KR20100101655A

KR20100101655A - 안정한 엘사미트루신 염 제제

Info

Publication number: KR20100101655A
Application number: KR1020107015451A
Authority: KR
Inventors: 어쇼크 고어; 궉 음 츠앙
Original assignee: 스펙트럼 파마슈티컬즈 인크
Priority date: 2007-12-19
Filing date: 2008-12-19
Publication date: 2010-09-17
Also published as: JP2011507899A; IL206473A; RU2010129518A; MX2010006880A; CN102006859A; CA2709227A1; AU2008342992A1; JP5788175B2; AU2008342992A2; JP2014114313A; RU2491056C2; IL206473A0; WO2009086108A1; BRPI0820811A2; US20110251143A1; EP2222276A1; ZA201004179B; NZ586166A

Abstract

본 발명은 엘사미트루신 염의 안정한 형태를 함유하는 제제에 관한 것이다. 이러한 제제는 종양 질환 및 병태를 치료하는데 유용하다.

Description

안정한 엘사미트루신 염 제제{STABLE ELSAMITRUCIN SALT FORMULATIONS}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 미국 가출원 번호 제61/015,183호(2007년 12월 19일 출원)를 우선권으로 주장한다. 이 출원의 내용은 그 전문이 본원에 참고 인용된다.

발명의 분야

본 발명은 종양 질환(neoplastic disease) 및 병태를 치료하기 위한 비경구 투여에 유용한 엘사미트루신 제제에 관한 것이다.

엘사미트루신은 엘사미트루신의 박물학(natural history), 화학 조성물, 제조 방법 및 생물활성과 관련하여 개시된 모든 내용이 본원에 참고 인용되는 미국 특허 번호(USPN) 제4,518,589호 및 제4,572,895호에 기술된 그람 양성균 방선균 균주 J907-21로부터 단리된 헤테로시클릭 항종양성 항생제이다. 엘사미트루신은 구아닌-사이토신(G-C)-농후 서열에서 DNA 내로 삽입되고 토포아이소머라제 I 및 II를 억제하여 단일 가닥을 절단하고 DNA 복제를 억제한다. 엘사미트루신은 유방, 결장 및 직장, 비소세포(non-small cell) 폐 및 난소의 전이성 암에 대해 그리고 재발성(relapsed) 또는 난치성(refractory) 비호지킨 림프종 환자에서 현저한 종양분해(oncolytic) 활성을 보유한다.

엘사미트루신은 화학적으로 벤조(h)(1)벤조피라노(5,4,3-cde)(1)벤조피란-5,12-디온,10((2-O-(2-아미노-2,6-디데옥시-3-O-메틸-알파-D-갈락토피라노피라노실)-6-데옥시-3-C-메틸-베타-D-갈락토피라노실)옥시)-6-히드록시-1-메틸로서 공지되어 있고, 일반적으로 하기 화학식 I에 표시된 구조를 갖는다. 엘사미트루신은 또한 10-O-엘사미노실엘사로실차르타린, BBM 2478A, BMY-28090, SPI-28090, BRN 5214813, 엘사미신 A, 엘사미트루시나 및 엘사미트루신(elsamitrucine)으로서 공지되어 있다.

[화학식 I]

선행 기술의 동결건조된 엘사미트루신 분말은 멸균수를 첨가한 숙신산으로 제공된다. 이는, 유기 용매 중에 엘사미트루신 염기를 용해시킨 후 충분한 수성 숙신산을 첨가하여 용해된 유리 염기 대 산의 1:1 용액을 형성함으로써 동일계에서 엘사미트루신 염을 형성한다. 그리고나서 이렇게 생성된 엘사미트루신-숙신산 용액을 3.5∼4.5의 pH로 조정하고 만니톨과 같은 팽화제와 혼합하여 동결건조 전에 안정성을 강화시킨다(예, USPN 제5,508,268호 참조). 분말 형태(결정질 또는 비정질)의 안정한 엘사미트루신 염은 현재까지 이용가능하지 않아서 모든 용해성 높은 엘사미트루신 약학 조성물은 유리 염기를 사용하여 동일계에서 제조되어야만 한다. 엘사미트루신은 통상 비경구적으로(일반적으로, 정맥으로) 인간을 비롯한 동물에게 투여되고 선행 기술의 동일계에서 형성된 염의 고유의 불안정성으로 인하여 사용 직전에 주사용 멸균수로 재구성되는 동결건조된 분말로서 공급된다.

따라서, 안정한 엘사미트루신 염을 포함하는 제제가 필요한 실정이다. 이러한 제제는 유리 염기 및 동일계에서 유리 염기를 용해시키는데 필요한 상응한 유기 용매를 사용할 필요없이 제조될 수 있는 염을 포함하여야 한다.

발명의 개요

본 발명은 종양 질환 및 병태를 치료하기 위한 비경구 투여에 유용한 수용성의 고체 엘사미트루신 염을 함유하는 제제에 관한 것이다.

본 발명의 일 구체예에서, 제제는 하나 이상의 안정한 고체 엘사미트루신 염 및 약학적으로 허용되는 담체로 된 용액을 포함한다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 제제는 용액 pH를 유지하는 완충제를 필요로 하지 않는다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 제제는 안정화 산화방지제를 필요로 하지 않는다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 제제는 삼투압 조절제를 추가로 포함한다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 제제는 약 3.5∼약 4.5의 pH를 설정하는 첨가제(agent)를 추가로 포함한다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 제제의 pH는 약 4.0이다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 제제의 고체 엘사미트루신 염은 엘사미트루신 락테이트, 엘사미트루신 푸마레이트, 엘사미트루신 말레에이트, 엘사미트루신 숙시네이트, 엘사미트루신 타르트레이트, 엘사미트루신 토실레이트, 엘사미트루신 메탄설포네이트, 엘사미트루신 벤조에이트, 엘사미트루신 살리실레이트, 엘사미트루신 히드로클로라이드, 엘사미트루신 설페이트 및 엘사미트루신 포스페이트로 이루어진 군 중에서 선택된다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 제제의 고체 엘사미트루신 염은 엘사미트루신 토실레이트이다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 약학적으로 허용되는 담체는 물 또는 식염수이다.

본 발명의 이러한 목적 및 기타 목적, 이점, 및 특성은 기재된 명세서를 참조하여 더욱 완전하게 이해되고 알게될 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1 : 본 발명의 교시에 따라 제조된 아세토니트릴:물의 1:1 혼합물로부터 재결정화된 엘사미트루신 토실레이트의 도면.

도 2A 및 2B는 시간 대비 5℃에서 2.5 ㎖ 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태의 효능이 도시된다.

도 3A 및 3B는 시간 대비 25℃에서 2.5 ㎖ 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태의 효능이 도시된다.

도 4A 및 4B는 시간 대비 40℃에서 2.5 ㎖ 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태의 효능이 도시된다.

도 5A 및 5B는 시간 대비 60℃에서 2.5 ㎖ 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태의 효능이 도시된다.

도 6은 역위 위치에서 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태의 아레니우스 플롯(Arrhenius Plot)이 도시된다.

도 7은 직립 위치에서 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태의 아레니우스 플롯이 도시된다.

용어의 정의

본 발명을 설명하기에 앞서, 이하에서 사용될 특정 용어의 의미를 제공하는 것이 도움이 될 수 있을 것이다.

