콜라겐(CII; Chondrex, Redmond, WA)으로 면역시켰다. 면역 후, 3주부터 이틀에 1회 간격으로 5주 동안 다양한 농도(300uM, 1.5mM, 7.5mM)의 설포라페인을 관절염 마우스의 복강내로 주입시켰다. 이때 대조군으로는 설포라페인 대신 부형제(vehicle)를 주입시켰다. 이후, 관절염이 유도된 마우스에서 설포라페인 주입에 의한 관절염의 증상 정도를 하기와 같은 측정법에 따라 평균증상지수를 평가하였다. 즉, 0점의 경우 관절염 증상이 없음(정상), 1점의 경우 미약하게 발견됨, 2점의 경우 중간정도의 증상, 3점의 경우 심한 증상이 발견됨을 척도로 하여 점수를 책정하였다. 또한, 7.5mM의 설포라페인을 주입한 마우스군은 주입 이후 시간별로 마우스로부터 혈장을 채취하여 LC/MASS를 통해 혈장내의 설포라페인 농도를 측정하였고, 1.5mM의 설포라페인을 주입한 마우스군은 관절조직에 대하여 관절파과와 염증세포의 침윤 정도를 면역조직화학법을 통해 현미경으로 관찰하였다.

이때, 상기 LC/MASS 분석은 수득한 관절염 마우스의 혈장을 4℃에서 센트리콘 필터(밀리포어사)에 통과시켜 3kDa 보다 큰 단백질들을 제거시켰고, 남은 샘플들을 HPLC 시스템(LC packings) 및 나노-ESI 소스가 구비된 Q-TRAP 2000 하이브리드 탄뎀 매스 스펙트로미터(Applied Biosystems/MDS SCIEXS)로 구성된 LC/MS 시스템을 이용하여 질량분석하였다. 이때 고(high)해상 분리를 위해 나노 크기의 RPC 분석용 컬럼(LC packings)을 사용하였으며, 이동상으로 0.1% 포름산이 함유된 증류수(phase A) 및 0.1% 포름산이 함유된 100% HPLC 등급의 ACN(phase B)를 사용하였고, 500nl/min의 속도로 분리하였다. 이온 스프레이 니들은 양전하 모드하에서 1.8kV를 유지시켰고, MRM(multiple reaction monitoring) 스캔 모드에서 m/z 178 내지 72 질량 전이들을 모니터링함으로서 분석하였다.

상기 면역조직화학법은 포르말린으로 고정된 마우스의 관절조직 5um 절편을 파라핀을 묻혀 현미경으로 관찰하였다. 이때 세포내 퍼옥시다제 활성은 3%의 과산화수소를 처리하여 억제시켰고, 상기 절편을 10%의 정상 염소의 혈청과 37℃에서 60분간 반응시켜 비특이적 결합을 억제하였다. 이후 상기 절편을 4℃ 토끼 항-vWF 항체(산타크루즈)와 밤새도록 반응 시켰고, 반응이 완료된 후 상기 절편에 퍼옥시다제가 결합된 스트렙타비딘(streptavidin)(다코사) 및 3,3-디아미노벤지딘을 상온에서 30분간 반응시킨 다음 헤마토크실린 또는 에오신으로 염색하여 이를 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 콜라겐으로 관절염을 유발시킨 마우스에서 각 농도별로 설포라페인을 주입시켰을 경우, 주입하지 않았을 경우에 비해 관절염의 증상이 완화되는 것을 확인할 수 있었으며(도 11a), 마우스의 다리 부분의 관절 부분을 육안으로 관찰한 결과에서도 설포라페인을 주입한 경우가 주입하지 않은 경우에 비해 관절염의 증상이 월등이 회복된 것을 확인할 수 있었다(도 11b). 또한 관절염 마우스의 혈장에서 설포라페인의 농도를 LC/MS를 이용하여 시간별로 측정한 결과, 7.5mM의 설포라페인을 1회 주입한 경우, 1시간 후에 혈장 내에서의 설포라페인 농도가 평균 210uM 정도인 것으로 나타났고 이러한 농도는 in vitro 실험에서 수행된 효과적인 농도에 충분히 도달된 양임을 확인할 수 있었으며, 4시간 이후에는 약 24uM의 농도로 급격히 감소됨을 확인할 수 있었다(도 11c).

또한, 관절염이 유발된 마우스에 대하여 설포라페인을 주입한 후 마우스의 관절 조직을 화학염색법으로 분석한 결과, 대조군 마우스(vehicle을 주입한 마우스)에 비해 설포라페인을 주입한 마우스에서 염증정도, 활막과다 증식증, 판누스 형성 및 골파괴 정도가 유의적으로 감소됨을 확인할 수 있었다(도 11d 및 11e).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 설포라페인 성분이 다른 부작용을 유발하지 않으면서 관절파괴 및 염증세포의 침윤과정을 감소시키고 신생혈관 형성도 감소시킴으로써 관절염의 증상을 효과적으로 완화시킬 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 13>

관절염 마우스에서 자가면역 및 사이토카인에 대한 설포라페인의 영향

설포라페인이 전염증성 사이토카인과 항염증성 사이토카인 및 bovine tye II 콜라겐(CII)-특이적 자가면역 반응에 어떠한 영향이 주는지를 조사하였다. 조사를 위해 먼저 설포라페인(1.5mM 또는 7.5mM) 또는 부형제(vehicle)를 주입한 마우스에 CII로 면역시킨 후 42일이 지난 다음, 상기 마우스로부터 혈청을 분리하여 혈청에 존재하는 CII에 대한 IgG 항체의 양을 ELISA 키트(Chondrex)를 이용하여 측정하였다. 또한, T-세포 증식반응은 상기와 같이 CII로 마우스를 면역시키고 마우스의 림프절 세포(lymph node cell) 및 비장세포(spleen cell)를 이용하여 Yoo SA 등에 의해 보고된 문헌(J. Immunol., 2005, 174, 5846~55)에 기술된 방법으로 T-세포의 증식 정도를 분석하였고, T 세포의 증식 속도는 상기 실시예 <8-3>에 기술된 단핵구의 증식정도를 측정하는 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 또한, 전염증성 사이토카인인 IL-17, TNF-a, IL-6 및 IFN-r와 항염증성 사이토카인인 IL-10의 농도는 CII로 면역시킨 마우스를 1.5mM의 설로라페인으로 처리한 다음 림프절 세포 및 비장세포의 배양 상등액을 가지고 ELISA 방법을 이용하여 측정하였다. 이때 대조군으로는 CII로 면역시키지 않은 정상 마우스를 사용하였다.

그 결과, CII로 유도된 관절염 마우스의 혈청에 존재하는 CII에 대한 IgG 항체의 양은 설포라페인을 처리한 마우스의 경우가 대조군 마우스(vehicle만 처리한 마우스)에 비해 현저하게 감소된 것으로 나타났다(도 12a). 또한 CII에 의한 T 세포 증식은 설포라페인이 처리된 마우스의 경우가 대조군 마우스(vehicle만 처리한 마우스)에 비해 림프절 세포증식 및 비장세포 증식이 모두 감소된 것으로 나타났다(도 12b). 나아가 CII에 의해 관절염이 유도된 마우스의 경우, 설포라페인이 처리된 군이 vehicle만을 처리한 군에 비해 분비되는 사이토카인의 양이 감소된 것을 확인할 수 있었는데, 특히 전염증성 사이토카인인 IL-17, TNF-a, IL-6 및 IFN-r의 양은 감소된 것으로 나타난 반면, 항염증성 사이토카인인 IL-10의 경우는 증가한 것으로 나타났다. 한편, CII를 처리하지 않은 마우스의 경우, 즉 정상의 마우스 경우에는 설포라페인의 주입 여부와 관계없이 사이토카인의 양적 변화는 거의 없는 것으로 나타났다(P<0.05)(도 12c 및 12d).