유사체(들): 본 발명에 사용된 "유사체(들)"는 다른 화합물과 구조적 유사성을 갖는 화합물을 포함한다. 예를 들어, 항바이러스 화합물 아시클로버(acyclovir)는 뉴클레오시드 유사체이고, 염기 구아닌으로부터 유래하는 뉴클레오시드 구아노신과 구조적으로 유사하다. 따라서 아시클로버는 구아노신을 모방하며(생물학적으로 "유사"하고), 바이러스 핵산 내의 구아노신 잔기를 대체함으로써(구아노신 잔기와 경쟁함으로써) DNA 합성을 방해하고, 번역/전사를 방지한다. 따라서, 다른 것(모체 화합물)과 구조적 유사성을 갖고 모체 화합물의 생물학적 또는 화학적 활성을 모방하는 화합물이 유사체이다. 유사체가 어떤 관련 방식으로 동일하게, 상보적으로 또는 경쟁적으로 모체 화합물의 생물학적 또는 화학적 특성을 모방할 수 있게 해주는, 본원에서 사용되는 유사체로서의 자격을 얻기 위해 요구되는 필수기(elemental group) 또는 작용기 치환의 최소수 또는 최대수는 존재하지 않는다. 유사체는 모체 화합물의 유도체일 수 있고, 종종 그러하다(하기 "유도체" 참조). 본원에 개시되는 화합물의 유사체는 이의 모체 화합물과 비교하여 동일한, 더 낮은 또는 더 높은 활성을 가질 수 있다.

유도체: 본원에 사용된 "유도체"는 자연적으로 또는 합성으로 모체 화합물로부터 제조된(유래한) 화합물이다. 유도체는 유사체(상기 "유사체" 참조)일 수 있고, 이에 따라 유사한 화학적 또는 생물학적 활성을 보유할 수 있다. 하지만, 본원에 사용되는 유도체는 모체 화합물의 활성을 필수적으로 모방해야하는 것은 아니다. 유도체로서의 자격을 얻기 위해 요구되는 필수기 또는 작용기 치환의 최소수 또는 최대수는 존재하지 않는다. 예를 들어, 항바이러스 화합물 갠클로버(ganclovir)는 아시클로버의 유도체이다. 갠클로버는 아시클로버와는 다른 항바이러스 활성 스펙트럼을 가질 뿐 아니라, 서로 다른 독성학적 특성을 갖는다. 본원에 개시된 화합물의 유도체는 이의 모체 화합물과 비교하여 동일한, 더 낮은, 더 높은 또는 전혀 유사하지 않은 활성을 가질 수 있다.

엘사미트루신: 본원에 사용된 용어 "엘사미트루신"은 대략 825.83 Da의 분자량을 갖는 항종양성 조성물을 나타내며, 화학적으로 벤조(h)(1)벤조피라노(5,4,3-cde)(1)벤조피란-5,12-디온,10((2-O-(2-아미노-2,6-디데옥시-3-O-메틸-알파-D-갈락토피라노실)-6-데옥시-3-C-메틸-베타-D-갈락토피라노실)옥시)-6-히드록시-1-메틸로서 공지되어 있고, 일반적으로 화학식 I로 표시된 구조를 갖는다. 엘사미트루신은 또한 10-O-엘사미노실엘사로실차르타린, BBM 2478A, BMY-28090, SPI-28090, BRN 5214813, 엘사미신 A, 엘사미트루시나 및 엘사미트루신으로 공지된다. 천연원 유래의 엘사미트루신의 단리 및 특성화 방법에 관한 USPN 4,518,589 및 4,572,895를 참조한다. 또한 문헌[Konishi M, Sugawara K, Kofu F, Nishiyama Y, Tomita K, Miyaki T, Kawaguchi H. 1986. Elsamicins, new antitumor antibiotics related to chartreusin I. Production, isolation, characterization and antitumor activity. J. Antibiot. (Tokyo) Jun;39(6):784- 91]을 참조한다.

제제: 본원에 사용된 용어 제제는 본 발명의 엘사미트루신 염 중 하나 이상 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 비제한적 예로서 주사용수 또는 식염수를 포함하는 약학적으로 허용되는 조제물을 나타낸다. 게다가, 본 발명의 제제는 또한 안정화제, 방부제 또는 추가 치료제를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 제제는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있고 이상적으로는 정맥 투여되거나 피부, 근육 또는 신체의 다른 조직 내로 주사되는 것에 적합하다. 약학 제제는 경구 투여를 위한 것일 수 있다.

염: 본원에 사용된 용어 "염" 또는 "염들"은 금속 또는 금속과 같이 작용하는 기: 이온성 결정질 화합물로 산의 산성 수소 중 일부 또는 전부를 치환하여 생성된 임의의 화합물을 포함한다. 이러한 경우, 염은 유사 염(pseudo salt), 또는 용액에서만 존재하는 동일계 형성 염을 포함하지 않는 안정한 고체로 존재할 수 있는 유기산 및 유리 염기의 생성물이다.

적당한 염 형태(들): 본원에 사용된 용어 "적당한 염 형태(들)은 비정질 또는 결정질 형태로서 안정한 고체 상태로 제조된 엘사미트루신 염을 의미한다.

고체 또는 고체 염: 본원에 사용된 용어 고체 또는 고체 염은 고체 상태로 존재하고 30% 미만의 잔류 수분, 바람직하게는 10% 미만의 잔류 수분 그리고 더욱 바람직하게는 5% 미만의 잔류 수분을 갖는 엘사미트루신 염을 나타낸다. 본원에 사용된 "수분"은 물 또는 유기 용매를 나타낸다. 용어 "고체"는 또한 본 발명의 엘사미트루신 염과 동일계에서 형성되고 수성상에 주로 존재하는 염을 구별하기 위해서 본원에 사용된다. 또한, 본 발명의 고체 염은 냉동 건조 또는 동결건조의 생성물이 아니다.

안정한: 본원에 사용된 "안정한"은 엘사미트루신 염 또는 비경구 엘사미트루신 염 함유 제제(동일계 염 형성법 이외의 방법에 의해 제조됨)를 나타내고, 여기서 엘사미트루신 염은 75℃의 고온에서 9시간, 또는 더욱 바람직하게는 98℃에서 밤새 건조하는 중에 거의 완전한 1:1 염비를 나타내는(이에 따라 고체 상태의 분해를 나타내지 않음) NMR 데이터를 보유한다. 게다가, 본원에 사용되는 "안정한"은 적절한 보관 온도에서 고체 형태로 24개월 이상 그리고 액체 형태로 18개월 이상 시험관내 성장 저해 테스트(실시예 4 참조)를 하여 측정시, 비경구 제제 내에 함유된 엘사미트루신 염이 90% 이상의 항종양 활성을 보유하는 것을 나타낸다.

발명의 상세한 설명

엘사미트루신 및 구조적으로 관련된 항생제는 DNA에서 GC-농후 트랙에 결합하고, Z-DNA에 비해 B-DNA가 명백히 선호된다. 이들은 RNA 합성을 억제하고 자유 라디칼 형성을 통해 DNA의 단일 가닥 절단(scission)을 야기한다. 엘사미트루신은 또한 지금까지 보고된 토포아이소머라아제 II의 가장 유력한 억제제인 것으로 여겨질 수 있고, 몇몇 DNA-단백질 복합체의 형성을 억제할 수 있다. 엘사미트루신은 c-myc 발암유전자의 P1 및 P2 프로모터 영역에 결합하여 Sp1 전사 요소의 결합을 억제하여, 전사를 억제한다.

엘사미트루신은 재발성 또는 난치성의 비호지킨 림프종 환자에서 활성을 나타내고, 백혈병 P388, 백혈병 L1210, 및 흑색종 B16 및 M5076을 포함하는 넓은 범위의 쥐과동물 종양(murine neoplasma)에 대해, 뿐만 아니라 MX1 및 HCT116 이종이식에 대해 생체내 활성을 나타낸다(예를 들어, 문헌[Raber MN, Newman RA, Newman BM, Gaver RC, Schacter LP1992 Phase I trial and clinical pharmacology of elsamitrucin. Cancer Res. Mar 15;52(6):1406-10]를 참조).