따라서 본 발명자들은 관절염 마우스에 설포라페인을 주입시킬 경우, T 세포에서 생성되는 전염증성 사이토카인의 양은 감소되는 반면, 항염증성 사이토카인의 양은 증가됨을 통해 관절염의 증상을 완화시킬 수 있다는 것을 알 수 있었으며, 따라서 자가면역 관절염을 유발하는 T_H17 세포로의 전이를 억제할 수 있을 뿐만 아니라 생체 내에서 CII에 대한 자가면역 반응을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 14>

설포라페인이 수동적 모델의 관절염 마우스에 미치는 영향

일반적으로 콜라겐 유도형 관절염은 CII-반응성 T 세포 및 CII에 대한 항체의 상승 작용에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다. 한편, 본 발명은 설포라페인이 CII-반응성 T 세포 활성 및 증식을 억제한다는 사실을 확인하였지만 이러한 관절염에 대한 설포라페인의 치료기작이 활막세포의 활성 및 증식에 직접적으로 작용하는지는 분명하지 않다. 따라서 본 발명자들은 적응 면역계(adaptice immunity)와는 독립적인 수동적 모델의 관절염 상에서 설포라페인에 대한 영향을 조사하였다.

이를 위해 1.5mM의 설포라페인이 주입된 8주령의 수컷 C57BL/6 마우스 및 PIGF(-/-) 마우스(C57BL/6) 각각에 대하여 항-type II 콜라겐 항체(2mg, Chondrex)를 정맥내로 주입시켰다. 이때 대조군으로는 설포라페인을 주입하지 않은 마우스에 항-type II 콜라겐 항체만을 주입시킨 마우스를 이용하였다. 이후 관절염의 증상 정도를 Yoo SA 등에 의해 보고된 문헌(J.Pharmacol Exp Ther., 2004, 310, 263~71)에 기술된 방법으로 측정했는데, 각 마우스의 다리에 대해서는 0 내지 4점수로 관절염의 평균 증상을 측정하였고, 앞다리 및 뒷다리의 부은 정도는 마이크로칼리퍼를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 항체 투여후 10일이 지난 다음 관절염의 지수는 대조군의 경우(severity:10.3± 2.8)가 설포라페인을 투여한 군(severity:5.5.3± 2.1)에 비해 약 2배 정도 높은 것으로 나타났다(p<0.001)(도 13a). 또한 관절염 마우스의 발의 붓기도 대조군에 비해 설포라페인 투여 군이 월등히 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 13b 및 13c). 따라서 본 발명자들은 설포라페인 성분이 항체-유도형 관절염의 증상을 완화 및 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

도 1a는 설포라페인의 다양한 농도에서 연골세포의 사멸정도를 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 1b는 다양한 농도의 설포라페인을 연골세포에 처리시 phase 2 효소인 NADPH 퀴논 옥시도리덕타제-1의 활성도를 나타낸 막대 그래프이다.

도 1c는 10uM의 설포라페인을 연골세포에 처리한 후 시간에 따른 NADPH 퀴논 옥시도리덕타제-1의 활성도를 나타낸 그래프이다.

도 2a는 연골세포에 각 농도별로 설포라페인을 처리한 후 IL-1 또는 TNF-a에 의해 유도되는 MMP-1, MMP-3, MMP-13의 생성양을 비교한 막대 그래프이다.

도 2b는 연골세포에 10uM의 설포라페인을 처리한 후 IL-1 또는 TNF-a에 의해 발현된 MMP-1, MMP-3, MMP-13의 mRNA의 양을 RT-PCR을 통해 분석한 결과이다.

도 3a는 연골세포에 10uM의 설포라페인을 처리한 후 IL-1 또는 TNF-a를 처리한 다음, 세포내의 MAPK들인 p38, ERK 또는 JNK의 활성화, 즉 인산화 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과이다.