추가적으로, 난치성/재발성 비호지킨 림프종의 실험적 치료는 엘사미트루신과 연관된 독성이 비교적 가볍고, 주로 무력감, 메스꺼움 및 구토로 이루어지며, 골수억제를 포함하지 않는다는 것을 입증하였다. 엘사미트루신의 활성 및 이의 골수억제의 결여는, 이러한 질환에서, 특히 다른 증명된 첨가제와 배합되는 경우에, 엘사미트루신이 사용될 수 있음을 시사한다(문헌[Allen SL, Schacter LP, Lichtman SM, Bukowski R, Fusco D, Hensley M, O'Dwyer P, Mittelman A, Rosenbloom B, Huybensz S. 1996. Phase II study of elsamitrucin (BMY-28090) for the treatment of patients with refractory/relapsed non-Hodgkin's lymphoma. Invest. New Drugs. 14(2):213-7]을 참조).

또한 2가지 감수성 유방암 세포주(하나는 에스트로겐 수용체-양성(ER+, MCF7)이고, 다른 하나는 에스트로겐 수용체-음성(ER-, MDA-MB-231) 세포주임) 상에서 그리고 DX 저항성 하위세포주(MCF7DX) 상에서, 엘사미트루신의 시험관내 활성을 독소루비신(DX)의 활성과 비교하여 조사하였다. 2가지 약물의 활성이 또한 치료받지 않은 환자로부터의 19개 임상 유방암 표본 상에서 조사되었다. 마우스에서 10%의 사망률을 나타내는 치사량(LD10)으로 3시간 노출하는 동안의 곡선하 면적으로부터 계산된 것과 같은 약리학적으로 적절한 농도에서, 그리고 10배 및 100배 농도에서 약물을 테스트하였다. DX-감수성 세포주에서, DX에 비해 엘사미트루신에 의해 RNA 및 DNA 전구체 혼입, 뿐만 아니라 세포 증식이 더 크게 억제된다. 게다가, ER- MDA-MB-231 세포주보다 ER+ MCF7 세포주에서 항증식 효과가 10배 더 높았다(IC50: 0.25 대 0.21 ㎍/㎖). 엘사미트루신은 MCF7DX 하위세포주에서 DX에 교차 내성을 갖는다. 임상 표본에서, DNA 전구체 혼입에 대한 효과는 동일한 약물 농도에서 DX보다 엘사미트루신에서 더 흔히 관찰된다. 엘사미트루신에 대한 시험관내 감수성은 ER- 종양보다 ER+ 종양에서 더욱 두드러지고; 약물의 최소 억제 농도는 2개의 그룹에서 각각 0.1 및 3.5 ㎍/㎖였다. 이러한 시험관내 결과는 임상적 치료, 주로 ER+ 유방암 환자 치료에서 엘사미트루신의 유망한 역할을 나타내는 것이다(문헌[Silvestrini R, Sanfilippo O, Zaffaroni N, De Marco C, Catania S. 1992. Activity of a chartreusin analog, elsamitrucin, on breast cancer cells. Anticancer Drugs. Dec; 3(6):677-81]을 참조).

Nassar 등에게 1996년 4월 16일에 허여되고, 브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)에게 양도된 미국 특허 제5,508,268호(이하 '268 특허)는 엘사미트루신 염기, 유기산, 안정화제 및 완충제를 포함하는 비경구 제제가 개시된다. 여기에 개시된 엘사미트루신 조성물은 염산, L(+)-락트산, L-타르타르산, D-글루콘산, 메탄-설폰산, 아디프산 및 숙신산을 포함한 다양한 유기산을 사용하여 제조되었고, 숙신산이 바람직하다. 엘사미트루신 조성물은 컬럼 4, 라인 5-30의 실시예의 교시에 따라 제조되었다. 이 실시예에서는 숙시네이트 염만이 기술된다. 구체적으로, '268 특허에 개시된 바에 따르면, 엘사미트루신 염은 하나 이상의 환원제(방부제)와 함께 유기산을 사용하여 동일계에서 형성되고, pH가 대략 4로 조절된다. 이렇게 생성된 용액을 여과하고, 안정성 시험을 위해 액체 상태로 유지시켰다. '268 특허에 개시된 다른 구체예에서, 유기산, 엘사미트루신 염기, 환원제 및 다른 적절한 약학 부형제, 비제한적 예로서, 당이 용액에서 혼합되고, 생성된 조성물은 동결건조된다.

하지만, '268 특허는 안정한 고체 엘사미트루신 염이 개시, 논의 또는 교시되지 않는다. '268 특허의 교시와 극명히 대조적으로, 본 발명자는 엘사미트루신 염기 및 선택된 유기산을 사용하여 제조된 안정한 고체 엘사미트루신 염을 제공하는 방법을 발견하였다. 본 발명의 교시에 따라 제조된 생성 조성물은 '268 특허에 기술되고 있는 동결건조물과 달리 고체의, 건조 또는 부분 건조된 엘사미트루신 염 분말이다. 따라서, 본 발명의 엘사미트루신 염 조성물이 진정한 고체 상태 염이고, 용해된 염기 및 유기산 혼합물을 함유하는 동일계 용액이 아니다.

본 발명은 '268 특허에 기술되는 동일계 형성 혼합물에 비해 많은 이점을 제공한다. 우선, 본 발명의 교시에 따라 제조된 엘사미트루신 염은 주의깊게 불순물을 분석할 수 있고, 필요에 따라 상당히 높은 정부 규제를 만족하도록 정제될 수 있다. 게다가, 본 발명의 진정한 염은 정확히 칭량되어 적절한 약학 담체, 예를 들어, 주사용수에 용해될 수 있다. 선택된 염 자체는 고체 상태로 보존되는 경우 매우 안정하고, 상응하는 용해된 용액에 비해 연장된 저장 수명을 갖는다. 따라서, 비경구 용액은 본 발명의 엘사미트루신 염을 사용하여 제조될 수 있고, 연장된 기간 동안 보관될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 제제는 하나 이상의 안정한 고체 엘사미트루신 염 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 제제는 약 3.5∼약 4.5의 pH를 설정하는 첨가제를 추가로 포함한다.

본 발명의 또다른 구체예에서, 제제의 pH는 약 4.0이다.

본원에 개시된 제제는 pH를 유지하는 완충제를 필요로 하지 않을 수 있다. 완충제는 통상 완충 용액을 포함하는 약산 또는 약염기이다. 완충제는 통상 물에 첨가되어 완충 용액을 형성한다. 이것은 상기 용액에서 나타나는 완충작용의 원인이 되는 물질이다. 이러한 첨가제는 물질에 첨가되어 이 물질을 안정화시키기 위해 산성 또는 염기성 조건으로 배치되게 된다. 예를 들어, 완충된 아스피린은 MgO와 같은 완충제를 갖고, 이는 환자의 위장을 통해 통과함에 따라 아스피린의 pH를 유지할 것이다. 완충제의 또다른 용도로는 제산제 정제가 있고, 이의 주요 목적은 위장의 산성도를 낮추는 것이다. 완충제의 예로는, 비제한적 예로서, 칼륨 디히드로겐 포스페이트, 숙신산, L(+)-락트산 및 L-타르타르산이 있다.

본 발명의 제제를 제조하는 경우에는 간단히 소정의 pH를 설정하는 첨가제를 사용할 수도 있지만 반드시 소정의 pH를 유지할 필요는 없다. 이러한 목적을 위해 산 및 염기를 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 일례로는 NaOH와 같은 강염기가 있다. 강염기는 염기성 화학 화합물이며 산-염기 반응에서 매우 약한 산을 탈양성자화시킬 수 있다. pKa가 약 13을 초과하는 화합물을 강염기라고 부른다. 강염기의 일반적인 예로는 알칼리 금속 및 알칼리 토금속의 수산화물, 예컨대 NaOH 및 Ca(OH)₂가 있다.

당업자는 엘사미트루신 제제에 바람직한 pH 또는 pH 범위(들)을 측정할 수 있고 필요하다면 이 pH 또는 pH 범위(들)을 pH 조절제로 설정할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, pH 범위는, 비제한적 예로서, 약 3.5∼약 4.5 및 약 2.0∼약 4.0일 수 있다. 또다른 구체예에서, pH는 약 4일 수 있다.

또한, 본 발명의 제제는 안정화 산화방지제를 필요로 하지 않는다. 안정화 산화방지제는 다른 분자들의 산화를 서행시키거나 방지할 수 있는 분자이다. 산화는 물질로부터 산화제로 전자를 전달하는 화학 반응이다. 산화 반응은 자유 라디칼을 생성할 수 있고, 이는 세포를 손상시키는 연쇄 반응을 시작한다. 산화방지제는 자유 라디칼 중간체를 제거함으로써 이 연쇄 반응을 중단시키고, 그 자체가 산화됨으로써 다른 산화 반응을 억제한다. 이러한 결과, 산화방지제는 종종 티올 또는 폴리페놀과 같은 환원제가 된다. 산화방지제에 대한 다른 예로는, 비제한적 예로서, 황- 및 알칼리 금속-함유 산화방지제를 포함한다. 황- 및 알칼리 금속-함유 산화방지제의 예로는, 비제한적 예로서, 나트륨 메타바이설파이트, 아세톤 나트륨 바이설파이트 및 나트륨 포름알데하이드 설폭실레이트를 포함한다.

본원에 개시된 제제에는 하나 이상의 삼투압 조절제가 포함될 수 있다. 삼투압 조절제는 화학물질이며 용액의 삼투압을 설정할 수 있다. 삼투압은 용질의 농도차로 인해 반투과성 멤브레인으로 나눈 공간에서 용액에 의해 생성되는 정수압이다. 삼투압 조절제의 포함은 환자의 삼투압을 일치시키는데 필요할 수 있다. 이러한 삼투압 조절제의 예로는, 비제한적 예로서, 만니톨 및 나트륨 클로라이드를 포함한다.

본원에 개시된 제제는 즉시 사용 가능한 용액으로 제조될 수 있다. 이전에 기술된 엘사미트루신 용액, 예컨대 US 5,508,628에 기술된 것은 동결건조되어 고체 형태로 얻어지며 투여 직전에 물과 같은 약학 담체와 재구성되는 반면에, 본원에 개시된 제제는 액체 형태에서 안정하며 하기 실시예에 기술된 바와 같이 연장된 저장 수명을 갖는다. 따라서, 본원에 개시된 용액은 보관될 수 있으며 사용 전에 재구성할 필요 없이 투여될 수 있다. US 5,508,628의 사용이 용이한 제제는 동결건조가 요구되는데 그 이유는 동일계 형성된 엘사미트루신 염 용액이 메탄올, 에탄올, 클로로포름, n-부탄올 및 t-부탄올과 같은 잔류 용매를 함유하기 때문이다. 냉동 건조 (또한 동결건조 또는 동결탈습(cryodesiccation)으로도 공지됨)는 부패되기 쉬운 물질을 보존하거나 또는 물질을 운송하기에 더욱 편리하게 하는데 통상 사용되는 탈수 방법이다. 냉동 건조는 물질을 냉동시키는 단계 및 이후 주변 압력을 감소시키는 단계 및 충분한 열을 가하여 물질 내 냉동된 물을 고체상에서 기체로 직접 승화시키는 단계에 의해 작용한다.

환자에게 잔류 용매가 존재하는 것을 투여하는 것은 허용될 수 없다. US 5,508,628에서 동결건조는 이러한 불순물을 제거하는 것이 필요하였다. 일 구체예에서, 본 발명에 개시된 제제는 메탄올, 에탄올, 클로로폼, n-부탄올 및 t-부탄올과 같은 불순물을 함유하지 않는다.

하기 실시예는 본 발명의 예시적 구체예로서 제공된다. 하기 실시예에 의해서는 본 발명의 안정하게 건조된 엘사미트루신 염 또는 거의 건조된 엘사미트루신 염을 한정하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 하기 실시예의 교시는 본원에 개시된 바와 동일한 조성물을 유도하는 다른 변경예를 제조하는데 지침으로서 당업계의 화학자에 의해 사용될 수 있다.

실시예 1

본 발명의 안정한 엘사미트루신 염의 초기 제조

최적화 및 스케일 업(scale up)을 하기 전에 엘사미트루신 염의 소형 뱃치를 제조하였다. 유기산계 8개의 상대 이온을 선택하였고, 이는 락트산, 말레산, 숙신산, L-타르타르산, p-톨루엔설폰산(본원에서 p-TSA 또는 토실레이트라고도 지칭함), 벤조산, 살리실산 및 황산을 포함한다. 3가지 용매를 약화학자인 당업자에게 공지된 선행 스크린법을 기초로 하여 선택하였으며, 선택된 용매는 디옥산, 디메틸포름아미드(DMF) 및 아세트산(AcOH)을 포함한다. p-TSA/MeOH의 추가 조합을 총 25종의 반응을 위해 포함시켰다.

각각의 반응 바이알에 3.0 x 10^-5몰의 엘사미트루신 염기를 첨가하였다. 엘사미트루신 염기를 55℃에서 0.25　㎖의 DMF 또는 AcOH에, 80℃에서 1.5　㎖의 디옥산에, 또는 70℃에서 12　㎖의 MeOH에 용해시키고, 5분간 교반하여 용액이 되게 하였다. 그 후 각각의 8가지 산의 1.05 당량에 상응하는 상기 열거한 유기산 중 하나의 0.126 M 디옥산 용액 245∼270 ㎕를 각각의 바이알에 채웠다(타르타르산은 디옥산에서의 불용성 때문에 메탄올/물의 1:1 혼합물에 분배시킴)(하기 표 1 참조).

초기 온도를 10분간 유지시키고, 그 후 DMF 및 AcOH는 20℃/시간, 디옥산은 30℃/시간 그리고 MeOH는 25℃/시간의 속도로 실온으로 강하(ramp down)시켰다. 디옥산/L-타르타르산, 디옥산/p-TSA, 디옥산/황산 및 AcOH/황산을 갖는 바이알에서 고체가 형성되었다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 50℃ 및 30 인치 Hg에서 진공 건조시켰다. 고체가 형성되지 않은 바이알을 질소 스트림으로 농축 건조시키고, 50℃ 및 30 인치 Hg에서 진공 건조시켰다. 메탄올을 진공 하에서 제거하고, 이렇게 생성된 잔류물을 실온에서 고진공 하에서 건조시켰다. 모든 샘플을 x선 회절(XRPD), 시차 주사 열량계(DSC) 및 열중량 분석법(TGA)으로 분석하여, 염의 결정도를 측정하였다. 결정질 고체를 디옥산/황산 및 AcOH/황산으로부터 얻었고; 반결정질 고체를 디옥산/L-타르타르산, 디옥산/p-TSA, DMF/락트산, DMF/말레산, DMF/L-타르타르산, DMF/벤조산, DMF/황산, AcOH/락트산, AcOH/p-TSA 및 AcOH/벤조산으로부터 얻었다. 모든 다른 고체는 XRPD에 의해 비정질로 파악되었다.

실시예 2

엘사미트루신 염 제조의 최적화

실시예 1의 교시에 따라 제조된 다음의 3가지 엘사미트루신 염을 스케일 업 개발을 위해 선택하였다. 선택된 염은 엘사미트루신 타르트레이트, 엘사미트루신 설페이트 및 엘사미트루신 토실레이트였다. 이들은 각각이 냉각 과정 중에 침전되는 결정질 또는 반결정질 고체를 제공하여, 염의 분리 및 정제(필요한 경우)를 더 좋게하여 더 큰 규모의 제조 기법에 더욱 적절하게 해주기 때문에 선택되었다. 하지만, 실시예 2에서 의도된 이러한 선택은 제한적으로 생각되어서는 안된다.

L-타르타르산, 황산 및 p-TSA를 디옥산에 용해시켰다. 적절한 반응 용기에 80℃에서 7.5 ㎖의 디옥산에 용해된 1.7 x 10^-4몰의 엘사미트루신 염기를 각각 채우고, 5분간 교반하여 용액이 되게 하였다. 그 후 각각의 바이알에 각각의 3가지 산의 대략 1.05 당량에 상응하는 디옥산 내의 유기산 0.5 M 용액 350∼380 ㎕를 채웠다(표 2).