도 3b는 연골세포에 10uM의 설포라페인을 처리한 후 IL-1 또는 TNF-a를 처리한 다음, 세포내의 NF-kB의 인산화 정도를 EMSA 방법을 통해 확인한 결과이다.

도 4a 및 4b는 연골 조직에 10uM 또는 20uM의 농도로 설포라페인을 처리한 후, IL-1 또는 TNF-a로 자극시킨 다음, 연골 조직의 기질인 프로테오글리칸의 분해 정도를 나타낸 막대 그래프이다.

도 4c는 연골 조직에 10uM 또는 20uM의 농도로 설포라페인을 처리한 후, IL- 1/oncostatin M으로 자극시킨 다음, 타입 II콜라겐의 분해 정도를 나타낸 막대 그래프이다.

도 5a는 류마티스 관절염의 활막세포에 각 농도별로 설포라페인을 처리한 다음 24시간 또는 48시간 후에 MTT 어세이를 통해 세포사멸 정도를 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 5b는 류마티스 관절염의 활막세포에 50uM의 농도로 설포라페인을 처리한 세포와 설포라페인을 처리하지 않은 세포를 APOPercentage 아폽토시스 어세이를 통해 현미경으로 각 세포들을 관찰한 사진이다.

도 5c는 류마티스 관절염의 활막세포에 50uM의 농도로 설포라페인을 처리한 세포와 설포라페인을 처리하지 않은 세포를 flow cytometry 방법을 통해 세포사멸 정도를 분석한 그래프이다.

도 6a 내지 도 6c는 류마티스 관절염의 활막세포에 각 농도별로 또는 시간별로 설포라페인을 처리한 후 세포내에서 발현되는 Bcl-2, p53, Bax 및 pAkt의 발현양을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과이며, 베타-액틴은 대조군으로 사용하였다.

도 6d는 상기 도 6a 내지 도 6c에서 Bcl-2, Bax 및 pAkt들의 발현양을 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 7a는 류마티스 관절염의 T 세포(CD4(+))에 각 농도별로 설포라페인을 처리한 후 24시간 또는 48시간 후에 MTT 어세이를 통해 세포사멸 정도를 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 7b는 류마티스 관절염 환자로부터 수득한 단핵구 세포에 다양한 농도의 설포라페인 존재 하에서 PHA 또는 anti-CD3 항체+ anti-CD28 항체로 단핵구 세포를 자극한 후 ELISA를 통해 생성된 IL-17의 양을 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 7c는 류마티스 관절염 환자로부터 수득한 단핵구 세포에 다양한 농도의 설포라페인 존재 하에서 LPS 또는 anti-CD3 항체+ anti-CD28 항체로 단핵구 세포를 자극한 후 ELISA를 통해 생성된 TNF-a의 양을 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 7d는 류마티스 관절염의 T 세포(CD4(+))에 1uM 또는 10uM의 설포라페인을 처리한 다음, anti-CD3 항체+anti-CD28 항체로 세포를 자극한 후 ELISA를 통해 생성된 IL-17 및 TNF-a의 양을 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 7e는 류마티스 관절염의 T 세포(CD4(+))에 1uM 또는 10uM의 설포라페인을 처리한 다음, anti-CD3 항체+anti-CD28 항체로 세포를 자극한 후 발현된 IL-17 및 TNF-a의 mRNA의 양을 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 7f는 류마티스 관절염의 T 세포(CD4(+))에 1uM 또는 10uM의 설포라페인을 처리한 다음, anti-CD3 항체로 세포를 자극한 후, RT-PCR을 통해 RORrt, T-bet 및 GATA-3의 발현정도를 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 7g는 류마티스 관절염의 단핵구 세포를 각 농도별 설포라페인 존재 하에서 PHA 또는 anti-CD3 항체+ anti-CD28 항체로 자극시킨 후, [³H] 티미딘 도입 방법(c.p.m.)을 통해 T 세포의 증식 정도를 측정한 결과이다.

도 8a는 류마티스 관절염의 활막 세포를 각 농도별 설포라페인으로 처리한 후, 각 세포들을 용해시킨 후 NQO1 효소의 활성도를 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 8b는 류마티스 관절염 활막 세포에 50uM의 설포라페인을 처리한 후 NQO1의 억제제인 커큐민을 다양한 농도로 처리한 후, MTT 어세이를 통해 각 세포의 사멸 정도를 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 9a 및 9b는 류마티스 관절염의 단핵구 세포를 anti-CD3 항체+anti-CD28 항체로 자극시킨 후 커큐민의 존재 또는 부존재 하에 1uM 또는 10uM의 설포라페인을 처리한 다음, 생성되는 IL-17 또는 TNF-a의 양을 막대 그래프로 나타낸 것이다.

도 10a는 류마티스 관절염의 활막 세포에 NQO1의 siRNA를 트랜스팩션한 후, 24시간 또는 48시간 후의 NQO1의 mRNA의 양을 RT-PCR(위) 또는 웨스턴 블럿(아래)을 통해 분석한 결과이며, lane 1 및 4는 siRNA를 트랜스팩션하지 않은 것이고, lane 2 및 5는 control siRNA을 트랜스팩션한 것이며, lane 3 및 6이 NQO1의 siRNA를 트랜스팩션한 것이다.

도 10b는 활막 세포에 NQO1의 siRNA를 트랜스팩션 함으로써 NQO1의 발현억제에 따른 활막 세포의 세포사멸 정도를 MTT 어세이로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 11a는 콜라겐 II로 유도된 관절염 마우스에 각 농도별로 설포라페인을 복강내로 주입시킨 후 관절염의 증상 정도를 그래프로 나타낸 것이다.

도 11b는 콜라겐 유도 관절염 마우스에 1.5mM의 설포라페인을 처리한 마우스와 대조군으로 부형제(vehicle)을 처리한 마우스의 경우, 각 마우스들의 앞다리(위) 및 뒷다리(아래)의 관절염 증상 정도를 육안으로 관찰한 사진이다.

도 11c는 마우스에 7.5mM의 설포라페인을 복강 내로 주입한 후, 시간별로 마 우스로부터 혈장을 분리한 다음, 혈장 내의 설포라페인의 농도를 LC-MASS를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 11d는 마우스에 1.5mM의 설포라페인 또는 PBS를 복강 내로 주입한 후, 마우스의 관절을 헤마토크실렌 및 에오신으로 염색한 다음 광학 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것으로서, a 내지 d는 PBS만을 주입한 마우스의 관절을 나타낸 사진이고, e 및 f는 설포라페인을 주입한 마우스의 관절을 나타낸 것이며, 특히 b의 화살은 관절의 침식 및 파과를 나타낸 것이고, d의 화살은 경화된 연골조직을 나타낸 것이며, e의 화살은 정상의 활막을 나타낸 것이고, f의 화살은 마우스의 발목관절에서 관절연골을 나타낸 것이다.

도 11e는 마우스에 1.5mM의 설포라페인 또는 부형제(vehicle)를 주입한 후, 조직 염색학으로 관찰하여 형성된 염증, 활막 과증식 및 판누스 형성 정도를 그래프로 비교하여 나타낸 것이다.

도 12a는 마우스에 1.5mM의 설포라페인, 7.5mM의 설포라페인 또는 부형제(vehicle)를 각각 주입한 후 6주 후에 혈청에 존재하는 타입 II 콜라겐에 대한 IgG 항체(anti-CII 항체)의 양을 1:8000 및 1:16000으로 희석하여 그 양을 비교한 그래프이다.