초기 온도를 10분간 유지시키고, 그 후 디옥산의 경우 30℃/시간의 속도로 실온으로 강하시켰다. 디옥산/L-타르타르산 및 디옥산/황산을 갖는 바이알에 산을 첨가하자 고체가 형성되었고, 디옥산/p-TSA 침전이 냉각 과정 중에 발생하였다. 여과 후 고체를 50℃ 및 30 인치 Hg에서 진공 건조시켰다. 샘플을 XRPD, DSC 및 TGA로 분석하여, 염의 결정도(표 3) 및 다른 물리적 특성을 측정하였다.

표 3에서 볼 수 있듯이, 실시예 2의 모든 고체는 반결정질이고, 약 5% 이하의 잔류 용매를 함유하며, 빠른 침전으로 인해 고체 내에 보유되는 많은 양의 용매 때문에 계속해서 끈적끈적하였다.

또한 본 발명의 엘사미트루신 염은 상기 기술된 것 것보다 더 느린 침전법을 사용하여 제조하였다. 80℃에서 7.6 x 10^-5 몰의 엘사미트루신 염기 및 5 ㎖의 디옥산을 반응 용기에 채웠다. 혼합물을 5분간 교반하여 염기의 용액이 되도록 한 후에, 1.05 당량에 상응하는 타르타르산의 0.2M 수용액 400 ㎕를 용해된 엘사미트루신 염기에 첨가하였다. 온도를 80℃에서 10분간 유지하고, 그 후 바이알을 30℃/시간의 속도로 실온으로 냉각시켰다. 냉각 단계 중에 침전이 일어났다. 고체를 여과하여 수집하고, 50℃ 및 30 인치 Hg에서 진공 건조시켰다. 샘플을 XRPD, DSC 및 TGA로 분석하여, 물성을 측정하였다[표 3, OVL-A-55(1) 및 OVL-A-55(2)]. 첫번째 샘플[디옥산/황산, OVL-A-55(1)]은 XRPD에 의할 때 결정질이었으나, DSC 곡선 위의 3개의 발열 피크 및 TGA 분석에 의할 때 3.6%의 잔류 용매를 함유하였다. 두번째 샘플[디옥산/L-타르타르산, OVL-A-55(2)]은 반결정질이었다.

다음으로, 엘사미트루신 염을 하기와 같은 수성 환경에서 제조하였다. 반응 바이알에 100 mg의 엘사미트루신 염기, 1.05 당량의 상응하는 산(p-TSA, 숙신산 및 L-타르타르산은 고체로 첨가하였음; 황산은 0.5 ㎖의 물에 용해시켰음) 및 물(p-TSA, 숙신산 및 L-타르타르산의 경우 10 ㎖, 황산의 경우 9.5 ㎖)을 채웠다. 현탁액을 10분간 교반하면서 80℃로 가열하여, 투명한 용액을 형성시키고, 그 후 30℃/시간의 속도로 실온으로 강하시켰다. 실온에서 밤새 교반한 후, 어떠한 실험에서도 침전물이 형성되지 않았다. 35℃에서 가벼운 질소 유동 하에서 물을 제거하였다. 물의 1/3을 제거한 후에 p-TSA 실험에서 침전이 관찰되었고, 이러한 고체를 여과하고 50℃ 및 30 인치 Hg에서 진공 건조하였다. 여과물도 또한 분석하였다. 다른 3개의 바이알을 증발 건조하고, 50℃ 및 30 인치 Hg에서 진공 건조하였다. 결과는 생성된 고체가 높은 비정질 함량을 갖는 반결정질임을 나타내었다[표 3, OVL-A-47(1), OVL-A-47(2-1), OVL-A-47(3), 및 OVL-A-65].

실시예 3

현미경법을 사용한 엘사미트루신 토실레이트 염의 결정화

현미경 슬라이드 위에서, 1∼2 mg의 비정질 엘사미트루신 토실레이트를 압설자의 도움으로 산재시키고(sprinkled), 커버 슬립을 위치시켰다. 용매 방울을 커버 슬립의 측면에 위치시켜, 용매가 커버 슬립 아래로 조금씩 스며들어 약물을 용해시키도록 하였다. 용매와 접촉한 약물을 실온에서 보관하고, 100x 또는 400x의 배율로 현미경 하에서 조사하였다. 사용된 용매는 이소프로필 알콜, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 프로필렌 글리콜, 테트라히드로퓨란, 디클로로메탄 및 이소프로필 알콜, 메탄올, 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤과 물의 1:1 혼합물이었다. 침상 또는 막대상의 결정이 용매(에탄올, 메탄올, 프로필렌 글리콜, 이소프로필 알콜, 아세톤, 및 모든 물:용매 혼합물) 내에서 현미경 하에서 관찰되었다. 샘플의 현미경적 조사는 엘사미트루신 토실레이트 염이 하나 이상의 용매 내에서 결정질이 됨을 나타낸다.

실시예 4

엘사미트루신의 MSA , p- TSA 및 HCl 염의 미세결정화

소량의 염(1∼2 mg)을 현미경 슬라이드 위에 위치시키고, 커버 슬립으로 덮었다. 몇몇 용매 방울을 커버 슬립의 모서리에 가하여, 모세관 현상이 슬라이드와 커버 슬립 사이에서 용매를 끌어올리도록 하였다. 물질이 부분적으로 용해되는 경우, 대부분의 고체가 용해될 때까지 슬라이드를 열판 위에서 서서히 가열하였다. 각각의 슬라이드를 실온으로 냉각시켜 서서히 결정화시켰다. 물 내의 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜 및 아세토니트릴의 1:1 혼합물을 결정화에 사용하였다. 모든 4가지 다른 용매 시스템 내의 각각의 염이 엘사미트루신 결정을 생성하였다. 엘사미트루신 토실레이트 염 결정은 도 1에 도시된 바와 같이 평면 편광 하에서 복굴절을 나타냈다.

실시예 5

p- TSA 염의 재결정화의 스케일 업

p-TSA 염의 재결정화를 크레이그 튜브(Craig tube) 내의 느린 증발로 수행하였다. p-TSA 염을 고온에서 아세토니트릴 및 물의 1:1 혼합물에 용해시켰다. 크레이그 튜브에서 열 여과 후에, 반응으로부터의 용매를 서서히 증발시켜, 침전물을 수득하였다. 현미경 하에서, 결정의 경향은 침상인 것으로 관찰되었다. 결정을 여과로 단리하고 진공 하에서 건조하였다. 물질은 XRD로 투명한 것으로 관찰되었고, 현미경법에 의해 결정질임을 확인하였다. 시차 주사 열량 분석에서, 물질은 용융 후 각각 183℃ 및 186℃에서 분해 또는 결정화되었다. 1H NMR 분석은 샘플이 상대 이온에 대한 API의 비가 1:1임을 나타냈다(p-TSA).

슬러리를 실온에서 6시간 동안 교반한 후에 HPLC로 수중에서 p-TSA 염의 용해도를 체크하였다. 수중의 p-TSA 염의 용해도가 15.6　mg/㎖ 임을 알 수 있었다(표 4, 로트 번호 OVL-A-137). pH 4(벤조에이트 완충제)에서 p-TSA 염의 용해도는 14.7 mg/㎖이었다(표 4, OVL-A-143).

본 발명의 교시에 따라 제조된 엘사미트루신 염의 안정성을 시험하였다. 분리된 p-TSA 염의 2가지 샘플(각각 40 mg)을 75℃에서 9시간 동안 진공 오븐 내에 놓아두었다. 이러한 노출 후에, 1번 샘플을 꺼내고, 온도를 98℃로 증가시키고, 두번째 샘플을 밤새 건조하였다. NMR 데이터는 완전한 1:1 염 비를 나타냈고, 따라서 고온에서의 건조 중에 고체 상태의 분해가 없었다. TGA에 의한 중량 손실은 두가지 샘플 모두에서 대략 2.5%였다. 칼 피셔(Karl Fischer) 분석은 2개의 로트가 여전히 물을 보유함을 나타냈고; 1번 샘플은 4.0%의 물 함량을 그리고 2번 샘플은 4.6%의 물 함량을 가졌다. 엘사미트루신의 p-TSA 염(16 mg)을 1.6 ㎖의 벤조에이트 완충제(pH 4)에 용해시키고, 50℃에서 10일간 교반하였다. HPLC 및 MS용 샘플을 3일, 5일 및 10일에 취하였다. 분해 생성물의 어떠한 증거도 MS(282에서의 피크) 또는 HPLC에서 발견되지 않았다.

실시예 6

HCl 염 형성의 스케일 업

엘사미트루신(200 mg)을 1 ㎖의 아세토니트릴/물(1:1)에 슬러리화하고, 75℃까지 가열하여 매우 점증된 슬러리를 형성시켰다. 수중의 1 M HCl 용액(0.321 ㎖, 1.05　당량)을 슬러리에 첨가하여 투명한 용액을 형성시켰다. 혼합물을 그 후 매우 가볍게 교반하면서 25℃/시간의 속도로 서서히 실온으로 냉각하였다. 실온에서 대략 6시간 동안 교반한 후에, 얻어진 고체를 여과로 단리하고, 50℃ 및 30 인치 Hg에서 진공 건조하여, 187.5　mg (88.86% 수득율)의 HCl 염을 수득하였다. DSC 및 XRD 분석은 염의 결정질 성질을 확인시켜 주었다.

실시예 7

엘사미트루신 및 엘사미트루신 토실레이트 염의 시험관내 성장 억제 활성

하기 실험은 본 발명의 교시에 따라 제조된 엘사미트루신 염이 엘사미트루신 염기와 비교하여 시험관내 항종양 활성을 보유하는지를 확인하는 것이다. 엘사미트루신 및 엘사미트루신 토실레이트는 하기의 것을 사용하여 시험관내에서 시험하였다: B16F10 (쥐 폐), HCT 116 (인간 결장), HT29 (인간 결장) 및 SK-MES-1 (인간 비소세포 폐 암종). 세포 성장 억제를 반자동화 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드) 검정으로 96-웰 미세배양 플레이트에서 평가하였다.

SK-MES-1 인간 비소세포 폐 암종, B16F10 쥐과동물 흑색종 세포, HCT 116 및 HT29 인간 결장 암종(총제적으로 "시험 세포 배양")을 우태혈청, 항체 및 다른 적절한 성장 인자, 예를 들어, 글루타민을 포함하는 완충 RPMI 1640에서 유지시켰다. 시험 세포(1,500∼2,000 세포/웰)를 100 ㎕/웰의 총 부피로 96-웰 미세배양 플레이트에 접종하였다. 5% CO₂ 및 95% 공기를 갖는 37℃ 가습 항온처리기에서 밤새 항온처리한 후에, 엘사미트루신 용액을 RPMI 1640으로 다양한 농도로 희석하고, 각 웰에 100 ㎕ 부피로 첨가하였다. 엘사미트루신 염기 및 엘사미트루신 토실레이트 용액(엘사미트루신 용액)을 제조하고, -20℃ 냉장고에 보관하였다. 용액을 전체 실험 중 10회 이하로 녹였다.

시험 세포 및 다양한 농도의 엘사미트루신 용액으로 접종한 세포 배양 플레이트를 CO₂ 및 95% 공기를 갖는 37℃ 가습 항온처리기에 5∼10일간 놓아두었다. 플레이트를 그 후 짧게 원심분리하고, 100 ㎕의 성장 배지를 제거하였다. 세포 배양물을 50 ㎕의 MTT 시약(Dulbecco^TM 포스페이트 완충 식염수 내에 1 mg/㎖)과 37℃에서 4시간 동안 항온처리하였다. 생성된 자주색 포마잔 침전물을 이소프로판올 내의 0.04 N HCl 200 ㎕로 용해시켰다. 흡광도를 TECAN^®GENios 마이크로플레이트 리더를 사용하여, 595 nm의 파장 및 650 nm의 기준 파장에서 모니터링하였다. 모든 실험에서, 2개의 중복되는 농도 범위에서 각각의 시약에 대한 흡광도 데이터를 얻었다. 대부분의 경우, 연구는 보다 넓은 농도 범위를 사용하여 반복되었다.

각 테스트 결과를 보관하고, 그래프 분석 및 IC₅₀ 값 측정을 위해 PRISM^® 3.03에 옮겼다. 모든 결과를 대조 흡광도의 퍼센트 대 약물 농도로 그래프화하였다. 하기 4-기호(four-logistic) 계산식으로 기술되는 S자형(sigmoidal) 용량-반응 곡선에 데이터를 맞추는 비선형 회귀 분석을 사용하여, PRISM^® 3.03으로 IC₅₀ 값을 계산하였다:

최고점은 대조 흡광도의 최대 퍼센트이고, 최저점은 제일 높은 물질 농도에서 대조 흡광도의 최소 퍼센트이고, Y는 관찰된 흡광도이고, X는 물질 농도이고, IC₅₀는 대조 세포와 비교하여 세포 성장을 50% 억제하는 첨가제 농도이고, 그리고 n은 곡선의 기울기이다. 표 4는 엘사미트루신 및 엘사미트루신 토실레이트 염이 시험된 세포주에서 본질적으로 동일한 항증식 효과를 보유함을 입증해준다. 따라서 표 4에서 증명되는 바와 같이, 본 발명의 교시에 따라 제조된 엘사미트루신 염은 엘사미트루신 염기를 단독으로 사용하여 제조된 치료 조성물과 동등한, 또는 더 우수한 생체내 항종양 활성을 가질 것으로 기대할 수 있다. 엘사미트루신 토실레이트는 유사한 양의 엘사미트루신 염기의 바람직하게는 약 20%, 더욱 바람직하게는 약 15% 그리고 가장 바람직하게는 약 10% 내인 IC₅₀를포함한다.

실시예 8

엘사미트루신 제제의 안정성

2.5 ㎖ 투여 형태 중의 엘사미트루신 F2 제제(pH 4.0에서 4.77% 만니톨을 포함하는 엘사미트루신 유리 염기 10 mg/㎖)를 안정성 연구에 사용하였다. 제제는 5℃ 및 25℃에서 12주 동안 직립 및 역위 위치에서 안정하였고 이러한 샘플을 위한 pH는 4.0∼4.3의 범위 내에서 사실상 안정하게 유지되었다. 하지만, 분해가 진행됨에 따라 상온에 보관된 샘플에서 pH의 감소가 관찰되었다. 아레니우스(Arrhenius)법을 이용하여, 5℃ 및 25℃에서 직립 샘플에 대한 제로 차수(zero order) 분해 속도 상수(kT)는 각각 1일 5.79 x 10^-5 및 9.84 x 10^-4 mg/㎖로 대략 추정되었다. 역위 샘플의 경우, 상응한 제로 차수 분해 속도 상수는 각각 5℃ 및 25℃에서 1일 2.49 x 10^-5 및 6.28 x 10^-4 mg/㎖였다. 이 엘사미트루신 F2 투여 형태는 따라서 (효능에서 동일한 수준의 감소를 실현하기 위해 5℃에서 상기 투여 형태에 대하여 47년과 비교하였을 때) 25℃에서 2.5년보다 연장된 기간 동안 90% 이상의 효능을 유지시킬 수 있다고 기대되었다.

사용된 엘사미트루신 F2 RTU 제제는 엘사미트루신 토실레이트 : 3.2903 g (최종 용액에서 10 mg/㎖ 유리 염기와 동일함), 만니톨 : 11.9251 g, 주사용수 : 250 ㎖로 이루어진다. pH는 NaOH를 사용하여 4.0이 되도록 설정되었다.