도 12b는 100ug/ml CII로 관절염이 유도된 마우스에 1.5mM의 설포라페인 또는 부형제(vehicle)를 각각 주입한 후 마우스로부터 림프절 세포 또는 지라 세포의 수를 카운트 하여 T 세포의 증식 정도를 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 12 c 및 d는 관절염 마우스의 림프절 세포 및 지라 세포로부터 생성된 사 이토카인에 대한 설포라페인의 영향을 조사한 것으로서, 100ug/ml CII로 처리한 마우스 및 처리하지 않은 마우스로부터 수득한 림프절 세포 및 지라 세포 각각에 대하여 1.5mM의 설포라페인 또는 부형제(vehicle)를 주입한 후, 생성된 IL-17, TNF-a, IL-6, IFN-r 및 IL-10의 양을 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 13a는 1.5mM의 설포라페인 또는 부형제(vehicle)를 각각 투여한 마우스에 항-CII 항체(2mg)의 혼합물을 주입한 후, 각 마우스에 대해 시간에 따른 관절염의 평균 증상지수를 그래프로 비교하여 나타낸 것이다.

도 13b는 1.5mM의 설포라페인 또는 부형제(vehicle)를 각각 투여한 마우스에 항-CII 항체(2mg)의 혼합물을 주입한 후, 각 마우스에 대해 시간에 따른 발의 붓기 정도를 그래프로 비교하여 나타낸 것이다.

도 13c는 1.5mM의 설포라페인 또는 부형제(vehicle)를 각각 투여한 마우스에 항-CII 항체(2mg)의 혼합물을 주입한 후, 각 마우스의 앞다리(위) 및 뒷다리(아래)의 관절염 증상 정도를 육안으로 관찰한 사진이다.

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition comprising sulforaphane as an effective component for preventing and treating arthritis <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1 F <400> 1 ctgttcaggg acagaatgtg ct 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP-1 R <400> 2 ttggactcac accatgtgtt 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP3-F <400> 3 tgcgtggcag tttgctcagc c 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP3-R <400> 4 gaatgtgagt ggagtcacct c 21 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP13-F <400> 5 ggctccgaga aatgcagtct ttctt 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP13-R <400> 6 atcaaatggg tagaagtcgc catgc 25 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F <400> 7 gctctccaga acatcatccc tgcc 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R <400> 8 cgttgtcata ccaggaaatg agctt 25 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17 F <400> 9 tggaggccat agtgaagg 18 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-17 R <400> 10 ggccacatgg tggacaat 18 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFa-F <400> 11 ctgtagccca tgttgtagca aac 23 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFa-R <400> 12 gacctgggag tagatgaggt acag 24 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RORrt-F <400> 13 ttttccgagg atgagattgc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RORrt-R <400> 14 ctttccacat gctggctaca 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-bet F <400> 15 agaaagtctt gggcatgaag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T-bet R <400> 16 tcagggatta acacacatgc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GATA-3 F <400> 17 aggagcagta tcatgaagcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GATA-3 R <400> 18 tcagtggttg gaacacagac 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin F <400> 19 gaatctccga ccaccactac 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin R <400> 20 aaggtgctca ggtcattctc 20 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NQO1-F <400> 21 gaggacgtcc ttcaactatg cc 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NQO1-R <400> 22 cctttgtcat acatggcagc g 21

Claims (7)

1. 설포라페인(sulforaphane)을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 설포라페인은 phase 2 효소의 활성을 유도하는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 phase 2 효소는 글루쿠로노실트랜스퍼라제(glucuronosyltransferase), 글루타치온 S 트랜스퍼라제(glutathione S transferase) 및 NADPH 퀴논 옥시도리덕타제-1(NADPH quinone oxidoreductase-1) 로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 설포라페인은 연골세포에서 MMP-1, MMP-3 및 MMP-13의 발현을 억제하고, JNK 및 NF-kB의 인산화를 억제하는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 설포라페인은 면역억제 효과, 활막세포의 증식억제 효 과 및 활막세포의 세포사멸 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관절염은 골 관절염 또는 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
7. 제1항에 있어서, 상기 설포라페인은 녹황색 채소로부터 분리된 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.

Images