안정성 연구의 구성: 250 ㎖의 엘사미트루신 토실레이트 스톡 용액(10 mg/㎖ 유리 염기, 4.77% 만니톨, pH 4.0)을 제조하였다. 8O x 5 ㎖ 앰버 혈청 바이알을 2.5 ㎖의 엘사미트루신 토실레이트 스톡 용액으로 채우고, 질소로 씻어내고 마개로 밀봉하였다. 이렇게 직립 및 역위 위치에서 밀봉된 바이알을 각각 4, 25, 40 및 60℃의 캐비넷에서 보관하였다. 스톡 용액의 독성을 0시간에서 기록하였다. 다양한 시점에서 pH 측정 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 위해 샘플을 분리하였다. 6O℃에서는 0, 2, 7, 10, 14일에 측정하였다. 4O℃에서는 0, 7, 14, 28, 38, 64, 77, 84일에 측정하였다. 25℃에서는 0, 7, 14, 28, 64, 84일에 측정하였다. 4℃에서는 0, 7, 14, 28, 64, 84일에 측정하였다.

안정성 연구에 사용된 장치 및 물질은 다음과 같다 - 바이알: 5 ㎖ Wheaton 앰버 혈청 바이알 (Mouth I. D. x O. D. - 13 x 20 mm, 파트 번호 223695, 로트 번호 1394689), 마개: 20-mm Stelmi 혈청 마개(브로모부틸, 회색, 파트 번호 6720GC, 로트 번호 B603/18047), 알루미늄 시일: 20-mm Wheaton 언라인드 알루미늄 시일 (파트 번호 224193-01), 엘사미트루신 토실레이트: Albany Molecular Research, Inc., 로트 번호 DKK-M-27, 주사용수(WFI): Phoenix Pharmaceuticals, 로트 번호 703097F, 만니톨: J. T. Baker, 로트 번호 C39645, 0.2 N 수산화나트륨 용액: VWR International, 로트 번호 7050, 0.22 미크론 셀룰로스 아세테이트 멤브레인 필터: Corning Inc., 파트 번호 430624, 확산제: 물, 파트 번호 WAT007272, pH 계량기: VWR Symphony Ag/AgCI pH 전극 (pH = 4.01, 7.0 및 10.0에서 VWR pH 표준으로 보정됨)이 구비된 Fisher Scientific Accumet Basic, 삼투압계: Advanced Instrument 삼투압계 Model 3320.

엘사미트루신 토실레이트 스톡 용액의 제조: 250 ㎖ 부피 플라스크 내에 3.2903 g의 엘사미트루신 토실레이트 및 11.9251 g의 만니톨을 정확하게 칭량하였다. 사용 직전 1시간 동안 물 분산제를 통해 질소를 버블링 처리함으로써 탈기된 약 200 ㎖의 주사용수를 플라스크에 첨가하였다. 모든 고체가 용해될 때까지 45∼5O℃에서 혼합물을 수조에서 교반하였다. 상온으로 냉각시킨 후, 용액의 pH를 0.2 N NaOH로 4.0으로 조정하였다. 주사용수를 이 후 마크에 첨가되고 용액의 pH를 재검토하였다. 용액을 이 후 0.22 미크론 셀룰로스 아세테이트 멤브레인 필터에 통과시켜 여과하고 5분 동안 물 분산제를 통해 질소로 버블링 처리하였다. 2.5 ㎖의 스톡 용액을 5 ㎖ 앰버 혈청 바이알(80 x)로 옮겼다. 각 바이알의 상부공간을 질소로 퍼지하고 Stemli 혈청 마개 및 Wheaton 언라인드 알루미늄 시일로 밀봉하였다.

본 발명의 안정성 연구를 위해 관련 불순물의 측정 이외에 엘사미트루신의 HPLC 중량/중량 검정을 실시하였다. HPLC 검정을 위한 시약은 다음과 같다 - HPLC 등급 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산(로트 번호 44093418)을 EMD Science로부터 얻었다. Millipore MiIIi-Q 시스템으로 물을 정제하였다. 장치는 컬럼 히터가 구비된 Waters Alliance 2695 분리 모듈, 오토샘플러 및 물 2996 포토다이오드 어레이 검출기로 이루어진 크로마토그래피 시스템이었다. 데이타 획득은 Waters Empower Pro 2 소프트웨어에 의해 제어되었다. 컬럼으로서 Cadenza Cd-CI 8, 3 ㎛, 4.6 x 150 mm (Silverstone Sciences)이 사용되었다. 267 nm에서 검출이 이루어졌다. 이동상 A는 0.1% 트리플루오로아세트산을 지닌 물을 함유하였다. 2000 ㎖의 물에 2 ㎖의 트리플루오로아세트산을 피펫팅하였다. 이동상 B는 0.08% 트리플루오로아세트산을 지닌 아세토니트릴을 함유하였다. 1250 ㎖의 아세토니트릴에 1 ㎖의 트리플루오로아세트산을 피펫팅하였다. 1 ℓ의 물을 1 ℓ의 아세토니트릴과 완전하게 혼합하였다.

하기 확인된 바와 같이 다양한 시점에서 HPLC 분석을 실시하였다.

하기 표 7은 구배 조건을 제시한다.

HPLC 분석은 1.0 ㎖/분과 동일한 유속에서 구배를 이루어 수행되었다. 오븐 온도는 4O℃에서 설정되었다. 오토샘플러 온도는 25℃에서 설정되었다. 주입 부피는 10 ㎕였다. 샘플 희석액 - 아세토니트릴/물 (50/50, v/v): 1 ℓ의 물을 1 ℓ의 아세토니트릴과 완전하게 혼합하였다. 샘플 블랭크 -아세토니트릴/물 (50/50, v/v): 샘플 희석액은 샘플 블랭크로 사용하였다. 표준 용액 - ∼0.1 mg/㎖의 엘사미트루신: 26.32 mg의 엘사미트루신 토실레이트를 정확하게 칭량하여 200 ㎖ 부피 플라스크 내 200 ㎖의 샘플 희석액 중에 용해시켰다. 샘플 용액 제조 (시점 당 1개의 바이알): 20 ㎖ 부피 플라스크에 2 ㎖의 엘사미트루신 RTU 용액을 피펫팅하고 18 ㎖의 샘플 희석액으로 희석하였다. 2 ㎖의 희석된 용액을 20 ㎖ 부피 플라스크 중에서 18 ㎖의 샘플 희석액으로 추가 희석하여 (약 0.1 mg/㎖에서 농도를 갖는) 최종 분석 샘플을 생성하였다. 엘사미트루신에 대한 체류 시간은 약 11.7분이었다.

사용 직후, 컬럼을 30분 동안 용매 B로 그리고나서 45분 동안 샘플 희석액으로 씻어내었다. 각각의 사용 완료시 샘플 희석액 중에 컬럼을 보관하였다. 0시간에서 스톡 용액 중의 엘사미트루신 유리 염기의 평균 농도는 301.6 mOsm/kg과 동일한 평균 삼투압으로 10.035 mg/㎖로서 측정되었다.

엘사미트루신 F2 RTU의 효능 - 2.5 ㎖ 투여 형태는 하기 표 8에 제시되고: 이는 12주의 기간 동안 직립 및 역위 위치에서 2.5 ㎖ 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태의 효능을 요약하고 있다. 이러한 투여 형태는 도 2A, 2B, 3A 및 3B에 도시된 바와 같이 4℃ 및 25℃에서 2가지 보관 위치로 모두 안정하였다. 이는 고온에서 상이한 분해 정도를 보였다. 313 및 333 K에서 제로 차수 분해 속도 상수(kT)는 하기 표 9에 나열되었다.

2.5 ㎖ 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태에 대한 추정된 분해 속도 상수 (k278K & k293K)의 측정: 표 9에서 한정된 데이터에 대한 아레니우스법을 이용하여, 5℃ (또는 278 K) 및 25℃ (또는 293 K)에서 직립 위치로 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태에 대한 분해 속도 상수를 각각 1일 5.79 x 10^-6 및 9.84 x 10^-4 mg/㎖과 동일하게 대략 추정하였다. 직립 위치에서 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태의 효능의 10% 감소(즉, 10 mg/㎖에서 9 mg/㎖)를 위해, 5℃에서 보관시 약 17282일 그리고 25℃에서 1016일 걸릴 것이다.

유사하게, 역위 위치에서, 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태에 대한 추정된 분해 속도 상수는 각각 5℃ 및 25℃에서 1일 2.49 x 10^-5 및 6.28 x 10^-4 mg/㎖였다. 이는 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태의 효능이 5℃에서 역위 위치로 40236일의 기간 동안 보관시 10% 감소하는 반면, 이를 25℃에서 보관시 1593일 걸린다는 것을 의미한다.

일반적으로, 역위 위치에서 보관된 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태의 샘플은 직립 위치에서보다 더욱 안정하였다. 2가지 보관 위치 사이에서 안정성 불일치에 대한 이유가 명확하지 않지만, 그럴 듯한 결론으로는 제제와 접촉하면서, 어떤 식으로든 분해 메카니즘(들)을 서행시키는 Stelmi 혈청 마개의 조성물과 관련이 있다.

불순물 프로파일: 표 10∼13은 2.5 ㎖ 엘사미트루신 F2 RTU 투여 형태의 불순물 프로파일이 나열되어 있다. 5 및 25℃에서 유지되는 바이알의 경우, 제제의 pH는 시험 기간 동안 (4.0∼4.3의 범위에서) 사실상 안정하였다. 하지만, 샘플을 고온에서 유지시 분해의 진행과 함께 pH의 감소가 관찰되었다. 주요 분해 불순물(6O℃의 응력 조건 하에서 유도됨)은 상대 체류 시간에서 다음과 같았다: 0.59, 0.62, 1.41, 1.65, 1.82 및 1.84.

달리 제시되어 있지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 성분의 양, 분자량, 반응 조건과 같은 특성 등을 표현하는 모든 수치는 용어 "약"에 의해 모든 사례에서 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 제시되어 있지 않는 한, 다음의 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수적 매개변수들은 본 발명에 의해 얻고자 하는 바람직한 특성에 따라 다양할 수 있는 근사치이다. 적어도, 청구범위의 영역에 대한 균등론(doctrine of equivalents)의 적용을 제한하고자 하는 시도이든 아니든 간에, 각 수적 매개변수는 표시된 유효 숫자의 수 관점에서 그리고 일반적인 반올림법을 적용하여 적어도 이해되어야 한다. 본 발명은 광범위한 영역을 제시하는 수적 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에서 제시한 수치 값은 가능한 한 정확하게 기록된 것이다. 하지만, 임의의 수치는 각각의 시험 측정법에서 확인되는 표준 편차로 인해서 필수적으로 일정 오차를 고유하게 포함한다.

본 발명을 기술하는 문맥에서 (특히 첨부된 청구범위의 문맥에서) 사용되는 부정관사("a", "an"), 정관사("the") 및 유사 지시사는, 본원에 달리 제시되거나 문맥에 의해 분명하게 반박되지 않는 한, 단수 및 복수 모두를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 값의 범위를 인용하는 것은 그 범위 내에 속하는 각각의 개별 값에 대해 개별적으로 언급하는 약기법으로서 제공하고자 하는 의도일 뿐이다. 달리 제시되어 있지 않는 한, 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 인용되어 있는 것과 같이 명세서에 포함되어 있다. 본원에 기술한 모든 방법은, 본문에 달리 제시되어 있지 않거나 문맥에 의해 분명하게 반박되지 않는 한, 임의의 적절한 순서로 수행할 수 있다. 본원에 제공된 임의의 실시예 및 모든 실시예, 또는 예시적인 용어(예, "예컨대")의 사용은 본 발명의 보다 나은 설명을 하기 위한 것뿐이고 단지 특허 청구된 본 발명의 영역을 한정하고자 하는 것이 아니다. 명세서에 어떠한 용어도 본 발명의 실시에 필수적인 임의의 비-특허 청구된 요소를 지시하기 위한 것으로 이해해서는 안된다.

본원에 개시된 본 발명의 대안적 요소 또는 구체예의 그룹화는 한정으로서 이해되어서는 안된다. 각 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그 그룹의 다른 구성원 또는 본원에 확인되는 다른 요소와 임의 조합하여 지칭 및 특허 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹 내에 포함되거나 그룹으로부터 삭제될 수 있다. 이러한 임의의 포함 또는 삭제가 발생하는 경우, 이 명세서는 변형된 그룹을 포함하는 것으로 간주하며 따라서 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠시(Markush) 그룹의 서면 기재사항(written description)을 충족한다.

본 발명의 바람직한 구체예가 본 발명을 수행하기 위해서 발명자에게 공지된 최상의 모드를 포함하여 본원에 기술되어 있다. 물론 이러한 기술된 구체예에 대한 변경예는 당업자라면 전술한 설명을 읽을 때 자명하게 이해할 수 있을 것이다. 본 발명자는 당업자가 이러한 변경예를 적절하게 사용할 것으로 예상하며, 본 발명자는 본 발명에 대해서 본원에 특별히 기술된 것과는 달리 실시하고자 한다. 따라서, 본 발명은 적용가능한 법이 허용하는 대로 첨부되어 있는 청구범위에서 인용된 청구 대상의 모든 변형예 및 동등물을 포함한다. 또한, 이의 모든 가능한 변경예에서 상기 기술한 요소의 임의의 조합은, 본원에 달리 제시되어 있거나 문맥에 의해 분명하게 반박되지 않는 한, 본 발명에 포함된다.

또한, 본 명세서 전반에 걸쳐 특허 및 인쇄된 공개물이 참고 인용되어 있다. 상기 인용된 참고 문헌 및 인쇄된 공개물은 각각 개별적으로 그 전문이 본원에 참고 인용되어 있다.

마치면서, 본원에 개시된 본 발명의 구체예는 본 발명의 원리를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 이해하여야 한다. 사용할 수 있는 다른 변형예도 본 발명의 영역 내에 속한다. 따라서, 본 발명의 대안적 구성은, 비제한적인 예로서, 본원의 교시에 따라서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 도시되고 기술된 바에 정확하게 한정되지 않는다.

Claims

하나 이상의 안정한 고체 엘사미트루신 염, 및
약학적으로 허용되는 담체
로 된 용액을 포함하는 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제는 용액 pH를 유지하는 완충제를 함유하지 않는 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 제제는 안정화 산화방지제를 필요로 하지 않는 것인 제제.
제1항에 있어서, 삼투압 조절제를 추가로 포함하는 제제.
제4항에 있어서, 상기 삼투압 조절제는 만니톨인 것인 제제.
제1항에 있어서, 약 3.5∼4.5 사이의 pH를 설정하는 첨가제(agent)를 추가로 포함하는 것인 제제.
제1항에 있어서, 약 3.0∼약 4.0 사이의 pH를 설정하는 첨가제를 추가로 포함하는 것인 제제.
제1항에 있어서, 약 4.0의 pH를 설정하는 첨가제를 추가로 포함하는 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 안정한 고체 엘사미트루신 염은 엘사미트루신 락테이트, 엘사미트루신 푸마레이트, 엘사미트루신 말레에이트, 엘사미트루신 숙시네이트, 엘사미트루신 타르트레이트, 엘사미트루신 토실레이트, 엘사미트루신 메탄설포네이트, 엘사미트루신 벤조에이트, 엘사미트루신 살리실레이트, 엘사미트루신 히드로클로라이드, 엘사미트루신 설페이트 및 엘사미트루신 포스페이트로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 제제.
제9항에 있어서, 상기 엘사미트루신 염은 엘사미트루신 토실레이트인 것인 제제.
제1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용되는 담체는 물 또는 식염수인 것인 제제.